JPH05501961A - Dnaプローブを用いる新規病原体検出方法 - Google Patents
Dnaプローブを用いる新規病原体検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
DNAプローブを用いる新規病原体検出方法本発明の概要
開示された新規方法により、人血検体を含む生物学的液体中の病原体例え1セ熱
帯熱マラリア原虫(Plasmodiumfalcipars)寄生虫の迅速な
多検体用の非放射性検出方法が達成される。その検出は寄生虫特異的DNAプロ
ーブおよびマククロタイタープレートを用いたサンドイッチ・ハイブリダイゼー
ション法の使用に基づいている。これらのアッセイは感度および特異性が高くま
た実施が容易なために、を椎動物および無を椎動物の多くの血液その他の着色組
織一体めルーチン分析に用いることができる。
特に、これらのアッセイは熱帯熱マラリア原虫の有無の検出に用いることができ
る。記述される方法は非放射性DANプローブを用いた多岐にわたる様々なりA
N検出分析への応用に適している。熱帯熱マラリア原虫の検出に関し、本発明は
さらに新規DAN断片およびかかる断片に基づくハイブリダイゼーション・プロ
ーブにも関する。
本発明は、前記新規方法に基づく診断キットを提供する。
本発明の背景
マラリアはプラスモジウム(Plas■odium)属に属する原生動物寄生虫
に起因している。この寄生虫のライフサイクルは工期、すなわち、を椎動物体内
における無性生殖期および蚊(通常はアノフエレス(^nopheles)属の
)の体内における有性生殖期に分かれる。ヒトマラリアに関係するプラスモジウ
ムの四種は熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫(P、vivax) 、四
日熱原虫(P。
malariae)および卵形マラリア原虫(P、 ovale)である。
これらの中では、最初の二つが最も普遍的である。熱帯熱マラリア原虫は場合に
よっては致命的な最も重い形のマラリアを引き起こす。さらに、この寄生虫は通
常用いられる抗マラリア薬に対する耐性をも生じる。
現在のマラリア診断方法は血液塗抹標本検査によっている。この方法は面倒であ
りまた専門性を必要とする。
さらに−人の熟達した鏡検技士でも1日に最高で60枚のスライドを検査できる
に過ぎない。血清学による診断もなし得るが、抗体が存続するため、現在の感染
を過去の感染と区別できない(1)。そのため、新世代の診断テストの探究には
、寄生虫有無の指標として寄生虫核酸を検出する可能性が含められている。理論
上は、かかるテストは指を針で刺すこと(finger prick)により得
られる極少量の血液(5〜5011Il)シか必要としないはずであり、また鋭
敏かつ迅速なはずである。血液lhl中わずか50体の寄生虫も核酸ハイブリダ
イゼーションにより検出できる(2)。最初に若干の訓練を受けただけで1日に
数百の検体を分析することができる。このアッセイの感度は血液銀行が輸血に使
用する血液のスクリーニングに用いることを可能にしている。
核酸ハイブリダイゼーションは、キャリアーとしての媒介生物種を同定するため
に、昆虫組織検体に対して行うこともできる。かかる情報は、マラリアの地理的
伝播を制限するための媒介コントロール措置の強化に役立つであろう。あるいは
また、化学的予防をかかる領域において採用し得るがこの手法の評価を核酸ハイ
ブリダイゼーションを用いて行うことができる。本特許出願に記載の方法は、核
酸ハイブリダイゼーション法を用いた効率的な寄生虫検出実施手段を提供する。
本発明による検出方法は、一般に、ヒト、およびを椎動物および無を椎動物一般
例えば家畜および昆虫などの血液、組織、サンプルおよび体液中の病原体特に血
中病原体の有無の検出に用いることができる。
前記病原体は、例えば細菌、ウィルスおよび、例えばプラスモジウム属の寄生虫
、特に熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫などであってよい。更なる
病原体例としてはシゲラ(Shigella)、例えばフレキシナ−菌(Shi
gella flexneri) 、赤痢菌(Shigella dysent
eriae)、ゾンネ菌(Shigella 5onnei)および結核菌(i
lyco−bacteriuIItuberculosis)などが挙げられる
。
本出願中の特定例は熱帯熱マラリア原虫に関するものであるが、その検出法が以
上概説した如く一般的に用いることができることは理解されよう。
従来技術
核酸(DNAおよびRNA)をベースにしたハイブリダイゼーションは現在多く
の臨床診断に用いられている。当初この技術は放射性標識プローブを用いた。放
射性方式による診断の感度は十分であるが、この方法は、放射性物質取扱いに必
要な注意および規制のために臨床ラボラトリ−において人気がない。そこで、核
酸ハイブリダイゼーションによる病原体検出の分野においては非放射性検出が重
要のこととなっている。最も人気のある非アイソトープ検出方法の一つは、核酸
プローブへのビオチンの酵素的(3)または光化学的(4)取込みに基づいてい
る。ビオチン標識プローブを結合するハイブリッドは次いでアビジンまたはスト
レプトアビジンおよび適当な酵素例えばホスファターゼまたはペルオキシダーゼ
などの複合体を用いて容易に検出することができる。前述の非アイソトープ法は
魅力的にみえるが、未だ人気はない。
い(つか重要な課題の解決が残っている。主な課題は着色バックグランドおよび
標的DNAの純度状態に関するものである。大抵のDNAをベースとした診断剤
は膜フィルターにトロセルロースまたはナイロン)上に置かれる。
病原体有無の検査対象体液例えば血液は、膜フィルターに直接スポットしてDN
Aを固定すると消し得ない着色マークを残してしまいそのために以後のハイブリ
ダイゼーション後の発色がほとんど不可能となる。従って残された唯一の選択肢
は組織または体液中に存在する病原体から得られる純粋DNAをスポットするこ
とである。DNAの単離は遠心分離および沈殿を含む手順を伴うので、迅速な多
検体診断のフィーシビリテイ−は激減してしまう。核酸ハイブリダイゼーション
に基づく好ましい診断法には次の条件が不可欠である:
良いDNAベースの多検体診断手順の必須条件1、 非放射性検出に基づくべき
である。
2、 少量の血液(指を針で刺して得られる一滴)を用いるべきである。
3、 診断キットに用いられる成分の大部分は室温で安定であるべきである。
4、 個々の成分を厳密にマイクロピペッティングすることは避けられるべきで
ある。
5 遠心分離および沈殿段階は避けられるべきである。
6、 うまく操作するのに最小の訓練ですむべきである。
本発明によりこれらすべての基準を満たす検出方法が提供される。
本発明は以下のとおり要約される:
1、 下記配列:
AGGTCTTAACATGACTAACT^^GGTCTT^^CTTAAC
T^^CTTAGGTCTTACTTT^^CTAAACT
を有する一本鎖DNA断片(f63)またはその相補鎖、またはf63またはそ
の相補鎖に対して/%イブリダイズできるそれらの変種、または相当する二本鎖
配列。−重鎖DNAを用いるのが好ましい。
2、 少くとも20塩基または塩基対長よりも大きい第1項に定義されたDNA
断片またはその隣接セグメント(con−tiguous segment)
、特にAGGTCTTAACATGACTAACT^。
3、−重鎖形態の第1または2項記載のDNA断片。
4、 第1および2項記載のDNA断片より成るハイブリダイゼーションプロー
ブ。
5、 比色検出可能な基により標識される第4項記載のハイブリダイゼーション
プローブ。この基の性質は本発明にとって臨界的ではない。
6、 比色検出用に標識された基がビオチンである第5項記載のハイブリダイゼ
ーションプローブ。ビオチンは一つの好ましいレポーター基である。
7、 比色検出用に標識された基が発色団(chromophoric)レポー
ター基である第5項記載のハイブリダイゼーションプローブ。
8、 以下の諸段階より成る血液またはその他の体液に存在する病原体の検出方
法:
a)塩酸グアニジン(GuHCA’) 、ナトリウムラウリルサルコシン(SL
S)およびTriton−X−100を含む溶液中で血液検体を溶解(lysi
ng)する。
b)適切には加熱により前記血液検体中に存在するDNAを変性させ、そして前
記病原体のDNAとハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブの存在
下に溶液ハイブリダイゼーションを行う。
c) 8b)段階に用いたハイブリダイゼーションプローブが結合する同じゲノ
ムDNA鎖にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼー
シコンプローブで被覆されたマイクロタイタープレートで8b)段階で形成され
たハイブリッドを捕獲(capture)する。(特に熱帯熱マラリア原虫を検
出するための)好ましい一態様においては、マイクロタイタープレートの被覆に
用いるヌクレオチド配列は、8b)段階で用いられるハイブリダイゼーションプ
ローブの配列と同じである。
d)前記マイクロタイタープレートを標準食塩−クエン酸緩衝液(SSC)、ド
デシル硫酸ナトリウム(SDS)およびTriton−X−100より成る溶液
を用いて洗浄する。
e)比色法によりハイブリッドの有無を検出する。
9、 ハイブリダイゼーションプローブが第2および第3項に記載のとおりであ
る第8項記載の方法。好ましい一側面において、本発明はプラスモジウム属に属
す種の検出に用いられる。
10、8 a)段階の試薬の最終濃度が次のとおりである第8および9項記載の
方法:
a)塩酸グアニジン: 1.OM 〜3.0Mb)ナトリウムラウリルサルコシ
ン:o、2%〜0.5%f/V N/V
c) Triton−X−100: 0.2%〜0.5%V/V V/V以上は
好ましい範囲を示している。
11、8 e)段階の最終濃度が次のとおりである第8および9項記載の方法・
a)標準食塩−クエン酸緩衝液 −0,5x〜2.5xsscb) Trito
n−X−100−0,2%〜0.5% ’i/VC) ドデシル硫酸ナトリウム
−0,2%〜0.5%1/V以上は好ましい範囲を示している。
12 溶解溶液が可溶化剤としてもハイブリダイゼーション溶液としても用いら
れる第8〜11項記載の方法。
13、 2XSSCが非特異的ハイブリッドの除去に用いられる第8〜12項記
載の方法。
14、 Triton−X−100およびSO3が血液超厚の着色物質の除去に
用いられる第8および14項記載の方法。
15、病原体が熱帯熱マラリア原虫である第8〜14項記載の方法。
16、病原体か三日熱マラリア原虫である第8〜14項記載の方法。
17、病原体がシゲラである第8〜14項記載の方法。
18、病原体が結核菌である第8〜14項記載の方法。
19 第8〜18項記載の方法に基づく標的ポリヌクレオチド配列に存在する所
与のヌクレオチド配列の検出のための診断キット。
DNAをベースとするサンドイッチハイブリダイゼーションの原理
背景:
非放射性方式における最終検出様式は、アルカリ性ホスファターゼまたは西洋ワ
サビペルオキシダーゼにより触媒される反応に用いられる基質の性質に応じて可
溶性または不溶性の色の発色である。したがって、残留着色物質を標的DNAか
ら除去しそして内生酵素を不活化させることが必須である。これによって(放射
性ハイブリダイゼーション方式の場合に行われているような)膜フィルターへの
血液の直接スポットは無用となる。何故ならばフィルターから残留する血液の染
み(blood 5tain)を除去することはほとんど不可能だからである。
この問題を避けるために、我々は、マイクロタイタープレート方式とサンドイッ
チハイブリダイゼーションを組み合わせて用いた。その基本原理を以下に記載す
る。
熱帯熱マラリアゲノムの特徴の一つがそれが該ゲノムの大領域にタンデムに存在
する21塩基対リピートを含んでいることであることはすでに示されている(5
〜6)。
この反復配列により表わされるゲノムの割合は約1%である。このリピート配列
を含むいくつかのクローンを比較した結果、コンセンサス21塩基対リピート配
列が示された。このコンセンサス配列に基づき、我々は63マーオリゴヌクレオ
チドプローブ(以下f63と記す)を設計し構築した。それは熱帯熱マラリア原
虫DNAの反復配列において最大に示されるタンデムに並ぶ3つの217−で構
成されている(第1図)。プローブとして一本鎖DNAおよび前述のその鎖長を
用いることが好ましいのは以下の理由に基づ(。−重鎖DNAは標的DNAに対
してのみハイブリダイズするので、プローブとして二本鎖よりも優れている。
二本鎖DNAの場合には、自己ハイブリダイゼーションの確立が高まり、そのた
めに標的DNAの結合に必要となるプローブの有効濃度が減少する。このことは
費用対効果において一本鎖プローブの方が優れている二七は明確に確立するもの
である。何故なら一重鎖ブローブはハイブリダイゼーシヨンに対してはるかに少
量しか要求されないからである。−重鎖DNA製造にはいくつかの方法を利用で
きるが、それらのうちでもオリゴヌクレオチド合成が最も便利である。
熱帯熱マラリア原虫以外の病原体の検出には、その病原体DNAにおいて反復さ
れる至適DNAプローブを設計する必要がある。このハイブリダイゼーションプ
ローブは次いで以下熱帯熱マラリア原虫について特定的に記載するサンドイッチ
・ハイブリダイゼーションの検出プロトコールと同様にして用いることができる
。
サンドイッチ・ハイブリダイゼーションの基本的プロトコールを以下に記す(第
2図に図説もされている)。
サンドイッチ・ハイブリダイゼーションによる人血中熱帯熱マラリア原虫感染の
非放射性診断フローチャート
指に針を突いて得た一滴の血液検体(50μ/)を溶解溶液とbio−f63プ
ローブを含む小プラスチック管に添加する。
フェーズ11 (Dよく混合する。
寄生虫DNA−
bio−f63プローブハイブリッド
第2図プレートA参照
1 ブで予め被覆されたマイクロタ
捕獲ハイブリ、ド
第2図プレートC参照
ル
フェーズ3 (i)フェーズ2からのマイクロタイタープレートのウェルを0.
2
1 (iii)各ウェルにおいてAPB−1溶液(xii)マイクロタイタープ
レート
リーダーで410nmの吸光度を読
む。
比色法による検出の用意の整った捕獲ハ第2図プレートD
より低い吸光度値を与えるはず
である。
この方法の成功は、熱帯熱マラリア原虫DNAが処理の間はとんど分解されずに
いるという事実に依存している。
溶液ハイブリダイゼーション段階において、ビオチン化f63は熱帯熱DNAに
結合し、そしてほとんど完全に進行するが、溶液ハイブリダイゼーション速度は
、固定標的DNAに比べはるかに速い。捕獲ハイブリダイゼーションの効率は、
熱帯熱マラリア原虫は熱帯熱マラリア原虫DNA長に正比例する。極端な場合、
熱帯熱マラリア原虫DNAが全く分解されなければ、わずか0.03%という捕
獲ハイブリダイゼーションでさえすべてのハイブリッドコンブレンクスを生じさ
せることができる。
その他の病原体の場合、捕獲ハイブリダイゼーションの効率は病原体ゲノムにお
けるプローブの反復回数に依存することとなろう。
血液検体中熱熱帯マラリア原虫DNAの非アイソトープ検出プロトコール
1、 プローブの調製:
マイクロタイタープレート被覆用プローブ、63マーオリゴヌクレオチド(f6
3)を自動DNAンンセサイザ−(^pplied biosystems 3
40A)を用いて合成した。
ハイブリッド検出用標識プローブ・公表された手順に従ってフォトビオチンアセ
テートを用いたフォトビオチン化によりf63のビオチン化を行った。
2、 マイクロタイタープレートの被覆:マイクロタイタープレート(Dyna
tech、ポリ塩化ビニル)のすべてのウェルを0.IM MgC6を含む50
μl量中の様々な量(1μ9〜10ng)のf63で被覆する。被覆を一夜行っ
た後、マイクロタイタープレートを10c厘の距離をおいて5分間殺菌UVラン
プ(40ワツト)下に曝露してDNAを固定する。次にウェルの内容物を捨て、
そしてそれらウェルを2XSSC緩衝液で洗浄する。それらウェルの各々におけ
る未占有部位を2XSSC,5XDenhardts10.5%Triton−
X−100.0.5%SDSおよび50IIg/111!サケ精子DNAを含む
緩衝液(200μl/ウエル)中でプレハイブリダイゼーションを行うことによ
りブロックする。このプレハイブリダイゼーションは、室温で4〜6時間行われ
る。被覆されたプレートはこの段階で室温で保存することができる。
3、 血液検体収集および溶液ハイブリダイゼーション:血液検体(50ttl
アリコート)を指に針を刺すことにより集めて、4M塩酸グアニジン(Gu H
CI) 、0.5%ナトリウムラウリルサルコシン(SLS)および0.5%T
riton−X−100を含む溶液50μlに直接式れる。この溶液はさらに5
r+gのオリゴヌクレオチドプローブ(ビオチン化f−63)をも含有する。こ
の混合物を95℃で5分間加熱した後室温に4〜6時間保って溶液ハイブリダイ
ゼーションを行わせる。
4、 捕獲ハイブリダイゼーション:
溶液ハイブリダイゼーション終了後、エッペンドルフ管の内容物を未標識f−6
3で予め被覆されたマイクロタイタープレートのウェルに移す。このサンドイン
チ・ハイブリダイゼーション(捕獲)を24時時間待させる。このフェーズにお
いて、プレートに被覆されたf−63とハイブリッドにおいて利用可能な残りの
相補部位との間にハイブリダイゼーションが生じる。そのハイブリッドはある場
所にビオチン化f−63を担持し他の相補部位を残す標的DNAの長片である(
第2図参照)。
5、 発色・
サンドイッチ・ハイブリダイゼーション終了後、マイクロタイタープレートのウ
ェルの内容物を捨て、そしてウェルを2xSSC,0,2% SDSおよび0,
2%Tri ton−X−100を含む溶液を用いて4回にわたり、各々室温で
5分間洗浄する。このハイブリダイゼーション後洗浄の間に、すべての着色物質
が除去され後にサンドインチ・ハイブリッドが残る。それらのウェルを次にI
M NaC1,loomM Tris−CA’ (pH7,5) 、2 nM
MgC1z、口、05%Triton−X−100および3%BS^を含む溶液
である^、P’7.5を用いて室温で30分間ブロックする。
次にそれらサンドイッチ・ハイブリッドを、例えばストレプトアビジン−アルカ
リ性ホスファターゼ接合体を用いることにより検出する。ストレプトアビジンア
ルカリ性ホスファターゼ接合体(1ag/ wl)をA、P7.5緩衝液に添加
する。この溶液(ストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ含有^、P7.
5緩衝液)50IINを各ウェルに添加し、そしてインキュベーションを室温で
さらに30分間続ける。過剰の未結合接合体をBS^不含A、P7.5緩衝液を
用いて4回、各々室温で5分間洗浄することにより除去する。
最後ニソれらウェルをA、P9.5 (100IIM Tris−CA!(pH
9,5)、100+M NaC1および5o1MMgc11ヲ含ム基質インキュ
ベーション緩衝液)ですすぐ。50alの基質p−ニトロフェニルホスフェート
を^、P 9.5に1119/II/濃度で添加しそしてこの溶液50alを各
ウェルに添加する。発色は6〜12時間行わせる。適当なプレートリーダー(例
えばDynatechプレートリーダー)を用いて(410rvにおける)吸光
度を記録する。
テスト結果を次表に示す。
結果:
1μ9 500ng100ng1.Ong500ng 超過 超過 超過 超過
7.5ng1.511 1.242 1.373 0.9291μ9 0.29
1 0.295 0.263 0.214注:ヒト検体では、感染が約1%の場
合50μmの血液は約50ngの寄生虫(熱帯熱マラリア原虫) DNAを有す
る。
「超過」という用語は2.0を超える光学密度を示す。
図の説明:
第1図は、熱帯熱マラリア原虫のコンセンサス反復配列(21塩基リピート)か
ら設計されたオリゴf63を示す。
第2図の説明
A:溶液ハイブリダイゼーション
Bニブローブf63で被覆されたマイクロタイターウェルを表わす。
C捕獲ハイブリダイゼーション
D:洗浄後で発色用意の整った捕獲ハイブリッド第3図は次を表わす・
A、ビオチン化f63 DNA
Bニゲツム熱帯熱マラリア原虫DNA
C: f63 DNA
参考文献:
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ビオチン化f63を表わす。
B ゲノム熱帯熱マラニア原虫DNAを表わす。
Cf63DNAを表わす。
要 約 書
開示された新規方法により、人血検体を含む生物学的液体中の病原体例えば熱帯
熱マラリア原虫寄生虫の迅速な多検体用の非放射性検出方法が達成される。その
検出は寄生虫特異的DNAプローブおよびマイクロタイタープレートを用いたサ
ンドイッチ・ハイブリダイゼーション法の使用に基づいている。これらのアッセ
イは感度および特異性が高くまた実施が容易なために、を推動物および無を推動
物の多くの血液その他の着色組織検体のルーチン分析に用いることができる。特
に、これらのアッセイは熱帯熱マラリア原虫の有無の検出に用いることができる
。記述される方法は非放射性DNAプローブを用いた多岐にわたる様々なりNA
検出分析への応用に適している。
熱帯熱マラリア原虫の検出に関し、本発明はさらに新規DNA断片およびかかる
断片に基づ(ハイブリダイゼーション・プローブにも関する。
本発明は、前記新規方法に基づく診断キットを提供する。
国際調査報告
喝−n*+Il+la*+1llItl’eal+6gHaρCT/5E911
00533国際調査報告
PCT/SE 91100533
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.下記配列: AGGTCTTAACATGACTAACTAAGCTCTTAACTTAAC TAACTTAGGTCTTACTTTAACTAAACT を有する一本鎖DNA断片(f63)またはその相補鎖、またはf63またはそ の相補鎖に対してハイブリダイズできるそれらの変種、または相当する二本鎖配 列。 2.少くとも20塩基または塩基対長よりも大きい請求項1記載のDNA断片ま たはその隣接セグメント、特にAGGTCTTAACATGACTAACTA。 3.一本鎖形態の請求項1または2記載のDM断片。 4.請求項1または2記載のDNA断片より成るハイブリダイゼーションプロー ブ。 5.比色検出可能な基により標識される請求項4記載のハイブリダイゼーション プローブ。 6.比色検出用に標識された基がビオチンである請求項5記載のハイブリダイゼ ーションプローブ。 7.比色検出用に標識された基が発色団レポーター基である請求項5記載のハイ ブリダイゼーションプローブ。 8.以下の諸段階より成る血液またはその他の体液に存在する病原体の検出方法 : a)GuHCl、SLSおよびTriton−X−100を含む溶液中で血液検 体を溶解する、 b)前記血液検体中に存在するDNAを変性させ、そして前記病原体のDNAと ハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブの存在下に溶液ハイブリダ イゼーションを行う、 c)8b)段階に用いたハイブリダイゼーションプローブが結合する同じゲノム DHA鎖にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーシ ョンプローブで被覆されたマイクロタイタープレートで8b)段階で形成された ハイブリッドを捕獲する、 d)そのマイクロタイタープレートをSSC、SDSおよびTriton−X− 100より成る溶液を用いて洗浄する、e)比色法によりハイブリッドの有無を 検出する。 9.変性段階8b)が加熱により行われる請求項8記載の方法。 10.マイクロタイタープレートの被覆に用いられるハイブリダイゼーションプ ローブが8b)段階で用いたハイブリダイゼーションプローブと同じヌクレオチ ド配列を有する請求項8または9記載の方法。 11.ハイブリダイゼーションプローブが請求項2または3に記載のとおりであ る請求項8記載の方法。 12.8a)段階の試薬最濃度が次のとおりである請求項8〜11のいずれかに 記載の方法: a)塩酸グアニジン:1.1M〜3.0Mb)ナトリウムラウリルサルコシン: 0.2%〜0.5%V/V c)Triton−X−100:0.2%〜0.5%V/V。 13.8e)段階の最終濃度が次のとおりである請求項8および12記載の方法 : a)標準食塩ークエン酸緩衝液−0.5×〜2.5×SSCb)Triton− X−100−0.2%〜0.5%V/Vc)ドデシル硫酸ナトリウム−0.2% 〜0.5%V/V。 14.溶解溶液が可溶化剤としてもハイブリダイゼーション溶液としても用いら れる請求項8〜13のいずれかに記載の方法。 15.2×SSCが非特異的ハイブリッドの除去に用いられる請求項8〜14の いずれかに記載の方法。 16.Triton−X−100およびSDSが血液起原の着色物質の除去に用 いられる請求項8〜15のいずれかに記載の方法。 17.病原体が熱帯熱マラリア原虫である請求項8〜16のいずれかに記載の方 法。 18.病原体が三日熱マラリア原虫である請求項8〜16のいずれかに記載の方 法。 19.病原体がシゲラである請求項8〜16のいずれかに記載の方法。 20.病原体が結核菌である請求項8〜16のいずれかに記載の方法。 21.病原体が血液病原体である請求項8〜16のいずれかに記載の方法。 22.請求項8〜21のいずれかに記載の方法に基づく標的ポリヌクレオチド配 列における所与のヌクレオチド配列の検出のための診断キット。
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