CN107014791A - 一种荧光传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种荧光传感器及其制备方法和应用，利用碳量子点作为荧光材料，通过单克隆抗体、核酸适配体同时与目标物结合，最终得到具有夹心式结构的荧光传感器，其上部为目标物的核酸适配体，中部为目标物，下部为目标物的单克隆抗体，所述目标物的核酸适配体上修饰有巯基，所述碳量子点通过氢键作用结合在目标物的核酸适配体上。本发明还公开了一种荧光传感器的制备方法。本发明制备的荧光传感器可用于定量检测毒菌毒素浓度，尤其是定量检测黄曲霉毒度B1的浓度，其稳定性和特异性强，检测范围更广、更准确。

Description

一种荧光传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种荧光传感器及其制备方法和应用。

背景技术

黄曲霉毒素（Aflatoxins，简称AFT）是一种毒性极强的剧毒物质。1993年，被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1（简称AFB1）最为多见，其毒性和致癌性也最强，玉米，花生，棉花种子以及一些干果中经常能被检测到。目前，开发高灵敏的黄曲霉毒素B1检测方法已成为国际关注的重点。

核酸适配体能与特定目标物质结合，具有高特异性、高选择性的特点，可以筛选不同种类的目标物，被广泛应用于生物传感器领域。同时其制备方法也更为简单，可在体外大量快速地合成，容易获得。碳量子点（Carbon Quantum Dots，简称CQDs）具有传统半导体量子点的优良光致发光性能，且毒性低、生物相容性好、化学稳定性高、耐光漂白性强、易于表面修饰，在生物成像、荧光标记、药物运输、金属离子检测、光催化、生物传感器等方面具有重要的应用潜力。

目前，检测黄曲霉毒素B1的方法很多，但存在如下缺点：检测所需试剂多,操作繁琐，检测周期长，重现性差，设备昂贵，前处理复杂等。因此，开发一种核酸适配体结合碳量子点检测黄曲霉毒素B1的荧光传感器，将具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种荧光传感器，构建一种特殊结构的荧光传感器，具有更强的稳定性，可用于低浓度的待测物的检测，使这种荧光传感器的检测范围更广；本发明的另一目的是提供这种荧光传感器的制备方法；本发明的第三个目的是将该荧光传感器应用于定量检测毒菌毒素浓度，尤其是用于黄曲霉毒素B1的定量检测。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种荧光传感器，所述荧光传感器为夹心式结构，以碳量子点为荧光材料；所述夹心式结构的上部为目标物的核酸适配体，夹心式结构的中部为目标物，夹心式结构的下部为目标物的单克隆抗体，所述目标物的核酸适配体上修饰有巯基，所述碳量子点通过氢键作用结合在目标物的核酸适配体上。

进一步地，所述目标物为黄曲霉毒素B1，所述碳量子点通过氢键作用结合在黄曲霉毒素B1的核酸适配体上。

本发明还提供一种荧光传感器在定量检测毒菌毒素浓度方面的应用。

进一步地，所述毒菌毒素为黄曲霉毒素B1。

本发明还提供一种荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将碳量子点与已激活的目标物的核酸适配体混合，碳量子点通过氢键作用结合在目标物的核酸适配体上，得到碳量子点-核酸适配体检测探针；

步骤二：将目标物的单克隆抗体固定在微孔板上；

步骤三：将目标物加入步骤二中固定有目标物的单克隆抗体的微孔板内，目标物与单克隆抗体发生特异性结合，冲洗掉未与单克隆抗体结合的目标物，留在微孔板底部的即为目标物与单克隆抗体的结合体；

步骤四：将步骤一的碳量子点-核酸适配体检测探针加入到步骤三的目标物与单克隆抗体的结合体中，得到荧光传感器。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.传统的检测大分子物质的方法，都是单一利用抗体与目标物结合，或是核酸适配体与目标物结合，从而间接测出目标物的量，而本发明采用碳量子点作为荧光材料，碳量子点通过氢键作用结合在目标物的核酸适配体上，通过单克隆抗体、核酸适配体同时与目标物结合，最终得到具有夹心式结构的荧光传感器，这种结构的荧光传感器具有更强的稳定性和特异性，其检测结果也更准确；另外，碳量子点是一种环境友好的荧光材料，相比其他的荧光材料，其生物相容性好、水溶性好、毒性低；

2.本发明目标物不同，可制备出不同的荧光传感器，并可应用于相应目标物浓度的定量检测，通过检测上清液中剩余的碳量子点-核酸适配体检测探针的量，得到相应的荧光强度，该检测方法简单，可用于定量检测不同的目标物待测液的浓度，适用范围更广；由于碳量子点本身具有很强的荧光，即使用于低浓度的待测物的检测，其荧光特性也很明显，使这种荧光传感器的检测范围更广。

附图说明

图1是本发明一种荧光传感器检测黄曲霉毒素B1的检测原理流程图。

图2是本发明一种荧光传感器检测不同浓度黄曲霉毒素B1的荧光强度曲线图。

图3是本发明一种荧光传感器检测黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的线性关系图。

图4是本发明一种荧光传感器检测黄曲霉毒素B1浓度的特异性曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步陈述，但并非是对本发明保护范围的限定。

本发明所涉及到的术语，除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

碳量子点：是以粒径小于10nm的碳质骨架和表面基团构成的荧光纳米材料。

核酸适配体：是一段DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)或者是XNA(核酸类似物)序列。通常是利用体外筛选技术—指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolutionof ligands by exponential enrichment，SELEX），从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。

赭曲霉毒素（Ochratoxins，简称OCT）是由多种曲霉和青霉菌产生的一类化合物，依其发现顺序分别称为赭曲霉毒素A（OTA）、赭曲霉毒素B（OTB）和赭曲霉毒素C（OTC）。

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，简称ZEN），又称F-2毒素，它首先从有赤霉病的玉米中分离得到。

本发明采用的材料与仪器如下：

Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)、Tween-20(吐温-20)、牛血清白蛋白（BSA），黄曲霉毒素B1标准品，黄曲霉毒素B1的核酸适配体，黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，赭曲霉毒素A（OTA），玉米赤霉烯酮（ZEN），96微孔板，购自上海生工生物技术有限公司（中国）；GL-16Ⅱ型离心机，购自上海安亭科学仪器厂；HZQ-F200型振荡培养箱，购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；IKA Vortex-3型旋涡混合器，购自上海楚柏实验室设备有限公司；07HWS-2数显恒温磁力搅拌器，购自杭州仪表电机有限公司；电子天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；F-7000型荧光光谱仪，购自日本HITACHI公司。

黄曲霉毒素B1的核酸适配体的核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。该核酸适配体的保存条件是-20℃，保存期限是1年。

黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的保存条件是4℃时，可短时间贮存，或者-20℃保存1年。

缓冲液A的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液A包括：10mmol/L的Na₂HPO₄，2mmol/L的KH₂PO₄，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl。

缓冲液B的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液B包括：10mmol/L的Na₂HPO₄，2mmol/L的KH₂PO₄，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，吐温-20；缓冲液B中吐温-20的质量百分数为0.05%。

封闭缓冲液包括：10mmol/L的Na₂HPO₄，2mmol/L的KH₂PO₄，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，牛血清白蛋白；封闭缓冲液中牛血清白蛋白的质量百分数为1%。

甲醇-PBS溶液包括：10mmol/L的Na₂HPO₄，2mmol/L的KH₂PO₄，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，甲醇；甲醇-PBS溶液中甲醇的质量分数为10%。

TCEP试剂的浓度为2.5mmol/L，PH=5.0。

实验用水是电阻为18.2MΩ的超纯水。

实施例1

一种荧光传感器，所述荧光传感器为夹心式结构，以碳量子点为荧光材料；所述夹心式结构的上部为目标物的核酸适配体，夹心式结构的中部为目标物，夹心式结构的下部为目标物的单克隆抗体，所述目标物的核酸适配体上修饰有巯基，所述碳量子点通过氢键作用结合在目标物的核酸适配体上。

实施例2

以目标物为黄曲霉毒素B1为例，但本发明目标物不限于黄曲霉毒素B1。

一种荧光传感器的制备方法包括以下步骤：

步骤一：制备碳量子点-核酸适配体检测探针

1）按葡萄糖水溶液与NaOH溶液的体积比为1：1，将10mL、1mol/L葡萄糖水溶液与10mL、1.5mol/L的NaOH溶液混合，在400w超声功率下超声处理4h；调节混合液PH=7，逐滴加入100ml无水乙醇并搅拌，再加入质量分数为12%的硫酸镁，搅拌20min后，得到碳量子点溶液，存储24h，备用，其中碳量子点溶液中碳量子点的粒径为4~5nm。

碳量子点是一种环境友好的荧光材料，相比其他的荧光材料，其生物相容性好、水溶性好、毒性低。

2）将黄曲霉毒素B1的核酸适配体固体粉末先在12000r/min下，离心1min，将离心管壁上的核酸适配体聚集到离心管底部，防止打开时撒出，再在离心管中加入19μL的TCEP试剂形成混合液，混合液浓度为100μmol/L，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲霉毒素B1的核酸适配体。

3）取1ml步骤1）的碳量子点溶液加入到步骤2）的激活后的黄曲霉毒素B1的核酸适配体中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，得到碳量子点-核酸适配体结合体。由于黄曲霉毒素B1的核酸适配体上修饰有巯基，碳量子点通过氢键作用结合在黄曲霉毒素B1的核酸适配体上。

4）将步骤3）的碳量子点-核酸适配体结合体在14000r/min下，离心20min，取出上清液，在离心管中加入1mL缓冲液A溶解沉淀物，得到碳量子点-核酸适配体检测探针，在4℃保存备用。

步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体固定在微孔板上

将100μL、0.1μg/mL的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体加入到96微孔板中，4℃孵育12h；用150μL缓冲液B冲洗3次；然后加入100μL封闭缓冲液，室温封闭1h；再用150μL缓冲液A冲洗3次，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体在96微孔板上的固定。

步骤三：制备黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体

向步骤二固定好黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的96微孔板中加入200μL黄曲霉毒素B1的待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用200μL缓冲液A冲洗3次去除未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，留在96微孔板底部的即为黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体。

步骤四：制备荧光传感器

将100μL步骤一的碳量子点-核酸适配体检测探针加入步骤三所得的结合体中，37℃孵育2h，结合体上的黄曲霉毒素B1与碳量子点-核酸适配体检测探针上的黄曲霉毒素B1的核酸适配体发生特异性结合，形成具有夹心式结构的荧光传感器，其以碳量子点为荧光材料，该夹心式结构的荧光传感器的上部为黄曲霉毒素B1的核酸适配体，中部为黄曲霉毒素B1，下部为黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，所述黄曲霉毒素B1的核酸适配体上结合有碳量子点。

实施例3

一种荧光传感器在定量检测毒菌毒素方面的应用，以检测黄曲霉毒素B1为例，但本发明不限于检测黄曲霉毒素B1，检测方法包括以下步骤：

步骤一：配制黄曲霉毒素B1待测液

1）配制黄曲霉毒素B1母液

首先将1mg黄曲霉毒素B1标准品溶于1mL甲醇-PBS（其中甲醇的质量分数为10%）溶液中，得到溶液A，溶液A的浓度C_A=1mg/mL；

取1μl溶液A加入甲醇-PBS（其中甲醇的质量分数为10%）溶液稀释成100mL的溶液B，溶液B的浓度C_B=10ng/mL，即得100mL、10ng/mL的黄曲霉毒素B1母液。

2）稀释黄曲霉毒素B1母液得到不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液

取10μL黄曲霉毒素B1母液，加入190μL甲醇-PBS溶液稀释，即得200μL、0.5ng/mL的黄曲霉毒素B1待测液；

同理可知，体积为200μL，浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、2.5ng/mL、3ng/mL和5ng/mL的黄曲霉毒素B1待测液中分别含有0μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL和100μL的黄曲霉毒素B1母液，及分别含有200μL、190μL、180μL、170μL、160μL、150μL、140μL和100μL的甲醇-PBS溶液。

步骤二：制备不同浓度的黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体

向实施例1步骤二固定好黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的96微孔板中分别加入200μL不同浓度（0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，5ng/mL）的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，其中0ng/mL作为空白对照，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用200μL缓冲液A冲洗3次去除未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到不同浓度的黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体。

黄曲霉毒素B1的浓度越大，固定在96微孔板底部的结合体越多。

步骤三：制备荧光传感器

将100μL步骤一的碳量子点-核酸适配体检测探针分别加入步骤二所得的不同浓度的结合体中，37℃孵育2h，结合体上的黄曲霉毒素B1与碳量子点-核酸适配体检测探针上的黄曲霉毒素B1的核酸适配体发生高效特异性结合，形成具有夹心式结构的荧光传感器，未结合的碳量子点-核酸适配体检测探针留在上清液中。

结合体上的黄曲霉毒素B1与碳量子点-核酸适配体检测探针上的黄曲霉毒素B1的核酸适配体结合越多，96微孔板内上清液中的碳量子点-核酸适配体检测探针就越少。

步骤四：用荧光光谱仪进行检测

取出步骤三的上清液，并用25μL缓冲液A冲洗96微孔板2次，将冲洗液与上清液混合后倒入比色皿中，将比色皿放入荧光光谱仪进行检测。荧光光谱的激发波长为380nm，得到不同浓度黄曲霉毒素B1待测液的荧光强度曲线。

步骤五：特异性分析

为了研究该制备方法得到的荧光传感器的特异性，分别用赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮对荧光传感器进行特异性检测。实验方法与本实施例实验方法的步骤一至步骤四类似，不同的是步骤二中向实施例1的步骤二中固定好黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的96微孔板中分别加入200μL、2ng/mL的赭曲霉毒素A的待测液或玉米赤霉烯酮的待测液。

步骤六：实验结果分析

1）检测原理

具体检测原理流程如图1所示。

首先将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体固定于96微孔板上，再加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体发生特异性结合被固定在板底，然后加入制备好的定量的碳量子点-核酸适配体检测探针，由于黄曲霉毒素B1的核酸适配体与黄曲霉毒素B1的强亲和力结合，使一部分检测探针被黄曲霉毒素B1固定，形成单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针的夹心式结构。加入黄曲霉毒素B1越多，被固定的碳量子点-核酸适配体检测探针就越多，上清液中剩余的碳量子点-核酸适配体检测探针就越少，其剩余量与黄曲霉毒素B1的加入量成负相关，故可建立起黄曲霉毒素B1与上清液中剩余检测探针之间的线性关系。通过检测上清液中的荧光强度，可得其中剩余碳量子点-核酸适配体检测探针的量，进而达到检测黄曲霉毒素B1浓度的目的。

2）黄曲霉毒素B1待测液的检测结果分析

图2为本发明一种荧光传感器检测不同浓度黄曲霉毒素B1的荧光强度曲线图，请参考图2，取435nm处的荧光强度最大值分析，当黄曲霉毒素B1浓度为0ng/mL时，上清液的荧光强度最大，随着黄曲霉毒素B1浓度的增加，荧光强度在逐步减小。上清液的荧光强度与黄曲霉毒素B1浓度在0.5ng/mL~3ng/mL范围内具有良好的线性关系，如图3所示，黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的线性关系为Y=216.463-23.153X，其中Y为荧光强度，X为黄曲霉毒素B1浓度，相关系数为：R²=0.97；黄曲霉毒素B1线性范围为：0.5ng/mL~3ng/mL，检出最低限为：0.5ng/mL。

由于上清液中剩余的碳量子点-核酸适配体检测探针的量与黄曲霉毒素B1的量成负相关，也就是说如果待测物的浓度越低，则上清液中剩余的碳量子点-核酸适配体检测探针的量就越多，那么荧光强度也就越强。

3）特异性结果分析

2ng/mL的赭曲霉毒素A的待测液、玉米赤霉烯酮的待测液以及黄曲霉毒素B1的待测液分别得到荧光传感器的上清液的检测结果对比如4图所示，与空白对照组（0ng/ml）进行比较，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的荧光强度与空白对照组的检测结果很接近，而黄曲霉毒素B1的荧光强度比空白对照组的荧光强度小。结果表明，黄曲霉毒素B1的核酸适配体和单克隆抗体除了与黄曲霉毒素B1结合之外，不会与其他2种毒菌毒素结合，因此该方法制备的荧光传感器可以实现对黄曲霉毒素B1的特异性检测，而不识别其他的毒菌毒素。也就是说，目标物和其对应的核酸适配体、单克隆抗体结合得到的夹心式结构的荧光传感器，在检测目标物待测液浓度时才具有更强的特异性。

综上所述，若选取的目标物不同，则可制备出不同的荧光传感器，并可应用于相应目标物浓度的定量检测，通过检测上清液中剩余的碳量子点-核酸适配体检测探针的量，得到相应的荧光强度，该检测方法简单，可用于检测不同的目标物，适用范围更广；由于碳量子点本身具有很强的荧光，即使用于低浓度的目标物待测液的检测，其荧光特性也很明显，使这种荧光传感器的检测范围更广；另外，通过单克隆抗体、核酸适配体同时与目标物结合，得到的这种夹心式结构的荧光传感器的稳定性和特异性更强，从而检测结果也更准确。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州轻工业学院

<120> 一种荧光传感器及其制备方法和应用

<130> 2017.3.27

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）核酸适配体

<400> 1

aaaaaagttg ggcacgtgtt gtctctctgt gtctcgtgcc cttcgctagg cccaca 56

Claims (5)

1.一种荧光传感器，其特征在于，所述荧光传感器为夹心式结构，以碳量子点为荧光材料；所述夹心式结构的上部为目标物的核酸适配体，夹心式结构的中部为目标物，夹心式结构的下部为目标物的单克隆抗体，所述目标物的核酸适配体上修饰有巯基，所述碳量子点通过氢键作用结合在目标物的核酸适配体上。

2.根据权利要求1所述的一种荧光传感器，其特征在于，所述目标物为黄曲霉毒素B1，所述碳量子点通过氢键作用结合在黄曲霉毒素B1的核酸适配体上。

3.权利要求1或2任一项所述的一种荧光传感器在定量检测毒菌毒素浓度方面的应用。

4.根据权利要求3所述的一种荧光传感器在定量检测毒菌毒素浓度方面的应用，其特征在于，所述毒菌毒素为黄曲霉毒素B1。

5.权利要求1或2所述的一种荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将碳量子点与已激活的目标物的核酸适配体混合，碳量子点通过氢键作用结合在目标物的核酸适配体上，得到碳量子点-核酸适配体检测探针；

步骤二：将目标物的单克隆抗体固定在微孔板上；

步骤三：将目标物加入步骤二中固定有目标物的单克隆抗体的微孔板内，目标物与单克隆抗体发生特异性结合，冲洗掉未与单克隆抗体结合的目标物，留在微孔板底部的即为目标物与单克隆抗体的结合体；

步骤四：将步骤一的碳量子点-核酸适配体检测探针加入到步骤三的目标物与单克隆抗体的结合体中，得到荧光传感器。