CN106932595B - Dna包被液及其制备方法和dna包被方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及DNA包被液及其制备方法和DNA包被方法。该DNA包被液由硫酸铵、氯化钠和水组成。本发明DNA包被液可以快速将DNA通过化学键结合的方式附在聚苯乙烯板的表面用于杂交，可以有效地将DNA包被于微平板和微量样品管等固相载体表面，用于后续的杂交试验。且该DNA包被液组成简单，成本低，易于大量配制，适合大规模的生产应用。

Description

DNA包被液及其制备方法和DNA包被方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及DNA包被液及其制备方法和DNA包被方法。
背景技术
将核酸或抗原抗体固定在固相载体表面的过程称为包被。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。
当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。
不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射(例如30W紫外灯，75cm照射12小时)，以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定，但是这种方法比较繁琐，而且费用较高，费时费力，不适合大规模的生产应用。
目前，DNA包被时采用的包被缓冲液有PBS缓冲液、CBS缓冲液、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液。但这些普通的包被液有如下缺点：①DNA包被过程中孵育时间长，DNA包被到聚苯乙烯板表面后不够稳定，保存时间相对较短。②聚苯乙烯载体不易吸附DNA，需要对聚苯乙烯板进行处理，过程比较繁琐，而且效果得不到很好的保证。③耗费的时间流程太长，聚苯乙烯板的处理导致成本较高。因此，需要提供一种包被效率高、稳定性好的DNA包被液。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了DNA包被液及其制备方法和DNA包被方法。本发明解决了微孔板包被DNA效率低，费用高的问题降低了人工成本和能源消耗，这种高效的DNA包被液可以快速将DNA通过化学键结合的方式附在聚苯乙烯板的表面用于杂交，可以有效地将DNA包被于微平板和微量样品管表面。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种DNA包被液，由硫酸铵、氯化钠和水组成。
本发明DNA包被液可以快速将DNA通过化学键结合的方式附在聚苯乙烯板的表面用于杂交，可以有效地将DNA包被于固相载体表面，用于后续的杂交试验。
作为优选，以质量百分比计，该DNA包被液中各组分用量为：硫酸铵42.0％～43.0％，氯化钠0.5％～0.8％，水补足。
在本发明提供的一具体实施例中，以质量百分比计，DNA包被液中各组分用量为：硫酸铵42.0％，氯化钠0.6％，水补足。
在本发明提供的另一具体实施例中，以质量百分比计，DNA包被液中各组分用量为：硫酸铵42.5％，氯化钠0.8％，水补足。
在本发明提供的另一具体实施例中，以质量百分比计，DNA包被液中各组分用量为：硫酸铵43.0％，氯化钠0.5％，水补足。
作为优选，该DNA包被液的pH值为6.0～6.2。
在本发明提供的实施例中，DNA包被液的pH值为6.1。
本发明还提供了该DNA包被液的制备方法，包括：将硫酸钠、氯化钠溶解于水中，调节pH值至6.0～6.2，过滤除菌。
作为优选，调节pH值采用的试剂为硫酸或氨水。
本发明还提供了一种DNA的包被方法，包括：采用本发明提供的DNA包被液作为缓冲液，将DNA样品与固相载体进行孵育。
作为优选，孵育的温度为15～30℃，孵育的时间为15～25h。
在本发明提供的实施例中，孵育的温度为室温，孵育的时间为20h。
作为优选，固相载体为聚苯乙烯固相载体。
在本发明提供的实施例中，固相载体为聚苯乙烯微平板或微量样品管。
本发明还提供了一种原位杂交方法，包括如下步骤：
采用本发明的DNA包被液作为缓冲液，将DNA样品与固相载体进行孵育；
去除缓冲液，将包被有DNA的固相载体进行干燥；
将特定标记的探针与包被有DNA的固相载体进行孵育；
检测目的DNA。
作为优选，干燥为在10％湿度条件下干燥3h。
本发明提供了DNA包被液及其制备方法和DNA包被方法。该DNA包被液由硫酸铵、氯化钠和水组成。本发明至少具有如下有益效果之一：
1、本发明DNA包被液可以快速将DNA通过化学键结合的方式附在聚苯乙烯板的表面用于杂交，可以有效地将DNA包被于微平板和微量样品管等固相载体表面，用于后续的杂交试验。
2、本发明DNA包被液组成简单，成本低，易于大量配制，适合大规模的生产应用。
具体实施方式
本发明公开了DNA包被液及其制备方法和DNA包被方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
包被：将核酸或者抗原抗体固定在微孔板上的过程称为包被，换言之，包被即是核酸或者抗原抗体结合到固相载体表面的过程。
DNA：脱氧核糖核酸，又称去氧核糖核酸，是一种生物大分子，可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。主要功能是信息储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物如蛋白质与核糖核酸所需。带有蛋白质编码的DNA片段称为基因。
本发明提供的DNA包被液及其制备方法和DNA包被方法中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 DNA包被液的制备
本实施例中DNA包被液的配方如下：
制备方法为：
硫酸铵、氯化钠、水按照上述质量分数混合溶解，调pH为6.1，过滤除菌。
实施例2 DNA包被液的制备
本实施例中DNA包被液的配方如下：
制备方法为：
硫酸铵、氯化钠、水按照上述质量分数混合溶解，调pH为6.0，过滤除菌。
实施例3 DNA包被液的制备
本实施例中DNA包被液的配方如下：
制备方法为：
硫酸铵、氯化钠、水按照上述质量分数混合溶解，调pH为6.2，过滤除菌。
试验例1 杂交试验
微孔板：NUNC Maxisorp微孔板。
试验方法：合成一段引物：5’-CACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3’，把上述引物分别与实施例1制备的DNA包被液、PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液混合均匀，每孔100μL加入到NUNC微孔板中，室温放置20h，弃掉孔内液体，微孔板在10％湿度下干燥3h保存，然后进行杂交试验，首先加入预放大分子，55℃孵育40分钟；再加入放大分子，55℃孵育40分钟；然后加入探针标记物，50℃孵育40分钟，最后加入底物，46℃孵育20min，用冷光仪测定其化学发光信号的光子数。按表1所示方式布板，其中，BL为空白，P1、P2、P3为单链DNA阳性质控。表2是微孔板各孔中的光子数检测结果，表3为各个缓冲液包被效果的统计分析结果。
表1 布板表
表2 测定的光子数
表3 不同包被液效果的方差分析结果
注：PV1.35代表阴阳性，PV1.35＞1.0为阳性，PV1.35＜1.0为阴性。
结论：
1、从实验结果的光子来看，DNA包被液包被的微孔板的空白和阳性质控光子数有明显的差别，而PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液包被的微孔板并无明显的区别。
2、从实验的结果值来看，DNA包被液包被的微孔板的阳性质控P1、P2、P3结果值较高，而PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液包被的微孔板的阳性质控P1、P2、P3结果值较低，有的甚至为阴性。
3、DNA包被液包被的微孔板空白和阳性质控的CV值能保持在5％以内，而PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液包被的微孔板CV值较大。
试验例2 杂交试验
微孔板：康宁Costar微孔板。
试验方法：合成一段引物：5’-CACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3’，把上述引物分别与实施例1制备的DNA包被液、PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液混合均匀，每孔100μL加入到康宁微孔板中，室温放置20h，弃掉孔内液体，微孔板在10％湿度下干燥3h保存，然后进行杂交试验，首先加入预放大分子，55℃孵育40分钟；再加入放大分子，55℃孵育40分钟；然后加入探针标记物，50℃孵育40分钟，最后加入底物，46℃孵育20min，用冷光仪测定其化学发光信号的光子数。(试验方法同NUNC Maxisorp微孔板)。按表1所示方式布板。表4是微孔板各孔中的光子数检测结果，表5为各个缓冲液包被效果的统计分析结果。
表4 测定的光子数
表5 不同包被液效果的方差分析结果
注：PV1.35代表阴阳性，PV1.35＞1.0为阳性，PV1.35＜1.0为阴性。
结论：
1、从实验结果的光子来看，DNA包被液包被的微孔板的空白和阳性质控光子数有明显的差别，而PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液包被的微孔板并无明显的区别。
2、从实验的结果值来看，DNA包被液包被的微孔板的阳性质控P1、P2、P3结果值较高，而PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液包被的微孔板的阳性质控P1、P2、P3结果值较低，有的甚至为阴性。
3、DNA包被液包被的微孔板空白和阳性质控的CV值能保持在5％以内，而PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液包被的微孔板CV值较大。
试验例3
参照试验例1方法检测实施例2、3包被液的包被效果，其结果如下：
表6 本发明实施例2、3包被液效果的方差分析结果
注：PV1.35代表阴阳性，PV1.35＞1.0为阳性，PV1.35＜1.0为阴性。
结果显示，实施例2、3包被液的包被效果与实施例1包被效果相近，具有包被效果高、稳定性好的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种DNA杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：将引物5’-CACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3’与DNA包被液混合均匀，所述DNA包被液由硫酸铵、氯化钠和水组成；以质量百分比计，各组分用量为：硫酸铵42.0％～43.0％，氯化钠0.5％～0.8％，水补足；所述DNA包被液的pH值为6.0～6.2，混合液以每孔100μL加入到微孔板中，室温放置20h，弃掉孔内液体，干燥微孔板，然后进行杂交试验，首先加入预放大分子，55℃孵育40分钟；再加入放大分子，55℃孵育40分钟；然后加入探针标记物，50℃孵育40分钟，最后加入底物，46℃孵育20min，用冷光仪测定其化学发光信号的光子数。
2.根据权利要求1所述的DNA杂交方法，其特征在于，所述干燥为在10％湿度条件下干燥3h。
3.根据权利要求1所述的DNA杂交方法，其特征在于，所述用于定量检测的DNA包被液制备方法为将硫酸铵、氯化钠溶解于水中，调节pH值至6.0～6.2，过滤除菌。
4.根据权利要求3所述的DNA杂交方法，其特征在于，调节pH值采用的试剂为硫酸或氨水。
5.根据权利要求1所述的DNA杂交方法，其特征在于，所采用的DNA的包被方法采用DNA包被液作为缓冲液，将DNA样品与固相载体进行孵育。
6.根据权利要求5所述的DNA杂交方法，其特征在于，所述固相载体为聚苯乙烯固相载体。
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