JPH08242896A - 核酸配列の検出方法 - Google Patents

核酸配列の検出方法

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JPH08242896A JP8043440A JP4344096A JPH08242896A JP H08242896 A JPH08242896 A JP H08242896A JP 8043440 A JP8043440 A JP 8043440A JP 4344096 A JP4344096 A JP 4344096A JP H08242896 A JPH08242896 A JP H08242896A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ハイブリダイゼーション反応を進行させるた
め極めて高いプローブ濃度を使用し得、対応するバック
グラウンドノイズレベルを増加させない核酸配列の検出
方法を提供する。 【解決手段】 特定の構造を含む組成物をサンプル中の
標的核酸配列とハイブリダイズし、組成物中の開裂可能
結合を開裂してマーカーの存在を検出することからな
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 現行のDNA プローブ方法では基本的に、標的DNA をニト
ロセルロースフィルターと直接接触させるか又はアガロ
ースゲルからSouthernトランスファー技術を介すること
によって標的DNA をニトロセルロースフィルターに結合
させる。次にDNA を変性し、フィルターをベーキングし
て強固な結合を確保する。一般にDNA の調製とゲルの泳
動とは時間及び費用のかかるプロセスでありしかもかな
り高度な技術レベルを要する。
【０００２】次のステップで、プローブDNA を調製す
る。プローブDNA の調製には、ニックトランスレーショ
ン、ポリヌクレオチドキナーゼによりDNA を放射性標識
するか又は32P 標識ヌクレオチドを使用するその他のポ
リメラーゼタイプのコピー反応を用いる。調製したプロ
ーブDNA は、結合した標的DNA とハイブリダイズし得
る。ハイブリダイゼーションは適当な温度で典型的には
数時間行なわれる。DNA プローブは、相補的塩基配列を
もつ結合標的DNA のいずれかとハイブリッド二重体を形
成するように結合する。次に、未結合プローブを含む外
来材料をフィルターから洗浄除去し、フィルターを放射
性ラベルに感受性のフィルムに露光する。
【０００３】国際特許出願第WO84/03520(Malcolm等)
は、核酸プローブと酵素含有マーカーとのタンデムハイ
ブリダイゼーションを使用する核酸配列の検出方法を開
示している。該方法では、ハイブリダイズ条件下で相補
的標的配列を含むサンプルとプローブとを接触させる。
標的配列とのハイブリダイゼーション以前又は以後に、
プローブの配列と相補的な配列をもつ酵素標識マーカー
ポリヌクレオチドとプローブとをハイブリダイゼーショ
ンによって結合する。
【０００４】米国特許第4358535 号(Falkow 等) は、該
当する標的核酸配列に相補的な放射性標識ヌクレオチド
プローブを開示しまた、標的核酸配列が由来する病原体
の存在をこれらプローブの使用によって検出する方法を
開示している。該方法では先ず、標的核酸配列をプロー
ブとのハイブリダイゼーション以前に不活性支持体上に
固定する。次に、ハイブリダイズ条件下で固定核酸を放
射性標識プローブと接触させ、固体支持体上でハイブリ
ダイゼーションを生起する。次に、不活性支持体上でラ
ベルの存在を検出することによって標的核酸配列の存在
を検出する。かかる系の欠点はプローブ自体を固定でき
ないことである。標的核酸配列でなくFalkow等のプロー
ブが固定されると、固定されたプローブのラベル分子は
プローブが標的核酸配列にハイブリダイズしたか否かに
かわりなく固体支持体に結合するであろう。その結果、
標的核酸の存在を検出することができない。
【０００５】欧州特許出願第0117440 号は、非放射性の
化学的標識ポリヌクレオチドプローブと該プローブを使
用する方法とを開示している。該方法で、標的核酸配列
がハイブリダイゼーション以前に固体支持体に固定され
ることはFalkow等の方法と同様である。
【０００６】最近、蛍光タッグまたは変色酵素系の如き
別の検出系が開発された。しかし乍らかかる系は、感度
及びバックグラウンド（ノイズ）レベルにかなりの問題
がある。
【０００７】米国特許第4362867 号(Paddock) は、二重
鎖螺旋構造を形成すべくハイブリダイズされる2 つの相
補的デオキシヌクレオチド配列を含むハイブリッド核酸
構造を開示している。2 つのデオキシヌクレオチドの間
に1 つのリボヌクレオチド配列が共有結合している。こ
の構造が、単一ユニットを形成しており、該ユニット内
でヌクレオチド配列の反復は全く存在しない。
【０００８】本発明は、被検（標的）DNA 溶液中の特異
的DNA 又はRNA 配列の検出方法を提供する。該方法は、
相補的標的DNA 配列に結合しない検出可能なリポーター
分子を完全に除去しこれにより検出系のシグナル対ノイ
ズ比を向上せしむべく、少なくとも1 つの点でプローブ
の核酸配列を特異的に開裂する手段を提供する。かかる
系ではハイブリダイゼーション反応を進行させるために
極めて高いプローブ濃度を使用し得、対応するバックグ
ラウンドノイズレベルに増加は生じない。
【０００９】発明の概要 本発明は、構造
【００１０】
【化７】
【００１１】〔式中、NA1 及びNA2 は非相補的核酸配
列、---S--- は開裂可能結合、n は 1〜1,000 の整数〕
をもつ天然産生でない合成分子に係る。
【００１２】本発明によれば、構造
【００１３】
【化８】
【００１４】〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列、---S--
- は開裂可能結合、n は 2〜1,000 の整数〕をもつ天然
産生でない合成分子が提供される。
【００１５】また、構造
【００１６】
【化９】
【００１７】〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列、---S--
- は開裂可能結合、n は 1〜1,000 の整数、実線は化学
結合、X は固体支持体、L はNA1 を固体支持体に結合す
る化学物質及びM はマーカー〕をもつ分子が提供され
る。
【００１８】また、構造
【００１９】
【化１０】
【００２０】〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列、---S--
- は開裂可能結合、n は 1〜1,000 の整数、Y は存在し
ないか又は特有の同定特性を与える化学物質、Z は存在
しないか又は異なる特有の同定特性を与える化学物質を
示す〕をもつ分子が提供される。
【００２１】サンプル中の対象核酸配列の存在を検出す
る方法は、(a) 対象核酸配列に実質的に相補的であり検
出可能マーカーと結合している核酸配列を含む本発明の
非固定分子とサンプルとをハイブリダイズ条件下で接触
させ、(b) 得られた分子を固体支持体上に固定し、(c)
開裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、(d) 固定
分子を分離回収し、(e) 固定分子におけるマーカーの存
在を検出し、これにより対象核酸配列の存在を検出する
ことを含む。
【００２２】サンプル中の対象核酸配列の存在を検出す
る別の方法は、(a) 対象核酸配列に実質的に相補的であ
り検出可能マーカーと結合している核酸配列を含む本発
明の固定分子とサンプルとをハイブリダイズ条件下で接
触させ、(b) 開裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理
し、(c) 固定分子を分離回収し、(d) 固定分子における
マーカーの存在を検出し、これにより対象核酸配列の存
在を検出することを含む。
【００２３】発明の詳細な説明 本発明は、構造
【００２４】
【化１１】
【００２５】〔式中、NA1 及びNA2 は非相補的核酸配
列、---S--- は開裂可能結合、n は 1〜1,000 の整数〕
をもつ天然産生でない合成分子に係る。
【００２６】本発明によれば、構造
【００２７】
【化１２】
【００２８】〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列、---S--
- は開裂可能結合、n は 2〜1,000 の整数〕をもつ天然
産生でない合成分子が提供される。
【００２９】本発明の分子中、開裂可能結合の点線は化
学結合を示し、該化学結合は共有結合又は水素結合のい
ずれでもよい。
【００３０】本発明の分子中のNA1 及びNA2 はDNA 配列
でもよく、この配列は同じでもよく異なっていてもよ
い。又は、分子がRNA 配列から構築されてもよく、この
RNA 配列も同じ配列又は異なる配列のいずれでもよい。
又は、NA1 及びNA2 が、RNA 配列とDNA 配列との組み合
わせでもよい。使用されるDNA 配列又はRNA 配列は、天
然産生配列でもよく又は合成によって形成されてもよ
い。NA1 及びNA2 の各々は約 8〜10,000塩基の長さでよ
い。8 塩基より短いとハイブリダイゼーションが有効に
生じない。約5,000 塩基の長さの配列が好ましい。
【００３１】本発明の分子は、核酸配列NA1 又はNA2 の
1 つ以上に検出可能マーカーを結合してもよい。このマ
ーカーは検出可能な任意の分子又は試薬でよい。かかる
検出可能分子の例は、放射性同位体、放射性ラベル分
子、蛍光分子、蛍光抗体、酵素又は化学発光触媒であ
る。別の適当なマーカーは酵素、蛍光分子又はその他の
検出可能分子でタッグされた特異的タンパク質に結合し
得る配位子である。適当な配位子の例は、アビジン又は
ストレプトアビジンに結合するビオチンである。別の適
当な配位子はカタラーゼのアポ酵素部分に結合するヘミ
ン分子である。
【００３２】本発明は更に、固体支持体と該支持体上に
固定された本発明の分子とを含む組成物に係る。固定分
子は検出可能マーカーに結合されていてもよい。
【００３３】本発明の分子は、分子自体の核酸配列又は
標的核酸配列の開裂又は分裂を全く生起しないで開裂又
は分裂し得る開裂可能結合をもつ。本文中の開裂可能結
合なる用語は、2 つの核酸配列を接合し得、それが結合
している核酸配列に開裂を生じることなく選択的に開裂
し得る結合性化学構造を意味する。開裂可能結合は単結
合でもよく又は多数ユニット配列でもよい。かかる化学
構造の一例は、RNA 配列である。開裂可能結合として適
当な別の化学構造は、DNA 配列、アミノ酸配列、非塩基
性ヌクレオチド配列又は非塩基性ヌクレオチド又は任意
の炭水化物ポリマー、例えばセルロース又は澱粉であ
る。開裂可能結合が核酸配列のとき、該配列はNA1 及び
NA2 の核酸配列と同じではない。
【００３４】n が1 より大きい本発明の分子においては
ユニットNA1 ---S--- NA2 が反復する。各反復内のユニ
ットは同じでもよく又はランダムもしくは所定パターン
の変異が存在してもよい。ユニットの変異は、各反復内
でNA1 もしくはNA2 又は双方が異なっているような変異
でもよい。NA1 又はNA2 の変異は、これらが1 つの反復
ユニットと次の反復ユニットとの間で異なる核酸配列を
もつような変異でもよい。この変異がランダムに生じて
各反復ユニット内のNA1 とNA2 とが異なっていてもよ
い。また変異が所定パターンで生じ、ユニットの所定倍
数毎に変異が反復してもよい。また、NA1 とNA2 との変
異が、1 つの反復ユニットと次の反復ユニットとの間で
のNA1 及びNA2 の各々の塩基の数の違い、例えば増加ま
たは減少であってもよい。この変異もランダムに発生し
てもよく又はパターン化していてもよい。 n＝3 でNA1
及びNA2 の双方が変異をもつときのランダム変異の例
は、NA1 ---S--- NA2 −NA1 '---S---NA2 ' −NA1 "---
S---NA2 " である。
【００３５】n＝4 でNA1 とNA2 との双方が変異をもつ
ときのパターン化した変異の例は、NA1 ---S--- NA2 −
NA1 '---S---NA2 ' −NA1 ---S--- NA2 −NA1 '---S---
NA2 ' である。
【００３６】前記例の双方において、各ユニットを結合
する実線は水素結合又は共有結合の如き化学結合を示
す。
【００３７】また、反復ユニットの変異が開裂可能結合
の変異、即ち1 つのユニットの開裂可能結合がアミノ酸
であり別のユニットの開裂可能結合がRNA 配列であるよ
うな変異でもよい。開裂可能結合の変異も前記同様にラ
ンダムでもよく又はパターン化されていてもよい。ま
た、反復ユニットの変異が、前記の如きNA1 ，NA2 の違
い、又は開裂可能結合の違いの組み合わせでもよく、こ
れら変異がランダムでもよくパターン化されてもよい。
【００３８】本発明によれば、構造
【００３９】
【化１３】
【００４０】〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列、---S--
- は開裂可能結合、n は 1〜1,000 の整数、実線は化学
結合、X は固体支持体、L はNA1 を固体支持体に結合す
る化学物質及びM はマーカー〕をもつ分子が提供され
る。
【００４１】前記分子中のX は、石英質、セルロースも
しくはプラスチック材料又は調整多孔ガラスでよい。実
線で示される化学結合は共有結合又は水素結合のいずれ
でもよい。開裂可能結合の点線も化学結合を示し、これ
もまた共有結合又は水素結合でよい。M は放射性同位
体、放射性ラベル分子、蛍光分子又は適当な配位子の如
き検出可能マーカーである。M はまたNA2 内部の配列に
相補的なマーカー核酸配列でもよい。L はNA1 の配列に
実質的に相補的な配列をもつ核酸でもよく、この場合の
L は、相補的核酸配列間の水素結合を介して固体支持体
にNA1 を結合する。
【００４２】本発明はまた、構造
【００４３】
【化１４】
【００４４】〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列、---S--
- は開裂可能結合、実線は化学結合、n は 1〜1,000 の
整数、Y は存在しないか又は特有の同定特性を与える化
学物質、Z は存在しないか又は異なる特有の同定特性を
与える化学物質〕をもつ分子を提供する。
【００４５】分子に特有の同定特性を与えるY 及びZ を
もつ本発明のこの具体例は、二相濃度系での使用に適し
ている。かかる分子において、Y の同定特性が疎水性の
ときZ の同定特性は親水性てあり、Y の同定特性が親水
性のときX の同定特性は疎水性である。また、Y 又はZ
の一方が欠失していてもよく、この場合、他方は疎水性
物質である。この場合、Y 又はZ を結合していない核酸
配列NA1 又はNA2 は分子の親水性部分として機能する。
または、Y 又はZ 基の一方が同定マーカーであり他方が
疎水性基でもよい。または、Y 又はZ が、分子を固体支
持体に結合するリンカー物質として機能してもよい。
【００４６】上記の分子において、実線で示される化学
結合は共有結合又は水素結合のいずれでもよい。開裂可
能結合の点線も化学結合を示し、この結合も共有結合又
は水素結合のいずれでもよい。この分子はNA1 又はNA2
に結合された検出可能マーカーを有していてもよい。
【００４７】本発明の分子は、細菌DNA 、例えばサルモ
ネラ菌Salmonella及び大腸菌Escherichia coli、ウィル
スDNA 、例えば単純疱疹ウィルスＩ型及びII型、アデノ
ウィルス、サイトメガロウィルスの如き標的DNA の検出
に有効である。細菌DNA 又はウィルスDNA の検出はヒ
ト、植物又は動物の病気の診断に有効である。特に有利
な用途は、ヒト感染性疾患、例えば淋病の検出である。
別の用途はヒト遺伝病、例えば鎌状赤血球貧血の診断で
ある。
【００４８】本発明の分子は核酸配列検出用プローブと
して有効であり、2 つの異なる形態、即ち(1) 不均一系
に適した固体支持体に固定された形態又は(2) 均一系に
適した非固定形態で使用され得る。固定形態では、自由
末端をもつ核酸配列に検出可能マーカーが結合されてい
る。プローブを固定する適当な固体支持体の例は、石英
質材料、セルロース材料、プラスチック材料例えばポリ
スチレン又は調整多孔ガラス(CPG) である。好ましい固
体支持体は、本発明の分子に結合し得る反応性の基、例
えばヒドロキシル、カルボキシル又はアミノ基をもつい
かなる固体でもよい。また、本発明の分子は支持体への
接着によって固体支持体に結合し得る。非固定形態で
は、予め固定された配列に相補的な核酸配列が、マーカ
ーを結合していない分子の自由末端に結合している。
【００４９】本発明の固定分子は、該分子の3'端と支持
体との反応を介して固体支持体に直接結合されてもよ
く、又は分子の3'端と反応して共有結合を形成しかつ固
体支持体と反応して別の共有結合を形成することによっ
て分子を支持体に結合する化学物質L を介して間接的に
固定されてもよい。結合性物質の別の例は、本発明の分
子の3'端の配列に相補的な核酸配列であり且つ該分子と
水素結合を形成し得る第1 反応部位をもち、同時に固体
支持体との共有結合又は水素結合を形成し得る第2 反応
部位をもつ物質である。本発明ではまた、本発明の新規
な分子をジアゾカップリングによって固体支持体に結合
してもよい。
【００５０】適当な結合性化学物質は、分子の核酸機能
を損傷しないで本発明の分子を固体支持体に結合し得る
いかなる反応性核酸−結合配位子でもよい。かかる結合
性物質の例は、欧州特許出願公開第0130523 号に記載さ
れており、以下の種類の核酸挿入化合物(intercalator
compounds)の誘導体から任意に選択され得る: アクリジ
ン色素、フェナントリジン、フェナジン、フェノチアジ
ン、キノリン、アフラトキシン、多環炭化水素及びそれ
らのオキシラン誘導体、アクチノマイシン、アントラサ
イクリノン、チアキサンテノン、アントラマイシン、マ
イトマイシン、白金錯体、フルオレン、フルオレノン及
びフロクマリン。
【００５１】本発明によれば、サンプル中の対象核酸配
列の存在を検出する方法が、(a) 対象核酸配列に実質的
に相補的で検出可能マーカーを結合した核酸配列を含む
本発明の非固定分子とサンプルとをハイブリダイズ条件
下で接触させ、(b) 得られた分子を固体支持体上に固定
し、(c) 開裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、
(d) 固定分子を分離回収し、(e) 固定分子におけるマー
カーの存在を検出しこれにより対象核酸配列の存在を検
出するステップを含む。
【００５２】サンプル中の対象核酸配列の存在を検出す
る別の方法は、(a) 対象核酸配列に実質的に相補的で検
出可能マーカーを結合した核酸配列を含む本発明の固定
分子とサンプルとをハイブリダイズ条件下で接触させ、
(b) 開裂可能結合を開裂すべく固定分子を処理し、(c)
固定分子を分離回収し、(d) 固定分子におけるマーカー
の存在を検出しこれにより対象核酸配列の存在を検出す
るステップを含む。
【００５３】サンプル中の対象核酸配列を検出するため
の別の方法は、(a) 対象核酸配列に実質的に相補的で検
出可能マーカーを結合している核酸配列を含み疎水性物
質Y と親水性物質Z とを含む構造
【００５４】
【化１５】
【００５５】で示される分子を含む水溶液とサンプルと
をハイブリダイズ条件下で接触させ、(b) 得られた溶液
を非極性溶媒と混合して、二相溶液の相界面に分子が存
在しYが一方の相に配向されZ が他方の相に配向された
二相溶液を形成し、(c) 開裂可能結合を開裂すべく分子
を処理し、(d) このように処理された分子を回収し、
(e) マーカーの存在を検出しこれにより対象核酸配列を
検出するステップを含む。
【００５６】サンプル中の対象核酸配列を検出する別の
方法は、(a) 対象核酸配列に実質的に相補的で検出可能
マーカーを結合した核酸配列を含む本発明の非固定分子
とサンプルとをハイブリダイズ条件下で接触させてハイ
ブリダイズ生成物を形成し、(b) ステップ(a) の非固定
分子の配列に相補的であるが塩基の数が約 1〜10個少な
く該分子にハイブリダイズしたときに該分子を検出不能
にする核酸配列とステップ(a) の生成物とをハイブリダ
イズ条件下で接触させて、該分子に相補的な核酸配列を
非ハイブリダイズ分子とハイブリダイズさせ、(c) マー
カーの存在を検出しこれによりハイブリダイズ生成物の
存在、従って対象核酸配列の存在を検出するステップを
含む。
【００５７】本発明はまた、サンプル中の外来病原体の
存在を定量的に検出するために、本発明方法のいずれか
を使用して病原体に特有の核酸配列を検出する方法を提
供する。本発明はまた、サンプル中の外来病原体の量を
検出するために、本発明方法のいずれかを使用して病原
体に特有の核酸配列を検出する定量方法を提供する。
【００５８】サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に
測定する方法は、(a) 対象核酸配列に実質的に相補的で
検出可能マーカーと結合した核酸配列を含む所定量の本
発明の非固定分子とサンプルとをハイブリダイズ条件下
で接触させ、(b) 得られた分子を固体支持体上に固定
し、(c) 固定分子を処理して開裂可能結合を開裂し、
(d) 固定分子を分離回収し、(e) 固定分子上に存在する
マーカーの量を定量的に測定しこれにより対象核酸配列
の量を定量的に測定するステップを含む。
【００５９】サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に
測定する別の方法は、(a) 対象核酸配列に実質的に相補
的で検出可能マーカーを結合している核酸配列を含む所
定量の本発明の固定分子とサンプルとをハイブリダイズ
条件下で接触させ、(b) 固定分子を処理して開裂可能結
合を開裂し、(c) 固定分子を分離回収し、(d) 固定分子
に存在するマーカーの量を定量的に測定しこれにより対
象核酸配列の量を定量的に測定するステップを含む。
【００６０】サンプル中の対象核酸配列の量を定量的に
測定する更に別の方法は、(a) 対象核酸配列に実質的に
相補的で検出可能マーカーを結合した核酸配列を含み疎
水性物質Y と親水性物質Z とを含む構造
【００６１】
【化１６】
【００６２】で示される分子を含む水溶液とサンプルと
をハイブリダイズ条件下で接触させ、(b) 得られた溶液
を非極性溶媒と混合して、二相溶液の相界面に分子が存
在しYが一方の相に配向されZ が他方の相に配向された
二相溶液を形成し、(c) 開裂可能結合を開裂すべく分子
を処理し、(d) このように処理された分子を回収し、
(e) マーカーの量を定量的に測定しこれにより対象核酸
配列の量を定量的に測定するステップを含む。
【００６３】本発明の分子はDNA 又はRNA のプローブと
して有効である。ハイブリダイゼーション以前にプロー
ブ分子を適当な固体支持体上に固定してもよい。かかる
固定は典型的には、支持体と分子の2 つのDNA 配列の一
方との結合によって行なわれるか又は分子と固体支持体
との単なる接着によって行なわれる。分子に含まれた他
方のDNA 配列は検出可能マーカーを含む。分子のDNA 配
列と対象DNA 配列とのハイブリダイズ後に、分子の固定
DNA 配列と検出可能マーカーを含む分子のＤＮＡ配列と
の間の結合を分裂し、固定しなかった材料を例えば洗浄
によって完全に除去し、ハイブリダイズ分子の検出可能
マーカーだけを検出可能マーカーとして残す。検出可能
マーカーを含む非ハイブリダイズ配列はリンカー又はハ
イブリダイゼーションによって固定配列に結合していな
いので除去される。従って、検出可能マーカーの存在が
対象配列の存在を指示する。
【００６４】ハイブリダイゼーション以前にプローブ分
子を固定すると対象ヌクレオチド配列とハイブリダイズ
させるためにプローブ分子を高い有効濃度で使用し得
る。この具体例の有効プローブ濃度は、ハイブリダイゼ
ーションステップ以前にプローブでなく対象配列を固定
する従来の方法で得られるよりもかなり高い。この具体
例の固定プローブと対象配列を含有すると推定される材
料とを接触させ、プローブ分子を適当な試薬、例えば開
裂可能結合がＲＮＡ のときはリボヌクレアーゼと適当
な条件下で接触させ、結合の開裂又は消化を行うか又は
その他の方法でプローブのDNA 配列間の結合を分裂す
る。固定プローブが対象配列とハイブリダイズしていな
いと、DNA 配列はリボヌクレアーゼによって開裂され、
対象配列から分離するので洗浄によって除去される。従
って、洗浄後の検出可能マーカーの存在が対象配列の存
在を指示する。
【００６５】本発明の分子は、ホモポリマーテイル、例
えば、ポリdA又はポリdT又は予め固定した配列に相補的
な任意の所定配列を含有し得る。対象ヌクレオチド配列
に分子をハイブリダイズする以前又は以後にポリdAテイ
ルを使用し、予め固定されたポリdT断片に分子を（ハイ
ブリダイゼーションによって）結合してもよい。従っ
て、分子は溶液中で対象配列にハイブリダイズされても
よく、非ハイブリダイズ分子を検出以前に除去するため
に固定されてもよい。
【００６６】本発明の別の特徴は二相濃縮系の使用にあ
る。かかる系は核酸構造の分配挙動を修飾するために有
効である。二相濃縮系では、開裂可能結合をもち一端に
親水性基をもち他端に親油性基をもつプローブ分子が構
築される。これらの基はいずれも検出分子として機能で
き、また一端に付加的に検出分子を結合してもよい。望
ましい分子へのハイブリダイゼーションが生じない場合
には、二相溶液中で開裂可能配列が開裂することによっ
て親水性基と親油性基とが夫々の最適溶解度まで分散す
る。
【００６７】しかし乍ら、ハイブリダイゼーションが生
じると親水性基と親油性基とが互いに橋かけされ界面に
濃縮する。したがってこの界面を単離し、使用した特定
マーカー用の適当なビジュアライザーに露光する。
【００６８】疎水性／親水性開裂可能結合プローブ系は
以下のごとく構築され得る。短い核酸プローブを親油性
分子（これはマーカー分子として機能してもよく機能し
なくてもよい）に結合する。プローブは水性条件に難溶
性で非極性溶媒に易溶性である。水性条件下でハイブリ
ダイゼーションを行う。次に非極性非混和相を添加する
と、ハイブリダイズしなかったプローブがこの相に分配
する。他方、ハイブリダイズしたプローブは親水性DNA
の付加的ハイブリダイズ成分によって界面に濃縮する。
この構築は本発明の他の分配構築と違って開裂可能結合
を必要としない。
【００６９】かかる二相濃縮系は水性容量の大きいサン
プルから少量の標的核酸を単離するのに有効である。サ
ンプルを二相濃縮系で処理し標的材料を二相の界面に濃
縮させる。2 つの相の容量に比較すると界面の容量が比
較的小さい。系から界面を分離すると少量の界面中に比
較的高い濃度の標的核酸が存在する。
【００７０】二相濃縮系はまたサンプルからmRNAを単離
するためにも有効である。ポリdTテイルをもつ二相プロ
ーブ分子を使用しmRNAとハイブリダイズさせ、次に本発
明の溶媒分配方法を使用してmRNAを単離する。かかる系
はポリdTカラムに比較して、単離時間が速い、外来材料
がカラムを閉塞するという問題がない、等の利点をも
つ。
【００７１】本発明の目的はサンプル中の特異的DNA 配
列又はRNA 配列の検出方法を提供することである。方法
は相補的標的DNA 配列に結合しない検出可能なマーカー
分子を完全に除去しこれにより検出系のシグナル対ノイ
ズ比を改良すべく、少なくとも一点でプローブのDNA 配
列を特異的に開裂する手段を提供する。
【００７２】不均一系では開裂可能結合がRNA 部分のと
き本発明の目的を達成するためにDNA とRNA との不安定
性の差を利用する。本発明のDNA プローブを相補的DNA
標的配列及び非相補的DNA 配列に夫々接触させたときの
異なる結果を示す第１図を参照するとよい。相補的標的
DNA 配列はプローブのDNA 鎖とハイブリダイズし、固体
支持体に結合したDNA 鎖と検出可能マーカーをもつDNA
鎖とを開裂可能結合の分裂後にも接続している。プロー
ブが非相補的DNA と接触した場合には、開裂可能結合が
分裂するとマーカーがプローブから分離する。かかる構
成の結果、プローブが相補的標的DNA 配列とハイブリダ
イズしたときにのみマーカーがプローブと結合状態で残
存する。ハイブリダイズしなかったプローブの開裂マー
カーは系から溶出する。これにより高いバックグラウン
ドノイズの原因になる未反応検出成分が系から除去され
る。標的DNA 分子にハイブリダイズした検出系成分だけ
が残存する。検出系の残りの成分を添加するとハイブリ
ダイズした材料だけが反応する。これによりハイブリダ
イゼーション反応を進行させるために極めて高いプロー
ブ濃度を使用でき対応するバックグラウンドノイズレベ
ルの上昇を生じない。
【００７３】開裂可能結合がRNA 配列のとき結合はRNA
分裂酵素によって開裂され得る。RNA リンクの開裂のた
めに種々のリボヌクレアーゼを使用し得る。リボヌクレ
アーゼA を使用するとき、一本鎖（即ちハイブリダイズ
していない）RNA だけが切断され、ハイブリダイズしな
かったプローブ分子から検出成分が除去されるがハイブ
リダイズしたプローブ分子は元の状態で残存する。リボ
ヌクレアーゼH を使用すると、RNA/DNA の二重鎖ハイブ
リッド中のRNA だけが開裂される。このためハイブリダ
イズしたプローブ分子の一本鎖DNA ギャップが残存し、
これを利用して検出系の別の成分と再度ハイブリダイズ
し得る。この種の不安定性の差を利用した種々の検出系
の使用が可能である。
【００７４】開裂可能結合はまた、1 つ又は一連の非塩
基性(abasic)ヌクレオチドによって形成されてもよい。
デオキシ(A,T,G,C) とは相違するものにし得るいかなる
修飾塩基も、DNA 配列の開裂可能点の形成用基質として
機能し得る。即ち、デオキシリボヌクレオシド又はリボ
ヌクレオシドの塩基部分をプローブの合成以前又は以後
に除去し得る。プローブ配列中の開裂可能結合は、非塩
基性前駆分子の使用によって合成されてもよく、又は合
成後の酵素による塩基の除去によって合成されてもよ
い。後者の例を以下に示す。合成中にリンカー物質とし
てデオキシウリジンを使用するときには、酵素N-ウラシ
ルDNA グリコシラーゼで処理してウラシル塩基をデオキ
シウリジンから除去し得る。この結果、デオキシウリジ
ンが存在するところには常に非塩基性リンクが形成され
る。このリンクは塩基性条件下で開裂するか、又は任意
の非塩基性部位で開裂し得る所謂Apエンドヌクレアーゼ
酵素のグループに属する酵素で処理して開裂され得る。
注目すべきはプローブ配列のウリジン部分が直接合成に
よるか又はシトシン部分の化学的脱アミノ反応によって
形成され得ることである。この脱アミノ反応が亜硫酸水
素ナトリウムによる適当な処理によって行なわれること
が文献に記載されている。シトシンの脱アミノ反応後
に、得られたウリジン部分をN-ウラシルDNA グリコシラ
ーゼの作用によって非塩基性リンクに変換する。次に、
塩基性条件を与えるか又はApエンドヌクレアーゼを作用
させて開裂を生起する。後者の方法は、予め存在するDN
A 中に開裂可能結合を形成し得るので、合成でない即ち
天然のDNA 配列を開裂可能リンク系のプローブとして使
用し得る。
【００７５】Apエンドヌクレアーゼ活性に関しては、そ
の活性の目的生成物が末端糖部分であるように酵素を選
択し得る。これはその後の検出反応の基質を提供する。
【００７６】本発明の検出系は、ルシフェラーゼの如き
発光酵素系のサブユニットたるマーカー成分を利用する
系である。別のサブユニットと適当な補因子と基質とを
添加すると発光が生じる。これを増幅して検出する。
【００７７】本発明の別の検出系は、酵素がプローブに
結合された「ディップスティック」系として形成される
固体プローブマトリクスをもつ系である。プローブマト
リクスを標的DNA 溶液に所定温度で所定時間浸漬する。
次にリボヌクレアーゼに浸漬し、ハイブリダイズしなか
ったプローブからプローブ酵素を開裂する。最後に簡単
に洗浄し、マトリクスを酵素基質溶液に浸漬すると検出
可能反応（例えば呈色反応）が生じる。
【００７８】上記の如き不安定性の差を利用する方法及
び開裂可能リンクを開裂する方法は均一系及び不均一系
の双方で使用し得る。プローブが固体支持体に固定され
ていない均一系での主要な問題は、ハイブリダイズしな
かった検出成分の検出を阻止しバックグラウンドノイズ
を許容範囲に抑えることである。この問題は、検出可能
マーカーの反応を阻害する試薬の使用によって解決でき
る。ハイブリダイゼーションが生じた後に、その後のい
かなる検出反応においても非ハイブリダイズマーカーを
立体阻害又は遮断する結合を含む競合核酸カウンタープ
ローブ配列を添加し得る。検出反応に必要な第2 成分の
添加以前に立体阻害剤を添加すると、非ハイブリダイズ
検出マーカーが阻害される。RNA 相補的配列を介して阻
害剤を導入すると、手順が逆になり阻害剤はリボヌクレ
アーゼの添加によって有効に除去され得る。
【００７９】カウンタープローブ自体はプローブの核酸
よりもやや短く例えば約 1〜5 塩基対短く構築される。
これによりカウンタープローブは標的配列よりもプロー
ブ核酸とハイブリダイズしにくく、従ってプローブ核酸
に対して標的配列と競合しない。
【００８０】開裂可能リンクのテストに使用されるプロ
ーブ分子は水解可能結合又は永久（水解不能結合）を使
用し固体支持媒体（シリカゲル又は調整多孔ガラス）に
構築された。この合成には公知の化学的方法を使用し得
る(Alvarado-Urbina、G. 、G.M.Sathe 、W.C.Liu 、M.F.
Gillan、P.D.Duck、R.Bender、及びK.K.Ogilvie(1981)
、遺伝子断片の自動合成(Automated Synthesis of Gen
e Fragments) 、Science214:270-274;Roberts、D.M.、
R.Crea、M.Malecha 、G.Alvarado-Urbina 、R.H.Chiare
llo 、D.M.Watterson(1985) 、部位特異的突然変異のた
めに設計されたカルモジュリン遺伝子の化学合成及び発
現(Chemical Synthesis and Expression of a Calmodul
in gene designed for a Site-Speci-fic Mutagenesi
s)、Biochemistry、印刷中；VanBoom 、J.H.及びC.T.Wr
eesman(1984)、溶液中での小オリゴリボヌクレオチドの
化学合成(Chemical Synthesis of Small Oligoribonucl
eotides in Solution)、In Oligonucleotide Synthesis
--A Practical Approach、153-183 ページ、M.J.Gait
編、IRL Press)。標準保護デオキシヌクレオシドモノマ
ーは市販のソースから得られた。また保護デオキシウリ
ジン及びリボヌクレオシドモノマーは公知の方法で調製
された（Ti、G.S.、B.L.Gaffney 、R.A.Jones(1982) 、
一時的保護: 保護ヌクレオシドの有効な一フラスコ合成
(Transient Protection:Efficient One Flask Synthesi
s of Protected Nucleosides) 、J.AM.Chem.Soc.104 :1
316)。合成には、BIO LOGICALS自動シンセサイザーを使
用し、各DNAの縮合のサイクル時間10分及び各RNA の縮
合のサイクル時間約12分を用いた。
【００８１】以下の構築プローブを使用し種々のテスト
を実施した。
【００８２】開裂可能リンクプローブ P.L.＝固体支持体に対する永久結合 H.L.＝固体支持体に対する加水分解可能結合 １.MRC046: 5'd(TTTTTTTTTT)r(UUUUUU)d(TTTTTTTTTTT)3'-P.L. ２.MRC059: 5'd(TTTTTTTTTT)r(UUUU)d(TTTTTTTTTTTT)3'-H.L. ３.MRC060: 5'd(TTTTTTTTTTTT)r(UUUU)d(TTTTTTTTTT)3'-H.L. ４.MRC064: 5'd(TTTTTTTTTTTT)d(UUUUUUUU)d(TTTTTTTTTT)3'-H.L. 5.MRC068: 5'd(TTTTTTTTTTTTTT)r(UUUUUUUU)d(TTTTTTTTTT)3'-H.L. ６.MRC069: 5'd(GGGTAACGCCAG)r(GGUUUU)d(CCCAGTCAC)3'-H.L. ７.MRC070: 5'd(GGGTAACGCCAG)r(GGUUUU)d(CCCAGTCAC)3'-P.L. ８.MRC071: 5'd(TTTTTTTTTTTTTTT)r(UU)d(TTTTTTTTTT)3'-H.L.カウンタープローブ ９.MRC043: 5'd(ACAACGTCGTGACTGGGA)3'-H.L. 10.MRC045: 5'd(ACAACGTCGTGACTGGGAA)3'-P.L. 11.MRC058: 5'd(ACAACGTCGTGACTGGGAAT)3'-P.L. 12.MRC062: 5'd(CAACGTCGTGACTGGGAAAACTTTTTTT)3'-H.L. 13.MRC063: 5'd(CAACGTCGTGACTGGGAAAACTTTTTTT)3'-P.L. 14.MRC067: 5'd(CAACGTCGTGACTGGGAAAACTTTTTTTTT)-3'-P.L. 15.MRC072: 5'd(GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTTTTTTTTTTTT)-3'-P.L. 16.MRC073: 5'd(GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTTTTTTTTTTTT)-3'-H.L.
【００８３】
【実施例】実施例１ 開裂可能リンクプローブの構築 プローブ分子 1〜3 及び 5〜8 は膵臓リボヌクレアーゼ
の如き多数のリボヌクレアーゼ及び塩基性条件（例えば
0.5M NaOH）によってリボヌクレオチドで開裂可能であ
ることが判明した。リボヌクレアーゼによる開裂の最も
一般的な方法及びその他の常用手順に関してはManiatis
等を参照するとよい（Maniatis、T.、E.F.Fritsch 及び
J.Sambrook、(1982)、Molecular Cloning、A Laboratory
Manual、Cold Spring Harbor Laboratory ）。プローブ
4 をN-ウラシルグリコシラーゼで処理し、ウリジン部分
からウラシル塩基を除去して非塩基性結合を残した。続
いて、Apエンドヌクレアーゼ又は弱塩基によって処理
し、該結合を開裂した。判り易いように実験中に検出分
子を P32標識した。 P32はポリヌクレオチドキナーゼで
プローブの5'端に結合した。
【００８４】開裂可能リンクプローブ（例えばMRC068）
を、合成に用いた固体支持体上に結合したままで P32を
キナーゼで結合した。膵臓リボヌクレアーゼで開裂後、
固体支持体をMicrofuge で数秒間遠心し、上清を乾燥
し、少量に再度懸濁させて20％ポリアクリルアミドゲル
で検査した。残りの固体支持体には放射能がほとんど又
は全く結合していないことが判明した。全ての放射能カ
ウントがリボヌクレアーゼによって水解され除去されて
いた。これらカウントを電気泳動で検査すると、これら
カウントがRNA リンクに対して遠位5'の14塩基断片に存
在することが判明した。ときには1 つ又は2 つのリボヌ
クレオチドが結合状態で維持されていた。残りの配列を
濃水酸化アンモニウムで固体支持体から加水分解しキナ
ーゼで P32と結合すると、3'遠位10塩基DNA に対応する
ことが判明した。これにも1 つ又は2 つのリボヌクレオ
チドが結合していてもよい。
【００８５】他方、5'標識開裂可能リンクプローブを膵
臓リボヌクレアーゼで処理する以前に（未知物質とし
て）過剰のオリゴdAにハイブリダイズすると、プローブ
が結合している固体支持体から放射性ラベルはほとんど
又は全く遊離しなかった。リボヌクレアーゼH を使用し
RNA リンクが開裂したと推定されるときにも同様であっ
た。オリゴdA断片は3'の10塩基DNA と5'の14塩基DNA と
の間のハイブリダイゼーションブリッジとして作用し、
5'の P32ラベル14塩基配列が上清に遊離することを阻止
する。このようにして非ハイブリダイズプローブ材料を
ハイブリダイズプローブ材料から識別し得る。別の実験
では、一本鎖DNA ファージM-13の領域に相同のMRC070の
5'-P32ラベルプローブを用い、同様の結果を得た。これ
らの場合には、M-13を未知物質として使用しMRC070にハ
イブリダイズした。リボヌクレアーゼで処理後、非ハイ
ブリダイズプローブを洗浄によって固体支持体から除去
した。固体支持体に結合した残留放射能カウントはMRC0
70プローブにハイブリダイズしたM-13の量を反映する。
【００８６】実施例２ カウンタープローブの構築 カウンタープローブ 9〜16を使用した実験で適当なハイ
ブリダイゼーション条件を測定した。配列 9〜14は一本
鎖DNA ファージM-13の短い領域と同じ配列をもつ。配列
15〜16はこのM-13領域に相補的である。最初の実験で
は、M-13からの短い合成配列を P32で標識した（5" P32
−GTTTTCCCAGTCACGACGTTG ）。この配列に相補的で固体
支持体に結合しているカウンタープローブを使用し溶液
から標識配列を除去した。種々のハイブリダイゼーショ
ン条件を試験し、条件の許容範囲がかなり広いことを知
見した。カウンタープローブとプローブとの結合効率に
かなり影響を与える要因は、固体支持体と相補的配列の
3'端との間の非特異的アームの長さであることが判明し
た。一般に、12-Tアームは約4000X の過剰で30分以内に
溶液からほぼ全部の標識プローブを分離する。固体支持
体と相補的配列との間にT アームが存在しないと標識プ
ローブの約60％しか溶液から除去されない。競合試験に
関する重要な点はプローブに相補的なカウンタープロー
ブ配列をプローブよりも 1〜5 塩基短くする必要があ
る。カウンタープローブが標的配列と同じ配列なので、
カウンタープローブが標的配列からプローブを奪取しな
いように標的配列とカウンタープローブとの間の競合を
最小にすることが重要である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸プローブと、このプローブを相補
的標的DNA 配列（図の左側）及び非相補的非標的DNA 配
列（図の右側）の夫々に接触させることによって得られ
た夫々の結果とを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート・ベンダー カナダ国、ケイ・１・アール・５・ダブリ ユ・６、オンタリオ、オタワ、ライアン・ ストリート・ノース・322 (72)発明者 ウイリアム・クロスビイ カナダ国、エス・７・ケイ・４・ワイ・ ４、サスカツチエワン、サスカトウーン、 フロビシヤー・クレスント・131 (72)発明者 ジヨン・ジー・ロバートスン カナダ国、ケベツク、レインジ・ガーデイ エン、デイバイン・ロード（番地なし)

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプル中の対象標的核酸配列の存在を
    検出する方法であって、(a) 対象標的核酸配列に実質的
    に相補的な核酸配列を含む、構造 【化１】 〔式中、NA1 及びNA2 は異なる非相補的核酸配列であ
    り、---S--- は開裂可能結合であって、NA1 又はNA2 の
    核酸配列を開裂又は分裂することなしに、あるいはNA1
    及びNA2 配列に、又はNA1 及びNA2 配列と開裂可能結合
    とにハイブリダイズ可能な標的核酸配列を開裂又は分裂
    することなしに開裂又は分裂され得る開裂可能結合であ
    り、NA1 及びNA2 の両方がDNA 配列の場合開裂可能結合
    はRNA 配列であり、又はNA1 及びNA2 がRNA 配列の場合
    開裂可能結合はDNA 配列であり、n は1〜4 の整数であ
    る〕を含み、各〔NA1 ---S--- NA2 〕において、マーカ
    ーがNA1 又はNA2 のいずれかに結合している天然産生で
    ない合成組成物とサンプルとをハイブリダイズ条件下で
    接触させハイブリダイズ複合体を形成し、(b) 複合体を
    固体支持体上に固定し、(c) 開裂可能結合を開裂すべく
    固定複合体を処理し、(d) 固定複合体を分離回収し、
    (e) 固定複合体におけるマーカーの存在を検出しこれに
    より対象標的核酸配列の存在を検出することを特徴とす
    る方法。
  2. 【請求項２】 サンプル中の対象標的核酸配列の存在を
    検出する方法であって(a) 対象標的核酸配列に実質的に
    相補的な核酸配列を含む、構造 【化２】 〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列であり、---S--- は開
    裂可能結合であって、NA1 又はNA2 の核酸配列を開裂又
    は分裂することなしに、あるいはNA1 及びNA2 配列に、
    又はNA1 及びNA2 配列と開裂可能結合とにハイブリダイ
    ズ可能な標的核酸配列を開裂又は分裂することなしに開
    裂又は分裂され得る開裂可能結合であり、NA1 及びNA2
    の両方がDNA 配列の場合開裂可能結合はRNA 配列であ
    り、又はNA1 及びNA2 がRNA 配列の場合開裂可能結合は
    DNA 配列であり、n は 1〜4 の整数であり、実線は化学
    結合を表わし、X は固体支持体であり、L はNA1 を固体
    支持体に結合する化学物質であり及びM はマーカーであ
    る〕を含む組成物とサンプルとをハイブリダイズ条件下
    で接触させハイブリダイズ複合体を形成し、(b) 開裂可
    能結合を開裂すべく複合体を処理し、(c) 固定複合体を
    分離回収し、(d) 固定複合体におけるマーカーの存在を
    検出しこれにより対象標的核酸配列の存在を検出するこ
    とを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】 サンプル中の対象標的核酸配列を検出す
    るための方法であって、(a) 対象標的核酸配列に相補的
    な核酸配列を含み、構造 【化３】 〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列であり、---S--- は開
    裂可能結合であって、NA1 又はNA2 の核酸配列を開裂又
    は分裂することなしに、あるいはNA1 及びNA2 配列に、
    又はNA1 及びNA2 配列と開裂可能結合とにハイブリダイ
    ズ可能な標的核酸配列を開裂又は分裂することなしに開
    裂又は分裂され得る開裂可能結合であり、NA1 及びNA2
    の両方がDNA 配列の場合開裂可能結合はRNA 配列であ
    り、又はNA 1 及びNA2 がRNA 配列の場合開裂可能結合は
    DNA 配列であり、実線は化学結合であり、n は 1〜4 の
    整数であり、Y は同定特性を与える疎水性化学物質であ
    り、Z は同定特性を与える親水性化学物質である〕を含
    み、マーカーがNA1 又はNA2 の一方に結合されている組
    成物を含む水溶液とサンプルとをハイブリダイズ条件下
    で接触させハイブリダイズ複合体を形成し、(b) 得られ
    た溶液を非極性溶媒と混合して、二相溶液の相界面に複
    合体が存在しY が一方の相に配向されZ が他方の相に配
    向された二相溶液を形成し、(c) 開裂可能結合を開裂す
    べく複合体を処理し、(d) このように処理された複合体
    を回収し、(e) マーカーの存在を検出しこれにより対象
    標的核酸配列を検出することを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】 サンプル中の外来病原体の存在を検出す
    るための診断方法であって、請求項１〜３のいずれかに
    記載の方法を使用して病原体に特有の核酸配列を検出す
    ることを含む診断方法。
  5. 【請求項５】 サンプル中の対象標的核酸配列の量を定
    量的に測定するための方法であって、(a) 対象標的核酸
    配列に実質的に相補的な核酸配列を含む所定量の、構造 【化４】 〔式中、NA1 及びNA2 は異なる非相補的核酸配列であ
    り、---S--- は開裂可能結合であって、NA1 又はNA2 の
    核酸配列を開裂又は分裂することなしに、あるいはNA1
    及びNA2 配列に、又はNA1 及びNA2 配列と開裂可能結合
    とにハイブリダイズ可能な標的核酸配列を開裂又は分裂
    することなしに開裂又は分裂され得る開裂可能結合であ
    り、NA1 及びNA2 の両方がDNA 配列の場合開裂可能結合
    はRNA 配列であり、又はNA1 及びNA2 がRNA 配列の場合
    開裂可能結合はDNA 配列であり、n は1〜4 の整数であ
    る〕を含み、各〔NA1 ---S--- NA2 〕において、マーカ
    ーがNA 1 又はNA2 のいずれかに結合している天然産生で
    ない合成組成物とサンプルとをハイブリダイズ条件下で
    接触させハイブリダイズ複合体を形成し、(b) 得られた
    複合体を固体支持体上に固定し、(c) 固定複合体を処理
    して開裂可能結合を開裂し、(d) 固定複合体を分離回収
    し、(e) 固定複合体に存在するマーカーの量を定量的に
    測定しこれにより対象標的核酸配列の量を定量的に測定
    することを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 サンプル中の対象標的核酸配列の量を定
    量的に測定するための方法であって、(a) 対象標的核酸
    配列に実質的に相補的な核酸配列を含む所定量の、構造 【化５】 〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列であり、---S--- は開
    裂可能結合であって、NA1 又はNA2 の核酸配列を開裂又
    は分裂することなしに、あるいはNA1 及びNA2 配列に、
    又はNA1 及びNA2 配列と開裂可能結合とにハイブリダイ
    ズ可能な標的核酸配列を開裂又は分裂することなしに開
    裂又は分裂され得る開裂可能結合であり、NA1 及びNA2
    の両方がDNA 配列の場合開裂可能結合はRNA 配列であ
    り、又はNA1 及びNA2 がRNA 配列の場合開裂可能結合は
    DNA 配列であり、n は 1〜4 の整数であり、実線は化学
    結合を表わし、X は固体支持体であり、L はNA1 を固体
    支持体に結合する化学物質であり及びM はマーカーであ
    る〕を含む組成物とサンプルとをハイブリダイズ条件下
    で接触させハイブリダイズ複合体を形成し、(b) 固定複
    合体を処理して開裂可能結合を開裂し、(c) 固定複合体
    を分離回収し、(d) 固定複合体に存在するマーカーの量
    を定量的に測定しこれにより対象標的核酸配列の量を定
    量的に測定することを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】 サンプル中の対象標的核酸配列の量を定
    量的に測定するための方法であって、(a) 対象標的核酸
    配列に相補的な核酸配列を含み、構造 【化６】 〔式中、NA1 及びNA2 は核酸配列であり、---S--- は開
    裂可能結合であって、NA1 又はNA2 の核酸配列を開裂又
    は分裂することなしに、あるいはNA1 及びNA2 配列に、
    又はNA1 及びNA2 配列と開裂可能結合とにハイブリダイ
    ズ可能な標的核酸配列を開裂又は分裂することなしに開
    裂又は分裂され得る開裂可能結合であり、NA1 及びNA2
    の両方がDNA 配列の場合開裂可能結合はRNA 配列であ
    り、又はNA1 及びNA2 がRNA 配列の場合開裂可能結合は
    DNA 配列であり、実線は化学結合であり、n は 1〜4 の
    整数であり、Y は同定特性を与える疎水性化学物質であ
    り、Z は同定特性を与える親水性化学物質である〕を含
    み、マーカーがNA1 又はNA2 の一方に結合されている組
    成物を含む水溶液とサンプルとをハイブリダイズ条件下
    で接触させハイブリダイズ複合体を形成し、(b) 得られ
    た溶液を非極性溶媒と混合して、二相溶液の相界面に複
    合体が存在しY が一方の相に配向されZ が他方の相に配
    向された二相溶液を形成し、(c) 開裂可能結合を開裂す
    べく複合体を処理し、(d) このように処理された複合体
    を回収し、(e) マーカーの量を定量的に測定しこれによ
    り対象標的核酸配列の量を定量的に測定することを特徴
    とする方法。
  8. 【請求項８】 サンプル中の外来病原体の量を測定する
    ための診断方法であって、請求項５〜７のいずれかに記
    載の方法を使用して病原体の核酸を検出することを含む
    方法。
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