RU96103646A

RU96103646A - Реагент-метка и способ проведения анализа

Info

Publication number: RU96103646A
Application number: RU96103646/13A
Authority: RU
Inventors: Сатерн Эдвин; Джонатан Камминс Уильям
Original assignee: Оксфорд Джин Текнолоджи Лимитед
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-08-01
Publication date: 1998-10-10

Claims

1. Реагент, включающий:
а) анализируемый компонент, состоящий по меньшей мере из двух анализируемых остатков и связанный с
b) компонентом-меткой, который содержит одну или более репортерных групп, пригодных для обнаружения методом масс-спектрометрии, за исключением олигонуклеотидов, отличающийся тем, что репортерная группа обозначает анализируемый остаток, а репортерную группу в каждом положении компонента-метки выбирают так, чтобы она обозначала анализируемый остаток в определенном положении анализируемого компонента.

2. Реагент по п. 1, отличающийся тем, что имеется линкерная группа, к которой присоединен анализируемый компонент и компонент-метка.

3. Реагент по п. 1 или 2, отличающийся тем, что анализируемый компонент представляет собой цепь из n-го числа анализируемых остатков, а компонент-метка представляет собой цепь, содержащую до n-го числа репортерных групп, причем репортерную группу в каждом положении цепи метки выбирают так, чтобы она определяла анализируемый остаток в соответствующем положении цепи анализируемого вещества.

4. Реагент по пп. 1-3, отличающийся тем, что анализируемый компонент связан с компонентом-меткой фоторасщепляемой связью.

5. Реагент по пп. 1-4, отличающийся тем, что имеет формулу A-L-R, где A представляет собой цепь из n-го числа анализируемых остатков, образующих анализируемый компонент, L представляет собой линкер, R представляет собой цепь, содержащую до n-го числа репортерных групп, образующих компонент-метку, и n-равно 2-20, причем компонент-метка содержит информацию, определяющую локализацию анализируемых остатков в анализируемом компоненте.

6. Реагент по пп. 2-5, отличающийся тем, что линкер включает в себя ароматическую группу, несущую гидроксильную группу, аминогруппу или сульфидрильную группу, предназначенную для синтеза анализируемого компонента, а также реакционноспособную группу для синтеза компонента-метки.

7. Реагент по п.6, отличающийся тем, что ароматическая группа, несущая гидроксильную группу, аминогруппу или сульфидрильную группу, предназначенную для синтеза анализируемого компонента, несет также орто-нитрогруппу, предназначенную для фоторасщепления.

8. Реагент по пп. 1-7, отличающийся тем, что присутствует заряженная группа, предназначенная для анализа методом масс-спектрометрии.

9. Реагент по пп. 1-8, отличающийся тем, что анализируемый компонент представляет собой пептидную цепь.

10. Реагент по пп. 1-8, отличающийся тем, что анализируемый компонент представляет собой олигонуклеотидную цепь.

11. Библиотека реагентов по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что состоит из множества реагентов, каждый из которых включает в себя различный анализируемый компонент.

12. Библиотека по п.11, отличающаяся тем, что состоит из 4ⁿ числа реагентов, каждый из которых включает в себя отличающийся от других анализируемый компонент, представляющий собой отличающуюся от других олигонуклеотидную цепь, состоящую из n-го числа нуклеотидов.

13. Библиотека по п. 12, отличающаяся тем, что реагенты смешаны друг с другом в растворе.

14. Способ проведения анализа, включающий следующие стадии: получение исследуемого вещества; инкубирование исследуемого вещества с библиотекой реагентов по пп. 11-13 в условиях, при которых по меньшей мере один реагент будет связан с исследуемым веществом; удаление несвязанных реагентов; отщепление компонента-метки от какого-либо связанного реагента или каждого из связанных реагентов; анализ отщепленных компонентов-меток как индикаторов природы анализируемых компонентов, связанных с исследуемым веществом.

15. Способ проведения анализа по п. 14, отличающийся тем, что исследуемое вещество представляет собой организм, или ткань, или группу клеток.

16. Способ секвенирования исследуемой нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
а) получение олигонуклеотида, иммобилизованного на носителе,
b) гибридизация исследуемой нуклеиновой кислоты с иммобилизованным олигонуклеотидом,
с) инкубирование гибрида, полученного в стадии (b), с библиотекой по п. 13 так, что олигонуклеотидная цепь первого реагента библиотеки гибридизируется с исследуемой нуклеиновой кислотой, прилегающей к иммобилизованному олигонуклеотиду,
d) лигирование примыкающих олигонуклеотидов так, чтобы образовался лигированный первый реагент,
e) удаление нелигированных реагентов,
f) отщепление и анализ компонента-метки лигированного первого реагента в качестве индикатора последовательности первой части исследуемой нуклеиновой кислоты.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя следующие стадии:
ci) инкубирование гибрида, полученного в стадии (f) с библиотекой по п. 13 так, чтобы олигонуклеотидная цепь второго реагента библиотеки гибридизировалась с исследуемой нуклеиновой кислотой, прилегающей к олигонуклеотидной цепи первого реагента,
di) лигирование примыкающих олигонуклеотидов так, чтобы образовался легированный второй реагент,
ei) удаление нелегированных реагентов,
fi) отщепление и анализ компонента-метки лигированного второго реагента в качестве индикатора последовательности второй части исследуемой нуклеиновой кислоты.

18. Способ по пп. 16 и 17, отличающийся тем, что на стадии
а) олигонуклеотид иммобилизуют на концах серии игл (pins), играющих роль носителя; на стадии (b) индивидуальный клон исследуемой ДНК гибридизируют с олигонуклеотидом, иммобилизованным на каждой отдельной игле (pin); на стадиях с) и d) образуется серия лигированных реагентов, причем разные иглы несут разные лигированные реагенты; на стадии f) компонент-метку каждого лигированного реагента отделяют и анализируют в качестве индикатора последовательности части исследуемой ДНК.

19. Способ по пп. 16 и 17, отличающийся тем, что на стадии b) каждый индивидуальный клон исследуемой ДНК гибридизируют с олигонуклеотидом, иммобилизованным на отдельном участке носителя, расположенном на некотором расстоянии от других участков; на стадиях c) и d) получают серию лигированных реагентов, причем различные участки носителя, находящиеся на расстоянии друг от друга, несут различные лигированные реагенты; на стадии f) компонент-метку каждого лигированного реагента отделяют и анализируют в качестве индикатора последовательности части исследуемой ДНК.

20. Способ по пп. 16 и 17, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
а) получение матрицы олигонуклеотидов, иммобилизованных на участках носителя, находящихся на расстоянии друг от друга, причем олигонуклеотид на одном участке отличается от олигонуклеотидов на других участках,
b) инкубирование исследуемой нуклеиновой кислоты с матрицей иммобилизованных олигонуклеотидов так, чтобы образовались гибриды на одном или нескольких участках носителя, находящихся на расстоянии друг от друга,
c) инкубирование гибридов, полученных на стадии b) с библиотекой по п. 13, так, чтобы олигонуклеотидная цепь реагента из библиотеки гибридизировалась с исследуемой нуклеиновой кислотой, примыкающей к каждому из иммобилизованных олигонуклеотидов,
d) лигирование примыкающих олигонуклеотидов так, чтобы образовались лигированные реагенты по меньшей мере на одном из участков носителя, находящихся на расстоянии друг от друга,
e) удаление нелигированных реагентов,
f) отщепление и анализ компонента-метки каждого из лигированных реагентов в качестве индикатора последовательности части исследуемой нуклеиновой кислоты.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что известна последовательность олигонуклеотида, иммобилизованного посредством ковалентной связи на каждом из участков носителя, находящихся на расстоянии друг от друга.

22. Способ анализа исследуемой ДНК, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
i) получение исследуемой ДНК, иммобилизованной на носителе,
ii) инкубирование иммобилизованной исследуемой ДНК, полученной на стадии i), со множеством реагентов по п. 10 так, чтобы олигонуклеотидные цепи различных реагентов гибридизировались с исследуемой ДНК на носителе,
iii) удаление негибридизированных реагентов,
iv) отщепление и анализ компонента-метки каждого реагента в качестве индикатора последовательности части исследуемой ДНК.

23. Способ по пп. 22, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя следующие стадии:
iia) инкубирование гибрида, полученного на стадии iv) с библиотекой реагентов по п. 13 так, чтобы олигонуклеотидные цепи различных реагентов гибридизировались с исследуемой ДНК,
iiia) лигирование примыкающих олигонуклеотидов, гибридизированных с исследуемой ДНК, и удаление нелегированных реагентов,
iva) отщепление и анализ компонента- метки каждого лигированного реагента в качестве индикатора последовательности части исследуемой ДНК.

24. Способ по п. 22 или 23, отличающийся тем, что индивидуальные клоны исследуемой нуклеиновой кислоты иммобилизуют на участках носителя, расположенных на расстоянии друг от друга, в результате чего на стадии (ii) олигонуклеотидные цепи различных реагентов гибридизируются с исследуемой нуклеиновой кислотой на разных участках носителя, находящихся на расстоянии друг от друга.

25. Способ по пп. 14-24, отличающийся тем, что каждый компонент-метку отделяют от связанного с ней реагента методом фотоотщепления.

26. Способ по пп. 14-25, отличающийся тем, что анализ компонента-метки проводят с помощью масс-спектрометрии.

27. Оборудование для проведения анализа, включающее: носитель, имеющий два или более находящихся на расстоянии друг от друга участка; индивидуальные клоны исследуемой нуклеиновой кислоты, иммобилизованные на находящихся на расстоянии друг от друга участках носителя; различные реагенты по п. 10, гибридизуемые с индивидуальными клонами исследуемой нуклеиновой кислоты на участках носителя, находящихся на расстоянии друг от друга.