JP2005519621A - ３’一本鎖部分を含む二本鎖ｄｎａを生成する方法および組換えのためのこれらの複合体の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、核酸を組換える方法を、提供する。特に、ＲＮＡ標的からの３’突出を含む部分的に二本鎖の核酸の生成のための方法、およびポリヌクレオチドを組換えする方法における、ＲＮＡ標的からの３’突出を含む部分的に二本鎖の核酸の使用が、記載される。これらの方法は、サーモサイクリングを必要としない。本発明はまた、改善された特性または所望の特性を備えたタンパク質の同定を可能にする、組換え方法および選択方法も、提供する。

Description

（関連出願の引用）
本出願は、米国仮出願第６０／３６３，７２９号（２００２年３月１１日出願）の利益を主張し、その内容は、その全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、ＲＮＡテンプレートからの３’一本鎖部分を含むハイブリダイズした第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を生成するための方法および組成物、ならびに組換え方法におけるこれらの複合体の使用に関する。１つの局面において、本発明は、サーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）を必要としない、組換えポリヌクレオチドを生成するための方法を提供し、このポリヌクレオチドは、所望の表現型のスクリーニングおよび／もしくは選択に有用であるか、ならびに／または有利な所定の特性を有するタンパク質をコードする。

ＤＮＡ分子をクローン化し、組換える能力において、近年、急速かつ確実な進歩が存在している。これらの進歩は、制限酵素の発見と共に始まった。この制限酵素は、二本鎖ＤＮＡを切断し得、それにより、組換えられて新規の組換え分子を生成し得るＤＮＡフラグメントが、生成された。この革命は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発見および開発によって拡張された。これは、特定のＤＮＡセグメントの迅速な増幅を可能にし、この後切断され、他のＤＮＡ分子と組換えられ得る、大量の材料を生成する。

これらの切断技術および増幅技術の威力にもかかわらず、実質的な改善の余地が残存する。制限酵素は、高価であり、そして時々非効率的であるか、または粗製の、夾雑物を含む調製物として市販される。さらに、ＰＣＲ増幅は、しばしば直接のクローニングに抵抗性の産物を生じ、これは、多くの好熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲに最も一般的に使用される酵素であるＴａｑを含む）による末端３’−ｄＡＭＰ残基の付加に起因する。

特に望ましい系は、制限酵素にほとんど頼らない核酸組換えのために適切なハイブリッド産物を生成し、効率的な組換えを提供し、そして広範な種々の化学構造を有する核酸の間の組換えに一般に有用である。

Ｊａｒｒｅｌｌら（ＷＯ ００／４０７１５および米国特許第６，３５８，７１２号を参照のこと）は、３’突出または５’突出を有する二本鎖産物の生成を含む、ライブラリー構築の方法を教示する。しかし、この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用するため、サーモサイクリングおよび指数関数増幅を必要とする。その上、Ｊａｒｒｅｌｌは、二本鎖ＤＮＡのテンプレートとしての使用を開示する。

組換え産物の生成を使用する方法としては、分子進化および「ＤＮＡシャッフリング」が挙げられる。分子進化は、強化された選択可能な特性または独特の選択可能な特性を有する、新規のタンパク質を生成するための強力な道具である。強化された酵素活性、強化された熱安定性、または有機溶媒もしくは所定の媒質（アルカリ媒質または高塩媒質）における強化された安定性、新規の酵素活性、あるいは他の所望の特徴を有するタンパク質は、単一の遺伝子の変異誘発された改変体の小片、または異なった遺伝子の小片を、組換えてハイブリッドタンパク質を形成することによって、生成され得る。一般に、インビトロでの方向付けられた進化としては、ハイブリッドポリヌクレオチドの生成、ポリヌクレオチドの増幅、および所望の特徴を有するタンパク質を選択するためのスクリーニングが、挙げられる。「ＤＮＡシャッフリング」は、関連遺伝子からの複数のドメインの再編成より、むしろ単一の遺伝子の変異誘発を含む。ＤＮＡシャッフリングのための公知の方法は、遺伝子の変異誘発、変異体の選択、ＤＮａｓｅＩによる断片化、およびＰＣＲを使用したインビトロでのフラグメントの組換えを含む（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１０７４７−４１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−９１（１９９４））。

分析は、多くのタンパク質が、多くの別々のドメインから構成されることを明らかにした。このようなタンパク質のそれぞれのドメインは、しばしば、タンパク質の活性全体に寄与する、特定の機能に関わる。多くのドメインが、進化的に可動性であることが見出されている。可動性タンパク質は、独立して折りたたむその能力によって特徴付けられる。複数の可動性ドメインを含む「モザイクタンパク質」は、特徴付けられており、「エキソンシャッフリング」による進化を通して生じていること考えられる。エキソンシャッフリングの天然のプロセスは、インビトロで、エキソンシャッフリングされた遺伝子のライブラリーの生成およびスクリーニングにより、模倣され得る（ＫｏｌｋｍａｎおよびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：４２３−２８（２００１））。このようなライブラリーにおけるドメインをコードするエキソンは、近縁の遺伝子かまたは分岐した遺伝子であり得る。さらに、ドメインをコードするエキソンは、同一種からの関連の遺伝子または近縁の種からのホモログに由来し得る。

従って、少なくとも１つの所定の一本鎖ＤＮＡ部分を含む二本鎖核酸配列を生成する方法の、厳粛な必要が存在する。この二本鎖核酸配列は、サーモサイクリングを必要とせず、従ってこれを避けた方法を使用して、ＲＮＡから生成され、そしてこの二本鎖核酸配列は、ランダムであり得るか、全てのｍＲＮＡ配列のプールから選択され得るか、または関連配列（例えば、特定のドメインをコードする全ての配列、遺伝子のスーパーファミリーのメンバーをコードする配列など）から選択され得る。

本明細書中に記載される全ての参考文献（特許出願および特許公報を含む）は、その全体が参考として援用される。

１つの局面において、本発明は、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の生成を導く局面のための方法を提供し、この複合体は、核酸の組換えに有用な３’一本鎖部分を含み、この方法は、以下：（ａ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を調製する工程であって、この複合体は３’一本鎖部分を含み、ここで、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素）で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する（切断は、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素によりなされ得る）工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼを用いて伸長し（このＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、本明細書中で記載するように、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し得るか、またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ポリメラーゼを有し得る；従って、本明細書中で記載される、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用した伸長は、同一または別々の酵素において生じ得る）、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程を、包含する方法に従って調製される、工程を、包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

１つの局面において、本発明は、核酸の組換え（ハイブリッドの形成）に導く局面のための方法を提供し、この方法は、以下：第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、これにより、ハイブリッド核酸が生成される工程を、包含する。

別の局面において、本発明は、核酸の組換え（ハイブリッドの形成）に導く局面のための方法を提供し、この方法は、以下：第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それによりハイブリッド核酸が生成される工程であって、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下を含む方法に従って調製される：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する（切断は、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素でなされ得る）工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程、を包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

１つの局面において、本発明は、核酸を組換えするための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を調製する工程であって、この複合体は、３’一本鎖部分を含み、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する（切断は、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素でなされる）工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程；を、包含する方法に従って調製される、工程；（ｂ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成される、工程；ならびに（ｃ）ハイブリッド核酸から組み換え核酸を生成する、工程を、包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

１つの局面において、本発明は、核酸の組換え（ハイブリッドの形成）に導く局面のための方法を提供し、この方法は、以下：ハイブリッド核酸から組換え核酸を生成する工程であって、このハイブリッド分子は、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を受入核酸分子とハイブリダイズすることによって調製され；これにより、ハイブリッド核酸が生成され；ここで、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する（切断は、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素でなされ得る）工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程；を、包含する方法に従って調製される、工程；ならびに（ｂ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成される工程を、包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

１つの局面において、本発明は、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の生成に導く局面のための方法を提供し、この複合体は、核酸の組換えに有用な３’一本鎖部分を有し、この方法は、以下：２つの３’一本鎖部分を有する第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を調製する工程であって、ここで、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する（切断は、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素でなされ得る）工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマー（ここで、この第２プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む混成プライマーである）を、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程；を、包含する方法に従って調製される工程を、包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

別の局面において、本発明は、核酸の組換え（ハイブリッドの形成）に導く局面のための方法を提供し、この方法は、以下：第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成される工程を、包含する。

１つの局面において、本発明は、ハイブリッド核酸を生成するための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を調製する工程であって、この複合体は、３’一本鎖部分を含み、この３’一本鎖部分を含む複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程；を、包含する方法に従って調製される、工程；ならびに（ｂ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成される、工程を、包含する。本明細書中に記載されるように、複合体と受入分子との間のアニーリングが起こる限り、３’一本鎖部分の一部または全体が、ハイブリダイズし得る。幾つかの実施形態において、この方法は、（ｃ）ハイブリッド核酸から組み換え核酸を生成する工程を、さらに包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

本明細書中に記載される方法の幾つかの実施形態において、第２プライマーは、プライマー伸長産物にハイブリダイズした標的ＲＮＡのフラグメントを含み、このフラグメントは、工程（ａ）の複合体中のＲＮＡの切断により、生成される。切断は、多くの方法（ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素による処理、熱処理、または化学処理を含む）によってなされ得る。

幾つかの実施形態において、この方法は、混成プライマー（５’ＲＮＡ部分が３’ＤＮＡ部分に隣接する）を用いて実践され、そして第２の鎖の作製は、プライマー伸長産物（混成プライマーの伸長から生じるＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のＲＮａｓｅ Ｈ切断によって生成された）にハイブリダイズした標的ＲＮＡのフラグメントを含む第２プライマーを用いてなされる。

１つの局面において、本発明は、核酸を組換えるための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を調製する工程であって、この複合体は、２つの３’一本鎖部分を含み、ここで、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する（切断は、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素でなされ得る）工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマー（ここで、この第２プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む混成プライマーである）を、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、２つの３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程；を、包含する方法に従って調製される、工程；（ｂ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の少なくとも１つの３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成される、工程；ならびに（ｃ）ハイブリッド核酸から組み換え核酸を生成する工程を、包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

別の局面において、本発明は、核酸を組換えるための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸を生成する工程であって、ここで、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下：（ａ）２つの３’一本鎖部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を調製する工程であって、ここで、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下を含む方法によって調製される：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する（切断は、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素でなされ得る）工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマー（ここで、この第２プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する混成プライマーである）を、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、２つの３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程によって調製される、工程；ならびに（ｂ）ハイブリッド核酸から組み換え核酸を生成する工程を、包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

１つの局面において、本発明は、核酸を組換えるための方法を提供し、この方法は、以下：ハイブリッド核酸から組換え核酸を生成する工程であって、このハイブリッド分子は、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受核酸分子と入ハイブリダイズすることによって調製され、それにより、ハイブリッド核酸分子が生成され、ここで、この第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する（切断は、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素でなされ得る）工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマー（ここで、この第２プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を有する混成プライマーである）を、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、２つの３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程を、包含する方法によって調製される、工程を包含する。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

別の局面において、本発明は、組換え核酸を、例えば、所望の表現型および／または有利な所定の特性を有するタンパク質をコードすることについて、選択および／またはスクリーニングするための方法を提供する。組換え産物は、例えば、分子進化、ＤＮＡシャッフリング、および組換えを利用する他の方法に有用である。固定化した組換え産物は、例えば、マイクロアレイの生成に有用である。

別の局面において、本発明は、本明細書中に記載のプロセスによって作製される通りの、本明細書中で記載される産物（３’一本鎖部分を有する複合体；ハイブリッド核酸；組換え核酸）を、提供する。例えば、本発明は、以下の工程を包含するプロセスによって作製されるハイブリッド核酸を提供する：（ａ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を調製する工程であって、この複合体は３’一本鎖部分を含み、ここで、この３’一本鎖部分を含む複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、この第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の複合体中の混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程を、包含する方法に従って調製される、工程；ならびに（ｂ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成される、工程。本明細書中に記載されるように、複合体と受入分子との間のアニーリングが起こる限り、３’一本鎖部分の一部または全体が、ハイブリダイズし得る。幾つかの実施形態において、工程（ｉｉ）の切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を使用してなされる。幾つかの実施形態において、この酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈである。

（発明を実施するための形態）
（本発明の方法）
本発明の方法は、３’突出（一本鎖部分）を含む複合体を使用する、ハイブリッド核酸および組換え核酸の生成に関する。本方法は、（ＲＮＡから生じる）複合体の生成が、サーモサイクリング（例えば、ＰＣＲ）を必要としない点において便利であり；このように、これらの方法は、時々、一般に「等温（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ）」であるといわれるが、この用語は、反応温度のいずれかおよび全てが同じでなければならないことを示さない（しかし、本明細書中で記載されるように、所定の工程またはさらには２個以上の一連の工程について、反応温度は、（そうである必要はないが）同じであり得る）。本発明の方法はまた、ハイブリッド核酸分子および組換え核酸分子の作製に有用な複合体の生成に関する。この方法は、少なくとも１つの３’一本鎖ＤＮＡ部分（突出）を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を生成する工程を包含し、この複合体は、その後の反応の基質として有用である。この反応としては、受入分子とのハイブリダイゼーションによりハイブリッド核酸が生成することおよびこのハイブリッド核酸からの組換え核酸（ポリヌクレオチド）の生成が挙げられる。

この方法は、一般に、特別に設計されたプライマー（一般に、１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ混成プライマー）を使用し、ＲＮＡテンプレートから、所定配列またはランダム配列の３’ＤＮＡ一本鎖末端（突出）を含む第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡの複合体の部分的に二本鎖の複合体を生成することを含む。３’一本鎖部分は、一般に、混成プライマーのＲＮＡ部分の相補体を含む。３’一本鎖部分は、この方法のその後の工程（例えば、組換え）の基質である。

一般に、複合体は、以下のように形成される：ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、ＲＮＡテンプレートから、以下のように生成される：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１混成プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を末端に含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する薬剤（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断し、第２プライマー伸長産物の３’一本鎖部分（突出）を残し、この３’一本鎖部分は、本発明の方法のさらなる工程の基質として使用され得る。１つの実施形態において、第２プライマー伸長産物合成を開始する第２プライマーは、ＲＮＡテンプレートのフラグメントである。本明細書中で使用される場合、「二本鎖ｃＤＮＡ」は、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体をいい、そして「ｃＤＮＡ」は、本明細書中で定義されるポリヌクレオチドである。従って、本発明の方法は、サンプルにおける複数のＲＮＡ配列からの配列を含む部分的に二本鎖の複合体（この複合体のそれぞれが、混成プライマーの５’ＲＮＡ部分の相補体である３’一本鎖部分を含む）の収集物の生成に使用され得る。

本発明の方法に従う混成プライマーは、一般に標的ＲＮＡにハイブリダイズし得るように設計される、３’ＤＮＡ部分を含む。ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズし得る配列は、部分的に二本鎖の複合体が生成されるＲＮＡテンプレートを定義する。例えば、混成プライマーは、全てのｍＲＮＡサンプルのポリＡテイルにハイブリダイズすると予想されるポリｄＴ配列を含み得るか、または、混成プライマーは、一般にランダム配列にハイブリダイズし得る少なくとも３’部分を含み得、その結果、ランダムプライマー部分は、テンプレートのランダムな部分にハイブリダイズする。幾つかの実施形態において、このプライマーは、混成プライマーが標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする条件下で標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしない５’部分をさらに含む。別の局面において、本発明の方法は、特定のＲＮＡ種またはＲＮＡ種のクラス（例えば、ＲＮＡ種のファミリーまたはスーパーファミリー）からの、部分的に二本鎖の複合体の生成のために使用され得る。後者の場合、混成プライマーは、一般に特定のＲＮＡ標的（またはＲＮＡ標的のファミリー）の配列に相補的な３’部分を含む。幾つかの実施形態において、混成プライマーの部分（例えば、５’ＲＮＡ部分）は、混成プライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズする条件下で、ｍＲＮＡのような標的ＲＮＡ（プライマーが標的ＲＮＡに結合した場合テイルを構成する）にハイブリダイズ不能な（ハイブリダイズし得ない）配列を含み得る。この非ハイブリダイズテイルは、時々、「所定の」配列と呼ばれる。

標的ＲＮＡは、翻訳可能なＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡを含む、任意のＲＮＡであり得る。ＲＮＡ標的はまた、当該分野で公知の方法（Ｋｕｒｎ，米国特許第６，２５１，６３９Ｂ１号を含む）を使用して、任意のＤＮＡ供給源（ゲノムＤＮＡを含む）から生成され得る。幾つかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートの転写によって調製され、ＤＮＡテンプレート（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む）のＲＮＡ成分を作製する。Ｋｕｒｎ，米国特許第６，２５１，６３９Ｂ１号；Ｋｕｒｎ，米国特許公報第２００２／００５８２７０Ａ１号を、参照のこと。従って、本明細書中に記載される方法に従って調製される３’一本鎖部分を含む部分的に二本鎖のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡのＲＮＡコピーから生成され得、従って、一般にｍＲＮＡには見出されない、非転写配列（例えば、イントロン、調節エレメントおよび制御エレメント、偽遺伝子など）を含む。明らかなように、３’一本鎖部分を含む部分的に二本鎖のＤＮＡは、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子非翻訳ＲＮＡ、疾患機構に関わる非翻訳ＲＮＡ、および遺伝子調節において機能する非翻訳ＲＮＡを含む、非翻訳ＲＮＡ配列から生成され得る。３’一本鎖部分を含む部分的に二本鎖のＤＮＡはまた、ゲノム内に存在する外因性エレメント（例えば、ウイルス配列）から生成され得る。

上述のように、部分的に二本鎖のＤＮＡの３’一本鎖部分（混成プライマーのＲＮＡ部分の相補体である）は、本発明の方法におけるさらなる工程のためのテンプレートとして作用する。この工程は、例えば、二本鎖ＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖３’部分を受入分子（一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡであり得、本明細書中に記載される本発明の方法に従って生成された一本鎖３’部分を含む二本鎖ＤＮＡを含み得る）とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成されること、およびハイブリッド核酸からの組換え核酸の生成である。幾つかの実施形態において、３’一本鎖部分は、所定の配列（すなわち、テンプレート核酸に一般にハイブリダイズ不能な配列である、公知の配列）を含み得る。ハイブリッド分子は、ニック（部分的に二本鎖の複合体のハイブリダイズされた３’末端および受入分子の５’末端に隣接するか、もしくはその逆で作製される）またはギャップを有する。これらのニックまたはギャップは、例えば、ハイブリダイズ可能な配列の長さが３’突出の長さより短い場合、または二重鎖の３’末端および／もしくは受入分子の５’末端においてヌクレオチドがハイブリダイズしない場合、作製される。従って、幾つかの実施形態において、３’一本鎖部分の全体が、受入分子とハイブリダイズする。他の実施形態において、３’一本鎖部分（突出）の一部が、受入分子とハイブリダイズする。従って、本明細書中で記載される複合体の一本鎖３’部分をハイブリダイズする工程に対する参照は、必要なアニーリングが達成される限り、一本鎖３’部分の全てまたは一部（部分）のハイブリダイゼーションをいう。幾つかの場合、組換え産物が生成される場合、例えば、核酸の組換え（結合）を達成する他の機能（例えば、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ）が存在する場合、ハイブリダイゼーションの程度は最小限であり得る。

本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドの組換えのための方法を提供する。組換えは、本明細書中に記載される本発明の方法に従い得る。当該分野に公知の任意の方法がまた、使用され得ることが意図される。組換えポリヌクレオチドは、例えば、本明細書中でさらに記載されるように、所望の特性をスクリーニングおよび／または選択するために有用である。本明細書中で使用される場合、そして当該分野で公知であるように、「組換え産物」は、３’一本鎖部分および受入分子を含む部分的に二本鎖のＤＮＡに対応する配列を含む、連続の（完全に結合した）ポリヌクレオチドをいう。

従って、本発明の方法の主要な利点の１つは、それぞれが所定の３’突出またはランダムな３’突出と連結する、ｍＲＮＡ（または他のＲＮＡ標的）プールからの配列を含む３’一本鎖部分を含む部分的に二本鎖の複合体を作製する能力である。プライマー設計に依存して、複合体は、目的の特定のＲＮＡ配列から生成され得るか、または多数のＲＮＡ（例えば、関連ＲＮＡのファミリーのメンバー）から生成され得る。本発明の方法はまた、非常に多数のＲＮＡの（サンプル中の全てのｍＲＮＡ配列を含む）からの複合体の生成にも適する。幾つかの実施形態において、ｍＲＮＡプールからの配列を含む二本鎖複合体は、単一の混成プライマーを使用して生成される。

上述のように、本発明の方法は、サーモサイクリングを必要とせず、全ての工程は等温で行われ得るが、種々の工程が、異なった温度で行われ得る。この特徴は、自動化を容易にすることおよびハイスループット手順の適応を含む、多くの利点をもたらす。この等温な反応は、サーマルサイクリングにより与えられるよりも速く、そして本発明の方法を小型デバイスにおいて行うのに適する。

本明細書中で使用される場合、「ｃＤＮＡ」または「二本鎖ＤＮＡ」は、一般に、ポリヌクレオチドである（つまり、ポリヌクレオチドを包含する）。用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡを呼び得、これを含み得るが、用語「ポリヌクレオチド」は、用いる文脈によって決定されることは、本明細書中の記載から明らかである。例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長は、一般に、ＤＮＡ分子の生成をいうが、用語「ＤＮＡ」は、（この文脈において、例えば）他の型の塩基、アナログ、結合などを含む分子（例えば、ポリメラーゼによってポリマー中に組み込まれ得る任意の基質）を除外することを意味しない。同様に、本明細書中で使用される場合、「二本鎖複合体」、「ＤＮＡ部分的二重鎖」、「３’一本鎖部分を含む複合体」、「３’一本鎖領域を含む二本鎖ＤＮＡ」、「３’突出を含む二本鎖ｃＤＮＡ」、および「３’一本鎖ＤＮＡ部分を含むハイブリダイズした第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物」は、交換可能に使用され、ポリヌクレオチドをいう（包含する）。

（一般的技術）
本発明の方法の実行は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術（これらは、当該技術の範囲内である）を用いる。このような技術は、文献において完全に説明される。例えば、以下である：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７，および定期的更新）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）。

本発明において使用されるプライマー、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的技術を用いて生成され得る。

（定義）
本明細書中で使用される場合、「標的配列」、「標的核酸」または「標的ＲＮＡ」は、３’一本鎖部分を含む二本鎖複合体の生成が所望される、目的の配列を含むポリヌクレオチドである。この標的配列は、実際の配列に関して、既知であっても未知であってもよい。いくつかの例において、用語「標的」、「テンプレート」およびこれらのバリエーションは、交換可能に使用される。

本明細書中で使用される場合、「増幅」は、一般に、所望の配列の複数のコピーを生成するプロセスをいう。「複数のコピー」は、少なくとも２コピーを意味する。「コピー」は、テンプレート配列への完全な配列相補性または完全な同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシイノシン）、意図的配列変更（例えば、テンプレートにハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列変更またはプライマーを介して導入される非標的配列）および／またはプライマー伸長の間に生じる配列エラーを含み得る。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書中で交換可能に使用されて、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは改変塩基、および／またはこれらのアナログあるいはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログ）を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーの組立の前またはその後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合体化によって、重合後にさらに改変され得る。他の型の改変としては、例えば、「キャップ」、アナログによる１個以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カバメート（ｃａｂａｍａｔｅ）など）、および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）での改変、ペンダント部分（例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン（ｐｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）など）を含む改変、介在因子（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）（例えば、アクリジン、ソラレンなど）での改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変された結合（例えば、αアノマー核酸など）での改変）、ならびにポリヌクレオチドの非改変形態が挙げられる。さらに、糖に元々存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置換され得るか、標準的な保護基によって保護され得るか、またはさらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するために活性化され得るか、あるいは固体支持体上に結合体化され得る。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、一般に当業者に公知のリボース糖もしくはデオキシリボース糖のアナログ形態を含み得、これらとしては、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−Ｏ−アリル−リボース、２’−フルオロ−リボースもしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロースもしくはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよびむ塩基性（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）が挙げられる。１以上のホスホジエステル結合は、代替の結合基によって置換され得る。これらの代替の結合基としては、以下の実施形態が挙げられるが、これらに限定されない：リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、”（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）によって置換され、ここで、各ＲもしくはＲ’が、独立して、Ｈであるか、または置換されたかもしくは置換されていないアルキル（１〜２０個のＣ）であり、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を必要に応じて含む、実施形態。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含め、本明細書中で言及されている全てのポリヌクレオチドに適用される。

本明細書中で使用される場合、「標識ｄＮＴＰ」または「標識ｒＮＴＰ」は、それぞれ、標識に直接的または間接的に結合されたｄＮＴＰまたはｒＮＴＰあるいはそれらのアナログをいう。例えば、「標識」ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰは、例えば、色素および／または検出可能部分（例えば、特定の結合対（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバー）によって直接標識され得る。「標識」ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰはまた、例えば、標識が結合されるおよび／または結合され得る部分に対する結合によって、間接的に標識され得る。ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰは、ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰの伸長産物への取り込みの後に標識が結合され得る部分（例えば、アミン基）を含み得る。本発明において有用な標識としては、ジゴキシゲニン、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性同位元素（例えば、^３Ｈ、^３５Ｓ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^１２５Ｉまたは^１４Ｃ）、酵素（例えば、ＬａｃＺ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、および比色分析標識（例えば、コロイド状金または着色ガラスもしくは着色プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ）が挙げられる。種々の抗リガンドおよびリガンドが（それ自体標識として、または標識に結合するための手段として）使用され得る。天然の抗リガンド（例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾール）を有するリガンドの場合、このリガンドは、標識された抗リガンドと組み合わせて使用され得る。

本明細書中で使用される場合、ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰの「型」は、ヌクレオチドの特定の塩基、すなわち、アデニン、シトシン、チミン、ウリジンまたはグアニンをいう。

本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、短い、一般的に一本鎖の、一般的には約２００ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうである必要はない、一般的に合成のポリヌクレオチドをいう。本発明におけるオリゴヌクレオチドは、混成プライマーを含む。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに等価かつ完全に適用可能である。

本明細書中で使用される場合、「プライマー」は、テンプレート配列（例えば、標的ＲＮＡまたはプライマー伸長産物）にハイブリダイズし、そしてテンプレートに対して相補的なポリヌクレオチドの重合を促進し得る遊離の３’−ＯＨ基を一般に有するヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド）をいう。「プライマー」は、例えば、オリゴヌクレオチドであり得る。これはまた、例えば、テンプレート自体中の配列に（例えば、ヘアピンループとして）ハイブリダイズし、そしてヌクレオチドの重合を促進し得るテンプレート（例えば、プライマー伸長産物またはテンプレート−ＤＮＡ複合体のＲＮａｓｅ切断後に作製されるテンプレートのフラグメント）の配列であり得る。従って、プライマーは、外因性（例えば、付加された）プライマーまたは内因性（例えば、テンプレートフラグメント）プライマーであり得る。

本明細書中で使用される場合、「ランダムプライマー」は、必ずしもサンプル中の特別または特定の配列に基づいて設計されないが、むしろランダムプライマーの配列がサンプル中の１個以上の配列に（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得る統計的期待値（または経験的観察）に基づく配列を含むプライマーである。ランダムプライマー（またはその相補体）の配列は、天然に存在してもしなくてもよく、または目的のサンプル中の配列のプールに存在してもしなくてもよい。単一の反応混合物中の複数のＲＮＡ種からのこの二本鎖複合体の生成は、一般に、必ずしもそうではないが、多数の、好ましくは非常に多数のランダムプライマーを使用する。当該分野で十分理解されるように、「ランダムプライマー」はまた、所望の数および／または有意な数の標的配列にハイブリダイズするように集合的に設計されるプライマーの集団（複数のランダムプライマー）のメンバーであるプライマーをいい得る。ランダムプライマーは、核酸配列の複数の部位でハイブリダイズし得る。ランダムプライマーの使用は、標的の正確な配列の先立つ知識を必要としない、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なプライマー伸長産物を生成するための方法を提供する。

「複合体」は、構成要素の集合体である。複合体は、安定であってもなくてもよく、そして直接的もしくは間接的に検出され得る。例えば、本明細書中に記載される場合、反応の特定の所定の構成要素、および反応産物の型を考慮して、複合体の存在が推測され得る。本発明の目的のために、複合体は一般に、最終のハイブリダイズした核酸および／または組換え産物に関して中間体である。複合体の例は、第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物を含む核酸二重鎖である。

本明細書中で交換可能に使用される、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの「部分」または「領域」は、２以上の塩基の連続配列である。他の実施形態において、領域または部分は、少なくとも約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０以上のいずれかの連続ヌクレオチドである。

別の配列に「隣接する」、領域、部分または配列は、その領域、部分または配列に直接接する。例えば、混成プライマーの５’ＤＮＡ部分に隣接するＲＮＡ部分は、その領域に直接接する。この例の説明については、図１Ａおよび図２Ａを参照のこと。

「反応混合物」は、適切な条件下で反応して複合体（中間体であり得る）および／または産物を形成する、構成要素の集合である。

「１つの」（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」など）は、他に示さない限り、複数形を含む。「１つの」フラグメントは、１以上のフラグメントを意味する。

特許法の確立した原則に従い、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味する。

事象（例えば、ハイブリダイゼーション、鎖の伸長など）が生じるのを「可能にする」条件または事象を生じるのに「適切な」条件、あるいは「適切な」条件は、このような事象が生じるのを妨げない条件である。従って、これらの条件は、事象を可能にする、増強する、容易にするおよび／または助長する。当該分野で公知かつ本明細書中に記載されるこのような条件は、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温度、および緩衝液条件に依存する。これらの条件はまた、所望される事象（例えば、ハイブリダイゼーション、切断、鎖の伸長、ハイブリダイゼーションまたは組換え）に依存する。

本明細書中で使用される場合、配列「変異」は、参照配列と比較した、目的の配列中の任意の配列変更をいう。参照配列は、野生型の配列または目的の配列の比較が望まれる配列であり得る。配列変異としては、置換、欠失または挿入のような機構に起因する、配列中の単一ヌクレオチド変化または１より多いヌクレオチドの変更が挙げられる。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）もまた、本明細書中で使用されるような配列変異である。配列変異は、標的配列に天然に存在し得るか、または配列のインビトロ操作（例えば、低忠実度のポリメラーゼを使用する配列コピーの生成および当該分野で公知の他の方法）により組み込まれ得る。

「マイクロアレイ」および「アレイ」は、本明細書中で交換可能に使用される場合、未決定の特徴をしばしば有する生化学的サンプル（標的）に対する推定結合（例えば、ハイブリダイゼーションによる）部位のアレイ、好ましくは整列されたアレイを有する表面を含む。好ましい実施形態において、マイクロアレイは、基板上の規定された位置で固定化された別個のポリヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブの集合体をいう。アレイは、紙、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、光ファイバーまたは任意の適切な他の固体支持体もしくは半固体支持体のような材料で製造され、そして平面（例えば、ガラス板、シリコンチップ）または三次元（例えば、ピン、繊維、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー）構成で構成される基板上に形成される。アレイを形成するプローブは、以下を含む任意の数の方法によって基板上に結合され得る：（ｉ）写真平板術を使用するインサイチュ合成（例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ）（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）、２５１：７６７−７７３；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）、９１：５０２２−５０２６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）、１４：１６７５；米国特許第５，５７８，８３２号；同第５，５５６，７５２号；および同第５，５１０，２７０号を参照のこと）；（ｉｉ）ガラス、ナイロンまたはニトロセルロース上の低密度の媒体（例えば、ｃＤＮＡプローブ）でのスポッティング／印刷（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）、２７０：４６７−４７０；ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６）、１４：４５７−４６０；Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（１９９６）、６：６３９−６４５；およびＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５）、９３：１０５３９−１１２８６）；（ｉｉｉ）マスキングによる方法（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２）、２０：１６７９−１６８４）ならびに（ｉｖ）ナイロンまたはニトロセルロースのハイブリダイゼーション膜上のドットブロットによる方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）を参照のこと）。プローブはまた、アンカーに対するハイブリダイゼーションによって、磁気ビーズによって基板上に、またはマイクロタイターウェルもしくはキャピラリーのような液体相に、非共有的に固定化され得る。このプローブ分子は、一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびｃＤＮＡのような核酸であるが、標的分子に特異的に結合し得る、タンパク質、ポリペプチド、オリゴ糖、細胞、組織およびこれらの任意の置換をまた含み得る。

用語「３’」は、一般に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または部分から３’側（下流）の、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または部分をいう。

用語「５’」は、一般に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または部分から５’側（上流）の、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または部分をいう。

用語「３’−ＤＮＡ部分」、「３’−ＤＮＡ領域」、「３’−ＲＮＡ部分」および「３’−ＲＮＡ領域」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’末端側に位置するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの部分または領域をいい、そして同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドに結合した最も３’側のヌクレオチドまたは部分を含んでも含まなくてもよい。最も３’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜約５０、より好ましくは約１０〜約４０、なおより好ましくは約２０〜約３０ヌクレオチドであり得る。

用語「５’−ＤＮＡ部分」、「５’−ＤＮＡ領域」、「５’−ＲＮＡ部分」および「５’−ＲＮＡ領域」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端側に位置するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの部分または領域をいい、そして同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドに結合した最も５’側のヌクレオチドまたは部分を含んでも含まなくてもよい。最も５’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜約５０、より好ましくは約１０〜約４０、なおより好ましくは約２０〜約３０ヌクレオチドであり得る。

本明細書中で使用される場合、「ハイブリッド核酸分子」は、ハイブリダイズした部分的に二本鎖の複合体および受入分子（これは、本発明の方法を使用して作製される第２の部分的に二本鎖の複合体であり得る）をいう。本明細書で使用される「受入分子」は、少なくとも１つの３’突出を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体がハイブリダイズするポリヌクレオチドである。

本明細書中で使用される場合、「組換え産物」は、３’一本鎖部分および受入分子を含む部分的に二本鎖の複合体に対応する配列を含む、連続的な（完全に結合した）ポリヌクレオチドをいう。組換え産物は、３’一本鎖部分および受入分子を含む部分的に二本鎖の複合体に対応する全ての配列を含み得るが、含まなくともよく、本明細書中に記載される組換え産物を生成する方法の幾つかが、元の部分的に二本鎖の複合体（３’突出を含む）および受入分子に対応する配列の欠失および／または変異を生じるからである。「核酸の組換え」は、組換え産物の産生をいう。これは、本明細書中で記載されるように、多くの方法（ライゲーションを含む）のいずれかにより達成され得る。

（３’突出を含む部分的に二本鎖の複合体を使用する本発明の方法）
以下は、本発明の方法の実施例である。上で提供された一般的記載を考慮して、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解される。例えば、混成プライマー手段の使用への言及は、本明細書中で使用される任意の混成プライマーが本明細書中で使用され得ることを意味する。

本発明の方法は、ＲＮＡテンプレートからの、所定配列のまたはランダム配列の３’ＤＮＡ一本鎖部分（突出）を含む部分的に二本鎖の複合体を含む、複合体の産生を含む。複合体（全体または一部）の３’一本鎖末端は、受入核酸と呼ばれる第２の核酸の３’一本鎖部分にハイブリダイズ可能である。この受入核酸は、一本鎖または３’一本鎖部分を含む第２の部分的に二本鎖の複合体（これは、本明細書中に記載される本発明の方法に従う、３’一本鎖突出を含む第２の部分的に二本鎖の複合体であり得る）であり得る。複合体の３’一本鎖部分と第２の核酸とのハイブリダイゼーションは、ハイブリッド（アニールした）核酸を生成する。組換え核酸（これは表面に固定化され得る）は、当該分野に公知であり、そして本明細書中で記載されるような、多くの方法のうちのいずれかで、ハイブリッド核酸から生成される。

組換え産物の使用は、当該分野で公知であり、その後の組換え産物のスクリーニングおよび／または選択、ならびに本明細書中で記載されるさらなる使用を含む。これらの使用は、本発明に包含される。

平易のために、３’一本鎖部分（突出）を含む部分的に二本鎖の複合体の生成のための方法は、ハイブリッド核酸の生成および組換え産物の作製の方法とは、別々に記載される。複合体の生成のための各方法は、ハイブリッド核酸および／または組換え産物の生成のための各方法に適用可能であり、逆もまた適用可能であることが、理解される。

（３’一本鎖配列を含む部分的に二本鎖の複合体を含む複合体の形成）
図１Ａは、ＲＮＡテンプレートからの３’一本鎖ＤＮＡ配列を含む部分的に二本鎖のＤＮＡの形成のための方法の１つの実施形態の図解を示す。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）片方の端にＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖を含む二本鎖ｃＤＮＡの形成は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１混成プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中のＲＮＡを、切断する工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を端に含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；ならびに（ｂ）ＲＮＡ−ＤＮＡへテロ二重鎖中のＲＮＡを切断し、３’一本鎖ＤＮＡ部分（交換可能に「突出」と呼ばれる）を含む部分的に二本鎖のＤＮＡを生成する、工程。説明されるように、全ての工程は等温であるが、各工程の温度は、同じであっても同じでなくてもよい。本発明の方法は、サーモサイクリング（すなわち、ＰＣＲ）を必要とせず、そしてテンプレートＲＮＡおよび第１プライマー伸長産物の複合体は、温度変性を使用して変性されも分離されもしない。

図１Ａで説明される実施形態は、２つのオリゴヌクレオチドを使用する：混成プライマー（１と記す）；第２プライマー（２と記す）、これらは、第２プライマー伸長産物（交換可能に「第２鎖ｃＤＮＡ」と呼ぶ）の形成のために使用される。

これらの図において示されるように、この混成プライマー１は、その３’末端にＤＮＡ部分Ａを、そしてその５’末端にＲＮＡ部分Ｂを含む。本明細書中で記載されるように、３’ＤＮＡ部分の後にその５’の方向でＲＮＡ部分が続き、その後にＤＮＡ部分が続く、混成プライマーを使用することも可能である。これらの各部分の長さは、一般に、３’一本鎖ＤＮＡ配列を含む部分的に二本鎖の複合体の形成、および３’一本鎖末端によって媒介される部分配列組換えの最大の効率のために、決定される。２部分のみ（すなわち、３’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−５’）の混成プライマーが、図１Ａ、図１Ｂおよび図２Ａ〜図２Ｂに示される。

混成プライマーの５’部分は、標的配列にハイブリダイズ可能であってもなくてもよい。幾つかの実施形態において、混成プライマー１の５’部分（図１Ａおよび図１Ｂならびに図２Ａに示す）は、プライマーが標的にハイブリダイズする場合、標的配列にハイブリダイズ可能でない配列（例えば、「テイル」を形成する配列）を、含む。一般に、５’部分は、第１プライマー伸長産物（第１鎖ｃＤＮＡ）内に組み込まれ、そして二本鎖ＤＮＡの複合体の３’突出（一本鎖ＤＮＡ部分）は、混成プライマーの５’部分の相補体を含む。本明細書中で記載されるように、一本鎖ＤＮＡ部分は、部分配列ハイブリダイゼーションおよび組換えのための基質である。別の実施形態において、第１プライマーの５’部分は、標的ＲＮＡにハイブリダイズ可能である。第１プライマーの５’部分は、複合体と第２核酸との間で、どの型、どのクラス、どの集団、および／またはどの種の組換えが所望されるかに依存して、多くの方法のいずれかで、（配列に関して）設計され得る。上述のように、生じた部分的に二本鎖のＤＮＡ複合体における突出の長さおよび配列は、標的ＲＮＡに結合する混成プライマーの、ＲＮＡ部分の長さおよび配列によって、決定される。この長さは、一般に、少なくとも２リボヌクレオチド長であるが、以下で議論されるように、より長いＲＮＡ部分が、本発明によって企図される。

５’部分の配列は、公知であり得（「所定の配列」と呼ばれる）、そして幾つかの実施形態において、制限酵素切断部位を含む。所定の配列は、公知の配列または公知の配列のファミリー（例えば、キナーゼドメイン）にハイブリダイズ可能であるように選択され得る。幾つかの実施形態において、５’所定配列は、この配列がテンプレートＲＮＡにハイブリダイズ可能であると予測されないという意味で、独特の配列であり得る。他の実施形態において、５’部分はランダム配列である。また他の実施形態において、５’部分は、所定の配列およびランダム配列を含む。ＲＮＡ部分の配列は、例えば、二本鎖ＤＮＡの制限酵素切断によって生成された３’一本鎖突出に対応する配列（この３’一本鎖突出にハイブリダイズ可能な配列の相補体）を含むように選択され、これにより、制限酵素で切断された受入分子に、複合体をハイブリダイゼーションさせ得る。本明細書中で使用される場合、３’一本鎖に「対応する」配列は、一般に、３’一本鎖突出配列の相補体にハイブリダイズ可能な配列である。

３’突出はまた、所定の３’突出領域を有する受入分子（交換可能に「受入核酸」と呼ばれる）とハイブリダイズするように選択され得る。所定の領域は、独特の配列であり得、その結果、ハイブリダイゼーションは、一般に、同じ独特の配列を含む受入分子と起こる。あるいは、所定の配列は、受入分子または受入分子のファミリーもしくは関連した受入分子（例えば、遺伝子ファミリーまたはスーパーファミリー）の３’末端に存在する配列に、ハイブリダイズ可能な配列に対応し得る。別の実施形態において、３’突出は、ランダムであり、従って、ハイブリダイゼーション工程の複雑性は、大いに上昇する（例えば、潜在的にハイブリダイズ可能な受入分子の数に関して）。

３’突出はまた、種々の長さの挿入物（３’突出に含まれる配列に対応する）によって組換え産物を産生するように選択され得る。例えば、３’突出を含む部分的に二本鎖の複合体が、３’独特配列（標的ＲＮＡに存在する配列ではないが、むしろ付属の３’配列を成すという意味）を含む受入分子にハイブリダイズされる場合、独特配列に対応するヌクレオチドは、組換え産物に挿入される。別の例において、３’突出が、第１混成プライマーにおけるランダム配列に対応する場合、一般に、組換え産物は、ランダム配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチドを含む。

しかし、３’末端が、標的ＲＮＡ内に存在する配列から生成される場合、ハイブリダイゼーションは、標的ＲＮＡに対応する二本鎖部分を作製し、そして新規のヌクレオチドは、一般に、最終組変え産物内に挿入されない。

部分的に二本鎖の複合体の３’末端と受入側の３’末端とは、完全な相補性でハイブリダイズする必要はなく、複合体と受入分子とのハイブリダイゼーションの間使用されるストリンジェンシーのレベルに依存する。適切なハイブリダイゼーション条件の選択は、本明細書中でさらに記載される。低減されたストリンジェンシーの使用は、互いにハイブリダイズしようとする、３’突出の数を増加させることが理解される。

さらに、部分的に二本鎖の複合体の３’末端および受入分子の３’末端は、同じ長さである必要はない。１つ以上のギャップが、ハイブリダイゼーション後に存在し得、本明細書中で記載される種々の方法を使用して埋められ得る。

３’末端もまた、部分的に二本鎖の複合体と受入分子との間のハイブリダイゼーションが、定方向的であるように、選択され得る。例えば、部分的に二本鎖の複合体分子の集団および受入分子の第２集団（これもまた、部分的に二本鎖の複合体分子であり得る）は、ハイブリダイゼーションが、互いに関して、特別な特定の方向性であるように、生成され得る。

上述のように、ランダム５’ＲＮＡ部分に対応する３’末端の使用は、全ての方向性のハイブリダイゼーションを許容する（従って、組換えの複雑性を増す）と予測される。

さらに、３’末端の配列は、ハイブリダイゼーションに好適かまたは好適でないように選択され得る。例えば、３’末端のＧＣ含有率の上昇、およびハイブリダイズの能力を上昇または低下させることが公知のヌクレオチドアナログ（ＤＮＡを含む）の使用、ならびに当該分野で公知の他の因子である。

第１混成プライマーの３’部分（テンプレートＲＮＡにハイブリダイズする）は、どの型、どのクラス、どの集団、および／またはどの種のＲＮＡが、部分的に二本鎖のＤＮＡ複合体（３’一本鎖領域を含む）内に組み込まれることが所望されるかに依存して、多くの方法（配列に関する）のいずれかで設計され得る。幾つかの実施形態において、混成プライマー１の３’部分（図１および図２に示す）は、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含み、さらに３’部分の３’末端に、さらなるランダム配列（一般に、ポリＡ配列と相補的でない）を含み得る。他の実施形態において混成プライマー１の３’部分は、多様なＲＮＡ種、大いに多様なＲＮＡ種または非常に大いに多様なＲＮＡ種に、ハイブリダイズ可能な配列を含むランダムプライマーである。当該分野で公知のランダムプライマーは、例えば、ＰＣＲベースの手順を使用するｃＤＮＡライブラリーの調製において、広範に使用されている。当該分野でよく理解されているように、「ランダムプライマー」は、プライマー集団（多数のランダムプライマー）のメンバーであるプライマーをいい、これは所望の標的配列および／または有意の数の標的配列にハイブリダイズするように、集合的に設計される。ランダムプライマーは、核酸配列上の多くの部位でハイブリダイズし得る。他の実施形態において、混成プライマー１の３’部分は、特定のＲＮＡまたは特定のＲＮＡのファミリー（またはこれらの部分）にハイブリダイズ可能な配列を含み得る。

幾つかの実施形態において、混成プライマー１は、同じ５’ＲＮＡ部分および目的のＲＮＡ配列（２以上〜何百または何千以上に及び得る）の多様性を拡大するための選択された多様な３’ＤＮＡ部分を含む、異なった混成プライマーの混合物である。

第２プライマーは、第１ＤＮＡ鎖にハイブリダイズし得る任意の配列であり、この第２プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより、第１プライマー伸長産物に沿って伸長され得、第２プライマー伸長産物を作製する。図１Ａ〜図１Ｂで示すように、プライマー２は、ＤＮＡから構成され得、そして２つの部分（ｓｅｃｔｉｏｎ）（交換可能に「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」または「領域（ｒｅｇｉｏｎ）」と呼ぶ）を含み得るが、そうである必要はない。プライマー２の３’部分Ｆは、生物学的サンプルにおける多くの、ほとんどの、および／または全ての潜在的なｍＲＮＡ配列のランダムプライミングについて、選択され得る。プライマー２の５’部分Ｅは、特定の標的配列に対し、相補的でなく、実質的にハイブリダイズ可能でない（すなわち、ハイブリダイズせず、テイルを形成する）配列であり得る。「テイル」配列は、一般に、第２プライマー伸長産物内に組み込まれる。他の実施形態において、プライマー２の５’末端部分Ｅは、第１プライマー伸長産物の標的配列にハイブリダイズ可能であり得る。なお他の実施形態において、これは、第１ＤＮＡ鎖中の配列にハイブリダイズされる、第１ＤＮＡ鎖（一般に３’末端に存在する）配列（例えば、ヘアピンまたは自己アニール構造）を含む。

１つの実施形態において、標的ＲＮＡのフラグメントは、第２プライマー伸長産物のプライマーとして作用する。本発明のこの実施形態は、図１Ｂにおいて説明され、以下でさらに議論される。標的ＲＮＡおよび第１プライマー伸長産物を含む最初の複合体中の標的ＲＮＡは、テンプレートＲＮＡの少なくとも１つのフラグメントが、第１プライマー伸長産物にハイブリダイズし続けるように、切断される。幾つかの実施形態において、切断は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡ切断を行う酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）のような薬剤を使用して、なされる。本発明のこの局面において、１つ以上のテンプレートＲＮＡフラグメントは、上述の様式において、第２の「プライマー」として寄与し、上述の方法において、第２プライマー伸長産物と同じ機能を有する、フラグメント伸長産物を生成する。本発明の方法において適切なＲＮＡフラグメントは、第１鎖ｃＤＮＡから分解されないために十分な長さであり、好ましくは約３ヌクレオチド長〜約１０ヌクレオチド長、より好ましくは約５ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長、なおより好ましくは約１０ヌクレオチド長〜約２０ヌクレオチド長、最も好ましくは約１２ヌクレオチド長〜約１７ヌクレオチド長である。テンプレートＲＮＡは、当該分野に周知の方法（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）による切断、熱処理による切断、および化学処理による切断（例えば、アルカリ条件下の処理）を含む）を使用して切断され得る。本明細書中で使用される場合、テンプレート切断は、第１プライマー伸長産物からのテンプレートＲＮＡの分離または変性に十分な熱を使用した、テンプレートＲＮＡと第１プライマー伸長産物との分離（例えば、サーマルサイクラーまたは温度制御インキュベーションの他の手段を使用する）を包含しない。

図１Ａで説明されるように、１つの実施形態において、ＲＮＡテンプレートからの、３’一本鎖ＤＮＡ配列を含む部分的に二本鎖の複合体の形成をもたらす、本発明の方法のプロセスは、以下のようである：
１．プライマー１が、サンプルにおけるＲＮＡ種に、ランダム配列部分Ａ（ｍＲＮＡのポリＡ配列に少なくとも一部基づき得る）のハイブリダイゼーションによって結合し、複合体Ｉを形成する（図１Ａ）。
２．逆転写酵素（「ＲＴ」と示される）が、ハイブリダイズしたプライマー１を、ハイブリダイズされた標的ＲＮＡ鎖に沿って伸長し、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成する。薬剤（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）は、ハイブリッド二重鎖の標的ＲＮＡ鎖を分解し、一本鎖第１鎖ｃＤＮＡ（「ＩＩ」と記す）を生成する。ＩＩの５’末端は、プライマー１である。
３．プライマー２が、ランダム配列Ｆのハイブリダイゼーションによって、第１鎖ｃＤＮＡ（ＩＩ）に結合し、複合体ＩＩＩを形成する。
４．プライマー２は、ＤＮＡポリメラーゼにより第１ｃＤＮＡ鎖ＩＩに沿って伸長され、二本鎖産物を形成する（「ＩＶ」と記す）。プライマー伸長は、ＩＩの５’ＲＮＡ部分に沿い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）により、複合体ＩＶの一端でのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド部分の形成をもたらす。ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性は、同じ酵素で提供され得る。

ＲＮａｓｅ Ｈは、複合体ＩＶの一端で、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解し、混成プライマー１の部分Ｂの相補体である配列を有する３’ＤＮＡ一本鎖末端により、部分的に二本鎖の複合体（「Ｖ」と記す）を作製する。ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって供給され得るか、または異なった酵素で提供され得る。この方法に有用な逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有しても有さなくてもよい。第２プライマー伸長工程に使用されるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、第１プライマー伸長産物の５’ＲＮＡ部分の複製のための逆転写活性を供給し得るが、または第２の酵素がこれを提供し得る。

図１Ｂは、標的ＲＮＡのフラグメントが、第２プライマー伸長産物のプライマーとして作用する、本発明の実施形態を説明する。図１Ｂにおいて示されるように、単一の（混成）プライマー（「１」と記す）は、標的ＲＮＡ上の配列に相補的な３’ＤＮＡ部分（「Ａ」と記す）および非標的関連配列（すなわち、相補的でないか、または所定の１組の条件下で「Ａ」がハイブリダイズする下で標的ＲＮＡ上の配列にハイブリダイズ可能でない）を含む５’−ＲＮＡ部分（「Ｂ」と記す）から構成され得る。混成プライマーの３’−ＤＮＡ部分は、ポリ−ｄＴヌクレオチドを含み得、この混成プライマーを、真核細胞に由来するｍＲＮＡのポリ−Ａ ３’末端に対し、相補的／ハイブリダイズ可能（所定の条件下で）にする。
１．標的ＲＮＡにハイブリダイズされる混成プライマー１（図１Ｂにおける複合体「Ｉ」）は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって伸長され、標的ＲＮＡおよび第１鎖ｃＤＮＡのＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二重鎖（図１Ｂにおける複合体「ＩＩ」）を形成する。
２．ついで、標的ＲＮＡが、例えばリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）の使用によって分解され（断片化され）、第１鎖ｃＤＮＡおよび１つ以上のＲＮＡフラグメント（オリゴヌクレオチド）の複合体（図１Ｂにおける複合体「ＩＩＩ」）を形成する。このフラグメントは、ヘテロ二重鎖における標的ＲＮＡの不完全な分解の結果である。
３．これらのフラグメントは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして機能し、第２鎖ｃＤＮＡを形成する。ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８２），２：１６１；ならびにＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ（１９８３），２５：２６３。次いで、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）が、二重鎖における第２鎖ｃＤＮＡの３’末端を、混成プライマー伸長産物の５’−ＲＮＡ配列に沿って伸長し、二本鎖ｃＤＮＡ産物の末端において、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を形成する（図１Ｂにおける複合体「ＩＶ」）。
４．二本鎖ｃＤＮＡの末端におけるヘテロ二重鎖は、ＲＮａｓｅ Ｈの基質である。ＲＮａｓｅ Ｈは、複合体ＩＶの一端でＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解し、混成プライマー１の部分Ｂの相補体である配列を有する３’ＤＮＡ一本鎖末端を有する部分的に二本鎖の複合体（「Ｖ」と記す）を形成する。

本発明の方法は、サンプル中の複数のＲＮＡ配列に由来する配列を含む、部分的に二本鎖の複合体の「ライブラリー」の産生のために使用され得る。例えば、混成プライマーは、サンプル内の全てのｍＲＮＡのポリ−Ａテイルにハイブリダイズすることが予測されるポリ−ｄＴ配列を含み得るか、または、混成プライマーは、一般に、ランダム配列にハイブリダイズ可能な少なくとも３’部分を含み得、このランダムプライマー部分がテンプレートのランダム部分にハイブリダイズする。別の局面において、本発明の方法は、特異的ＲＮＡ種またはＲＮＡ種のクラス（例えば、ＲＮＡ種のファミリーまたはスーパーファミリー）からの部分的に二本鎖の複合体の生成のために使用され得る。この後者の場合において、混成プライマーは、一般に、特異的ＲＮＡ標的（またはＲＮＡ標的のファミリー）の配列に相補的な３’部分を含む。

便宜上、第１プライマー伸長産物（第１鎖ｃＤＮＡ）および第２鎖プライマー伸長産物（第２鎖ｃＤＮＡ）は、図１Ａ、図１Ｂ、および図２で記載および説明される。本発明の方法は、１つのＲＮＡ配列の二重鎖コピーを含む部分的に二本鎖の複合体の生成だけでなく、同一の標的ＲＮＡ分子または異なった標的ＲＮＡ分子上に位置する、１より多い異なった特異的核酸配列からの複合体の生成にもまた、同時に有用である。

本明細書中で記載されるように、部分的に二本鎖の複合体は、当該分野で公知の方法（Ｋｕｒｎ，米国特許第６，２５１，６３９号が挙げられる）を用いてそれ自体ＤＮＡ供給源（例えば、ゲノムＤＮＡ）から生成されたＲＮＡ標的から生成され得る。従って、本明細書中の方法に従って調製される二本鎖複合体は、ゲノムＤＮＡのＲＮＡコピーに対応し得、そしてそれにより、一般にｍＲＮＡ中に存在しない非転写配列（例えば、イントロン、調節エレメントおよび制御エレメントなど）を含む。明白に、３’一本鎖部分を含む部分的に二本鎖のＤＮＡは、非翻訳ＲＮＡ配列から生成され得、これらの非翻訳ＲＮＡ配列としては、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子非翻訳ＲＮＡ、疾患メカニズムに関する非翻訳ＲＮＡ、および遺伝子調節において機能する非翻訳ＲＮＡが、挙げられる。

（２つの３’一本鎖配列を含む部分的に二本鎖のＤＮＡを含む複合体の形成）
ＲＮＡテンプレートからの２つの３’一本鎖ＤＮＡ配列を含む部分的に二本鎖のＤＮＡの形成の１つの実施形態の図解を、図２Ａおよび図２Ｂに示す。この方法は、（ａ）ＲＮＡ−ＤＮＡへテロ二重鎖をｃＤＮＡの各末端に含む二本鎖ｃＤＮＡの形成は、以下のようである：（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡにハイブリダイズされる第１混成プライマーを伸長することにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の複合体中でＲＮＡを切断する工程；（ｉｉｉ）第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２混成プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、ＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二重鎖を各末端に含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；および（ｂ）ＲＮＡ−ＤＮＡへテロ二重鎖におけるＲＮＡを切断し、２つの３’一本鎖ＤＮＡ部分（または突出）を含む部分的に二本鎖の複合体を生成する工程。説明したように、全ての工程は等温であるが、各工程の温度は同じでも異なっていてもよい。便宜上、本発明のこの局面において、第２鎖ｃＤＮＡの生成は、第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズし得る別の混成プライマーを使用して、導入される。本明細書中で使用される場合、用語「ｃＤＮＡ」は、ポリヌクレオチドを含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物をいう。

図２Ａ〜図２Ｂにおいて説明される実施形態は、２つのオリゴヌクレオチドを使用する：第１プライマー伸長産物の形成のために使用される第１混成プライマー（１と記す）；および第２プライマー伸長産物の形成のために使用される第２混成プライマー（２と記す）。第１混成プライマーの５’部分は、一般に、第１プライマー伸長産物内に組み込まれ、そして第２（逆）混成プライマーの５’部分は、第２プライマー伸長産物（第２鎖ｃＤＮＡ）内に組み込まれる。第１混成プライマーおよび第２混成プライマーの５’部分の相補体は、二本鎖ＤＮＡ複合体の２つの３’一本鎖部分のそれぞれを含む。

図２Ａおよび図２Ｂにおいて、「テイル」配列を含む２つの混成プライマーが、使用されて、ｃＤＮＡの各末端に、ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖を含む二本鎖ｃＤＮＡを生成する。ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖からＲＮＡを切断する薬剤によるＲＮＡの切断は、２つの３’ＤＮＡ一本鎖末端を有する部分的に二本鎖の複合体を作製する。

図２Ａにおいて示される混成プライマー２の５’部分は、標的配列または第１プライマー伸長産物にハイブリダイズ可能でない配列（例えば、プライマーが第１プライマー伸長産物にハイブリダイズする場合に「テイル」を形成する配列）を含み得る。幾つかの実施形態において、５’部分は、「所定の」配列であるか、または幾つかの実施形態において、ランダム配列である。混成プライマー２の５’部分は、混成プライマー１の５’部分と同一であっても異なっていてもよい。

ＲＮＡテンプレートからの２つの３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む部分的に二本鎖の複合体の形成をもたらす本発明の方法のプロセスは、以下のようである：
１．混成プライマー１は、配列部分Ａ（少なくとも部分的にｍＲＮＡのポリ−Ａ配列に基づき得る）のハイブリダイゼーションによってサンプル中のＲＮＡ種に結合し、複合体Ｉを形成する。混成プライマー１は、テンプレートｍＲＮＡにハイブリダイズ可能でない「テイル」配列（黒の太線で示される）を含み得るが、含む必要はない。
２．逆転写酵素が、ハイブリダイズしたプライマー１を、ハイブリダイズされる標的ＲＮＡ鎖に沿って伸長し、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成し、ＩＩと記した。薬剤（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）が、ハイブリッド二重鎖の標的ＲＮＡ鎖を分解し、一本鎖ｃＤＮＡを形成する（「ＩＩＩ」と記す）。ＩＩＩの５’末端は、プライマー１である。
３．混成プライマー２は、配列Ｆのハイブリダイゼーションによって第１鎖ｃＤＮＡ（ＩＩＩ）に結合し、複合体ＩＶを形成する。逆混成プライマーは、テンプレートＲＮＡまたは第一鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズ可能でない「テイル」配列（黒の太線で示される）をさらに含む。混成プライマー１のテイル配列および第２混成プライマーは、異なった配列であり得るが、幾つかの実施形態においては、このテイル配列は同一の配列であり得る。
４．混成プライマー２は、ＤＮＡポリメラーゼにより、第１鎖ｃＤＮＡ ＩＩＩに沿って伸長されて、二本鎖産物を形成する（「Ｖ」と記す）。プライマーは、逆転写酵素のようなＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、ＩＶの５’ＲＮＡ部分に沿って伸長し、複合体Ｖの一端においてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド部分の形成をもたらす。ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性は、本明細書中に記載されるように、同一の酵素で提供され得る。
５．薬剤（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）は、複合体Ｖの一端においてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解し、３’ＤＮＡ一本鎖末端を有する部分的に二本鎖の複合体（「ＶＩ」と記す）を形成する。この複合体は、混成プライマー１の部分Ｂの相補体である配列を有する。
６．混成プライマー１は、一本鎖ＤＮＡ末端（ＲＮＡ部分に対する補体である）へのＲＮＡ部分のハイブリダイゼーションによって、複合体ＶＩに結合し、複合体ＶＩＩを形成する。
７．複合体ＶＩＩにおける、結合プライマー１のセンスｃＤＮＡ鎖に沿ったプライマー伸長は、上述のｃＤＮＡ産物（ＶＩＩ）の置換をもたらし、そして、第２の混成プライマーのテイル配列を複製し、複合体ＶＩＩＩを形成する。
８．複合体ＶＩＩＩは、混成プライマー１および混成プライマー１の補体からなる２つのＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二重鎖を一端に有し、そして混成プライマー２および混成プライマー２の相補体を他方の末端で有する。薬剤（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）は、ＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二重鎖のＲＮＡ部分を切断し、２つの３’一本鎖ＤＮＡ配列を含む部分的に二本鎖のＤＮＡを形成する。ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素のような）によって供給され得るか、または異なった酵素によって提供され得る。本発明の方法に有用な逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有しても有さなくてもよい。１つの３’ＤＮＡ一本鎖末端は、混成プライマー１の部分Ｂの補体である配列を有し、そして１つの３’ＤＮＡ一本鎖末端は、混成プライマー２の部分Ｂの相補体である配列を有する。

本発明のこれらの実施形態の混成プライマーの設計は、一般に、一本鎖３’末端を有する部分的に二本鎖複合体を生成する方法について、上述の同じ考えによって支配される。しかし、標的ＲＮＡに結合する混成プライマーおよび第１プライマー伸長産物に結合する混成プライマーは、一般に、異なった５’ＲＮＡ部分を有することが、理解される。５’ＲＮＡ部分は、生じる３’突出が、（例えば、ハイブリダイズ可能な配列の設計あるいは１つの５’部分または両方の５’部分におけるランダム配列の使用によって）、相互にハイブリダイズ可能であるか、または３’突出が、１つ以上の受入分子とハイブリダイズ可能であるように設計される。

（３’一本鎖部分を含む部分的に二本鎖の複合体を使用する方法）
本発明は、組換え核酸の局面についての方法を、提供する。幾つかの実施形態において、本方法は、部分的に二本鎖のＤＮＡの３’一本鎖部分を受入核酸分子とハイブリダイズし、これにより、ハイブリッド核酸が生成される工程を包含する；この３’一本鎖部分を含む部分的に二本鎖の複合体を、本明細書中に記載の方法のいずれかに従って調製する。別の局面において、本発明は、核酸を組換える方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：部分的に二本鎖の複合体の３’一本鎖部分を受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成される工程（上記および本明細書中で述べられるように、３’一本鎖部分の全てまたは一部（部分）がハイブリダイズし得る）；３’一本鎖部分を含むこの部分的に二本鎖の複合体を、本明細書中に記載の方法のいずれかに従って調製し、そしてハイブリッド核酸から組換え核酸を生成する。本明細書中で使用される場合、「組換え産物」は、３’一本鎖部分および受入分子を含む部分的に二本鎖のＤＮＡに対応する配列を含む連続的な（完全に結合した）ポリヌクレオチドをいう。組換え産物は、３’一本鎖部分および受入分子を含む部分的に二本鎖のＤＮＡに対応する全ての配列を含み得るが、必ずしも含まなくてもよい。このような本明細書中で記載される組換え産物の生成方法の幾つかが、起源の部分的に二本鎖のＤＮＡ（３’突出を含む）および／もしくは受入分子に対応する配列の欠失ならびに／または変異をもたらすからである。本明細書中で使用される場合、「ｃＤＮＡ」または「部分的に二本鎖のＤＮＡ」または「二本鎖ＤＮＡ」は、ポリヌクレオチドである（すなわち、ポリヌクレオチドを包含する）。上述のように、用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡをいい、これを含み得るが、用語「ポリヌクレオチド」は、この用語が参照されるこの文脈によって決定されることが、本明細書の記載から明らかである。例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長は、一般に、ＤＮＡ分子の生成をいうが、用語「ＤＮＡ」は、（例えば、この文脈では）他の型の塩基、アナログ、結合など、（例えば、ポリメラーゼによってポリマー中に組みこまれ得る任意の基質）を含む分子を除外することを意味しない。

（ハイブリッド核酸の生成方法）
３’一本鎖部分を含む部分的に二本鎖のＤＮＡ（交換可能に「部分的に二本鎖の複合体」とよぶ）は、本明細書中に記載される発明の方法のいずれかに従って調製される。部分的に二本鎖の複合体は、１つの３’突出または２つの３’突出（両端に１つずつ）を含み得る。本発明の部分的に二本鎖の複合体は、本明細書中で記載される方法のいずれかに従って生成される、異なった部分的に二本鎖の複合体の多様性（僅かから非常に多くまで）（標的ＲＮＡの多様性に対応する）であり得る。異なった部分的に二本鎖の複合体の集団を生成する方法およびアプローチは、本明細書中で記載される。このような集団は、配列において関連し得る（例えば、遺伝子ファミリーのメンバー；特定のモチーフまたはドメインに対応する配列を含む）か、または配列において非常に多様であり得る（例えば、ポリ−ｄＴまたはランダム混成プライマーを使用して全てのｍＲＮＡから生成される；ランダムプライマーを使用して、標的集団中の全てのＲＮＡから生成される）。本明細書中で記載される場合、部分的に二本鎖の複合体は、それ自体がＤＮＡ供給源（例えば、ゲノムＤＮＡ）から当該分野で公知の方法（Ｋｕｒｎ，米国特許第６，２５１，６３９Ｂ１号を含む）を使用して生成される、ＲＮＡ標的から生成され得る。従って、本明細書中で記載される方法に従って調製される部分的に二本鎖の複合体は、ゲノムＤＮＡのＲＮＡコピーから生成され得、従って、一般にｍＲＮＡにおいて見出されない、非転写配列（例えば、イントロン、調節エレメントおよび制御エレメントなど）を含む。

受入分子（交換可能に「受入分子」または「受入体」と呼ぶ）は、１つまたは２つの３’一本鎖部分（３’突出）を含む、部分的に二本鎖のであり得る。二本鎖受入分子は、１つまたは２つの３’一本鎖部分を含む第２の部分的に二本鎖のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）であり得、本明細書中で記載される本発明の方法のいずれかに従って調製される。部分的に二本鎖の受入体（１つまたは２つの３’突出を含む） についての他の供給源としえては、少なくとも以下が挙げられる：二本鎖ｃＤＮＡ、二本鎖ゲノムＤＮＡ（１つ以上のゲノム供給源由来）、ライブラリーから調製される二本鎖ＤＮＡ、そして当該分野で公知の任意の方法（ＰＣＲ（例えば、Ｊａｒｒｅｌｌ ＷＯ ００／４０７１５を参照）を含む）を使用して調製される二本鎖ＤＮＡ。１つまたは２つの３’（一本鎖）突出を含む部分的に二本鎖のＤＮＡの生成方法としては、当該分野で公知であり、適切な制限酵素による制限酵素切断、Ｄｎａｓｅ切断、二本鎖ＤＮＡの機械的剪断、ならびに、例えば、米国特許第６，３４４，３５６号および同第６，３１９，７１４号に記載されるさらなる方法が挙げられる。

受入核酸分子は、一本鎖であり得る。幾つかの実施形態において、一本鎖受入体は、表面に固定化される（以下でさらに記載する）。一本鎖受入体は、少なくとも以下の供給源から調製され得る：当該分野で公知の方法（Ｋｕｒｎ，米国特許第６，２５１，６３９号；Ｋｕｒｎ，米国特許公報第２００２／００５８２７０号；Ｋｕｒｎ，同時係続米国出願第１０／１００，３２１号において記載される方法を含む）により調製される一本鎖ＤＮＡ；当該分野で公知の方法を使用して調製した第１鎖ｃＤＮＡ；および当該分野で周知の方法を使用して、単純にＤＮＡを一本鎖にすることによる任意の二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子由来。

受入分子は、異なった受入分子の多様性であり得ることが、理解される。このような集団は、配列に関連し得る（例えば、遺伝子ファミリーのナンバー；特定のモチーフまたはドメインに対応する配列を含む）か、または配列において非常に多様である（例えば、全てのｍＲＮＡから生成される、ゲノムＤＮＡの集団から生成される、など）。あるいは、受入分子は、単一の配列（公知の遺伝子（例えば、コード領域、ゲノム部分、などの一部または全てであり得る）に対応し得る。

受入分子は、本明細書中で記載される１つ以上の供給源から選択され得る。例えば、受入分子は、本明細書中に記載される方法に従って調製される３’突出を含む部分的に二本鎖のＤＮＡならびに他の一本鎖および／または二本鎖受入分子である受入分子を含み得る。

さらに、部分的に二本鎖の複合体（３’突出を含む）および／または受入分子は、１つまたは多様な（僅かから非常に多くまで）生物からのＲＮＡまたはＤＮＡと対応し得、そしてネイティブまたは非ネイティブの（例えば、変異、合成、などの）ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。従って、「遺伝子ファミリー」（または関連核酸配列）の概念は、本明細書中で使用される場合、特定の生物に由来する関連配列および多様な生物にまたがって関連する配列の、両方を包含する。

部分的に二本鎖の複合体および／または受入分子は、核酸のどの型、どのクラス、どの集団、および／またはどの種が、ハイブリッド分子内に（すなわち、部分的に二本鎖の複合体の３’末端と受入分子のハイブリダイゼーション後に）取り込まれるのが望ましいかに依存して、多くの方法のいずれかで選択され得る。例えば、特定のタンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質サブドメイン、タンパク質モチーフ、タンパク質ファミリーまたはタンパク質スーパーファミリー、などに対応する核酸が、選択され得る。さらなる例において、エキソン、オープンリーディングフレーム、エキソン−イントロン領域、および／または非翻訳領域（あるいはこれらの任意の組み合わせ）に対応する核酸もまた、選択され得る。別の例において、核酸は、ランダムに生成された核酸に対応し得る。なお別の例において、核酸は、非翻訳ＲＮＡ配列に対応し得る。これらの例は、本明細書中でさらに議論される。

３’突出を含む部分的に二本鎖のＤＮＡの型、クラス、集団、および／または種を選択するための方法が、本明細書中で記載される。一般に、第１混成プライマーの３’部分は、ＲＮＡのどの型、どのクラス、どの集団、および／またはどの種が、部分的に二本鎖の複合体（３’一本鎖領域を含む）中に取り込まれるのが望ましいかに依存して、本明細書中で議論されるように、多くの方法のいずれかで設計される（配列に関して）。

受入分子の型、クラス、集団、および／または種を選択するための方法は、当該分野で周知であり、以下が挙げられる：ＰＣＲを用いた所望の配列の増幅；ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡを含む）の制限エンドヌクレアーゼ切断；以前にクローン化したＤＮＡの調製；および当該分野で周知の他の方法。受入分子は、以下を含む種々の供給源から調製され得ることが、理解される：ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド；一本鎖ＤＮＡ；二本鎖ＤＮＡ、など。

以下の議論は、３’突出を含む部分的に二本鎖の複合体に表され得る特定の例示的な核酸（本発明の方法に従って調製される）および／または受け入れ分子を記載する。部分的に二本鎖の複合体および受入分子は、以下に記載する１つ以上の特徴を含み得ることが理解される。

幾つかの実施形態において、部分的に二本鎖の複合体および／または受入分子は、オープンリーディングフレーム（または部分的なオープンリーディングフレーム）に対応する。他の実施形態において、部分的に二本鎖の複合体および／または受入分子は、ゲノムＤＮＡに対応する（そしてそれにより、エキソン、イントロンおよび／または非翻訳領域を含み得る）。他の実施形態において、部分的に二本鎖の複合体および／または受入分子は、ランダムに選択された／生成された部分に対応する。

幾つかの実施形態において、部分的に二本鎖の複合体および／または受入分子は、関連配列の公知の配列または群に対応する。例えば、部分的に二本鎖の複合体および／または受入分子は、公知の生物学的活性の１つ以上の個別の機能ドメイン全長または機能ドメインの部分に対応し得る。多くのタンパク質が、個別の機能ドメインを有することが、当該分野で周知である（例えば、Ｔｒａｕｔ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３（１９８６）；Ｇｏら，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９：９１（１９８５）を、参照のこと）。このようなドメインは、しばしば互いに分離し得、そして各々独立した機能ドメインの活性を保存する様式で、他の個別の機能ドメインと組換えられ得ることもまた、周知である。

機能的タンパク質ドメインの例としては、例えば、以下が挙げられる：ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー、ホメオドメイン、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、など）、ＡＴＰまたはＧＴＰ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、（例えば、ロイシンジッパー、ＴＰＲリピート、ＷＤリピートＳＴＹＸドメイン（例えば、Ｗｉｓｈａｒｔら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：３０１，１９９８を参照）、Ｇ−タンパク質ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、（例えば、Ｓｈｏｋａｔ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５０９，１９９５を参照）、ＳＲＣホモロジードメイン（例えば、Ｓｕｄｏｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：１４６９，１９９８を参照）、ＳＨ２ドメイン（例えば、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２８：６１，１９９５を参照）、ＰＴＢドメイン（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｒｅｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：２７７，１９９５を参照）、ＰＨドメイン（例えば、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１８：３４３，１９９３を参照）、特定の触媒ドメインおよび細胞表面レセプタードメイン（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：１１，１９９８を参照）、炭水化物認識ドメイン（例えば、Ｋｉｓｈｏｒｅら，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１５：５８３，１９９７を参照）、免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｒａｐｌｅｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：１３９，１９９５を参照）。

本発明に従う使用に適切な機能的タンパク質ドメインとしては、遺伝子ファミリーを生成する進化を通して再生されるドメインが挙げられる。このような遺伝子ファミリーの例としては、例えば、組織プラスミノゲンアクチベーター遺伝子ファミリー（例えば、ＷＯ ００／４０７１５、図６を参照）、電位型ナトリウムチャネルのファミリー（例えば、Ｍａｒｂａｎら，Ｊ．ｐｈｙｓｉｏｌ．５０８：６４７，１９９８を参照）、接着分子の特定のファミリー（例えば、Ｔａｙｌｏｒら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２８：１３５，１９９８を参照）、種々の細胞外ドメインタンパク質ファミリー（例えば、Ｅｎｇｌｅ，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１５：２９５，１９９６を参照）、タンパク質キナーゼＣファミリー（例えば、Ｄｅｋｋｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３９６，１９９５を参照）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー（例えば、Ｎａｉｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍ．４７：１，１９９５を参照）、溶血素ファミリー（例えば、Ｌｏｐｅｚら，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．３：１９９，１９９７を参照）、核ホルモンレセプター遺伝子スーパーファミリー（例えば、Ｒｉｂｅｉｒｏら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４６：４４３，１９９５；Ｃａｒｓｏｎ−Ｊｕｒｉｃａら，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１１：２０１，１９９０を参照）、ニューレキシンファミリー（例えば、Ｍｉｓｓｌｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：１３３９；１９９８を参照）、チオレドキシン遺伝子ファミリー（例えば、Ｓａｈｒａｗｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４２：４２２，１９９６を参照）、リン酸基転移タンパク質ファミリー（例えば、Ｒｅｉｚｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４０７，１９９７を参照）、細胞壁ヒドロラーゼファミリー（例えば、Ｈａｚｅｌｗｏｏｄら，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６１：２１１，１９９８を参照）、および合成タンパク質の特定のファミリー（例えば、脂肪酸シンターゼ、ポリケチドシンターゼを（例えば、ＷＯ ９８／０１５４６，米国特許第５，２５２，４７４号、米国特許第５，０９８，８３号を参照）、ペプチドシンテターゼ（例えば、Ｍｏｏｔｚら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５４３，１９９７；Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２５：３，１９９５を参照）、およびテルペンシンターゼ）。

本明細書中に記載される方法を使用して、特定のタンパク質ドメインの持続性（またはドメインの一部）に対応する配列を含む部分的に二本鎖の複合体が生成され得、各部分的に二本鎖の複合体は、特定のドメインに必ずしも関連しない配列をさらに含み得る。例えば、キナーゼドメインを含むが、他の部分は必ずしも関連しない部分的に二本鎖の複合体（例えば、レセプター配列、細胞内キナーゼ、など）が、調製され得る。

部分的に二本鎖の複合体および／または受入分子はまた、本明細書中で記載されるように、「リンカー」アミノ酸に対応する核酸（一般に、非ネイティブ核酸配列）を含み得、これは、ハイブリダイゼーション工程および組換え工程の間に付加される核酸を反映し得る。

さらに本明細書において記載される場合、部分的二本鎖複合体および／または受入分子はまた、直接的または間接的に組換え分子（または第２の分子もしくは経路の分子さえ）の発現を調節し得る配列に対応する核酸を含み得る。例えば、部分的二本鎖複合体および／または受入分子は、転写および／もしくは発現に関連する配列エレメントまたは転写および／もしくは発現を調節する配列エレメント（例えば、プロモーター）に対応する配列を含み得る。このようなエレメントは、公知であり得る（この配列が、転写および／もしくは発現に関係することが公知であるという意味で）か、または新規であり得る。新規エレメント（または、新規エレメント配列）を同定するための方法は、当該分野で公知であり、以下に簡潔に記載される。別の例において、部分的二本鎖複合体および／または受入分子は、わずかな非翻訳ＲＮＡ（このようなＲＮＡは、例えば、遺伝子発現の調節にかかわる）に対応する配列を含み得る。

本明細書に記載された方法に従って調製された、３’一本鎖部分を含む部分的二本鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡのＲＮＡコピーから作製され得、従って、一般的にｍＲＮＡで見出されない非転写配列（例えば、イントロン、調節エレメントおよび制御エレメント、偽遺伝子など）を含む。

いくつかの実施形態において、受入分子（一本鎖または二本鎖であり得る）は、転写および／もしくは発現に関連する配列エレメントまたは転写および／もしくは発現を調節する配列エレメントを含み（インビボ（例えば、宿主細胞）またはインビトロ）、少なくとも以下を含む：転写制御配列、ＲＮＡスプライシング制御配列、他のＲＮＡ改変制御配列および／または翻訳制御配列。広範な種々のこのような転写制御配列および／または翻訳制御配列および／または発現制御配列は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照のこと）。

部分的二本鎖複合体および／または受入分子はまた、非翻訳ＲＮＡ配列に対応する核酸を含み得、この非翻訳ＲＮＡ配列は、例えば、ｔＲＮＡ配列、リボソームＲＮＡ配列、ならびに上記に記載されるような疾患プロセスおよび／もしくは遺伝子調節にかかわる非翻訳ＲＮＡ配列を含む。従って、本発明に記載された方法に従って調製された３’一本鎖部分を含む部分的二本鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡのＲＮＡコピーから作製され得、従って、一般的にｍＲＮＡで見出されない非転写配列（例えば、イントロン、調節エレメントおよび制御エレメント、偽遺伝子など）を含む。３’一本鎖部分を含む部分的二本鎖ＤＮＡはまた、ゲノム内に存在する外因性エレメント（例えば、公知の機能または未知の機能の非コード配列の産物である、ウイルス配列または任意のＲＮＡ配列）から作製され得る。

部分的二本鎖複合体および／または受入分子はまた、検出可能なタンパク質部分（例えば、蛍光または発光の色変化または誘導などの検出可能な応答を促進する酵素部分；公知のモノクローナル抗体と相互作用する部分など）（組換えポリヌクレオチド分子（例えば、ＧＳＴドメイン、ｆｌａｇドメイン、ｓｉｘ−ｃｙｓドメイン、銅キレートドメインなどのタグ）によってコードされた任意のポリペプチドの容易な精製を可能にする部分）に対応する核酸を含み得る。好ましい実施形態において、受入分子は、このような核酸配列を含む。

本発明で有用であるさらなる核酸配列の例は、以下を含む：ベクター配列（発現ベクター配列を含む）、レポーター遺伝子または選択マーカーを含むベクター、「タグ」を含むベクター；線状プラスミド配列、リンカーオリゴヌクレオチドなど。適切なベクター配列は、当該分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照のこと）。一般的にこのような核酸は、受入分子（これは一般的に、一本鎖である（しかし、必ずしも一本鎖ではない））に含まれる。

本発明の方法はさらに、部分的二本鎖複合体の３’一本鎖部分（本発明の方法に従って調製される）を受容核酸分子とハイブリダイズする工程を包含し、この結果、ハイブリッド核酸が作製される（あるいは、部分的二本鎖複合体および受入分子が、ハイブリダイゼーションを許容する条件下で結合される）。本明細書で使用される場合、ハイブリッド核酸分子とは、ハイブリダイズされた部分的二本鎖複合体および受入分子（本発明の第２の部分的二本鎖複合体であり得る）をいう。ハイブリッド分子は、ニック（隣接でハイブリダイズされた部分的二本鎖複合体の３’末端および受入分子の５’末端、またはその逆を作製）またはギャップを有する（例えば、ハイブリダイズ可能な配列長が３’オーバーハング長未満の場合、あるいは二重鎖の３’末端および／または受入分子の５’末端におけるヌクレオチドがハイブリダイズされない場合に作製される）。従って、別掲のとおり、複合体の一本鎖３’部分のハイブリダイゼーションとの言及は、３’部分全体（一部の）部分のハイブリダイゼーションをさす。

３’末端のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズ可能な部分の長さおよび３’末端の配列を含む、多くの因子に依存する。２つの３’末端のハイブリダイゼーションに必要なオーバーラップの最小の長さは、以下の通りである：約２ヌクレオチド長、少なくとも３ヌクレオチド長、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長、もしくはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。ハイブリダイズする部分のオーバーラップは、少なくとも２ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長または１００ヌクレオチド長、あるいはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。本明細書で使用される場合、オーバーラップは、ハイブリダイズし得ない部分を点在させた（または隣接した）ハイブリダイズ部分を含む、ハイブリダイズされた３’末端を含み得る。

３’末端の配列についての設計要件は、本明細書で検討され、少なくとも以下を含む：規定された３’末端または相対的に規定された３’末端（例えば、関連配列の配列またはグループに対応する）の使用；ランダム部分の使用；ハイブリダイズしそうなヌクレオチドまたはハイブリダイズしそうにないヌクレオチドの使用（例えば、増加させたＧ：Ｃ含有量もしくは減少させたＧ：Ｃ含有量、ヌクレオチドアナログの使用など）。一般に、（相補性に関して）３’末端がより関連すれば関連するほど、潜在的にハイブリダイズ可能な３’末端の数が少なくなる。対応して、ランダム部分（部分的二本鎖複合体および／または受入分子において）を含む３’末端の使用により、潜在的にハイブリダイズ可能に作製される３’末端の数が増加する。潜在的にハイブリダイズ可能な３’末端の数を増加させ（または減少させる）ための他の因子は、当該分野で公知であり、本明細書で検討される。当該分野で周知の通り、２つの配列間の相補性の割合は、ハイブリダイゼーションに寄与する。

３’末端のハイブリダイゼーションは、異なる「ストリンジェンシー」の条件下でのハイブリダイゼーションを含む。一般に、ストリンジェントがハイブリダイゼーション条件下であるほど、ハイブリダイズする３’末端間における配列同一性は高い。従って、一般に、減少されたストリンジェンシー（例えば、中程度のストリンジェンシー、低いストリンジェンシー）の条件下におけるハイブリダイゼーションは、部分的二本鎖複合体と受入分子との間で、潜在的にハイブリダイズ可能な３’末端の増加、および可能な組み合わせ数の付帯増加という結果になる。

ハイブリダイゼーションは周知であり、当該分野で理解されており、また、例えば、イオン強度や温度などの他の因子に依存する。当該分野で広範に公知であり、公表されているハイブリダイゼーション応答のストリンジェンシーを増強する条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。関連条件の例は、以下を含む（ストリンジェンシーを増強する順）：２５℃のインキュベーション温度、３７℃のインキュベーション温度、５０℃のインキュベーション温度および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣの緩衝液濃度、６×ＳＳＣの緩衝液濃度、１×ＳＳＣの緩衝液濃度、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度（ここで、ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよびｌ５ｍＭクエン酸緩衝液）および他の緩衝系を用いたそれらの等価物；０％ホルムアミド濃度、２５％ホルムアミド濃度、５０％ホルムアミド濃度および７５％のホルムアミド濃度；５分から２４時間までのインキュベーション時間；１洗浄工程、２洗浄工程またはそれ以上の回数の洗浄工程；１分か２分か１５分の洗浄インキュベーション時間；そして、６×ＳＳＣの洗浄溶液、１×ＳＳＣの洗浄溶液、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水。

一般に、ハイブリダイズ可能な３’末端（部分的二本鎖複合体および受入分子の）の配列は、少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９５％、約９５％の相補性である。

便宜上、一つの部分的二本鎖複合体および一つの受入分子だけのハイブリダイゼーションが、記載される（そして、図３〜図６に図示される）。本発明の方法は、単に、部分的二本鎖複合体（本明細書に記載される方法に従って）および一つの受入分子（本明細書に記載されるように、部分的二本鎖複合体であり得る）を含むハイブリッド分子を産生することが有用であるのではなく、より大きな部分的二本鎖複合体およびまたは受入分子を含むハイブリッド分子を産生することが有用であると理解されている。従って、本発明は、本明細書に記載されるように、少なくとも２つの部分的二本鎖複合体および少なくとも１つの受入分子を含むハイブリッド分子を提供する。

（組換えハイブリッドポリヌクレオチド）
別の局面において、本発明は、本発明の方法に従って調製されたハイブリッドポリヌクレオチドから、組換えポリヌクレオチドの生成方法を提供する。組換えポリヌクレオチドは、さらに本明細書で記載されるように、例えば、所望の特性に対するスクリーニングおよび／または選択において有用である。本明細書で使用される場合、「組換え産物」とは、３’一本鎖部分を含む部分的二本鎖複合体および受入分子に対応する配列を含む、連続した（完全に結合される）ポリヌクレオチドをいう。

本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドの組換えのための方法を提供する。組換えは、本明細書において記載される本発明の方法に従うものであり得る。当該分野で公知の任意の方法が使用され得ることも、企図される。本明細書に記載される場合、ハイブリッド核酸分子とは、ハイブリダイズされた部分的二本鎖複合体および受入分子（本発明の第２の部分的二本鎖複合体であり得る）をいう。ハイブリッド分子は、ニック（隣接でハイブリダイズされた受入分子の５’末端（部分的二本鎖複合体の３’オーバーハングにハイブリダイズされる）と部分的二本鎖複合体の３’末端との間に作製される）またはギャップを有する（例えば、ハイブリダイズされた受入分子の５’末端長が、３’オーバーハング長未満の場合に作製される）。ニックまたはギャップは、ハイブリッド分子の１つの鎖だけで説明されるが、ニックまたはギャップは、ハイブリッド分子の両方の鎖に作製され得ることが理解されている（一般に、受入分子が二本鎖である場合）。

便宜上、本明細書で記載される実施形態は、一般に、受入分子の３’オーバーハングにハイブリダイズされた単一の３’オーバーハングを含む、部分的二本鎖複合体に関連した（これは、二本鎖または一本鎖であり得る）。一般に、この立体配位において（実例として、図３〜図６に図示される）、受入分子の３’オーバーハングは、部分的二本鎖複合体の３’一本鎖部分にハイブリダイズされ、そういうものとして、受入分子の３’オーバーハングは、プライマー伸長のためのプライマーとして供し得る。しかし、（具体的に述べられていない場合）本明細書に記載される方法は、部分的二本鎖複合体の３’オーバーハングが、プライマー伸長のためのプライマーとして供し得る実施形態（例えば、二つの３’オーバーハングを有する部分的二本鎖複合体、二つの３’オーバーハングを含む受入分子など）に適用することが理解される。

いくつかの実施形態において、組換え産物は、ＤＮＡリガーゼを用いて、受入分子（上記で述べたように、これは、プライマーとしても供し得る）の３’末端と部分的二本鎖複合体の非オーバーハング鎖の５’末端とをライゲートすることによって、作製される。適切な条件およびリガーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ）は、当該分野で公知である。５’末端リボヌクレオチドが、部分的二本鎖複合体の非オーバーハング鎖の上に残存する場合（すなわち、混成プライマーの少なくとも１つのリボヌクレオチドが、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖からＲＮＡの切断後に残存する）、リボヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ ＨまたはＴ４ ＲＮＡｓｅ Ｈ）の付加によって除去され得る（標準ラギング鎖の複製において、岡崎フラグメントの伸長によって付加されるリボヌクレオチドを切断することが公知である）。（Ｂｈａｇｗａｔ Ｍ ａｎｄ Ｎｏｓｓａｌ Ｎ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７６：２８５１６−２４を参照のこと）
他の実施形態において、組換え産物は、（ａ）ハイブリダイズされた受入分子の３’末端からのプライマー伸長（この結果、ギャップが充填される）、および（ｂ）本明細書に記載されるようなライゲーションによって作製される。他の実施形態において、組換え産物は、（ａ）ハイブリダイズされた複合体の３’末端からのプライマー伸長（この結果、ギャップが充填される）、および（ｂ）本明細書に記載されるようなライゲーションによって作製される。他の実施形態において、組換え産物は、（ａ）ハイブリダイズされた受入分子の３’末端および複合体の３’末端からのプライマー伸長（この結果、ギャップが充填される）、および（ｂ）本明細書に記載されるようなライゲーションによって作製される。一般に、プライマー伸長は、鎖置換活性を欠損するＤＮＡポリメラーゼによる。さらに本明細書に記載されるように、新しい変異の導入がプライマー伸長の間に望まれている場合、低フィデリティーＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、プルーフリーディング能力を欠損する）が使用され得る。新しい変異の付加は、産物においてより大きな多様性を生じる。

いくつかの実施形態において、組換え産物は、鎖置換活性を含むＤＮＡポリメラーゼを用いて、ハイブリダイズされた受入分子の３’末端（および／またはハイブリダイズされた複合体の３’末端）からのプライマー伸長、および部分的二本鎖複合体のハイブリダイズされた非オーバーラップ鎖の置換によって、生成される。いくつかの実施形態において、鎖置換活性を含む低フィデリティーポリメラーゼが使用され、その結果、さらなる変異がプライマー伸長の間に付加される。

いくつかの実施形態において、組換え産物は、ニックトランスレーション（部分または全ての鎖（一般に相補鎖）に沿って伸長し得る）によって生成される。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性および／または５’エキソヌクレアーゼ活性を有するかまたは有さない鎖置換活性を含む。３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが使用される場合、ハイブリダイズの後にポリメラーゼを付加することは、一本鎖の３’オーバーハングの分解を防ぐために、所望される。

いくつかの実施形態において、ハイブリッド分子は、３’エキソヌクレアーゼ活性およびまたは５’エキソヌクレアーゼ活性を含む薬剤（一般に、酵素）で処置され、この結果、遊離した受入分子の３’末端および／または二本鎖化二重鎖の非オーバーラップ鎖の５’末端は、種々の範囲で除去される（増大したサイズのギャップを作製する）。低フィデリティーポリメラーゼを用いたギャップの充填後に、ハイブリッド分子のエキソヌクレアーゼ処置は、組換え産物のより大きい部分に変異の導入をもたらす。

本発明の別の局面において、組換え分子は、ハイブリダイズされた部分的二本鎖複合体および一本鎖受入分子（さらに本明細書に記載されるように、これは固定化され得る）を含むハイブリッド分子から作製される。いくつかの実施形態において、一本鎖受入分子は、ＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長によって、二本鎖核酸に変換され得る（ハイブリダイズされた部分的二本鎖ＤＮＡ複合物の３’オーバーハング部分によってプライムされる）。他の実施形態は、本明細書の固定化された受入分子について説明するセクションに記載される（下記）。

図３は、以下の組換え産物を作製するための方法の一つの実施形態を、実例として例示する：
１．３’一本鎖オーバーハング配列を有する部分的二本鎖複合体は、制限消化によって生成された部分的二本鎖ＤＮＡフラグメント（制限消化から産生された「突出末端」は、第１の複数の部分的二本鎖複合体の３’一本鎖のオーバーハング配列でハイブリダイズし得る）を含む、複数の受入分子にハイブリダイズされる；
２．ＤＮＡポリメラーゼによる伸長は、ギャップ（もしあれば）を充填するのに使用される；
３．ハイブリダイズされた末端のライゲーションは、組換え二本鎖産物を作製する。

図４は、以下の組換え産物を作製するための方法の一つの実施形態を、実例として例示する：
１．３’一本鎖オーバーハング配列を有する部分的二本鎖複合体は、一本鎖核酸配列を含む受入分子にハイブリダイズされる。

２．組換え一本鎖産物を作製するために、ギャップ（もしあれば）を充填するためのプライマー伸長による伸長およびハイブリダイズされた末端のライゲーション；
プライマー伸長は、部分的二本鎖複合体の３’オーバーハングによってプライムされ、この結果、二本鎖組換え産物が作製される。

図５は、以下の組換え産物を作製するための方法の一つの実施形態を、実例として例示する：
１．ランダムな３’一本鎖オーバーハングを含む部分的二本鎖複合体は、ランダムな３’オーバーハング配列を含む受入分子にハイブリダイズされる；
２．ギャップ（もしあれば）を充填するためのプライマー伸長による伸長および組換え一本鎖産物を生成するためにハイブリダイズされた末端のライゲーション。

（本発明の組換え産物の使用）
組換え産物は、有用な特性を有する産物をスクリーニングし、そして／または選択するのに有用である。スクリーニング方法および選択方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，８３０，７２１；同第６，３３５，１６０号；同第６，３４４，３５６号；同第５，８１１，２３８号；Ｚｈａｎｇら（１９９７）ＰＮＡＳ ９４：４５０５−４５０９；Ｇｕｌｉｋ ａｎｄ Ｆａｈｌ（１９９５）ＰＮＡＳ ９２：８１４０−８１４４；Ｙｏｕ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：７７−８３；Ｂａｒｂａｓ（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３８０９−３８１３；Ｃｒａｍｅｒｉａら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｈｅｉｍ ａｎｄ Ｔｓｉｅｎ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：；１７８−１８２を参照のこと。

一般に、組換え分子は、当該分野で周知の方法を用いて発現され得る。例えば、組換え分子は、プラスミドまたは発現ベクターにクローンされるか、ＰＣＲ法で増幅されるか、またはインビボで組換えを許容され得る（例えば、適切な宿主へのトランスフェクションによる）。組換え分子は、翻訳され得、その後、当該分野で公知の手順を用いて、所望の特性についてスクリーニングまたは選択（インビボまたはインビトロ）され得る。所望の特性は、以下を含む：増強された酵素活性および／または改変された酵素活性および／またはハイブリッド酵素活性；増強されたあるいは改良されたタンパク質ドメインの折りたたみ；レポーター（例えば、プロモータートラップ）および／もしくは所望の表現型の翻訳および／もしくは発現を調節する能力、ならびに／または有利な既定特性を有するタンパク質のコードを調節する能力。例えば、非翻訳ＲＮＡまたはＲＮＡ障害が評価される場合、あるいは非コーディング配列の産物であり遺伝子発現調節において機能する他のＲＮＡ分子が評価される場合、組換え分子は、組換え配列の翻訳に関係なくスクリーンされ得るか、または選択され得ることが理解されている。

（固体支持体（または半固体支持体）に付着された組換え核酸の生成）
本発明の方法は、支持体（これは、固体または半固体であり得る）に固定された組換え一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の生成を提供する。図６は、本発明の一つの実施形態を例示する。部分的二本鎖複合体の３’一本鎖部分と固定された一本鎖受入分子とのハイブリダイゼーションは、部分的二本鎖複合体と固定された一本鎖受入分子との複合を含む、ハイブリッドの核酸の生成を生じる。本明細書で使用される場合、「ｃＤＮＡ」とは、ポリヌクレオチドである（すなわち、ポリヌクレオチドを包含する）。ハイブリダイズされた一本鎖受入分子の３’末端によってプライムされたプライマー伸長は、以前にハイブリダイズされた部分的二本鎖複合体（第１のｃＤＮＡ鎖に対応する）の非オーバーラップ鎖の置換、および以下を含む複合体の形成を生じる；（ａ）（ｉ）第１の一本鎖（ＤＮＡ）核酸および（ｉｉ）第１のｃＤＮＡ鎖を含む、固定されたキメラ一本鎖ＤＮＡ；および（ｂ）第２のプライマー伸長産物。ハイブリダイズされた第２のプライマー伸長産物の変性または分解は、固定された一本鎖キメラＤＮＡを生じる。

固定された受入分子は、当該分野で公知の方法を用いることによって固定される（固体支持体または半固体支持体（例えば、紙、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコンもしくは他の金属、光ファイバー）への付着を含む）。固体支持体または半固体支持体は、当該分野で公知の任意の手段で構成され得る（二次元配置（例えば、ガラス板、シリコンチップ）または三次元配置（例えば、ピン、ファイバー、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー）を含む）。

核酸を固体支持体に付着する手段および／または固定する手段は、（ｉ）写真平版技術を用いたインサイチュ合成（例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ）（Ｆｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１），２５１：７６７−７７３；Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４），９１：５０２２−５０２６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６），１４：１６７５；米国特許第５，５７８，８３２号；同第５，５５６，７５２号； および同第５，５１０，２７０号を参照のこと）；（ｉｉ）ガラス、ナイロンまたはニトロセルロース上への中程度の密度から低密度でのスポッティング／プリンティング（Ｓｃｈｅｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５），２７０：４６７−４７０，ＤｅＲｉｓｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６），１４：４５７−４６０；Ｓｈａｌｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（１９９６），６：６３９−６４５；およびＳｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５），９３：１０５３９−１１２８６を参照のこと）；（ｉｉｉ）マスキングによる（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２），２０：１６７９−１６８４を参照のこと）および（ｉｖ）ナイロンハイブリダイゼーション膜またはニトロセルロースハイブリダイゼーション膜上にドットブロットすることによって（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと）を含む。オリゴヌクレオチドプライマーはまた、アンカーに対するハイブリダイゼーションによって、マグネチックビーズによって、またはマイクロタイターウェルもしくはキャピラリーのような液相中で、支持体上に、非共有結合で固定され得る。

本方法の一つの実施形態において、受入核酸は、マイクロアレイとして固定される。

必要に応じて、標識は、部分的二本鎖複合体の片方の鎖または両方の鎖に付着され得るか、あるいは固定された受入分子に付着され得るか、あるいは受入分子が付着される固体支持体（例えば、色素分子を付着したビーズ）に付着され得るか、あるいは任意の組み合わせもしくはその順列に付着され得る。標識は、固定された受入分子（部分的二本鎖複合体を結合し、そして／またはさらに産物を形成する）の同定および／または定量を許容する。標識は、蛍光色素または放射性同位元素を含む。この標識はまた、小分子（特定の結合対の一メンバーである）であり得、そして、この特定の結合対の他のメンバー（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン各々であり、この結合対の最後のメンバーは、酵素（比色定量、蛍光定量法または化学発光のような方法によって検出され得る検出可能なシグナルの発生を触媒する）を結合している）との結合後に検出され得る。上記の例の全ては、当該分野で周知である。

固定された二本鎖受入分子または一本鎖受入分子を含むハイブリッド分子の生成は、本明細書に記載された任意の方法による。

一般に、組換え固定化ポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖であり得る）の産生は、本明細書に記載された任意の方法によって達成される。

他の実施形態において、固定化組換え産物は、ハイブリダイズされた部分的二本鎖複合体の３’オーバーハングによってプライムされた、プライマー伸長によって二本鎖を与えられる。

他の実施形態において、固定化部分的二本鎖組換え産物は、ハイブリダイズされた部分的二本鎖複合体の３’オーバーハングによってプライムされたプライマー伸長によって生成される（３’オーバーハング鎖の末端が到達される前に中止され、この場合、５’オーバーハングを有する固定化二本鎖ＤＮＡが産生される）。

他の実施形態において、二本鎖のヘテロ二重鎖の非オーバーラップ鎖の一部分または全てを除去するために、５’エキソヌクレアーゼおよび／または３’エキソヌクレアーゼが使用され得る（例えば、プライマー伸長後および／またはライゲーション後）。このような操作は、結合した部分的二本鎖複合体および受入分子の長さより短い、一本鎖組換え産物の産生をもたらし得る。

他の実施形態において、固定される組換え鎖（一般に、部分的二本鎖複合体の３’オーバーハング鎖を含む複合体中に存在する）の生成後、オリジナルの部分的二本鎖複合体の３’オーバーハング鎖は、固定された組換え産物を産生するために除去される。部分的二本鎖複合体の３’オーバーハング鎖の除去は、熱変性または当該分野で公知の任意の他の方法（例えば、アルカリ処理）を介する二本の鎖の変性によって、達成され得る。

他の実施形態において、オリジナルの部分的二本鎖複合体の３’オーバーハング鎖は、エキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ）を用いて３’オーバーハング鎖を分解することによって、部分的または完全に除去され得る。このような５’エキソヌクレアーゼおよびそれらの使用のための条件は、当該分野で公知である。この手段が、３’オーバーハング鎖の５’末端から実施され、完成されない場合、遊離した３’オーバーハングを有する固定化部分的二本鎖複合体の形成を生じる。

（固定化組換え産物の使用）
このような固定化ポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖であり得る）の使用は、当業者に容易に明らかである。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、各々のプローブ配列および位置が既知である、多くの異なるポリヌクレオチドプローブを含むアレイを提供するために使用され得る。このようなアレイは、例えば、比較され得る単一サンプルまたは多数のサンプルのいずれかの発現分析で有用である。例えば、米国特許第６，３４４，３１６号および同第６，３０３，３０１号を参照のこと。他の実施形態において、固体支持体は、レポーター基としてさらに染色され、例えば、ｍＲＮＡを同定および／またはｍＲＮＡのレベルを定量するための手段を提供し得るビーズであり得る。さらに他の実施形態において、固体支持体に付着された一本鎖ＤＮＡは、合成による配列決定によって（例えば、ピロ配列決定（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））、一本鎖ＤＮＡを配列決定するのに使用され得る。所望の配列とのハイブリダイゼーションによって、配列混合物からの所望の配列の選択について、付着した一本鎖組成物を使用することもまた可能である（例えば、付着した一本鎖配列が、１サンプルの発現遺伝子の配列を含む場合、別の配列由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡからの類似配列の選択について、付着した一本鎖を有する固体支持体を使用することは可能である）。付着した一本鎖ポリヌクレオチドは、１配列または多数の配列であり得る。

（キット）
本発明はまた、核酸の組換えまたは指向性発展の方法で有用であるキットを含む。本発明の実施に有用である試薬は、望ましくは一緒に提供され得、キットに組み合わされ得る。本発明のキットは、本明細書に記載される方法によって作製される３’オーバーハング配列を有する部分的二本鎖複合体、および本明細書に記載される任意の方法で使用するための指示書を含む（さらに、組換えを達成するための成分（例えば、適切な酵素）を含み得る）。いくつかの実施形態において、部分的二本鎖複合体は、ＤＮＡ混合のために、ｃＤＮＡライブラリー、エキソン混合のための全長ドメインもしくは部分的なドメイン、またはコーディング配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、このキットはまた、ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、このキットは、本明細書に記載されるように、核酸を組換えるための指示書を含む。いくつかの実施形態において、このキットは固体支持体を含む。

（本発明の方法に使用される成分および反応条件）
（テンプレート核酸）
ＲＮＡ目的物は、ヒト、動物、植物および微生物（例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌、植物およびそのフラグメント）を含む任意の供給源および／または種由来の、精製された形態または精製されていない形態における任意の供給源（例えば、総ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、葉緑体ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはその混合物のようなＲＮＡであり得る）由来のＲＮＡを含む。このＲＮＡは、コーディングＲＮＡまたは非コーディングＲＮＡ（例えば、翻訳されていない小さなＲＮＡ）であり得ることが理解されている。ＲＮＡは、当該分野において標準的な技術を用いて獲得され得、そして精製され得る。ＤＮＡ目的物（ゲノムＤＮＡ目的物を含む）の使用は、ＲＮＡ形態へのＤＮＡ目的物の初期転写を必要とし、これは、Ｋｕｒｎ（米国特許第６，２５１，６３９ Ｂ１）に開示される方法を用いて、そして当該分野で公知の他の技術（例えば、発現系）によって達成され得る。従って、部分的二本鎖複合体は、当該分野で公知の方法（Ｋｕｒｎ，米国特許第６，２５１，６３９号を含む）を用いて、ＤＮＡ供給源（例えば、ゲノムＤＮＡ）から生成されたＲＮＡ目的物から生成され得る。ゲノムＤＮＡのＲＮＡコピーは、一般にｍＲＮＡで見出されない非転写配列（例えば、イントロン、調節エレメントおよび制御エレメントなど）を、一般的に含む。ＲＮＡ目的物はまた、インビトロでの転写に供され得るクローン化ゲノムＤＮＡ配列から生成され得る。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの使用は、一本鎖ＲＮＡを獲得するためのハイブリッドの変性、ＲＮＡを獲得するためのＤＮＡ鎖の転写後の変性、または一本鎖ＤＮＡを作製するためのＲＮＡｓｅ Ｈを用いた消化など当該分野で公知の他の方法を必要とする。標的ＲＮＡは、生物試料などの複雑な混合物の微量な画分だけであり得、そして当該分野で周知の手段によって、種々の生体物質から獲得され得る。標的ＲＮＡは、公知または未知であり得、また目的の１つ以上の所望の特定の核酸配列（これらはの各々、互いに同じであるかまたは異なっているかもしれない）を含み得る。変性はまた、ＲＮＡ標的分子の中に存在する二次構造を除去するために実施され得る。標的核酸が二本鎖である場合（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド）、初期工程は標的の変性であり得た。変性工程は、熱変性または当該分野で公知の任意の他の方法であり得る。複合材料からのＤＮＡ鎖の除去はまた、ＤＮａｓｅを用いた処置によって達成され得る。

（混成プライマー）
本発明の方法は、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分で構成される混成プライマーを使用する。混成プライマーが設計され得、その結果、新しい核酸の結合によるプライマー伸長産物のその後の置換は、プライマー伸長をプライムし得る。

本方法および本発明の組成物においての使用のための混成プライマーは、標的ＲＮＡにハイブリダイズし得る配列を含む。標的ＲＮＡにハイブリダイズし得る配列は、特異的な標的ＲＮＡ（例えば、特定遺伝子のｍＲＮＡについて）の特定配列に基づき得るか、または複数のＲＮＡ種に存在していることが既知であるより一般的な配列型に基づき得る（例えば、一般に当該分野で、全ての真核生物ｍＲＮＡに存在していると考えられるポリＡテイル配列）。さらに、標的ＲＮＡにハイブリダイズし得る配列は、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含み得、そして３’部分の３’末端で追加ランダム配列（一般に、ポリＡ配列に相補的でない）をさらに含み得る。

標的ＲＮＡにハイブリダイズし得る配列はまた、ランダム配列を含み得る。ランダムプライマーは、当該分野で周知であり、少なくとも以下を含む：サンプル中の２つ以上の配列にハイブリダイズし得るプライマー；およびサンプル（例えば、総ｍＲＮＡ）中の多数のＲＮＡにハイブリダイズし得るポリｄＴ配列を含むプライマー。便宜上、単一のランダム混成プライマーは、上記で検討されている。しかし、用語「ランダムプライマー」は、所望のおよび／または有意な標的配列の集団に対してまとめて設計されているプライマー集団のメンバーであるプライマーを示し得ると理解されている。

単一の反応混合物中の多数のｍＲＮＡ種由来の、部分的に二本鎖の複合体の産生が、種々の、すなわち多数のプライマーを使用し得るが、必須ではないこともまた、理解される。従って、本発明の部分的に二本鎖の複合体が、単一の反応混合物中の多数のｍＲＮＡ種から産生される場合、本発明は、種々の異なる混成プライマー（ランダムまたは非ランダム）の使用を企図する。

いくつかの実施形態において、第一混成プライマーは、本発明の方法で使用される。他の実施形態において、種々の異なる第一混成プライマーが、本発明の方法で使用される。他の実施形態において、第一混成プライマーおよび第二混成プライマーが、本発明の方法で使用される。第二混成プライマー（プライマーの第二鎖合成のために使用される）は、第一混成プライマーの配列の一部または全てを含み得、そして、第一混成プライマーは、第二混成プライマーの配列の一部または全てを含み得る。いくつかの実施形態において、第二混成プライマーは、第一混成プライマーとは異なる配列を含む。他の実施形態において、種々の異なる第二混成プライマーは、本発明の方法で使用される。

その混成プライマーは、好ましくは５’末端に、標的とはハイブリダイズしない（所定の一連の条件下では）配列（例えば、そのプライマーが標的に結合する場合、テールを構成するハイブリダイズしない５’部分）を含み得る。混成プライマーの個々のＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分は、完全にまたは部分的にその標的ＲＮＡにハイブリダイズし得る。

重合による伸張に適したプライマーの産生は、当該分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開番号 ＷＯ９９／４２６１８中（およびそれに引用される参考文献）に記載される。その混成プライマーは、３’末端ヌクレオチドが、核酸伸張のために適切なヌクレオチドである、ＲＮＡおよびＤＮＡ（上記定義を参照のこと）の組み合わせを含む。３’末端ヌクレオチドは、プライマー中に存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼにより伸張され得る任意のヌクレオチドまたはアナログであり得る。一般に、３’末端ヌクレオチドは、３’−ＯＨを有する。適切なプライマーとしては、少なくともＲＮＡの一部および少なくともＤＮＡの一部を含むプライマーが挙げられる。例えば、混成プライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分（ＲＮＡ部分が、３’−ＤＮＡ部分に隣接する）；または介在性ＲＮＡ部分を含む５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み得る。従って、一つの実施形態において、その混成プライマーは、５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含み、好ましくは、その中でＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣接する。別の実施形態において、その混成プライマーは、少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分（すなわち、二つのＤＮＡ部分の間のＲＮＡ部分）を含む５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む。なお別の実施形態において、本発明の混成プライマーは、３’ＤＮＡ部分および少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分（例えば、ＤＮＡ部分の間のＲＮＡ部分）を含む。

３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む混成プライマー中のＲＮＡ部分の長さは、約１〜約５０ヌクレオチドであり得るか、またはそれより長くてもよく、約３〜約２０ヌクレオチド、約４〜約１５ヌクレオチド、および約５〜約１０ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、ＲＮＡ部分は、少なくとも約１、３、４、５ヌクレオチドのいずれかであり得、約１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。いくつかの実施形態において、その混成プライマーのＲＮＡ部分は、約１０〜約２０ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、その混成プライマーのＲＮＡ部分は、約１０〜約２０ヌクレオチドからなり、そして、その混成プライマーのＤＮＡ部分は、約５〜約２０ヌクレオチドからなる。

５’ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む混成プライマー中の５’ＲＮＡ部分の長さは、約２〜約５０ヌクレオチドであり得るか、またはそれより長くてもよく、約５〜約２０ヌクレオチド、約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは、約８〜約１７ヌクレオチドおよび約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマーの他の実施形態において、５’−ＲＮＡ部分は、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約１５、１７、１８、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長い上限を有する。

５’ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非５’−ＲＮＡ部分を含む混成プライマーの実施形態において、非５’−ＲＮＡ部分は、約１〜約７ヌクレオチド、約２〜約６ヌクレオチドおよび約３〜約５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非−５’−ＲＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、非−５’−ＲＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得、約５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、５’−ＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣接する混成プライマーの実施形態において、５’−ＲＮＡ部分の長さは、約３〜約５０ヌクレオチドであり得るか、またはそれより長くてもよく、約５〜約２０ヌクレオチド、約７〜約１８ヌクレオチド、約８〜約１７ヌクレオチドおよび約１０〜１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、５’−ＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣接する混成プライマーのいくつかの実施形態において、５’−ＲＮＡ部分は、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約１５、１７、１８、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマー中の介在性ＲＮＡ部分の長さは、約１〜約７ヌクレオチド、約２〜約６ヌクレオチドおよび約３〜約５ヌクレオチドであり得る。５’―ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分および少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、介在性ＲＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得、約５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマー中の介在性ＲＮＡ部分の長さは、約１〜約７ヌクレオチド、約２〜約６ヌクレオチドおよび約３〜約５ヌクレオチドであり得る。少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、介在性ＲＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得、約５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を含み、さらに５’−ＲＮＡ部分を含む混成プライマー中で、５’−ＲＮＡ部分は、約３〜約２５ヌクレオチド、約５〜約２０ヌクレオチド、約７〜約１８ヌクレオチド、約８〜１７ヌクレオチドおよび約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を含み、さらに５’−ＲＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、５’−ＲＮＡ部分は、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約１５、１７、１８、２０、２５、３０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む混成プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、約１〜約２０ヌクレオチド、約３〜約１８ヌクレオチド、約５〜約１５ヌクレオチドおよび約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、約１〜約２０ヌクレオチド、約３〜約１８ヌクレオチド、約５〜約１５ヌクレオチドおよび約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマーの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、約１〜約１０ヌクレオチド、約２〜約８ヌクレオチドおよび約３〜約６ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非−３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、非−３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得、約６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

５’−ＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣接する５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマーの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分の長さは、約１〜約２０ヌクレオチド、約３〜約１８ヌクレオチド、約５〜約１５ヌクレオチドおよび約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣接する５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含むプライマーのいくつかの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマー中の非３’−ＤＮＡ部分の長さは、約１〜約１０ヌクレオチド、約２〜約８ヌクレオチドおよび約３〜約６ヌクレオチドであり得る。少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含むプライマーのいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得、約６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、約１〜約２０ヌクレオチド、約３〜約１８ヌクレオチド、約５〜約１５ヌクレオチドおよび約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。

３’−ＤＮＡ部分および少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を含む混成プライマー中の非−３’−ＤＮＡ部分（すなわち、３’−ＤＮＡ部分以外の任意のＤＮＡ部分）の長さは、約１〜約１０ヌクレオチド、約２〜約８ヌクレオチドおよび約３〜約６ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を含む混成プライマーのいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を有する混成プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、約１〜約２０ヌクレオチド、約３〜約１８ヌクレオチド、約５〜約１５ヌクレオチドおよび約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも一つの介在性ＲＮＡ部分を有する混成プライマーのいくつかの実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得、約１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。種々の部分に対する長さが、本発明の方法の反応条件下で必要に応じて、大きくあり得、または小さくあり得ることが理解される。

いくつかの実施形態において、混成プライマーの５’−ＤＮＡ部分は、そのプライマーの最も５’末端のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、混成プライマーの５’−ＲＮＡ部分は、そのプライマーの最も５’末端のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、混成プライマーの３’−ＤＮＡ部分は、そのプライマーの最も３’末端のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、５’−ＲＮＡ部分に隣接し、そのプライマーの最も３’末端のヌクレオチドを含む（そして、５’−ＲＮＡ部分は、そのプライマーの最も５’末端のヌクレオチドを含む）。

混成プライマーの全長は、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチドおよび約２０〜約２５ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、その長さは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドであり得、約２５、３０、５０、６０、７０、７５、８５、１００ヌクレオチドのいずれか、またはそれより長いヌクレオチドの上限を有する。その長さが、本発明の方法の反応条件下で適切なように、より長くあり得、またはより短くあり得ることが理解される。

標的核酸に対するハイブリダイゼーション（それは、他の因子（例えば、イオン強度および温度）に依存することが周知であり、当該分野でよく理解されている）を達成するために、標的ＲＮＡにハイブリダイズし得るそのプライマーのその部分が、好ましくは、標的核酸と少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７５％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、および最も好ましくは、少なくとも約９５％相補性である。

いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡにハイブリダイズする混成プライマーのＲＮＡ部分は、３’ＤＮＡ部分に対して５’である。いくつかの実施形態において、５’ＲＮＡ部分は、３’ＤＮＡ部分に隣接している。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡであり、そして、標的ＲＮＡにハイブリダイズする混成プライマーは、ポリ−ｄＴ配列を含み、そしてさらに、混成プライマーが標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする条件下では、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしない５’部分を含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡにハイブリダイズするその混成プライマーは、ランダム配列を含む。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡにハイブリダイズするために、多数の異なる混成プライマーが使用される。

（第二プライマー）
本発明の方法における第二プライマー（第二鎖ｃＤＮＡの生成を準備する）は、第二鎖ｃＤＮＡが目的のＲＮＡ配列を含むような第一鎖ｃＤＮＡ上の部位で、第一鎖ｃＤＮＡ（相互変換可能に第一プライマー伸張産物と呼ばれる）に（一連の所定の条件下で）ハイブリダイズする配列（これはプライマーの全体であり得るかまたはそうではない）を含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズし得る第二プライマーの配列は、第一鎖ｃＤＮＡ上の所望の結合部位の公知の配列に基づいて設計される。他の実施形態において、ハイブリダイズし得る配列は、例えば、多数のＲＮＡ種から生成される第一鎖ｃＤＮＡのランダムなプライミングのために適切になるように、当該分野で公知のランダム配列に基づいている。他の実施形態において、第二プライマーは、米国特許第５，９６２，２７１号および同第５，９６２，２７２号に記載される鎖交換オリゴヌクレオチドを含み、このオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ上に存在するＣａｐ配列にハイブリダイズし、このオリゴヌクレオチドによって、逆転写酵素が、「交換（ｓｗｉｔｃｈ）オリゴヌクレオチド」によりプライミングされる第二鎖ｃＤＮＡの生成を可能にする、ｍＲＮＡテンプレートから交換オリゴヌクレオチドの交換を引き起こす。あるいは、ホモポリマー化テールは、第一プライマー伸張産物の３’末端に付加され、そして、第二プライマーは、ホモポリマー化テールの相補体を含む。

いくつかの実施形態では、第二プライマー（第二鎖ｃＤＮＡの生成をプライミングする）は、混成プライマーである（上記のように）。これらの実施形態において、本方法は、二本の３’一本鎖ＤＮＡ部分を含む二本鎖ｃＤＮＡの生成に関与する。

第一鎖ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション（それは、他の因子（例えば、イオン強度および温度）に依存することが当該分野で周知であり理解される）を達成するために、第一鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズし得る第二プライマーの配列は、好ましくは、第一鎖ｃＤＮＡと少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７５％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、および最も好ましくは、少なくとも約９５％相補性である。

いくつかの実施形態において、第二プライマーは、ＤＮＡを含む。別の実施形態において、第二プライマーは、ＲＮＡを含む。なお別の実施形態において、第二プライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態において、第二プライマーは、混成プライマー伸張産物の３’末端における自己プライミング（例えば、ヘアピンループにより）により提供される。これらの実施形態では、例えば、米国特許第６，１３２，９９７号中に記載されるように、混成プライマー伸張産物の３’末端における配列は、混成プライマー伸張産物それ自体の中の別の配列とハイブリダイズする。これらの実施形態において、混成プライマー伸張産物の３’にあるこの配列は、米国特許第６，１３２，９９７号の混成プライマー伸張産物および／または混成プライマー伸張産物に沿った伸張産物へのハイブリダイゼーションの後、一般的に、切断される（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼにより）。

いくつかの実施形態において、第二プライマーは、一つ以上の標的ＲＮＡフラグメントにより供給され、そして、それだけでは、外因的に添加されたプライマーではない。このような標的ＲＮＡフラグメントは、一つ以上のＲＮＡフラグメントが、第一プライマー伸張産物に結合したままであるように、標的ＲＮＡの複合体中の標的ＲＮＡ、および、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中でＲＮＡを切断する薬剤（例えば、酵素）による第一プライマー伸張産物の不完全な分解（断片化または切断）を含む当該分野で周知の方法を使用して生成され得る。前の節の上で述べたように、切断／断片化もまた、熱処理（変性するためまたは第一プライマー伸張産物からテンプレートＲＮＡを分離するために、十分ではない）または化学処理（例えば、アルカリ条件下での処理）により影響され得る。いくつかの実施形態において、プライマーとしての役目をする標的ＲＮＡフラグメントを生じる切断は、ＲＮａｓｅＨによりもたらされる。

（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを切断し得る薬剤、およびＲＮＡポリメラーゼ）
本発明の方法は、以下の酵素：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を備える酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を備える酵素、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断し得る薬剤（例えば、ＲＮａｓｅＨのようなリボヌクレアーゼ）およびいくつかの局面では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する。これらの活性の内の一つ以上は、単一の酵素中で見出され得、使用され得る。例えば、ＲＮａｓｅＨ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって供給され得るかまたは別個の酵素中で供給され得る。この方法に対して有用な逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を有してもよいし、有さなくてもよい。ＤＮＡ依存性ポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ポリメラーゼは、単一の酵素中で提供され得るかまたは二つの別個の酵素中で提供され得る。

本発明の一つの局面は、プライマー−ＲＮＡ複合体からの二本鎖ｃＤＮＡの形成である。この過程は、一般にＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性およびリボヌクレアーゼ活性を使用する。

本発明の方法および本発明の組成物に使用するためのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従ったプライマーの伸張に影響し得る。従って、好ましいＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも大部分はリボヌクレオチドから構成される核酸テンプレートに沿って核酸プライマーを伸張し得るものである。本発明の方法および組成物に使用するための適切なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしては、逆転写酵素が挙げられる。多くの逆転写酵素（例えば、トリの骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ−ＲＴ）由来およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ−ＲＴ）由来）が、一つより多くの活性（例えば、ポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼ活性）を有し、そして、二本鎖ｃＤＮＡ分子の形成において機能し得る。しかし、いくつかの例では、ＲＮａｓｅＨ活性を欠く逆転写酵素を使用することが好ましい。その変異がＲＮａｓｅＨ活性を除去する野生型逆転写酵素の変異を有する逆転写酵素を含む、ＲＮａｓｅＨ活性を欠く逆転写酵素は、当該分野で公知である。他の供給源に由来するＲＮａｓｅＨ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉから単離されたＲＮａｓｅＨ）の添加は、二本鎖ｃＤＮＡの形成のために使用され得る。

本発明の方法および本発明の組成物に使用するためのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従った混成プライマーの伸張に影響し得る。従って、好ましいポリメラーゼは、少なくとも大部分はデオキシヌクレオチドから構成される核酸テンプレートに沿って核酸プライマーを伸張し得るものである。二本鎖ｃＤＮＡの形成は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する逆転写酵素により行われ得る。ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有してもよく、または有さなくてもよい。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鎖にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末端に結合する高い親和性を有する。ＤＮＡポリメラーゼは、実質的に切れ目を入れる（ｎｉｃｋｉｎｇ）活性を有してもよく、または有さなくてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有してもよく、または有さなくてもよい。一般的に、このエキソヌクレアーゼ活性は、例えば、ｐＨ、塩濃度、テンプレートが二本鎖かまたは一本鎖のいずれか、などの因子（これらは全て、当業者にはよく知られている）に依存する。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したＤＮＡポリメラーゼ変異体。５’→３’ヌクレアーゼ活性および３’→５’ヌクレアーゼ活性のいずれも欠いたＤＮＡポリメラーゼ変異体（例えば、エキソ^−／−クレノウＤＮＡポリメラーゼ）もまた、記載されている。いくつかの実施形態において、鎖置換活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、好ましい。このようなポリメラーゼは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５７４４３１２号（およびそれに引用された参考文献）に記載されている。そのポリメラーゼは、さらに修復活性を有してもよく、または修復活性をほとんど有さないかあるいは全く有さなくてもよい。

本発明の方法および組成物に使用するための適切なＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第５６４８２１１号および同第５７４４３１２号に開示されたものを含み、それらとしては、ｅｘｏ⁻Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ⁻Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、ｅｘｏ⁻Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）、シークエンス等級Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｅｘｏ^−／−Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼおよび耐熱性嫌気性菌および耐熱性硫酸細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

本発明の方法および組成物に使用するための薬剤（例えば、リボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中で、リボヌクレオチドを切断し得る。好ましくは、リボヌクレアーゼは、切断されるリボヌクレオチドに隣接したヌクレオチドの個性および型に関係なく、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中でリボヌクレオチドを切断する。リボヌクレアーゼは、配列の個性と関係なく切断することが好ましい。本発明の方法および組成物のための適切なリボヌクレアーゼの例は、当該分野で周知であり、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）が挙げられ、ハイブリダーゼが挙げられる。

一般に、本発明の方法および組成物に使用される酵素は、前記方法および組成物の核酸構成要素の実質的な分解を引き起こすべきではない。

いくつかの実施形態において、その同じ酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する。いくつかの実施形態において、その同じ酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する。いくつかの実施形態において、その同じ酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する。いくつかの実施形態において、異なる酵素が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、異なる酵素がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する。いくつかの実施形態において、異なる酵素が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する。

（反応条件および検出）
本発明の方法を実行するための適切な反応培地および反応条件は、ポリメラーゼによるプライマー伸張、ハイブリダイゼーションおよび本発明の方法に従った組換えを可能にするものである。このような培地および条件は、当業者に公知であり、種々の出版物（例えば、米国特許第５，５５４，５１６号、同第５，７１６，７８５号、同第５，１３０，２３８号、同第５，１９４，３７０号、同第６，０９０，５９１号、同第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号、同第５，１６９，７６６号、同第５，４８０，７８４号、同第５，３９９，４９１号、同第５，６７９，５１２号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４２６１８）に記載される。緩衝液は、その緩衝液成分が、本発明の方法の酵素成分に対して非阻害的である限り、他の緩衝液もまた、使用され得るが、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液でもよい。ｐＨは、好ましくは、約５〜約１１であり、より好ましくは、約６〜約１０であり、さらにより好ましくは、約７〜約９であり、そして最も好ましくは、約７．５〜約８．５である。反応培地はまた、二価金属イオン（例えば、Ｍｇ^２＋またはＭｎ^２＋）を、約０．０１〜約１５ｍＭおよび最も好ましくは約１〜約１０ｍＭの範囲内の遊離イオンの最終濃度で含み得る。その反応培地はまた、培地の全イオン強度に寄与する他の塩（例えば、ＫＣｌまたはＮａＣｌ）を含み得る。例えば、塩（例えば、ＫＣｌ）の範囲は、好ましくは、約０〜１２５ｍＭであり、より好ましくは、約０〜約１００ｍＭであり、そして最も好ましくは、約０〜約７５ｍＭである。その反応培地はさらに、本方法の酵素成分の活性には不可欠ではないが、反応の効率に影響し得る添加剤を含み得る。このような添加剤としては、タンパク質（例えば、ＢＳＡ一本鎖結合タンパク質、（例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質）および非イオン界面活性剤（例えば、ＮＰ４０またはＴｒｉｔｏｎ）が挙げられる。酵素活性を維持し得る試薬（例えば、ＤＴＴ）もまた、含まれ得る。このような試薬は、当該分野で公知である。適切な場合、本方法で使用されるＲＮａｓｅの活性を阻害しないＲＮａｓｅインヒビター（例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｒｎａｓｉｎ））もまた、含まれ得る。本発明の方法の任意の局面は、同一の温度かまたは異なる温度で起こり得る。好ましくは、ＤＮＡ二本鎖複合体を生成する反応（特に、第一鎖ｃＤＮＡ複合段階および第二鎖ｃＤＮＡ複合段階以外のプライマー伸張ならびに鎖置換）は、扱いにくい温度サイクル過程を避けて、等温で行われる。その反応は、本明細書に記載されたプライマー伸張、ハイブリダイゼーションおよび組換えを可能にする温度および使用された酵素の活性を実質的に阻害しない温度で行われる。その温度は、約１５℃〜約８５℃、約２５℃〜約８５℃、約３０℃〜約８０℃および約３７℃〜約７５℃の任意の範囲内であり得る。ＲＮＡ転写（例えば、ＲＮＡ標的がＤＮＡから生成される場合）を含むいくつかの実施形態において、転写段階の温度は、次の段階（例えば、ＲＮＡ標的の変性）の温度より低い。これらの実施形態において、転写段階の温度は、約２５℃〜約８５℃、約３０℃〜約７５℃および約３７℃〜約７０℃の範囲内であり得る。ＲＮＡの切断が、熱によって影響を受ける場合、インキュベーションは、第一プライマー伸張産物を変性する（切断の前に）ことなく、所望の切断に影響するのに十分な温度で行われ、それは、約６５℃〜約８０℃または約７０℃〜約７５℃であり得る。伸張は、十分な酵素活性を維持するのに適した温度で行われる。

本発明の方法のプライマー伸張産物の複合のために使用され得るヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸）は、好ましくは、約５０〜約２５００μＭ、より好ましくは約１００〜約２０００μＭ、さらにより好ましくは約２００〜約１７００μＭおよび最も好ましくは約２５０〜約１５００μＭの量で提供される。いくつかの実施形態において、プライマー伸張鎖中のその存在がその鎖の置換を増強する（例えば、従来的なＡＴ、ＣＧ塩基ペアより弱い塩基ペアを誘導することによって）ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが含まれる。このようなヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログとしては、デオキシイノシンおよび全て当該分野で公知である他の修飾された塩基が挙げられる。本発明の方法においてＲＮＡ転写物の複合に使用され得るヌクレオチドおよび／またはアナログ（例えば、リボヌクレオシド三リン酸）は、好ましくは約０．２５〜約６ｍＭ、より好ましくは約０．５〜約５ｍＭ、さらにより好ましくは、約０．７５〜約４ｍＭおよび最も好ましくは約１〜約３ｍＭの量で提供される。

本発明の反応のオリゴヌクレオチド成分は一般に、標的核酸配列の数より過剰である。それらは、標的核酸の約１０倍、約１０^２倍、約１０^４倍、約１０^６倍、約１０^８倍、約１０^１０倍、約１０^１２倍の量のいずれかかまたは少なくとも約１０倍、約１０^２倍、約１０^４倍、約１０^６倍、約１０^８倍、約１０^１０倍、約１０^１２倍の量のいずれかで提供され得る。混成プライマーは、それぞれ以下の濃度：５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２５００ｎＭ、５０００ｎＭのいずれかかまたは少なくとも以下の濃度：５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２５００ｎＭ、５０００ｎＭのいずれかで提供され得る。

一つの実施形態において、前記成分は、組換え生成物を生成するための方法の開始時点で同時に添加される。別の実施形態において、成分は、必要な場合および／または反応により可能になった場合、プロセスの間の適切な時点の前か後かのいずれかで添加される。このような時点（その内のいくつかは、以下に記載される）は、当業者によって、容易に同定され得る。プライマー伸張および本発明の方法に従った組換えのために使用される酵素は、それらの温度安定性および／または当業者に公知の他の検討材料により決定される、標的核酸の変性（この文脈中の変性は、一般に標的ＲＮＡを、それらを接近可能にするために、配列を開く条件に置くことをいう）段階の前、変性段階の後または標的ＲＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーションの後、３’突出部を含む二本鎖複合体の産生の後または受入れ分子に対する３’突出部を含む二本鎖複合体のハイブリダイゼーションの後のいずれかで、反応混合物に添加され得る。第一鎖ｃＤＮＡ（混成プライマーの伸張産物）および第二鎖ｃＤＮＡ（第二プライマー伸張産物）複合反応は、連続的に実施され得、それに続いて、ハイブリダイゼーション段階および組換え段階が実施され得る。これらの実施形態では、その反応条件および反応成分は、異なる反応間で変化し得る。

組換えプロセス（一本鎖３’突出部を含む二本鎖複合体の生成を含む）は、種々の時点で停止され得、後に再開され得る。前記時点は、当業者によって容易に同定され得る。一つの時点は、第一鎖ｃＤＮＡ複合の終わりの時点である。別の時点は、第二鎖ｃＤＮＡ複合の終わりの時点である。別の時点は、３’一本鎖突出部を含む部分的に二本鎖複合体の生成の後である。別の時点は、二本鎖複合体の受入れ核酸との部分的なハイブリダイゼーションの後である。反応を停止するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、酵素活性を阻害する温度まで反応混合物を冷却することまたは酵素を無効化する温度まで反応混合物を加熱することを含む。反応を再開するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、酵素活性を可能にする温度まで反応混合物の温度を上昇させることまたは無効化された（枯渇した）酵素を補充することを含む。いくつかの実施形態において、その反応の一つ以上の成分が、反応の再開の前か後かで補充される。あるいは、その反応は、中断なしに、進行する（すなわち最初から最後まで）ことを可能とし得る。

その反応を、例えばプライマーを除去するために、複合物中間体の精製なしに、進行することを可能とし得る。生成物は、当業者に容易に同定され得る種々の時点で、精製され得る。一つの時点は、第一鎖ｃＤＮＡ複合の終わりの時点である。別の時点は、第二鎖ｃＤＮＡ複合の終わりの時点である。別の時点は、３’一本鎖突出部を含む二本鎖複合体の部分的な生成の後である。別の時点は、二本鎖複合体の受入れ核酸との部分的なハイブリダイゼーションの後である。

以下の実施例は、本発明の例示を提供するが、これらに限定されない。

（実施例１：単一の混成プライマーを使用したポリＡ ｍＲＮＡ由来の第二鎖ｃＤＮＡに付加した固有の配列の３’突出部を有する二本鎖ｃＤＮＡの作製）
ＭＯＬＴ−４細胞株（ＣＬＯＮＴＥＣＨ ６５８７−１）由来のポリＡ ｍＲＮＡを使用した。プロセスは、次の２つの工程：１）第一ｃＤＮＡ鎖の複合；２）第二ｃＤＮＡ鎖の複合および試料の総ｍＲＮＡ由来の二本鎖ｃＤＮＡ（３’突出部または一本鎖部分を有する）を生成するための切断、であった。二本鎖ｃＤＮＡ産物は、一方の末端に、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を含み、それは、ＲＮａｓｅＨの基質である。このヘテロ二重鎖部分の二本鎖の配列は、標的とは関連がなく、複合（第一）プライマーの使用を介して、組み込まれる。
プライマー配列：

ここで、イタリック体のヌクレオチドは、リボヌクレオチドを示し、そして、「Ｎ」は、縮重ヌクレオチド（すなわち、それは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり得る）を示す。

（工程１：ポリＡ ｍＲＮＡ由来の第一鎖ｃＤＮＡの複合）
１μｇの総ポリＡ ｍＲＮＡを、１０μｌの全容積中で、次の薬品：
２μｌ プライマー ＭＴＡ３（１００μＭ）
５μｌ ｄＮＴＰ（２５ｍＭ）
１μｌ リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｒｎａｓｉｎ）
１μｌ ＤＴＴ
２μｌ ５×ＡＭＶ逆転写酵素反応緩衝液
１０μｌの全容積まで、ＤＥＰＣ処理した水と混合した。

反応混合物を７５℃で２分間インキュベートし、その後、３７℃まで冷却した。１μｌのＡＭＶ逆転写酵素（ＵＳＢ ７００４１Ｙ、１５Ｕ／μｌ）を各反応に添加し、その反応混合物を、６０分間、この温度でさらにインキュベートした。

（工程２：第二鎖ｃＤＮＡ複合および３’一本鎖部分（突出部）を生成するための切断）
第一鎖ｃＤＮＡ反応混合物を、以下を含む、１０μｌの第二鎖ｃＤＮＡ合成混合物と混合した：
１μｌ １０×クレノウ反応緩衝液
０．１μｌ ｄＮＴＰ（２５ｍＭ）
０．５μｌ クレノウ（ＵＳＢ ２１４１Ｙ ５Ｕ／μｌ） ＤＮＡポリメラーゼ
０．１μｌのＥ．ｃｏｌｉリボヌクレアーゼＨ（ＢＲＬ １８０２１−０１４、４Ｕ／μｌ）
８．４μｌ 水。

反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、７５℃で５分間インキュベートし、酵素を不活性にすることにより反応を停止した。

（実施例２：実施例１の工程２の反応の生成物の特徴づけ）
実施例１の反応において、使用された混成プライマーの５’ＲＮＡ部分の「固有の」配列があるために、「固有の」配列（すなわち、ＲＮＡテンプレートにはハイブリダイズしない配列）が、第二鎖ｃＤＮＡの３’末端に作製されることが予測される。（第二鎖ｃＤＮＡの３’末端の）この配列は、混成プライマーの５’ＲＮＡ部分に相補的であり、標的ＲＮＡ中の配列に関連しない。得られた第二鎖ｃＤＮＡ中のこの配列の存在を決定するために、第二鎖ｃＤＮＡの３’末端にある、予想される配列と相補的であるプライマーを、順方向プライマーとして使用して、そして、Ｇ３ＰＤＨ特異的プライマーを、逆方向プライマーとして使用して、その反応生成物（実施例１の工程２の反応混合物中で見出される）のＰＣＲ増幅を行った。このプライマーの組は、「固有の」配列を有する二本鎖ｃＤＮＡ由来の特定の産物を増幅すると予想される。

ＰＣＲ反応は、以下のように行った：
各５０μｌのＰＣＲ反応は、以下のものを含む：
０．４μＭの各プライマー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）
１００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）
２ｍＭ塩化マグネシウム（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）
１〜２ユニットのポリメラーゼ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ ｔａｑまたはＭａｓｔｅｒＡｍｐ Ｔｆｌのいずれか、（これらは両方ともＥｐｉｃｅｎｔｅｒから入手））
酵素とともに供給される５μｌ １０×緩衝液
実施例１の工程２で生成されたｃＤＮＡの１：２０希釈物。

ＰＣＲ増幅サイクルは、９４℃で３０秒間、５１℃で３０秒間そして、７２℃で３０秒間である。一般に、その試料は、２０回から２５回のサイクルで行った。試料を４℃で保持する前に、最後に７２℃で５分間伸張させた。

ＭＯＬＴ４細胞株により発現するＴ細胞レセプター特異的ｍＲＮＡ（ＴＣＲ）に対して特異的なプライマーを使用して、同様の実験を行った。

Ｇ３ＰＤＨプライマーを使用したＰＣＲ生成物の予想される大きさ（塩基対）

（プライマー配列）
Ｇ３ＰＤＨ５：５’ＴＴＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＡＴＧ ＡＣＡ ＡＣＧ ＡＡ
Ｇ３ＰＤＨ５−４：５’ＣＣＡ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＡ
Ｇ３ＰＤＨ３：５’ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＧＴ
ｄＭＴＡ１：５’ＧＡＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ
Ｔ細胞レセプタープライマーを使用したＰＣＲ生成物の予想される大きさ（塩基対）

（プライマー配列）
ＴＣＲ５：５’ＣＣＣ ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＣＴ ＴＣＣ ＧＣＴ ＧＴＣ
ＴＣＲ５−２：５’ＣＡＡ ＡＣＣ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＧＴ
ＴＣＲ３：５’ＣＡＡ ＣＡＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＧＣＴ ＧＡＣ Ｃ
工程２の反応混合物がプライマーＤＭＴＡ１およびプライマーＧ３ＰＤＨ５を使用して、ＰＣＲによって増幅された（Ｇ３ＰＤＨ ｍＲＮＡの配列の増幅）場合、約２５０塩基対長である生成物の存在によって、そして、プライマーＤＭＴＡ１およびＴＣＲ５−２を使用する（ＴＣＲβ鎖ｍＲＮＡの配列の増幅）場合、約４００塩基対長の生成物の存在によって示されるように、その結果は、固有の配列が第二鎖ｃＤＮＡに組み入れられることを示す。従って、その結果は、（実施例１で使用された混成プライマーのＲＮＡ部分の）「固有の」配列の、生じる部分的に二本鎖のｃＤＮＡ生成物への組み入れを示した。

上述の発明は、明快な理解を目的とした図および実施例を手段として、ある程度詳細に記載されているが、いくつかの変更および改変が実施され得ることが当業者には明らかである。従って、その記述および実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、本発明の範囲は、添付の請求項により表される。

図１Ａは、混成プライマーおよび第２プライマーを使用して、標的ＲＮＡから、１つの３’一本鎖ＤＮＡ部分（突出）を有する第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を生成する、等温（サーモサイクリングを避ける）プロセスの図解を示す。 図１Ｂは、混成プライマーおよびＲＮＡテンプレートのフラグメントを使用して、標的ＲＮＡから、１つの３’一本鎖ＤＮＡ部分（突出）を有する第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を生成するプロセスの図解を示す。この図は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（ここでは、ＲＮａｓｅ Ｈ）を使用して切断をもたらすことを説明するが、当該分野で公知の、そして本明細書中に記載される他の切断をもたらす手段が、使用され得る。 図２Ａは、２つの混成プライマーを使用して、標的ＲＮＡから、２つの３’一本鎖ＤＮＡ部分（突出）を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を生成する、等温プロセスの図解を示す。 図２Ｂは、２つの混成プライマーを使用して、標的ＲＮＡから、２つの３’一本鎖ＤＮＡ部分（突出）を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を生成する、等温プロセスの図解を示す。 図３は、本発明の方法に従って調製された、３’突出を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を使用する方法の図解を示す。 図４は、本発明の方法に従って調製された、３’突出を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を使用する方法の図解を示す。 図５は、本発明の方法に従って調製された、３’突出を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を使用する方法の図解を示す。 図６は、固定化核酸、ならびに本発明の方法に従って調製された３’突出を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を使用する方法の図解を示す。

Claims (29)

1. ハイブリッド核酸を生成するための方法であって、該方法は、以下：
   （ａ）第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を調製する工程であって、該複合体は３’一本鎖部分を含み、ここで、該３’一本鎖部分を含む複合体は、以下：
   （ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および該標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、該第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；
   （ｉｉ）工程（ｉ）の該複合体中のＲＮＡを、切断する工程；
   （ｉｉｉ）該第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、それにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；
   （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の該複合体中の該混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖部分を含む第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程；
   を、包含する方法に従って調製される、工程；ならびに
   （ｂ）該第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の該複合体の該３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ハイブリッド核酸が生成される、工程；
   を、包含する、方法。
2. （ｃ）前記ハイブリッド核酸から、組換え核酸を生成する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２プライマーが、前記プライマー伸長産物にハイブリダイズした前記標的ＲＮＡのフラグメントを含み、該フラグメントが、工程（ａ）の前記複合体中のＲＮＡの切断により生成される、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記第２プライマーがＤＮＡを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
5. 標的ＲＮＡにハイブリダイズする前記混成プライマーのＲＮＡ部分は、該３’ＤＮＡ部分に対して５’である、請求項１または請求項２に記載の方法。
6. 前記５’ＲＮＡ部分は、前記３’ＤＮＡ部分に隣接する、請求項５に記載の方法。
7. 前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡであり、そして標的ＲＮＡにハイブリダイズする前記混成プライマーが、ポリｄＴ配列を含み、かつ該混成プライマーが該標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする条件下で標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしない５’部分をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
8. 標的ＲＮＡにハイブリダイズする前記混成プライマーが、ランダム配列を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
9. 複数の異なった混成プライマーが、前記標的ＲＮＡへのハイブリダイズのために使用される、請求項１または請求項２に記載の方法。
10. 前記混成プライマーの前記ＲＮＡ部分が、約１０個〜約２０個のヌクレオチドからなり、該混成プライマーの前記ＤＮＡ部分が、約５個〜約２０個のヌクレオチドからなる、請求項１または請求項２に記載の方法。
11. ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡを切断する前記酵素が、ＲＮａｓｅ Ｈである、請求項１または請求項２に記載の方法。
12. 同一の酵素が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、そしてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する、請求項１または請求項２に記載の方法。
13. 同一の酵素が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、そしてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する、請求項１または請求項２に記載の方法。
14. 同一の酵素が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、そしてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する、請求項１または請求項２に記載の方法。
15. 異なった酵素が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
16. 異なった酵素が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、そしてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する、請求項１または請求項２に記載の方法。
17. 異なった酵素が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、そしてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する、請求項１または請求項２に記載の方法。
18. 異なった酵素が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、そしてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する、請求項１または請求項２に記載の方法。
19. 前記複合体の３’一本鎖部分の全体が、前記受入分子にハイブリダイズしている、請求項１または請求項２に記載の方法。
20. 前記複合体の３’一本鎖部分の一部が、前記受入分子にハイブリダイズしている、請求項１または請求項２に記載の方法。
21. 工程（ｉｉ）の前記ＲＮＡ切断が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素による、請求項１または請求項２に記載の方法。
22. 前記酵素がＲＮａｓｅ Ｈである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記組換え核酸を生成する工程が、ライゲーション含む、請求項２に記載の方法。
24. 前記組換え核酸を生成する工程が、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による３’末端の伸長を含む、請求項２に記載の方法。
25. 前記ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、鎖置換活性を有する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記組換え核酸を生成する工程が、ギャップのフィリングおよびライゲーションを含む、請求項２に記載の方法。
27. 切断が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で行われる、請求項３に記載の方法。
28. 前記酵素がＲＮａｓｅ Ｈである、請求項２７に記載の方法。
29. ハイブリッド核酸を作製する方法であって、該方法は、以下：第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体の３’一本鎖部分を、受入核酸分子とハイブリダイズし、それによりハイブリッド核酸が生成される工程であって、該第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体は、以下：（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズした第１プライマーを、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第１プライマー伸長産物および標的ＲＮＡを含む複合体が生成される工程であって、該第１プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む混成プライマーである、工程；（ｉｉ）工程（ｉ）の該複合体中のＲＮＡを、切断する工程；（ｉｉｉ）該第１プライマー伸長産物にハイブリダイズした第２プライマーを、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する酵素で伸長し、これにより、第２プライマー伸長産物が生成されて、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物の複合体を形成する、工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の該複合体中の該混成プライマーからＲＮＡを、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素で切断し、その結果、３’一本鎖部分を含む、第１プライマー伸長産物および第２プライマー伸長産物を含むハイブリダイズした複合体を生成する工程、を包含する方法に従って調製される、方法。

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