CN112920195B - 一种比率型粘度荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比率型粘度荧光探针，其结构式如下：
为比率型荧光探针，可以降低背景、杂质的干扰，在检测粘度时具有良好的灵敏度；是一种简单，快速，灵敏的细胞粘度检测试剂，且对细胞毒性低，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。本发明还提供一种比率型粘度荧光探针的制备方法和应用，所述比率型粘度荧光探针可用于溶液体系或生物体系中粘度测定。
Description
技术领域
本发明涉及有机小分子荧光探针技术领域，具体涉及一种比率型粘度荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
细胞内微环境的稳定是保证细胞正常进行一系列生命活动重要条件，如增殖、分化、代谢等。粘度作为细胞内微环境中的一个重要参数，可以通过控制信号的传递来促进生物功能，还可以影响生物分子之间的相互作用和细胞内营养物质和代谢产物的运输等。细胞粘度与细胞的许多生理和病理过程密切相关，粘度的变化会对一些正常的生理功能造成影响，从而导致细胞功能失常紊乱，引起一些疾病如高血压、糖尿病等。因此检测细胞内粘度对于疾病诊断和病理学的研究具有重要的意义。
目前所报道的一些粘度探针分子易受环境(如极性)的干扰，有些金属配合物粘度探针可以监测粘度变化，但成本过高。由于咔唑类衍生物具有良好的化学稳定性、热稳定性以及光稳定性等优点，咔唑衍生物在光化学及生物化学领域具有良好的应用前景。
基于此，本发明的目的在于设计一种基于咔唑的比率型粘度荧光探针，降低杂质的干扰，并降低检测成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种比率型粘度荧光探针，可以降低背景、杂质的干扰，在检测粘度时具有良好的灵敏度。
为了解决上述问题，本发明的技术方案如下：
一种比率型粘度荧光探针，具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
式(Ⅰ)。
进一步地，所述比率型粘度荧光探针具有两个荧光发射峰，分别在520nm处和620nm处。
本发明还提供一种比率型粘度荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1,咔唑1eq，丙烯酸乙酯1.2eq，碱1.2eq，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)50mL，70℃下加热回流14h，反应完成后经萃取、洗涤、干燥、纯化得到中间体N-1，所述中间体N-1的结构式如下：
步骤S2，将9eq的三氯氧磷加入无水DMF 10ml，冰浴下搅拌1h；再加入中间体N-11eq，15ml无水DMF，体系变为橙红色；氮气保护，混合后的液体在室温搅拌半小时，升温至100℃下，反应12h，反应完成后加入水20mL，再将pH值调整到8，经萃取、洗涤、干燥、纯化得到中间体N-2，所述中间体N-2的结构式如下：
步骤S3，取1eq的4-甲基喹啉和1.3eq碘乙烷，加入溶剂甲苯15mL，110℃下加热回流9h，反应生成黄绿色固体，过滤、洗涤、干燥得到中间体N-3，所述中间体N-3的结构式如下：
步骤S4，称取1.1eq的N-3，1eq的N-2,加入15mL甲醇为溶剂，两滴哌啶，体系在70℃下反应12h，反应完成后除去甲醇，纯化得到中间体N-4，所述中间体N-4的结构式如下：
步骤S5，加入1eq的中间体N-4，甲醇6ml，水2ml，5eq的氢氧化钾，室温搅拌两小时后，旋蒸除甲醇，经萃取、洗涤、调节pH至2，析出固体，将固体物洗涤、干燥得到中间体N-5，所述中间体N-5的结构如下：
步骤S6，取0.3mmol的N-5溶于3ml的无水二氯甲烷中，缓慢滴加1.5ml的氯化亚砜，滴两滴DMF为催化剂，加热回流，旋干溶剂得中间体N-6，所述中间体N-6的结构式如下：
步骤S7，冰水浴，取5-氨基荧光素0.2mmol溶于1mlDMF，3ml无水二氯甲烷中，再加入0.6mmol DMAP，再用5ml无水二氯甲烷溶解中间体N-6，加入反应容器中，撤去大部分冰，反应12h，反应结束后，用10％的氨水淬灭反应，析出固体，然后洗涤，过滤，重结晶得到荧光探针分子P-2，所述荧光探针分子P-2的结构式如下：
进一步地，步骤S1中，碱为碳酸钾；并通过柱层析分离纯化得到中间体N-1，其中柱层析分离用洗脱剂配比为石油醚/二氯甲烷(v:v)＝5:1。
进一步地，步骤S2中，通过柱层析分离纯化得到中间体N-2，其中柱层析分离用洗脱剂配比为石油醚/二氯甲烷(v:v)＝1:2。
进一步地，步骤S3中，洗涤固体的溶剂为无水乙醚，分三次洗涤。
进一步地，步骤S4中，通过柱层析分离纯化得到中间体N-4，其中柱层析分离用洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷(v:v)＝1:40。
进一步地，步骤S5中，萃取用有机溶剂为二氯甲烷，温度为室温；步骤S6中，回流温度为70℃；步骤S7中，重结晶用溶剂为乙醇。
本发明还提供一种比率型粘度荧光探针在溶液体系或生物体系中粘度测定的应用。
进一步地，利用荧光探针检测粘度时，荧光测定的激发波长为480nm，荧光发射峰为双峰，峰值分别在520nm处和620nm处；随着粘度增加，520nm处和620nm处的荧光强度同步增加，且520nm处的荧光强度与620nm处的荧光强度比值与溶液粘度呈线性关系，从而根据520nm处的荧光强度与620nm处的荧光强度比值测定溶液体系的粘度。
与现有技术相比，本发明提供的比率型粘度荧光探针及其制备方法和应用，有益效果在于：
一、本发明提供的比率型粘度荧光探针，为比率型荧光探针，可以降低背景、杂质的干扰，在检测粘度时具有良好的灵敏度。
二、本发明提供的比率型粘度荧光探针，基于咔唑类衍生物制备得到，具有良好的化学稳定性、热稳定性以及光稳定性等优点，通过荧光光谱检测实现溶液粘度检测，简便、快捷。
三、本发明提供的比率型粘度荧光探针，是一种简单，快速，灵敏的细胞粘度检测试剂，且对细胞毒性低，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为荧光探针P-2的核磁氢谱图；
图2为荧光探针P-2在不同溶液中的紫外吸收光谱图；
图3为荧光探针P-2在不同溶剂中的荧光谱图；
图4为荧光探针P-2在不同比例的甘油-PBS溶液中的荧光发射图谱；
图5为荧光探针P-2在激发波长为480nm时，I520/I620的线性关系图；
图6为荧光探针P-2(30μM)与Hela细胞孵育24小时后的细胞形态图；
图7为荧光探针p-2与Hela细胞孵育24h后的CCK-8毒性检测图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应该被视为在本文中具体公开。
实施例1
中间体N-1的合成，合成线路如下：
合成方法为：咔唑(1.5g，9mmol，1eq)，丙烯酸乙酯(1.2ml，10.5mmol，1.2eq)，碳酸钾(1.5g，11mmol，1.2eq)加入100mL圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)50mL，70℃下加热回流14h，薄层层析色谱(TLC)监测反应，反应完成。通过乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，得到有机相，旋干溶剂，柱层析分离纯化得黄色油状液体(中间体N-1)，洗脱剂配比为石油醚/二氯甲烷(v:v)＝4:1。产率为85％。
中间体N-1的核磁测试结果如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(d,J＝7.7Hz,2H),7.25(q,J＝8.3Hz,4H),7.08–6.95(m,2H),4.45–4.38(m,2H),3.87(dd,J＝14.3,7.1Hz,2H),2.65–2.59(m,2H),0.94(t,J＝7.1Hz,3H)。
中间体N-2的合成，合成线路如下：
合成方法为：将(0.7g,4.5mmol,9eq)的三氯氧磷加入无水DMF 10ml，冰浴下搅拌1h。再加入中间体N-1(0.8g，0.5mmol，1eq)，15ml无水DMF，体系变为橙红色。氮气保护，混合后的液体在室温搅拌半小时，升温至100℃下，反应12h，薄层层析色谱(TLC)监测反应，反应完成。加入水20mL，再将pH值调整到8，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，得到有机相，旋干溶剂，通过柱层析分离纯化得到黄色固体(中间体N-2)，洗脱剂配比为石油醚/二氯甲烷(v:v)＝1:2，产率为70％。
中间体N-2的核磁测试结果如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.28–9.76(m,1H),8.57(t,J＝15.7Hz,1H),8.26–7.92(m,2H),7.68–7.44(m,3H),7.43–7.29(m,1H),4.80–4.37(m,2H),4.22–3.98(m,2H),3.04–2.75(m,2H),1.24–1.05(m,3H)。
中间体N-3的合成，合成方法为：取4-甲基喹啉(0.86g,6mmol,1eq)和碘乙烷(1.23g,8mmol,1.3eq)，加入溶剂甲苯15mL，在磁力搅拌器搅拌下加热至回流。薄层层析色谱(TLC)监测反应，反应9h后，体系中生成大量黄绿色固体。用抽滤漏斗过滤得到固体，并用30mL乙醚分三次洗涤，得到的固体进行干燥，得到中间体N-3。
中间体N-3的核磁测试结果如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.21–10.13(m,1H),8.65–8.44(m,1H),8.51–8.36(m,1H),8.36–8.18(m,1H),8.14–7.89(m,2H),5.66–5.24(m,2H),3.06(t,J＝15.3Hz,3H),2.02–1.58(m,3H)。
中间体N-3的结构如下：
中间体N-4的合成，合成路线如下：
中间体N-4的合成方法如下：取N-3(0.70g，2.34mmol,1eq)、N-2(0.70g，2.37mmol,1eq)于50ml圆底烧瓶中，加入25mL乙醇为溶剂，2滴哌啶，体系在70℃下反应12h。薄层层析色谱(TLC)监测反应，反应完成，通过柱层析分离纯化得到红黑色固体(中间体N-4)，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷(v:v)＝1:40，产率为50％。
中间体N-4的核磁测试结果如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.62(d,J＝6.5Hz,1H),8.84(d,J＝8.4Hz,1H),8.41(s,1H),8.31(d,J＝6.6Hz,1H),8.23(d,J＝7.7Hz,1H),7.97(d,J＝4.7Hz,2H),7.92(t,J＝5.7Hz,2H),7.89(s,1H),7.85(d,J＝7.4Hz,1H),7.52(t,J＝7.5Hz,1H),7.44(d,J＝8.3Hz,2H),7.31(t,J＝7.4Hz,1H),4.82(q,J＝7.2Hz,2H),4.60(t,J＝6.9Hz,2H),4.14–4.03(m,2H),2.86(t,J＝6.8Hz,2H),1.62(t,J＝7.2Hz,3H),1.17(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体N-5的合成，合成线路如下：
中间体N-5的合成方法为：加入(0.33mmol,190mg,1eq)的反应物N-4，甲醇6ml，水2ml，(1.7mmol,0.1g,5eq)的氢氧化钾，室温搅拌两小时后，旋蒸除甲醇，用有机溶剂萃取，再用饱和食盐水洗涤有机层，合并水相，盐酸调pH至2，析出固体，过滤水洗涤至中性，真空干燥得到中间体N-5。
中间体N-5的核磁测试结果如下：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.64(d,J＝6.4Hz,1H),8.59(d,J＝8.6Hz,1H),8.23(s,1H),8.09(d,J＝8.9Hz,1H),8.02(dd,J＝16.2,8.9Hz,1H),7.88(t,J＝6.7Hz,1H),7.84–7.79(m,2H),7.79–7.71(m,2H),7.46(d,J＝8.6Hz,1H),7.43–7.36(m,1H),7.32(t,J＝7.5Hz,2H),7.04(t,J＝7.4Hz,1H),4.67–4.49(m,2H),4.37(dd,J＝25.4,18.2Hz,2H),2.61(dd,J＝19.3,12.1Hz,2H),1.57–1.34(m,3H)。
荧光探针P-2的合成，合成线路如下：
荧光探针P-2的合成方法为：取0.3mmol的N-5溶于3ml的无水二氯甲烷中，缓慢滴加1.5ml的氯化亚砜，滴两滴DMF为催化剂，70℃加热回流3h。旋干溶剂得中间体N-6。
冰水浴，取5-氨基荧光素0.2mmol溶于1mlDMF，3ml无水二氯甲烷中，再加入0.6mmol DMAP，再用5ml无水二氯甲烷溶解中间体N-6，加入反应容器中，撤去大部分冰，反应12h，反应结束后，用10％的氨水淬灭反应，析出固体，然后洗涤，过滤，乙醇重结晶得到目标荧光探针分子P-2。
请参阅图1，为荧光探针P-2的核磁氢谱图。荧光探针P-2的核磁测试结果如下：1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.36(s,1H),9.12(d,J＝8.2Hz,1H),8.88(d,J＝26.5Hz,1H),8.42(dd,J＝40.8,22.1Hz,4H),8.31–8.20(m,2H),8.15(d,J＝7.9Hz,1H),8.02(s,1H),7.82(dd,J＝22.8,8.0Hz,2H),7.61–7.47(m,2H),7.32(d,J＝24.0Hz,2H),7.04–6.91(m,3H),6.89–6.81(m,2H),6.71(d,J＝13.0Hz,2H),6.60(dd,J＝17.2,8.0Hz,3H),5.83(t,J＝20.4Hz,2H),4.89(s,2H),3.18(s,2H),1.59(d,J＝5.8Hz,3H)。
实施例2
荧光探针分子P-2在不同溶剂中的荧光谱图的变化
选择甲醇(MeOH)，乙醇(EtOH)，乙腈(ACN)，缓冲液PBS，二氯甲烷(DCM)，二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氧六烷(Diox)，甲苯(PhMe)，甘油(gly)等不同溶剂作为研究对象，分别测定探针分子P-2的紫外吸收峰和荧光发射峰。请结合参阅图2和图3，其中图2为荧光探针P-2在不同溶液中的紫外吸收光谱图；图3为荧光探针P-2在不同溶剂中的荧光谱图。由图2和图3可知，在甘油中荧光发射峰(620nm处)强度显著增强，说明荧光探针分子对粘度响应。
实施例3
荧光探针P-2随粘度的增加而产生的荧光谱图的变化
取实施例1制备的荧光探针P-2溶于DMSO中，制成1mM的母液。从母液中取出10μL加入到2mL的离心管当中，用不同比例(10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％)的甘油-PBS溶液(pH＝7.2)稀释至1mL，测量其荧光性质。
请结合参阅图4和图5，其中图4为荧光探针P-2在不同比例的甘油-PBS溶液中的荧光发射图谱；图5为荧光探针P-2在激发波长为480nm时，I520/I620的线性关系图。图4中横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；图5中横坐标为溶液中甘油百分比含量，表示溶液粘度，纵坐标为520nm处和620nm处的荧光强度比值。由图4可知，荧光发射峰为双峰，峰值分别在520nm处和620nm处，且520nm处的荧光强度大于620nm处的荧光强度；随着粘度增加，520nm处和620nm处的荧光强度同步增加，且620nm处的增加幅度更大；由图5可知，520nm处的荧光强度与620nm处的荧光强度比值与溶液粘度呈线性关系，因此可以根据520nm处的荧光强度与620nm处的荧光强度比值测定溶液体系的粘度。
实施例4
荧光探针P-2对Hela细胞的CCK-8细胞毒性检测
处于生长对数期的Hela细胞以每孔104个接种于96孔板，放入细胞培养箱(37℃，5％CO2)中贴壁生长24h。将细胞培养基吸除，加入用培养基稀释的荧光探针P-2(浓度为5,10,15,20，30μM)与HeLa细胞共孵育24h，弃去培养基，每孔加入100μL用培养基稀释的10％的CCK-8溶液继续孵育2h。用酶标仪(450nm)记录每孔的吸光度值。按下式计算细胞存活率：
其中A0、A1、A2分别为空白组(纯培养基，无探针)、实验组(细胞用探针处理)、对照组(细胞无处理)的吸光度值。
请结合参阅图6和图7，其中6为荧光探针P-2(30μM)与Hela细胞孵育24小时后的细胞形态图；图7为荧光探针p-2与Hela细胞孵育24h后的CCK-8毒性检测图。由图6可以看出，在实验最高浓度(30μM)下视野中的大部分细胞保持正常细胞形态；由图7可以看出，随着探针浓度从5μM增加至30μM，细胞存活率无明显降低，仍能达到90％，说明探针P-2基本无毒性，是可能用于细胞粘度检测的。
与现有技术相比，本发明提供的检测粘度的荧光探针及其制备方法和应用，有益效果在于：
与现有技术相比，本发明提供的比率型粘度荧光探针及其制备方法和应用，有益效果在于：
一、本发明提供的比率型粘度荧光探针，为比率型荧光探针，可以降低背景、杂质的干扰，在检测粘度时具有良好的灵敏度。
二、本发明提供的比率型粘度荧光探针，基于咔唑类衍生物制备得到，具有良好的化学稳定性、热稳定性以及光稳定性等优点，通过荧光光谱检测实现溶液粘度检测，简便、快捷。
三、本发明提供的比率型粘度荧光探针，是一种简单，快速，灵敏的细胞粘度检测试剂，且对细胞毒性低，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
以上对本发明的实施方式作出详细说明，但本发明不局限于所描述的实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行的多种变化、修改、替换和变型均仍落入在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种比率型粘度荧光探针，其特征在于，具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
2.根据权利要求1所述的比率型粘度荧光探针，其特征在于，所述比率型粘度荧光探针具有两个荧光发射峰，分别在520nm处和620nm处。
3.一种权利要求1所述的比率型粘度荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1,咔唑1eq，丙烯酸乙酯1.2eq，碱1.2eq，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)50mL，70℃下加热回流14h，反应完成后经萃取、洗涤、干燥、纯化得到中间体N-1，所述中间体N-1的结构式如下：
步骤S2，将9eq的三氯氧磷加入无水DMF 10ml，冰浴下搅拌1h；再加入中间体N-1 1eq，15ml无水DMF，体系变为橙红色；氮气保护，混合后的液体在室温搅拌半小时，升温至100℃下，反应12h，反应完成后加入水20mL，再将pH值调整到8，经萃取、洗涤、干燥、纯化得到中间体N-2，所述中间体N-2的结构式如下：
步骤S3，取1eq的4-甲基喹啉和1.3eq碘乙烷，加入溶剂甲苯15mL，110℃下加热回流9h，反应生成黄绿色固体，过滤、洗涤、干燥得到中间体N-3，所述中间体N-3的结构式如下：
步骤S4，称取1.1eq的N-3，1eq的N-2,加入15mL甲醇为溶剂，两滴哌啶，体系在70℃下反应12h，反应完成后除去甲醇，纯化得到中间体N-4，所述中间体N-4的结构式如下：
步骤S5，加入1eq的中间体N-4，甲醇6ml，水2ml，5eq的氢氧化钾，室温搅拌两小时后，旋蒸除甲醇，经萃取、洗涤、调节pH至2，析出固体，将固体物洗涤、干燥得到中间体N-5，所述中间体N-5的结构如下：
步骤S6，取0.3mmol的N-5溶于3ml的无水二氯甲烷中，缓慢滴加1.5ml的氯化亚砜，滴两滴DMF为催化剂，加热回流，旋干溶剂得中间体N-6，所述中间体N-6的结构式如下：
步骤S7，冰水浴，取5-氨基荧光素0.2mmol溶于1mlDMF，3ml无水二氯甲烷中，再加入0.6mmol DMAP，再用5ml无水二氯甲烷溶解中间体N-6，加入反应容器中，撤去大部分冰，反应12h，反应结束后，用10％的氨水淬灭反应，析出固体，然后洗涤，过滤，重结晶得到荧光探针分子P-2，所述荧光探针分子P-2的结构式如下：
4.根据权利要求3所述的比率型粘度荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1中，碱为碳酸钾；并通过柱层析分离纯化得到中间体N-1，其中柱层析分离用洗脱剂按体积比计配比为：石油醚/二氯甲烷＝5:1。
5.根据权利要求3所述的比率型粘度荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中，通过柱层析分离纯化得到中间体N-2，其中柱层析分离用洗脱剂按体积比计配比为：石油醚/二氯甲烷＝1:2。
6.根据权利要求3所述的比率型粘度荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S3中，洗涤固体的溶剂为无水乙醚，分三次洗涤。
7.根据权利要求3所述的比率型粘度荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S4中，通过柱层析分离纯化得到中间体N-4，其中柱层析分离用洗脱剂按体积比计配比为：甲醇/二氯甲烷＝1:40。
8.根据权利要求3所述的比率型粘度荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S5中，萃取用有机溶剂为二氯甲烷，温度为室温；
步骤S6中，回流温度为70℃；
步骤S7中，重结晶用溶剂为乙醇。
9.一种权利要求1所述的比率型粘度荧光探针在溶液体系中粘度测定的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，利用荧光探针检测粘度时，荧光测定的激发波长为480nm，荧光发射峰为双峰，峰值分别在520nm处和620nm处；随着粘度增加，520nm处和620nm处的荧光强度同步增加，且520nm处的荧光强度与620nm处的荧光强度比值与溶液粘度呈线性关系，从而根据520nm处的荧光强度与620nm处的荧光强度比值测定溶液体系的粘度。
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