JP2004004087A - ポリスチレン表面に核酸プローブを固定化する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイを別々のウェル中で行うことなく、1つのウェル中で行うことができ、アッセイの再現性を改善することができる、アッセイ方法および製造物品を提供することである。
【解決手段】溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、以下の工程を包含する、方法:(a)強酸、強塩基、および水で順次洗浄することにより該ポリスチレン表面を清浄化する工程;(b)該清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程;および(c)該核酸プローブを、該第一官能基および該第二官能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、該吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【選択図】 なし
【解決手段】溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、以下の工程を包含する、方法:(a)強酸、強塩基、および水で順次洗浄することにより該ポリスチレン表面を清浄化する工程;(b)該清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程;および(c)該核酸プローブを、該第一官能基および該第二官能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、該吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの分野に属する。より詳細には、本発明は、分析される核酸を溶液から取り出す目的のために、ポリスチレン表面上に核酸プローブを固定するための改良方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
同一人に譲渡された米国特許第4,868,105号には、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが開示されている。このアッセイでは、分析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブのセットとハイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセットとハイブリダイズされる。次いで、プローブ−分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに相補的である固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブにハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形態で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。最終的に、標識化プローブのセットの一本鎖セグメントは標識プローブにハイブリダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じたシグナルによって検出され得る。
【0003】
同一人に譲渡された欧州特許出願(EP)第317077号には、米国特許第4,868,105号に記載のアッセイの変形が開示されており、ここでは、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌクレオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結合した核酸(分枝または直鎖状)に特異的にハイブリダイズするセグメント、ならびに、標識プローブに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。マルチマーを用いるアッセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリダイズさせ、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントとハイブリダイズする固定化核酸を含む他の容器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にハイブリダイズされ、さらに、標識プローブはマルチマーの第二のセグメントの反復にハイブリダイズされる。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の部位を提供するので、シグナルが増幅される。
【0004】
1990年7月27日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願米国特許出願第558,897号(PCT WO92/02526)には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチマーよりも強くシグナルを増強する。
【0005】
EP317077に記載のように、2つの型の溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ形式が使用される:それはビーズアッセイ手順、およびマイクロタイタープレートアッセイ手順である。実際には、マイクロタイタープレートアッセイが、好ましい。ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル中の捕獲プローブを固定する手順は、以下に示すとおりであった。ポリ−(フェニルアラニル−リシン)を、プレートのウェル表面上に受動的に吸着させた。固定化されるべきオリゴヌクレオチドを、固相法によって5’改変シチジン(シチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル誘導体)を有するように合成した。このオリゴヌクレオチドを、改変シチジンと二価性架橋剤のエチレングリコールビス−(スクシンイミジルスクシネート)との反応によって活性化し、そして、活性化オリゴヌクレオチドを、ウェルに添加し、室温でインキュベートした。インキュベーションの間、架橋剤の他の官能基は、吸着したポリ−(フェニルアラニル−リシン)の一級アミノ基と反応し、このためオリゴヌクレオチドを固定する。次いで、ウェルをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄(washed)し、HM緩衝液(0.1% SDS、4×SSC、1mg/mL 音波処理サケ精子DNA、1mg/mL ポリ−A、10mg/mL ウシ血清アルブミン)でコートし、PBSで再び洗浄し、そして使用のために保存した。示されるように、捕獲プローブセットおよび増幅プローブセットに対する、分析物の初期ハイブリダイゼーションを、塩基条件下で別のウェル中で行った。ハイブリダイゼーション後、溶液を中和した。そして、中和溶液を固定化プローブを含むウェル中に移した。初期ハイブリダイゼーションは、固定化捕獲プローブを含んだウェル中では行われ得なかった。なぜなら、固定化複合体は、ハイブリダイゼーション条件下で不安定であるからである。
【0006】
本発明は、上記の従来の手順よりも優れるいくつかの利点を提供する。第一に、本発明によれば、初期ハイブリダイゼーションを包含する全体のアッセイが、1っのウェル中で行われ得る。第二に、本発明は、アッセイの再現性を改良する。最後に、大きなコーム型マルチマーを用いるその好ましい実施態様において、バックグラウンドシグナルを減少させる。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の1つの局面は、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、この方法は以下の工程を包含する:
(a)強酸、強塩基および水で順次洗浄することによりポリスチレン表面を清浄化する(cleansing)工程;
(b)ポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程;および
(c)核酸プローブを、塩基安定性の連結を通じて、吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【0008】
本発明の別の局面は、ポリスチレン表面上に吸着したポリマーおよび塩基安定性の連結を通じてポリマーに共有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン表面を包含する、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための製造物品である。
【0009】
本発明のさらに別の局面は、試料中において分析される一本鎖核酸の存在を検出するための溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイの改善であり、ここで、アッセイが、以下の工程:
(a)試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触させる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびDNAマルチマーのセグメントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕獲プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびポリスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに相補的な第二セグメントを有する、工程;
(b)工程(a)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、ポリスチレン表面に固定化した該オリゴヌクレオチドと接触させる工程;
(c)工程(b)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、該マルチマーと接触させる工程;および
(d)工程(c)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、該マルチマーにハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、そして改良点は、工程(b)において、吸着したポリマーを通じてポリスチレン表面に固定化したオリゴヌクレオチドであって、塩基安定性の連結を通じて該吸着したポリマーに共有結合したオリゴヌクレオチドを使用することである。
【0010】
【課題を解決するための手段】
(項目1) 溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、以下の工程を包含する、方法:
(a)強酸、強塩基、および水で順次洗浄することによりこのポリスチレン表面を清浄化する工程;
(b)この清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程;および
(c)この核酸プローブを、この第一官能基およびこの第二官能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、この吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【0011】
(項目2) 上記結合が、二価性架橋剤を通じてつくられる、項目1に記載の方法。
【0012】
(項目3) 上記ポリマーがポリペプチドであり、そして上記第二官能基が一級アミノ基である、項目1に記載の方法。
【0013】
(項目4) (d)少なくとも、上記溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで使用される条件と同程度のストリンジェントな条件に、上記ポリマー−核酸プローブでコートされた表面をさらす工程を包含する、項目1に記載の方法。
【0014】
(項目5) 上記ポリマー−核酸プローブでコートされた表面を、25〜65℃で10〜180分間、低濃度のデタージェントを含有する弱塩基溶液と接触させる、項目2に記載の方法。
【0015】
(項目6) 上記溶液が、0.01〜2重量%ドデシル硫酸ナトリウムを含有する0.1〜0.5N NaOHである、項目3に記載の方法。
【0016】
(項目7) 上記強酸が1〜10N HClであり、そして上記強塩基が1〜10Nアルカリ金属水酸化物である、項目1に記載の方法。
【0017】
(項目8) 最初に上記核酸プローブが、上記架橋剤に、このプローブ上の第一官能基とこの架橋剤の官能基の1つとの間の反応を通じて共有結合して、活性化した核酸プローブを形成し、そして次いで、この活性化核酸プローブが、上記吸着したポリマーに、上記第二官能基の1つとこの架橋剤の他の官能基との間の反応を通じて共有結合する、項目2に記載の方法。
【0018】
(項目9) 上記核酸プローブが、このプローブ上の上記官能基を提供するために、N4−位が改変されているシチジンを有する、項目8に記載の方法。
【0019】
(項目10) 上記ポリマーがポリ(Phe−Lys)であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸ブローブが、
【0020】
【化1】
からなる群より選択され、ここでXがシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体を表す、項目2に記載の方法。
【0021】
(項目11) ポリスチレン表面上に吸着したポリマー、および塩基安定性二価性架橋剤を通じて、このポリマーに共有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン表面を含む、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで使用するための製造物品。
【0022】
(項目12) 上記物品が、マイクロタイタープレートのウェルである、項目11に記載の製造物品。
【0023】
(項目13) 上記物品が、ビーズである、項目11に記載の製造物品。
【0024】
(項目14) 上記表面上に上記プローブが、約0.1〜10ピコモル存在する、項目11に記載の製造物品。
【0025】
(項目15) 上記ウェル表面上に上記プローブが、約0.4〜0.7ピコモル存在する、項目12に記載の製造物品。
【0026】
(項目16) 上記ポリマーがポリ(Phe−Lys)であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸プローブが、
【0027】
【化2】
からなる群より選択され、ここでXがシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体を表す、項目11に記載の製造物品。
【0028】
(項目17) 試料中において分析される一本鎖核酸の存在を検出するための溶液相核酸サンドイッチハイブリダィゼーションアッセイであって、ここでこのアッセイが以下の工程:
(a)この試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触させる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびDHAマルチマーのセグメントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕獲プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびポリスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに相補的な第二セグメントを有する、工程;
(b)工程(a)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、ポリスチレン表面に固定化した、このオリゴヌクレオチドと接触させる工程;
(c)工程(b)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、このマルチマーと接触させる工程;および
(d)工程(c)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、このマルチマーにハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、
そして改良点は、このオリゴヌクレオチドが、表面に吸着したポリマーを通じてこのポリスチレン表面に固定化され、塩基安定性の連結を通じてこのポリマーに共有結合していることである、アッセイ。
【0029】
(項目18) 上記結合が、二価性架橋剤を通じてつくられる、項目17に記載のアッセイ。
【0030】
(項目19) 上記ポリスチレン表面がマイクロタイタープレートのウェルであり、工程(a)〜(d)がこのウェル内で行われる、項目17に記載のアッセイ。
【0031】
(項目20) 上記表面が、工程(a)を行う前に、オリゴヌクレオチドをその中に固定化してそして洗浄した後、工程(a)のハイブリダイゼーション条件にさらされる、項目17に記載のアッセイ。
【0032】
(項目21) 上記ポリマーがポリ(Phe−Lys)であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸プローブが、
【0033】
【化3】
からなる群より選択され、ここでXがシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体を表す、項目18に記載のアッセイ。
【0034】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる共有結合を特徴付けるのに使用される用語「塩基安定性」とは、4〜70℃の範囲の温度で1N NaOHと接触したとき、または少なくとも溶液相ハイブリダイゼーションアッセイにおける分析物に対するプローブのハイブリダイゼーションにおいて使用される程度にストリンジェントな(例えば、模擬またはよりストリンジェントな)条件下で、実質的な分解(例えば、加水分解による共有結合の切断)が起こらない結合を意味する。
【0035】
用語「二価性架橋剤」は、2つの官能基を有する有機分子を意図しており、ここで、官能基の内の1つは、試薬とポリマーとの間に共有結合を形成するために、本発明中で使用されているポリマーの官能基と反応し得、そして、もう1つの官能基は、試薬とプローブとの間に第二の共有結合を形成するために、固定化される核酸プローブ上の官能基と反応し得る。得られた3成分の複合体は、試薬の2っの官能基とポリマー上の官能基およびプローブ上の官能基との間の反応を通じて、ポリマーおよびプローブの両方に共有結合する架橋剤を含む。好ましくは、ポリマーおよびプローブ上の官能基は、一級アミノ基であり、そして試薬上の官能基は、一級アミノ基と反応する官能基から選択される(例えば、カルボキシル基、塩化スルホニル基、またはアルデヒド基)。
【0036】
用語「溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ」は、同一人に譲渡された米国特許第4,869,105号およびEP317077に記載およびクレームされているアッセイ法を意味する。
【0037】
「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、そして架橋剤の官能基と反応する付加的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味する。
【0038】
「マルチマー」とは、分析される核酸および多数の標識プローブに、同時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマーの分枝は、共有結合によりつくられ、そしてマルチマーは、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズする核酸に対して、および多数の標識プローブに対してハイブリダイズし得る、2つの型のオリゴヌクレオチド単位で構成される。このようなマルチマーの組成物および調製は、EP317077およびWO92/02526に記載されており、これらの開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。
【0039】
(ポリスチレン表面上のプローブの固定)
以下の記載は、従来のポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル表面上にプローブを固定することを述べているが、本発明の方法が、核酸サンドイッチハイブリダイゼーションにおいて用いられる他のポリスチレン表面(例えば、粒子(ビーズ)、チューブ、フィルター、カラムなど)に、プローブを固定するのに用いられ得ることは、認識される。
【0040】
最初に、ポリスチレン表面を、強酸、強塩基、および水性緩衝液で、連続して洗浄することにより清浄化する。酸は通常、0.1〜5Nの濃度での、塩酸、硝酸、または硫酸のような鉱酸である。塩酸(IN)が好ましい。表面を、通常4〜37℃の範囲の温度で1〜60分間(好ましくは約15〜20分間)、酸と接触させる。次いで、酸処理をしたウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水のような中性の水性緩衝液で洗浄する。強塩基は、通常0.1〜5Nの濃度のアルカリ金属水酸化物(例えば、NaOH、KOH)である。水酸化ナトリウム(1N)が好ましい。表面と塩基との間の接触時間は、通常1〜60分間であるが、好ましくは約15〜20分間である。接触温度は、典型的には、再度4〜37℃である。塩基処理に続いて、表面を中性の水性緩衝液で再び洗浄する。
【0041】
表面を、ポリマーでコートする。このポリマーは、好ましくは多数の反応性の一級アミノ基を有するポリペプチドであって、そしてポリスチレン上で受動的に吸着されるポリペプチドである。ポリペプチドは、典型的には、1分子当り平均して約10%〜100%の、一級アミン含有アミノ酸残基を有する。ポリペプチドは、天然産生タンパク質または合成ポリペプチドであり得る。合成ポリペプチドは、ホモポリマー(同じアミノ酸で構成されている)またはコポリマー(2種またはそれ以上のアミノ酸で構成されている)であり得る。天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれかにある、スルフヒドリルまたはカルボキシレートのような、他の反応性官能基が用いられ得る。その分子量は、厳密ではなく、通常5,000〜50,000ダルトンの範囲内である。この資格内で使用され得るポリペプチドの例は、ポリリシン、ポリ(Phe−Lys)、ポリ(Ala−Glu)、カゼイン、およびウシ血清アルブミンである。30,000〜60,000の範囲の分子量を有するポリ(Phe−Lys)(phe:lysが1:1モル比)が、好ましい。清浄化したポリスチレンを、ポリペプチドの中性(pH6〜8)水性緩衝溶液と接触させることにより、コーティングを行う。溶液中のポリペプチド濃度は、通常0.01〜10mg/mlであるが、0.1〜1.5mg/mLが、より通例である。溶液は、必要に応じて約5Mまでの濃度の塩を含有し得る。ポリペプチドコーティング工程は、通常20℃〜65℃で0.5〜36時間、好ましくは25〜35℃で15〜20時間行われる。この処理に続き、表面を、中性の水性緩衝液で繰り返し洗浄し、吸着していないあらゆるポリペプチドを取り除く。必要に応じて、表面を、アッセイの初期ハイブリダイゼーションの工程で用いられる条件を模擬した条件か、またはよりストリンジェントな条件(pH、イオン強度、デタージェント、プロテイナーゼ)にさらして、初期ハイブリダイゼーションの間に脱落し得る吸着したポリペプチドを脱落させ得る。
【0042】
吸着したポリペプチドと共有結合する一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、Warnerら、DNA(1984)3:401に記載の自動化ホスホルアミデート法によって調製され得、そしてSanchez−PescadorおよびUrdea,DNA(1984)3:339に従って精製され得る。それらは、5’改変ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを包含する。そしてこれらは、反応部位を提供する官能基を含有しており、この反応部位により架橋剤にオリゴヌクレオチドをカップリングさせる。好ましい改変ヌクレオチドは、5−メチル−シチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体であり、それは米国特許第4,868,105号に記載されている。他の改変ヌクレオチドは、米国特許第4,948,882号に記載されている。オリゴヌクレオチドプローブの長さおよび塩基組成は、それがハイブリダイズすべき核酸配列の長さおよび塩基組成に依存する。その長さは通常15〜100ヌクレオチド、より通例では20〜30ヌクレオチドである。21塩基のオリゴヌクレオチド5’−XCACCACTTTCTCCAAAGAAG−3’(EP317077に記載)、および5’−XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG−3’(ここでXはシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体を表す)が、標準プローブ配列として選択された。
【0043】
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5’改変ヌクレオチドの官能基と架橋剤の官能基の1つとの間の反応を経て、塩基安定性の二価性架橋剤とカップリングする。オリゴヌクレオチドが架橋剤の両方の官能基とカップリングするのを避けるために、試薬は非常に過剰で使用される(例えば、50倍〜1000倍過剰)。塩基安定性、および、オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドのアミノ基との反応性の機能的基準が満たされる限り、種々の架橋剤が使用され得る。適切な架橋剤の例は、Pierce Chemical Catalog中に見られ得る。カップリング反応の条件は、使用した特定の試薬により変更する。現在において、好ましい架橋剤は、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートである。架橋剤は、通常極性溶媒または水性緩衝液に溶解され、そしてこの溶液は、水性緩衝液および極性溶媒中のオリゴヌクレオチド溶液に添加される。カップリングは、通常は中性(6−8)pH、および4℃〜25℃の範囲の温度で約10分間〜18時間行われる。得られたオリゴヌクレオチド−架橋剤複合体(本明細書中では、時に「活性化オリゴヌクレオチド」と呼ばれる)は、従来のクロマトグラフィー手順を用いて、未反応の開始物質および不要の反応生成物から精製され得る。
【0044】
次いで、架橋剤の残存官能基が、吸着したポリペプチドのアミノ基と反応し得る条件下で、ポリペプチドでコートした表面を、精製した活性化オリゴヌクレオチドの中性水性緩衝化溶液と接触させる。典型的に、このカップリング反応は、0℃〜25℃で0.5〜18時間、好ましくは2℃〜8℃で8〜18時間、過剰な活性化オリゴヌクレオチド(10倍〜100倍過剰が好ましい)を用いて行われる。この反応が完了した後、表面を水性緩衝液で洗浄し、表面から未反応の活性化オリゴヌクレオチドを除去する。本方法のこの段階で、表面は、核酸プローブが架橋剤を通じて共有結合した吸着したポリペプチドでコートされる。標準的なマイクロタイターウェルの場合、1ウェル当りの固定化核酸プローブは、典型的に0.1〜10pmol、好ましくは0.4〜0.7pmolである。この時点で、必要に応じて、表面に二価性架橋剤をさらに添加し、プレート表面上に残存するあらゆる反応基と反応させることによって、プレートを「過カップリング(overcouple)」し得る。
【0045】
表面が増幅アッセイ手順で使用されるとき、特に、WO92/02526の大きなコーム型マルチマーを使用するアッセイでは、アッセイの溶液相ハイブリダイゼーション工程における主要な条件(pH、イオン強度、温度、デタージェント)を模擬した条件に表面を置くのが好ましい。このような処理は、溶液相ハイブリダイゼーション中で脱落し得る、あらゆるポリペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を脱落させるのに役立つ。従って、このような場合では、表面を、低濃度のデタージェント(例えば、0.01〜2.0重量% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む0.1〜0.5N NaOH)を含有する弱塩基溶液と25〜85℃で10〜180分間接触させる。この最終処理の後、表面をアスピレートする。次いで、表面を水性緩衝液で洗浄する。それは、使用するまで、湿度を制御した環境で0℃〜10℃で貯蔵され得る。
【0046】
(溶液相ハイブリダイゼーションアッセイでのコートしたポリスチレン表面の使用)
コートしたポリスチレン表面は、以下の溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションで用いられる。コートした表面が、マイクロタイタープレートのウェルの内側の表面である場合、分析される核酸を、過剰量の以下に示す2つの一本鎖核酸プローブセットを入れたウェル中に入れる:(1)捕獲プローブのセット、それぞれ、分析物に相補的な第一結合配列、および、ウェル表面に結合した核酸に相補的な第二結合配列を有する、および(2)増幅プローブ(分枝または直鎖状)のセット、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有する。増幅プローブを用いることにより、マルチマーは「万能」試薬にするべく設計され得、そして各分析物に対して異なるマルチマーをつくる必要はない。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物にハイブリダイズした2つのプローブからなる3成分の核酸複合体である。プローブの第二結合配列は、分析物と相補的ではないので、一本鎖セグメントのままで残っている。この複合体は、ウェル表面上の固定化プローブに、第二結合配列によってハイブリダイズする。得られた生成物は、ウェル表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形成された二重鎖によって、ウェル表面に結合した複合体を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面から除去する。
【0047】
次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーション条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列にハイブリダイズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーからも分離する。次いで、標識オリゴヌクレオチドを、マルチマーの相補的なオリゴヌクレオチド単位にハイブリダイズさせるような条件下で加える。次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取る。
【0048】
分析される核酸は、種々の供給源(例えば、生物学的液体または固体、食料品、環境物質など)由来であり得、種々の手段(例えば、プロテイナーゼK/SDS、カオトロピック塩など)によりハイブリダイゼーション分析のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または化学的手段(例えば、制限酵素、音波処理、化学分解(例えば、金属イオン)など)によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フラグメントは、0.1Kb程に小さくあり得、通常少なくとも約0.5Kbであり、そして1Kbまたはそれ以上であり得る。分析される配列は、分析のため一本鎖形態で提供される。配列が天然に一本鎖形態で存在する場合、変性は必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、配列を変性する。変性は種々の技法(例えば、アルカリ、一般的には約0.05〜0.2Mの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、またはそれらの組合せ)により行われ得る。
【0049】
分析される配列に相補的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも15ヌクレオチド、通常少なくとも25ヌクレオチド、そして約5Kb以下、通常約1Kb以下、好ましくは約100ヌクレオチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約30ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。第一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コンセンサス配列、多型性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連し得る。
【0050】
増幅プローブおよび捕獲プローブの第一結合配列を適切に選択することによって、それらは、特定の遺伝子を含む特異的な核酸分子、または異なる複数の核酸分子の一部として存在する、他の配列を同定するのに使用され得る。目的とする核酸分子を、同じ特定の配列を含む他の分子から識別するためには、プローブの1つを、特定の配列に相補的に形成し、一方、他のプローブを、その分子に特有である(すなわち、特定の配列を含む他の分子には存在しない)その分子のもうひとつの配列に相補的に形成する。
【0051】
捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、ポリスチレン表面に分枝した(branch)オリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、相補的であるように、そして試料/分析物の内在性配列に遭遇することのないように選択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。
【0052】
捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングにより調製され得るが、前者が好ましい。
【0053】
結合配列は、完全に相補的であって、ホモ二本鎖を提供する必要はない。多くの場合では、5個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約10%未満の塩基がミスマッチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中で用いられる用語「相補的」とは、安定した二重構造を提供するのに十分な相補性の程度を意味する。
【0054】
標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に相補的な配列を含む。標識オリゴヌクレオチドは、1つまたはそれ以上の分子(「標識」)を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供する。標識は、相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端メンバーまたは末端テイルとして存在し得る。配列に結合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告されている。例えば、Learyら、Proc Natl Acad Sci USA(1983)80:4045;RenzおよびKurz、Nuc Acids Res(1984)12:3435;RichardsonおよびGumport、Nuc Acids Res(1983)11:6167;Smithら、Nuc Acids Res(1985)13:2399;MeinkothおよびWahl、Ana Biochem.(1984)138:267を参照のこと。標識は、相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが包含される。例示の特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド(Texas red)、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、NADPH、α−β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが包含される。
【0055】
分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少なくとも約1.5:1であり、より好ましくは少なくとも2:1である。通例、2:1から10,000:1の範囲内である。各プローブの濃度は、一般的に約10−10〜10−6Mの範囲であり、試料の核酸濃度は、10−21〜10−12Mまでの種々の範囲をとる。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般的に約10分から2時間までを要し、多くは約1時間で完了する。ハイブリダイゼーションは、やや高めの温度で、一般的には約20℃から80℃の範囲で、より通常には約35℃から70℃までで、特に65℃で行われ得る。
【0056】
ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加剤を合有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデタージェント(0.1〜1%)、塩類(例えば、クエン酸ナトリウム(0.017〜0.17M))、フィコール、ポリビニルピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含される。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドである。これらの他の溶媒は、2〜50%の範囲内の量で存在する。
【0057】
ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ストリンジェンシーを変化させる。
【0058】
標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存して、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に対しては、ルミノメーターまたはフィルムが有用である。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミノメーター、分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、本アッセイに用いられ得る。
【0059】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。
【0060】
【実施例】
(実施例1)
White Microlite 1 Removawellストリップ(ポリスチレンマイクロタイタープレート、96ウェル/プレート)を、Dynatech Inc.から購入した。
【0061】
(予備洗浄)
各ウェルに200μLの6N HClを満たし、室温で15〜20分間インキュベートした。次いで、このプレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いでウェルに200μLの6N NaOHを満たし、室温で15〜20分間インキュベートした。プレートを再び1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【0062】
(ポリ(Phe−Lys)コーティング)
ポリ(Phe−Lys)をSigma Chemicals,Inc.から購入した。このポリペプチドは、phe:lysを1:1のモル比で有しており、平均分子量は47,900gm/molである。平均長さは309アミノ酸であり、155アミン/molを含む。ポリペプチドの1mg/ml溶液30mLを、2M NaCl/0.5×PBSと混合し、最終濃度0.1mg/mL(pH6.0)にした。各ウェルに、この溶液を100μLずつ加えた。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、30℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【0063】
(最初のストリッピング)
0.5重量% SDSを含有する200μLの0.2N NaOHをポリペプチドでコートしたウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、65℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【0064】
(オリゴヌクレオチドの活性化)
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)の50mgアリコートを、それぞれ500μLのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。
【0065】
1×PBS中の上記21−merオリゴヌクレオチド(XT1*と呼ぶ)の26 OD260単位を、DSS−DMFの各アリコートに添加した。混合物をボルテックスにかけ、室温で30分間インキュベートした。2本のNAP25カラム(26 OD260当り1,50μLアリコート)を、1×PBSで平衡化し、DSS−DMF−オリゴヌクレオチド混合物を1×PBS 2mLで希釈し、そして希釈混合物をカラム上に即座に載せた。カラムから流出させ、そして溶離剤を廃棄した。活性化オリゴヌクレオチドを、各カラムから1×PBS 3.5mLで溶出し、全部のカラムを集めて1×PBS 100mLに入れた。
【0066】
(ポリ(Phe−Lys)でコートしたプレートヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング)
各ウェルに、活性化オリゴヌクレオチド含有溶離剤を50μLずつ加え、ウェルを室温で120分間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。
【0067】
(最終ストリッピング)
0.5重量% SDSを含有する200μLの0.2N NaOHを各ウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、65℃で60分間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。ストリッピングしたプレートを、2〜8℃で乾燥剤ビーズと共に貯蔵した。
【0068】
(実施例2)
(予備洗浄)
Microlite 1 Removawellポリスチレンマイクロタイタープレートを、1N HClおよび1N NaOHを使用した以外は、実施例1のように予備洗浄した。
【0069】
(ポリペプチドコーティング)
ウェルを実施例1のようにコートした。最初のストリッピング工程を省いた。
【0070】
(オリゴヌクレオチドの活性化)
XT1*オリゴヌクレオチドを、以下のことを除いて、実施例1のように活性化した:XT1*に対するDSSのモル比を、1000:1の代わりに400:1にした;活性化中に用いた緩衝液およびpHは、pH7.8でのリン酸ナトリウムであった;活性化を停止させるために使用した緩衝液およびpHは、pH6.5のリン酸ナトリウムであった;そして、活性化オリゴヌクレオチドを精製するのに用いた温度および緩衝液は、pH6.5のリン酸ナトリウム、4℃であった。
【0071】
(コートしたウェルヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング)
カップリングを、緩衝液をリン酸ナトリウム(pH7.8)とし、そしてインキュベーションを一晩行った以外は、実施例1のように行った。
【0072】
(ストリッピング)
ウェルを、0.2N NaOH/0.5重量% SDSで、実施例1のようにストリッピングした。
【0073】
(実施例3)
実施例1および2の固定化手順を、カップリング工程で使用した活性化オリゴヌクレオチドの量をいろいろと変えて用いて繰り返した。ウェル表面に結合したオリゴヌクレオチドの量を、これらの各実験において測定した。図1は、これらの実験結果を示すグラフである。示したように、実施例2の手順により、ウェルに添加した所定の量の活性化オリゴヌクレオチドで、約10倍以上のオリゴヌクレオチドが表面に結合した。
【0074】
(実施例4)
本実施例は、HCV RNAアッセイにおける本発明の使用を例示し、そして、プレート上に固定化されたプローブの量に対するアッセイ感度に関する。
【0075】
(アッセイで使用するマルチマーの合成)
「15×3」増幅溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを、この実施例で用いた。「15×3」の呼称は、形式が、増幅プローブにハイブリダイズする第一セグメント、および、3つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第二セグメントの15個の反復を有するコーム型マルチマーを用いることに由来する。
【0076】
15個の分枝部位、および、3つのオリゴヌクレオチド結合部位を有する側鎖伸長を有する15×3コーム型分枝オリゴヌクレオチドを、以下のように合成した。
【0077】
オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動DNA合成機(Applied Biosystems,Inc.,(ABI)モデル380B)で行った。βシアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用いた。これには、PhostelTM試薬(ABN)を用いる5’リン酸化が包含される。示したこと以外は、標準的なABIプロトコルを用いた。複数のサイクルを用いた(例えば、1.2サイクル)と示されている場合、ABIにより推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられた。Applied BiosystemsModel 380B DNA合成機で行われる、サイクル1.2および6.4を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。
【0078】
以下の構造のコーム体を最初に調製した:
【0079】
【化4】
ここで、X’は分枝モノマーであり、そしてRは過ヨウ素酸切断可能リンカーである。
【0080】
15個の(TTX’)繰り返しによるコーム体の部分を、33.8mgのアミノプロピル誘導体化チミジンの調整孔ガラス(CPG)(2000Å、支持体1グラム当り7.4マイクロモルチミジン)を用いて、1.2サイクルプロトコルで、最初に合成する。分枝部位ヌクレオチドは、下式であった:
【0081】
【化5】
ここでR2は
【0082】
【化6】
を表す。
【0083】
コーム体(側鎖を含まない)の合成に関して、βシアノエチルホスホルアミダイトモノマーの濃度は、A、C、G、およびTが0.1M、分枝部位モノマーEが0.15M、およびPhostelTM試薬が0.2Mであった。脱トリチル化は、脱保護期間中に階段フロースルー(stepped flowthrouh)を用いて、塩化メチレン中の3%トリクロロ酢酸で行った。最終的に、5’DMTをアセチル基で置換した。
【0084】
切断可能リンカーRおよび式3’−RGTCAGTpの6塩基の側鎖伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位で合成した。塩基保護基(上式のR2)の除去は、コーム体の合成に用いたのと同じカラム中にCPG支持体を保持している間に、手動的に行った。R2がレブリニルである場合、0.5Mヒドラジン水和物のピリジン/氷酢酸(1:1 v/v)溶液を加え、15分ごとに液体を取り替えながら90分間CPG支持体と接触させておき、続いてピリジン/氷酢酸(1:1 v/v)で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄した。脱保護を行った後、切断可能リンカーRおよび6塩基側鎖伸長を、6.4サイクルを用いて加えた。
【0085】
これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度は、0.1Mであった(0.2MのRおよびPhostelTM試薬を除く;Rは、2−(4−(4−(2−ジメトキシトリチルオキシ)エチル)−フェノキシ2,3−ジ(ベンゾイルオキシ)−ブタンオキシ)フェニル)エチル−2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイトであった)。
【0086】
脱トリチル化は、3%トリクロロ酢酸の塩化メチレン溶液で連続フロースルーを用いて行い、次いでトルエン/クロロメタン(1:1 v/v)の溶液でリンスする。分枝ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクル「CE NH3」を用いて380Bで自動的に除去した。水酸化アンモニウム溶液を4mLのスクリューキャップWheatonバイアルに集め、60℃で12時間加熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒をSpeed−Vacエバポレーターで除去し、残渣を100μLの水に溶解した。以下の構造の3’バックボーン伸長(セグメントA)、側鎖伸長、および連結反応テンプレート/リンカーもまた、自動合成機を用いて作成した。
【0087】
【化7】
粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法(7%、7M尿素および1×TBEランニング緩衝液を含む)により精製した。
【0088】
3’バックボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した。コーム体(4pmol/μL)、3’バックボーン伸長(6.25pmol/μL)、側鎖伸長(93.75pmol/μL)、側鎖連結テンプレート(93.75pmol/μL)、およびバックボーン連結テンプレート(5pmol/μL)を、1mM ATP/5mM DTT/50mM トリスHCl、pH8.0/10mM MgCl2/2mM スペルミジン中で、0.5単位/μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼと合わせた。この混合物を37℃で2時間インキュベートし、次いで水浴中で95℃に加熱し、次いで1時間かけて35℃未満までゆっくりと冷却した。2mM ATP、10mM DTT、14%ポリエチレングリコール、および0.21単位/μL T4リガーゼを加え、そして混合物を23℃で16〜24時間インキュベートした。DNAをNaCl/エタノール中で沈澱させ、水中に再懸濁し、そして以下のような2回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、1mM ATP、5mM DTT、14%ポリエチレングリコール、50mM トリスHCl、pH7.5、10mM MgCl2、2mM スペルミジン、0.5単位/μL T4ポリヌクレオチドキナーゼ、および0.21単位/μL T4リガーゼを加え、そして混合物を23℃で16〜24時間インキュベートした。次いで、連結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
【0089】
(使用した標識プローブおよび捕獲プローブ)
本アッセイで使用した、増幅(標識)プローブHCV−特異的セグメントおよび捕獲プローブHCV−特異的セグメントは、以下の通りである:
ウイルス単離物第I群の、HCV E1遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なプローブ(図2Aを参照):
【0090】
【表1】
ウイルス単離物第II群の、HCV E1遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なプローブ(図2Bを参照):
【0091】
【表2】
C遺伝子および5’−末翻訳領域のヌクレオチド配列に相補的なプローブ(図3参照):
【0092】
【表3】
上のセットでは、それぞれの捕獲プローブは、HCV配列に相補的な配列に加えて、XT1*に相補的な下流配列を含む。
【0093】
(アッセイ形式)
以下の範囲の抽出用緩衝液を調製した。
【0094】
【表4】
トリス、EDTA、SDS、音波処理サケ精子DNAおよびSSCを、25mLの脱イオン水に添加し、そして脱イオン水で体積を93mLに調整した。溶液を穏やかに混合し、そしてpHを7.5に調整した。プロテイナーゼKを溶液に添加し、そして溶解するまで混合する。溶液を水浴中で、37℃で3時間インキュベートした。溶液を室温まで冷却し、そしてホルムアミドを添加した。
【0095】
含有物と、溶液を形成する残りのものとを混合することにより、以下に示す処方のハイブリダイゼーション緩衝液を調製した。
【0096】
【表5】
捕獲プローブおよび標識プローブの各25μLを、PK緩衝液(プロテイナーゼK12mgを、抽出緩衝液6mL中に溶解)3,000μLを添加した。この混合物の50μLを、実施例2のように調製したマイクロタイタープレートのウェルに添加し、その後、HCV核酸を含有すると思われる試料50μLを添加した。プレートを、Mylarで覆い、そして65℃で16時間インキュベートした。次いで、プレートを冷却し、Mylarを除去し、ウェルをアスピレートし、1×洗浄緩衝液(0.1% SDS/0.015M NaCl/0.0015M クエン酸ナトリウム)で洗浄し、そして再度アスピレートした。
【0097】
ハイブリダイゼーション緩衝液中のマルチマーの溶液(25fmol/50μL)を調製し、50μLを各ウェルに添加した。プレートを、Mylarで覆い、30秒間攪拌し、そして55℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートを冷却し、Mylarを除去し、1×洗浄緩衝液で洗浄し、そしてアスピレートした。
【0098】
アッセイを、HCV RNAを5、50、および500チポモル(tipomol)(tm、チポモル=602分子、または10−21モル)のそれぞれを含む標本について、1ウェル当り種々の量の固定化(捕獲)DNAで実施例2のように調製したマイクロタイタープレートを用いて行った。感度は、デルタ値=(平均値−2倍標準偏差)−(ゼロ+2倍標準偏差)として特徴付けた。図4に、これらのアッセイの結果を示す。示されるように、本アッセイにおいて最適な感度は、1ウェル当り0.1〜1.1pmolの固定化DNAで生じる。
【0099】
(実施例5)
HBV DNAのアッセイを、上記の実施例4に記載した形式、および種々のポリペプチドコーティングを使用した以外は、上記の実施例2のようにコートしたマイクロタイタープレートを用いて行った。これらのアッセイでは、ポリ(Phe−Lys)、カゼイン、Boehringer−Mannheim「ブロッキング試薬」(#1096176)Boehringer−Mannheim Catalog)、ポリ(Ala−Glu)およびポリ(Glu−Lys)でコートしたプレートは、アッセイにおいて類似の成果を示した。
【0100】
(実施例6)
改変した手順を、以下に示す:
(予備洗浄)
White Microlite 1 Removawellストリップ(ポリスチレンマイクロタイタープレート、96ウェル/プレート)を、Dynatech Inc.から入手した。各ウェルを250μLの1N HClで満たし、そして室温で15〜20分間インキュベートした。次いで、プレートを250μLの1N NaOHで満たし、そして室温で15〜20分間インキュベートした。次いでプレートを1×PBSで3回洗浄し、そしてウェルをアスピレートして液体を除去した。
【0101】
(ポリ(Phe−Lys)コーティング)
ポリ(Phe−Lys)(上記)を、2M NaCl/1×PBSと混合し、最終濃度を0.1mg/mL(pH6.0)にして、そして得られた溶液の200μLをそれぞれのウェルに添加した。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、そして30℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで3回洗浄し、そしてウェルをアスピレートして液体を除去した。
【0102】
(オリゴヌクレオチドの活性化)
50mM リン酸ナトリウム(pH7.8)中に含まれる、
【0103】
【化8】
ここでXがN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)−5−メチルシチジンである)の250OD260単位に、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(「BS3」、180mg)を添加した。混合物をボルテックスし、そして室温で30分間インキュベートした。10mM リン酸ナトリウム(pH6.5)で平衡化したゲル濾過カラム(Sephadex(登録商標)G−25、Pharmacia)を、活性化オリゴヌクレオチドを精製するのに使用した。活性化オリゴヌクレオチド反応混合物を、カラムに加え、濾過した。溶出物を集め、次の工程に用いるまで保存した。溶出物の濃度を、50mM リン酸ナトリウム(pH7.8)で希釈して、3.7×10−2OD260/mLに調整した。
【0104】
(ポリ(Phe−Lys)でコートしたプレートヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング)
活性化オリゴヌクレオチド含有溶離液(100μL)をそれぞれのウェルに添加し、ウェルを4℃で12〜18時間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで2回洗浄し、そしてウェルをアスピレートし、液体を除去した。
【0105】
(最終ストリッピング)
0.1重量% SDSを含有するNaOH(0.2N、250μL)を、それぞれのウェルに添加した。プレートをプラスチックで包み、そして65℃で60分間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで3回洗浄し、そしてウェルをアスピレートし、液体を除去した。
【0106】
(過カップリング)
0.4mg/mL BS3を含有するリン酸ナトリウム(50mM、100μL、pH7.8)を、各ウェルに添加し、そしてプレートで12〜18時間インキュベートさせた。次いで、プレートを1×PBSで2回、そして水で1回洗浄した。次いで、洗浄し終わったプレートを、4℃で小袋内で貯蔵した。
【0107】
上記の本発明を実施するための態様について、生化学、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、および関連分野における当業者に明らかな改変は、以下の請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【0108】
核酸プローブは、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、特に大きな分枝DNA増幅マルチマーを用いたアッセイで用いるためのマイクロタイタープレートのウェルのようなポリスチレン表面に以下の工程によって固定化される:(a)強酸、強塩基、および水で順次して洗浄することにより、表面を清浄化する工程;(b)清浄化された表面上へ一級アミノ基を有するポリペプチドを受動的に吸着させる工程;および(c)プローブを、塩基安定性の二価性架橋剤を通じて、吸着したポリペプチドに共有結合させる工程;および(d)アッセイで用いられるハイブリダイゼーション条件を模擬した条件に表面をさらす工程。
【0109】
【発明の効果】
第1に、本発明の方法および物品により、初期ハイブリダイゼーションを包含する全体の溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイを、1つのウェル中で行うことができる。第2に、アッセイの再現性が改良される。最後に、大きなコーム型マルチマーを用いるその好ましい実施形態において、バックグラウンドシグナルを減少させる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、実施例3に記載した実験結果のグラフである。
【図2A】図2Aは、実施例4に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図2B】図2Bは、実施例4に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図3A】図2Aは、実施例4に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図3B】図3Bは、実施例4に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図4】図4は、実施例4に記載した試験結果のグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの分野に属する。より詳細には、本発明は、分析される核酸を溶液から取り出す目的のために、ポリスチレン表面上に核酸プローブを固定するための改良方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
同一人に譲渡された米国特許第4,868,105号には、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが開示されている。このアッセイでは、分析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブのセットとハイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセットとハイブリダイズされる。次いで、プローブ−分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに相補的である固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブにハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形態で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。最終的に、標識化プローブのセットの一本鎖セグメントは標識プローブにハイブリダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じたシグナルによって検出され得る。
【0003】
同一人に譲渡された欧州特許出願(EP)第317077号には、米国特許第4,868,105号に記載のアッセイの変形が開示されており、ここでは、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌクレオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結合した核酸(分枝または直鎖状)に特異的にハイブリダイズするセグメント、ならびに、標識プローブに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。マルチマーを用いるアッセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリダイズさせ、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントとハイブリダイズする固定化核酸を含む他の容器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にハイブリダイズされ、さらに、標識プローブはマルチマーの第二のセグメントの反復にハイブリダイズされる。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の部位を提供するので、シグナルが増幅される。
【0004】
1990年7月27日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願米国特許出願第558,897号(PCT WO92/02526)には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチマーよりも強くシグナルを増強する。
【0005】
EP317077に記載のように、2つの型の溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ形式が使用される:それはビーズアッセイ手順、およびマイクロタイタープレートアッセイ手順である。実際には、マイクロタイタープレートアッセイが、好ましい。ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル中の捕獲プローブを固定する手順は、以下に示すとおりであった。ポリ−(フェニルアラニル−リシン)を、プレートのウェル表面上に受動的に吸着させた。固定化されるべきオリゴヌクレオチドを、固相法によって5’改変シチジン(シチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル誘導体)を有するように合成した。このオリゴヌクレオチドを、改変シチジンと二価性架橋剤のエチレングリコールビス−(スクシンイミジルスクシネート)との反応によって活性化し、そして、活性化オリゴヌクレオチドを、ウェルに添加し、室温でインキュベートした。インキュベーションの間、架橋剤の他の官能基は、吸着したポリ−(フェニルアラニル−リシン)の一級アミノ基と反応し、このためオリゴヌクレオチドを固定する。次いで、ウェルをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄(washed)し、HM緩衝液(0.1% SDS、4×SSC、1mg/mL 音波処理サケ精子DNA、1mg/mL ポリ−A、10mg/mL ウシ血清アルブミン)でコートし、PBSで再び洗浄し、そして使用のために保存した。示されるように、捕獲プローブセットおよび増幅プローブセットに対する、分析物の初期ハイブリダイゼーションを、塩基条件下で別のウェル中で行った。ハイブリダイゼーション後、溶液を中和した。そして、中和溶液を固定化プローブを含むウェル中に移した。初期ハイブリダイゼーションは、固定化捕獲プローブを含んだウェル中では行われ得なかった。なぜなら、固定化複合体は、ハイブリダイゼーション条件下で不安定であるからである。
【0006】
本発明は、上記の従来の手順よりも優れるいくつかの利点を提供する。第一に、本発明によれば、初期ハイブリダイゼーションを包含する全体のアッセイが、1っのウェル中で行われ得る。第二に、本発明は、アッセイの再現性を改良する。最後に、大きなコーム型マルチマーを用いるその好ましい実施態様において、バックグラウンドシグナルを減少させる。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の1つの局面は、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、この方法は以下の工程を包含する:
(a)強酸、強塩基および水で順次洗浄することによりポリスチレン表面を清浄化する(cleansing)工程;
(b)ポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程;および
(c)核酸プローブを、塩基安定性の連結を通じて、吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【0008】
本発明の別の局面は、ポリスチレン表面上に吸着したポリマーおよび塩基安定性の連結を通じてポリマーに共有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン表面を包含する、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための製造物品である。
【0009】
本発明のさらに別の局面は、試料中において分析される一本鎖核酸の存在を検出するための溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイの改善であり、ここで、アッセイが、以下の工程:
(a)試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触させる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびDNAマルチマーのセグメントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕獲プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびポリスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに相補的な第二セグメントを有する、工程;
(b)工程(a)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、ポリスチレン表面に固定化した該オリゴヌクレオチドと接触させる工程;
(c)工程(b)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、該マルチマーと接触させる工程;および
(d)工程(c)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、該マルチマーにハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、そして改良点は、工程(b)において、吸着したポリマーを通じてポリスチレン表面に固定化したオリゴヌクレオチドであって、塩基安定性の連結を通じて該吸着したポリマーに共有結合したオリゴヌクレオチドを使用することである。
【0010】
【課題を解決するための手段】
(項目1) 溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、以下の工程を包含する、方法:
(a)強酸、強塩基、および水で順次洗浄することによりこのポリスチレン表面を清浄化する工程;
(b)この清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程;および
(c)この核酸プローブを、この第一官能基およびこの第二官能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、この吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【0011】
(項目2) 上記結合が、二価性架橋剤を通じてつくられる、項目1に記載の方法。
【0012】
(項目3) 上記ポリマーがポリペプチドであり、そして上記第二官能基が一級アミノ基である、項目1に記載の方法。
【0013】
(項目4) (d)少なくとも、上記溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで使用される条件と同程度のストリンジェントな条件に、上記ポリマー−核酸プローブでコートされた表面をさらす工程を包含する、項目1に記載の方法。
【0014】
(項目5) 上記ポリマー−核酸プローブでコートされた表面を、25〜65℃で10〜180分間、低濃度のデタージェントを含有する弱塩基溶液と接触させる、項目2に記載の方法。
【0015】
(項目6) 上記溶液が、0.01〜2重量%ドデシル硫酸ナトリウムを含有する0.1〜0.5N NaOHである、項目3に記載の方法。
【0016】
(項目7) 上記強酸が1〜10N HClであり、そして上記強塩基が1〜10Nアルカリ金属水酸化物である、項目1に記載の方法。
【0017】
(項目8) 最初に上記核酸プローブが、上記架橋剤に、このプローブ上の第一官能基とこの架橋剤の官能基の1つとの間の反応を通じて共有結合して、活性化した核酸プローブを形成し、そして次いで、この活性化核酸プローブが、上記吸着したポリマーに、上記第二官能基の1つとこの架橋剤の他の官能基との間の反応を通じて共有結合する、項目2に記載の方法。
【0018】
(項目9) 上記核酸プローブが、このプローブ上の上記官能基を提供するために、N4−位が改変されているシチジンを有する、項目8に記載の方法。
【0019】
(項目10) 上記ポリマーがポリ(Phe−Lys)であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸ブローブが、
【0020】
【化1】
からなる群より選択され、ここでXがシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体を表す、項目2に記載の方法。
【0021】
(項目11) ポリスチレン表面上に吸着したポリマー、および塩基安定性二価性架橋剤を通じて、このポリマーに共有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン表面を含む、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで使用するための製造物品。
【0022】
(項目12) 上記物品が、マイクロタイタープレートのウェルである、項目11に記載の製造物品。
【0023】
(項目13) 上記物品が、ビーズである、項目11に記載の製造物品。
【0024】
(項目14) 上記表面上に上記プローブが、約0.1〜10ピコモル存在する、項目11に記載の製造物品。
【0025】
(項目15) 上記ウェル表面上に上記プローブが、約0.4〜0.7ピコモル存在する、項目12に記載の製造物品。
【0026】
(項目16) 上記ポリマーがポリ(Phe−Lys)であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸プローブが、
【0027】
【化2】
からなる群より選択され、ここでXがシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体を表す、項目11に記載の製造物品。
【0028】
(項目17) 試料中において分析される一本鎖核酸の存在を検出するための溶液相核酸サンドイッチハイブリダィゼーションアッセイであって、ここでこのアッセイが以下の工程:
(a)この試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触させる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびDHAマルチマーのセグメントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕獲プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびポリスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに相補的な第二セグメントを有する、工程;
(b)工程(a)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、ポリスチレン表面に固定化した、このオリゴヌクレオチドと接触させる工程;
(c)工程(b)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、このマルチマーと接触させる工程;および
(d)工程(c)の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、このマルチマーにハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、
そして改良点は、このオリゴヌクレオチドが、表面に吸着したポリマーを通じてこのポリスチレン表面に固定化され、塩基安定性の連結を通じてこのポリマーに共有結合していることである、アッセイ。
【0029】
(項目18) 上記結合が、二価性架橋剤を通じてつくられる、項目17に記載のアッセイ。
【0030】
(項目19) 上記ポリスチレン表面がマイクロタイタープレートのウェルであり、工程(a)〜(d)がこのウェル内で行われる、項目17に記載のアッセイ。
【0031】
(項目20) 上記表面が、工程(a)を行う前に、オリゴヌクレオチドをその中に固定化してそして洗浄した後、工程(a)のハイブリダイゼーション条件にさらされる、項目17に記載のアッセイ。
【0032】
(項目21) 上記ポリマーがポリ(Phe−Lys)であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸プローブが、
【0033】
【化3】
からなる群より選択され、ここでXがシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体を表す、項目18に記載のアッセイ。
【0034】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる共有結合を特徴付けるのに使用される用語「塩基安定性」とは、4〜70℃の範囲の温度で1N NaOHと接触したとき、または少なくとも溶液相ハイブリダイゼーションアッセイにおける分析物に対するプローブのハイブリダイゼーションにおいて使用される程度にストリンジェントな(例えば、模擬またはよりストリンジェントな)条件下で、実質的な分解(例えば、加水分解による共有結合の切断)が起こらない結合を意味する。
【0035】
用語「二価性架橋剤」は、2つの官能基を有する有機分子を意図しており、ここで、官能基の内の1つは、試薬とポリマーとの間に共有結合を形成するために、本発明中で使用されているポリマーの官能基と反応し得、そして、もう1つの官能基は、試薬とプローブとの間に第二の共有結合を形成するために、固定化される核酸プローブ上の官能基と反応し得る。得られた3成分の複合体は、試薬の2っの官能基とポリマー上の官能基およびプローブ上の官能基との間の反応を通じて、ポリマーおよびプローブの両方に共有結合する架橋剤を含む。好ましくは、ポリマーおよびプローブ上の官能基は、一級アミノ基であり、そして試薬上の官能基は、一級アミノ基と反応する官能基から選択される(例えば、カルボキシル基、塩化スルホニル基、またはアルデヒド基)。
【0036】
用語「溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ」は、同一人に譲渡された米国特許第4,869,105号およびEP317077に記載およびクレームされているアッセイ法を意味する。
【0037】
「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、そして架橋剤の官能基と反応する付加的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味する。
【0038】
「マルチマー」とは、分析される核酸および多数の標識プローブに、同時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマーの分枝は、共有結合によりつくられ、そしてマルチマーは、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズする核酸に対して、および多数の標識プローブに対してハイブリダイズし得る、2つの型のオリゴヌクレオチド単位で構成される。このようなマルチマーの組成物および調製は、EP317077およびWO92/02526に記載されており、これらの開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。
【0039】
(ポリスチレン表面上のプローブの固定)
以下の記載は、従来のポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル表面上にプローブを固定することを述べているが、本発明の方法が、核酸サンドイッチハイブリダイゼーションにおいて用いられる他のポリスチレン表面(例えば、粒子(ビーズ)、チューブ、フィルター、カラムなど)に、プローブを固定するのに用いられ得ることは、認識される。
【0040】
最初に、ポリスチレン表面を、強酸、強塩基、および水性緩衝液で、連続して洗浄することにより清浄化する。酸は通常、0.1〜5Nの濃度での、塩酸、硝酸、または硫酸のような鉱酸である。塩酸(IN)が好ましい。表面を、通常4〜37℃の範囲の温度で1〜60分間(好ましくは約15〜20分間)、酸と接触させる。次いで、酸処理をしたウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水のような中性の水性緩衝液で洗浄する。強塩基は、通常0.1〜5Nの濃度のアルカリ金属水酸化物(例えば、NaOH、KOH)である。水酸化ナトリウム(1N)が好ましい。表面と塩基との間の接触時間は、通常1〜60分間であるが、好ましくは約15〜20分間である。接触温度は、典型的には、再度4〜37℃である。塩基処理に続いて、表面を中性の水性緩衝液で再び洗浄する。
【0041】
表面を、ポリマーでコートする。このポリマーは、好ましくは多数の反応性の一級アミノ基を有するポリペプチドであって、そしてポリスチレン上で受動的に吸着されるポリペプチドである。ポリペプチドは、典型的には、1分子当り平均して約10%〜100%の、一級アミン含有アミノ酸残基を有する。ポリペプチドは、天然産生タンパク質または合成ポリペプチドであり得る。合成ポリペプチドは、ホモポリマー(同じアミノ酸で構成されている)またはコポリマー(2種またはそれ以上のアミノ酸で構成されている)であり得る。天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれかにある、スルフヒドリルまたはカルボキシレートのような、他の反応性官能基が用いられ得る。その分子量は、厳密ではなく、通常5,000〜50,000ダルトンの範囲内である。この資格内で使用され得るポリペプチドの例は、ポリリシン、ポリ(Phe−Lys)、ポリ(Ala−Glu)、カゼイン、およびウシ血清アルブミンである。30,000〜60,000の範囲の分子量を有するポリ(Phe−Lys)(phe:lysが1:1モル比)が、好ましい。清浄化したポリスチレンを、ポリペプチドの中性(pH6〜8)水性緩衝溶液と接触させることにより、コーティングを行う。溶液中のポリペプチド濃度は、通常0.01〜10mg/mlであるが、0.1〜1.5mg/mLが、より通例である。溶液は、必要に応じて約5Mまでの濃度の塩を含有し得る。ポリペプチドコーティング工程は、通常20℃〜65℃で0.5〜36時間、好ましくは25〜35℃で15〜20時間行われる。この処理に続き、表面を、中性の水性緩衝液で繰り返し洗浄し、吸着していないあらゆるポリペプチドを取り除く。必要に応じて、表面を、アッセイの初期ハイブリダイゼーションの工程で用いられる条件を模擬した条件か、またはよりストリンジェントな条件(pH、イオン強度、デタージェント、プロテイナーゼ)にさらして、初期ハイブリダイゼーションの間に脱落し得る吸着したポリペプチドを脱落させ得る。
【0042】
吸着したポリペプチドと共有結合する一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、Warnerら、DNA(1984)3:401に記載の自動化ホスホルアミデート法によって調製され得、そしてSanchez−PescadorおよびUrdea,DNA(1984)3:339に従って精製され得る。それらは、5’改変ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを包含する。そしてこれらは、反応部位を提供する官能基を含有しており、この反応部位により架橋剤にオリゴヌクレオチドをカップリングさせる。好ましい改変ヌクレオチドは、5−メチル−シチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体であり、それは米国特許第4,868,105号に記載されている。他の改変ヌクレオチドは、米国特許第4,948,882号に記載されている。オリゴヌクレオチドプローブの長さおよび塩基組成は、それがハイブリダイズすべき核酸配列の長さおよび塩基組成に依存する。その長さは通常15〜100ヌクレオチド、より通例では20〜30ヌクレオチドである。21塩基のオリゴヌクレオチド5’−XCACCACTTTCTCCAAAGAAG−3’(EP317077に記載)、および5’−XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG−3’(ここでXはシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体を表す)が、標準プローブ配列として選択された。
【0043】
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5’改変ヌクレオチドの官能基と架橋剤の官能基の1つとの間の反応を経て、塩基安定性の二価性架橋剤とカップリングする。オリゴヌクレオチドが架橋剤の両方の官能基とカップリングするのを避けるために、試薬は非常に過剰で使用される(例えば、50倍〜1000倍過剰)。塩基安定性、および、オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドのアミノ基との反応性の機能的基準が満たされる限り、種々の架橋剤が使用され得る。適切な架橋剤の例は、Pierce Chemical Catalog中に見られ得る。カップリング反応の条件は、使用した特定の試薬により変更する。現在において、好ましい架橋剤は、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートである。架橋剤は、通常極性溶媒または水性緩衝液に溶解され、そしてこの溶液は、水性緩衝液および極性溶媒中のオリゴヌクレオチド溶液に添加される。カップリングは、通常は中性(6−8)pH、および4℃〜25℃の範囲の温度で約10分間〜18時間行われる。得られたオリゴヌクレオチド−架橋剤複合体(本明細書中では、時に「活性化オリゴヌクレオチド」と呼ばれる)は、従来のクロマトグラフィー手順を用いて、未反応の開始物質および不要の反応生成物から精製され得る。
【0044】
次いで、架橋剤の残存官能基が、吸着したポリペプチドのアミノ基と反応し得る条件下で、ポリペプチドでコートした表面を、精製した活性化オリゴヌクレオチドの中性水性緩衝化溶液と接触させる。典型的に、このカップリング反応は、0℃〜25℃で0.5〜18時間、好ましくは2℃〜8℃で8〜18時間、過剰な活性化オリゴヌクレオチド(10倍〜100倍過剰が好ましい)を用いて行われる。この反応が完了した後、表面を水性緩衝液で洗浄し、表面から未反応の活性化オリゴヌクレオチドを除去する。本方法のこの段階で、表面は、核酸プローブが架橋剤を通じて共有結合した吸着したポリペプチドでコートされる。標準的なマイクロタイターウェルの場合、1ウェル当りの固定化核酸プローブは、典型的に0.1〜10pmol、好ましくは0.4〜0.7pmolである。この時点で、必要に応じて、表面に二価性架橋剤をさらに添加し、プレート表面上に残存するあらゆる反応基と反応させることによって、プレートを「過カップリング(overcouple)」し得る。
【0045】
表面が増幅アッセイ手順で使用されるとき、特に、WO92/02526の大きなコーム型マルチマーを使用するアッセイでは、アッセイの溶液相ハイブリダイゼーション工程における主要な条件(pH、イオン強度、温度、デタージェント)を模擬した条件に表面を置くのが好ましい。このような処理は、溶液相ハイブリダイゼーション中で脱落し得る、あらゆるポリペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を脱落させるのに役立つ。従って、このような場合では、表面を、低濃度のデタージェント(例えば、0.01〜2.0重量% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む0.1〜0.5N NaOH)を含有する弱塩基溶液と25〜85℃で10〜180分間接触させる。この最終処理の後、表面をアスピレートする。次いで、表面を水性緩衝液で洗浄する。それは、使用するまで、湿度を制御した環境で0℃〜10℃で貯蔵され得る。
【0046】
(溶液相ハイブリダイゼーションアッセイでのコートしたポリスチレン表面の使用)
コートしたポリスチレン表面は、以下の溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションで用いられる。コートした表面が、マイクロタイタープレートのウェルの内側の表面である場合、分析される核酸を、過剰量の以下に示す2つの一本鎖核酸プローブセットを入れたウェル中に入れる:(1)捕獲プローブのセット、それぞれ、分析物に相補的な第一結合配列、および、ウェル表面に結合した核酸に相補的な第二結合配列を有する、および(2)増幅プローブ(分枝または直鎖状)のセット、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有する。増幅プローブを用いることにより、マルチマーは「万能」試薬にするべく設計され得、そして各分析物に対して異なるマルチマーをつくる必要はない。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物にハイブリダイズした2つのプローブからなる3成分の核酸複合体である。プローブの第二結合配列は、分析物と相補的ではないので、一本鎖セグメントのままで残っている。この複合体は、ウェル表面上の固定化プローブに、第二結合配列によってハイブリダイズする。得られた生成物は、ウェル表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形成された二重鎖によって、ウェル表面に結合した複合体を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面から除去する。
【0047】
次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーション条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列にハイブリダイズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーからも分離する。次いで、標識オリゴヌクレオチドを、マルチマーの相補的なオリゴヌクレオチド単位にハイブリダイズさせるような条件下で加える。次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取る。
【0048】
分析される核酸は、種々の供給源(例えば、生物学的液体または固体、食料品、環境物質など)由来であり得、種々の手段(例えば、プロテイナーゼK/SDS、カオトロピック塩など)によりハイブリダイゼーション分析のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または化学的手段(例えば、制限酵素、音波処理、化学分解(例えば、金属イオン)など)によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フラグメントは、0.1Kb程に小さくあり得、通常少なくとも約0.5Kbであり、そして1Kbまたはそれ以上であり得る。分析される配列は、分析のため一本鎖形態で提供される。配列が天然に一本鎖形態で存在する場合、変性は必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、配列を変性する。変性は種々の技法(例えば、アルカリ、一般的には約0.05〜0.2Mの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、またはそれらの組合せ)により行われ得る。
【0049】
分析される配列に相補的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも15ヌクレオチド、通常少なくとも25ヌクレオチド、そして約5Kb以下、通常約1Kb以下、好ましくは約100ヌクレオチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約30ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。第一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コンセンサス配列、多型性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連し得る。
【0050】
増幅プローブおよび捕獲プローブの第一結合配列を適切に選択することによって、それらは、特定の遺伝子を含む特異的な核酸分子、または異なる複数の核酸分子の一部として存在する、他の配列を同定するのに使用され得る。目的とする核酸分子を、同じ特定の配列を含む他の分子から識別するためには、プローブの1つを、特定の配列に相補的に形成し、一方、他のプローブを、その分子に特有である(すなわち、特定の配列を含む他の分子には存在しない)その分子のもうひとつの配列に相補的に形成する。
【0051】
捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、ポリスチレン表面に分枝した(branch)オリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、相補的であるように、そして試料/分析物の内在性配列に遭遇することのないように選択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。
【0052】
捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングにより調製され得るが、前者が好ましい。
【0053】
結合配列は、完全に相補的であって、ホモ二本鎖を提供する必要はない。多くの場合では、5個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約10%未満の塩基がミスマッチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中で用いられる用語「相補的」とは、安定した二重構造を提供するのに十分な相補性の程度を意味する。
【0054】
標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に相補的な配列を含む。標識オリゴヌクレオチドは、1つまたはそれ以上の分子(「標識」)を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供する。標識は、相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端メンバーまたは末端テイルとして存在し得る。配列に結合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告されている。例えば、Learyら、Proc Natl Acad Sci USA(1983)80:4045;RenzおよびKurz、Nuc Acids Res(1984)12:3435;RichardsonおよびGumport、Nuc Acids Res(1983)11:6167;Smithら、Nuc Acids Res(1985)13:2399;MeinkothおよびWahl、Ana Biochem.(1984)138:267を参照のこと。標識は、相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが包含される。例示の特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド(Texas red)、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、NADPH、α−β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが包含される。
【0055】
分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少なくとも約1.5:1であり、より好ましくは少なくとも2:1である。通例、2:1から10,000:1の範囲内である。各プローブの濃度は、一般的に約10−10〜10−6Mの範囲であり、試料の核酸濃度は、10−21〜10−12Mまでの種々の範囲をとる。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般的に約10分から2時間までを要し、多くは約1時間で完了する。ハイブリダイゼーションは、やや高めの温度で、一般的には約20℃から80℃の範囲で、より通常には約35℃から70℃までで、特に65℃で行われ得る。
【0056】
ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加剤を合有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデタージェント(0.1〜1%)、塩類(例えば、クエン酸ナトリウム(0.017〜0.17M))、フィコール、ポリビニルピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含される。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドである。これらの他の溶媒は、2〜50%の範囲内の量で存在する。
【0057】
ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ストリンジェンシーを変化させる。
【0058】
標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存して、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に対しては、ルミノメーターまたはフィルムが有用である。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミノメーター、分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、本アッセイに用いられ得る。
【0059】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。
【0060】
【実施例】
(実施例1)
White Microlite 1 Removawellストリップ(ポリスチレンマイクロタイタープレート、96ウェル/プレート)を、Dynatech Inc.から購入した。
【0061】
(予備洗浄)
各ウェルに200μLの6N HClを満たし、室温で15〜20分間インキュベートした。次いで、このプレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いでウェルに200μLの6N NaOHを満たし、室温で15〜20分間インキュベートした。プレートを再び1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【0062】
(ポリ(Phe−Lys)コーティング)
ポリ(Phe−Lys)をSigma Chemicals,Inc.から購入した。このポリペプチドは、phe:lysを1:1のモル比で有しており、平均分子量は47,900gm/molである。平均長さは309アミノ酸であり、155アミン/molを含む。ポリペプチドの1mg/ml溶液30mLを、2M NaCl/0.5×PBSと混合し、最終濃度0.1mg/mL(pH6.0)にした。各ウェルに、この溶液を100μLずつ加えた。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、30℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【0063】
(最初のストリッピング)
0.5重量% SDSを含有する200μLの0.2N NaOHをポリペプチドでコートしたウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、65℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【0064】
(オリゴヌクレオチドの活性化)
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)の50mgアリコートを、それぞれ500μLのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。
【0065】
1×PBS中の上記21−merオリゴヌクレオチド(XT1*と呼ぶ)の26 OD260単位を、DSS−DMFの各アリコートに添加した。混合物をボルテックスにかけ、室温で30分間インキュベートした。2本のNAP25カラム(26 OD260当り1,50μLアリコート)を、1×PBSで平衡化し、DSS−DMF−オリゴヌクレオチド混合物を1×PBS 2mLで希釈し、そして希釈混合物をカラム上に即座に載せた。カラムから流出させ、そして溶離剤を廃棄した。活性化オリゴヌクレオチドを、各カラムから1×PBS 3.5mLで溶出し、全部のカラムを集めて1×PBS 100mLに入れた。
【0066】
(ポリ(Phe−Lys)でコートしたプレートヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング)
各ウェルに、活性化オリゴヌクレオチド含有溶離剤を50μLずつ加え、ウェルを室温で120分間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。
【0067】
(最終ストリッピング)
0.5重量% SDSを含有する200μLの0.2N NaOHを各ウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、65℃で60分間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで4回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。ストリッピングしたプレートを、2〜8℃で乾燥剤ビーズと共に貯蔵した。
【0068】
(実施例2)
(予備洗浄)
Microlite 1 Removawellポリスチレンマイクロタイタープレートを、1N HClおよび1N NaOHを使用した以外は、実施例1のように予備洗浄した。
【0069】
(ポリペプチドコーティング)
ウェルを実施例1のようにコートした。最初のストリッピング工程を省いた。
【0070】
(オリゴヌクレオチドの活性化)
XT1*オリゴヌクレオチドを、以下のことを除いて、実施例1のように活性化した:XT1*に対するDSSのモル比を、1000:1の代わりに400:1にした;活性化中に用いた緩衝液およびpHは、pH7.8でのリン酸ナトリウムであった;活性化を停止させるために使用した緩衝液およびpHは、pH6.5のリン酸ナトリウムであった;そして、活性化オリゴヌクレオチドを精製するのに用いた温度および緩衝液は、pH6.5のリン酸ナトリウム、4℃であった。
【0071】
(コートしたウェルヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング)
カップリングを、緩衝液をリン酸ナトリウム(pH7.8)とし、そしてインキュベーションを一晩行った以外は、実施例1のように行った。
【0072】
(ストリッピング)
ウェルを、0.2N NaOH/0.5重量% SDSで、実施例1のようにストリッピングした。
【0073】
(実施例3)
実施例1および2の固定化手順を、カップリング工程で使用した活性化オリゴヌクレオチドの量をいろいろと変えて用いて繰り返した。ウェル表面に結合したオリゴヌクレオチドの量を、これらの各実験において測定した。図1は、これらの実験結果を示すグラフである。示したように、実施例2の手順により、ウェルに添加した所定の量の活性化オリゴヌクレオチドで、約10倍以上のオリゴヌクレオチドが表面に結合した。
【0074】
(実施例4)
本実施例は、HCV RNAアッセイにおける本発明の使用を例示し、そして、プレート上に固定化されたプローブの量に対するアッセイ感度に関する。
【0075】
(アッセイで使用するマルチマーの合成)
「15×3」増幅溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを、この実施例で用いた。「15×3」の呼称は、形式が、増幅プローブにハイブリダイズする第一セグメント、および、3つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第二セグメントの15個の反復を有するコーム型マルチマーを用いることに由来する。
【0076】
15個の分枝部位、および、3つのオリゴヌクレオチド結合部位を有する側鎖伸長を有する15×3コーム型分枝オリゴヌクレオチドを、以下のように合成した。
【0077】
オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動DNA合成機(Applied Biosystems,Inc.,(ABI)モデル380B)で行った。βシアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用いた。これには、PhostelTM試薬(ABN)を用いる5’リン酸化が包含される。示したこと以外は、標準的なABIプロトコルを用いた。複数のサイクルを用いた(例えば、1.2サイクル)と示されている場合、ABIにより推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられた。Applied BiosystemsModel 380B DNA合成機で行われる、サイクル1.2および6.4を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。
【0078】
以下の構造のコーム体を最初に調製した:
【0079】
【化4】
ここで、X’は分枝モノマーであり、そしてRは過ヨウ素酸切断可能リンカーである。
【0080】
15個の(TTX’)繰り返しによるコーム体の部分を、33.8mgのアミノプロピル誘導体化チミジンの調整孔ガラス(CPG)(2000Å、支持体1グラム当り7.4マイクロモルチミジン)を用いて、1.2サイクルプロトコルで、最初に合成する。分枝部位ヌクレオチドは、下式であった:
【0081】
【化5】
ここでR2は
【0082】
【化6】
を表す。
【0083】
コーム体(側鎖を含まない)の合成に関して、βシアノエチルホスホルアミダイトモノマーの濃度は、A、C、G、およびTが0.1M、分枝部位モノマーEが0.15M、およびPhostelTM試薬が0.2Mであった。脱トリチル化は、脱保護期間中に階段フロースルー(stepped flowthrouh)を用いて、塩化メチレン中の3%トリクロロ酢酸で行った。最終的に、5’DMTをアセチル基で置換した。
【0084】
切断可能リンカーRおよび式3’−RGTCAGTpの6塩基の側鎖伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位で合成した。塩基保護基(上式のR2)の除去は、コーム体の合成に用いたのと同じカラム中にCPG支持体を保持している間に、手動的に行った。R2がレブリニルである場合、0.5Mヒドラジン水和物のピリジン/氷酢酸(1:1 v/v)溶液を加え、15分ごとに液体を取り替えながら90分間CPG支持体と接触させておき、続いてピリジン/氷酢酸(1:1 v/v)で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄した。脱保護を行った後、切断可能リンカーRおよび6塩基側鎖伸長を、6.4サイクルを用いて加えた。
【0085】
これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度は、0.1Mであった(0.2MのRおよびPhostelTM試薬を除く;Rは、2−(4−(4−(2−ジメトキシトリチルオキシ)エチル)−フェノキシ2,3−ジ(ベンゾイルオキシ)−ブタンオキシ)フェニル)エチル−2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイトであった)。
【0086】
脱トリチル化は、3%トリクロロ酢酸の塩化メチレン溶液で連続フロースルーを用いて行い、次いでトルエン/クロロメタン(1:1 v/v)の溶液でリンスする。分枝ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクル「CE NH3」を用いて380Bで自動的に除去した。水酸化アンモニウム溶液を4mLのスクリューキャップWheatonバイアルに集め、60℃で12時間加熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒をSpeed−Vacエバポレーターで除去し、残渣を100μLの水に溶解した。以下の構造の3’バックボーン伸長(セグメントA)、側鎖伸長、および連結反応テンプレート/リンカーもまた、自動合成機を用いて作成した。
【0087】
【化7】
粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法(7%、7M尿素および1×TBEランニング緩衝液を含む)により精製した。
【0088】
3’バックボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した。コーム体(4pmol/μL)、3’バックボーン伸長(6.25pmol/μL)、側鎖伸長(93.75pmol/μL)、側鎖連結テンプレート(93.75pmol/μL)、およびバックボーン連結テンプレート(5pmol/μL)を、1mM ATP/5mM DTT/50mM トリスHCl、pH8.0/10mM MgCl2/2mM スペルミジン中で、0.5単位/μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼと合わせた。この混合物を37℃で2時間インキュベートし、次いで水浴中で95℃に加熱し、次いで1時間かけて35℃未満までゆっくりと冷却した。2mM ATP、10mM DTT、14%ポリエチレングリコール、および0.21単位/μL T4リガーゼを加え、そして混合物を23℃で16〜24時間インキュベートした。DNAをNaCl/エタノール中で沈澱させ、水中に再懸濁し、そして以下のような2回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、1mM ATP、5mM DTT、14%ポリエチレングリコール、50mM トリスHCl、pH7.5、10mM MgCl2、2mM スペルミジン、0.5単位/μL T4ポリヌクレオチドキナーゼ、および0.21単位/μL T4リガーゼを加え、そして混合物を23℃で16〜24時間インキュベートした。次いで、連結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
【0089】
(使用した標識プローブおよび捕獲プローブ)
本アッセイで使用した、増幅(標識)プローブHCV−特異的セグメントおよび捕獲プローブHCV−特異的セグメントは、以下の通りである:
ウイルス単離物第I群の、HCV E1遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なプローブ(図2Aを参照):
【0090】
【表1】
ウイルス単離物第II群の、HCV E1遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なプローブ(図2Bを参照):
【0091】
【表2】
C遺伝子および5’−末翻訳領域のヌクレオチド配列に相補的なプローブ(図3参照):
【0092】
【表3】
上のセットでは、それぞれの捕獲プローブは、HCV配列に相補的な配列に加えて、XT1*に相補的な下流配列を含む。
【0093】
(アッセイ形式)
以下の範囲の抽出用緩衝液を調製した。
【0094】
【表4】
トリス、EDTA、SDS、音波処理サケ精子DNAおよびSSCを、25mLの脱イオン水に添加し、そして脱イオン水で体積を93mLに調整した。溶液を穏やかに混合し、そしてpHを7.5に調整した。プロテイナーゼKを溶液に添加し、そして溶解するまで混合する。溶液を水浴中で、37℃で3時間インキュベートした。溶液を室温まで冷却し、そしてホルムアミドを添加した。
【0095】
含有物と、溶液を形成する残りのものとを混合することにより、以下に示す処方のハイブリダイゼーション緩衝液を調製した。
【0096】
【表5】
捕獲プローブおよび標識プローブの各25μLを、PK緩衝液(プロテイナーゼK12mgを、抽出緩衝液6mL中に溶解)3,000μLを添加した。この混合物の50μLを、実施例2のように調製したマイクロタイタープレートのウェルに添加し、その後、HCV核酸を含有すると思われる試料50μLを添加した。プレートを、Mylarで覆い、そして65℃で16時間インキュベートした。次いで、プレートを冷却し、Mylarを除去し、ウェルをアスピレートし、1×洗浄緩衝液(0.1% SDS/0.015M NaCl/0.0015M クエン酸ナトリウム)で洗浄し、そして再度アスピレートした。
【0097】
ハイブリダイゼーション緩衝液中のマルチマーの溶液(25fmol/50μL)を調製し、50μLを各ウェルに添加した。プレートを、Mylarで覆い、30秒間攪拌し、そして55℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートを冷却し、Mylarを除去し、1×洗浄緩衝液で洗浄し、そしてアスピレートした。
【0098】
アッセイを、HCV RNAを5、50、および500チポモル(tipomol)(tm、チポモル=602分子、または10−21モル)のそれぞれを含む標本について、1ウェル当り種々の量の固定化(捕獲)DNAで実施例2のように調製したマイクロタイタープレートを用いて行った。感度は、デルタ値=(平均値−2倍標準偏差)−(ゼロ+2倍標準偏差)として特徴付けた。図4に、これらのアッセイの結果を示す。示されるように、本アッセイにおいて最適な感度は、1ウェル当り0.1〜1.1pmolの固定化DNAで生じる。
【0099】
(実施例5)
HBV DNAのアッセイを、上記の実施例4に記載した形式、および種々のポリペプチドコーティングを使用した以外は、上記の実施例2のようにコートしたマイクロタイタープレートを用いて行った。これらのアッセイでは、ポリ(Phe−Lys)、カゼイン、Boehringer−Mannheim「ブロッキング試薬」(#1096176)Boehringer−Mannheim Catalog)、ポリ(Ala−Glu)およびポリ(Glu−Lys)でコートしたプレートは、アッセイにおいて類似の成果を示した。
【0100】
(実施例6)
改変した手順を、以下に示す:
(予備洗浄)
White Microlite 1 Removawellストリップ(ポリスチレンマイクロタイタープレート、96ウェル/プレート)を、Dynatech Inc.から入手した。各ウェルを250μLの1N HClで満たし、そして室温で15〜20分間インキュベートした。次いで、プレートを250μLの1N NaOHで満たし、そして室温で15〜20分間インキュベートした。次いでプレートを1×PBSで3回洗浄し、そしてウェルをアスピレートして液体を除去した。
【0101】
(ポリ(Phe−Lys)コーティング)
ポリ(Phe−Lys)(上記)を、2M NaCl/1×PBSと混合し、最終濃度を0.1mg/mL(pH6.0)にして、そして得られた溶液の200μLをそれぞれのウェルに添加した。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、そして30℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで3回洗浄し、そしてウェルをアスピレートして液体を除去した。
【0102】
(オリゴヌクレオチドの活性化)
50mM リン酸ナトリウム(pH7.8)中に含まれる、
【0103】
【化8】
ここでXがN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)−5−メチルシチジンである)の250OD260単位に、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(「BS3」、180mg)を添加した。混合物をボルテックスし、そして室温で30分間インキュベートした。10mM リン酸ナトリウム(pH6.5)で平衡化したゲル濾過カラム(Sephadex(登録商標)G−25、Pharmacia)を、活性化オリゴヌクレオチドを精製するのに使用した。活性化オリゴヌクレオチド反応混合物を、カラムに加え、濾過した。溶出物を集め、次の工程に用いるまで保存した。溶出物の濃度を、50mM リン酸ナトリウム(pH7.8)で希釈して、3.7×10−2OD260/mLに調整した。
【0104】
(ポリ(Phe−Lys)でコートしたプレートヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング)
活性化オリゴヌクレオチド含有溶離液(100μL)をそれぞれのウェルに添加し、ウェルを4℃で12〜18時間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで2回洗浄し、そしてウェルをアスピレートし、液体を除去した。
【0105】
(最終ストリッピング)
0.1重量% SDSを含有するNaOH(0.2N、250μL)を、それぞれのウェルに添加した。プレートをプラスチックで包み、そして65℃で60分間インキュベートした。次いで、プレートを1×PBSで3回洗浄し、そしてウェルをアスピレートし、液体を除去した。
【0106】
(過カップリング)
0.4mg/mL BS3を含有するリン酸ナトリウム(50mM、100μL、pH7.8)を、各ウェルに添加し、そしてプレートで12〜18時間インキュベートさせた。次いで、プレートを1×PBSで2回、そして水で1回洗浄した。次いで、洗浄し終わったプレートを、4℃で小袋内で貯蔵した。
【0107】
上記の本発明を実施するための態様について、生化学、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、および関連分野における当業者に明らかな改変は、以下の請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【0108】
核酸プローブは、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、特に大きな分枝DNA増幅マルチマーを用いたアッセイで用いるためのマイクロタイタープレートのウェルのようなポリスチレン表面に以下の工程によって固定化される:(a)強酸、強塩基、および水で順次して洗浄することにより、表面を清浄化する工程;(b)清浄化された表面上へ一級アミノ基を有するポリペプチドを受動的に吸着させる工程;および(c)プローブを、塩基安定性の二価性架橋剤を通じて、吸着したポリペプチドに共有結合させる工程;および(d)アッセイで用いられるハイブリダイゼーション条件を模擬した条件に表面をさらす工程。
【0109】
【発明の効果】
第1に、本発明の方法および物品により、初期ハイブリダイゼーションを包含する全体の溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイを、1つのウェル中で行うことができる。第2に、アッセイの再現性が改良される。最後に、大きなコーム型マルチマーを用いるその好ましい実施形態において、バックグラウンドシグナルを減少させる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、実施例3に記載した実験結果のグラフである。
【図2A】図2Aは、実施例4に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図2B】図2Bは、実施例4に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図3A】図2Aは、実施例4に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図3B】図3Bは、実施例4に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図4】図4は、実施例4に記載した試験結果のグラフである。
Claims (1)
- 溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、以下の工程を包含する、方法:
(a)強酸、強塩基、および水で順次洗浄することにより該ポリスチレン表面を清浄化する工程;
(b)該清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程;および
(c)該核酸プローブを、該第一官能基および該第二官能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、該吸着したポリマーに共有結合させる工程。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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