CN105861676A - 一种用于包被核酸引物的缓冲液及包被核酸引物的制备方法 - Google Patents
一种用于包被核酸引物的缓冲液及包被核酸引物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于包被核酸引物的缓冲液，按质量体积浓度包括，5.3～5.6g/L的磷酸氢二钠、2.5～3.0g/L的磷酸二氢钠、0.5～0.8g/L的氯化钠、25～32g/L的多聚赖氨酸、0.03～0.09g/L的防腐剂和水。采用本发明的包被缓冲液，能够有效的减少核酸引物包被的整体时间，又能够减少复杂的工艺步骤，一步法工艺大大降低的成本效益，而且本发明的包被缓冲液，大大降低了原料成本，使最终产品的价格更低廉。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于包被核酸引物的缓冲液及包被核酸引物的制备方法。
背景技术
随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，利用核酸杂交来进行肿瘤或癌的诊断、病毒、细菌等感染、以及各种基因疾病的检测领域中。现有技术中将核酸引物包被在微孔板上，如聚苯乙烯塑料板，进行肿瘤或癌的诊断、病毒、细菌等感染、以及各种基因疾病的检测。
核酸引物，又名引子，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。包被(Coating)，是将某种化学基团的分子通过化学偶联方式均匀涂布在目标材料表面，结合到固相载体表面的过程。如蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基因与固相载体表面的疏水基因间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
由于近些年生物学发展迅速，以及生物物理技术的大量应用，对包被核酸引物的需求量也在快速提高，同时，对包被核酸引物的价格也日趋降低。然而，现有工艺技术耗时太长，平均耗时在4～5天左右，并且工艺技术太过于复杂，反复洗板步骤，平均工艺下来每块板需要洗板15次左右，而且现有的工艺技术材料消耗成本太高，包被所用的试剂成本太高，需要进口，并且价格昂贵。
因此，如何找到一种包被核酸引物的制备方法，能够减少核酸引物包被的整体时间，降低时间成本，又能够减少复杂的工艺步骤，已成为行业内具有前瞻意识的生产厂家亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于包被核酸引物的缓冲液及包被核酸引物的制备方法，本发明提供的核酸引物的包被方法，能够有效的减少核酸引物包被的整体时间，又能够减少复杂的工艺步骤。
本发明提供了一种用于包被核酸引物的缓冲液，按质量体积浓度包括：
优选的，所述缓冲液还包括16～18g/L的硫酸钠。
优选的，所述缓冲液还包括2-巯基乙醇；
所述2-巯基乙醇的质量体积浓度为0.35～0.46g/L。
优选的，所述防腐剂为叠氮钠和/或ProClin300。
本发明还提供了一种包被核酸引物的制备方法，包括以下步骤：
A)将核酸引物溶于TE缓冲溶液中，得到混合液；
将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、多聚赖氨酸、氯化钠、防腐剂和水混合后，得到缓冲液；
B)将上述步骤得到的混合液和缓冲液再次混合后，得到包被混合液；
C)将上述步骤得到的包被混合液放入包被板后进行包被，得到包被后的核酸引物。
优选的，所述混合液中，所述核酸引物的浓度为3～5μg/mL。
优选的，所述包被混合液中，所述核酸引物的浓度为1.5～2.5μg/mL。
优选的，所述包被的时间为18～25h；所述包被的温度为0～37℃；
所述包被板为多孔微孔聚苯乙烯板。
优选的，所述步骤A)具体为：
将核酸引物溶于TE缓冲溶液中，得到混合液；
将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠与水搅拌混合，再加入多聚赖氨酸，再加入硫酸钠、氯化钠和防腐剂后，得到缓冲液。
优选的，所述包被后还包括处理步骤：
用PBS缓冲液清洗所述包被板，洗涤1～3遍后干燥；
所述干燥的时间为4～9h；所述干燥的湿度为10％～35％RH。
本发明提供了一种用于包被核酸引物的缓冲液，按质量体积浓度包括，5.3～5.6g/L的磷酸氢二钠、2.5～3.0g/L的磷酸二氢钠、0.5～0.8g/L的氯化钠、25～32g/L的多聚赖氨酸、0.03～0.09g/L的防腐剂和水。与现有技术相比，本发明有效的减少核酸引物包被的整体时间，将现有的核酸引物包被工艺，从平均耗时在4～5天，提升到平均耗时在1天左右，大大提高了生产的通量；而且能够减少复杂的工艺步骤，现有工艺需要反复洗板，平均整个工艺每块包被板需要洗板15次左右，而本发明的平均洗板步骤需要6次左右，大大降低了工艺复杂性，更适合作为标准工艺推广；此外，现有的包被缓冲液价格昂贵，而本发明的包被缓冲液，大大降低了原料成本，使最终产品的价格更低廉。
附图说明
图1为本发明实施例1中验证实验信噪比数据图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用分析纯。
本发明所有原料，其牌号和简称均属于本领域常规牌号和简称，每个牌号和简称在其相关用途的领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据牌号、简称以及相应的用途，能够从市售中购买得到或常规方法制备得到。
本发明提供了一种用于包被核酸引物的缓冲液，按质量体积浓度包括：
本发明所述磷酸氢二钠的加入量优选为5.3～5.6g/L，更优选为5.35～5.55g/L，最优选为5.4～5.5g/L；本发明对所述磷酸氢二钠没有特别限制，以本领域技术人员熟知的磷酸氢二钠即可。本发明所述磷酸二氢钠的加入量优选为2.5～3.0g/L，更优选为2.6～2.9g/L，最优选为2.7～2.8g/L；本发明对所述磷酸二氢钠没有特别限制，以本领域技术人员熟知的磷酸二氢钠即可。本发明所述氯化钠的加入量优选为0.5～0.8g/L，更优选为0.55～0.75g/L，最优选为0.6～0.7g/L；本发明对所述氯化钠没有特别限制，以本领域技术人员熟知的氯化钠即可。本发明所述多聚赖氨酸的加入量优选为25～32g/L，更优选为26～31g/L，更优选为27～30g/L，最优选为28～29g/L；本发明对所述多聚赖氨酸没有特别限制，以本领域技术人员熟知的多聚赖氨酸即可。本发明所述多防腐剂的加入量优选为0.03～0.09g/L，更优选为0.04～0.08g/L，最优选为0.05～0.07g/L；本发明对所述防腐剂没有特别限制，以本领域技术人员熟知的防腐剂即可，本发明优选为叠氮钠和/或ProClin300。
本发明为提高缓冲液在包被核酸引物过程中的使用效果，优选还包括硫酸钠，所述硫酸钠的加入量优选为16～18g/L，更优选为16.2～17.8g/L，最优选为16.5～17.5g/L；优选还包括2-巯基乙醇，所述2-巯基乙醇的加入量优选为0.35～0.46g/L，更优选为0.37～0.43g/L，最优选为0.39～0.41g/L。
本发明还提供了一种包被核酸引物的制备方法，包括以下步骤：
A)将核酸引物溶于TE缓冲溶液中，得到混合液；
将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、多聚赖氨酸、氯化钠、防腐剂和水混合后，得到缓冲液；
B)将上述步骤得到的混合液和缓冲液再次混合后，得到包被混合液；
C)将上述步骤得到的包被混合液放入包被板后进行包被，得到包被后的核酸引物。
本发明所述制备方法中，所述原料的具体优选方案，以及加入份数的优选数值与前述缓冲液中组分的具体优选方案，以及加入份数的优选数值均一致，在此不再一一赘述。
本发明首先将核酸引物溶于TE缓冲溶液中，得到混合液；将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、多聚赖氨酸、氯化钠、防腐剂和水混合后，得到缓冲液。本发明对所述核酸引物没有特别限制，以本领域技术人员熟知的核酸引物即可；本发明对所述TE缓冲溶液没有特别限制，以本领域技术人员熟知的TE缓冲溶液即可，即由Tris和EDTA配置而成的，其pH值本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求以及质量要求进行选择和调整，本发明所述TE缓冲溶液的pH值优选为7.0～8.0，更优选为8.0。本发明对所述混合液中，核酸引物的浓度没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求以及质量要求进行选择和调整，本发明所述核酸引物的浓度优选为3～5μg/mL，更优选为3.3～4.7μg/mL，更优选为3.6～4.4μg/mL，最优选为3.9～4.1μg/mL。
本发明将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、多聚赖氨酸、氯化钠、防腐剂和水混合后，得到缓冲液，本发明为提高缓冲液的混合效果和使用效果，优选将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠与水搅拌混合，再加入多聚赖氨酸，再加入硫酸钠、氯化钠和防腐剂后，得到缓冲液，更具体的优选为先加入磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，后加入多聚赖氨酸，待溶液澄清后再加入易溶解的防腐剂、硫酸钠和氯化钠试剂，最后避光常温磁力搅拌2～3小时后，得到缓冲液。
本发明然后将上述步骤得到的混合液和缓冲液再次混合后，得到包被混合液。本发明对所述包被混合液中，核酸引物的浓度没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求以及质量要求进行选择和调整，本发明所述包被混合液中核酸引物的浓度优选为1.5～2.5μg/mL，更优选为1.6～2.4μg/mL，更优选为1.7～2.3μg/mL，最优选为1.9～2.1μg/mL。
本发明最后将上述步骤得到的包被混合液放入包被板后进行包被，得到包被后的核酸引物，即包被核酸引物。本发明所述包被的时间优选为18～25h，更优选为19～24h，最优选为20～23h；所述包被的温度优选为0～37℃，更优选为5～30℃，更优选为10～25℃，最优选为15～20℃。本发明对所述包被板没有特别限制，以本领域技术人员熟知的用于包被过程的包被板即可，本发明优选为多孔微孔聚苯乙烯板，更优选为96孔微孔聚苯乙烯塑料板。本发明为保证包被效果，还优选提前对包被板进行处理，本发明对所述处理步骤没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求以及质量要求进行选择和调整，由于本发明所公开的缓冲液，本发明的处理步骤仅需使用1X的PBS溶液(pH 8.2)清洗96孔聚苯乙烯塑料板三遍即可，再离心1200rpm，2min左右，确保板内无残留液体，放置干燥箱箱中待用即可。
本发明对所述放入的方式没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际生产情况、产品要求以及质量要求进行选择，本发明优选为注入，更具体优选为采用包被机或者校准过的多通道移液器等分至每孔中。本发明对所述包被混合液的用量没有特别限制，本发明优选为100～150μL。本发明所述包被过程更具体优选为采用包被机或者校准过的多通道移液器等分至每孔中，每孔加入包被混合液100～150μL，用锡箔纸或者保鲜膜密封板，并放置在4度冰箱中过夜包被。
本发明所述包被后优选还包括处理步骤，所述处理步骤优选为，采用PBS缓冲液清洗所述包被板，洗涤1～3遍后干燥，更具体优选为使用1X的PBS溶液(pH 8.2)清洗96孔聚苯乙烯塑料板3遍，离心1200rpm，2min左右，确保板内无残留液体，放置干燥箱中干燥4～9小时；本发明所述干燥的湿度优选为10％～35％RH，更优选为15％～30％RH，最优选为20％～25％RH。
本发明提供了一种用于包被核酸引物的缓冲液和包被核酸引物的制备方法，即缓冲液的应用方法。与现有技术相比，本发明有效的减少核酸引物包被的整体时间，又能够减少复杂的工艺步骤，一步法工艺大大降低的成本效益，而且本发明的包被缓冲液，大大降低了原料成本，使最终产品的价格更低廉。实验结果表明，本发明将现有的核酸引物包被工艺，从平均耗时在4～5天，提升到平均耗时在1天左右，大大提高了生产的通量；而且现有工艺需要反复洗板，平均整个工艺每块包被板需要洗板15次左右，而本发明的平均洗板步骤需要6次左右，大大降低了工艺复杂性，更适合作为标准工艺推广；此外，而本发明的包被缓冲液，大大降低了原料成本，使最终产品的价格更低廉。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种用于包被核酸引物的缓冲液及包被核酸引物的制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例中所述材料均由市售购得，其牌号与厂家与说明书中所述的牌号与厂家相一致。
实施例1
包被缓冲液在板式化学发光领域的应用；
步骤1：首先设计一种包被引物核酸序列(5’-NH2-GAGCGGATATATGCTTAGGAAT-3’)，合成该序列并溶解在PH为8.0的TE缓冲溶液中，将引物稀释至3ug/mL；
步骤2：配制包被缓冲液，按照下述浓度比例，5.6g/L的磷酸氢二钠、2.8g/L的磷酸二氢钠、0.6g/L的氯化钠、17g/L的硫酸钠、28g/L的多聚赖氨酸、0.06g/L的防腐剂和去离子水，注意，先加磷酸钠缓冲液，后加入多聚赖氨酸，待溶液澄清后加入易溶解的硫酸钠和氯化钠试剂，避光常温磁力搅拌2小时；
步骤3：将溶解在TE缓冲液中的引物和配制好的包被缓冲液等比例混合，确保引物终浓度在1.5μg/mL；
步骤4：使用1X PBS pH 8.2溶液清洗空白的96孔聚苯乙烯塑料板三遍，离心1200rpm，2min左右，确保板内无残留液体，放置干燥箱箱中待用；
步骤5：将步骤3中准备的试剂用包被机或者校准过的多通道移液器等分至每孔中，每孔加入包被混合液100μL，用锡箔纸或者保鲜膜密封板，并放置在实验室冰箱中4℃过夜包被。
步骤6：使用1X PBS PH 8.2溶液清洗96孔聚苯乙烯塑料板三遍，离心1200rpm 2min左右，确保板内无残留液体，放置干燥箱中干燥5～6小时，得到包被后的核酸引物。
步骤7：装袋密封，加入2g干燥剂，转至成品库储存。
验证步骤：设计核酸序列(5’-ATTCCTAAGCATATATCCGCTC-biotin-3’)，该序列与上述实施例1中包被的引物互补，合成该引物，将浓度稀释至100pmol/μL。
步骤9将引物稀释成3个梯度，分别是100pmol/μL，10pmol/μL，1pmol/μL。分别加入100μL到包被板孔内。
验证实验设计方案，参见表1。
表1
验证实验获得数据，参见表2。
表2
| 800 | 536580 | 62500 | 5735 |
| 855 | 554850 | 61450 | 6555 |
| 765 | 578565 | 65135 | 5355 |
| 755 | 568745 | 64780 | 5675 |
| 920 | 567850 | 59865 | 6125 |
| 880 | 578695 | 68710 | 6345 |
| 910 | 605245 | 58740 | 5845 |
| 775 | 575850 | 61520 | 6005 |
实验信噪比数据参见图1，图1为本发明实施例1中验证实验信噪比数据图，由图1可知，信号的梯度折式变化明显，线性范围良好。
包被精密性CV统计，参见表3。
表3
| 浓度值 | 参考值 | CV值 |
| 100pmol/μL | <15％ | 3.5％ |
| 10pmol/μL | <15％ | 5.1％ |
| 1pmol/μL | <15％ | 6.5％ |
由表3可知，包被缓冲液的精密性均在参考值范围内。
对本发明提供的缓冲液与现有缓冲液进行正常生产多批次平行实验，实验结果参见表4。
表4
由表4可知，本发明在精密性、吸附率、线性范围和高低值范围均优于现有常规工艺。
实施例2
磁珠包被流程：
1、将500mg氨基(PVA)磁珠加入到1.5mlEP管中，用1X pBS清洗3遍；加入0.1M MES处理3min；
2、将磁珠吸附，倒掉MES溶液，加入1ml本发明提供的包被缓冲液(按照下述浓度比例，5.5g/L的磷酸氢二钠、3.0g/L的磷酸二氢钠、0.7g/L的氯化钠、18g/L的硫酸钠、30g/L的多聚赖氨酸、0.09g/L的防腐剂和去离子水)，再加入引物100pmol，反应2～3小时；
3、加入磁珠封闭剂(JSR，Cat#65293)，结束反应，吸附磁珠，倒掉封闭剂；
4、1XPBS清洗三遍，将磁珠溶入1X TE缓冲液中，4度待用。
至此，完成捕获磁珠的包被过程。
设计一种捕获探针序列如下，参见表5：
表5
设计一种报告探针序列：
5’-ATGCTTTGACTCAGAGCTACATCGAAGCT-AP-3’(在3’端偶联上一个碱性磷酸酶分子标)
将合成后的CE、LE、BL按照1:4:2的比例混合，稀释成100fmol/ul作为反应引物，检测国家标准物质中心的标准品(货号GBW(E)090142)，浓度为4.4*105IU/ml。以该标准物质为检测靶标，对引物混合物命名为“HCV1b探针”。对技术的灵敏度和特异性进行验证。
将标准品稀释成5个梯度，StdA、StdB、StdC、StdD、StdE分别是4.4*105IU/ml、4.4*104IU/ml、4.4*103IU/ml、4.4*102IU/ml、4.4*101IU/ml。
配制检测体系：
总体系为100ul，每孔加入上述标准品2ul
设计布板如表6所示：
表6
检测方法：
步骤1将上述混合体系的微孔板置入55度恒温箱中杂交1.0～1.5小时之间，取出微孔板恢复至室温，配制好1X的洗脱液，准备进行洗板；
步骤2将96孔微孔磁力架置于板底，吸附磁珠1分钟左右，手托住板架甩出板内液体，再加入200ul的1X洗脱液，如此反复三遍；
步骤3取下96孔微孔板磁力架，每孔加入初级放大分子溶液100ul，置于55度恒温箱中放置40分钟；
步骤4将96孔微孔磁力架置于板底，吸附磁珠1分钟左右，手托住板架甩出板内液体，再加入200ul的1X洗脱液，如此反复三遍；
步骤5取下96孔微孔板磁力架，每孔加入标记探针溶液100ul，置于50度恒温箱中放置40分钟；
步骤6将96孔微孔磁力架置于板底，吸附磁珠1分钟左右，手托住板架甩出板内液体，再加入200ul的1X洗脱液，如此反复三遍；
步骤7取下96孔微孔板磁力架，每孔加入底物溶液100ul，置于35度恒温箱中放置10分钟；
步骤8将微孔板放入酶标仪或者化学发光仪中进行读数判定。
RLU结果见表7：
表7
扣除背景RLU结果见表8：
表8
HCV-RNA第二代核酸标准品，运用QuantiMAT技术检测有着良好的线性范围，大约检出限在440个IU/ml；
当拷贝数超过4.4*105IU/ml时，信号呈饱和状态，说明已到达检测上限值；
据此可以推断出QuantiMAT技术对HCV1b型别病毒的检测范围在440IU/ml～440000IU/ml之间；
其他型别的HCV病毒检测限在范围内适用。
实施例3
使用本发明在磁珠上包被偶联核酸：
本实施案例需要磁珠表面包被有一层聚乙烯涂层，然后使用本发明中的包被缓冲液进行包被偶联；
磁珠的处理方法，用1X PBS清洗磁珠，重悬后吸附三次，弃掉1XPBS，更换包被缓冲液，按照下述浓度比例，5.3g/L的磷酸氢二钠、2.5g/L的磷酸二氢钠、0.5g/L的氯化钠、16g/L的硫酸钠、25g/L的多聚赖氨酸、0.03g/L的防腐剂和去离子水。
加入20μg的包被引物(5’-NH2-GAGCGGATATATGCTTAGGAAT-3’)，避光孵育4小时；
孵育结束后加入封闭试剂(10％的bsa溶液)，洗涤三次，溶入TE缓冲液中4度保存；
验证步骤：设计核酸序列(5’-ATTCCTAAGCATATATCCGCTC-biotin-3’)，该序列与上述实施例1中包被的引物互补，合成该引物，将浓度稀释至100pmol/μL。
步骤9将引物稀释成3个梯度，分别是100pmol/μL，10pmol/μL，1pmol/μL。分别加入100μL到包被板孔内。
验证实验设计方案，参见表9。
表9
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
验证实验获得数据，参见表10。
表10
| 400 | 1036580 | 112500 | 10735 |
| 455 | 1054850 | 120450 | 12555 |
| 395 | 1078565 | 135135 | 11355 |
| 355 | 1068745 | 124780 | 10675 |
| 420 | 1067850 | 119865 | 12125 |
| 450 | 1078695 | 128710 | 12345 |
| 460 | 1005245 | 118740 | 11845 |
| 385 | 1075850 | 121520 | 12005 |
包被精密性CV统计，参见表11。
表11
| 浓度值 | 参考值 | CV值 |
| 100pmol/μL | <15％ | 3.9％ |
| 10pmol/μL | <15％ | 5.6％ |
| 1pmol/μL | <15％ | 4.9％ |
由表11可知，包被缓冲液的精密性均在参考值范围内。
对本发明提供的缓冲液与现有缓冲液进行正常生产多批次平行实验，实验结果参见表12。
表12
| 性能指标 | 常规工艺值 | 本发明工艺值 |
| 批内精密性 | 15％ | 8％ |
| 批间精密性 | 20％ | 12％ |
| 偶联吸附率 | 45％ | 75％ |
| 线性范围 | 0.95 | 0.99 |
| 低值范围 | 10fg/μL | 1fg/μL |
| 高值范围 | 1ng/μL | 5ng/μL |
由表12可知，本发明在精密性、吸附率、线性范围和高低值范围均优于现有常规工艺。
对比例1
常规工艺
预先需要对板子进行强酸、强碱的涮洗，然后用多聚赖氨酸过夜处理，提高包被吸附力(1天)；
1X PBS清洗3次，晾干后加入活化过的探针(探针活化试剂BS3，价格昂贵)过夜孵育(1天)；
1XPBS清洗3次，晾干后加入膜再生液(需要提前配制)，过夜孵育(1天)；
1XPBS清洗3次，晾干后加入封闭液(需要加入过量的BS3ThermoFisher，CAT#21580，￥1463/50mg)过夜孵育(1天)；
1XPBS清洗3次后在低于15RH％的湿度条件下进行干燥6小时，封装待用。
包被缓冲液采用(ThermoFisher，CAT#17250，￥1329/100ML)
验证实验设计方案，参见表13。
表13
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
| Blank | 100 | 10 | 1 |
验证实验获得数据，参见表14。
表14
| 1200 | 336580 | 32500 | 3735 |
| 1055 | 354850 | 31450 | 3555 |
| 1165 | 378565 | 35135 | 3355 |
| 1055 | 368745 | 34780 | 3675 |
| 1120 | 367850 | 29865 | 3125 |
| 1080 | 378695 | 38710 | 3345 |
| 1110 | 405245 | 38740 | 3845 |
| 1275 | 375850 | 31520 | 3005 |
包被精密性CV统计，参见表15。
表15
| 浓度值 | 参考值 | CV值 |
| 100pmol/μL | <15％ | 4.5％ |
| 10pmol/μL | <15％ | 5.9％ |
| 1pmol/μL | <15％ | 7.5％ |
对本发明现有缓冲液进行正常生产多批次平行实验，实验结果参见表16。
表16
| 性能指标 | 常规工艺值 |
| 批内精密性 | 15％ |
| 批间精密性 | 20％ |
| 偶联吸附率 | 45％ |
| 线性范围 | 0.95 |
| 低值范围 | 10fg/μL |
| 高值范围 | 1ng/μL |
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种用于包被核酸引物的缓冲液，其特征在于，按质量体积浓度包括：
2.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液还包括16～18g/L的硫酸钠。
3.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液还包括2-巯基乙醇；
所述2-巯基乙醇的质量体积浓度为0.35～0.46g/L。
4.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠和/或ProClin300。
5.一种包被核酸引物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将核酸引物溶于TE缓冲溶液中，得到混合液；
将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、多聚赖氨酸、氯化钠、防腐剂和水混合后，得到缓冲液；
B)将上述步骤得到的混合液和缓冲液再次混合后，得到包被混合液；
C)将上述步骤得到的包被混合液放入包被板后进行包被，得到包被后的核酸引物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述混合液中，所述核酸引物的浓度为3～5μg/mL。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述包被混合液中，所述核酸引物的浓度为1.5～2.5μg/mL。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述包被的时间为18～25h；所述包被的温度为0～37℃；
所述包被板为多孔微孔聚苯乙烯板。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)具体为：
将核酸引物溶于TE缓冲溶液中，得到混合液；
将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠与水搅拌混合，再加入多聚赖氨酸，再加入硫酸钠、氯化钠和防腐剂后，得到缓冲液。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述包被后还包括处理步骤：
用PBS缓冲液清洗所述包被板，洗涤1～3遍后干燥；
所述干燥的时间为4～9h；所述干燥的湿度为10％～35％RH。
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| Title |
|---|
| ELENA P. IVANOVA, ET AL.: "Poly(l-lysine)-mediated immobilisation of oligonucleotides on carboxy-rich polymer surfaces", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 * |
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