CN110483682B

CN110483682B - 检测黏度的高分子荧光探针及其制备方法与应用

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Publication number: CN110483682B
Application number: CN201910801285.1A
Authority: CN
Inventors: 耿兵; 陈慧颖; 赵建志; 王永康; 梁吉虹
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-08-28
Also published as: CN110483682A

Abstract

本发明公开了一种检测黏度的高分子荧光探针，所述高分子荧光探针具有式I所示的结构：

其中，m，n均为自然数；1≤n≤9，100<(m:n)<200。本发明的高分子荧光探针能够区分不同黏度，具有较高的灵敏度，良好的光学稳定性以及对黏度特异性响应；本发明的高分子荧光探针带有红色荧光并能进入细胞内，红色荧光能显著降低背景荧光的干扰，荧光强度稳定，耐光漂白性较高。

Description

检测黏度的高分子荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及有机高分子荧光探针技术领域，具体涉及一种检测黏度的高分子荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

黏度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素，同时是流体扩散速率的主要参考指标。微环境的黏度在病理学研究中起到非常重要的作用，因为黏度的变化往往会影响细胞微环境中各种新陈代谢的进行，黏度的异常与许多疾病有关。所以检测细胞内的黏度对于临床诊断和病理分析具有重要的意义。

荧光成像技术由于具有实时监测，背景信号低，灵敏度高等优点而成为检测生物分子以及生物微环境重要的一种手段。目前已有利用荧光探针检测黏度的报道，例如专利CN108715760A、CN10708993A、CN109369636A和CN110129037A等。但上述检测黏度的荧光探针均为小分子荧光探针。在实际应用时，小分子荧光化合物具有一定的局限性：首先，当把小分子荧光物质和待测体系混合在一起时，可能会污染待测体系，待测体系再难以用在其他方面；第二，小分子荧光物质很少用在光学仪器上，因为其难以制成光学配件，很大程度上制约了其实现自动化检测。

高分子荧光探针和小分子荧光探针相比具有显著不同的特征及优势。其最主要的一点在于高分子能接上其他功能小分子基团却基本不改变本身性质，而小分子一般不具有该能力。因此，高分子荧光探针能进一步修饰连接上其他功能基团，即使得这种探针作为一种能够整合多种功能的载体以研究和解决各种问题，这在生物学、医药学等领域具有重要意义。其中，人工合成的高分子比生物大分子更稳定、更易修饰、更易控制其物理化学性质，且成本一般较低。但目前还未见有关于检测黏度的高分子荧光探针的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测黏度的高分子荧光探针，本发明的高分子荧光探针可进入活细胞并在细胞内富集，且选择性好、灵敏度高，完全人工合成，不含有任何生物特征基团。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种高分子荧光探针，所述高分子荧光探针具有式I所示的结构：

其中，m，n均为自然数；1≤n≤9，100<(m:n)<200。

本发明的第二方面，提供上述高分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

将式II所示的含有荧光团的单体探针、丙烯酸羟乙酯和偶氮二异丁腈溶解在有机溶剂中，在惰性气体保护下，恒温反应，反应后经沉析、干燥，得到高分子荧光探针；

优选的，式II所示的含有荧光团的单体探针、丙烯酸羟乙酯和偶氮二异丁腈加入的摩尔比为1:100:1。

优选的，所述有机溶剂为环己酮或N,N-二甲基甲酰胺中的一种。

优选的，恒温反应的温度为60-70℃，反应时间为10-24h。

优选的，式II所示的含有荧光团的单体探针由如下方法制备而成：

(1)以4-二乙氨基酮酸和环己酮为原料，在浓硫酸中加热反应，得到化合物1；

(2)将化合物1和费舍尔氏醛在乙酸酐中加热反应，经分离纯化得到化合物2；

(3)将化合物2溶于1,2-二氯乙烷中，进行酰氯化反应，得到化合物3；

(4)将化合物3与丙烯酸羟乙酯搅拌反应，分离纯化，得到式II所示的含有荧光团的单体探针；

其中，化合物1、化合物2和化合物3的结构式分别如下所示：

更优选的，步骤(1)中，4-二乙氨基酮酸和环丙酮的摩尔比为1:2，反应温度为85℃，反应时间为4h。

更优选的，步骤(2)中，化合物1和费舍尔氏醛的摩尔比为1:1，反应温度为50℃，反应时间为30min。

本发明的第三方面，提供上述高分子荧光探针在如下1)-3)至少一项中的用途：

1)检测溶液和/或生物体系的黏度；

2)制备用于检测溶液和/或生物体系黏度的试剂；

3)作为溶液和/或生物细胞中黏度变化的指示剂。

本发明的第四方面，提供一种检测细胞内黏度的方法，包括以下步骤：

将待检测细胞与上述高分子荧光探针混合孵育，然后进行生物成像，所述生物成像为单光子成像，激发波长为561nm，发射波长为570-620nm，根据成像结果对细胞内黏度进行判断。

本发明的有益效果：

(1)本发明的高分子荧光探针能够区分不同黏度，具有较高的灵敏度，良好的光学稳定性以及对黏度特异性响应；本发明的高分子荧光探针带有红色荧光并能进入细胞内，红色荧光能显著降低背景荧光的干扰，荧光强度稳定，耐光漂白性较高。

(2)本发明的高分子荧光探针完全人工合成，不含有任何生物特征的基团，更易修饰，更易控制其物理化学性能，其合成成本低。

(3)本发明的高分子荧光探针的合成步骤简单、合成原料易得，产品收率高。

附图说明

图1：含荧光团的单体探针的¹H NMR谱。

图2：含荧光团的单体探针¹³C NMR谱。

图3：本发明的高分子荧光探针在不同黏度体系中的发射光谱。

图4：本发明的高分子荧光探针的细胞成像应用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，目前检测黏度的荧光探针多为小分子荧光探针，而小分子荧光探针在实际应用过程中存在诸多的不足。高分子荧光探针和小分子荧光探针相比具有显著不同的特征及优势。其最主要的一点在于高分子能接上其他功能小分子基团却基本不改变本身性质，而小分子一般不具有该能力。但目前还未见有关于检测黏度的高分子荧光探针的报道。

基于此，本发明的目的是提供一种用于黏度检测的高分子荧光探针，其分子结构式如下：

m，n为自然数，其中1≤n≤9，100<(m:n)<200。

上述高分子荧光探针中，m、n的取值一方面会影响本发明的高分子荧光探针的分子量，进而影响高分子荧光探针进入细胞的能力；另一方面，也会影响高分子荧光探针的荧光强度和稳定性。本发明的高分子荧光探针中含有羟基，属于多羟基聚合物，而羟基具有亲水性，即能够很好地溶于水，细胞内的环境就是以水为主要成分，因此，本发明的高分子荧光探针能够进入细胞并富集。并且高分子探针进入细胞一般是通过胞吞的形式进入的。荧光探针的分子量大小会影响其进入细胞，分子量过小会使得聚合物在水中的颗粒过大，分子量过大会导致聚合物的分子太大，无法适用于探针进入细胞。本发明的高分子荧光探针的分子量大小适宜，能够保证荧光探针进入细胞并在细胞内富集。而且经MTT试验证明，本发明的高分子荧光探针对细胞毒性较低且不影响细胞的正常生存。

本发明的高分子荧光探针是以多个苯环组成的大共轭结构作为荧光团，其荧光强度和稳定性与荧光探针的分子量也密切相关，经试验发现，在本发明上述限定的分子量条件下，其荧光强度和稳定性较优；特别是在n＝2，m:n为173:1时，探针的荧光强度和稳定性达到峰值。

所述的高分子荧光探针由如下方法制备而成：

(1)4-二乙氨基酮酸(①)与环己酮(②)在浓硫酸中加热反应，结晶提纯干燥得到化合物③；其反应式如下：

(2)化合物③和费舍尔氏醛(④)在乙酸酐中加热反应，经过分离纯化得到化合物⑤；其反应式如下：

(3)将化合物⑤溶于1，2-二氯乙烷中，滴加二氯亚砜(⑥)或三氯氧磷(⑦)，加热回流，进行酰氯化，得到酰氯粗产品(⑧)；其反应式如下：

(4)加入有机溶剂(乙腈或二氯甲烷中的一种)将粗酰氯产品(⑧)完全溶解，缓慢加入丙烯酸羟乙酯(⑨)，搅拌反应，分离纯化得到含有荧光团的单体(⑩)；其反应式如下：

(5)将含有荧光团的单体(⑩)、丙烯酸羟乙酯(⑨)和偶氮二异丁腈溶解在有机溶剂(环己酮或N,N-二甲基甲酰胺中的一种)中，在惰性气体(氮气、氦气、氖气、氩气或氪气中的一种)保护下，恒温反应，经沉析、干燥获得能够检测黏度的高分子荧光探针

其反应式如下：

本发明的高分子荧光探针可以用于检测溶液和细胞内的黏度，其对黏度的检测机理如下：

化合物③中的六元环与费舍尔氏醛通过单键相连，所以在低黏度的情况下，费舍尔氏醛可以通过单键自由旋转，使整个探针分子不共平面，探针几乎没有荧光即荧光处于“关闭”状态；当在黏度比较大的体系中时，由于费舍尔氏醛的自由旋转受到限制，使得整个探针分子共平面，探针就会发出很强的荧光，即荧光开关被打开。所以，通过这种“开关型”荧光探针可以检测不同的黏度。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：高分子荧光探针的合成

(1)化合物③的合成

称取4-二乙氨基酮酸0.6267g(2mmol)(①)与环己酮0.3926g(4mmol)(②)，溶于5ml浓硫酸中，85℃下加热反应24h，停止反应。将反应后的溶液逐滴滴加到300ml的蒸馏水中，进行稀释，再往稀释后的体系中滴加高氯酸产生沉淀，当不再产生沉淀时停止滴加高氯酸，然后进行减压过滤，并在抽滤状态下用蒸馏水将产物表面的酸洗涤干净。将洗涤后的产物放入真空干燥箱中常温真空干燥24h，即得到纯净干燥的化合物③。化合物③为绿色固体。产率为70％。

(2)化合物⑤的合成

取化合物③0.5g(1.3mmol)，费舍尔氏醛(④)0.2673g(1.3mmol)，溶于8ml乙酸酐中，在50℃下反应30min后停止反应。将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物，以体积比为15:1的二氯甲烷和甲醇作为流动相对粗产物进行纯化，最终得到绿色固体产物⑤。产率为67％。

(3)化合物⑩的合成

取化合物⑤0.3g(0.536mmol)溶于15ml 1，2-二氯乙烷中，缓慢滴加0.25ml二氯亚砜(⑥)，85℃加热回流6h后停止反应，旋干溶剂，得到酰氯粗产品(⑧)。

在酰氯粗产品(⑧)中加入无水二氯甲烷，搅拌，使其全部溶解，再在搅拌状态下缓慢滴加0.3ml(2.68mmol)丙烯酸羟乙酯，室温下搅拌24h以上，将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物，以体积比为15:1的二氯甲烷和甲醇作为流动相对粗产物进行纯化，最终得到含有荧光团的单体⑩，为红色固体。产率为43％。

含荧光团的单体探针⑩的¹H NMR谱如图1，¹³C NMR谱如图2；

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.35-8.34(d,J＝3.6Hz,1H),8.17-8.09(dd,J1＝20.6Hz,J2＝10.0,1H),8.0-7.93(m,1H),7.59-7.53(dd,J1＝15.4Hz,J2＝7.8,2H),7.46-7.44(d,J＝4.6Hz,1H),7.24-7.22(d,J＝9.2Hz,1H),7.17-7.12(dd,J1＝12.8Hz,J2＝6.8,2H),6.82(s,1H),6.74-6.67(dd,J1＝20.6Hz,J2＝9.8,2H),6.18-6.16(d,J＝8.0Hz,1H),5.91-5.86(m,1H),5.34-5.32(t,J＝4.6Hz,1H),4.19-4.02(m,4H),3.83(s,4H),3.17-3.14(d,J＝15.6Hz,1H),2.91-2.82(dd,J1＝22.2Hz,J2＝12.6,3H),2.03-1.98(dd,J1＝14.8Hz,J2＝7.2,2H),1.49-1.32(m,6H),1.24(s,6H),0.89-0.84(dd,J1＝12.8Hz,J2＝6.8,3H),；

¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.08,132.43,132.29,132.27,132.14,131.92,130.11,128.86,128.70,128.11,122.77,122.60,108.83,72.76,68.67,66.41,64.02,60.63,59.37,49.05,44.21,43.83,31.73,29.54,29.47,29.43,29.31,29.27,29.20,29.14,29.03,27.01,26.37,24.56,22.54,14.39,13.60,12.80.

(4)高分子荧光探针

的合成

将含有荧光团的单体⑩0.1316g(0.2mmol)、丙烯酸羟乙酯2.3222g(20mmol)和偶氮二异丁腈0.0328g(0.2mmol)溶解在环己酮中，在惰性气体氮气保护下，在60℃下恒温搅拌反应12h。反应完后将溶液冷却，在搅拌状态下，将反应体系滴加到二氯甲烷中，沉析出聚合物，静置，倒出上层清液，再用甲醇溶解，反复沉析三次，放入真空干燥箱中烘干得到高分子荧光探针

其中，n＝2，m:n大约为173:1。

实施例2：荧光探针在不同黏度体系中的荧光光谱

配制浓度为20mg/ml实施例1所得高分子荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用。

测试液中，分别取2ml不同比例甘油与甲醇的溶剂(甘油:甲醇＝0:10，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，10:0)，然后加入探针母液(终浓度为0.2mg/ml)，进行荧光扫描(激发波长510nm，检测波段530-750nm)，测得各体系中相对荧光强度，如图3所示。由图3可知，随着溶剂黏度的增加，相对荧光强度变强。

实施例3：荧光探针在宫颈癌细胞中的成像

配制浓度为100μg/ml实施例1所得高分子荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用。

将适当密度的Hela细胞接种到灭菌的35mm成像培养皿中，在CO₂培养箱(温度为37℃，5％CO₂)中培养，待细胞贴壁后，第一组加入40μL的高分子黏度荧光探针孵育半小时后进行生物成像(单光子成像：激发波长：561nm，发射波长：570-620nm)；第二组先加入10μM黏度刺激物莫能菌素(Monensin)，40分钟后再加入40μL高分子荧光探针，孵育半小时后进行生物成像；第三组先加入10μM黏度刺激物制霉菌素(Nystatin)，40分钟后加入40μL高分子黏度荧光探针，孵育半小时后进行生物成像；成像结果如图4所示。通过分析比较可以看出在单光子条件下，在只有探针的情况下细胞只发微弱的光；在加有探针以及黏度刺激物(莫能菌素，制霉菌素)的情况下细胞发出强烈的红光；因此不同黏度的细胞可以通过本发明合成的高分子荧光探针进行细胞成像来区分。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种高分子荧光探针，所述高分子荧光探针具有式I所示的结构：

其中，m，n均为自然数；1≤n≤9，100<(m:n)<200。

2.权利要求1所述的高分子荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式II所示的含有荧光团的单体探针、丙烯酸羟乙酯和偶氮二异丁腈加入的摩尔比为1:100:1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为环己酮或N,N-二甲基甲酰胺中的一种。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，恒温反应的温度为60-70℃，反应时间为10-24h。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式II所示的含有荧光团的单体探针由如下方法制备而成：

其中，化合物1、化合物2和化合物3的结构式分别如下所示：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，4-二乙氨基酮酸和环己酮的摩尔比为1:2，反应温度为85℃，反应时间为4h。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，化合物1和费舍尔氏醛的摩尔比为1:1，反应温度为50℃，反应时间为30min。

9.权利要求1所述的高分子荧光探针在如下1)-3)至少一项中的用途：

1)检测溶液和/或生物体系的黏度；

2)制备用于检测溶液和/或生物体系黏度的试剂；

3)作为溶液和/或生物细胞中黏度变化的指示剂。

10.一种检测细胞内黏度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待检测细胞与权利要求1所述的高分子荧光探针混合孵育，然后进行生物成像，所述生物成像为单光子成像，激发波长为561nm，发射波长为570-620nm，根据成像结果对细胞内黏度进行判断。