JPS61164160A - ハイブリツド化分析による検出のための核酸の光化学的標識付け方法 - Google Patents

ハイブリツド化分析による検出のための核酸の光化学的標識付け方法

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JPS61164160A
JPS61164160A JP61000819A JP81986A JPS61164160A JP S61164160 A JPS61164160 A JP S61164160A JP 61000819 A JP61000819 A JP 61000819A JP 81986 A JP81986 A JP 81986A JP S61164160 A JPS61164160 A JP S61164160A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はハイブリッド化分析（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎａｓｓａｙ）Ｋ適する標識核酸プローブ（ｐｒｏｂ
ｅ）の提供に関するものである。
ヨーロッパ特許順相８４１０７６２４．３号においては
、標識核酸を製造するための光化学的方法を記している
。分析はヨーロッパ特許第８４１０７２４８、１に記さ
れている種類のものである。
ヨーロッパ特許８４１０７６２４．３の標識プロ−ブは
（ａ）核酸成分、（ｂ）核酸成分に光化学的に結合させ
た核酸結合配位子（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ、ｂｉｎ
−ｄｉｎｇｌｉｇａｎｄ）、及び（ｃ）化学的に（ｂ）
に結合させた標識から成っている。これらのプローブは
一般に全く申し分なく働らくが、場合によってはその性
能を改善することが望ましいことがある。かくして、本
発明の目的は向−ヒした溶解性を有するプローブを提供
すること、かかるプローブの製造の効率を増大させるこ
と、及び分析におけるプローブの感度を向上させること
にある。
これら及びその他の目的並びに利点は、（ａ）核酸成分
、（１））該核酸成分に光化学的に結合させた核酸結合
配位子、（Ｃ）標識及び（ｄ）化学的に（ｂ）と（Ｃ）
を結合するスペーサーから成る標識核酸プローブを提供
するものである本発明によって、実現することができる
。
スペーサーは、炭素、酸素、窒素及び硫黄から成るグル
ープから選択した、約５０原子に至るまで、好ましくは
約２〜２０原子の連鎖を包含することが好都合である。
このようなスペーサーはペプチド、炭化水素、ポリアル
コール、ポリエーテル、ポリアミド、ポリイミン及び炭
水化物から成るグループ、たとえば−グリシル−グリシ
ル−グリシル−又はその他のオリゴペプチド、たとえば
−ＮＨ−（ＣＨ２）５　−Ｃｏ−のような−アミノ−ア
ルカン−カルボニル基、スペルミン又はスペルミジン基
、たとえば　−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−又は−ＮＦ
Ｔ−ＣＨ，−ＣＴ−Ｔ２−ＮＨ−のようなω−アルカン
ジアミン基などから選択した多官能性の一員とすること
ができる。糖、ポリエチレンオキシド基、グリセリル、
ペンタエリトリトールなどの基もまたスペーサーとして
用いることができる。これらのスペーサーは直接に核酸
結合配位子及び／又は標識に対して結合していてもよい
し、あるいは結合は、たとえばジチオビススクシンイミ
ジルプロピオネ−）、１．４−ブタンジオールジグリシ
ジルエーテル、ジインシアネート、カルボジイミド、グ
リオキサール、グルタルアルデヒドなどのようなカップ
ラ−の２価の基を含んでいてもよい。
スペーサーは、上に定義したプローブ ａ　−ｂ　−ｄ　−ｃ の製造プロセスの任意の段階で組み入れることができる
。かくして、順序は以下の ａ　−４−ｂ　−４−ｄ　＋　ｃ　。
ｂ＋ｄ＋ｃ＋ａ。
ｄ＋ｃ＋ｂ＋ａ。
ｂ　＋　ｄ　＋　ａ　＋ｃ　、その他、の何れであって
もよい。個々の段階に対する灸件は化学において公知で
ある。
ヨーロッパ特許第８４１０７６２４．３号中に記すよう
に、核酸はフロクマリン又はフエナントリジン化合物の
ような光反応性の化合物又はたとえハネトロプシン、ジ
スタマイシン、ヘキスト３３２５８及びビスベンズイミ
ダゾールのような非内位添加化合物を使用して、核酸を
光化学的に配位子に鋳金させることによって、螢光検出
を包む、通常の方法で”読み取り°′すなわち分析する
ことができる標識に対して核酸を結合させる。かくして
最終生成物は（ａ）核酸成分、（ｂ）核酸成分に光化学
的に結合させた内位添加化合物（ｉｎｔｅｒｃａ−Ｉａ
ｔｏｒ）又はその他の核酸結合配位子、及び（ｃ）化学
的に（ｂ）に対して結合させた標識から成る標識核酸プ
ローブである。
アンゲリシン誘導体は下式を有している：親ｆヒ合物　
Ｒ，ｌ　　Ｒ・、ＦＬＩＴ’ｌ・番）（ＨＨＨ ＣＨ３ＨＣＨ３Ｈ ＣＨ５ＣＨ３ＣＨ，ＯＨ，０Ｈ ＣＨ３Ｈ０Ｈ３ＣＨ，０Ｈ３ ＣＨ８ＨＣＴ（３Ｃ）Ｔ、Ｎ）Ｔ。
ＣＨ８ＨＣＨ３０Ｈ２ＣＩ　　　。
異なるＲ１、Ｒ２、Ｒ８、Ｒ４を有する多くのその他の
化合物は、後記の公知の手順に従って合成することがで
きる。
Ｒ８及びＲ３がメチルであり、Ｒ２がＨであシ且つＲ４
が−ＣＨ２ＮＨ，である例、　（ＲＮＨ２）Ｘ＝ａ、が
含酸されている。
Ｒ１〜Ｒ２は−Ｈ，−ＯＨ，アルキル、アルコキシル、
カルボニル、カルバルコキシルとすることができ、 Ｒζ及ヒＲ４は−Ｈ，−ＯＨ，アルキル、アルコキシル
、カルボキシル、カルバルコキシル及びＸ−Ｙとするこ
とができ、 ここでＸは以下のものであり、 −Ｃ−（ＣＡＴ、）。−Ｙ −Ｎ−（Ｃ）！、）。−Ｙ −Ｃ−Ｎ−（ＣＨ，）　ｎ−Ｙ −〇−Ｎ−ポリアミンーＹ　ポリアミンの重合度＝１〜
３Ｏ −Ｃ−ＮＣ−Ｎ−ポリエーテ ル−−Ｎ−ポリアルコールーＹ Ｃ−５− Ｃ−０− Ｙはビオチンのような標識である。
３と几＊ＮＨ６との反応 ここでＲ＊ＮＨ２は または 又は アングリシンＳ１アムト（Ａｍｔ）、ダウオマイシン、
アミノアクリジンである。記載のその他の内位添加化合
物は、リンカ−（Ｉｉｎｋｅｒ）及び核酸のための標識
を有するように同様に変性することができる。
新規光化学的方法は、生化学的に感応性の物質に対する
通常の化学的カップリング方法よりも有利な反応条件を
提供する。照射に対する適切な波長を用いることによっ
て、ＤＮＡＸＲＮＡ及び蛋白質を重合体の本来の構造に
影響を及ぼすことなく変性することができる。以下にお
いて内位添加化合物によって例示する核噴結合配位子及
び標識を先ず結合させ、次いでそれを核酸と光反応させ
ることができ、あるいは核酸を先ず内位添加化合物と光
反応させ、次いで標識と結合させることができる。二本
鎖ＤＮＡによって例示した核酸の、たとえば、ハブテン
又は酵素のような標識に対するカップリングに対する全
般的なスキームは次のとおりである： 標識 ＋ 光反応性内位添加化合物 プローブのハイブリッド化可能な部分が二本鎖形態にあ
る場合は、かかる部分を次いで変性してハイブリッド可
能な一本鎖部分を与える。あるいは、標識ＤＮＡが既に
一本鎖形態にあるハイブリッド化可能な部分から成る場
合には、このような変性を、望むならば、回避すること
ができる。あるいはまた、検出すべき因果関係の存在疋
おいてのみ二本鎖ＤＮＡを生じるハイブリッド化方式を
用いてハイブリッド化を生じさせたのちに本発明の方法
によって二本鎖ＤＮＡを標識付けすることができる。
特異的で且つ効率的な光化学生成物を与えるためには、
核酸成分と光反応性内位添加化合物を、−１６二 暗所で特定的な仕方で反応させることが望ましい。
ＤＮＡへのカップリングに対しては、アミノメチルブソ
ラレン、アミノメチルアンゲリシン及びアミノアルキル
エチジウム又はメチジラムアジドが特に有用な化合物で
ある。こ名、らは二本＠ＤＮＡに結合し且つその複合体
のみが光付加物を与える。
標識付けした二本鎖ＤＮＡを７１イブリッド化可能々−
末鎖領域を与えるために変性しなければならない場合に
おいては、ＤＮＡの二本鎖と単一の光付加物との同時的
な相互作用を防止するような条件を使用する。プローブ
のノ・イブリッド化可能な一本鎖部分に沿う変性の頻度
は−・イブリッド化を実質的に妨げるほど大きくないこ
とが必要であり、それ故、ヌクレオケト塩基２５当り、
より一般的には５０当り、且つ好ましくは１００当シに
１つよシも多くの変性部位が存在しないことが好捷しい
。アンゲリシン誘導体はモノ付加物の生成のためにブソ
ラレン化合物よシもすぐれている。−末鎖プロープをい
くらかの余分の二本鎖ＤＮＡに対して共有結合させる場
合には、フエナン）　ＩＪジム及びブソラレン化合物は
暗所において二本鎖ＤＮＡに対して特異的に作用するこ
とから、これらの化合物の使用が望ましい。以下にさら
に詳細に説明する、標識付けのために核酸を変性すべき
試薬の合成に対する化学は、あらゆる場合に対して同様
である。
核酸咬分は一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡあるいは
制限酵素によって製造されるもののような断片あるいは
比較的短かいオリゴマーすら、使用することができる。
核酸成分を標識に対して結合させるために用いる本発明
の核酸結合配位子は、公知の核酸結合配位子の任意の適
当々光反応性形態とすることができる。特に好適な核酸
結合配位子は、たとえばフロクマリン類、たとえばアン
ゲリシン（イソプロラレン）又はプソラレンあるいは核
酸と光化学的に反応するそれらの誘導体、たとえば４′
−アミノメチル−４，５′−ジメチルアンゲリシン、４
′−アミノメチルートリオキサレン（４′−アミノメチ
ル−４，５’、８−）リメチループンラレン、３−カル
ボキシ−５−又はτ８−アミノー又は−ヒドロキシープ
ソラレン、並びにモノ−又はビス−アジドアミノアルキ
ルメチジラムあるいはエチジウム化合物のような内位添
加化合物である。種々のその他の内位添加化合物の光反
応性形態もまた、以下の表中に例示するように、使用可
能である。
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　−一　　　　　　Ｈづ×　　−≧　　　　　４ ヘヘ豐ト Ｕ　　　　　　に）　　　　　　−四 −−〇− ４ｒＪ−Ｑ％−、Ｍ ’／　　　　　　　　　ｔ’）’ このような内位添加化合物の特に有用な光反応性形態は
アジド内位添加化合物である。それらの反応性二トレン
は長波長紫外光又は可視光において容易に生じ且つアリ
ールアジドのニトレンは、それらの転移生成物よりも挿
入反応が優先する〔ホワイトら、メソツズインエンチモ
ル（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）４６：６
４４（１９７７）］。代表的なアジド内位添加化合物は
３−アジドアクリジン、９−アジドアクリジン、エチジ
ウムモノアジド、エチジウムジアジド、エチジウムモノ
アジド（ミッチェルら、ＪＡＣ８，１０４：　４２６５
（１９８２）〕、４−アジド−７−クロロキノリン及び
２−アジドフルオレンである。その他の有用な光反応性
内位添加化合物はフロクマリンであシ、これはピリミジ
ン残基と共にＣ２＋２］環状゛付加物を形成する。たと
えばビスークロロエｆルアミン及びエポキシド又はアジ
リジン、たとえば、アフラトキシン、多環炭化水素エポ
ギシド、ミドマイシン、及びノルフィリン人のようなア
ルキル化剤をも使用することができる。
２５一 本発明に従って核酸成分に結合させる標識は検出できる
物理的及び化学的性質を有する任意の化学原子団又は残
基とすることができる。標識はそれを内位添加化合物に
化学的に結合させることを可能とする官能性の化学基を
有している。このような標識術は材料は免疫検定の分野
において十分に開発されており、一般にこのような方法
において有用な大部分の標識を本発明に対して適用する
ことができる。特に有用なものは、たとえば酵素〔クリ
ニカルケミストリー（ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｅｍ）（１９
７６）２２：１２４３参照〕、酵素基質（英国特許第１
．Ｆ１４８，７４１号参照）、補酢素（米国特許第４．
２３０．７９７号及び４．２３８．５６５号参照）、及
び酵素抑制剤（米国特許第４，１３４，７９２号）のよ
うな酵素的に活性なグループ；螢光剤（クリニカルケミ
ストリー（１９７９）、２５：３５３参照）及びフィコ
ビリたんば〈質を包含する発色団：たとえば化学ルミネ
センス剤及び化ルミネセンス剤（クリニカルケミストリ
ー（１９７９）２５：５１２及び同上１５３１参照）；
特異的績合性配位子；及び、たとえばＨ−、８，Ｐ。
１２５工、及び１４Ｃのような放射性同位元素を包含す
る残基である。このような標識は、それら自体の化学的
性質（たとえば、螢光剤、螢色団及び放射性同位元素）
又はそれらの反応性あるいは結合性（たとえば酵素、基
体、補酵素及び抑制剤）に基づいて検出される。たとえ
ば、補足因子標識核酸は、標識がそれに対する補足因子
となる酵素及び酵素に対する基質を加えることによって
検出することができる。ハプテン又は配位子（たとえば
ビオチン）標識核酸はハプテンに対する抗体又は抗体断
片あるいは検出可能な分子で標識付けしだ配位子と結合
する蛋白質（たとえばアビジン）を加えることによって
検出することができる。このような検出可能な分子は、
測定可能な物理的性質（たとえば螢光又は吸光性）を有
するか又は酵素反応に関与する（たとえば、前記の表参
照）ある種の分子とすることができる。たとえば、基質
に対して作用して測定可能な物理的性質をもつ生成物を
与える酵素を使用することができる。後者の例はガラク
トシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、パパイン及び
ペルオキシダーゼを包含するが、これらに限定されるも
のではない。その場におけるハイブリッド化の研究に対
しては、最終生成物が水に不溶性であることが理想的で
ある。その他の標識はこの分野の通常の専門家１（は明
白であろう。
標識は、たとえば共有結合を包含する直接の化学結合に
よって、又はマイクロカプセル又はリポソーム中への組
み込みと一方においてそれらのカプセル又はリポソーム
の内位添加化合物への結合というよう々間接的な結合に
よって、内位添加化合物に結合させることができる。標
識を内位添加化合物に結合させるための方法は、この分
野において本質的に公知であり且つ本発明を遂行するた
め如は任意の便宜的な方法を用いることができる。
内位添加化合物を先ず標識と化学的に結合させ、そのの
ちに核酸成分と結合させることが有利である。たとえば
、ビオチンはカルボキシル基を含有しているから、フロ
クマリンの光化学的反応性又はビオチンの生物学的活性
を妨害することなしに、それをアミド又はエステルによ
ってフロクマリンと結合させることができる、たとえば
、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド十Ｂ、ＮＨ
，−一→ ビオチン−ｐ−ニトロフェニルエステル−２９＝ １例として、 ビオチン　ニトロフェニル　エステル その他のアミノメチルアンゲリシン、ブソラレン及びフ
エナントリジウム誘導体は、たとえばフエナントリジウ
ムハロゲニド及びたとえばアミノプロピルメチジウムク
ロリドのようなその誘導体におけるように、同様に反応
させることができる、すなわち、 〔ハーソバーグら、ジャーナルオブアメリカンケミカル
ソサエティー１０４　：３１３（１９８２）参照〕 あるいは、たとえばジチオビススクシンイミジルプロピ
オネート又は１．４−ブタンジオールジグリシジルエー
テルのような２官能性の試剤は、溶剤、成分の出車及び
反応東件に関して同じく公知のようにして、反応物がア
ルキルアミノ残基を有している場合に、標識を伴なう光
化学的に反応性の分子を結合させるために直接に使用す
ることができる。ある種の２官能性試剤、たとえばグル
タルアルデヒドは、結合はするけれども、核酸を変性し
て分析を妨害するおそれがあるために、適当ではないも
のと思われる。このような問題を防ぐだめには慣例的な
注意をはらえばよい。
標識核酸の製造においては特定の順序を変更することが
できる。かくして、たとえば、アミノ置換したプソラレ
ンを先ず光化学的に核酸と結合させることができ、ペン
ダントアミノ基を有するその生成物を、そのアミノ基に
よって標識に対して結合させることができる。あるいは
捷た、プソラレンを先ずだとえげ酵素のような標識に対
して、次いで核酸（Ｃ対して結合させることもできる。
核酸結合配位子と標識の間のスペーサーの鎖長は炭化水
素又はペプチドによって延長することができる。典型的
な例は、Ｊ、Ｌ、デカラント及びＪ。
ローノ、ホトケミストリーホトビオロジ−３７，１５５
〜１６１　（１９８３）Ｋよって記された方法に従かう
ハロゲン化アルキルを用いる８−ヒドロキシプソラレン
誘導体の延長を包含する。次いでハロアルキル化誘導体
を、Ｗ、Ａ、サフランら、プロイージングナショナルア
カデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、Ｕ、８゜Ａ、７９．４５９４
（１９８２）に記されているように、チオール又はアミ
ンと反応させて反応性の生成物を与える。
標識が酵素である場合には、たとえば、生成物を最後的
に適当な媒体上に置いて、触媒の程度を定量する。かく
して、酵素がホスファターゼである場合には、媒体は燐
酸ニトロフェニルを含有していればよく、生成するニト
ロフェノールの量を□色の観測によって監視すればよい
。酵素がガラクトシダーゼである場合には、媒体は同じ
くニトロフェノールヲ遊離する０−ニトロフェニル−Ｄ
−ガラクト−ピラノシドを含有すればよい。
本発明の標識核酸は、すべての通常のハイブリッド化分
析方式に対して適用することができ、且つ一般にハイブ
リッド化生成物又は標識核酸を包含する凝集物の生成に
基づく任意の方式が可能である。特に、本発明の独特の
標識プローブは、溶液及び固相ハイブリッド化方式にお
いて使用することができるが、後者の場合には試料又は
プローブ核酸の固定を包含する方式及びサンドインチ方
式が含まれる。
に相補的な又はそれと相同的な少なくとも１つの一重鎖
塩基配列から成っている。しかしながら、このような塩
基配列は単一の連続的なポリヌクレオチド分節である必
要はなく、非相同的な分節によって中断された２種以上
の個々の分節から成ることができる。これらの非相同分
節は線状であってもよいし、又はそれらは自己相補的で
且つヘアピンループを形成してもよい。その上に、プロ
ーブの相同領域は、生長のために相同分節が挿入させで
ある、特定ベクトルのＤＮＡ又はＲＮＡ　から成るもの
のように、３′−及び５′−末端において非相同分節側
面的に接していてもよい。何れの場合においても、分析
試薬として提供されるプローブは、１つ以上の点忙おい
て対象とする試料核酸との検出可能なハイブリッド化を
示す。線状又は環状の一本鎖ポリヌクレオチドをプロー
ブ要素として使用することができ、その大部分または小
部分は、必須の相同分節が一本鎖形態にあって試料ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ　　とのハイブリッド化が可能である限シ
において、相補的なポリヌクレオチド鎖と重複していて
もよい。有用なプローブは、相同プローブ分節が本質的
に一本鎖形態のみにある線状また環状プローブを包含す
る〔特に、ツー及びメシング、ジーｙ（Ｇｅｎｅ）１７
：２７１　（１９８２）参照〕。
本発明の標識プローブは、任意の通常のハイブリッド化
方法において使用することができる。改良が成されるに
つれて且つ概念的に新しい方式が開発されるにつれて、
それらを容易に本発明の標識プローブに対して適用させ
ることができる。特に有用な通常のン・イブリッド化方
式は、試料の核酸またはポリヌクレオチードブローブを
固体担体上に固定化する方法（固相ハイブリッド化）及
びポリヌクレオチド種がすべて溶液中に存在している方
法（溶液ハイブリッド化）を包含する。
固相ハイブリッド化方式においては、ハイブリッドに関
与するポリヌクレオチド種の一つを適当な方法でその一
本鎖形態で固体担体に固定する。
有用な固体担体はこの分野で公知であって、共有結合又
は非共有結合の何れかによって核酸を結合するものがあ
る。一般に疎水結合を包含するものと理解されている非
共有結合性担体は、たとえばＦ紙又は固体のシートのよ
うな挿々の形態にある、たトエばニトロセルロース、ナ
イロン誘導体及びフッ素化ポリ炭化水素のような、天然
産及び合成重合体材料を包含する。共有結合担体もまた
有用であって、ポリヌクレオチドに対して結合するよう
に活性化することができる、たとえばジクロロトリアジ
ン、ジアゾベンジロキシメチルなどのような、化学的に
反応性の基を有する材料から成るものである。
典型的な固相ハイブリッド化方法は試料核酸の一本鎖形
態での担体上への同定化によって始まる。
この初期段階は本質的に試料からの相補鎖の再アニール
を防止すると共に、検出性を増大させるように試料物質
を濃縮するだめの手段としても用いることができる。ポ
リヌクレオチドプローブを次いで担体と接触させ且つ本
萌細書中に記すような標識の測定によってハイブリッド
化を検出する。
固体担体は検出すべき分節に対してハイブリッド化した
標識プローブを混成しなかったプローブから分離するた
めの便利な手段を提供する。
興味あるもう一つの方法はサンドイツチノ・イブリッド
化方法であって、この方法においては、プローブの相同
性分節の二つの相互に排他的な断片の中の一方を固定化
し他方を標識付けする。問題とするポリヌクレオチド分
節の存在は、固定化断片と標識プローブ断片への二元的
なノ・イブリッド化を生じさせる。これ以上の詳細につ
いては酵素学の諸方法、６５：４６８（１９８０）及び
ジーｙ（Ｇｅｎｅ）２１　ニア７〜８５（１９８３）を
参照されたい。
光化学的に反応性の残基を標識に直接に結合させるため
に２官能性の試剤を用いる代りに特別のリンカ−残基を
組み込むことができる。これは次のような利点を有して
いる： １、検出できる標識とＤＮＡの表面の間の距離を立体的
な拘束を最適化するように変えることができる。
、　ｚ　リンカ−の適当な選択が複合体の溶解性を２、
リンカ−の適当な選択が複合体の溶解性を向上させるこ
とができる。
３、リンカ−の適当な選択が巳次的な反応に対する特異
点を提供することができる。たとえば、ペプチド残基を
たんばく質分解的に消化して標識を溶液中に解放させる
ことができる。
４、　カチオン性リンカ−を用いることによって標識化
合物の全体的結合親和性を増大させることができる。こ
れは光反応の効率の向上を助けるものと思われる。
本発明を以下の非限定的な実施例に従って説明する。
実施例１ ペプチドスペーサー メリフィールドの合成手順［：Ｒ，Ｂ、メリフィールド
、ジャーナルオプアメリカンケミカルソサエティー、８
５．２１４９　（１９６３）　］に従って、グリシルグ
リシルグリシル（Ｇ’ＧＧ）に結合させたポリスチレン
■を合成して下記構造（以下Ｐ−ＣＨ２ＧＧＧと記す）
を形成させる：１ｆのＰ−ＣＨ，−ＧＧＧ　［約０．５
ミリモル当量のトリペプチド（ＧＧＧ）］を３Ｑｄのジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に懸濁させ、十分に振
とうし、その懸濁液に２５０■の固体ジシクロへキシル
カルボジイミドと２５０Ｔｎ９のビオチンを加える。生
じる混合物を室温（２０〜２５℃）で１５時間保つ。ポ
リスチレン樹脂（ビオチンに結合したＰ−ＣＨ，−ＧＧ
Ｇ）を洗浄して未反応のビオチンとその他の副生物を除
く。洗浄は架橋したポリスチレン担体を攻撃することが
ない任意の溶剤によって行なわれる（たとえば、洗浄は
ＤＭＦ、エタノールなどを用いて行なうことができる）
。
生じる生成物をエタノール性の水酸化ナトリウムで処理
する。下記の式（ＧＧＧ−Ｂ）を有する生成物を含有す
る重合体を２０．２５ａ／のエタノールと２．２５Ｊｌ
１７の２Ｎ水酸化す）　ＩＪウム水溶液の混合物によっ
て室温で３０分間処理する。
混合物をガラスフィルターを用いて濾過したのち、直ち
に水酸化ナトリウム水溶液で中和する。
次いで減圧下に蒸発乾固する。
乾ｆｉＤＭＦ中でビオチンｐ−ニトロフェニルエステル
をＧＧＧ−Ｂと反応させることによっても同様な生成物
が生じる。この反応はカルボジイミドを必要としない。
ビオチンと活性化ペプチドリンカ−を含有する試剤は以
下の手順によって製造することができる。
この試剤は任意の脂肪族第一アミン含有分子に結合させ
ることができる。上記のメリフィールド合成を僅かに変
更した方法によって、１〜１００又はそれ以上の原子の
スペース長さを有する分子をスペーサーとしてビオチン
と核酸結合配位子の間に導入することができる。スペー
サーの長さの選択は標識、たとえば、ビオチン、を使用
するために遂行すべき反応の種類によって決定される。
ビオチンの代シにフルオレセインイソチオシアネー）　
（ＦＩＴＣ）を用いる反応はフルオレセイン結合スペー
サーを与える。ＦＩＴＣを用いる反応はペプチドを担体
から遊離させたのちに遂行することができる。
実施例２ １００１ｎｇノ化合物ＧＧＧ−Ｂ、　５０１ｆｆｌ；＋
７７）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び３０■のジシ
クロへキシルカルボジイミドを１０ｄのＤＭＦ’中に導
入する。その溶液を室温で１５時時間表うする。次いで
生じる混合物を一２０’Ｃで８時間冷却する。
この冷却はジシクロ−ヘキシル尿素の溶解度を低下させ
る。生じる懸濁物を冷却遠心分離機中で２０００Ｇで遠
心分離する。溶液を減圧下に蒸発させて下記化合物を取
得する。
ＧＧＧ−Ｂ　はジイミドの存在においてもアミン（−Ｎ
Ｈ２）と直接に反応する。
実施例３ 炭化水素スペーサー 標識、たとえば、ビオチンと光化学的に核酸と反応する
アミンの間のスペーサー分子（ＣＨ２）。を製造するた
めには、以下の段階が用いられる。
段階（１）。
段階（２）： カルボジイミドによる活性化 ０．５ｆの６−アミノカプロン酸（ｎ＝５、ＡＣＡ）と
１．５２のｎ−ヒドロ中シースクシイミドビオチンを１
０ｄのジメチルホルムアミド中に導入する。
反応を室温で２４時時間桁させる。ＤＭＦを減圧下に蒸
発させる。生成物Ｂ−ＡＣ，Ａ　（ｎ　＝　５　）はそ
のままアミンとの反応に使用することができ又はＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドによって活性化してＢ−ＡＣＡ
−ＮＨ８を生成させることができる。
８０　ｍ９（Ｄ　Ｂ−Ａ’ＣＡ　（ｎ　＝　５　）、５
０ｍのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び３０ｍ９のジ
シクロへキシルカルボジイミドを１０１７のＤＭＦ中で
混合する。溶液を室温で１５時間振とうし、−２０℃で
４時間冷却したのち、遠心分離する。溶液を減圧下に蒸
発乾固してＢ−ＡＣＡ−ＮＨ８（ｎ　＝　５　）を取得
する。生成するＢ−ＡＣＡ−ＮＨ８は直ちに第一アミン
との反応に用いることができる。
実施例４ ポリアミドスペーサー 下記の方法は、反応性部位上してカルボキシル（−ＣＯ
ＯＨ）基をもつカルボキシプソラレン、アンゲリンン、
アジドフエナントリジウム、アジドアシジン及びその桶
のアジド光反応性化合物において、使用することができ
る。
モノアジドｐ−カルボキシメチジウムクロリドのアシル
イミダゾールエステル（１ｆ）とスペルミン（５り）を
、１：３シア′ミノプロパンによる反応に対するＲ、　
Ｐ、ノ・−ツパーグ及びＰ、ダーバン、ジャーナルオブ
アメリカンケミカルソサエティー、１０４．３１３（１
９８２）に記されてｂるようＫ、５ｏ’の乾燥ジメチル
スルホキシド中に導入する。それによって生じる生成物
を５ｔの固体Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドピオチンと
反応させる。
溶剤としてメタノールを用いるセファデックスＬＨ２０
上のカラムクロマトグラフィーによって−４゜５− Ｍ５ＰＢを未反応物質から精製する。
実施例５ １ｆの１．４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと
１ｆのＡＭＴ（下記実施例７に記す）を１Ｎ水酸化す）
　ＩＪウム溶液中で混合する。４℃で１時間ののちに、
０．５ｆのエチレンジアミンを加える。反応を４℃で終
夜進行させる。生成する混合物を次いでＨＣＩによって
ｐＨ７，５に中和したのち、３ｆのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドビトンを４ｄＯＤＭＦ中で加える。反応を２
４時時間桁させる。生成物をセファデックスＩ、Ｈ２０
カラム（ファーマシア）中で精製する。生成物（ＡＭＴ
−ＰＧ−Ｂ）を最初に溶出する。
実施例６ ジメチルアンゲリシン（ＡＭＡ）の反応ＮＨ８−ＧＧＧ
−ＢとＡＭＡをＤＭＦ／Ｈ２０（９：１）混合物中で２
＝１のモル比で混合する。溶液を終夜機械的に撮とうし
、次いで大過剰のグリシンを加えて未反応のエステルを
不活性化する。溶剤を減圧下に蒸発させ、化合物を、セ
ファデックスＬＨ２０カラム上でメタノール−水（８：
２０）混合物を溶剤として使用して、クロマトグラフィ
ーにかける。溶出した生成物（Ｂ−ＧＧＧ−ＡＭＡ）の
Ｍ度をＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム：　メタノー
ル：酢酸８：１：１）によって定量する。
−４７＝ （Ｂ−（）ＧＧ−ＡＭＡ） 実施例７ ＡＭＡの代りにＡＭＴを用いる以外は実施例７と同様な
手順を用いて（Ｂ−ＧＧＧ−ＡＭＴ）を製造する。
４８一 実施例８ ＮＨ８−ＧＧＧ−Ｂの代りにＢ−ＧＧＧ−ＡＭＴ又はＢ
−ＧＧＧ−ＡＭＡを用いる以外は実施例７と同一の手順
を使用して化合物Ｂ−ＡＧＡ−ＡＭＴ及びＢ　−ＡＣＡ
−ＡＭＡを製造する。
（Ｂ−Ａ−ＣＡ−ＡＭＡ） 実施例９ Ｂ−ＧＧＧ−ＡＭＡのＤＮＡプローブに対する光化〒カ
ップリング及びハイブリッド化分析におけるその使用： １００ダの大腸菌ＤＮＡをｌ　ｍｌのトリスＥＤＴＡ（
１０Ｕトリス　１ｍＭ　ＥＤＴＡ：　ｐＨ７，２）中に
溶解し、そ（７）ＤＮＡ溶液に１０１ｎ９（７）　Ｂ−
ＧＧＧ　−ＡＭＡ（１０ｍの１ｍｇ／ｄの溶液）を加え
る。生成する混合物を３４６　ｎｍで３０分間照射する
。次いで混合物を透析して未反応のＢ−ＧＧＧ−ＡＭＡ
を除去する。次いで試料をエタノールで沈殿させる。次
いで標識プローブを大腸菌ＤＮＡ（試験試料）とのハイ
ブリッド化に対する能力について試験する。
大腸菌ＤＮＡ（１ｍｇ）をニトロセルロース紙上に固定
化しくヨーロッパ特許明細書筒８４１０７２４８、１参
照）、標識プローブとハイブリッド化させる。
試験ＤＮＡ試料を０．１ｍＮａＯＨで５分間処理し、次
いで氷冷する。試料を等容量の０．１ＮＨＣ１゜０．９
ＭＮａ（”：ｌ　　、　　０．０９Ｍ　＜えん酸Ｎａを
用いて中和し、次いで僅かな吸引下にあらかじめ０．９
　ＭＮａＣ＋、０．０９Ｍ＜えん酸Ｎａ中に浸漬させで
あるニトロセルロースフィルター（＆、！：、ｔＪｆ、
シーＬライヒヤーアンドシュエルからのＢｉ１２）を用
いて濾過する。次いでフィルターを６ＸＳＳＣＣ］×標
準食塩くえん酸溶液（Ｓｔａｎｄａｒｄ　５ａｌｉｎｅ
Ｃ４ｔｒａｔｅ）は０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５
Ｍ（えん酸Ｎａである〕、次いで７０％エタノールで洗
浄したのち、８０℃において減圧下に数時間又は常圧で
６５℃において終夜熱処理する。この時点において、フ
ィルターは直ちにハイブリッド化手順に対して使用でき
る。
ハイブリッド化の程度を、マセスダリサーチラボラトリ
ー、メリーランド、アメリカから市販されているビオチ
ン分析キットによって測定する。
ハイブリッド化手順は一本鎖ＤＮＡを包含しているから
、その上に試料ＤＮＡが固定化しであるニトロセルロー
スフィルターは、未知のＤＮＡ　と検出プローブがそれ
に無差別に結合することがないように予備処理しなけれ
ば々らない。このような処理は一般に、デンハート氏溶
液〔水中のそれぞれ２％の中の血清アルブミン、フイコ
ル（ｆｉ−ｃｏｌｌ）　　及びポリビニルピロリドン〕
として公知の混合物中のたんば〈質と多糖によって戸紙
上の有効部位を飽和させることから成っており、この溶
液中に、何らかの塩及び緩衝剤（たとえば、６ｘＳＳＣ
，０，１Ｍ）リス、ｐＨ８）と共に、ハイブリッド化の
ために使用すべき温度（たとえば６５℃）において数時
間浸漬する。次いでこの予備浸漬液を変性試料（未知）
ＤＮＡ及び変性検出剤プローブを包含するハイブリッド
化媒体に取り替え、且つＤＮＡのアニールを数時間にわ
たって進行させる。代表的な二つのハイブリッド化条件
は次のものである： （１）　　６ｘＳＳＣ，０，１Ｍ）リス、ｐ）１８．６
５℃、デンハート氏溶液の包含は任意的： （Ｉｆ）　　４ＸＳＳＣ，４０％ホルムアミド、４０℃
、士デンハート氏溶液。必要な液の容量を最適とするた
めに、且つ蒸発を防止するために、ハイブリッド化は、
しばしば、平らに押し付は且つ密封しであるプラスチッ
ク類の袋中で行なわれる。
ハイブリッド化ののちに、セレクタープローブに対して
確実に塩基対合させであるＤＮＡを、ハイブリッド安定
性を保持するために広範なアニールを必要とする溶液中
に一連のフィルターを浸漬することによって、フィルタ
ーから洗浄する。たとえば、フィルターを大量の２ｘＳ
ＳＣ中に６５℃において２間取シ替えて浸漬しく低い塩
濃度において貧弱に塩基対合したハイブリッドは解離す
る）、次いで大量の２×ＳＳＣ中に室温において２間取
シ替えて浸漬する。次いでフィルターをＰ紙でぬぐうこ
とによって乾燥する。
５３一 本明細書及び特許請求の範囲は例証のために示したもの
であって限定のためではないこと、並びに種々の修飾及
び変更を本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行
なうことができるということは明白であろう。
特許出願人　モレキュラー・ダイアクリスティックスｅ
インコーポレーテッ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）核酸成分、（ｂ）該核酸成分に光化学的に結
    合させた核酸結合配位子、（ｃ）標識及び（ｄ）化学的
    に（ｂ）と（ｃ）を結合するスペーサーから成ることを
    特徴とする標識核酸プローブ。 ２、スペーサーは炭素、酸素、窒素及び硫黄から選択し
    た約５０原子に至るまで、好ましくは２〜２０原子の連
    鎖を包含することを特徴とする、特許請求の範囲第１項
    記載のプローブ。 ３、スペーサーはペプチド、炭化水素、ポリアルコール
    、ポリエーテル、ポリアミン、ポリイミン、及び炭水化
    物から成るグループから選択したメンバーの多官能性基
    から成ることを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載
    のプローブ。 ４、スペーサーは−グリシル−グリシル−グリシル−又
    は −ＨＮ−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−ＮＨ−、又は−ＮＨ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿５−ＣＯ−、又は −ＮＨ−（ＣＨ＿２）＿６−ＮＨ−、又は スペルミン、又は スペルミジン であることを特徴とする、第１〜３項記載のプローブ。 ５、スペーサーは２価の基すなわちカップラ−によつて
    （ｂ）及び（ｃ）の中の少なくとも１つに結合している
    ことを特徴とする、第１項記載のプローブ。 ６、核酸結合配位子はアクリジン染料、フエナントリジ
    ン、フエナジン、フロクマリン、フエノチアジン及びキ
    ノリン並びにアントラサイクリンから選択した内位添加
    化合物であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項
    記載のプローブ。 ７、内位添加化合物はフロクマリン又はフエナントリジ
    ンであることを特徴とする、特許請求の範囲第６項記載
    のプローブ。 ８、内位添加化合物は、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中で Ｒ＿１、Ｒ＿２及びＲ＿３はそれぞれ独立的に水素又は
    低級アルキルであり、且つ Ｒ＿４は水素、低級アルキル又はヒドロキシによつて置
    換してある低級アルキル、低級 アルコキシ、アミノ、ハロ及び／又は ▲数式、化学式、表等があります▼ である、 の化合物、好ましくは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の４′−アミノメチル−４′，５′−ジメチル−アンゲ
    リシンであることを特徴とする、特許請求の範囲第６及
    び７号記載のプローブ。 ９、内位添加化合物は、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中で Ｒ、Ｒ＿１、Ｒ＿２及びＲ＿３はそれぞれ独立的に水素
    又は低級アルキルであり、 Ｒ＿４は水素、低級アルキル又はヒドロキシによつて置
    換してある低級アルキル、低級 アルコキシ、アミノ、ハロ及び／又は ▲数式、化学式、表等があります▼ であり、且つ Ｒ＿５は水素、ヒドロキシ、カルボキシ、カルボ−低級
    アルコキシ又は低級アルコキシ である、 の化合物、好ましくは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物であることを特徴とする、特許請求の範囲第６
    及び７項記載のプローブ。 １０、試験試料を標識核酸プローブとのハイブリッド化
    条件にさらし、且つその生成物を該標識の存在について
    分析することから成る試料中の特定核酸の存在の決定の
    ための方法にして、該プローブは（ａ）核酸成分、（ｂ
    ）核酸成分に光化学的に結合させた核酸結合配位子、（
    ｃ）標識及び（ｄ）化学的に（ｂ）と（ｃ）を結合する
    スペーサーから成ることを特徴とする該方法。 １１、核酸プローブを化学的に官能化させた核酸結合化
    合物、好ましくは内位添加化合物と接触させ、該プロー
    ブと該核酸結合化合物を光化学的照射にさらして共有結
    合反応を達成し、且つさらにその反応生成物を化学的に
    官能化させた部分に対してスペーサー化合物を経て標識
    を結合させるべき反応にさらすことを特徴とする、標識
    核酸プローブの製造方法。
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