CN111138639B - pH响应型共轭聚合物纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种pH响应型共轭聚合物纳米粒子及其制备方法和应用，pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液的制备方法包括以下步骤：将超纯水和无水乙腈混合均匀，得到混合液；将混合液于20～35℃保持超声状态，将母液滴加到混合液中，滴加完毕后继续超声1～2小时，得到溶液M；其中，母液的制备方法为：将聚噻吩衍生物溶解于氯仿中，得到聚噻吩衍生物的浓度为1～2mg/mL的母液；向溶液M中通入氮气，除去氯仿和乙腈，得到pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液。本发明的pH响应型共轭聚合物纳米粒子具有生物相容性良好、荧光强度高和毒性低等特性，可用于水溶液中弱酸性pH值的精确测量，也可用于肿瘤细胞微环境响应的灵敏检测和荧光成像。
Description
技术领域
本发明属于荧光传感检测技术领域，具体来说涉及一种pH响应型共轭聚合物纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
细胞内的pH值对细胞增殖与凋亡、离子传输、酶活性、细胞内吞以及肌肉收缩等许多生理过程起着至关重要的作用。正常细胞的细胞质pH值处于6.8-7.4，酸性细胞器的pH值为4.5-6.0。异常的pH值会引起细胞功能紊乱，导致心、肺病变或神经性疾病，甚至危及生命。因此精确监测细胞内pH值的变化可以为生理学、药物学、病理学等研究提供重要参数。目前，pH值的测定通常是使用商品化的玻璃电极，不适用于活细胞中pH值的监测。荧光分析技术具有灵敏度高、选择性好，优异的时空分辨性，便于实时获得直观、准确的样品信息。利用荧光探针结合荧光分析技术检测细胞的pH值是一种非侵入、操作简单、灵敏度高的理想方法。目前报道的pH探针大部分基于小分子荧光染料，这些探针光稳定性差，stocks位移小，灵敏度低，水溶性差，毒性较大，无法对pH值的变化进行长时间的追踪和观察。因此开发弱酸性范围内有线性响应的pH探针仍是非常必要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种侧链含有氨基的聚噻吩衍生物。
本发明的另一目的是提供所述聚噻吩衍生物的制备方法。
本发明的另一目的是提供pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液中的pH响应型共轭聚合物纳米粒子，其以聚噻吩为荧光报告基团，侧链氨基为pH响应性基团，利用相转化法构建了一种在弱酸性范围(pH＝5.0-7.4)有线性响应的共轭聚合物纳米粒子荧光探针。
本发明的另一目的是提供pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在测定弱酸性水溶液的pH值中的应用。
本发明的另一目的是提供pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在肿瘤细胞微环境响应的灵敏检测和荧光成像中的应用。
pH响应型共轭聚合物纳米粒子由于聚集诱导的荧光淬灭效应，共轭聚合物纳米粒子几乎不发射荧光。在酸性条件下，共轭聚合物侧链含氨基，易在弱酸性条件下质子化。在静电斥力的驱使下，共轭聚合物纳米粒子(pH响应型共轭聚合物纳米粒子)迅速解离，恢复无规线团构象，体系的荧光开启。根据共轭聚合物荧光强度与pH的线性关系曲线，可用于水溶液中弱酸性pH值的精确测量，也可用于肿瘤细胞微环境响应的灵敏检测和荧光成像。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种侧链含有氨基的聚噻吩衍生物，其结构通式如下：
其中，R1为氢或甲基，R2为氢或饱和烷基链，X为氧原子或硫原子，m和n均为正整数。
上述聚噻吩衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将4-位上为氢或甲基的3-溴噻吩衍生物加入至NMP中，待溶解后，得到溶液A，将溶液A加入至含有Y的甲醇溶液中，得到溶液B，在所述溶液B中加入溴化亚铜和/或丁基锂，在氮气或惰性气体保护下回流反应至少24h，得到溶液C；将所述溶液C冷却至室温20～25℃，过滤，将滤液旋干，再加入二氯甲烷溶解，水洗至少3次，得到第一有机相液体，在第一有机相液体中加入无水硫酸镁，用于干燥该第一有机相液体，过滤，将第一有机相液体旋干，得到产物D，其中，所述3-溴噻吩衍生物的物质的量份数、NMP的体积份数、甲醇溶液的体积份数、溴化亚铜的物质的量份数和丁基锂的物质的量份数的比为(14～16)：(3～4)：20：10：(0～10)，所述3-溴噻吩衍生物的结构通式为：
Y为甲醇钠或甲硫醇钠；
在所述步骤1中，在所述含有Y的甲醇溶液中，Y的质量体积浓度为35％。
在所述步骤1之后，将所述产物D经柱层析纯化。
在所述步骤1中，所述3-溴噻吩衍生物的物质的量份数与步骤1中所述二氯甲烷的体积份数的比为1：(14～18)。
在所述步骤1中，所述3-溴噻吩衍生物的物质的量份数与步骤1中的二氯甲烷的体积份数的比为1：(2-4)。
步骤2，将所述产物D、反应物E和NaHSO4加入至无水甲苯中，在氮气或惰性气体保护下回流反应6～12小时，冷却至室温20～25℃，用水洗至少3次，得到第二有机相液体，用无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥所述第二有机相液体，过滤，旋干二氯甲烷得到产物F，其中，按物质的量计，所述产物D、反应物E和NaHSO4的比为(7～12)：(17～26)：(2～3)，所述产物D的物质的量份数与所述无水甲苯的体积份数的比为(7～12)：20，所述反应物E的结构通式为：
R3为亚甲基链；
在所述步骤2之后，将所述产物F经柱层析纯化。
步骤3，将产物F、仲胺、碳酸钾和碘化钾加入到丙酮中，回流反应8～10小时，冷却至室温20～25℃，抽滤除去不溶的盐，得到溶液G，旋干所述溶液G中的丙酮，再加入二氯甲烷并溶解，得到溶液H，用水洗所述溶液H至少三次，得到第三有机相液体，用无水硫酸钠干燥所述第三有机相液体，过滤，得到溶液I，旋干所述溶液I中的二氯甲烷，得到产物J，其中，按物质的量计，所述产物F、仲胺、碳酸钾和碘化钾的比为(9～11)：(89～90)：(54～55)：(4～5)；
在所述步骤3中，所述产物F的质量份数与所述丙酮的体积份数的比为(9～11)：100。
在所述步骤3中，所述产物F的物质的量份数与步骤3中所述二氯甲烷的体积份数的比为(9～11):30。
在所述步骤3之后，将所述产物J经柱层析纯化。
步骤4，将所述产物J溶于氯仿中，得到溶液K，在惰性气体或氮气的保护下，将溶液K滴加至混合溶液中，在20～35℃反应72～84小时，冷却至室温20～25℃，旋蒸除去氯仿，得到固体，将所述固体溶解在甲醇中，得到溶液L，向所述溶液L中加入氨水，在搅拌条件下于室温20～25℃保持6～12小时，离心后得到暗红色固体，以甲醇作为溶剂用索氏提取法提取暗红色固体12～24小时，再以氯仿作为溶剂用索氏提取法提取至提取管中的氯仿无色，将抽提所得到的氯仿浓缩至体积为V1mL，再在V2mL的正己烷中沉降，收集沉降所得固体，真空干燥，得到所述聚噻吩衍生物，其中，V1：V2＝(2～3)：100，所述混合溶液为氯仿和无水三氯化铁的混合物，所述混合溶液中氯仿的体积份数与所述无水三氯化铁的物质的量份数的比为100:(13～16)；按物质的量计，所述产物J和无水三氯化铁的比为(2～4)：(13～16)；按体积份数计，所述混合溶液中氯仿、溶解所述固体的甲醇和氨水的比为100：300：90。
在所述步骤4中，干燥的温度为35℃，干燥时间为8小时。
在上述技术方案中，获得溶液K且溶有所述产物J的氯仿的体积份数与所述产物J的物质的量份数的比为25：(2～4)。
在上述技术方案中，所述物质的量份数的单位为mmol，所述体积份数的单位为mL。
pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液的制备方法，包括以下步骤：
S1，将超纯水和无水乙腈混合均匀，得到混合液，其中，按体积份数计，所述超纯水和无水乙腈的比为9：1；
S2，将混合液于20～35℃保持超声状态，将母液滴加到混合液中，滴加完毕后继续超声1～2小时，得到溶液M；其中，按体积份数计，所述母液与所述混合液的比为2：30，所述母液的制备方法为：将所述聚噻吩衍生物溶解于氯仿中，得到聚噻吩衍生物的浓度为1～2mg/mL的母液；
在所述S2中，所述超声的功率为10～100W。
在所述S2中，将母液滴加到混合液中：将母液均分成4份，4份先后依次滴加至超声中的混合液中，每份滴加完毕后上下振动50～70次，其中，滴加的速度为0.1～0.15mL/min。
S3，向所述溶液M中通入氮气，除去氯仿和乙腈，得到pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液。
上述pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液中的pH响应型共轭聚合物纳米粒子，pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液通过冷冻干燥获得pH响应型共轭聚合物纳米粒子。
上述pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在测定弱酸性水溶液的pH值中的应用。
在上述技术方案中，在pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液中加入不同体积的乙酸水溶液，用于得到不同pH的建模溶液，用激发光分别激发不同pH的所述建模溶液，获得所述建模溶液的发射光光谱，以所述建模溶液的发射光光谱波峰的强度值和所述建模溶液的pH值为X轴和Y轴，形成一坐标系，绘制一所述建模溶液的标准曲线，将待测溶液的发射光光谱波峰的强度值代入所述标准曲线，确定该待测溶液的pH。
在上述技术方案中，所述pH的调节范围为5～8，所述建模溶液的pH依次为8.0、7.7、7.3、7.0、6.5、6.1、5.6和5.1。
在上述技术方案中，激发光的波长为440nm。
在上述技术方案中，所述乙酸水溶液的浓度为0.01～0.1M。
上述pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在肿瘤细胞微环境响应的灵敏检测和荧光成像中的应用。
在上述技术方案中，在室温20～25℃下，将细胞培养在所述pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液中1-2h，调节细胞环境的pH值小于7.4，通过共聚焦显微镜，实现pH响应型共轭聚合物纳米粒子在Hela细胞中的pH依懒性的荧光成像。
本发明的pH响应型共轭聚合物纳米粒子具有生物相容性良好、荧光强度高和毒性低等特性，可用于水溶液中弱酸性pH值的精确测量，也可用于肿瘤细胞微环境响应的灵敏检测和荧光成像。
具有的优点和有益效果如下：
1.用于合成pH响应型共轭聚合物纳米粒子的原料易得，合成方法简单，条件温和；
2.pH响应型共轭聚合物纳米粒子毒性低，生物相容性好，可用于肿瘤细胞微环境响应的灵敏检测与成像。
3.pH响应型共轭聚合物纳米粒子探针检测原理简单，无新物质生成，检测结果准确度高。
附图说明
图1为pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在不同pH值水溶液中的荧光光谱；
图2为pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液的荧光发射强度与pH值的线性关系曲线；
图3为pH响应型共轭聚合物纳米粒子(探针)在不同pH水溶液中荧光发射强度与响应时间的关系曲线；
图4为pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液对Hela细胞的荧光成像图，其中，图4a为pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在pH为7.4的Hela细胞中的荧光成像图，图4b为pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在pH为6.0的Hela细胞中的荧光成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
在下述实施例的步骤1中，在含有Y的甲醇溶液中，Y的质量体积浓度为35％。
下述实施例中，物质的量份数的单位为mmol，体积份数的单位为mL。
实施例1
聚3-(3-N,N’-二乙基)丙氧基-4-甲基噻吩的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将3-溴-4-甲基噻吩(2.5g,14mmol)加入至3.8mL NMP(N-甲基吡咯烷酮)中，待完全溶解后，得到溶液A，将溶液A加入至20mL含有甲醇钠的甲醇溶液中，得到溶液B，在溶液B中加入溴化亚铜(1.5g,10mmol)，在氮气保护下回流反应24h，得到溶液C；将溶液C冷却至室温20～25℃，过滤，将滤液旋干，再加入30mL二氯甲烷溶解，水洗3次，得到第一有机相液体，在第一有机相液体中加入无水硫酸镁，用于干燥该第一有机相液体，过滤，将第一有机相液体旋干，得到作为粗产物的产物D，其中，3-溴-4-甲基噻吩的结构式为：
在步骤1中，将作为粗产物的产物D经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：正己烷)，得到1.3g 3-甲氧基-4-甲基噻吩(产率72.2％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.74(s,1H),6.08(d,1H),3.74(s,3H),2.01(s,3H)。
步骤2，将3-甲氧基-4-甲基噻吩(1.5g，11.7mmol)、反应物E(3.6g，25.9mmol)和NaHSO4(300mg，2.5mmol)加入至20mL无水甲苯中，在氮气保护下回流6小时，冷却至室温20～25℃，用水洗3次，得到第二有机相液体，用无水硫酸钠干燥第二有机相液体，过滤，旋干二氯甲烷，得到作为粗产物的产物F，其中，反应物E为3-溴-1-丙醇，其结构式为
在步骤2之后，将作为粗产物的产物F经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：正己烷)，得到3-(3'-溴)丙氧基-4-甲基噻吩(1.0g，产率34％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.90-6.81(m,1H),6.22-6.16(d,1H),4.12-4.06(m,2H),3.64-3.55(t,2H),2.37-2.28(m,2H),2.10(s,3H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:155.8,129.1,120.1,96.5,67.4,32.4,30.1,12.8。
步骤3，将3-(3'-溴)丙氧基-4-甲基噻吩(2.5g,10.8mmol)、二乙胺(6mL,89.8mmol)、碳酸钾(7.5g,54.3mmol)和碘化钾(675mg,4.1mmol)加入到100mL丙酮中，回流反应8小时，冷却至室温20～25℃，抽滤除去不溶的盐，得到溶液G，旋干溶液G中的丙酮，再加入30mL二氯甲烷并溶解，得到溶液H，用水洗溶液H三次，得到第三有机相液体，用无水硫酸钠干燥第三有机相液体，过滤，得到溶液I，旋干溶液I中的二氯甲烷，得到作为粗产物的产物J。
在步骤3之后，将产物J经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：按体积分数计，乙酸乙酯、甲醇和三乙胺＝88:10:2)，得到3-(3'-N,N'-二乙基)丙氧基-4-甲基噻吩(2.2g，产率90％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.83-6.79(m,1H),6.17-6.14(d,1H),4.01-3.95(t,2H),2.65-2.54(m,6H),2.10(s,3H),1.97-1.89(m,2H),1.07-0.98(t,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:156.1,129.2,119.6,96.2,68.1,49.5,47.2,26.9,12.8,11.8。
步骤4，将3-(3'-N,N'-二乙基)丙氧基-4-甲基噻吩(700mg,3.1mmol)溶于25mL无水氯仿中，得到溶液K，在氮气的保护下，将溶液K滴加至混合溶液中，在室温20～25℃反应72小时，旋干氯仿，得到固体，将固体溶解在300mL甲醇中，得到溶液L，向溶液L中加入90mL氨水，在搅拌条件下于室温20～25℃保持12小时，离心后得到暗红色固体，以甲醇作为溶剂用索氏提取法提取暗红色固体24小时，再以氯仿作为溶剂用索氏提取法提取至提取管中的氯仿无色，将抽提所得到的氯仿浓缩至体积为2mL，再在100mL的正己烷中沉降，收集沉降所得固体，真空干燥(干燥的温度为35℃，干燥时间为8小时)，得到聚噻吩衍生物——聚3-(3'-N,N'-二乙基)丙氧基-4-甲基噻吩(400mg，产率57％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.03-3.80(t,2H),2.73-2.49(m,6H),2.30(s,3H),2.02-1.87(m,2H),1.11-0.96(t,6H)。其中，混合溶液为无水氯仿(100mL)和无水三氯化铁(2.5g,15.5mmol)的混合物。
实施例2
聚3-(4-N,N’-二乙基)丁硫基-4-甲基噻吩的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将3-溴-4-甲基噻吩(2.5g,14mmol)加入至3.8mL NMP(N-甲基吡咯烷酮)中，待完全溶解后，得到溶液A，将溶液A加入至20mL含有甲硫醇化钠的甲醇溶液中，得到溶液B，在溶液B中加入溴化亚铜(1.5g,10mmol)和丁基锂(60mg，9.3mmol)，在氮气保护下回流反应24h，得到溶液C；将溶液C冷却至室温20～25℃，过滤，将滤液旋干，再加入30mL二氯甲烷溶解，水洗3次，得到第一有机相液体，在第一有机相液体中加入无水硫酸镁，用于干燥该第一有机相液体，过滤，将第一有机相液体旋干，得到作为粗产物的产物D，其中，3-溴-4-甲基噻吩的结构式为：
在步骤1之后，将作为粗产物的产物D经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：正己烷)，得到3-甲硫基-4-甲基噻吩(1.05g，产率51.7％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.73(s,1H),6.71(d,1H),2.74(s,3H),2.21(s,3H)。
步骤2，将3-甲硫基-4-甲基噻吩(1.05g，7.3mmol)、反应物E(3.0g，17.7mmol)和NaHSO4(300mg，2.5mmol)加入至20mL无水甲苯中，在氮气保护下回流反应10小时，冷却至室温20～25℃，用水洗3次，得到第二有机相液体，用无水硫酸镁干燥第二有机相液体，过滤，旋干二氯甲烷，得到产物F，其中，反应物E为4-溴-1-丁醇，其结构式为：
在步骤2之后，将作为粗产物的产物F经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：正己烷)，得到3-(4'-溴)丁硫基-4-甲基噻吩(1.1g，产率57％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.73(s,1H),6.72(s,1H),3.30(m,2H),2.93(t,2H),2.21(s,3H),1.79(m,2H)1.69(m,2H)。
步骤3，将3-(4'-溴)丁硫基-4-甲基噻吩(2.5g,9.4mmol)、二乙胺(6mL,89.8mmol)、碳酸钾(7.5g,54.3mmol)和碘化钾(675mg,4.1mmol)加入100mL到丙酮中，回流反应8小时，冷却至室温20～25℃，抽滤除去不溶的盐，得到溶液G，旋干溶液G中的丙酮，再加入30mL二氯甲烷并溶解，得到溶液H，用水洗溶液H三次，得到第三有机相液体，用无水硫酸钠干燥第三有机相液体，过滤，得到溶液I，旋干溶液I中的二氯甲烷，得到产物J。
在步骤3之后，将作为粗产物的产物J经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：按体积份数计，乙酸乙酯、甲醇和三乙胺＝88:10:2)，得到3-(4'-N,N'-二乙基)丁硫基-4-甲基噻吩(1.9g，产率78％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.73(s,1H),6.72(s,1H),2.93(t,2H),2.40(t,4H),2.36(t,2H),2.21(s,3H),1.69(m,2H),1.39(m,2H),1.0(t,6H)。
步骤4，将3-(4'-N,N'-二乙基)丁硫基-4-甲基噻吩(700mg,2.7mmol)溶于25mL无水氯仿中，得到溶液K，在氮气的保护下，将溶液K滴加至混合溶液中，在35℃反应72小时，冷却至室温20～25℃，旋干氯仿，得到固体，将固体溶解在300mL甲醇中，得到溶液L，向溶液L中加入90mL氨水，在搅拌条件下于室温20～25℃保持12小时，离心后得到暗红色固体，以甲醇作为溶剂用索氏提取法提取暗红色固体24小时，再以氯仿作为溶剂用索氏提取法提取至提取管中的氯仿无色，将抽提所得到的氯仿浓缩至体积为2mL，再在100mL的正己烷中沉降，收集沉降所得固体，真空干燥(干燥的温度为35℃，干燥时间为8小时)，得到聚噻吩衍生物——聚3-(4'-N,N'-二乙基)丁硫基-4-甲基噻吩(380mg，产率54.2％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:2.93(t,2H),2.40(m,6H),2.31(s,3H),1.69-1.39(m,4H),1.10-0.95(t,6H)。其中，混合溶液为无水氯仿(100mL)和无水三氯化铁(2.2g,13.6mmol)的混合物。
实施例3
聚3-(5-N,N’-二甲基)戊硫基噻吩的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将3-溴噻吩(2.5g,15.3mmol)加入至3.8mL NMP(N-甲基吡咯烷酮)中，待溶解后，得到溶液A，将溶液A加入至20mL含有甲硫醇化钠的甲醇溶液中，得到溶液B，在溶液B中加入溴化亚铜(1.5g,10mmol)和丁基锂(60mg，9.3mmol)，在氮气保护下回流反应24h，得到溶液C；将溶液C冷却至室温20～25℃，过滤，将滤液旋干，再加入30mL二氯甲烷溶解，水洗3次，得到第一有机相液体，在第一有机相液体中加入无水硫酸镁，用于干燥该第一有机相液体，过滤，将第一有机相液体旋干，得到产物D；
在步骤1之后，将作为粗产物的产物D经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：正己烷)，得到3-甲硫基噻吩(1.0g，产率50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.17(d,1H),6.87(s,1H),6.86(d,1H),2.47(s,3H)。
步骤2，将3-甲硫基噻吩(1.5g，11.7mmol)、反应物E(3.6g，19.6mmol)和NaHSO4(300mg，2.5mmol)加入至20mL无水甲苯中，在氮气保护下回流12小时，冷却至室温20～25℃，用水洗3次，得到第二有机相液体，用无水硫酸钠干燥第二有机相液体，过滤，旋干二氯甲烷得到产物F，其中，反应物E为5-溴-1-戊醇，其结构式为：
在步骤2之后，将作为粗产物的产物F经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：正己烷)，得到3-(5'-溴)戊硫基噻吩(1.6g，产率51.6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.17(d,1H),6.87(s,1H),6.86(d,1H),3.3(t,2H),2.93(t,2H),1.79(m,2H),1.69(m,2H),1.29(m,2H)。
步骤3，将3-(5'-溴)戊硫基噻吩(2.5g,9.4mmol)、二甲胺(二甲胺体积为6.2mL,89.8mmol)、碳酸钾(7.5g,54.3mmol)和碘化钾(675mg,4.1mmol)加入到100mL丙酮中，回流反应8小时，冷却至室温20～25℃，抽滤除去不溶的盐，得到溶液G，旋干溶液G中的丙酮，再加入30mL二氯甲烷并溶解，得到溶液H，用水洗溶液H三次，得到第三有机相液体，用无水硫酸钠干燥第三有机相液体，过滤，得到溶液I，旋干溶液I中的二氯甲烷，得到产物J。
在步骤3之后，将作为粗产物的产物J经柱层析纯化(填充物：硅胶，洗脱液：按体积份数计，乙酸乙酯、甲醇和三乙胺＝88:10:2)，得到3-(5'-N,N'-二甲基)戊硫基噻吩(1.9g，产率88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.17(d,1H),6.87(s,1H),6.86(d,1H),2.93(t,2H),2.36(t,2H),2.27(s,6H),1.69(m,2H),1.29(m,2H),1.39(m,2H)。
步骤4，将3-(5'-N,N'-二甲基)戊硫基噻吩(700mg,3.1mmol)溶于25mL无水氯仿中，得到溶液K，在氮气的保护下，将溶液K滴加至混合溶液中，在35℃反应72小时，冷却至室温20～25℃，旋干氯仿，得到固体，将固体溶解在300mL甲醇中，得到溶液L，向溶液L中加入90mL氨水，在搅拌条件下于室温20～25℃保持12小时，离心后得到暗红色固体，以甲醇作为溶剂用索氏提取法提取暗红色固体24小时，再以氯仿作为溶剂用索氏提取法提取至提取管中的氯仿无色，将抽提所得到的氯仿浓缩至体积为2mL，再在100mL的正己烷中沉降，收集沉降所得固体，真空干燥(干燥的温度为35℃，干燥时间为8小时)，得到聚噻吩衍生物——聚3-(5'-N,N'-二甲基)戊硫基噻吩(500mg，产率71.4％)，其中，混合溶液为无水氯仿(100mL)和无水三氯化铁(2.5g,15.5mmol)的混合物。
pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液的制备方法，包括以下步骤：
S1，将超纯水和无水乙腈混合均匀，得到混合液，其中，按体积份数计，超纯水和无水乙腈的比为27：3；
S2，将混合液于35℃保持超声状态，超声的功率为100W，在混合液超声状态下，将母液滴加到混合液中：将母液均分成4份，4份先后依次滴加至超声中的混合液中，每份滴加完毕后上下振动60次；
滴加完毕后继续超声1小时，得到溶液M，其中，滴加的速度为0.1mL/min～0.15mL/min，按体积份数计，母液与混合液的比为2：30，母液的制备方法为：将聚噻吩衍生物溶解于氯仿中，得到聚噻吩衍生物的浓度为1mg/mL的母液；
S3，向溶液M中通入氮气，除去氯仿和乙腈，得到pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液。
按照上述pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液的制备方法将实施例1～3制备所得的聚噻吩衍生物制成pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液。
pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在测定弱酸性水溶液的pH值中的应用，将2mL实施例1所得pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液装至石英比色皿中，在pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液中逐渐加入不同体积的乙酸水溶液，用于得到不同pH的建模溶液，pH的调节范围为5～8。用440nm激发光分别激发不同pH的所述建模溶液，获得所述建模溶液的发射光光谱，以所述建模溶液的发射光光谱波峰的强度值和所述建模溶液的pH值为X轴和Y轴，形成一坐标系，绘制建模溶液的标准曲线，如图2所示。
建模溶液的发射光光谱波峰的强度值和所述建模溶液的pH值如下表：
将待测溶液的发射光光谱波峰的强度值代入所述标准曲线，确定该待测溶液的pH，待测溶液具体如下：
待测溶液的实际pH值的检测工具为：pH计(EL20梅特勒托利多仪器有限公司)
将待测溶液的发射光光谱波峰的强度值代入所述标准曲线后，通过标准曲线确定该待测溶液的pH与该待测溶液的实际pH相同。
图1是实施例1pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在不同pH值水溶液中的荧光光谱。图中表明：在440nm波长的光激发下，共轭聚合物纳米粒子探针水溶液在pH＝8荧光强度低，几乎不发射荧光。随着水溶液酸性的增强，共轭聚合物在575nm处的荧光强度逐渐增强。
图2是实施例1pH响应型共轭聚合物纳米粒子探针荧光发射强度与pH值的线性关系曲线。图中表明：在570nm处的荧光发射强度变化与溶液的pH值呈良好的线性关系。
图3是实施例1pH响应型共轭聚合物纳米粒子探针在不同pH值的水溶液中荧光发射强度与响应时间的关系曲线。图中表明：pH响应型共轭聚合物纳米粒子探针在不同pH值的水溶液中均能快速、灵敏的响应，荧光发射强度达到稳定。
上述pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在肿瘤细胞微环境响应的灵敏检测和荧光成像中的应用，将Hela细胞培养在实施例1所得pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液中，分别调节细胞pH值至7.4和6.0，实现Hela细胞的pH依懒性的荧光检测与成像。图4是共轭聚合物纳米粒子探针的细胞荧光成像图。其中，图4a是探针在pH为7.4的细胞中的荧光成像图，图4b是探针在pH为6.0的细胞中的荧光成像图。图中表明：共轭聚合物纳米粒子探针可以穿透细胞膜进入细胞内部，对Hela细胞进行成像，并且对Hela细胞的pH有依赖性的荧光变化，可实现了正常细胞与肿瘤细胞的区分。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (18)
1.侧链含有氨基的聚噻吩衍生物的制备方法，聚噻吩衍生物的结构通式如下：
其中，R1为氢或甲基，R2为氢或饱和烷基链，X为氧原子或硫原子，m和n均为正整数，其特征在于，聚噻吩衍生物的制备方法包括以下步骤：
步骤1，将4-位上为氢或甲基的3-溴噻吩衍生物加入至NMP中，待溶解后，得到溶液A，将溶液A加入至含有Y的甲醇溶液中，得到溶液B，在所述溶液B中加入溴化亚铜和/或丁基锂，在氮气或惰性气体保护下回流反应至少24 h，得到溶液C；将所述溶液C冷却至室温20~25℃，过滤，将滤液旋干，再加入二氯甲烷溶解，水洗至少3次，得到第一有机相液体，在第一有机相液体中加入无水硫酸镁，用于干燥该第一有机相液体，过滤，将第一有机相液体旋干，得到产物D，其中，所述3-溴噻吩衍生物的物质的量份数、NMP的体积份数、甲醇溶液的体积份数、溴化亚铜的物质的量份数和丁基锂的物质的量份数的比为（14~16）：（3~4）：20：10：（0~10），所述3-溴噻吩衍生物的结构通式为：
，Y为甲醇钠或甲硫醇钠；
步骤2，将所述产物D、反应物E和NaHSO4加入至无水甲苯中，在氮气或惰性气体保护下回流反应6~12小时，冷却至室温20~25℃，用水洗至少3次，得到第二有机相液体，用无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥所述第二有机相液体，过滤，旋干二氯甲烷得到产物F，其中，按物质的量计，所述产物D、反应物E和NaHSO4的比为（7~12）：（17~26）：（2~3），所述产物D的物质的量份数与所述无水甲苯的体积份数的比为（7~12）：20，所述反应物E的结构通式为：
，R3为亚甲基链；
步骤3，将产物F、仲胺、碳酸钾和碘化钾加入到丙酮中，回流反应8~10小时，冷却至室温20~25℃，抽滤除去不溶的盐，得到溶液G，旋干所述溶液G中的丙酮，再加入二氯甲烷并溶解，得到溶液H，用水洗所述溶液H至少三次，得到第三有机相液体，用无水硫酸钠干燥所述第三有机相液体，过滤，得到溶液I，旋干所述溶液I中的二氯甲烷，得到产物J，其中，按物质的量计，所述产物F、仲胺、碳酸钾和碘化钾的比为（9~11）：（89~90）：（54~55）：（4~5）；
步骤4，将所述产物J溶于氯仿中，得到溶液K，在惰性气体或氮气的保护下，将溶液K滴加至混合溶液中，在20~35℃反应72~84小时，冷却至室温20~25℃，旋蒸除去氯仿，得到固体，将所述固体溶解在甲醇中，得到溶液L，向所述溶液L中加入氨水，在搅拌条件下于室温20~25℃保持6~12小时，离心后得到暗红色固体，以甲醇作为溶剂用索氏提取法提取暗红色固体12~24小时，再以氯仿作为溶剂用索氏提取法提取至提取管中的氯仿无色，将抽提所得到的氯仿浓缩至体积为V1 mL，再在V2 mL的正己烷中沉降，收集沉降所得固体，真空干燥，得到所述聚噻吩衍生物，其中，V1：V2=（2~3）：100，所述混合溶液为氯仿和无水三氯化铁的混合物，所述混合溶液中氯仿的体积份数与所述无水三氯化铁的物质的量份数的比为100:（13~16）；按物质的量计，所述产物J和无水三氯化铁的比为（2~4）：（13~16）；按体积份数计，所述混合溶液中氯仿、溶解所述固体的甲醇和氨水的比为100：300：90。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，在所述含有Y的甲醇溶液中，Y的质量体积浓度为35%。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1之后，将所述产物D经柱层析纯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，所述3-溴噻吩衍生物的物质的量份数与步骤1中所述二氯甲烷的体积份数的比为1：（14~18）。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，所述3-溴噻吩衍生物的物质的量份数与步骤1中的二氯甲烷的体积份数的比为1：（2-4）。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤2之后，将所述产物F经柱层析纯化。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，所述产物F的质量份数与所述丙酮的体积份数的比为（9~11）：100。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，所述产物F的物质的量份数与步骤3中所述二氯甲烷的体积份数的比为（9~11）:30。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤3之后，将所述产物J经柱层析纯化。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤4中，干燥的温度为35℃，干燥时间为8小时。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，获得溶液K且溶有所述产物J的氯仿的体积份数与所述产物J的物质的量份数的比为25：（2~4）；
所述物质的量份数的单位为mmol，所述体积份数的单位为mL。
12.pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将超纯水和无水乙腈混合均匀，得到混合液，其中，按体积份数计，所述超纯水和无水乙腈的比为9：1；
S2，将混合液于20~35℃保持超声状态，将母液滴加到混合液中，滴加完毕后继续超声1~2小时，得到溶液M；其中，按体积份数计，所述母液与所述混合液的比为2：30，所述母液的制备方法为：将权利要求1~11中任意一项所述制备方法获得的聚噻吩衍生物溶解于氯仿中，得到聚噻吩衍生物的浓度为1~2 mg/mL的母液；
S3，向所述溶液M中通入氮气，除去氯仿和乙腈，得到pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，在所述S2中，所述超声的功率为10~100W。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，在所述S2中，将母液滴加到混合液中：将母液均分成4份，4份先后依次滴加至超声中的混合液中，每份滴加完毕后上下振动50~70次，其中，滴加的速度为0.1 ~ 0.15 mL/min。
15.pH响应型共轭聚合物纳米粒子，其特征在于，获得方法为：将权利要求12~14中任意一项所述制备方法获得的pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液通过冷冻干燥，得到pH响应型共轭聚合物纳米粒子。
16.如权利要求12~14中任意一项所述制备方法获得的pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在测定弱酸性水溶液的pH值中的应用。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，在pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液中加入不同体积的乙酸水溶液，用于得到不同pH的建模溶液，用激发光分别激发不同pH的所述建模溶液，获得所述建模溶液的发射光光谱，以所述建模溶液的发射光光谱波峰的强度值和所述建模溶液的pH值为X轴和Y轴，形成一坐标系，绘制一所述建模溶液的标准曲线，将待测溶液的发射光光谱波峰的强度值代入所述标准曲线，确定该待测溶液的pH。
18.如权利要求17所述pH响应型共轭聚合物纳米粒子水溶液在肿瘤细胞微环境响应的灵敏检测和荧光成像中的应用。
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