CN104569383A - 一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法 - Google Patents

一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，包括步骤：(1)核酸活化；(2)碳酸探针包被聚乙烯微孔板；(i)1X？PBS洗聚乙烯微孔板，洗板后加入Phe？Lys？solution溶液200μL，30℃，孵育15h～17h；(j)甩出聚乙烯微孔板中Poly？Phe？Lys液体，1X？PBS洗板；(k)加入稀释的核酸溶液，2℃-8℃孵育15h～17h；(o)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X？PBS洗板；(p)加入膜再生液250μL，室温孵育1h-2h；(q)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X？PBS洗板；(r)加入偶联剂100μL，2℃-8℃孵育15h-17h；(s)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X？PBS洗板；本发明的在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，使得核酸牢固地包被在聚乙烯微孔板上，检测灵敏度高。

Description

一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法。
背景技术
随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，利用核酸杂交来进行肿瘤或癌的诊断、病毒、细菌等感染、以及各种基因疾病的检测领域中。现有技术中将捕获核酸探针包被在微孔板上，进行肿瘤或癌的诊断、病毒、细菌等感染、以及各种基因疾病的检测。但是现有技术中，核酸探针固定在微孔板上，固定的不牢固，造成检测灵敏度低，孔间变异大。
发明内容
本发明提供一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，使得核酸牢固地包被在聚乙烯微孔板上，检测灵敏度高、孔间差异小。
为了解决上述技术问题，本发明提供的在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法是这样实现的：
一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，包括步骤：
(1)核酸活化； 
(2)核酸探针包被聚乙烯微孔板；
(i)1X PBS洗聚乙烯微孔板，洗板后加入Phe Lys solution溶液200μL，30℃，孵育15h～17h；
(j)甩出聚乙烯微孔板中Poly Phe Lys液体，1X PBS洗板；
(k)加入稀释的核酸溶液，2℃-8℃孵育15h～17h；
(o)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板；
(p)加入膜再生液250μL，室温孵育1h-2h；
(q)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板；
(r)加入偶联剂100μL。2℃-8℃孵育15h-17h；
(s)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板。
可选的，所述步骤(1)包括：(a)解冻BS3；
(b)平衡PD-10柱子；
(c)计算活化核酸体积；
(d)在所述核酸中添加磷酸盐缓冲液；
(e)在添加了磷酸盐缓冲液核酸溶液中添加所述步骤a中解冻的BS3，室温摇匀25～35min；
(f)将步骤(e)中反应液加载到PD-10柱子，用洗脱液洗脱，收集洗脱下的洗脱成分；
(g)将所述洗脱成分进行OD260验证；
(h)含有95％核酸的洗脱成分合并起来，取9.5nmoleBS3活化并纯化的核酸加入到包被液中稀释。
可选的，所述步骤h取9.5nmoleBS3活化并纯化的核酸加入到包 被液中稀释的浓度：95nmole/L。
可选的，包括步骤：所述步骤(2)还包括：(t)使用1X PBS洗板洗板后，将聚乙烯微孔板在温度22℃±3℃、湿度≤15％环境下干燥2h-3h。
可选的，所述膜再生液为：ddH2O：280mL、氢氧化钠:2.25g、SDS:0.28g、混合摇匀15～60min制成。
可选的，所述偶联剂为：1M NaH2PO4:0.918mL和1M Na2HPO4:9.882mL用ddH2O调节体积至120mL并混匀；使用前加入BS3，混匀5min后使用。
本发明提供的在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，核酸包被牢固，检测灵敏度高。相对于现有聚乙烯微孔板包被技术，包被的核酸探针，是采用生物素和亲和素包被。本发明聚乙烯微孔板底的包被探针是5’端由氨基修饰的探针序列，经过BS3活化后，与聚苯丙赖氨酸溶液(Poly Phe Lys solution)氨基化的包被板发生氨基脱水缩合反应，包被探针会被牢固的交联在板底上。与生物素和亲和素包被技术相比，因不需要蛋白纯化，成本低。
附图说明
图1是使用生物素包被的聚乙烯微孔板探针稀释不同浓度的光子数折线图；
图2是本发明使用氨基脱水缩合包被的聚乙烯微孔板探针稀释不同浓度的光子数折线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，包括步骤：
(1)核酸活化； 
步骤(一)包括：(a)解冻BS3；
BS3使用前20min-2h，从冰箱中取出，干燥器室温下解冻。
(b)平衡PD-10柱子；
用合适的容器支撑柱子，用25mL洗脱液平衡胶床。
(c)计算活化核酸体积；
计算核酸活化所需最小体积，10块板需12.7nmol核酸。
(d)在所述核酸中添加磷酸盐缓冲液；
添加1M磷酸盐缓冲液体积为核酸体积的1/10。
(e)在添加了磷酸盐缓冲液核酸溶液中添加所述步骤a中解冻的BS3，室温摇匀25～35min；
添加BS32.0mg。
(f)将步骤(e)中反应液加载到PD-10柱子，用洗脱液洗脱，收集洗脱下的洗脱成分；
洗脱液体积为0.5mL。
(g)将所述洗脱成分进行OD260验证；
I.每次洗脱成分，4μL+96μL ddH2O，颠倒混匀，瞬时离心；ii.ddH2O做空白检测OD260；III.记录OD260及OD260/OD280。计算每次洗脱成分的OD260浓度、稀释倍数及总的DNA量。
(h)含有95％核酸的洗脱成分合并起来，取9.5nmoleBS3活化并纯化的核酸加入到包被液中稀释，稀释浓度为95nmole/L。
(2)核酸探针包被聚乙烯微孔板；
(i)1X PBS洗聚乙烯微孔板，洗板后加入Phe Lys solution溶液180～220μL，25～35℃，孵育15h～17h；
(j)甩出聚乙烯微孔板中Poly Phe Lys液体，1X PBS洗板；
(k)加入稀释的核酸溶液，2℃-8℃孵育15h～17h；
加入80～120μLBS3活化的核酸溶液。
(o)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板；
(p)加入膜再生液200～300μL，室温孵育1h-2h；
膜再生液为：ddH2O：280mL、氢氧化钠:2.25g、SDS:0.28g、混合摇匀15-60min制成。上述配方只是提供一种方案，根据该配方同等比例增加或减少组分的量，都在本申请提供配方技术方案中。
(q)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板；
(r)加入偶联剂100μL，2℃-8℃孵育15h-17h；
偶联剂为：1M NaH2PO4:0.918mL和1M Na2HPO4:9.882mL用ddH2O调节体积至120mL并混匀；使用前加入BS3，混匀5min后使用。上述配方只是提供一种方案，根据该配方同等比例增加或减少组分的 量，都在本申请提供配方技术方案中。
(s)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板；
(t)使用1X PBS洗板后，将聚乙烯微孔板在温度22℃±3℃、湿度≤15％环境下干燥2h-3h。
如下本发明使用氨基脱水缩合包被的聚乙烯微孔板和现有技术使用生物素包被的聚乙烯微孔板检测HPV E6/E7mRNA为例，检测步骤如下，检测结果如表一、表二和图1、图2所示。
1)标本处理：将标本(宫颈上皮脱落细胞)转移至离心管，3000rpm离心5分钟后去上清；加入2mL去离子水，离心去上清；将裂解液100ul与去离子水200ul、5ul蛋白酶K(20mg/ml)加入，吹打、混匀，放置65℃恒温箱孵育一小时；一小时后取出，将标本恢复至室温，取上清液用于检测。
裂解液配制各组分的终浓度为：
a.Hepes钠盐：13.0mg/ml；
b.Hepes游离酸：11.92mg/ml；
c.氯化锂：50.88mg/ml；
d.乙二胺四乙酸：3.0mg/ml；
e.十二烷基硫酸锂：60.0mg/ml；
f.Proclin300：0.2ul/ml。
2)配置检测混合液
表一检测混合液配置(uL/每孔)
   待测样品 水 阳性质控 裂解液 封闭反应液 检测探针
样品孔 50 31 - 17 1 1
空白孔 - 64.7 - 33.3 1 1
检测探针的浓度为100pmol
表一
3)封板，55℃放置3.5小时。
4)用1×洗脱液200ul洗板三次，每次洗板后将孔中液体拍干。
5)每孔加入100ul配好的预放大分子，封板，55℃杂交反应40分钟。
6)用1×洗脱液200ul洗板三次，每次洗板后将孔中液体拍干。
7)每孔加入100ul配好的次级放大分子，封板，55℃杂交反应40分钟。
8)用1×洗脱液200ul洗板三次，每次洗板后将孔中液体拍干。
9)每孔加入100ul配好的探针标记物，封板，55℃杂交反应40分钟。
10)用1×洗脱液200ul洗板三次，每次洗板后将孔中液体拍干。
11)每孔加入100ul配好的底物，封板，46℃杂交反应20分钟。
12)取出包被板，室温放置5分钟后放入化学发光仪中进行读板。
如表二所示，是使用生物素包被的聚乙烯微孔板的读板数据，其中探针稀释浓度分别为：2倍、1倍、0.5倍、0.25倍和0.13倍；相对光子数，是去掉本底的值，分别在同样探针浓度稀释倍数下两组、 每组8个孔的光子数的平均值；信噪比是样品的相对光子数(平均值)/本底的平均光子数(平均值)得到。
探针稀释浓度 2 1 0.5 0.25 0.13
相对光子数 7770481.375 4066517.125 3332228.188 1637410.313 768167.625
孔间变异系数 6％ 6％ 7％ 11％ 8％
信噪比 13.8 7.2 5.8 2.8 1.4
表二
如表二所示，是使用氨基脱水缩合包被的聚乙烯微孔板的读板数据，其中探针稀释浓度分别为：2倍、1倍、0.5倍、0.25倍和0.13倍；相对光子数，是去掉本底的值，分别在同样探针浓度稀释倍数下两组、每组8个孔的光子数的平均值；信噪比是样品的相对光子数(平均值)/本底的平均光子数(平均值)得到。
探针稀释浓度 2 1 0.5 0.25 0.13
相对光子数 4907253 2622911.438 1399450.75 703442.0625 343109.4375
孔间变异系数 1％ 0％ 1％ 1％ 2％
信噪比 1188.6 635.3 338.9 170.4 83.1
表三
图1是表二的折线图，图2是表三的折线图，图1和图2中X轴为探索稀释浓度，Y轴为相对光子数；如图1和图2所示，图1中探针稀释浓度对应的光子数信号值的折线相对系数为0.9693，图2中 探针稀释浓度对应的光子数信号值的折线相对系数为0.9983，图1中本底信号值相对于图2中本底信号值较大。从表二、表三对比，图1和图2对比，本发明使用氨基脱水缩合包被的聚乙烯微孔板孔间变异系数较小，本底值较低，信噪比大，更优于使用生物素包被的聚乙烯微孔板。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)核酸活化；
(2)核酸探针包被聚乙烯微孔板；
(i)1X PBS洗聚乙烯微孔板，洗板后加入Phe Lys solution溶液180～220μL，25～35℃，孵育15h～17h；
(j)甩出聚乙烯微孔板中Poly Phe Lys液体，1X PBS洗板；
(k)加入稀释的核酸溶液，2℃-8℃孵育15h～17h；
(o)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板；
(p)加入膜再生液200～300μL，室温孵育1h-2h；
(q)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板；
(r)加入偶联剂80～120μL，2℃-8℃孵育15h-17h；
(s)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X PBS洗板。
2.根据权利要求1所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：(a)解冻BS3；
(b)平衡PD-10柱子；
(c)计算活化核酸体积；
(d)在所述核酸中添加磷酸盐缓冲液；
(e)在添加了磷酸盐缓冲液核酸溶液中添加所述步骤a中解冻的BS3，室温摇匀25～35min；
(f)将步骤(e)中反应液加载到PD-10柱子，用洗脱液洗脱，收集洗脱下的洗脱成分；
(g)将所述洗脱成分进行OD260验证；
(h)含有95％核酸的洗脱成分合并起来，取9.5nmoleBS3活化并纯化的核酸加入到包被液中稀释。
3.根据权利要求2所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，所述步骤h取9.5nmoleBS3活化并纯化的核酸加入到包被液中稀释的浓度：95nmole/L。
4.根据权利要求1所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，包括步骤：所述步骤(2)还包括：(t)使用1X PBS洗板洗板后，将聚乙烯微孔板在温度22℃±3℃、湿度≤15％环境下干燥2h-3h。
5.根据权利要求1～4所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，所述膜再生液为：ddH2O：280mL、氢氧化钠:2.25g、SDS:0.28g、混合摇匀15-60min制成。
6.根据权利要求1～4所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，根据权利要求1～4所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，所述偶联剂为：1M NaH2PO4:0.918mL和1MNa2HPO4:9.882mL用ddH2O调节体积至120mL并混匀；使用前加入BS3，混匀5min后使用。
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