JP3515781B2 - ポリスチレン表面に核酸プローブを固定化する方法 - Google Patents

ポリスチレン表面に核酸プローブを固定化する方法

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    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの分
野に属する。より詳細には、本発明は、分析される核酸
を溶液から取り出す目的のために、ポリスチレン表面上
に核酸プローブを固定するための改良方法に関する。
背景技術 同一人に譲渡された米国特許第4,868,105号には、溶
液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ
が開示されている。このアッセイでは、分析される核酸
は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブの
セットとハイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセ
ットとハイブリダイズされる。次いで、プローブ−分析
物複合体は、捕獲プローブのセグメントに相補的である
固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。この
セグメントは固定化プローブにハイブリダイズするの
で、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形態
で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分
離工程が容易になる。最終的に、標識化プローブのセッ
トの一本鎖セグメントは標識プローブにハイブリダイズ
されるので、分析物含有複合体は、標識から直接または
間接的に生じたシグナルによって検出され得る。
同一人に譲渡された欧州特許出願（EP）第317077号に
は、米国特許第4,868,105号に記載のアッセイの変形が
開示されており、ここでは、標識プローブにより生じる
シグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの
使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌク
レオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結
合した核酸（分枝または直鎖状）に特異的にハイブリダ
イズするセグメント、ならびに、標識プローブに特異的
にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有する
ように構築されている。マルチマーを用いるアッセイで
は、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび
捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリダイ
ズさせ、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントと
ハイブリダイズする固定化核酸を含む他の容器に移すと
いう開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化
複合体にハイブリダイズされ、さらに、標識プローブは
マルチマーの第二のセグメントの反復にハイブリダイズ
される。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の
部位を提供するので、シグナルが増幅される。
1990年７月27日に出願された同一人に譲渡された同時
係属出願米国特許出願第558,897号（PCT WO92/02526）
には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム
型分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されて
いる。このコームは、より小さいマルチマーよりも強く
シグナルを増強する。
EP 317077に記載のように、２つの型の溶液相核酸サ
ンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ形式が使用
される：それはビーズアッセイ手順、およびマイクロタ
イタープレートアッセイ手順である。実際には、マイク
ロタイタープレートアッセイが、好ましい。ポリスチレ
ンマイクロタイタープレートのウェル中の捕獲プローブ
を固定する手順は、以下に示すとおりであった。ポリ−
（フェニルアラニル−リシン）を、プレートのウェル表
面上に受動的に吸着させた。固定化されるべきオリゴヌ
クレオチドを、固相法によって5'改変シチジン（シチジ
ンのN4−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル誘
導体）を有するように合成した。このオリゴヌクレオチ
ドを、改変シチジンと二価性架橋剤のエチレングリコー
ルビス−（スクシンイミジルスクシネート）との反応に
よって活性化し、そして、活性化オリゴヌクレオチド
を、ウェルに添加し、室温でインキュベートした。イン
キュベーションの間、架橋剤の他の官能基は、吸着した
ポリ−（フェニルアラニル−リシン）の一級アミノ基と
反応し、このためオリゴヌクレオチドを固定する。次い
で、ウェルをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄（w
ashed）し、HM緩衝液（0.1％SDS、４×SSC、1mg/mL音波
処理サケ精子DNA、1mg/mLポリ−Ａ、10mg/mLウシ血清ア
ルブミン）でコートし、PBSで再び洗浄し、そして使用
のために保存した。示されるように、捕獲プローブセッ
トおよび増幅プローブセットに対する、分析物の初期ハ
イブリダイゼーションを、塩基条件下で別のウェル中で
行った。ハイブリダイゼーション後、溶液を中和した。
そして、中和溶液を固定化プローブを含むウェル中に移
した。初期ハイブリダイゼーションは、固定化捕獲プロ
ーブを含んだウェル中では行われ得なかった。なぜな
ら、固定化複合体は、ハイブリダイゼーション条件下で
不安定であるからである。
本発明は、上記の従来の手順よりも優れるいくつかの
利点を提供する。第一に、本発明によれば、初期ハイブ
リダイゼーションを包含する全体のアッセイが、１つの
ウェル中で行われ得る。第二に、本発明は、アッセイの
再現性を改良する。最後に、大きなコーム型マルチマー
を用いるその好ましい実施態様において、バックグラウ
ンドシグナルを減少させる。
発明の開示 本発明の１つの局面は、溶液相核酸サンドイッチハイ
ブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第
一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に
固定化するための方法であって、この方法は以下の工程
を包含する： （ａ）強酸、強塩基および水で順次洗浄することにより
ポリスチレン表面を清浄化する（cleansing）工程； （ｂ）ポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマ
ーを受動的に吸着させる工程；および （ｃ）核酸プローブを、塩基安定性の連結を通じて、吸
着したポリマーに共有結合させる工程。
本発明の別の局面は、ポリスチレン表面上に吸着した
ポリマーおよび塩基安定性の連結を通じてポリマーに共
有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン表面を
包含する、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーシ
ョンアッセイにおいて用いるための製造物品である。
本発明のさらに別の局面は、試料中において分析され
る一本鎖核酸の存在を検出するための溶液相核酸サンド
イッチハイブリダイゼーションアッセイの改善であり、
ここで、アッセイが、以下の工程： （ａ）試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識
プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触さ
せる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析物
に相補的な第一セグメントおよびDNAマルチマーのセグ
メントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕獲
プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびポ
リスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに相
補的な第二セグメントを有する、工程； （ｂ）工程（ａ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
条件下で、ポリスチレン表面に固定化した該オリゴヌク
レオチドと接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
条件下で、該マルチマーと接触させる工程；および （ｄ）工程（ｃ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
条件下で、該マルチマーにハイブリダイズする標識オリ
ゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、 そして改良点は、工程（ｂ）において、吸着したポリマ
ーを通じてポリスチレン表面に固定化したオリゴヌクレ
オチドであって、塩基安定性の連結を通じて該吸着した
ポリマーに共有結合したオリゴヌクレオチドを使用する
ことである。
図面の簡単な説明 図面において、 図１は、実施例３に記載した実験結果のグラフであ
る。
図２−３は、実施例４に記載したプローブの部分配列
を載せている。
図４は、実施例４に記載した試験結果のグラフであ
る。
発明を実施するための形態 定義 本発明において用いられる共有結合を特徴付けるのに
使用される用語「塩基安定性」とは、４〜70℃の範囲の
温度で1N NaOHと接触したとき、または少なくとも溶液
相ハイブリダイゼーションアッセイにおける分析物に対
するプローブのハイブリダイゼーションにおいて使用さ
れる程度にストリンジェントな（例えば、模擬またはよ
りストリンジェントな）条件下で、実質的な分解（例え
ば、加水分解による共有結合の切断）が起こらない結合
を意味する。
用語「二価性架橋剤」は、２つの官能基を有する有機
分子を意図しており、ここで、官能基の内の１つは、試
薬とポリマーとの間に共有結合を形成するために、本発
明中で使用されているポリマーの官能基と反応し得、そ
して、もう１つの官能基は、試薬とプローブとの間に第
二の共有結合を形成するために、固定化される核酸プロ
ーブ上の官能基と反応し得る。得られた３成分の複合体
は、試薬の２つの官能基とポリマー上の官能基およびプ
ローブ上の官能基との間の反応を通じて、ポリマーおよ
びプローブの両方に共有結合する架橋剤を含む。好まし
くは、ポリマーおよびプローブ上の官能基は、一級アミ
ノ基であり、そして試薬上の官能基は、一級アミノ基と
反応する官能基から選択される（例えば、カルボキシル
基、塩化スルホニル基、またはアルデヒド基）。
用語「溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ」
は、同一人に譲渡された米国特許第4,868,105号およびE
P 317077に記載およびクレームされているアッセイ法を
意味する。
「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定
して取り込まれ得て、そして架橋剤の官能基と反応する
付加的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味す
る。
「マルチマー」とは、分析される核酸および多数の標
識プローブに、同時に直接または間接的にハイブリダイ
ズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマー
の分枝は、共有結合によりつくられ、そしてマルチマー
は、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸に
ハイブリダイズする核酸に対して、および多数の標識プ
ローブに対してハイブリダイズし得る、２つの型のオリ
ゴヌクレオチド単位で構成される。このようなマルチマ
ーの組成物および調製は、EP 317077およびWO92/02526
に記載されており、これらの開示内容は、本明細書中に
参考として援用されている。
ポリスチレン表面上のプローブの固定 以下の記載は、従来のポリスチレンマイクロタイター
プレートのウェル表面上にプローブを固定することを述
べているが、本発明の方法が、核酸サンドイッチハイブ
リダイゼーションにおいて用いられる他のポリスチレン
表面（例えば、粒子（ビーズ）、チューブ、フィルタ
ー、カラムなど）に、プローブを固定するのに用いられ
得ることは、認識される。
最初に、ポリスチレン表面を、強酸、強塩基、および
水性緩衝液で、連続して洗浄することにより清浄化す
る。酸は通常、0.1〜5Nの濃度での、塩酸、硝酸、また
は硫酸のような鉱酸である。塩酸（1N）が好ましい。表
面を、通常４〜37℃の範囲の温度で１〜60分間（好まし
くは約15〜20分間）、酸と接触させる。次いで、酸処理
をしたウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水のような中性
の水性緩衝液で洗浄する。強塩基は、通常0.1〜5Nの濃
度のアルカリ金属水酸化物（例えば、NaOH、KOH）であ
る。水酸化ナトリウム（1N）が好ましい。表面と塩基と
の間の接触時間は、通常１〜60分間であるが、好ましく
は約15〜20分間である。接触温度は、典型的には、再度
４〜37℃である。塩基処理に続いて、表面を中性の水性
緩衝液で再び洗浄する。
表面を、ポリマーでコートする。このポリマーは、好
ましくは多数の反応性の一級アミノ基を有するポリペプ
チドであって、そしてポリスチレン上で受動的に吸着さ
れるポリペプチドである。ポリペプチドは、典型的に
は、１分子当り平均して約10％〜100％の、一級アミン
含有アミノ酸残基を有する。ポリペプチドは、天然産生
タンパク質または合成ポリペプチドであり得る。合成ポ
リペプチドは、ホモポリマー（同じアミノ酸で構成され
ている）またはコポリマー（２種またはそれ以上のアミ
ノ酸で構成されている）であり得る。天然アミノ酸また
は合成アミノ酸のいずれかにある、スルフヒドリルまた
はカルボキシレートのような、他の反応性官能基が用い
られ得る。その分子量は、厳密ではなく、通常5,000〜5
0,000ダルトンの範囲内である。この資格内で使用され
得るポリペプチドの例は、ポリリシン、ポリ（Phe−Ly
s）、ポリ（Ala−Glu）、カゼイン、およびウシ血清ア
ルブミンである。30,000〜60,000の範囲の分子量を有す
るポリ（Phe−Lys）（phe:lysが1:1モル比）が、好まし
い。清浄化したポリスチレンを、ポリペプチドの中性
（pH6〜８）水性緩衝溶液と接触させることにより、コ
ーティングを行う。溶液中のポリペプチド濃度は、通常
0.01〜10mg/mlであるが、0.1〜1.5mg/mLが、より通例で
ある。溶液は、必要に応じて約5Mまでの濃度の塩を含有
し得る。ポリペプチドコーティング工程は、通常20℃〜
65℃で0.5〜36時間、好ましくは25〜35℃で15〜20時間
行われる。この処理に続き、表面を、中性の水性緩衝液
で繰り返し洗浄し、吸着していないあらゆるポリペプチ
ドを取り除く。必要に応じて、表面を、アッセイの初期
ハイブリダイゼーションの工程で用いられる条件を模擬
した条件か、またはよりストリンジェントな条件（pH、
イオン強度、デタージェント、プロテイナーゼ）にさら
して、初期ハイブリダイゼーションの間に脱落し得る吸
着したポリペプチドを脱落させ得る。
吸着したポリペプチドと共有結合する一本鎖のオリゴ
ヌクレオチドプローブは、Warnerら、DNA（1984）３:40
1に記載の自動化ホスホルアミデート法によって調製さ
れ得、そしてSanchez−PescadorおよびUrdea,DNA（198
4）３:339に従って精製され得る。それらは、5'改変ヌ
クレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを包含する。
そしてこれらは、反応部位を提供する官能基を含有して
おり、この反応部位により架橋剤にオリゴヌクレオチド
をカップリングさせる。好ましい改変ヌクレオチドは、
５−メチル−シチジンのN4−（６−アミノカプロイル−
２−アミノエチル）誘導体であり、それは米国特許第4,
868,105号に記載されている。他の改変ヌクレオチド
は、米国特許第4,948,882号に記載されている。オリゴ
ヌクレオチドプローブの長さおよび塩基組成は、それが
ハイブリダイズすべき核酸配列の長さおよび塩基組成に
依存する。その長さは通常15〜100ヌクレオチド、より
通例では20〜30ヌクレオチドである。21塩基のオリゴヌ
クレオチド5'−XCACCACTTTCTCCAAAGAAG−3'（EP 317077
に記載）、および5'−XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG−3'
（ここでＸはシチジンのN4−（６−アミノカプロイル−
２−アミノエチル）誘導体を表す）が、標準プローブ配
列として選択された。
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5'改変
ヌクレオチドの官能基と架橋剤の官能基の１つとの間の
反応を経て、塩基安定性の二価性架橋剤とカップリング
する。オリゴヌクレオチドが架橋剤の両方の官能基とカ
ップリングするのを避けるために、試薬は非常に過剰で
使用される（例えば、50倍〜1000倍過剰）。塩基安定
性、および、オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの
アミノ基との反応性の機械的標準が満たされる限り、種
々の架橋剤が使用され得る。適切な架橋剤の例は、Pier
ce Chemical Catalog中に見られ得る。カップリング反
応の条件は、使用した特定の試薬により変更する。現在
において、好ましい架橋剤は、ビス（スルホスクシンイ
ミジル）スベレートである。架橋剤は、通常極性溶媒ま
たは水性緩衝液に溶解され、そしてこの溶液は、水性緩
衝液および極性溶媒中のオリゴヌクレオチド溶液に添加
される。カップリングは、通常は中性（６−８）pH、お
よび４℃〜25℃の範囲の温度で約10分間〜18時間行われ
る。得られたオリゴヌクレオチド−架橋剤複合体（本明
細書中では、時に「活性化オリゴヌクレオチド」と呼ば
れる）は、従来のクロマトグラフィー手順を用いて、未
反応の開始物質および不要の反応生成物から精製され得
る。
次いで、架橋剤の残存官能基が、吸着したポリペプチ
ドのアミノ基と反応し得る条件下で、ポリペプチドでコ
ートした表面を、精製した活性化オリゴヌクレオチドの
中性水性緩衝化溶液と接触させる。典型的に、このカッ
プリング反応は、０℃〜25℃で0.5〜18時間、好ましく
は２℃〜８℃で８〜18時間、過剰な活性化オリゴヌクレ
オチド（10倍〜100倍過剰が好ましい）を用いて行われ
る。この反応が完了した後、表面を水性緩衝液で洗浄
し、表面から未反応の活性化オリゴヌクレオチドを除去
する。本方法のこの段階で、表面は、核酸プローブが架
橋剤を通じて共有結合した吸着したポリペプチドでコー
トされる。標準的なマイクロタイターウェルの場合、１
ウェル当りの固定化核酸プローブは、典型的に0.1〜10p
mol、好ましくは0.4〜0.7pmolである。この時点で、必
要に応じて、表面に二価性架橋剤をさらに添加し、プレ
ート表面上に残存するあらゆる反応基と反応させること
によって、プレートを「過カップリング（overcoupl
e）」し得る。
表面が増幅アッセイ手順で使用されるとき、特に、WO
92/02526の大きなコーム型マルチマーを使用するアッセ
イでは、アッセイの溶液相ハイブリダイゼーション工程
における主要な条件（pH、イオン強度、温度、デタージ
ェント）を模擬した条件に表面を置くのが好ましい。こ
のような処理は、溶液相ハイブリダイゼーション中で脱
落し得る、あらゆるポリペプチド−オリゴヌクレオチド
複合体を脱落させるのに役立つ。従って、このような場
合では、表面を、低濃度のデタージェント（例えば、0.
01〜2.0重量％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.
1〜0.5N NaOH）を含有する弱塩基溶液と25〜85℃で10〜
180分間接触させる。この最終処理の後、表面をアスピ
レートする。次いで、表面を水性緩衝液で洗浄する。そ
れは、使用するまで、湿度を制御した環境で０℃〜10℃
で貯蔵され得る。
溶液相ハイブリダイゼーションアッセイでのコートした
ポリスチレン表面の使用 コートしたポリスチレン表面は、以下の溶液相サンド
イッチハイブリダイゼーションで用いられる。コートし
た表面が、マイクロタイタープレートのウェルの内側の
表面である場合、分析される核酸を、過剰量の以下に示
す２つの一本鎖核酸プローブセットを入れたウェル中に
入れる：（１）捕獲プローブのセット、それぞれ、分析
物に相補的な第一結合配列、および、ウェル表面に結合
した核酸に相補的な第二結合配列を有する、および
（２）増幅プローブ（分枝または直鎖状）のセット、そ
れぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、お
よび、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第
二結合配列を有する。増幅プローブを用いることによ
り、マルチマーは「万能」試薬にするべく設計され得、
そして各分析物に対して異なるマルチマーをつくる必要
はない。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列に
より分析物にハイブリダイズした２つのプローブからな
る３成分の核酸複合体である。プローブの第二結合配列
は、分析物と相補的ではないので、一本鎖セグメントの
ままで残っている。この複合体は、ウェル表面上の固定
化プローブに、第二結合配列によってハイブリダイズす
る。得られた生成物は、ウェル表面に結合したオリゴヌ
クレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形
成された二重鎖によって、ウェル表面に結合した複合体
を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面
から除去する。
次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーション
条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅
プローブの結合可能な第二結合配列にハイブリダイズさ
せる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの
非結合マルチマーからも分離する。次いで、標識オリゴ
ヌクレオチドを、マルチマーの相補的なオリゴヌクレオ
チド単位にハイブリダイズさせるような条件下で加え
る。次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄し
て、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取
る。
分析される核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的
液体または固体、食料品、環境物質など）由来であり
得、種々の手段（例えば、プロテイナーゼK/SDS、カオ
トロピック塩など）によりハイブリダイゼーション分析
のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または
化学的手段（例えば、制限酵素、音波処理、化学分解
（例えば、金属イオン）など）によって、分析される核
酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フ
ラグメントは、0.1Kb程に小さくあり得、通常少なくと
も約0.5Kbであり、そして1Kbまたはそれ以上であり得
る。分析される配列は、分析のため一本鎖形態で提供さ
れる。配列が天然に一本鎖形態で存在する場合、変性は
必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得
る場合、配列を変性する。変性は種々の技法（例えば、
アルカリ、一般的には約0.05〜0.2Mの水酸化物、ホルム
アミド、塩類、熱、またはそれらの組合せ）により行わ
れ得る。
分析される配列に相補的である、捕獲プローブおよび
増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも15
ヌクレオチド、通常少なくとも25ヌクレオチド、そして
約5Kb以下、通常約1Kb以下、好ましくは約100ヌクレオ
チド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的に
は約30ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の
異なる配列に結合するように選択される。第一結合配列
は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質
に依存して、コンセンサス配列、多型性に関連した配
列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連
し得る。
増幅プローブおよび捕獲プローブの第一結合配列を適
切に選択することによって、それらは、特定の遺伝子を
含む特異的な核酸分子、または異なる複数の核酸分子の
一部として存在する、他の配列を同定するのに使用され
得る。目的とする核酸分子を、同じ特定の配列を含む他
の分子から識別するためには、プローブの１つを、特定
の配列に相補的に形成し、一方、他のプローブを、その
分子に特有である（すなわち、特定の配列を含む他の分
子には存在しない）その分子のもうひとつの配列に相補
的に形成する。
捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、
それぞれ、ポリスチレン表面に分枝した（branch）オリ
ゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、
相補的であるように、そして試料／分析物の内在性配列
に遭遇することのないように選択される。第二結合配列
は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補
的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得
る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み
得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げ
ないか、または非特異的結合を生じさせないものでなけ
ればならない。
捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオ
チド合成法またはクローニングにより調製され得るが、
前者が好ましい。
結合配列は、完全に相補的であって、ホモ二本鎖を提
供する必要はない。多くの場合では、５個またはそれ以
上のヌクレオチドのループを無視して、約10％未満の塩
基がミスマッチであるヘテロ二本鎖で十分である。従っ
て、本明細書中で用いられる用語「相補的」とは、安定
した二重構造を提供するのに十分な相補性の程度を意味
する。
標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオ
リゴヌクレオチド単位に相補的な配列を含む。標識オリ
ゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の分子（「標
識」）を含み、これは検出し得るシグナルを直接または
間接的に提供する。標識は、相補的な配列の個々のメン
バーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端
メンバーまたは末端テイルとして存在し得る。配列に結
合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告
されている。例えば、Learyら、Proc Natl Acad Sci US
A（1983）80:4045;RenzおよびKurz、Nuc Acids Res（19
84）12:3435;RichardsonおよびGumport、Nuc Acids Res
（1983）11:6167;Smithら、Nuc Acids Res（1985）13:2
399;MeinkothおよびWahl、Ana Biochem.（1984）138:26
7を参照のこと。標識は、相補的な配列に、共有結合ま
たは非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識に
は、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵
素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サ
ブユニット、金属イオンなどが包含される。例示の特定
の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレ
ッド（Texas red）、フィコエリトリン、ウンベリフェ
ロン、ルミノール、NADPH、α−β−ガラクトシダー
ゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが包含される。
分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プ
ローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、
好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少な
くとも約1.5:1であり、より好ましくは少なくとも2:1で
ある。通例、2:1から10,000:1の範囲内である。各プロ
ーブの濃度は、一般的に約10-10〜10-6Mの範囲であり、
試料の核酸濃度は、10-21〜10-12Mまでの種々の範囲と
なる。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般
的に約10分から２時間までを要し、多くは約１時間で完
了する。ハイブリダイゼーションは、やや高めの温度
で、一般的には約20℃から80℃の範囲で、より通常には
約35℃から70℃までで、特に65℃で行われ得る。
ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に
緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加
剤を含有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデ
タージェント（0.1〜１％）、塩類（例えば、クエン酸
ナトリウム（0.017〜0.17M）、フィコール、ポリビニル
ピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含され
る。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは、
例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、
アルコール、およびホルムアミドである。これらの他の
溶媒は、２〜50％の範囲内の量で存在する。
ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシー
は、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従
って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ス
トリンジェンシーを変化させる。
標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存し
て、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、
多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に
対しては、ルミノメーターまたはフィルムが有用であ
る。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、ま
たは着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミノ
メーター、分光光度計により、または視覚的に測定され
得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイ
ムノアッセイに適用され得る方法が、本アッセイに用い
られ得る。
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの
実施例は、本発明をどのようにも限定することを意図し
ない。
実施例 １ White Microlite 1 Removawellストリップ（ポリスチ
レンマイクロタイタープレート、96ウェル／プレート）
を、Dynatech Inc.から購入した。
予備洗浄 各ウェルに200μＬの6N HClを満たし、室温で15〜20
分間インキュベートした。次いで、このプレートを１×
PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去
した。次いでウェルに200μＬの6N NaOHを満たし、室温
で15〜20分間インキュベートした。プレートを再び１×
PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去
した。
ポリ（Phe−Lys）コーティング ポリ（Phe−Lys）をSigma Chemicals,Inc.から購入し
た。このポリペプチドは、phe:lysを1:1のモル比で有し
ており、平均分子量は47,900gm/molである。平均長さは
309アミノ酸であり、155アミン/molを含む。ポリペプチ
ドの1mg/ml溶液30mLを、2M NaCl/0.5×PBSと混合し、最
終濃度0.1mg/mL（pH6.0）にした。各ウェルに、この溶
液を100μＬずつ加えた。プレートをプラスチックで包
んで乾燥を防ぎ、30℃で一晩インキュベートした。次い
で、プレートを1X PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピレ
ートし液体を除去した。
最初のストリッピング 0.5重量SDSを含有する200μＬの0.2N NaOHをポリペプ
チドでコートしたウェルに加えた。プレートをプラスチ
ックで包み、65℃で１時間インキュベートした。次い
で、プレートを１×PBSで４回洗浄し、ウェルをアスピ
レートし液体を除去した。
オリゴヌクレオチドの活性化 ジスクシンイミジルスベレート（DSS）の50mgアリコ
ートを、それぞれ500μＬのジメチルホルムアミド（DM
F）に溶解した。
１×PBS中の上記21−merオリゴヌクレオチド（XT1＊
と呼ぶ）の26 OD260単位を、DSS−DMFの各アリコートに
添加した。混合物をボルテックスにかけ、室温で30分間
インキュベートした。２本のNAP25カラム（26 OD260当
り1,50μＬアリコート）を、１×PBSで平衡化し、DSS−
DMF−オリゴヌクレオチド混合物を１×PBS 2mLで希釈
し、そして希釈混合物をカラム上に即座に載せた。カラ
ムから流出させ、そして溶離剤を廃棄した。活性化オリ
ゴヌクレオチドを、各カラムから１×PBS 3.5mLで溶出
し、全部のカラムを集めて１×PBS 100mLに入れた。
ポリ（Phe−Lys）でコートしたプレートへの活性化オリ
ゴヌクレオチドのカップリング 各ウェルに、活性化オリゴヌクレオチド含有溶離剤を
50μＬずつ加え、ウェルを室温で120分間インキュベー
トした。次いで、プレートを１×PBSで４回洗浄し、ウ
ェルをアスピレートして液体を除去した。
最終ストリッピング 0.5重量％SDSを含有する200μＬの0.2N NaOHを各ウェ
ルに加えた。プレートをプラスチックで包み、65℃で60
分間インキュベートした。次いで、プレートを１×PBS
で４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去し
た。ストリッピングしたプレートを、２〜８℃で乾燥剤
ビーズと共に貯蔵した。
実施例 ２ 予備洗浄 Microlite 1 Removawellポリスチレンマイクロタイタ
ープレートを、1N HClおよび1N NaOHを使用した以外
は、実施例１のように予備洗浄した。
ポリペプチドコーティング ウェルを実施例１のようにコートした。最初のストリ
ッピング工程を省いた。
オリゴヌクレオチドの活性化 XT1＊オリゴヌクレオチドを、以下のことを除いて、
実施例１のように活性化した:XT1＊に対するDSSのモル
比を、1000:1の代わりに400:1にした；活性化中に用い
た緩衝液およびpHは、pH7.8でのリン酸ナトリウムであ
った；活性化を停止させるために使用した緩衝液および
pHは、pH6.5のリン酸ナトリウムであった；そして、活
性化オリゴヌクレオチドを精製するのに用いた温度およ
び緩衝液は、pH6.5のリン酸ナトリウム、４℃であっ
た。
コートしたウェルへの活性化オリゴヌクレオチドのカッ
プリング カップリングを、緩衝液をリン酸ナトリウム（pH7.
8）とし、そしてインキュベーションを一晩行った以外
は、実施例１のように行った。
ストリッピング ウェルを、0.2N NaOH/0.5重量％SDSで、実施例１のよ
うにストリッピングした。
実施例 ３ 実施例１および２の固定化手順を、カップリング工程
で使用した活性化オリゴヌクレオチドの量をいろいろと
変えて用いて繰り返した。ウェル表面に結合したオリゴ
ヌクレオチドの量を、これらの各実験において測定し
た。図１は、これらの実験結果を示すグラフである。示
したように、実施例２の手順により、ウェルに添加した
所定の量の活性化オリゴヌクレオチドで、約10倍以上の
オリゴヌクレオチドが表面に結合した。
実施例 ４ 本実施例は、HCV RNAアッセイにおける本発明の使用
を例示し、そして、プレート上に固定化されたプローブ
の量に対するアッセイ感度に関する。
アッセイで使用するマルチマーの合成 「15×３」増幅溶液相核酸サンドイッチハイブリダイ
ゼーションアッセイを、この実施例で用いた。「15×
３」の呼称は、形式が、増幅プローブにハイブリダイズ
する第一セグメント、および、３つの標識オリゴヌクレ
オチドにハイブリダイズする第二セグメントの15個の反
復を有するコーム型マルチマーを用いることに由来す
る。
15個の分枝部位、および、３つのオリゴヌクレオチド
結合部位を有する側鎖伸長を有する15×３コーム型分枝
オリゴヌクレオチドを、以下のように合成した。
オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動DNA
合成機（Applied Biosystems,Inc.,（ABI）モデル380
B）で行った。βシアノエチル型のホスホルアミダイト
化学を用いた。これには、PhostelTM試薬（ABN）を用い
る5'リン酸化が包含される。示したこと以外は、標準的
なABIプロトコルを用いた。複数のサイクルを用いた
（例えば、1.2サイクル）と示されている場合、ABIによ
り推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイ
クルに用いられた。Applied Biosystems Model 380B DN
A合成機で行われる、サイクル1.2および6.4を実施する
ためのプログラムを本明細書中に添付する。
以下の構造のコーム体を最初に調製した： ここで、X'は分枝モノマーであり、そしてＲは過ヨウ素
酸切断可能リンカーである。
15個の（TTX'）繰り返しによるコーム体の部分を、3
3.8mgのアミノプロピル誘導体化チミジンの調整孔ガラ
ス（CPG）（2000Å、支持体１グラム当り7.4マイクロモ
ルチミジン）を用いて、1.2サイクルプロトコルで、最
初に合成する。分枝部位ヌクレオチドは、下式であっ
た： ここでR2は を表す。
コーム体（側鎖を含まない）の合成に関して、βシア
ノエチルホスホルアミダイトモノマーの濃度は、Ａ、
Ｃ、Ｇ、およびＴが0.1M、分枝部位モノマーＥが0.15
M、およびPhostelTM試薬が0.2Mであった。脱トリチル化
は、脱保護期間中に階段フロースルー（stepped flowth
rough）を用いて、塩化メチレン中の３％トリクロロ酢
酸で行った。最終的に、5'DMTをアセチル基で置換し
た。
切断可能リンカーＲおよび式3'−RGTCAGTpの６塩基の
側鎖伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位で合
成した。塩基保護基（上式のR2）の除去は、コーム体の
合成に用いたのと同じカラム中にCPG支持体を保持して
いる間に、手動的に行った。R2がレブリニルである場
合、0.5Mヒドラジン水和物のピリジン／氷酢酸（1:1 v/
v）溶液を加え、15分ごとに液体を取り替えながら90分
間CPG支持体と接触させておき、続いてピリジン／氷酢
酸（1:1 v/v）で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄
した。脱保護を行った後、切断可能リンカーＲおよび６
塩基側鎖伸長を、6.4サイクルを用いて加えた。
これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度
は、0.1Mであった（0.2MのＲおよびPhostelTM試薬を除
く;Rは、２−（４−（４−（２−ジメトキシトリチルオ
キシ）エチル）−フェノキシ2,3−ジ（ベンゾイルオキ
シ）−ブタンオキシ）フェニル）エチル−２−シアノエ
チル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイトであっ
た）。
脱トリチル化は、３％トリクロロ酢酸の塩化メチレン
溶液で連続フロースルーを用いて行い、次いでトルエン
／クロロメタン（1:1 v/v）の溶液でリンスする。分枝
ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクル「CE
NH3」を用いて380Bで自動的に除去した。水酸化アンモ
ニウム溶液を4mLのスクリューキャップWheatonバイアル
に集め、60℃で12時間加熱して全ての塩基保護基を除去
した。室温まで冷却した後、溶媒をSpeed−Vacエバポレ
ーターで除去し、残渣を100μＬの水に溶解した。以下
の構造の3'バックボーン伸長（セグメントＡ）、側鎖伸
長、および連結反応テンプレート／リンカーもまた、自
動合成機を用いて作成した。
粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法（７
％、7M尿素および１×TBEランニング緩衝液を含む）に
より精製した。
3'バックボーン伸長および側鎖伸長を、以下のように
してコーム体に連結した。コーム体（4pmol/μＬ）、3'
バックボーン伸長（6.25pmol/μＬ）、側鎖伸長（93.75
pmol/μＬ）、側鎖連結テンプレート（93.75pmol/μ
Ｌ）、およびバックボーン連結テンプレート（5pmol/μ
Ｌ）を、1mM ATP/5mM DTT/50mMトリスHCl、pH8.0/10mM
MgCl2/2mMスペルミジン中で、0.5単位／μＬのT4ポリヌ
クレオチドキナーゼと合わせた。この混合物を37℃で２
時間インキュベートし、次いで水浴中で95℃に加熱し、
次いで１時間かけて35℃未満までゆっくりと冷却した。
2mM ATP、10mM DTT、14％ポリエチレングリコール、お
よび0.21単位／μL T4リガーゼを加え、そして混合物を
23℃で16〜24時間インキュベートした。DNAをNaCl/エタ
ノール中で沈殿させ、水中に再懸濁し、そして以下のよ
うな２回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、1m
M ATP、5mM DTT、14％ポリエチレングリコール、50mMト
リスHCl、pH7.5、10mM MgCl2、2mMスペルミジン、0.5単
位／μL T4ポリヌクレオチドキナーゼ、および0.21単位
／μL T4リガーゼを加え、そして混合物を23℃で16〜24
時間インキュベートした。次いで、連結反応産物をポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
使用した標識プローブおよび捕獲プローブ 本アッセイで使用した、増幅（標識）プローブHCV−
特異的セグメントおよび捕獲プローブHCV−特異的セグ
メントは、以下の通りである： ウイルス単離物第Ｉ群の、HCV E1遺伝子のヌクレオチド
配列に相補的なプローブ（図2Aを参照）： ウイルス単離物第II群の、HCV E1遺伝子のヌクレオチド
配列に相補的なプローブ（図2Bを参照）： Ｃ遺伝子および5'−未翻訳領域のヌクレオチド配列に相
補的なプローブ（図３参照）： 上のセットでは、それぞれの捕獲プローブは、HCV配
列に相補的な配列に加えて、XT1＊に相補的な下流配列
を含む。
アッセイ形式 以下の範囲の抽出用緩衝液を調製した。
抽出用緩衝液の処方−100mL 100mL用の処方： 5.3mL 1Mトリス−HCl,pH8 4.24mL 0.25M EDTA 13mL 10％ SDS 160μL 10mg/mL sssDNA 26.5mL 20X SSC 7mL脱イオンホルムアミド 93mgプロテイナーゼＫ トリス、EDTA、SDS、音波処理サケ精子DNAおよびSSC
を、25mLの脱イオン水に添加し、そして脱イオン水で体
積を93mLに調整した。溶液を穏やかに混合し、そしてpH
を7.5に調整した。プロテイナーゼＫを溶液に添加し、
そして溶解するまで混合する。溶液を水浴中で、37℃で
３時間インキュベートした。溶液を室温まで冷却し、そ
してホルムアミドを添加した。
含有物を、溶液を形成する残りのものとを混合するこ
とにより、以下に示す処方のハイブリダイゼーション緩
衝液を調製した。
ハイブリダイゼーション緩衝液処方−1L １リットル用の処方 5grブロッキング試薬 10mL 10％ SDS 200mL 20X SSC 脱イオン水で１リットルにする 捕獲プローブおよび標識プローブの各25μＬを、PK緩
衝液（プロテイナーゼK12mgを、抽出緩衝液6mL中に溶
解）3,000μＬを添加した。この混合物の50μＬを、実
施例２のように調製したマイクロタイタープレートのウ
ェルに添加し、その後、HCV核酸を含有すると思われる
試料50μＬを添加した。プレートを、Mylarで覆い、そ
して65℃で16時間インキュベートした。次いで、プレー
トを冷却し、Mylarを除去し、ウェルをアスピレート
し、１×洗浄緩衝液（0.1％SDS/0.015M NaCl/0.0015Mク
エン酸ナトリウム）で洗浄し、そして再度アスピレート
した。
ハイブリダイゼーション緩衝液中のマルチマーの溶液
（25fmol/50μＬ）を調製し、50μＬを各ウェルに添加
した。プレートを、Mylarで覆い、30秒間攪拌し、そし
て55℃で30分間インキュベートした。次いで、プレート
を冷却し、Mylarを除去し、１×洗浄緩衝液で洗浄し、
そしてアスピレートした。
アッセイを、HCV RNAを５、50、および500チポモル
（tipomol）（tm、チポモル＝602分子、または10-21モ
ル）のそれぞれを含む標本について、１ウェル当り種々
の量の固定化（捕獲）DNAで実施例２のように調製した
マイクロタイタープレートを用いて行った。感度は、デ
ルタ値＝（平均値−２倍標準偏差）−（ゼロ＋２倍標準
偏差）として特徴付けた。図４に、これらのアッセイの
結果を示す。示されるように、本アッセイにおいて最適
な感度は、１ウェル当り0.1〜1.1pmolの固定化DNAで生
じる。
実施例 ５ HBV DNAのアッセイを、上記の実施例４に記載した形
式、および種々のポリペプチドコーティングを使用した
以外は、上記の実施例２のようにコートしたマイクロタ
イタープレートを用いて行った。これらのアッセイで
は、ポリ（Phe−Lys）、カゼイン、Boehringer−Mannhe
im「ブロッキング試薬」（＃1096176）Boehringer−Man
nheim Catalog）、ポリ（Ala−Glu）およびポリ（Glu−
Lys）でコートしたプレートは、アッセイにおいて類似
の成果を示した。
実施例 ６ 改変した手順を、以下に示す： 予備洗浄 White Microlite 1 Removawellストリップ（ポリスチ
レンマイクロタイタープレート、96ウェル／プレート）
を、Dynatech Inc.から入手した。各ウェルを250μＬの
1N HClで満たし、そして室温で15〜20分間インキュベー
トした。次いで、プレートを250μＬの1N NaOHで満た
し、そして室温で15〜20分間インキュベートした。次い
でプレートを１×PBSで３回洗浄し、そしてウェルをア
スピレートして液体を除去した。
ポリ（Phe−Lys）コーティング ポリ（Phe−Lys）（上記）を、2M NaCl/1×PBSと混合
し、最終濃度を0.1mg/mL（pH6.0）にして、そして得ら
れた溶液の200μＬをそれぞれのウェルに添加した。プ
レートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、そして30℃
で一晩インキュベートした。次いで、プレートを１×PB
Sで３回洗浄し、そしてウェルをアスピレートして液体
を除去した。
オリゴヌクレオチドの活性化 50mMリン酸ナトリウム（pH7.8）中に含まれる、PSCP
（5'−XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG−3'、ここでＸがN4−
（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）−５−メ
チルシチジンである）の2500D260単位に、ビス（スルホ
スクシンイミジル）スベレート（「BS3」、180mg）を添
加した。混合物をボルテックスし、そして室温で30分間
インキュベートした。10mMリン酸ナトリウム（pH6.5）
で平衡化したゲル濾過カラム（Sephadex Ｇ−25、Phar
macia）を、活性化オリゴヌクレオチドを精製するのに
使用した。活性化オリゴヌクレオチド反応混合物を、カ
ラムに加え、濾過した。溶出物を集め、次の工程に用い
るまで保存した。溶出物の濃度を、50mMリン酸ナトリウ
ム（pH7.8）で希釈して、3.7×10-2OD260/mLに調整し
た。
ポリ（Phe−Lys）でコートしたプレートへの活性化オリ
ゴヌクレオチドのカップリング 活性化オリゴヌクレオチド含有溶離液（100μＬ）を
それぞれのウェルに添加し、ウェルを４℃で12〜18時間
インキュベートした。次いで、プレートを１×PBSで２
回洗浄し、そしてウェルをアスピレートし、液体を除去
した。
最終ストリッピング 0.1重量％SDSを含有するNaOH（0.2N、250μＬ）を、
それぞれのウェルに添加した。プレートをプラスチック
で包み、そして65℃で60分間インキュベートした。次い
で、プレートを１×PBSで３回洗浄し、そしてウェルを
アスピレートし、液体を除去した。
過カップリング 0.4mg/mL BS3を含有するリン酸ナトリウム（50mM、10
0μＬ、pH7.8）を、各ウェルに添加し、そしてプレート
で12〜18時間インキュベートさせた。次いで、プレート
を１×PBSで２回、そして水で１回洗浄した。次いで、
洗浄し終わったプレートを、４℃で小袋内で貯蔵した。
上記の本発明を実施するための態様について、生化
学、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、および関連
分野における当業者に明らかな改変は、以下の請求の範
囲の範囲内に含まれることが意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラニング，ジョイス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94519，コンコード フィッツパトリッ ク アベニュー 3141 (56)参考文献 特開 昭60−70359（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−188970（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開455905（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼー
    ションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有
    する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するた
    めの方法であって、以下の工程を包含する、方法： （ａ）強酸、強塩基、および水で順次洗浄することによ
    り該ポリスチレン表面を清浄化する工程； （ｂ）該清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基
    を有するポリマーを受動的に吸着させる工程；および （ｃ）該核酸プローブを、該第一官能基および該第二官
    能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、該吸着した
    ポリマーに共有結合させる工程であって、ここで該結合
    は、二価性架橋剤を通じてつくられる、工程。
  2. 【請求項２】前記ポリマーがポリペプチドであり、そし
    て前記第二官能基が一級アミノ基である、請求項１に記
    載の方法。
  3. 【請求項３】（ｄ）少なくとも、前記溶液相サンドイッ
    チハイブリダイゼーションアッセイで使用される条件と
    同程度のストリンジェントな条件に、前記ポリマー−核
    酸プローブでコートされた表面をさらす工程を包含す
    る、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記ポリマー−核酸プローブでコートされ
    た表面を、25〜65℃で10〜180分間、低濃度のデタージ
    ェントを含有する弱塩基溶液と接触させる、請求項１に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】前記溶液が、0.01〜２重量％ドデシル硫酸
    ナトリウムを含有する0.1〜0.5N NaOHである、請求項
    ２に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記強酸が１〜10N HClであり、そして前
    記強塩基が１〜10Nアルカリ金属水酸化物である、請求
    項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】最初に前記核酸プローブが、前記架橋剤
    に、該プローブ上の第一官能基と該架橋剤の官能基の１
    つとの間の反応を通じて共有結合して、活性化した核酸
    プローブを形成し、そして次いで、該活性化核酸プロー
    ブが、前記吸着したポリマーに、前記第二官能基の１つ
    と該架橋剤の他の官能基との間の反応を通じて共有結合
    する、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記核酸プローブが、該プローブ上の前記
    官能基を提供するために、N4−位が改変されているシチ
    ジンを有する、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記ポリマーがポリ（Phe−Lys）であり、
    前記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そ
    して前記核酸プローブが、 【化１】 からなる群より選択され、ここでＸがシチジンのN4−
    （６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）誘導体を
    表す、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】ポリスチレン表面上に吸着したポリマ
    ー、および塩基安定性二価性架橋剤を通じて、該ポリマ
    ーに共有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン
    表面を含む、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼー
    ションアッセイで使用するための製造物品。
  11. 【請求項１１】ポリスチレン表面上に吸着したポリマ
    ー、および塩基安定性二価性架橋剤を通じて、該ポリマ
    ーに共有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン
    表面を含む、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼー
    ションアッセイで使用するための製造物品であって； 該製造物品が、該ポリスチレン表面上に該ポリマーを吸
    着させる前に、強酸、強塩基、および水性緩衝液で該ポ
    リスチレン表面を順次洗浄することにより調製される、 製造物品。
  12. 【請求項１２】前記物品が、マイクロタイタープレート
    のウェルである、請求項10または11に記載の製造物品。
  13. 【請求項１３】前記物品が、ビーズである、請求項10ま
    たは11に記載の製造物品。
  14. 【請求項１４】前記表面上に前記プローブが、約0.1〜1
    0ピコモル存在する、請求項10または11に記載の製造物
    品。
  15. 【請求項１５】前記ウェル表面上に前記プローブが、約
    0.4〜0.7ピコモル存在する、請求項12に記載の製造物
    品。
  16. 【請求項１６】前記ポリマーがポリ（Phe−Lys）であ
    り、前記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであ
    り、そして前記核酸プローブが、 【化２】 からなる群より選択され、ここでＸがシチジンのN4−
    （６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）誘導体を
    表す、請求項10または11に記載の製造物品。
  17. 【請求項１７】試料中において分析される一本鎖核酸の
    存在を検出するための溶液相核酸サンドイッチハイブリ
    ダイゼーションアッセイであって、ここで該アッセイが
    以下の工程： （ａ）該試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標
    識プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触
    させる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析
    物に相補的な第一セグメントおよびDHAマルチマーのセ
    グメントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕
    獲プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよび
    ポリスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに
    相補的な第二セグメントを有する、工程； （ｂ）工程（ａ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
    条件下で、ポリスチレン表面に固定化した、該オリゴヌ
    クレオチドと接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
    条件下で、該マルチマーと接触させる工程；および （ｄ）工程（ｃ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
    条件下で、該マルチマーにハイブリダイズする標識オリ
    ゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、 そして改良点は、該オリゴヌクレオチドが、表面に吸着
    したポリマーを通じて該ポリスチレン表面に固定化さ
    れ、塩基安定性の連結を通じて該ポリマーに共有結合し
    ていることであり、ここで該結合は、二価性架橋剤を通
    じてつくられる、工程である、アッセイ。
  18. 【請求項１８】試料中において分析される一本鎖核酸の
    存在を検出するための溶液相核酸サンドイッチハイブリ
    ダイゼーションアッセイであって、ここで該アッセイが
    以下の工程： （ａ）該試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標
    識プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触
    させる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析
    物に相補的な第一セグメントおよびDNAマルチマーのセ
    グメントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕
    獲プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよび
    ポリスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに
    相補的な第二セグメントを有する、工程； （ｂ）工程（ａ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
    条件下で、ポリスチレン表面に固定化した、該オリゴヌ
    クレオチドと接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
    条件下で、該マルチマーと接触させる工程；および （ｄ）工程（ｃ）の生成物を、ハイブリダイゼーション
    条件下で、該マルチマーにハイブリダイズする標識オリ
    ゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、 そして改良点は、該オリゴヌクレオチドが、表面に吸着
    したポリマーを通じて該ポリスチレン表面に固定化さ
    れ、塩基安定性の連結を通じて該ポリマーに共有結合
    し、そして結合していない分析物から生じるバックグラ
    ウンドシグナルが、該ポリスチレン表面上に該ポリマー
    を吸着させる前に、強酸、強塩基、および水性緩衝液で
    該ポリスチレン表面を順次洗浄することにより減少され
    ることであり、ここで該結合は、二価性架橋剤を通じて
    つくられる、アッセイ。
  19. 【請求項１９】前記ポリスチレン表面がマイクロタイタ
    ープレートのウェルであり、工程（ａ）〜（ｄ）が該ウ
    ェル内で行われる、請求項17または18に記載のアッセ
    イ。
  20. 【請求項２０】前記表面が、工程（ａ）を行う前に、オ
    リゴヌクレオチドをその中に固定化してそして洗浄した
    後、工程（ａ）のハイブリダイゼーション条件にさらさ
    れる、請求項17または18に記載のアッセイ。
  21. 【請求項２１】前記ポリマーがポリ（Phe−Lys）であ
    り、前記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであ
    り、そして前記核酸プローブが、 【化３】 からなる群より選択され、ここでＸがシチジンのN4−
    （６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）誘導体を
    表す、請求項18に記載のアッセイ。
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