DE69230864T2

DE69230864T2 - Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuresonden an polystyroloberflächen

Info

Publication number: DE69230864T2
Application number: DE69230864T
Authority: DE
Inventors: Chu-An Chang; Joyce Running; Patrick Sheridan
Original assignee: Chiron Diagnostics Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1991-12-23
Filing date: 1992-12-22
Publication date: 2000-11-09
Anticipated expiration: 2012-12-23
Also published as: CA2125145A1; EP0620864B1; US5747244A; US5712383A; AU3427693A; JP3515781B2; WO1993013224A1; JPH07502656A; JP2004004087A; EP0620864A1; ATE191237T1; DE69230864D1

Description

Technischer Bereich

Diese Erfindung betrifft den Bereich von Nucleinsäure- Hybridisierungstests. Spezifischer betrifft sie ein verbessertes Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuresonden an Polystyroloberflächen zum Zweck der Entfernung von Nucleinsäureanalyten aus einer Lösung.

Hintergrund des Fachgebietes;

Das gemeinschaftlich besessene Patent US 4.868.105 beschreibt einen Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstest in Lösungsphase, in welchem der Nucleinsäureanalyt zuerst in einem ersten Gefäß in Lösung an einen Markierungs-Sondensatz und einen Einfang-Sondensatz hybridisiert wird. Der Sonde-Analyt-Komplex wird dann in ein zweites Gefäß überführt, welches eine Festphase-immobilisierte Sonde enthält, die komplementär zu einem Segment der Einfangsonden ist. Die Segmente hybridisieren an die immobilisierte Sonde, wobei der Komplex aus der Lösung entfernt wird. Den Analyt in Form eines immobilisierten Komplexes zu haben, erleichtert nachfolgende Trennungsschritte in dem Test. Schließlich werden einzelsträngige Segmente des Markierungs-Sondensatzes an markierte Sonden hybridisiert, wobei ermöglicht wird, den den Analyt enthaltenden Komplex über ein Signal nachzuweisen, welches direkt oder indirekt durch die Markierung erzeugt wird.
Die gemeinschaftlich besessene Europäische Patentanmeldung (EP) 317077 offenbart eine Variation des Tests, der in US 4.868.105 beschrieben ist, in welchem das Signal, das durch die markierten Proben erzeugt wird, amplifiziert wird. Die Amplifikation beinhaltet die Verwendung von Nucleinsäure-Multimeren. Diese Multimere sind verzweigte Polynucleotide, welche so konstruiert wurden, dass sie ein Segment beinhalten, welches spezifisch an den Nucleinsäureanalyten hybridisiert oder an eine Nucleinsäure (verzweigt oder linear), die an den Analyt gebunden ist, und Wiederholungen eines zweiten Segmentes, das spezifisch an die markierte Sonde hybridisiert. In dem Test, der das Multimer verwendet, werden die Anfangsschritte der Hybridisierung des Analyten an Markierungs- oder Amplifikations-Sondensätze und Einfang-Sondensätze in einem ersten Gefäß und des Übertragens des Komplexes in ein anderes Gefäß, welches immobilisierte Nucleinsäuren enthält, die an ein Segment der Einfangsonden hybridisieren, fortgesetzt. Das Multimer wird dann an den immobilisierten Komplex hybridisiert und die markierten Sonden werden wiederum an die Wiederholungen des zweiten Segments auf dem Multimer hybridisiert. Da die Multimere ein große Anzahl von Stellen zur Anheftung der Markierungssonde bereitstellen, wird das Signal amplifiziert.
Die gemeinschaftlich besessene, anhängige Anmeldung mit der US- Serien-Nr. 558.897, die am 27. Juli 1990 eingereicht wurde, (PCT WO92/02526) beschreibt die Herstellung großer verzweigter Polynucleotid- Multimere vom Kammtyp zur Verwendung in dem vorstehend beschriebenen Lösungsphasentest. Die Kämme stellen in dem Test eine größere Signalverstärkung bereit als die kleineren Multimere.
Wie in EP 317077 beschrieben, werden zwei Typen von Formaten für Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstests in Lösungsphasen angewendet: Ein Kügelchen-Testverfahren und ein Mikrotiterplatten-Testverfahren. In der Praxis wird der Mikrotiterplattentest bevorzugt. Das Verfahren zur Immobilisierung der Einfangsonde in den Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten war wie folgt. Poly-(Phenylalanyl-Lysin) wurde passiv an die Oberflächen der Vertiefungen auf den Platten adsorbiert. Das zu immobilisierende Oligonucleotid wurde durch Festphase-Verfahren synthetisiert, wobei es ein 5-modifiziertes Cytidin erhielt (das N4-(6-Aminocaproyl-2- aminoethyl)derivat von Cytidin). Dieses Oligonucleotid wurde durch Umsetzung des modifizierten Cytidins mit dem bifunktionellen Vernetzungsmittel Ethylenglycolbis-(succinimidylsuccinat) aktiviert und das aktivierte Oligonucleotid wurde in die Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation reagiert die andere funktionelle Gruppe des Vernetzungsmittels mit den primären Aminogruppen des adsorbierten Poly- (Phenylalanyl-Lysin)s, wobei das Oligonucleotid immobilisiert wird. Die Vertiefungen wurden dann mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (phosphate buffered sahne, PBS) gewaschen, mit HM-Puffer (0,1% SDS, 4 · SSC, 1 mg/ml beschallte Heringssperma-DNA, 1 mg/ml Poly-A, 10 mg/ml Rinderserumalbumin) beschichtet, nochmals mit PBS gewaschen, und zur Anwendung aufbewahrt. Wie angegeben wurde die Anfangshybridisierung des Analyten an die Einfang- und Amplifikationssondensätze in separaten Vertiefungen unter basischen Bedingungen durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde die Lösung neutralisiert und die neutralisierte Lösung wurde in die Vertiefungen übertragen, welche die immobilisierte Sonde enthielten. Die Anfangshybridisierung konnte nicht in den Vertiefungen durchgeführt werden, in welchen die immobilisierte Einfangsonde enthalten war, da der immobilisierte Komplex unter den Hybridisierungsbedingungen instabil war.
Die vorliegende Erfindung stellt einige Vorteile gegenüber dem vorstehend beschriebenen früheren Verfahren bereit. Als erstes erlaubt sie den ganzen Test einschließlich der Anfangshybridisierung in einer einzigen Vertiefung durchzuführen. Zweitens verbessert sie die Reproduzierbarkeit des Testes. Schließlich stellt sie in ihrer bevorzugten Ausführungsform, in welcher große Multimere vom Kammtyp angewendet werden, ein verringertes Hintergrundsignal bereit.

Offenbarung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Immobilisierung einer Nucleinsäuresonde mit einer ersten funktionellen Gruppe auf einer Polystyroloberfläche zur Verwendung in einem Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstest in Lösungsphase, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Reinigen der Polystyroloberfläche durch aufeinanderfolgendes Waschen mit einer starken Säure, starken Base und Wasser;
(b) passives Adsorbieren eines Polymers mit (einer) zweiten funktionellen Gruppe(n) auf der Polystyroloberfläche; und
(c) kovalentes Binden der Nucleinsäuresonde an das adsorbierte Polymer über eine basenstabile Bindung.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Erzeugnis zur Verwendung in einem Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstest in Lösungsphase, umfassend eine Polystyroloberfläche mit einem daran adsorbierten Polymer und einer Nucleinsäuresonde, die kovalent über ein basenstabiles bifunktionelles Vernetzungsmittel an das Polymer gebunden ist.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Verbesserung eines Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstests in Lösungsphase zum Nachweis der Gegenwart eines einzelsträngigen Nucleinsäureanalyten in einer Probe, wobei der Test die folgenden Schritte umfasst:
(a) Inkontaktbringen der Probe unter Hybridisierungsbedingungen mit einem Satz von Markierungssonden, von denen jede ein erstes Segment aufweist, das komplementär zu dem Analyten ist, und ein zweites Segment, das komplementär zu einem Segment eines DNA-Multimers ist, und einem Satz von Einfangsonden, von denen jede ein erstes Segment besitzt, das komplementär zum Analyten ist, und ein zweites Segment, das komplementär zu einem Oligonucleotid ist, das auf einer Polystyroloberfläche immobilisiert ist;
(b) Inkontaktbringen des Produktes von Schritt (a) unter Hybridisierungsbedingungen mit dem auf einer Polystyroloberfläche immobilisierten Oligonucleotid;
(c) Inkontaktbringen des Produktes von Schritt (b) unter Hybridisierungsbedingungen mit dem Multimer; und
(d) Inkontaktbringen des Produktes von Schritt (c) unter Hybridisierungsbedingungen mit einem markierten Oligonucleotid, das mit dem Multimer hybridisiert, und die Verbesserung ist die Verwendung in Schritt (b) eines Oligonucleotids, das auf der Polystyroloberfläche über ein an die Oberfläche adsorbiertes Polymer immobilisiert ist, an welches das Oligonucleotid über eine basenstabile Bindung kovalent gebunden ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den Zeichnungen wird Folgendes dargestellt:
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse der Experimente, die in Beispiel 3 beschrieben sind.
Die Fig. 2 bis 3 sind die Auflistung von Sequenzen der Segmente der Sonden, die in Beispiel 4 beschrieben sind.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse der Tests, die in Beispiel 4 beschrieben sind.

Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Definitionen

Der Begriff "basenstabil", wie er verwendet wird, um die kovalenten Verknüpfungen, die in dieser Erfindung angewendet werden, zu charakterisieren, bezeichnet Verknüpfungen, die keinem wesentlichen Abbau unterliegen (z. B. Aufspaltung kovalenter Bindungen aufgrund von Hydrolyse), wenn sie mit 1 N NaOH bei Temperaturen im Bereich von 4 bis 70ºC oder unter Bedingungen, die mindestens so stringent (z. B. ähnlich stringent oder noch stringenter) wie die, die bei der Hybridisierung der Sonden an die Analyte in dem Lösungsphase-Hybridisierungstest verwendet werden, behandelt werden.
Der Begriff "bifunktionelles Vernetzungsmittel" bezieht sich auf organische Moleküle, die zwei funktionelle Gruppen haben, wovon eine dazu in der Lage ist, mit einer funktionellen Gruppe auf dem erfindungsgemäßen Polymer zu reagieren, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem Vernetzungsmittel und dem Polymer gebildet wird, und die andere in der Lage ist, mit einer funktionellen Gruppe auf der zu immobilisierenden Nucleinsäuresonde zu reagieren, wobei eine zweite kovalente Bindung zwischen dem Vernetzungsmittel und der Sonde erhalten wird, Der resultierende Dreifachkomplex umfasst das Vernetzungsmittel, welches über die Umsetzung zwischen den zwei funktionellen Gruppen auf dem Vernetzungsmittel und funktionellen Gruppen auf dem Polymer und der Sonde sowohl an das Polymer als auch an die Sonde kovalent gebunden ist. Vorzugsweise sind die funktionellen Gruppen auf dem Polymer und der Sonde primäre Aminogruppen und die funktionellen Gruppen auf dem Vernetzungsmittel sind ausgewählt aus solchen, die mit primären Aminogruppen reagieren (z. B. Carboxyl-, Sulfonylchlorid- oder Aldehyd-Gruppen).
Ein "Nucleinsäure-Hybridisierungstest in Lösungsphase" betrifft die Testverfahren, welche in den gemeinschaftlich besessenen Patenten/Patentanmeldungen US Patent Nr. 4.868.105 und EP 317077 beschrieben und beansprucht sind.
Ein "modifiziertes Nucleotid" betrifft ein Nucleotid-Monomer, welches stabil in ein Polynucleotid eingebaut ist und welches eine zusätzliche funktionelle Gruppe besitzt, die mit einer funktionellen Gruppe auf dem Vernetzungsmittel reagiert.
Ein "Multimer" betrifft ein verzweigtes Polynucleotid, welches in der Lage ist, simultan direkt oder indirekt an einen Nucleinsäureanalyten und eine Vielzahl markierter Sonden zu hybridisieren. Die Verzweigung in den Multimeren wird durch kovalente Bindungen erreicht und die Multimere sind aus zwei Arten von Oligonucleotid-Einheiten zusammengesetzt, die in der Lage sind, an Nucleinsäureanalyte oder an eine Nucleinsäure, welche an einen Nucleinsäureanalyten hybridisiert ist, und an eine Vielzahl markierter Sonden zu hybridisieren. Die Zusammensetzung und Herstellung solcher Multimere ist in EP 317077 und WO92/02526 beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme enthalten ist.

Immobilisierung der Sonde an einer Polystyrol-Oberfläche

Während die folgende Diskussion an den Oberflächen von Vertiefungen herkömmlicher Polystyrol-Mikrotiterplatten immobilisierte Sonden betrifft, wird es klar sein, dass die Methodik der Erfindung für an andere Polystyrol-Oberflächen immobilisierte Sonden, die ebenfalls für Nucleinsäure- Sandwich-Hybridisierungen eingesetzt werden, wie Partikel (Kügelchen), Röhren, Filter, Säulen und ähnliches, angewendet werden kann.
Die Polystyroloberfläche wird zuerst durch aufeinanderfolgendes Waschen mit einer starken Säure, einer starken Base und wässrigem Puffer gereinigt. Die Säure wird normalerweise eine Mineralsäure, wie Salzsäure, Salpetersäure oder Schwefelsäure, in einer Konzentration von 0,1 bis 5 N sein. Salzsäure (1 N) wird bevorzugt. Die Oberfläche wird normalerweise für 1 bis 60 Minuten (vorzugsweise etwa 15 bis 20 Minuten) bei Temperaturen im Bereich von 4 bis 37ºC mit der Säure in Kontakt gebracht. Die säurebehandelten Vertiefungen werden dann mit einem neutralen wässrigen Puffer, wie Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, gewaschen. Die starke Base wird normalerweise ein Alkalimetallhydroxid (z. B. NaOH, KOH) in einer Konzentration von 0,1 bis 5 N sein. Natriumhydroxid (1 N) wird bevorzugt. Die Kontaktzeit zwischen der Oberfläche und der Base wird gewöhnlich 1 bis 60 Minuten, vorzugsweise etwa 15 bis 20 Minuten sein. Die Kontakttemperatur wird wiederum typischerweise bei 4 bis 37ºC liegen. Nach der Basenbehandlung wird die Oberfläche wiederum mit einem neutralen wässrigen Puffer gewaschen.
Die Oberfläche wird mit einem Polymer, vorzugsweise einem Polypeptid, das eine Vielzahl reaktiver primärer Aminogruppen besitzt und das passiv an Polystyrol adsorbiert, beschichtet. Das Polypeptid enthält typischerweise durchschnittlich etwa 10% bis 100% primäre Amine enthaltende Aminosäurereste pro Molekül. Das Polypeptid kann ein natürlich auftretendes Protein oder ein synthetisches Polypeptid sein. Das synthetische Polypeptid kann ein homopolymeres (aus der gleichen Aminosäure zusammengesetzt) oder ein copolymeres (aus zwei oder mehr Aminosäuren zusammengesetzt) sein. Andere reaktive Funktionseinheiten, wie Sulfhydryl oder Carboxylat auf natürlichen oder synthetischen Aminosäuren können eingesetzt werden. Sein Molekulargewicht ist nicht kritisch und liegt normalerweise im Bereich zwischen 5.000 und 50.000 Dalton. Beispiele für Polypeptide, die zu diesem Zweck verwendet werden können, sind Poly-Lysin, Poly(Phe-Lys), Poly(Ala- Glu), Casein und Rinderserumalbumin. Poly(Phe-Lys) (im Phe:Lys-molaren Verhältnis von 1 : 1), welches ein Molekulargewicht im Bereich von 30.000 bis 60.000 hat, wird bevorzugt. Die Beschichtung wird durchgeführt indem das gereinigte Polystyrol mit einer neutralen (pH 6-8) wässrigen Pufferlösung des Polypeptids in Kontakt gebracht wird. Die Konzentration des Polypeptids in der Lösung wird normalerweise 0,01 bis 10 mg/ml sein, gewöhnlicher 0,1 bis 1,5 mg/ml. Die Lösung kann gegebenenfalls Salz bis zu einer Konzentration von etwa 5 M enthalten. Der Schritt zur Beschichtung mit dem Polypeptid wird normalerweise bei 20ºC bis 65ºC für 0,5 bis 36 Stunden durchgeführt, vorzugsweise bei 25 bis 35ºC für 15 bis 20 Stunden. Nach dieser Behandlung wird die Oberfläche wiederholt mit einer neutralen Pufferlösung gewaschen, um jegliches nicht adsorbiertes Polypeptid zu entfernen. Gegebenenfalls können Bedingungen gewählt werden (pH, Ionenstärke, Detergens, Proteinasen), die dem Anfangshybridisierungsschritt des Testes ähnlich oder noch stringenter sind, um adsorbiertes Polypeptid zu entfernen, welches einer Entfernung während der Anfangshybridisierung zugänglich wäre.
Die einzelsträngige Oligonucleotidsonde, die kovalent an das adsorbierte Polypeptid gebunden ist, kann nach dem automatischen Phosphoramidit-Verfahren, welches von Warner et al., DNA (1984) 3 : 401 beschrieben ist, hergestellt werden und nach Sanchez-Pescador and Urdea, DNA (1984) 3: 339 gereinigt werden. Diese beinhalten einen 5'-modifizierte Nucleotid- oder Nichtnucleotid-Linker, der eine funktionelle Gruppe besitzt, welche eine reaktive Stelle bereitstellt, über die das Oligonucleotid an das Vernetzungsmittel gekoppelt wird. Ein bevorzugtes modifiziertes Nucleotid ist das N 4-(6-Aminocaproyl-2-aminoethyl)derivat von 5-Methyl-Cytidin, welches in US 4.868.105 beschrieben ist. Andere modifizierte Nucleotide sind in US 4.948.882 beschrieben. Die Länge und Basenzusammensetzung der Oligonucleotidsonde hängt von der Länge und Basenzusammensetzung der Nucleinsäuresequenz ab, an welche sie hybridisieren soll. Sie wird normalerweise 15-100 Nucleotide lang sein, gewöhnlicher 20-30 Nucleotide lang. Das 21 Basen-Oligonucleotid 5-XCACCACTTTCTCCAAAGAAG-3 (beschrieben in EP 317077) und 5'-XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3, wobei X das N&sup4;-(6-Aminocaproyl-2-aminoethyl)derivat von Cytidin repräsentiert, sind als Standard- Sondensequenzen ausgewählt worden.
Das Oligonucleotid wird über die Umsetzung zwischen der funktionellen Gruppe des 5'-modifizierten Nucleotids des Oligonucleotids und einer der funktionellen Gruppen des Vernetzungsmittels an das basenstabile bifunktionelle Vernetzungsmittel gekoppelt. Um die Kopplung des Oligonucleotids an beide funktionelle Gruppen des Vernetzungsmittels zu verhindern, wird das Mittel in großem Überschuss eingesetzt (z. B. 50-1000- facher Überschuss). Eine Vielzahl von Vernetzungsmitteln kann verwendet werden, solange die funktionellen Kriterien von Basenstabilität und Reaktivität mit dem Oligonucleotid und den Aminogruppen des Polypeptids aufrecht erhalten werden. Beispiele für geeignete Vernetzungsmittel können im Pierce Chemical Catalog gefunden werden. Die Bedingungen für die Kopplungsreaktion werden mit dem jeweils verwendeten Mittel variieren. Das gegenwärtig bevorzugte Vernetzungsmittel ist Bis-(sulfosuccinimidyl)- suberat. Das Vernetzungsmittel wird normalerweise in einer polaren Lösung oder einem wässrigen Puffer gelöst werden und die Lösung wird einer Lösung des Oligonucleotids in einem wässrigen Puffer und dem polaren Lösungsmittel hinzugefügt. Die Kopplung wird normalerweise bei neutralem pH (6-8) und bei Temperaturen im Bereich von 4ºC bis 25ºC für etwa 10 Minuten bis 18 Stunden durchgeführt werden. Das resultierende Oligonucleotid-Vernetzungsmittel- Konjugat (manchmal hierin als "aktiviertes Oligonucleotid" bezeichnet) kann von nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien und unerwünschten Reaktionsprodukten unter Verwendung herkömmlicher Chromatographieverfahren gereinigt werden.
Die Polypeptid-beschichtete Oberfläche wird dann mit einer neutralen wässrigen gepufferten Lösung des gereinigten aktivierten Oligonucleotids unter Bedingungen, die erlauben, dass die verbleibende funktionelle Gruppe des Vernetzungsmittels mit einer Aminogruppe des adsorbierten Polypeptids umgesetzt wird, in Kontakt gebracht. Typischerweise wird diese Kopplungsreaktion unter Verwendung eines Überschusses an aktiviertem Oligonucleotid (10- bis 100-facher Überschuss wird bevorzugt) bei 0ºC bis 25ºC für 0,5 bis 18 Stunden, vorzugsweise bei 2ºC bis 8ºC für 8 bis 18 Stunden durchgeführt. Nachdem diese Umsetzung vollständig abgelaufen ist, wird die Oberfläche mit einem wässrigen Puffer gewaschen, um nicht umgesetztes aktiviertes Oligonucleotid von der Oberfläche zu entfernen. In diesem Stadium des Verfahrens ist die Oberfläche mit adsorbiertem Polypeptid beschichtet, an welches die Nucleinsäuresonde über das Vernetzungsmittel kovalent gebunden worden ist. Im Falle von Standard-Miktotiter-Vertiefungen werden typischerweise 0,1 bis 10 umol, vorzugsweise 0,4 bis 0,7 umol immobilisierte Nucleinsäuresonde pro Vertiefung eingesetzt. An diesem Punkt kann man gegebenenfalls die Platte "überkoppeln", indem man zusätzlich bifunktionelles Vernetzungsmittel auf die Oberfläche gibt, um dieses mit jeder reaktiven Gruppe, welche auf der Plattenoberfläche verbleibt, umzusetzen.
Wenn die Oberfläche in einem Amplifikations-Testverfahren verwendet werden soll, insbesondere in einem Test, der die großen Multimere vom Kammtyp aus WO92/02526 verwendet, wird bevorzugt, die Oberfläche Bedingungen auszusetzen, welche den Bedingungen (pH, Ionenstärke, Temperatur, Detergens) entsprechen, die während des Lösungsphasen-Hybridisierungsschrittes des Tests maßgeblich sind. Eine solche Behandlung tendiert dahin, jeglichen Polypeptid-Oligonucleotid-Komplex, welcher während der Lösungsphase-Hybridisierung entfernt werden könnte, zu entfernen. Dem gemäß wird für solche Fälle die Oberfläche mit einer milden basischen Lösung, welche eine niedrige Konzentration an Detergens (z. B. 0,1 bis 0,5 N NaOH, enthaltend 0,01 bis 2,0 Gew.-% Natriumdodecylsulfat (SDS)) bei 25 bis 85ºC für 10 bis 180 Minuten in Kontakt gebracht. Nach dieser abschließenden Behandlung wird die Oberfläche abgesaugt. Dann wird die Oberfläche mit wässrigem Puffer gewaschen. Sie kann in einer auf Feuchtigkeit kontrollierten Umgebung bei 0ºC bis 10ºC bis zur Verwendung aufbewahrt werden.

Verwendung der beschichteten Polystyroloberfläche in einem Lösungsphase - Hybridisierung

Die beschichtete Polystyroloberfläche wird wie folgt in einer Lösungsphase-Sandwich-Hybridisierung verwendet. In dem Fall, in dem die beschichtete Oberfläche die innere Oberfläche der Vertiefung einer Mikrotiterplatte ist, wird der Nucleinsäureanalyt mit einem Überschuss von zwei einzelsträngigen Nucleinsäure-Sondensätzen in die Vertiefung gegeben: (1) Ein Satz Einfangsonden, von denen jede eine erste Bindungssequenz aufweist, welche komplementär zu dem Analyt ist, und eine zweite Bindungssequenz, die komplementär zu der Nucleinsäure ist, die an die Vertiefungsoberfläche gebunden ist, und (2) ein Satz von Amplifikationssonden (verzweigt oder linear), von denen jede eine erste Bindungssequenz aufweist, welche in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, und eine zweite Bindungssequenz, welche in der Lage ist an ein Segment des Multimers zu binden. Durch die Verwendung einer Amplifikationssonde kann das Multimer als ein "universelles" Mittel gestaltet werden und es müssen nicht für jeden Analyten unterschiedliche Multimere hergestellt werden. Das resultierende Produkt ist ein Nucleinsäurekomplex aus drei Komponenten, nämlich den beiden Sonden, welche durch ihre ersten Bindungssequenzen an den Analyten hybridisiert sind. Die zweiten Bindungssequenzen der Sonden verbleiben als einzelsträngige Segmente, da sie nicht komplementär zu dem Analyten sind. Dieser Komplex hybridisiert über die zweite Bindungssequenz an die immobilisierte Sonde auf der Vertiefungsoberfläche. Das resultierende Produkt umfasst den Komplex, der über den Doppelstrang, der durch das an die Vertiefungsoberfläche gebundene Oligonucleotid und die zweite Bindungssequenz der Einfangsonde gebildet wird, an die Vertiefungsoberfläche gebunden ist. Ungebundene Materialien werden dann z. B. durch Waschen von der Oberfläche entfernt.
Das Amplifikationsmultimer wird dann unter Hybridisierungsbedingungen zu dem gebundenen Komplex zugegeben, um dem Multimer die Möglichkeit zu geben, an die zugängliche zweite Bindungssequenz der Amplifikationssonde des Komplexes zu hybridisieren. Der resultierende Komplex wird dann durch Waschen von jeglichem ungebundenen Multimer abgetrennt. Dann wird das markierte Oligonucleotid unter Bedingungen, die ihm erlauben, an die komplementären Oligonucleotid-Einheiten des Multimers zu hybridisieren, zugegeben. Der resultierende immobilisierte markierte Nucleinsäurekomplex wird dann gewaschen, um ungebundenes markiertes Oligonucleotid zu entfernen, und abgelesen.
Der Nucleinsäureanalyt kann von einer Vielzahl von Quellen stammen, z. B. biologischen Flüssigkeiten oder Feststoffen, Nahrungsmittel, Material aus der Umgebung usw., und kann für die Analyse durch Hybridisierung durch eine Vielzahl von Mitteln vorbereitet werden, z. B. Proteinase K/SDS, chaotrope Salze, usw. Es kann auch von Vorteil sein, die durchschnittliche Größe des Nucleinsäureanalyten durch enzymatische, physikalische oder chemische Mittel, z. B. Restriktionsenzyme, Beschallung, chemischen Abbau (z. B. Metallionen), usw. zu verringern. Die Fragmente können bis zu 0,1 kb klein sein, sind gewöhnlich mindestens etwa 0,5 kb groß und können 1 kb oder größer sein. Die Sequenz des Analyten wird für die Analyse in einzelsträngiger Form bereitgestellt. Wo die Sequenz natürlicherweise in einzelsträngiger Form vorkommt, kann es sein, dass eine Denaturierung nicht erforderlich ist. Wo die Sequenz jedoch in doppelsträngiger Form vorliegt, wird die Sequenz denaturiert. Die Denaturierung kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden, wie durch Alkali-Behandlung, im allgemeinen mit etwa 0,05 bis 0,2 M Hydroxid, mit Formamid, mit Salzen, durch Hitze oder durch Kombinationen davon.
Die ersten Bindungssequenzen der Einfangsonde und der Amplifikationssonde, welche zu der Analyt-Sequenz komplementär sind, werden jeweils mindestens 15 Nucleotide enthalten, gewöhnlich mindestens 25 Nucleotide und nicht mehr als etwa 5 kb, gewöhnlich nicht mehr als etwa 1 kb, vorzugsweise nicht mehr als etwa 100 Nucleotide. Sie werden typischerweise etwa 30 Nucleotide groß sein. Normalerweise werden sie so ausgewählt, dass sie an unterschiedliche Sequenzen des Analyten binden können. Die ersten Bindungssequenzen können auf der Grundlage einer Vielzahl von Überlegungen ausgewählt werden. In Abhängigkeit von der Natur des Analyten kann man an einer Konsensus-Sequenz interessiert sein, an einer Sequenz, die mit Polymorphismen assoziiert ist, einem besonderen Phänotyp oder Genotyp, einem bestimmten Stamm oder ähnlichem.
Bei entsprechender Auswahl der ersten Bindungssequenzen der Amplifikations- und Einfangsonden können diese verwendet werden, um ein spezifisches Nucleinsäuremolekül zu identifizieren, welches ein bestimmtes Gen beinhaltet, oder eine andere Sequenz, welche als Teil verschiedener Nucleinsäuremoleküle vorliegt. Um das interessierende Nucleinsäuremolekül von anderen Molekülen, die ebenfalls die gegebene Sequenz enthalten, zu unterscheiden, wird eine der Sonden komplementär zu der gegebenen Sequenz hergestellt, während die andere komplementär zu einer anderen Sequenz des Moleküls gemacht wird, wobei die andere Sequenz ausschließlich in diesem Molekül auftritt (d. h. sie liegt in dem anderen Molekül, welches die gegebene Sequenz enthält, nicht vor).
Die zweiten Bindungssequenzen der Einfangsonde und der Amplifikationssonde sind derart ausgewählt, dass sie zu der Oligonucleotidverzweigung der Polystyroloberfläche bzw. zu dem Segment des Multimers komplementär sind und derart, dass sie nicht durch endogene Sequenzen in der Probe/in dem Analyten behindert werden. Die zweite Bindungssequenz kann benachbart zu der ersten Bindungssequenz liegen oder durch eine intermediäre nicht-komplementäre Sequenz davon abgetrennt vorliegen. Falls gewünscht, können die Sonden andere, nicht-komplementäre Sequenzen beinhalten. Diese nicht-komplementären Sequenzen dürfen die Bindung der Bindungssequenzen nicht behindern oder das Auftreten von unspezifischer Bindung verursachen.
Die Einfangsonde und die Amplifikationssonde können durch Oligonucleotidsynthese-Verfahren oder durch Clonierung, vorzugsweise durch das erstgenannte, hergestellt werden.
Es ist zu bedenken, dass die Bindungssequenzen keine perfekte Komplementarität besitzen müssen, um Homoduplexe bereitzustellen. In vielen Situation reichen Heteroduplexe aus, wobei weniger als etwa 10% der Basen Fehlpaarungen sind, wobei Schleifen von fünf oder mehr Nucleotiden ignoriert werden. Demgemäß bezeichnet der Begriff "komplementär", wie er hierin verwendet wird, einen Grad von Komplementarität, der ausreichend ist, um eine stabile Duplexstruktur bereitzustellen.
Das markierte Oligonucleotid wird eine Sequenz beinhalten, die zu den sich wiederholenden Oligonucleotid-Einheiten des Multimers komplementär ist. Das markierte Oligonucleotid wird ein oder mehrere Moleküle beinhalten ("Markierungen"), die ein nachweisbares Signal direkt oder indirekt bereitstellen. Die Markierungen können an individuelle Teile der komplementären Sequenz gebunden sein oder können als terminale Teile oder als terminaler Schwanz, der eine Vielzahl von Markierungen trägt, vorliegen. In der Literatur sind verschiedene Verfahren zur Bereitstellung von an die Sequenz gebundenen Markierungen beschrieben worden. Siehe z. B. Leary et al., Proc Natl Sci USA (1983) 80:4045; Renz and Kurz, Nun Acids Res (1984) 12:3435; Richardson and Gumport, Nuc Acids Res (1983) 11 : 6167; Smith et al., Nuc Acids Res (1985) 11:2399; Meinkoth and Wahl, Anal Biochem (1984) 138:267. Die Markierungen können entweder kovalent oder nicht-kovalent an die komplementäre Sequenz gebunden sein. Markierungen, welche eingesetzt werden können, beinhalten Radionuclide, fluoreszierende Stoffe, chemilumineszierende Stoffe, Farbstoffe, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Enzym-Inhibitoren, Enzym-Untereinheiten, Metallionen und ähnliches. Illustrative spezifische Markierungen beinhalten Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin, Umbelliferon, Luminol, NADPH, α-β- Galactosidase, Meerrettich-Peroxidase, usw.
Das Verhältnis von Einfangsonde und Amplifikationssonde zu den erwarteten Molen an Analyt wird jeweils mindestens stöchiometrisch sein und vorzugsweise im Überschuss vorliegen. Das Verhältnis ist vorzugsweise mindestens etwa 1,5 : 1, und mehr bevorzugt mindestens 2 : 1. Es wird normalerweise im Bereich von 2 : 1 bis 10.000 : 1 liegen. Die Konzentrationen von jeder der Sonden wird im allgemeinen im Bereich von etwa 10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;&sup6; M liegen, wobei die Proben-Nucleinsäurekonzentrationen von 10&supmin;²¹ bis 10&supmin; ¹² M variieren. Die Hybridisierungsschritte des Tests werden im allgemeinen von etwa 10 Minuten bis 2 Stunden betragen, wobei sie häufig in etwa einer Stunde beendet sind. Die Hybridisierung kann bei einer leicht erhöhten Temperatur durchgeführt werden, im allgemeinen im Bereich von etwa 20ºC bis 80ºC, gewöhnlicher von etwa 35ºC bis 70ºC, insbesondere bei 65ºC. Die Hybridisierungsreaktionen werden gewöhnlich in einem wässrigen Medium durchgeführt, insbesondere in einem gepufferten wässrigen Medium, welches verschiedene Zusätze beinhalten kann. Zusätze, welche verwendet werden können, beinhalten niedrige Konzentrationen von Detergens (0,1 bis 1%), Salze, z. B. Natriumcitrat (0,017 bis 0,17 M), Ficoll, Polyvinylpyrrolidon, Träger-Nucleinsäuren, Träger-Proteine, usw. Nicht-wässrige Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Alkohole und Formamid, können dem wässrigen Medium hinzugefügt werden. Diese anderen Lösungsmittel werden in Mengen im Bereich von 2 bis 50% vorliegen.
Die Stringenz des Hybridisierungsmediums kann durch Temperatur, Salzkonzentration, das Lösungsmittelsystem und ähnliches kontrolliert werden. Damit wird in Abhängigkeit von der Länge und der Natur der interessierenden Sequenz die Stringenz variiert werden.
In Abhängigkeit von der Natur der Markierung können verschiedene Techniken zum Nachweis der Anwesenheit der Markierung eingesetzt werden. Für fluoreszierende Stoffe sind eine große Zahl unterschiedlicher Fluorometer erhältlich. Für chemilumineszierende Stoffe sind Luminometer oder Filme erhältlich. Ein fluoreszierendes, chemilumineszierendes oder gefärbtes Produkt kann durch den Einsatz von Enzymen bereitgestellt und fluorimetrisch, luminometrisch, spektralphotometrisch oder visuell bestimmt werden. Die verschiedenen Markierungen, welche in Immuntests eingesetzt wurden, und die Techniken, die für die Immuntests geeignet sind, können mit dem gegenständigen Test eingesetzt werden.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter. Es ist nicht beabsichtigt, dass diese Beispiele die Erfindung auf irgendeine Art eingrenzen.

Beispiel 1

White Microlite 1 Removawell-Streifen (Polystyrol-Mikrotiterplatten, 96 Vertiefungen pro Platte) wurden von Dynatech Inc. gekauft.

Vorwaschen

Jede Vertiefung wurde mit 200 ul 6 N HCl gefüllt und 15 bis 20 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann viermal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen. Dann wurden die Vertiefungen mit 200 ul 6 N NaOH gefüllt und 15 bis 20 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden nochmals viermal mit 1 X PBS gewaschen und die Vertiefungen wurden ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen.

Beschichtung mit Poly-(phe-lys)

Poly-(Phe-Lys) wurde von Sigma Chemicals, Inc. gekauft. Dieses Polypeptid hat ein molares Verhältnis Phe:Lys von 1 : 1 und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 47.900 g/mol. Es hat eine durchschnittliche Länge von 309 Aminosäuren und enthält 155 Amine/mol. 30 ml einer 1 mg/mlkonzentrierten Lösung des Polypeptids wurde mit 2 M NaCl/0,5 · PBS gemischt, wobei eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml (pH 6,0) erhalten wurde. 100 ul dieser Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben, die Platte wurde in Plastik eingepackt, um ein Austrocknen zu verhindern, und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Dann wurde die Platte viermal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen wurden ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen.

Erstes Strippen

200 ul einer 0,2 N NaOH-Lösung, welche 0,5 Gew.-% SDS enthielt, wurde zu den Polypeptid-beschichteten Vertiefungen gegeben. Die Platte wurde in Plastik eingepackt und eine Stunde bei 65ºC inkubiert. Dann wurde die Platte viermal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen wurden ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen.

Oligonucleotid-Aktivierung

50 mg-Aliquote von Disuccinimidylsuberat (DSS) wurden jeweils in 500 ul Dimetylformamid (DMF) gelöst.
26 OD&sub2;&sub6;&sub0; -Einheiten des vorstehend beschriebenen 21-mer Oligonucleotids (als XT1* bezeichnet) in 1 · PBS wurden zu jedem Aliquot von DSS-DMF zugegeben. Das Gemisch wurde verwirbelt und 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Zwei NAP25-Säulen (1,5 ul Aliquot pro 26 OD&sub2;&sub6;&sub0;) wurden mit 1 · PBS equilibriert, das DSS-DMF-Oligonucleotidgemisch wurde mit 2 ml 1 · PBS verdünnt und das verdünnte Gemisch wurde sofort auf die Säulen gegeben. Die Säulen wurden auslaufen gelassen und das Eluat wurde verworfen. Aktiviertes Oligonucleotid wurde von jeder Säule mit 3,5 ml 1 · PBS eluiert, wobei die gesamte Säule in 100 ml 1 · PBS gesammelt wurde.

Kopplung von aktiviertem Oligonucleotid an Poly-(Phe-Lys)- beschichteten

50 ul des aktiviertes Oligonucleotid-enthaltenden Eluats wurde in jede Vertiefung gegeben und die Vertiefungen wurden 120 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann viermal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen wurden ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen.

Abschließendes Strippen

20ul einer 0,2 N NaOH-Lösung, welche 0,5 Gew.-% SDS enthielt, wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde in Plastik eingepackt und 60 Min. bei 65ºC inkubiert. Die Platte wurde dann viermal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen wurden ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen. Die gestrippte Platte wurde mit Trocknungskügelchen bei 2-8ºC aufbewahrt.

Beispiel 2

Vorwaschen

Microlite 1 Removawell Polystyrol-Mikrotiterplatten wurden wie in Beispiel 1 vorgewaschen mit der Ausnahme, dass 1 N HCl und iN NaOH verwendet wurden.

Polypeptidbeschichtung

Die Vertiefungen wurden wie in Beispiel 1 beschichtet. Der erste Strip-Schritt wurde eliminiert.

Oligonucleotidaktivierung

Das XT1*-Oligonucleotid wurde wie in Beispiel 1 aktiviert, mit folgender Ausnahme: das molare Verhältnis von DSS zu XT1* war 400 : 1 anstelle von 1000 : 1; der Puffer und der pH-Wert während der Aktivierung war Natriumphosphat bei pH 7,8; der Puffer und der pH-Wert bei der Quench- Aktivierung war Natriumphosphat bei pH 6,5; und die Temperatur und der Puffer, der für die Reinigung des aktivierten Oligonucleotids verwendet wurde, war Natriumphosphat bei pH 6,5 und 4ºC.

Kopplung des aktivieren Oligonucleotids an beschichtete Vertiefungen

Die Kopplung wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, dass der verwendete Puffer Natriumphosphat pH 7, 8 war und die Inkubation über Nacht erfolgte.

Strippen

Die Vertiefungen wurden mit 0,2 N NaOH/0,5 Gew.-% SDS wie in Beispiel 1 gestrippt

Beispiel 3

Die Immobilisierungsverfahren aus den Beispielen 1 und 2 wurden unter Verwendung verschiedener Mengen an aktiviertem Oligonucleotid, welches für den Kopplungsschritt verwendet wurde, wiederholt. In jedem dieser Experimente wurden die Mengen an Oligonucleotid, welche an die Vertiefungsoberfläche gebunden waren, bestimmt. Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse dieser Experimente zeigt. Wie angegeben, resultierte das Verfahren aus Beispiel 2 bei einer gegebenen Menge von aktiviertem Oligonucleotid, welches in die Vertiefung gegeben wurde, in etwa 10 mal mehr an die Oberfläche gebundenem Oligonucleotid.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der Erfindung in einem HCV-RNA-Test und zeigt die Empfindlichkeit des Tests gegen die Menge an Sonde, die auf der Platte immobilisiert ist.

Synthese des Multimers, welches in dem Test verwendet wird

In diesem Beispiel wurde ein "15 · 3" amplifizierter Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstest in Lösungsphase eingesetzt. Die Bezeichnung "15 · 3" stammt daher, dass das Format ein Multimer von einem Kamm-Typ verwendet, welches ein erstes Segment besitzt, das an die Amplifikations sonde hybridisiert, und 15 Wiederholungen eines zweiten Segmentes, welches an drei markierte Oligonucleotidsonden hybridisiert.
Das 15 · 3-verzweigte Oligonucleotid vom Kamm-Typ, welches 15 Verzweigungsstellen und Seitenkette-Verlängerungen besitzt, welche Bindungsstellen für drei markierte Oligonucleotide haben, wurde wie folgt synthetisiert.
Alle chemischen Synthesen von Oligonucleotiden wurden mit einem automatischen DNA-Syntheseautomaten (Applied Biosystems, Inc., (ABI) Modell 380 B) durchgeführt. Es wurde Phosphoramidit-Chemie vom Beta-Cyanoethyl-Typ eingesetzt, welche 5-Phosphorylierung beinhaltet, wobei PhostelTM - Reagenz (ABN) verwendet wurde. Mit Ausnahme der Stellen an denen es angegeben ist, wurden ABI-Standardprotokolle verwendet. Wo angegeben ist, dass ein Vielfaches eines Zyklus verwendet wurde (z. B. 1, 2 Zyklen), wurde in dem spezifischen Zyklus das Vielfache der Standardmenge an Amidit in Bezug auf die von ABI-angegebenen Mengen verwendet. Hier beigefügt sind die Programme zur Durchführung der Zyklen 1.2 und 6.4, wie sie mit dem Applied Biosystems Modell 380 B-DNA-Syntheseautomaten benutzt wurden.
Zuerst wurde ein Kamm-Körper der folgenden Struktur hergestellt:
wobei X' ein Verzweigungsmonomer, und R ein Periodat-spaltbarer Linker ist.
Unter Verwendung von 33,8 mg Aminopropyl-derivatisiertem Thymidinkontrolliertem Porenglas (Controlled Pore Glass; CPG) (2000 Å, 7,4 Mikromol Thymidin pro Gramm Träger) wurde zuerst der Teil des Kammkörpers mit den 15 (TTX')-Wiederholungen mit einem 1,2 Zyklus-Protokoll synthetisiert. Das Verzweigungsstelle-Nucleotid hatte die folgende Formel:
wobei R² folgendes repräsentiert
Für die Synthese des Kammkörpers (die Seitenketten nicht beinhaltend) betrugen die Konzentrationen von Beta-Cyanoethyl-phosphoramidit-Monomeren 0,1 M für A, C, G und T, 0,15 M für das Verzweigungsstellen-Monomer E und 0,2 M für das PhostelTM -Reagenz. Die Detritylierung wurde mit 3% Trichloressigsäure in Methylenchlorid unter Verwendung eines schrittweisen Durchflusses für die Dauer der Schutzgruppenentfernung durchgeführt. Zum Abschluss wurde die 5'-DMT mit einer Acetylgruppe ersetzt.
Ein spaltbarer Linker R und sechs Basen-Seitenketten-Verlängerungen der Formel 3'-RGTCAGTp wurden an jeder Verzweigungsmonomerstelle wie folgt synthetisiert. Die Basen-Schutzgruppen-Entfernung (R² in der vorstehenden Formel) wurde manuell durchgeführt, während der CPG-Träger in der gleichen Säule, welche für die Synthese des Kammkörpers verwendet wurde, zurückgehalten wurde. Im Falle von R² = Levulinyl wurde eine Lösung aus 0,5 M Hydrazinhydrat in Pyridin/Eisessig (1 : 1 v/v) zugegeben und für 90 Min. mit dem CPG-Träger in Kontakt gehalten, wobei die Flüssigkeit alle 15 Minuten erneuert wurde, gefolgt von intensivem Waschen mit Pyridin/ Eisessig (1 : 1 v/v) und dann mit Acetonitril. Nach der Schutzgruppenentfernung wurden der spaltbare Linker R und sechs Basen-Seitenketten-Verlängerungen unter Verwendung eines 6.4-Zyklus zugegeben.
Bei diesen Synthesen betrug die Konzentration der Phosphoramidite 0,1 M (mit Ausnahme von 0,2 M R und PhostelT M-Reagenz; R war 2-(4-(4-2- Dimethoxytrityloxy)ethyl)-phenoxy-2, 3-di(benzoyloxy)-butanoxy) phenyl) ethyl-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit).
Die Detritylierung wird mit einer Lösung aus 3% Trichloressigsäure in Methylenchlorid unter Verwendung eines kontinuierlichen Durchflusses erreicht, gefolgt von einer Spüllösung aus Toluol/Chlormethan (1 : 1 v/v). Verzweigte Polynucleotidketten wurden von dem festen Träger im 380 B unter Verwendung des Zyklus "CE NH&sub3;" automatisch entfernt. Die Ammoniumhydroxid- Lösung wurde in 4 ml Wheaton-Röhrchen mit Schraubdeckeln gesammelt und 12 Stunden bei 60ºC erhitzt, um alle Basen-Schutzgruppen zu entfernen. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel in einem Speed-Vac Eindampfungsapparat entfernt und der Rückstand in 100 ul Wasser gelöst. 3- Grundgerüst-Verlängerung (Segment A), Seitenkette-Verlängerungen und Ligierungs-Matrize/Linker der nachfolgenden Strukturen wurden ebenfalls unter Verwendung des automatischen Syntheseautomaten hergestellt:
Der ungereinigte Kammkörper wurde mit einem Standard-Polyacrylamidgel-Verfahren (7% mit 7 M Harnstoff und 1 · TBE-Elektrophoresepuffer) gereinigt.
Die 3'-Grundgerüst-Verlängerung und die Seitenketten-Verlängerungen wurden wie folgt an den Kammkörper ligiert. Der Kammkörper (4 umol/ul), die 3'-Grundgerüst-Verlängerung (6,25 umol/ul), die Seitenketten-Verlängerung (93,75 umol/ul), die Seitenketten-Kopplungsmatrize (93,75 umol/ul) und die Grundgerüst-Kopplungsmatrize (5 umol/ul) wurden in 1 mM ATP/ 5 mM DTT/ 50 mM Tris-HCl, pH 8,0/10 mM MgCl&sub2;/2 mM Spermidin mit 0,5 U/ul T4- Polynucleotidkinase vereint. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, dann in einem Wasserbad auf 95ºC erhitzt und dann während eines Zeitraumes von einer Stunde langsam auf unterhalb von 35ºC abgekühlt. 2 mM ATP, 10 mM DTT, 14% Polyethylenglycol und 0,21 U/ul T4-Ligase wurden zugegeben und das Gemisch wurde 16-24 Stunden bei 23ºC inkubiert. Die DNA wurde in NaCl/Ethanol gefällt, in Wasser resuspendiert und wie folgt einer zweiten Ligierung ausgesetzt. Das Gemisch wurde auf 1 mM ATP, 5 mM DTT, 14% Polyethylenglycol, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM Spermidin, 0,5 U/ul T4-Polynucleotidkinase eingestellt und 0,21 U/ul T4-Ligase wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 16-24 Stunden bei 23ºC inkubiert. Die Ligierungsprodukte wurden dann durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt.

Verwendete Markierungs- und Einfangsonden

Die Amplifikations-(Markierungs-) und Einfangsonde HCV-spezifischer Segmente, welche in diesem Test verwendet wurden, waren wie folgt:
Die Sonden sind komplementär zu Nucleotidsequenzen des HCV-E1-Gens von Gruppe I-Virusisolaten (siehe Fig. 2 A): ·
Die Sonden sind komplementär zu Nucleotidsequenzen des HCV-E1-Gens von Gruppe II-Virusisolaten (siehe Fig. 2 B):
Die Sonden sind komplementär zu Nucleotidsequenzen des C-Gens und zu der 5'-nicht translatierten Region (siehe Fig. 3):
In den vorstehenden Sätzen enthielt jede Einfangsonde zusätzlich zu den Sequenzen, welche zu den HCV-Sequenzen komplementär sind, eine stromabwärts liegende Sequenz, welche zu XT1* komplementär ist.

Testformat

Extraktionspuffer der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt
Extraktionpuffer-Rezept - 100 ml
Rezept für 100 ml
5,3 ml 1 M Tris-HCl, pH 8
4,24 ml 0,2 M EDTA
13 ml 10% SDS
160 ul 10 mg/ml sssDNA
26,5 ml 20 · SSC
7 ml deionisiertes Formamid
93 mg Proteinase K
Der Tris-Puffer, EDTA, SDS, beschallte Heringssperma-DNA und SSC wurden zu 25 ml deionisiertem Wasser zugegeben und das Volumen wurde mit deionisiertem Wasser auf 93 ml eingestellt. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt. Proteinase K wurde zu der Lösung zugegeben und gemischt, bis sie sich auflöste. Die Lösung wurde 3 Stunden in einem Wasserbad bei 37ºC inkubiert. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und das Formamid wurde zugegeben.
Der Hybridisierungspuffer des nachfolgenden Rezepts wurde hergestellt, indem die Bestandteile mit Unterbrechungen gemischt wurden, wobei eine Lösung hergestellt wurde.
Hybridisierungspuffer-Rezept - 11
Rezept für 1 Liter
5 g Blockierungs-Reagenz
10 ml 10% SDS
200 ml 20XSSC
DI- Wasser auf 1 Liter
25 ul der Einfang- und Markierungssonden wurden zu 3.000 ul PK-Puffer (12 mg Proteinase K gelöst in 6 ml Extraktionspuffer) zugegeben. 50 ul dieses Gemisches wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die wie in Beispiel 2 hergestellt worden war, gegeben, gefolgt von der Zugabe von 50 ul der Probe, von welcher angenommen wurde, dass sie HCV-Nucleinsäure enthält. Die Platte wurde mit Mylar bedeckt und 16 Stunden bei 65ºC inkubiert. Die Platte wurde dann abgekühlt, das Mylar entfernt, die Vertiefungen ausgesaugt, mit 1 · Waschpuffer (0,1% SDS/ 0,015 M NaCl/ 0,0015 M Natriumcitrat) gewaschen und nochmals ausgesaugt.
Eine Lösung aus Multimer (25 fmol/50 ul) in Hybridisierungspuffer wurde hergestellt und 50 ul wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde mit Mylar bedeckt, 30 Sekunden geschüttelt und 30 Minuten bei 55ºC inkubiert. Die Platte wurde dann abgekühlt, das Mylar entfernt, mit 1 · Waschpuffer gewaschen und ausgesaugt.
Der Test wurde mit Probenmaterial durchgeführt, welches HCV-RNA in Mengen von 5, 50 bzw. 500 Tipomolen (tm, 1 Tipomol = 602 Moleküle oder 10 2 l Mole) unter Verwendung von Mikrotiterplatten, welche wie in Beispiel 2 hergestellt worden war, mit unterschiedlichen Mengen immobilisierter (Einfang-)DNA pro Vertiefung durchgeführt. Die Sensitivität wurde als ein Deltawert = (Durchschnitt - 2 Stunden Entwicklung) - (0 + 2 Stunden Entwicklung) charakterisiert. Fig. 4 stellt die Ergebnisse dieser Tests dar. Wie angegeben, tritt die optimale Sensitivität für diesen Test bei 0,1 bis 1,1 umol immobilisierter DNA pro Vertiefung auf.

Beispiel 5

Tests für HBV-DNA wurden unter Verwendung des in vorstehendem Beispiel 4 beschriebenen Formats und mit Mikrotiterplatten wie in vorstehendem Beispiel 2 beschichtet, jedoch unter Verwendung unterschiedlicher Polypeptid-Beschichtungen, durchgeführt. In diesen Tests zeigten Poly-(Phe- Lys)-, Casein-, Boehringer-Mannheim-"Blocking-Reagenz" (#1096176 Boehringer-Mannheim Katalog)-, Poly-(Ala-Glu)- und Poly-(Glu-Lys)- beschichtete Platten ähnliches Verhalten in dem Test.

Beispiel 6

Ein modifiziertes Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

Vorwaschen

White Microlite 1 Removawell-Streifen (Polystyrol-Mikrotiterplatten, 96 Vertiefungen/Platte) wurden von Dynatech Inc. erhalten. Jede Vertiefung wurde mit 250 ul 1 N HCl gefüllt und 15-20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann mit 250 ul 1 N NaOH gefüllt und 15- 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurde dann dreimal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen.

Poly-(Phe-Lys)-Beschichtung

Poly-(Phe-Lys) (wie vorstehend beschrieben) wurde mit 2 M NaCl/1 X PBS zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml (pH 6,0) gemischt und 200 ul der resultierenden Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde in Plastik verpackt, um ein Austrocknen zu verhindern, und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die Platte wurde dann dreimal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen wurden ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen.

Oligonucleotid-Aktivierung

Zu 250 OD2 6 0 'Einheiten von PSCP (5- XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-Y, wobei X N&sup4;-(6-Aminocaproyl-2-aminoethyl)-5-methylcytidin ist) in 50 mM Natriumphosphat (pH 7,8) wurde Bis(sulfosuccinimidyl)-suberat ("BS³", 180 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde verwirbelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Gelfiltrationssäule (Sephadex® G-25, Pharmacia), welche mit 10 mM Natriumphosphat (pH 6,5) equilibriert worden war, wurde verwendet, um das aktivierte Oligonucleotid zu reinigen. Das aktiviertes Oligonucleotid-Reaktionsgemisch wurde auf die Säule gegeben und filtrieren gelassen. Das Eluat wurde gesammelt und zur Verwendung im nächsten Schritt aufbewahrt. Die Konzentration des Eluats wurde unter Verwendung von 50 mM Natriumphosphat (pH 7,8) zur Verdünnung auf 3,7 · 10&supmin; 2 OD&sub2;&sub6;&sub0; /ml eingestellt.

Kopplung des aktivierten Oligonucleotids an Poly-(Phe-Lys)- beschichtet Platten

Das aktiviertes Oligonucleotid-enthaltende Eluat (100 u1) wurde in jede Vertiefung gegeben und die Vertiefungen wurden 12-18 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die Platte wurde dann zweimal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen.

Abschließendes Strippen

NaOH (0,2 N, 250 ul), enthaltend 0,1 Gew.-% SDS, wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde in Plastik eingewickelt und 60 Minuten bei 65ºC inkubiert. Die Platte wurde dann dreimal mit 1 · PBS gewaschen und die Vertiefungen wurden ausgesaugt, um die Flüssigkeit zu entfernen.

Überkopplung

Natriumphosphat (50 mM, 100 ul, pH 7, 8), welches 0,4 mg/ml BS³ enthielt, wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und 12-18 Stunden mit der Platte inkubieren gelassen. Die Platte wurde dann zweimal mit 1 · PBS und einmal mit Wasser gewaschen. Die vollständig behandelten Platten wurden dann in Beuteln bei 4ºC aufbewahrt.
Modifikationen der vorstehend beschriebenen Möglichkeiten, die Erfindung durchzuführen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet der Biochemie, Nucleinsäure-Hybridisierungstests und verwandter Gebiete offensichtlich sind, sind beabsichtigt, in den Schutzumfang der nachfolgenden Ansprüche zu gehören.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung einer Nucleinsäuresonde mit einer ersten funktionellen Gruppe auf einer Polystyroloberfläche zur Verwendung in einem Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstest in Lösungsphase, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Reinigen der Polysytroloberfläche durch aufeinanderfolgendes Waschen mit einer starken Säure, starken Base und Wasser;

(b) passives Adsorbieren eines Polymers mit zweiten funktionellen Gruppen auf der gereinigten Polystyroloberfläche; und

(c) kovalentes Binden der Nucleinsäuresonde an das adsorbierte Polymer über eine basenstabile Verknüpfung, die die ersten und zweiten funktionellen Gruppen einbezieht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bindung über ein bifunktionelles Vernetzungsmittel bewirkt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polymer ein Polypeptid ist und die zweiten funktionellen Gruppen primäre Aminogruppen sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend den Schritt, daß man (d) die Polymer-Nucleinsäuresonde-beschichtete Oberfläche Bedingungen aussetzt, die mindestens so stringent sind wie die Bedingungen, die im Sandwich-Hybridisierungstest in Lösungsphase verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Polymer-Nucleinsäuresonde-beschichtete Oberfläche mit einer milden Basenlösung, die eine niedrige Konzentration an Detergens enthält, bei 25 bis 45ºC für 10 bis 180 Minuten in Kontakt gebracht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Lösung 0,01 bis 2 Gew.-% Natriumdodecylsulfat enthaltende 0,1 bis 0,5 N NaOH ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die starke Säure 1 bis 10 N HCl ist und die starke Base 1 bis 10 N Alkalimetallhydroxid ist.

8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Nucleinsäuresonde zuerst über eine Reaktion zwischen der ersten funktionellen Gruppe auf der Sonde und einer der funktionellen Gruppen des Vernetzungsmittels kovalent an das Mittel gebunden wird, so daß man eine aktivierte Nucleinsäuresonde erhält, und die aktivierte Nucieinsäuresonde dann kovalent über eine Reaktion zwischen einer der zweiten funktionellen Gruppen und der anderen funktionellen Gruppe des Mittels an das adsorbierte Polymer gebunden wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Nucleinsäuresonde ein Cytidin besitzt, in dem die N&sup4;-Position modifiziert ist, um die funktionelle Gruppe auf der Sonde bereitzustellen.

10. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Polymer Poly(Phe-Lys) und das Vernetzungsmittel Disuccinimidylsuberat ist, und die Nucleinsäuresonde ausgewählt ist aus 5'-XCACGACTTTCTCCAAAGAAG-3' und 5'- XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3', wobei X das N&sup4;-(6-Aminocaproyl-2-aminoethyl)derivat von Cytidin darstellt.

11. Erzeugnis zur Verwendung in einem Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstest in Lösungsphase, umfassend eine Polystyroloberfläche mit einem daran adsorbierten Polymer und einer Nucleinsäuresonde, die kovalent über ein basenstabiles bifunktionelles Vernetzungsmittel an das Polymer gebunden ist.

12. Erzeugnis nach Anspruch 11, wobei das Erzeugnis eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte ist.

13. Erzeugnis nach Anspruch 11, wobei das Erzeugnis ein Kügelchen ist.

14. Erzeugnis nach Anspruch 11, wobei sich etwa 0,1 bis 10 umol der Sonde auf der Oberfläche befinden.

15. Erzeugnis nach Anspruch 12, wobei sich etwa 0,4 bis 0,7 umol der Sonde auf der Vertiefungsoberfläche befinden.

16. Erzeugnis nach Anspruch 11, wobei das Polymer Poly(Phe-Lys) und das Vernetzungsmittel Disuccinimidylsuberat ist und die Nucieinsäuresonde ausgewählt ist aus 5'-XCACCACTTTCTCCAAAGAAG-3' und 5'- XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3', wobei X das N&sup4;-(6-Aminocaproyl-2-aminoethyl)derivat von Cytidin darstellt.

17. Nucleinsäuresandwich-Hybridisierungstest zum Nachweis der Gegenwart eines einzelsträngigen Nucleinsäureanalyten in einer Probe, wobei der Test die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Inkontaktbringen der Probe unter Hybridisierungsbedingungen mit einem Satz von Markierungssonden, von denen jede ein erstes Segment aufweist, das komplementär zum Analyten ist, und eines zweites Segment, das komplementär zu einem Segment eines DNA-Multimers ist, und einem Satz von Eingangsonden, von denen jede ein erstes Segment besitzt, das komplementär zum Analyten ist, und ein zweites Segment, das komplementär zu einem Oligonucleotid ist, das auf einer Polysytroloberfläche immobilisiert ist;

(b) Inkontaktbringen des Produkts von Schritt (a) unter Hybridisierungsbedingungen mit dem auf einer Polystyroloberfläche immobilisierten Oligonucleotid;

(c) Inkontaktbringen des Produkts von Schritt (b) unter Hybridisierungsbedingungen mit dem Multimer; und

(d) lnkontaktbringen des Produkts von Schritt (c) unter Hybridisierungsbedingungen mit einem markierten Oligonucleotid, das mit dem Multimer hybridisiert, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonucleotid auf der Poly sytroloberfläche über ein an die Oberfläche adsorbiertes Polymer immobilisiert ist, an das das Oligonucleotid über eine basenstabile Bindung kovalent geknüpft ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Bindung über ein bifunktionelles Vernetzungsmittel bewirkt wird.

19. Test nach Anspruch 17, wobei die Polystyroloberfläche eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte ist und die Schritte (a) bis (d) in der Vertiefung durchgeführt werden.

20. Test nach Anspruch 17, wobei die Oberfläche den Hybridisierungsbedingungen von Schritt (a) ausgesetzt wurde, nachdem das Oligonucleotid daran immobilisiert worden war, und vor Durchführung des Schrittes (a) gewaschen wurde.

21. Test nach Anspruch 18, wobei das Polymer Poly(Phe-Lys) und das Vernetzungsmittel Disuccinimidylsuberat ist und die Nucleinsäuresonde ausgewählt ist aus 5'-XCACCACTTTCTCCAAAGAAG-3' und 5'- XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3', wobei X das N&sup4;-(6-Aminocaproyl-2- aminoethyl)derivat von Cytidin darstellt.