CN1232182A - 一种新的聚合酶链式反应检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸分子的检测方法,该方法包括:(1)将特异性的探针用包被液点样于检测膜上,然后加以干燥,其中包被液的盐浓度大于2M,而且检测膜为平均孔径1—10微米的高分子聚合物膜;(2)将该检测膜的一端置于含PCR扩增产物的液体中;(3)检测PCR产物是否与探针发生了杂交。本发明还提供了应用该方法的试剂盒。这些试剂盒可高效、快速地用于检测,如检测诸如沙眼衣原体、结核分枝杆菌、乙肝病毒、丙肝病毒和人获得性免疫缺陷病毒等病原体。

Description

一种新的聚合酶链式反应检测方法和试剂盒

本发明涉及核酸的检测方法，具体地涉及对聚合酶链反应(PCR)产物进行检测的方法。本发明还涉及核酸检测试剂盒，具体地涉及检测聚合酶链反应产物的试剂盒。更具体地，本发明涉及用于PCR疾病诊断的检测方法和试剂盒。

近年，随着生命科学研究的不断发展，人们已认识到核酸是决定遗传信息的关键物质。因此，通过检测样品中是否存在病原体的核酸，可以判断出检测对象是否携带某种病原体或患某种疾病。此外，通过检测是否存在致病基因等，可以预先对检测对象的健康情况作出判断。因此，在分子水平上对核酸进行检测已经越来越引起人们的重视。

目前PCR方法在中国已经得到广泛的应用，但是在PCR结果的判断上同样仍然处于相对较低的水平，在引物二聚体、非特异扩增条带的辨别上带有明显的个人化特征，结果的准确性较差。

目前常见的PCR扩增产物的分析方法有许多种，其优缺点如下：

方法	简要说明	优点	缺点	实用性
					琼脂糖凝胶电泳	不同大小的DNA分子电泳的速度不同，在胶上的位置不同	便宜、方便、快速、易于推广	特异性差	实用
聚丙烯酰胺凝胶电泳	不同大小的DNA分子电泳的速度不同，在胶上的位置不同	分辨率高于琼脂糖	特异性较差	实用
					酶谱分析法	根据目标模板的确定序列用内切酶消化结果鉴别	特异性较好，无需特殊仪器	适用范围有限制，操作性和灵敏度稍差	实用
核酸探针杂交法	用特异性探针与扩增产物杂交	特异性好	较为费时
					(1)点杂交	产物固定在膜上，与探针杂交	特异性好	步骤因产物而异，实用性较差	不实用

(2)反向点杂交	探针固定在膜上，与产物杂交	可以一次制备大量探针的膜，很方便制成试剂盒形式		实用
					(3)Southern杂交	扩增产物电泳分离后杂交	特异性好	操作复杂，需特殊仪器，难以推广	不实用
(4)微孔板杂交	探针固定在微孔板底部，与游离模板杂交	特异性好，可以定量测定	操作复杂，需特殊仪器，实验难度大，难以推广	视操作方式而定
					序列分析法	直接测定产物序列	精确	繁琐，成本高	不实用
荧光着色分析法	在扩增中掺入特殊荧光来鉴别产物	灵敏，易于自动化	成本高，需专用的仪器和试剂	不实用

本发明提出的方法由反向点杂交法衍生而来，它利用在固相膜上的探针，在快速流动的液相中进行杂交等反应。不仅保存了点杂交法的特异性好的优点，而且使操作过程更为简单、快速、灵敏。

下面以一种常见的病原体沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，简称CT)为例，进一步详细地来说明本领域已有技术的状况。

沙眼衣原体是一种病原体，它具有与革兰氏阴性菌相似的细胞壁、DNA及RNA，可附着于宿主细胞与其特异体受体结合，从而导致成人及新生儿包涵体结膜炎，男性化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。沙眼衣原体不仅可致眼部感染，还可引起性传播疾病，如宫颈炎、盆腔炎、尿道炎、不孕症等。该病原体感染时常缺乏特异症状，易形成隐匿感染，给临床诊断带来困难。同时衣原体传播时易与其它微生物病原体混合感染，造成诊断和治疗的复杂性。目前沙眼衣原体的感染率和危害性在性传播疾病中已超过淋球菌。国内有关子宫沙眼衣原体的报道远低于国外，这与实验方法、病例选择、地区差异均有关系，尤其是因为缺乏方便、准确、特异、灵敏的检测方法。

经典的沙眼衣原体检测方法有细胞培养法，免疫荧光法，酶联免疫法(EIA)，近年来又发展了核酸杂交法及PCR扩增其特异靶序列等检测方法。

在上述方法中，细胞培养法既费时又繁琐，而且培养条件不适、标本运送不当、标本不足等原因均可影响检测敏感性；免疫荧光和EIA直接检测法快速简便，但灵敏度和特异性较低，且由于感染后产生的IgG存在时间长，因此无法区分初次与再次感染。核酸杂交法特异性及敏感性较高，但操作比较复杂，结果不很稳定，目前还无法广泛推广。PCR法灵敏度高于细胞培养法、EIA法和DNA探针法，故PCR法作为临床上各种衣原体感染标本检测的实用方法，具有灵敏、快速、简单的优点，对CT的早期诊断及抗菌治疗效果评价具有重要意义。

目前PCR方法在中国已经得到广泛的应用，但是在PCR结果的判断上绝大多数仍停留在普通的电泳后目测水平。在引物二聚体、非特异扩增条带的辨别上带有明显的个人化特征，结果的准确性较差。在此情况下，使用针对特定靶序列的特异性探针与扩增产物进行特异杂交，能较好地提高检测的灵敏度和特异性。

杂交的方式从探针的形式上分为正向和反向杂交，在操作的形式上分为液相杂交、固相杂交等。反向固相杂交是将探针固定在固相载体上，然后将靶序列与探针进行杂交，使靶序列核酸特异吸附在固相上。随后再用金、荧光、发光物、酶标等标记方法使吸附的核酸显示出来。

常规的杂交-酶标法的操作步骤都很多，包括独立进行的预杂交、杂交、洗脱、酶标、显示和中止等多个步骤。某些步骤往往需反复多次才能达到较好的结果，因而费时费力，对试剂的消耗也较多，十分不便，成本也很高。

因此，本领域中迫切需要一种对核酸分子，尤其是PCR扩增出的核酸分子进行高效而特异性地检测的方法。

本发明的目的就是提供一种高效、简便的检测核酸分子(尤其PCR产物)的方法。

本发明的另一目的是提供用于该检测方法的试剂盒。

本发明提供了一种检测核酸分子(尤其是PCR扩增出的核酸分子)的方法，该方法包括：

(1)将特异性的探针用包被液点样于检测膜上，然后加以干燥，其中包被液的盐浓度大于2M，而且检测膜为平均孔径1-10微米的高分子聚合物膜；

(2)将该检测膜的一端置于含PCR扩增产物的液体中；

(3)检测PCR产物是否与探针发生了杂交。

本发明还提供了一种检测核酸分子(尤其是PCR扩增出的的核酸分子)的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)检测膜，该膜为平均孔径1-10微米的高分子聚合物膜；

(b)包被液，该包被液的盐浓度大于2M；

该试剂盒还可任选地含有：

(c)进行PCR反应所需的试剂；

(d)检测PCR产物所需的试剂。

在另一例子中，本发明提供了另一种形式的检测核酸分子(尤其是PCR扩增出的的核酸分子)的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)检测膜，该膜为平均孔径1-10微米的高分子聚合物膜，在该检测膜上已固定有特异性的探针，其中该探针是用盐浓度大于2M的包被液点样的；

该试剂盒还可任选地含有：

(c)进行PCR反应所需的试剂；

(d)检测PCR产物所需的试剂。

下面结合附图进一步阐述本发明。在附图中，

图1为检测膜浸入含核酸分子的液体使液体移动方向的示意图。

图2为本发明一种检测膜的形状示意图。

本发明人通过多年研究发现，通过改进传统核酸杂交-检测法中所用的材料，可以大大提高核酸-杂交检测法的效率，并使操作大为简化。

在本发明中，“检测膜”指用于检测核酸分子的固相载体，它通常为膜状或片状，有时也被称为“载体膜”。其结构一般由背衬材料和涂在背衬材料上的膜涂层所组成。膜涂层一般为聚合物材料。

在本发明中，检测核酸分子时采用层析的形式，在固相载体上直接进行杂交反应。为了进行这样的杂交反应，载体必须满足三个方面的要求，即(1)具有良好的亲水性；(2)易于包被核酸探针和(3)对核酸、酶及其它物质的非特异吸附作用较小。

对于后两方面的要求，可选择在一定条件下能有效结合核酸探针，而在一般杂交条件下对核酸、蛋白质、酶、酶底物和其它有机分子较少发生非特异性吸附的高分子聚合膜材料，比如醋酸基、硝酸基或硫酸基的多聚物，如纤维素膜或者尼龙膜等。正如本领域技术人员所熟知的那样，在聚合过程中，通过调节聚合原料的浓度、配比、聚合速度、温度、添加剂、催化剂种类等条件，可以方便地控制聚合物的孔径、硬度、亲水性等各种理化指标。

本领域中用于核酸分子杂交的常规膜，其孔径很小，一般平均孔径为0.5微米左右或以下。但是用这种膜进行层析杂交时，有很多缺点如速度极其缓慢等，因此不适合用于本发明的检测方法。本发明的发明人发现，当检测膜涂层的聚合物的平均孔径在1-10微米时，不仅可以大大改善层析杂交的速度指标，从而使杂交过程在较短的时间内完成，而且还能使杂交效率保持在很高水平，并提高检测的灵敏度。较佳地，该检测膜的平均孔径为2-8微米；更佳地，平均孔径为2-6微米。

本发明的检测膜，其形状没有限制。较佳地为长条形。可以单片使用(如图1)，也可以多片同时使用。一种较佳的形式是将其制成梳齿形(图2)，以便于使用。齿条数不限，一般为2-50条，较佳地为4-20条。参见图1，在使用时，将检测膜40的一端50浸在液体液面30之下。由于吸水材料10的存在，液体会从检测膜的浸没端50向吸水端60移动，从而将液体中的核酸分子夹带至探针包被点20处，以发生杂交反应。

本发明的检测膜可以在一端含有吸水材料，从而制成一体化的检测膜(固相膜+吸水材料)。

在本发明的检测方法中，需要将特异性的核酸探针固定在固相载体(即检测膜)上。在这一固定过程中，为了牢固地固定核酸探针并形成不扩散的探针点，需要使用包被液。

包被液的选择非常重要。首先，包被液应当提供适当的酸碱度，使得载体膜不被腐蚀及核酸不被降解或脱基团；其次还应提供适当的离子强度、带电性及电荷，使核酸能与载体膜较易互相吸引，以降低反应的难度并提高结合的效率。本领域中一般使用的包被液是较低浓度的缓冲液，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等。但是，将这些包被液用于层析杂交时，却发现其效果不佳，主要的缺点是所形成的核酸探针的点样点会扩散得很大。从而降低检测灵敏度，不利于检测。

为了选出合适的包被液，本发明的发明人选用各种不同的溶剂(包括有机溶剂)和溶质进行了试验。结果意外地发现，对于包被液的效果而言，所选用的溶质的种类并不重要，只要其不对核酸分子和检测膜造成损害即可。相反，盐浓度对于包被效果有显著影响。本领域常规包被液(或缓冲液)的盐浓度一般为毫摩尔数量级，一般为5-100mM左右。根据本发明，当盐浓度大于1M以上时，可以获得可接受的点样结果。较佳地，盐浓度范围为2M至该盐的饱和浓度之间；更佳地，盐浓度为3M至该盐的饱和浓度之间。

至于提高盐浓度而改善核酸探针固定点样效果的机制，可能是因为足够的盐浓度使得液体的表面张力增大，从而使得核酸探针在包被过程中不会在载体膜上发生大范围的扩散，导致提高了单位面积上包被的核酸探针的量。

根据本发明，对包被液的溶剂没有特别的要求，只要在该溶剂中能够使盐浓度大于1M，更佳地大于2M。较佳地，包被液溶剂是水。

在本发明，溶解于包被液中的盐类可以是本领域中常用的无机盐或有机盐，只要其不对核酸分子和检测膜造成损害即可。例如，盐的阳离子可选自：碱金属离子、碱土金属离子、过渡金属离子、铵离子等，更具体的例子有锂、钠、钾、铯、镁、铁、铝、钙、铵等。阴离子可选自：卤离子、一元或多元的无机酸根离子、和/或一元或多元的有机酸根离子，更具体的例子有硝酸根离子、磷酸根离子、硫酸根离子、氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、乙酸根离子、草酸根离子、琥珀酸根离子、柠檬酸根离子等。

也可以使用一种或多种盐类。较佳地，该盐类溶解于水中后，溶液的pH接近中性(或稍偏碱性或酸性)。可用于本发明的盐类的例子(并不限于此)有：氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、乙酸钠、乙酸钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、尿素、柠檬酸钠、柠檬酸钾、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠以及它们的混合物。较佳地，盐类为氯化钾、氯化钠、乙酸钠，硫酸铵及其混合物。

此外，尿素也可用作本发明包被液中的盐类。

本发明方法可用于检测来源不同的、以及用不同方法获得的核酸分子。较佳地，所检测的核酸分子是PCR扩增产物。

在实际的PCR操作过程中，由于各种原因，比如模板数量、质量的不稳定，模板核酸在总核酸中的丰度，PCR反应体系的PH值、离子强度、二价镁离子的浓度，干扰因子的种类和数量，DNA聚合酶的性能(核苷酸掺入速率、对模板的忠实程度、对反应体系的要求等)，引物的特异性、纯度和浓度等等，经常导致PCR扩增结果的不确定性。会出现条带模糊或拖尾现象、引物二聚体、非特异扩增产物、灵敏度不够导致的假阴性等。针对这些问题，就需要使用特异的核酸探针并结合其它具有放大效应的检测手段就有了实际的必要性。

在将特异性的核酸探针用本发明的包被液固定在检测膜上之后，可将其一端浸在含有待检测的核酸分子的液体(如PCR扩增后的反应液体)中，检测膜的一端与吸水性材料相接触，以便吸引含有待检测核酸分子的液体(见图1)。待检测的核酸分子便会到达探针的包被点样点，如果该核酸分子可与探针发生特异性结合，那么就可得到阳性结果；如果不与探针发生特异性结合，就得到阴性结果。

在实施本发明方法时，对于已经被探针特异地吸附在载体膜上的核酸，应当采用信号放大的方式对核酸进行特异地显示。可以利用的方法包括本领域熟知的金标记、酶标记、同位素标记、荧光标记和化学发光物标记等方法。其中以酶标记最为常见，因为这种方法具有使用安全、操作简便、结果清楚、不需要特殊设备、灵敏度较高等优点。常用的标记酶是碱性磷酸酶或者过氧化物酶，一般条件下，都使用可溶性的酶反应底物和产物。但是当显色反应是在固相载体上进行时，如果仍然使用可溶性的酶反应底物和产物，会导致酶显色反应的有色产物在固相载体表面的水相层中快速扩散，结果无法分辨。当使用包括5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑、3,3′-二氨基联苯胺等不溶性底物时，问题就迎刃而解，可以清晰地观察并便于保存。

鉴于实际诊断中趋向于简易和试剂、操作规范的要求，本发明提供了一种检测核酸分子的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)检测膜，它是平均孔径1-10微米的高分子聚合物膜；

(b)包被液，该包被液的盐浓度大于2M；

该试剂盒还可任选地含有：

(c)进行PCR反应所需的试剂；

(d)检测PCR产物所需的试剂。

在使用时，用户可将试剂盒中的包被液与核酸探针(用户自己制备的或通过其他途径得到的)混合，然后进行点样。待干燥后便可用于检测。

或者，将包被液与核酸探针混合并点样的操作由制造商完成，这样便提供了另一种试剂盒，该试剂盒包括：

(a)检测膜，该膜为平均孔径1-10微米的高分子聚合物膜，在该检测膜上已固定有特异性的探针，其中该探针是用盐浓度大于2M的包被液点样的；

该试剂盒还可任选地含有：

(c)进行PCR反应所需的试剂；

(d)检测PCR产物所需的试剂。

为了方便应用，这些试剂盒中都可任选地包含(c)进行PCR反应所需的试剂，如引物、PCR聚合酶、dNTP等；以及(d)检测PCR产物所需的试剂。检测所需的试剂随具体情况有所不同，这都是本领域技术人员所熟知的。

此外，试剂盒还可含有进行其他操作所需的物品，如采样、抽提等所需的试剂和材料。

一般，试剂盒可包括标本采集和保存的规范(即标准说明)、用DNA提取液对标本中核酸的提取、用针对沙眼衣原体特异的引物优化配制的PCR反应液和高效的DNA聚合酶对提取的核酸进行PCR扩增、通过用生物素标记正链引物的方法使扩增产物带上生物素标记、用已经利用发明提供的方法固定在发明所称固相载体膜上的沙眼衣原体特异核酸探针进行特异高效的俘获、随后在杂交、亲和素偶联酶结合等步骤中将酶固定在特定的点上，并催化专用的酶底物，使之产生不溶性有色产物，出现不溶性的有色斑点。可以根据有无这个特定位置的有色斑点来判断原始样品中是否存在沙眼衣原体DNA。

下面结合具体实施例，进一步详细地阐述本发明。

实施例1

包被液中的盐浓度

在该实施例中，比较了用不同盐浓度的包被液包被核酸探针时的效果。

在该实施例中选用孔径在5微米的尼龙膜时，取生物素标记寡核苷酸(检测沙眼衣原体的探针，见下面实施例)与各种不同盐混合至一定盐浓度，用微量吸嘴移取1微升(含2.5pmol标记探针)，点在载体膜上，37℃放置20分钟使其干燥，然后将膜在254nm紫外光下照射3分钟。浸入5×SSC溶液中漂洗5分钟，除去未结合的探针和盐。浸入链霉亲和素交联碱性磷酸酶溶液中，室温放置10分钟。换PBS缓冲液，洗膜三次，每次5分钟。加入碱性磷酸酶底物后显色。结果如下表：

            表1：探针包被液成分对包被效果的影响

盐种类及浓度	点样斑直径(微米)1	显色结果
			0.5M NaCl	＞8	无法分辨
1M NaCl	＞8	无法分辨
			0.5M KCl	＞8	无法分辨
1.5M NaCl	4-6	有较大圆点
			2M NaCl	3-4	有圆点
4M NaCl	1-2	清晰圆点
			饱和NaCl	1	清晰圆点
2M(NH4)2SO4	2-4	清晰圆点
			3M乙酸钠	2-3	清晰圆点
3M氯化钾	2-3	清晰圆点
			饱和KCl	1-2	清晰圆点
3M尿素	2-3	清晰圆点
			2M磷酸钠	2-3	清晰圆点
3M乙酸钾	2-3	清晰圆点
			3M硝酸钾	2-3	清晰圆点
3M柠檬酸钠	2-3	清晰圆点
			2M NaCl+2M KCl	1-2	清晰圆点

注¹：在点膜后5分钟时，包被液未被吸干时测量。

结果表明：当包被液中盐浓度小于1M时，探针不能被有效地包被。当盐浓度大于1M时，探针可以被包被。当盐浓度大于2M时，探针可以被有效地包被。在包被液中盐浓度大于3M时，探针包被的效果非常好。至于盐的种类，没有特别的要求，只要不对探针和检测膜造成严重损害即可。

实施例2

检测膜平均孔径大小及效果

在该实施例中，比较了检测膜平均孔径大小对核酸分子检测的影响。

在该实施例中使用各种不同孔径的载体膜，用含2.5pmol寡核苷酸探针(检测沙眼衣原体的探针，见下面实施例)的1微升4M NaCl溶液作包被液，比较膜种类、孔径对效果的影响。

用微量吸嘴移取1微升(含2.5pmol生物素标记探针)至载体膜(膜的大小为8mm×25mm)的正中部位，37℃放置20分钟使其干燥，然后将膜在254nm紫外光下照射3分钟。膜下端浸入80ml 5×SSC溶液中，上端用吸水纸吸引(如图1)，使下方溶液被洗干，除去未结合的探针和盐。浸入80微升链霉亲和素交联碱性磷酸酶溶液中，室温放置10分钟。换PBS缓冲液，室温放置5分钟，重复三次。浸入80微升碱性磷酸酶底物液后，室温放置5-10分钟显色。结果如下表：

                   表2：膜对包被效果的影响

检测膜种类及平均孔径	显色结果	层析情况
			0.22微米尼龙膜	无法分辨	下方液体未吸干
0.45微米尼龙膜	无法分辨	下方液体未吸干
			1微米尼龙膜	有圆点	能吸干，稍慢
5微米尼龙膜	清晰圆点	能吸干，很快
			0.45微米硝酸纤维素膜	无法分辨	下方液体未吸干
1微米硝酸纤维素膜	圆点	能吸干，稍慢
			5微米硝酸纤维素膜	清晰圆点	能吸干，很快

结果表明，包被所用的载体膜的孔径大小对结果的影响很大，孔径较小的膜由于液体迁移的速度太慢而无法实际应用于层析杂交；孔径在1-10微米，更佳地在1-5微米之间较为合适；当孔径＞10微米时，其机械强度较差，易于破损。至于膜的种类则对实验效果的影响不重要。

实施例3

检测沙眼衣原体

(1)引物

通过对沙眼衣原体的研究已知道，沙眼衣原体的共有质粒，存在于所有沙眼衣原体各种血清型中，该质粒据报道还未在其它微生物基因组上找到同源序列。该质粒位于沙眼衣原体的双子房中，它的一个基因可能编码dnaB样蛋白。肺炎衣原体缺乏质粒，沙眼衣原体与鹦鹉衣原体，虽然都有质粒，但通过内切酶分析，两种质粒不同。沙眼衣原体的共有质粒在每个衣原体中有10个拷贝，有助于提高PCR检测的灵敏度。所以选择沙眼衣原体的共有质粒作为靶序列，它具特异性和保守性。并且以此靶序列作为扩增模板，可诊断存在不同病灶的沙眼衣原体的存在。

在选择靶核酸序列中，对基因库及Internet上Medline中有关CT的基因序列进行了全面检索，并进行了同源性区域比较，找到五个高度同源性的沙眼衣原体的共有质粒的序列，这五个质粒分别为CTDNAB(一个能编码出dnaB样蛋白的基因)，CTORF(位于沙眼衣原体双子房中的质粒)，CTPLAS75(一种沙眼衣原体能在哺乳动物细胞中生长所需要的质粒)，CTPLASCR(沙眼衣原体中隐藏质粒的序列，它能参与DNA复制)，PPLICG(与其它病原体有明显不同的双子房质粒)。

选择其中CTORF作为设计靶核酸序列，该序列长度为7496bp，它在每个病原体中有10个拷贝。在高同源区设计了一对引物，扩增产物为273bp。引物设计在1881及2131nt的位置。上下游引物长度均为23bp，序列如下：

正链5′-TTTCT CATAC GGTTT TCCTC GAT-3′，

负链5′-CAGAG AACGC TGCTC GTCTT TTT-3′。

引物由DNA合成仪自动合成，采用反向高压液相层析或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步纯化，紫外吸收法定量后，溶解在无菌双蒸水中，浓度为25pmol/微升。这套引物特异性地针对沙眼衣原体的核酸序列，与其它相近种类微生物，如生殖支原体、人形支原体、解脲支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体等没有同源性。

用沙眼衣原体进行PCR反应：将引物等加入PCR反应体系中，各成分终浓度为50mM KCl,10mM Tris-HCl PH8.3(25℃),2mMMgCl₂,0.5UTaq DNA聚合酶，3％甲酰胺，0.2mM dNTPs,4pmol正链引物，4pmol负链引物，反应总体积为20微升。此体系中分别加入10⁴、10³、10²、10¹、10⁰个沙眼衣原体模板DNA，在变性温度93℃，退火温度55℃，延伸温度72℃的循环下，进行35个循环的PCR扩增，循环结束后继续在72℃保温5分钟，然后冷却至室温。取样10微升，加入2微升的琼脂糖电泳上样液(0.25％溴酚蓝，5％葡聚糖水溶液)，混匀后和DNA分子量标记一起在含0.5ug/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上点样，电压5V/cm电泳30分钟。取出凝胶，在254nm的紫外灯下观察，以DNA分子量标记为参照在273bp地方有一根明显的澄黄色亮带，即为沙眼衣原体DNA的PCR扩增产物。此方法的灵敏度为一个反应体系中可以检测到10个沙眼衣原体模板DNA。

用各种病原体进行PCR反应：仍选用上述的引物对中病原体进行PCR反应。

采用固相DNA化学合成方法得到特定寡核苷酸引物，经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，紫外吸收法定量后，溶解在无菌双蒸水中，浓度为25pmol/微升。加入PCR反应体系中，成分为50mM KCl,10mMTris-HCl PH8.3(25℃),2mM MgCl₂，0.5UTaq DNA聚合酶，3％甲酰胺，0.2mM dNTPs,4pmol正链引物，4pmol负链引物，反应总体积为20微升。此体系中分别加入约100个拷贝的沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、解脲支原体、人形支原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、人白细胞DNA，在变性温度93℃，退火温度55℃，延伸温度72℃的循环下，进行35个循环的PCR扩增，循环结束后继续在72℃保温5分钟，然后冷却至室温。取样10微升，加入2微升的琼脂糖电泳上样液(0.25％溴酚蓝，5％葡聚糖水溶液)，混匀后和DNA分子量标记一起在含0.5ug/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上点样，电压5V/cm电泳30分钟。取出凝胶，在254nm的紫外灯下观察，以DNA分子量标记为参照，沙眼衣原体DNA的PCR扩增产物在273bp处有一根明显的澄黄色亮带。其它样品用这对引物扩增均不能得到273bp的扩增产物。

如上所述，本实施例中的引物可特异性地扩增出沙眼衣原体的DNA片段。

(2)探针

在本实施例中，确定CTORF作为靶核酸序列，寡核苷酸探针设计在1941nt的位置，长度为21bp，序列如下：

负链：5′TAAAC GAGCG GAAAA TGAAA T-3′。

寡核苷酸探针由DNA合成仪自动合成，采用反向高压液相层析或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步纯化。这条探针特异性地针对沙眼衣原体的核酸序列，与其它相近种类微生物，如生殖支原体、人形支原体、解脲支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体等没有同源性。

具体方法是：沙眼衣原体特异寡核苷酸探针用化学法自动合成后纯化，其5′端用带放射性同位素P³³的γ-ATP通过T4多核苷酸激酶催化磷酸化的方式标记P³³，标记后比活约2000Ci/mmol。乙醇沉淀法纯化标记探针。沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、解脲支原体、人形支原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、人白细胞总DNA裂解物0.5μg热变性后分别点样并热固定在0.45微米孔径、直径8mm的尼龙膜上。在5×SSC,0.5％SDS,100微克/ml变性并片段化鲑精DNA,30％甲酰胺缓冲液200μl中45℃保温条件下将样品膜孵育1小时进行预杂交，加入标记探针至2ng/ml与样品膜共同孵育、杂交2小时，0.2×SSC在42℃下洗膜三次。将X光胶片与膜紧贴曝光2小时，对X光胶片进行显影。在对应于沙眼衣原体DNA的地方出现一明显的黑色曝光点，在其它样品的对应点未出现明显的黑点。

结果表明，所设计的寡核苷酸探针对沙眼衣原体具有高特异性。

(3)本发明的检测方法和试剂盒

在该实施例中选用的包被液为4M氯化钠，检测膜为5微米的尼龙膜，膜上已包被有特异探针。

取含肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、解脲支原体、人形支原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、人白细胞总DNA各1纳克左右约50微升，含1、10、100、1000个沙眼衣原体的悬浮液约50微升，空白对照生理盐水50微升。分别加入DNA提取液50微升，混匀后100℃沸水浴15分钟，12000转/分离心5分钟，取上清液4微升，加入PCR反应体系(含沙眼衣原体特异性引物，其中正链引物5′端被生物素标记)中至终体积为20微升。在变性温度93℃，退火温度55℃，延伸温度72℃的循环下，进行35个循环的PCR扩增，循环结束后继续在72℃保温5分钟，然后冷却至室温。取PCR扩增产物10微升进行热变性后，加入杂交液至50微升。将检测膜齿条下端浸入杂交液，在42℃环境中进行杂交反应约15分钟。取出检测膜齿条，转移到50微升链霉亲和素-碱性磷酸酶工作液中，室温反应10分钟。取出检测膜齿条，转移到50微升碱性磷酸酶底物液中，室温反应10分钟。取出齿条，观察探针包被点。结果如下表。

                   表3：沙眼衣原体基因检测试剂盒使用结果。

模板来源	显色情况	判断结果
			人白细胞总DNA	无斑点	阴性
肺炎衣原体	无斑点	阴性
			鹦鹉热衣原体	无斑点	阴性
解脲支原体	无斑点	阴性
			人形支原体	无斑点	阴性
大肠杆菌	无斑点	阴性
			金黄色葡萄球菌	无斑点	阴性
1个沙眼衣原体	无斑点	阴性
			10个沙眼衣原体	有斑点	阳性
100个沙眼衣原体	有斑点	阳性
			1000个沙眼衣原体	有斑点	阳性

空白生理盐水

无斑点

阴性

结果表明，本发明的检测方法和试剂盒可检测出10个以上的沙眼衣原体，对其它相近的病原体基因无交叉反应。而且，与传统检测法相比，省时、高效、特异性高。

实施例4

检测结核分枝杆菌

在该实施例中，基本上采用与实施例3相同的方法，不同点在于该实施例中的检测方法和试剂盒用于检测结核分枝杆菌，且使用5μm硝酸纤维素膜。其中引物为：

正链CCTGC CCAGG TCGAC ACATA GG，

负链GTGTG GCTAA CCCTG AACCG TG，

而且检测试剂中包括特异性的探针TGCTA CCCAC AGCCG GTTAG G。

结果表明，本发明的检测方法和试剂盒可检测出约10个以上的结核分枝杆菌，对其它相近的病原体基因无交叉反应。而且与传统检测法相比，省时、高效、特异性高。

实施例5

检测乙肝病毒

在该实施例中，基本上采用与实施例3相同的方法，不同点在于该实施例中的检测方法和试剂盒用于检测乙肝病毒，其中引物为：

正链CCTCT TCATC CTGCT GCTAT GCC，

负链GGGGA AAGCC CTACG AACCA CTG，

而且检测试剂中包括特异性的探针CGAAC CACTG AACAA ATGGC A。

结果表明，本发明的检测方法和试剂盒可检测出约10个以上的乙肝病毒，对其它相近的病原体基因无交叉反应。而且与传统检测法相比，省时、高效、特异性高。

实施例6

检测丙肝病毒

该实施例中的检测方法和试剂盒用于检测丙肝病毒，其中引物为：

正链CTTCA CGCAG AAAGC GTCTA GC，

负链TCTAC GAGAC CTCCC GGGGC AC，

而且检测试剂中包括特异性的探针GGCAC TCGCA AGCAC CCTAT C。

取甲肝病毒、丙肝病毒、庚肝病毒、人获得性免疫缺陷病毒、汉坦病毒、风疹病毒、人白细胞总mRNA各10纳克左右约50微升，空白对照为生理盐水50微升。分别加入5M异硫氰酸胍溶液50μl，苯酚50μl，氯仿50μl，振荡10秒后，12000转/分离心5分钟。取上清液150μl，加入350μl无水乙醇，混匀，-20℃下30分钟后，于15000转/分离心10分钟。吸去上清液，沉淀在50℃干燥箱中放置10分钟。加入PCR反应体系(含丙肝病毒特异性引物，其中正链引物5′端被生物素标记；含10U重组反转录酶)中至终体积为20微升。在42℃条件下保温30分钟(进行反转录)。在变性温度93℃，退火温度55℃，延伸温度72℃的循环下，进行35个循环的PCR扩增，循环结束后继续在72℃保温5分钟，然后冷却至室温。取PCR扩增产物10微升进行热变性后，加入杂交液至50微升。将检测膜齿条下端浸入杂交液，在42℃环境中进行杂交反应约15分钟。取出检测膜齿条，转移到50微升链霉亲和素-碱性磷酸酶工作液中，室温反应10分钟。取出检测膜齿条，转移到50微升碱性磷酸酶底物液中，室温反应10分钟。取出齿条，观察探针包被点。

结果表明，本发明的检测方法和试剂盒可检测出约100个以上的丙肝病毒，对其它相近的病原体基因无交叉反应。而且与传统检测法相比，省时、高效、特异性高。

实施例7

检测人获得性免疫缺陷病毒

在该实施例中，基本上采用与实施例6相同的方法，不同点在于该实施例中的检测方法和试剂盒用于检测人获得性免疫缺陷病毒，其中引物为：

正链CCCTA CAATC CCCAA AGTCA AGG，

负链TACTG CCCCT TCACC TTTCC A，

而且检测试剂中包括特异性的探针GCTGT CCCTG TAATA ACCG。

结果表明，本发明的检测方法和试剂盒可检测出约100个以上的人获得性免疫缺陷病毒，对其它相近的病原体基因无交叉反应。而且与传统检测法相比，省时、高效、特异性高。

尽管本发明是结合具体实施例进行描述的，但是本领域的技术人员知道，可以对本发明作各种等价的改动和修改。应理解，这些等价形式同样在申请权利要求书所限定的范围之内。

Claims (16)

1．一种检测PCR产物的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)将特异性的探针用包被液点样于检测膜上，然后加以干燥，其中包被液的盐浓度大于2M，而且检测膜为平均孔径1-10微米的高分子聚合物膜；

(2)将该检测膜的一端置于含PCR扩增产物的液体中；

(3)检测PCR产物是否与探针发生了杂交。

2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该检测膜的平均孔径为2-8微米，而包被液的盐浓度大于3M。

3．如权利要求2所述的方法，其特征在于，该包被液中的盐选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、乙酸钠、乙酸钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、尿素、柠檬酸钠、柠檬酸钾、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠以及它们的混合物。

4．一种聚合酶链反应产物检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

(a)检测膜，该膜为平均孔径1-10微米的高分子聚合物膜；

(b)包被液，该包被液的盐浓度大于2M；

该试剂盒还可任选地含有：

(c)进行PCR反应所需的试剂；

(d)检测PCR产物所需的试剂。

5．如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该检测膜的平均孔径为2-8微米，而包被液的盐浓度大于3M。

6．如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该包被液中的盐选自：氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、乙酸钠、乙酸钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、尿素、柠檬酸钠、柠檬酸钾、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠以及它们的混合物。

7．如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该检测膜的外形为梳子形。

8．一种聚合酶链反应产物检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

(a)检测膜，该膜为平均孔径1-10微米的高分子聚合物膜，在该检测膜上已固定有特异性的探针，其中该探针是用盐浓度大于2M的包被液点样的；

该试剂盒还可任选地含有

(c)进行PCR反应所需的试剂；

(d)检测PCR产物所需的试剂。

9．如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，该检测膜的平均孔径为2-8微米，而包被液的盐浓度大于3M。

10．如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，该包被液中的盐选自：氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、乙酸钠、乙酸钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、尿素、柠檬酸钠、柠檬酸钾、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠以及它们的混合物。

11．如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，该检测膜的外形为梳子形。

12．如权利要求4或8所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有进行PCR所需的试剂，该试剂包括：引物：正链TTTCTCATAC GGTTTTCCTC GAT，

负链CAGAG AACGC TGCTC GTCTT TTT，

而且检测试剂中包括特异性的探针TAAAC GAGCG GAAAA TGAAAT，

该试剂盒用于检测沙眼衣原体。

13．如权利要求4或8所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有进行PCR所需的试剂，该试剂包括引物：正链CCTGC CCAGG TCGAC ACATA GG，负链GTGTGGCTAA CCCTG AACCG TG，

而且检测试剂中包括特异性的探针TGCTA CCCAC AGCCG GTTAG G

该试剂盒用于检测结核分枝杆菌。

14．如权利要求4或8所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有进行PCR所需的试剂，该试剂包括引物：正链CCTCT TCATC CTGCT GCTAT GCC，

负链GGGGA AAGCC CTACG AACCA CTG，

而且检测试剂中包括特异性的探针CGAAC CACTG AACAA ATGGC A，

该试剂盒用于检测乙肝病毒。

15．如权利要求4或8所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有进行PCR所需的试剂，该试剂包括引物：正链CTTCA CGCAG AAAGC GTCTA GC，

负链TCTAC GAGAC CTCCC GGGGC AC，

而且检测试剂中包括特异性的探针GGCAC TCGCA AGCAC CCTAT C，

该试剂盒用于检测丙肝病毒。

16．如权利要求4或8所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有进行PCR所需的试剂，该试剂包括引物：正链CCCTA CAATC CCCAA AGTCA AGG，

负链TACTG CCCCT TCACC TTTCC A,GCTGT CCCTG TAATA ACCG

而且检测试剂中包括特异性的探针GCTGT CCCTG TAATA ACCG，

该试剂盒用于检测人获得性免疫缺陷病毒。

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