ES2374966T3 - Colorantes de ácidos nucleicos diméricos y triméricos, y sistemas y procedimientos asociados. - Google Patents

Colorantes de ácidos nucleicos diméricos y triméricos, y sistemas y procedimientos asociados. Download PDF

Info

Publication number
ES2374966T3
ES2374966T3 ES06738900T ES06738900T ES2374966T3 ES 2374966 T3 ES2374966 T3 ES 2374966T3 ES 06738900 T ES06738900 T ES 06738900T ES 06738900 T ES06738900 T ES 06738900T ES 2374966 T3 ES2374966 T3 ES 2374966T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
dye
constituent
inclusive
nucleic acid
optionally
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES06738900T
Other languages
English (en)
Inventor
Fei Mao
Wai-Yee Leung
Xing Xin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotium Inc
AlleLogic Biosciences Corp
Original Assignee
Biotium Inc
AlleLogic Biosciences Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36992471&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2374966(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biotium Inc, AlleLogic Biosciences Corp filed Critical Biotium Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2374966T3 publication Critical patent/ES2374966T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/08—Indoles; Hydrogenated indoles with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/36—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms
    • C07D213/38—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms having only hydrogen or hydrocarbon radicals attached to the substituent nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/06—Ring systems of three rings
    • C07D221/10—Aza-phenanthrenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D491/14—Ortho-condensed systems
    • C07D491/147—Ortho-condensed systems the condensed system containing one ring with oxygen as ring hetero atom and two rings with nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B15/00—Acridine dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Un procedimiento para determinar la formación de ácido nucleico o la ausencia del mismo en una muestra que puede comprender o no un ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una disolución de ensayo que comprende la muestra y un colorante fluorescente de ácido nucleico, teniendo el colorante fluorescente de ácido nucleico la fórmula: en el que el PUENTE es un enlazante sustancialmente alifático que es neutro o tiene hasta una carga positiva, y comprende entre aproximadamente 8 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno; Q1 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico; Q2 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de acido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico, al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y el constituyente colorante Q2 es un constituyente colorante indicador, al menos un constituyente del constituyente colorante Q1 y el constituyente colorante Q2 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico o un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico; y el constituyente colorante indicador y el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico son opcionalmente el mismo. b) llevar a cabo un proceso usando la disolución de ensayo que sería suficiente para la amplificación del ácido nucleico diana en el que la muestra debe comprender el ácido nucleico diana; e c) iluminar la disolución de ensayo con luz a una longitud de onda suficiente para la absorción por el constituyente colorante indicador y determinar la emisión fluorescente o una ausencia de la misma; en el que el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico se selecciona entre un colorante de acridina, un colorante de cianina asimétrica, un colorante de cianina simétrica, un colorante de fenantridinio, y un colorante de pironina, y un colorante de estirilo; y en el que dicho colorante de acridina tiene la estructura: en el que cada R1, de manera independiente, es H o alquilo C1-C2, inclusive; uno de R2 y R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R2 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R3 es H o -CH3; cuando R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R2 se selecciona entre H, -CH3, -NH2, -NHCH3, -CN, y -C(=O)NH2; cada uno de R6, de manera independiente, es H o un alquilo C1-C2, inclusive; cada uno de R7, de manera independiente, es H o un alquilo C1-C2, inclusive; para cada pareja de R6 o R7 y R1 adyacentes, de manera independiente, R6 o R7 y R1 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, y - es un anión; dicho colorante de cianina asimétrica tiene la estructura: en la que cada uno de R1 y R1' de manera independiente es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos; un halógeno; -OR9;-SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; o -C(=O)NHR; o un sustituyente asociado con unión a la ranura menor; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura: cuando R1' comprende al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, cualquiera de dicho uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, de manera independiente, es H o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s), inclusive, o un arilo; cuando R1' comprende R11 y R12, R11 y R12 pueden, en combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; X se selecciona entre O y S; n se selecciona entre 0, 1 y 2; R2 puede ser metilo o etilo, o puede representar donde el PUENTE se une a la estructura; R3, R4, y R5 son, de manera independiente, H o -CH3, u, opcionalmente, cualquier pareja adyacente de estos sustituyentes puede formar un anillo de 5 o 6 miembros; R6 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomos(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R7 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o un arilo sustituido o no sustituido que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomos(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8'es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 100 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; - OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomos(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; R8 y R8' pueden, en combinación formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 vez(ces), inclusive, de manera independiente, por alquilo C1-C2, inclusive, alcoxilo C1-C2, inclusive, alquilmercapto C1-C2, inclusive, o un halógeno; para cualquiera de R6, R8, o R8' que comprende al menos uno de R16 y R17, cualquiera de dicho uno de los mismos R16 y R17, de manera independiente, es H; alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) o un arilo; para cualquier R6, R8, y R8' que comprende R16 y R17, los mismos R16 y R17 pueden, en combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; solo uno de R1, R1', R6, R7 y R8 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; y - es un anión; y dicho colorante de fenantridinio tiene la estructura: en la que R1 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; y - es un anión.

Description

Colorantes de ácidos nucleicos diméricos y triméricos, y sistemas y procedimientos asociados.
ANTECEDENTES
[0001] Se han usado colorantes fluorescentes para la detección y el análisis de muestras biológicas. Como los colorantes fluorescentes son muy sensibles, se pueden usar para detectar un número muy pequeño de moléculas fluorescentes. Por ejemplo, dichos colorantes fluorescentes se pueden usar para detectar menos de 50 moléculas fluorescentes que se asocian con células. Barak, y col., J. Cell Biol. 90, 595 (1981).
[0002] Se pueden usar colorantes fluorescentes como sondas para uso en formación de imágenes en células vivas o muestras de tejidos. Por ejemplo, una sonda de colorante fluorescente unida a un receptor sobre la superficie de células de Dictyosrelium se ha usado en la formación de imágenes de una única molécula de AMPc marcado fluorescentemente. Ueda, y col., Science 294, 864 (2001). Algunas sondas fluorescentes que tienen diferentes longitudes de onda fluorescentes se pueden usar para llevar a cabo adquisición de imágenes multicolor en células vivas o muestras de tejidos. Las sondas fluorescentes son muy sensibles, de relativamente baja toxicidad, y fáciles de eliminar con respecto a sondas radioactivas.
[0003] Se pueden usar colorantes fluorescentes en la detección de ácidos nucleicos, incluyendo ADN y ARN y muestras biológicas que implican ácidos nucleicos. Los polímeros de ácidos nucleicos tales como ADN y ARN están implicados en la transmisión de información genética de una generación a la siguiente y en el funcionamiento rutinario de los organismos vivos. Los ácidos nucleicos son por tanto de interés y objetos del estudio. Los colorantes de ácidos nucleicos que se unen específicamente a los ácidos nucleicos y forman complejos muy fluorescentes son herramientas útiles para dicho estudio. Estos colorantes se pueden usar para detectar la presencia y cantidades de ADN y ARN en una variedad de medios, incluyendo disoluciones puras, extractos celulares, geles electroforéticos, chips de micromatrices, células vivas o fijadas, células muertas, y muestras ambientales. Estos colorantes se pueden usar para la detección cuantitativa del ADN en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR), que es una técnica usada en la investigación genómica y el diagnóstico médico.
[0004] La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción de extensión del cebador que proporciona un procedimiento para amplificar ácidos nucleicos específicos in vitro. Por lo general, en la PCR, la disolución de reacción se mantiene durante un corto periodo a cada una de tres temperaturas, 96°C, 60°C y 72°C, para permitir la separación o desnaturalización de la cadena, la hibridación, y la extensión de la cadena, respectivamente. Estas tres etapas de temperatura se repiten durante 30 o 40 ciclos con el uso de un termociclador automatizado que puede calentar o enfriar el tubo que contiene la mezcla de reacción muy rápidamente. Repitiendo el ciclo de la PCR, se pueden producir un millón de copias en una única mezcla de reacción enzimática en unas pocas horas, permitiendo a los investigadores determinar el tamaño y la secuencia del ADN diana. Esta técnica de amplificación del ADN se ha usado para la clonación y otras manipulaciones biológicas moleculares. Se proporciona una discusión adicional de la PCT en Mullis, y col., Methods Enzymol. (1987), y Saiki, y col., Science (1985).
[0005] Una técnica basada en la PCR que es útil es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). De manera breve, el mecanismo de la qPCR se basa en la amplificación de la PCR de un ADN diana de una manera exponencial. Haciendo avanzar una reacción de la PCR y midiendo el número total de copias de ADN en puntos dados durante el curso de la reacción de amplificación se puede calcular de manera retroactiva la cantidad de material de ADN de partida.
[0006] La detección de ADN basada en la fluorescencia es un procedimiento de detección generalmente sensible, versátil, y conveniente que se usa en la qPCR. Existen dos tipos de reactivos fluorescentes usados en la qPCR. El primer tipo se basa en oligonucleótidos marcados con uno o más colorantes fluorescentes, o con una combinación de un colorante fluorescente y un colorante apagador. Estos oligonucleótidos marcados liberan fluorescencia de una manera proporcional a la cantidad de ADN presente tanto tras la hibridación de una secuencia diana, como tras la escisión de los oligonucleótidos que sigue a la hibridación. El mecanismo y el uso de reactivos fluorescentes basados en oligonucleótidos se han descrito en diversas patentes y publicaciones. Véase, por ejemplo, Holland, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991); Lee, y col., Nucleic Acids Res. (1993); y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.210.015, 5.538.848, 6.258.569, 5.691.146, 5.925.517, 5.118.801, 5.312.728, y 6.635.427. Aunque los reactivos fluorescentes basados en oligonucleótidos para la qPCR tienen la ventaja de ser muy específicos para una secuencia diana, tienen un diseño muy complejo y por consiguiente son caros de usar. El segundo tipo de reactivos fluorescentes usado en la qPCR se basa en los colorantes fluorescentes unidos al ADN, que se denominan comúnmente como colorantes o tintes fluorescentes de ácido nucleico. Debido a que los colorantes fluorescentes de ácido nucleico son moléculas relativamente sencillas, son fáciles de fabricar y de esta manera, baratos de usar. Su aplicación en la qPCR es útil para la detección genética rutinaria en los laboratorios de investigación.
[0007] No todos los tintes fluorescentes de ácido nucleico disponibles comúnmente se pueden usar para la qPCR. Idealmente, un colorante fluorescente de ácido nucleico deberá cumplir algunos criterios para ser adecuado para uso en la qPCR. En primer lugar, debe ser químicamente estable durante la PCR y el almacenamiento. Debido a que la PCR se lleva a cabo a elevada temperatura, el colorante debe ser termoestable. Adicionalmente, debido a que el pH del tampón Tris usado para la PCR puede variar considerablemente desde alcalino (pH 8,5) a baja temperatura (4ºC) a neutro o ligeramente ácido a elevada temperatura, el resistente debe ser a la descomposición asistida por ácido o por base. En segundo lugar, el colorante, cuando está presente en la disolución de la PCR, no debe inhibir el proceso de la PCR. En tercer lugar, el colorante debe no ser fluorescente o mínimamente fluorescente en ausencia del ADN, y debe volverse muy fluorescente en presencia de ADN. En cuarto lugar, el colorante debe tener longitudes de onda de absorción y emisión que sean compatibles con los instrumentos existentes, que están normalmente equipados con canales ópticos optimizados para los colorantes fluorescentes comunes, tales como FAM, JOE, VIC (Applied Biosystems, Foster City, CA), TAMRA, ROX, Texas Red, Cy3, y Cy5, por ejemplo. En quinto lugar, el colorante debe unirse con el ADN con poca o ninguna preferencia por la secuencia. En sexto lugar, los complejos de ADN-colorante deben tener intensidades de fluorescencia que estén relacionadas linealmente con la cantidad de ADN presente.
[0008] Dados los anteriores criterios, no es sorprendente que se puedan usar muy pocos colorantes de unión a ácido nucleico para la qPCR. El bromuro de etidio (BE) es un colorante de ADN que se ha usado para demostrar la factibilidad de usar un colorante sencillo para la qPCR. Higuchi, y col., Bio-Technol. 10(4), 413 (1992). Sin embargo, BE adolece de problemas de baja sensibilidad y longitudes de onda indeseables. Un colorante ampliamente usado para la qPCR es SYBR Green I de Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon (OR)). Wittwer, y col., Biotechniques 22(1), 130 (1997). SYBR Green I es un colorante de cianina asimétrica cíclicamente sustituido. Zipper, y col., Nucleic Acids Res. 32(12), e103 (2004); y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.436.134 y 5.658.751. Las ventajas de SYBR Green I son que tiene longitudes de onda de excitación y emisión muy estrechamente relacionadas con las de FAM, con lo cual, la mayor parte de los instrumentos son compatibles, y que es muy fluorescente cuando se une al ADN. Recientemente, un colorante de ADN denominado LC Green se ha usado para la qPCR, aunque no se ha dado a conocer la estructura del colorante. Aunque el colorante LC Green parece tener longitudes de onda deseables que corresponden al canal óptico de FAM comúnmente usado en la mayor parte de los instrumentos de la PCR, es mucho menos sensible a SYBR Green I. Más recientemente, un aglutinante de la ranura menor del ADN denominado BEBO, y un colorante relacionado denominado BOXTO, ambos cuales son colorantes de cianina asimétricas, se han informado para uso en la qPCR. Bengtsson, y col., Nucleic Acids Res. 31(8), e45 (2003); y Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0132046. De manera similar a LC Green, BEBO y BOXTO quedan rezagados significativamente respecto de SYBR Green I en términos de sensibilidad.
El documento EP1344835 da a conocer un compuesto meta-EthD que comprende dos unidades fluorescentes unidas por un puente alifático y que se usan como un agente intercalante y sonda de amplificación del ADN.
El documento EP1348713 se refiere a un procedimiento para medir muestras de ácido nucleico que implica un colorante, incluyendo meta-EthD.
Atwell G J y col (JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. WASHINGTON.; US, vol. 29, 1 de enero de 1986 (1986-01-01), páginas 69-74) dan a conocer derivados de tiacridina y diacridina como fármacos antitumorales, que se usan en ensayos de ARN polimerasa. Wirth M y col (JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 110, nº. 3, 1988, páginas 932-939) dan a conocer también derivados de tiacridina.
ZIMMERMAN S C Y COL (JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 111, nº. 17, 1989, páginas 6805-6809) describen compuestos de bisacridina que son de uso como agentes intercalantes para la detección del ADN.
US5410030 da a conocer un colorante dimérico con un puente alifático útil para teñir el ADN.
[0009] Aunque se ha usado ampliamente SYBR Green I como colorante de ADN para la qPCR, este todavía tiene carencias en algunos aspectos. Por una parte, SYBR Green I tiene un efecto inhibidor sobre el proceso de la PCR que limita la fuerza máxima de la señal que se puede conseguir aumentando la concentración del colorante hasta que la concentración de colorante alcanza un punto en el que el colorante comienza a inhibir el proceso de la PCR significativamente. Un aumento adicional en la concentración del colorante disminuirá realmente la fuerza de la señal o aumentará el número de ciclos (Ct) debido a una amplificación reducida del ADN. Por otra, SYBR Green I es químicamente inestable en condiciones alcalinas, tales como la condición alcalina del tampón de la PCR cuando se almacena a baja temperatura. Se ha informado que SYBR Green I almacenado en tampón Tris a 4ºC se descompone significativamente en el curso de unos pocos días y que los productos de descomposición del colorante son aparentemente potentes inhibidores. Karsai, y col., BioTechniques 32(4), 790 (2002). Por otra parte, SYBR Green I proporciona solo un color de fluorescencia. Muchos instrumentos de detección de la fluorescencia comercialmente disponibles tienen múltiples canales ópticos (el canal óptico FAM y otros canales ópticos adicionales) y son de esta manera capaces de detectar múltiples colores de fluorescencia.
[0010] Es deseable el desarrollo de colorantes fluorescentes o la preparación o su uso.
RESUMEN
[0011] Se describe un procedimiento de producir o diseñar un colorante fluorescente de aplicación útil, tal como por ejemplo en un proceso de la qPCR. El procedimiento implica unir covalentemente dos o tres colorantes monoméricos mediante un puente que puede ser flexible y sustancialmente neutro (por ejemplo, neutro o ligeramente cargado). Un procedimiento de producir o diseñar un colorante, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, puede permitir el desarrollo de un colorante fluorescente de ácido nucleico que tenga una longitud de onda y/o otra propiedad espectral que hasta ahora no se ha podido obtener.
[0012] Se proporciona un colorante fluorescente adecuado para una aplicación útil, por ejemplo tal como el descrito anteriormente. Un colorante dimérico o trimérico, que se puede producir de acuerdo con un procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva, puede formar una estructura en horquilla, que se cree puede permitir al colorante teñir los ácidos nucleicos mediante un mecanismo de liberación a demanda, como se describe adicionalmente en la presente memoria descriptiva. Un colorante descrito en la presente memoria descriptiva puede tener al menos una característica de todas las siguientes características: “fondos de fluorescencia” (fluorescencia en ausencia de ácidos nucleicos) relativamente bajos, si tiene alguno, e idealmente, sin fondos de fluorescencia; relativamente baja inhibición de la PCR, e idealmente, sin inhibición de la PCR; relativamente elevada fuerza de la señal fluorescente; y elevada estabilidad relativa. El colorante puede ser mejor en al menos una de estas características, o en todas estas características, que un colorante existente, tal como SYBR Green I, meramente a modo de ejemplo. Un colorante descrito en la presente memoria descriptiva puede tener una propiedad, tal como una longitud de onda y otra propiedad espectral, por ejemplo, que no se había obtenido hasta ahora.
[0013] Se proporcionan colorantes o tintes de ácidos nucleicos diméricos y/o triméricos que son capaces de formación del dímero intramolecular, o de la formación de una estructura en horquilla. Se cree que el colorante con forma de horquilla puede ser no fluorescente o mínimamente fluorescente por sí mismo, pero puede llegar a ser muy fluorescente en presencia de ácidos nucleicos. Se cree que la unión entre el ácido nucleico y el colorante se puede producir mediante un estado intermedio en el que el colorante toma, en parte, una conformación aleatoria abierta. Se cree además que esta conformación aleatoria abierta del colorante puede existir en una pequeña cantidad y en equilibrio con el estado de horquilla. Se cree que cuando la cantidad de ácidos nucleicos aumenta, se puede producir un cambio de equilibrio desde el estado en horquilla hacia el estado unido al ácido nucleico del colorante, de tal manera que la fuerza de la señal de fluorescencia resultantes puede ser sustancialmente lineal, proporcional a la cantidad de ácidos nucleicos presentes.
[0014] El mecanismo anteriormente descrito, que se puede denominar como mecanismo de liberación a demanda de la tinción del ADN, puede ser deseable para varias aplicaciones, tales como la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) por ejemplo. Meramente a modo de explicación, se cree que la formación de la estructura en horquilla puede volver la “concentración eficaz del colorante” baja, de tal manera que el colorante descrito en la presente memoria descriptiva puede interferir muy poco con el proceso de la PCR. De esta manera, en comparación con los colorantes anteriores, tales como SYBR Green I, por ejemplo, se puede usar una mayor concentración de un colorante descrito en la presente memoria descriptiva en la qPCR. Esta mayor concentración de colorante puede aumentar la sensibilidad de detección del ADN, quizá significativamente.
[0015] Se proporciona un procedimiento de determinación de la formación de ácido nucleico o de su ausencia en una muestra. La muestra puede comprender o no un ácido nucleico diana. Dicho procedimiento puede comprender proporcionar una disolución de ensayo que comprenda la muestra y un colorante fluorescente de ácido nucleico. En el que el colorante fluorescente de ácido nucleico tiene la fórmula:
En el que PUENTE es un enlazante sustancialmente alifático que es neutro o que tiene hasta una carga positiva, que comprende entre aproximadamente 8 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno; Q1 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente de ácido no nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente de ácido no nucleico; Q2 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente de ácido no nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente de ácido no nucleico. Los constituyentes del colorante pueden ser cualquiera de los constituyentes de colorante adecuados, tales como por ejemplo, los descritos en la presente memoria descriptiva. El constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico se selecciona entre un colorante de acridina que tiene una estructura como la descrita en la presente memoria descriptiva, un colorante de cianina simétrica que tiene una estructura como la descrita en la presente memoria descriptiva, un colorante de cianina simétrica, un colorante de fenantridinio que tiene una estructura como la descrita en la presente memoria descriptiva, un colorante de pironina, y un colorante de estirilo. Al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 es un constituyente colorante indicador, y al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 es un colorante fluorescente de ácido nucleico o un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico o un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico. El constituyente colorante indicador y el constituyente
5 colorante fluorescente de ácido nucleico puede ser o no el mismo. El procedimiento comprende llevar a cabo un proceso usando la disolución de ensayo que sería suficiente para que la amplificación del ácido nucleico diana comprenda la muestra del ácido nucleico diana. Meramente a modo de ejemplo, el proceso puede ser un proceso de la PCR, tal como, por ejemplo, un proceso de la PCR en tiempo real. El procedimiento comprende iluminar la disolución de ensayo con luz a una longitud de onda suficiente para la absorción por el constituyente colorante indicador y determinar la emisión fluorescente o su ausencia.
[0016] Se proporciona otro procedimiento de determinar la formación de ácido nucleico o una ausencia del mismo en una muestra. La muestra puede comprender o no un ácido nucleico diana. Dicho procedimiento puede comprender proporcionar una disolución de ensayo que comprenda la muestra y un colorante fluorescente de ácido
15 nucleico, en el que el colorante fluorescente de ácido nucleico tiene la fórmula.
en el que PUENTE es un enlazante sustancialmente alifático que es neutro o que tiene hasta una carga positiva, que comprende entre aproximadamente 15 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno; Q1 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente de ácido no nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente de ácido no nucleico; Q2 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un 25 constituyente colorante fluorescente de ácido no nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente de ácido no nucleico. Los constituyentes del colorante pueden ser cualquiera de los constituyentes de colorante adecuados, tales como por ejemplo, los descritos en la presente memoria descriptiva. El constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico se selecciona entre un colorante de acridina que tiene una estructura como la descrita en la presente memoria descriptiva, un colorante de cianina simétrica que tiene una estructura como la descrita en la presente memoria descriptiva, un colorante de cianina simétrica, un colorante de fenantridinio que tiene una estructura como la descrita en la presente memoria descriptiva, un colorante de pironina, y un colorante de estirilo. Al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 el constituyente colorante Q2 y el constituyente colorante Q3 es un constituyente colorante indicador y al menos un constituyente colorante Q1 constituyente colorante Q2 y el colorante Q3 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico o un constituyente colorante no
35 fluorescente de ácido nucleico. El constituyente colorante indicador y el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico pueden ser o no el mismo. El procedimiento comprende llevar a cabo un proceso usando la disolución de ensayo que sería suficiente para que la amplificación del ácido nucleico diana comprenda la muestra del ácido nucleico diana. Meramente a modo de ejemplo, el proceso puede ser un proceso de la PCR, tal como, por ejemplo, un proceso de la PCR en tiempo real. El procedimiento comprende iluminar la disolución de ensayo con luz a una longitud de onda suficiente para que la absorba el constituyente colorante indicador y determinar la emisión fluorescente o su ausencia.
[0017] En las fórmulas proporcionadas anteriormente, PUENTE puede tener la fórmula que se muestra directamente a continuación.
45 -L1-[A1-(CH2)a]a[A2-(CH2)k-]b]A3-(CH2)y-]c[A4-(CH2)8-]d[A5-(CH2)k-]e
[A6-(CH2)k-]f[A7-(CH2)k-]g[A8-(CH2)e-]h[A9-(CH2),-]i-A10-L2-
En esta fórmula, cada uno de L1 y L2, -de manera independiente, es un resto que comprende un enlace simple; una unidad de polimetileno que tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; cada uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 y A10, de manea independiente, es un grupo potenciador de la unión de ácido nucleico (NABEG); un alquilo ramificado que 55 comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S, o al menos un anillo saturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; cada uno de a, k, y, 8, k, k, k, y ,, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y cada uno de a, b, c, d, e, f, g, h, e i, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive. PUENTE puede comprender un número adecuado de átomos no de hidrógeno, tales como entre aproximadamente 8 a aproximadamente 100 o aproximadamente 150, inclusive, aproximadamente 12 a
aproximadamente 60, inclusive, o aproximadamente 15 a aproximadamente 40, inclusive, Meramente a modo de ejemplo. PUENTE puede comprender hasta una carga positiva, Meramente a modo de ejemplo. PUENTE puede ser cualquier molécula enlazante adecuada, tal como cualquiera descrita en la presente memoria descriptiva, por ejemplo. En un ejemplo, PUENTE tiene la fórmula:
5 -(CH2)x-C(=O)NH-(CH2)a-[O-(CH2)k]b-[O-(CH2)y]c-NH(O=C)-(CH2)x-
en la que cada x, de manera independiente, es un entero seleccionado entre 1 y 11, inclusive; a es un entero seleccionado entre 2 y aproximadamente 20, inclusive; cada uno de k y y, de manera independiente, es 2 o 3; b es
10 cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y c es cero o 1.
[0018] Se proporcionan también composiciones asociadas con los procedimientos anteriormente descritos. Meramente a modo de ejemplo, se proporciona un colorante de cualquiera de las estructuras proporcionadas directamente a continuación.
20 En las estructuras de colorante anteriores, ' representa un anión, tal como un yoduro o un anión de cloro, meramente a modo de ejemplo.
[0019] Se proporciona también un compuesto colorante que tiene la fórmula que se muestra directamente a continuación. 25
en esta fórmula, PUENTE es un enlazante sustancialmente alifático que comprende entre aproximadamente 15 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno que es neutro o tiene hasta una carga positiva; Q1 es un
constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico; Q2 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico; y Rr es un grupo reactivo o un grupo funcional. El grupo reactivo o grupo funcional puede ser cualquiera de dichos grupos adecuados, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. El compuesto colorante puede ser cualquier composición adecuada, como se describe, por ejemplo, en la presente memoria descriptiva. Un procedimiento de usar el compuesto colorante, o colorante, comprende conjugar el compuesto colorante a una molécula sustrato, tal como una molécula sustrato seleccionada entre un nucleótido, un oligonucleótido, un péptido, una proteína, un hapteno, un fármaco, una micropartícula, un polímero sintético, un polímero natural, una célula biológica, un virus, y una molécula de una superficie sólida.
[0020] Se proporciona también un procedimiento para preparar una muestra que puede comprender o no ácido nucleico. El procedimiento comprende proporcionar una combinación de la muestra y un compuesto colorante, o colorante, tal como los descritos en la presente memoria descriptiva, en el que si el ácido nucleico está presente en la muestra, se forma un complejo de ácido nucleico-colorante. El procedimiento puede comprender además incubar la combinación. Se proporciona también un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de ácido nucleico en una muestra. El procedimiento comprende proporcionar una combinación de la muestra y un compuesto colorante, o colorante, tal como los descritos en la presente memoria descriptiva, en el que si el ácido nucleico está presente en la muestra, se forma un complejo de ácido nucleico-colorante; que ilumina la combinación con luz a una longitud de onda suficiente de tal manera que si se forma el complejo de ácido nucleico, se absorbe por consiguiente la luz; y determinar la emisión fluorescente o una ausencia de la misma. Se proporciona también un kit para determinar la formación de ácido nucleico o su ausencia en una muestra. El kit comprende que al menos una composición suficiente para la amplificación del ácido nucleico diana en la muestra deba comprender la muestra del ácido nucleico diana, y un compuesto colorante, o colorante, tal como los descritos en la presente memoria descriptiva.
[0021] Se describen adicionalmente en la presente memoria descriptiva estos y otros diversos aspectos, características y realizaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0022] Se proporciona en la presente memoria descriptiva una descripción detallada de algunos aspectos, características y realizaciones con referencia a los dibujos que la acompañan, que se describen brevemente a continuación. Los dibujos son ilustrativos y no están dibujados necesariamente a escala. Los dibujos ilustran algunos aspectos de las características y pueden ilustrar una o más realización(es) o ejemplo(s) en todo o en parte. Se puede usar una referencia de número, letras, y/o símbolo en un dibujo para referirse a un elemento o característica concreta en otro dibujo para referirse a un elemento o característica similar.
[0023] La Figura 1 (FIG. 1) es una ilustración esquemática de la unión de ADN mediante un mecanismo de liberación a demanda, en el que tres estados de conformación del colorante están en sustancial equilibrio
[0024] La Figura 2 (FIG. 2) es una representación gráfica de la absorbancia normalizada frente a la longitud de onda (nm), o los espectros de absorción normalizados de a) un colorante quimérico, AOAO (O), y b) un colorante AO monomérico, DMAO (L), en tampón PBS.
[0025] La Figura 3 (FIG. 3) es una representación grafica de la absorbancia normalizada frente a la longitud de onda (nm), o los espectros de absorción normalizados de a) un colorante dimérico AOAO-7 (e), y b) un colorante AO monomérico (.), en un tampon y en presencia de ADN.
[0026] La Figura 4 (FIG. 4) es una representación gráfica de la fluorescencia relativa frente a la longitud de onda (nm), o los espectros de emisión de fluorescencia de DMAO (L) y AOAO-7 (O) en tampón PBS antes de la adición de ADN, a) y c), respectivamente, y DMAO (A) y AOAO-7 (e) en tampón PBS después de la adición de ADN, b) y d), respectivamente.
[0027] La Figura 5 (FIG. 5) es una representación gráfica de la absorbancia normalizada frente a la longitud de onda (nm), o los espectros de absorción normalizados de a) TOTO-1 (preparado de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos Nº 5.582.977) (línea más oscura), y b) TOTO-3 (línea más clara), en un tampón.
[0028] La Figura 6 (FIG. 6) es una representación gráfica de la absorbancia normalizada frente a la longitud de onda (nm) o los espectros de absorción normalizados de a) TOTO-1 de acuerdo a la Patente de los Estados Unidos Nº 5.582.977 (línea más oscura), y b) TOTO-3 (línea más clara) en un tampón y en presencia de ADN.
[0029] La Figura 7 (FIG. 7) incluye una representación gráfica de la fluorescencia relativa frente a la concentración de ADN (μg/ml), o una valoración, de un ADN monocatenario (0), y un ADN bicatenario (.), en disolución y en presencia de AOAO-12 (a 0,2 μM). La Figura 7 incluye también una representación gráfica insertada de la fluorescencia relativa frente a la concentración de ADN que muestra una relación sustancialmente lineal entre las dos.
[0030] La Figura 8 (FIG. 8) es una representación gráfica de la fluorescencia relativa frente al número de ciclos (Ct), o la amplificación de la PCR, usando SYBR Green I a una concentración inferior de colorante (L) y a una concentración mayor de colorante (.), y AOAO-12 a una concentración inferior de colorante0) y ( a una concentración mayor de colorante (_), en la que Ct se refiere generalmente al numero de ciclos al cual la seral de fluorescencia alcanza un umbral arbitrario y, en una gráfica de amplificación de la PCR, corresponde generalmente al momento en el que la señal de fluorescencia a aumentar desde el valor inicial. Para cada colorante, se midió la concentración relativa de colorante en la densidad óptica (DO) a la absorción máxima del colorante en tampón PBS, correspondiendo la concentración de 1X y 2X AOAO-12 a 471 nm a una DO de 0,1 y 0,2, respectivamente, y correspondiendo la concentración de colorante de 0,5X y 1X SYBR Green I a 495 nm a una DO de 0,025 y 0,05, respectivamente.
[0031] La Figura 9 (FIG. 9) incluye una representación gráfica de la fluorescencia relativa frente al número de ciclos (Ct), o la amplificación de la PCR, usando AOAO-12 (0), y SYBR Green I (L), como sonda fluorescente, cada una a concentraciones óptimas. Para cada colorante, se midió la concentración relativa de colorante en la densidad óptica (DO) a la absorción máxima del colorante en tampón PBS, correspondiendo la concentración de colorante de AOAO-12 a 471 nm a una DO de 0,4, y correspondiendo la concentración de colorante de SYBR Green I a 495 nm a una DO de 0,025. La Figura 9 incluye también una representación gráfica insertada de Ct frente al log de un número de copias de una muestra de ADN, usando AOAO-12 (_) y SYBR Green I (.), respectivamente, que en cada caso, muestra una relación sustancialmente lineal entre las dos.
[0032] La Figura 10 (FIG. 10) es una ilustración esquemática de las posibles combinaciones A, B, C, D y E, de colorantes monoméricos, Q1 y Q2, para formar un colorante monomérico. La combinación A comprende dos colorantes fluorescentes indicadores idénticos de ácido nucleico o dos colorantes fluorescentes indicadores de ácido nucleico de espectros similares. La combinación B comprende un colorante fluorescente indicador de ácido nucleico y una molécula no indicadora que se une al ADN. La combinación C comprende una molécula no indicadora que se une al ADN y un colorante indicador que no se une al ADN. La combinación D comprende un colorante fluorescente indicador de ácido nucleico y un colorante no fluorescente no indicador de ácido nucleico. La combinación E comprende un colorante fluorescente indicador de ácido nucleico y un colorante fluorescente indicador sin ácido nucleico.
[0033] La Figura 11 (FIG. 11) es una representación gráfica de la intensidad de la fluorescencia frente al número de ciclos (Ct), o la amplificación de la PCR, usando colorante monomérico TO (o), colorante monomérico TOTO-1 (L), y colorante dimérico TOTO-12 (0) (Compuesto N° 24, Tabla 2).
[0034] La Figura 12 (FIG. 12) es una representación gráfica de la absorbancia frente a la longitud de onda (nm), o los espectros de absorción, del colorante heterodimérico AORO-7 en tampón PBS (o), y del colorante heterodimérico AORO-7 en tampón PBS y en presencia de ADN (+).
[0035] La Figura 13 (FIG. 13) es una representación gráfica de la intensidad de fluorescencia arbitraria frente a la longitud de onda (nm), o los espectros de emisión, del colorante heterodimérico AORO-7, con excitación tanto a 500 nm (línea sólida, más oscura) como a aproximadamente 560 nm (línea rayada, más clara), registradas por separado.
[0036] La Figura 14 (FIG. 14) incluye una representación gráfica de la fluorescencia relativa frente al número de ciclos (Ct), o la amplificación de la PCR, usando el colorante heterodimérico AORO-7. La Figura 14 incluye también una representación gráfica insertada, o gráfica de curva de fusión, de la señal de la fluorescencia relativa frente a la temperatura (ºC).
[0037] La Figura 15 (FIG. 15) es una representación gráfica, o gráfica de la curva de fusión, del cambio de la fluorescencia relativa frente a la temperatura (ºC), A) usando la vigilancia de AOAO-12 (líneas punteadas), y B) usando la vigilancia de SYBR Green I (líneas sólidas), de cuatro amplicones, TBP (o), SDHA (L), RPL4 (0), y HMBS (0).
[0038] La Figura 16 (FIG. 16) es una representación gráfica de la fluorescencia relativa vigilada a 60ºC frente a minutos a 96ºC, o la termoestabilidad a 96ºC, de AOAO-12.
DESCRIPCIÓN
[0039] Se describen en la presente memoria descriptiva colorantes o tintes fluorescentes que pueden ser útiles en algunas aplicaciones, tales como, por ejemplo, detección del ácido nucleico. Dichos colorantes pueden ser, por ejemplo, colorantes diméricos o triméricos de ácido nucleico que tienen un fondo bajo de fluorescencia en ausencia de ácidos nucleicos, pero que llegan a ser muy fluorescentes en presencia de ácidos nucleicos. Los colorantes diméricos y triméricos de ácidos nucleicos pueden ser útiles en algunas aplicaciones, tales como, por ejemplo, detección de ácido nucleico, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Se describen también, por ejemplo, en la presente memoria descriptiva, los procedimientos asociados con la preparación y el uso de colorantes
o tintes fluorescentes, como son los sistemas útiles, o kits, que comprenden colorantes o tintes fluorescentes.
[0040] En la presente memoria descriptiva, se entenderá que la palabra que aparece en singular abarca su homóloga plural, y la palabra que aparece en plural abarca su homóloga singular, a no ser que se entienda de manera implícita o explícita o se establezca de otra manera. Además, se entenderá que para cualquier componente dado descrito en la presente memoria descriptiva, cualquiera de las posibles candidatas o alternativas relacionadas de este componente, se pueden usar de manera general individualmente o en combinación entre sí, a no ser que se entienda de manera implícita o explícita o se establezca de otra manera. Adicionalmente, se entenderá que cualquier lista de dichas candidatas o alternativas, es meramente ilustrativa, no limitante, a no ser que se entienda de manera implícita o explícita o se establezca de otra manera. Aún más, se entenderá que cualquier figura o número presentado en la presente memoria descriptiva es aproximado, y que cualquier intervalo numérico incluye el número mínimo y el número máximo que definen el intervalo, si el término “inclusive” o similar aparece o no, a no ser que se entienda de manera implícita o explícita o se establezca de otra manera. Adicionalmente, se entenderá que cualquier lenguaje permisivo, abierto o de final abierto abarca cualquier lenguaje relativamente permisivo y restrictivo, lenguaje abierto y cerrado, o lenguaje de final abierto o de final cerrado, respectivamente, a no ser que se entienda de manera implícita o explícita o se establezca de otra manera. Meramente a modo de ejemplo, la palabra “comprendiendo” puede abarcar lenguaje de tipo “que comprende”, “consistente esencialmente de” y/o “consistente de”.
[0041] Diversos términos se describen generalmente a continuación o se usan en la presente memoria descriptiva para facilitar la comprensión. Se entenderá que una descripción general correspondiente de estos diversos términos se aplica a variaciones o formas lingüísticas o gramaticales de estos diversos términos. Se entenderá también que la descripción general de cualquier término a continuación puede no aplicarse o puede no aplicarse completamente cuando el término se usa de manera no general o más específica. Se entenderá también que la terminología usada
o la descripción proporcionada en la presente memoria descriptiva, tal como en relación con diversas realizaciones, por ejemplo, no es limitante. Se entenderá además que las realizaciones descritas en la presente memoria descriptiva o las aplicaciones descritas en la presente memoria descriptiva no son limitantes, y como tales, pueden variar.
[0042] Generalmente, los términos “tinte” y “colorante” se pueden usar de manera indistinta y referirse a una molécula aromática capaz de absorber luz en el intervalo espectral de entre aproximadamente 250 a aproximadamente 1.200 nm. Generalmente, el término “colorante” puede referirse a un colorante fluorescente, un colorante no fluorescente, o ambos. Generalmente, el término “colorante fluorescente” se refiere a un colorante capaz de emitir luz cuando se excita por otra luz de longitud de onda apropiada.
[0043] Generalmente, el término “apagador de fluorescencia” se refiere a una molécula capaz de apagar la fluorescencia de otra molécula fluorescente. Se puede producir el apagado de la fluorescencia mediante al menos una de tres maneras. El primer tipo de apagado de la fluorescencia se produce por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) (Förster, Ann. Plys. (1948); y Stryer, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1967)), en la que un apagador absorbe la emisión de luz de una molécula fluorescente. El pico de absorción de un apagador FRET tiene que tener normalmente un solapamiento significativo con el pico de emisión de un colorante fluorescente del apagador FRET que es un apagador fluorescente eficaz. Un apagador FRET es normalmente un colorante no fluorescente, pero puede ser también un colorante fluorescente. Cuando un apagador es un colorante fluorescente, solo se utiliza la propiedad de absorción del colorante. Se produce un segundo tipo de apagado de la fluorescencia mediante transferencia de electrones fotoinducida (PET), en la que el apagador es una molécula rica en electrones que apaga la fluorescencia de una molécula fluorescentes transfiriendo un electrón al colorante excitado electrónicamente. Un tercer tipo de apagado de fluorescencia se produce mediante agregación del colorante, tal como formación del dímero H, en la que dos o más moléculas de colorante están en contacto físico entre sí, disipando por tanto la energía electrónica en los modos vibracionales de las moléculas. Este tipo de apagado de contacto de la fluorescencia se puede producir entre dos colorantes fluorescentes idénticos, o entre dos colorantes fluorescentes diferentes, o entre un colorante fluorescente y un apagador FRET, o entre un colorante fluorescente y un apagador PET. Otros tipos de apagadores de la fluorescencia, aunque no se usan tan comúnmente, incluyen compuestos estables con radicales libres y algunos complejos de metales pesados.
[0044] Generalmente, el término “ácido nucleico” se refiere a un ADN bicatenario (ADNds), ADN monocatenario (ADNss), ARN bicatenario (ARNds), ARN monocatenario (ARNss) y/o sus derivados. Un ácido nucleico puede ser natural o sintético.
[0045] Generalmente, el término “tinte fluorescente de ácido nucleico” o “colorante fluorescente de ácido nucleico” se refiere a un colorante capaz de unirse a un ácido nucleico para formar un complejo fluorescente de coloranteácido nucleico. Un colorante fluorescente de ácido nucleico es normalmente no fluorescente o débilmente fluorescente por sí mismo, pero llega a ser muy fluorescente tras unirse al ácido nucleico. Generalmente, el término “molécula no fluorescente que se une al ácido nucleico” se refiere a una molécula que se une al ácido nucleico que puede ser o no un colorante y que no llega a ser fluorescente tras la unión al ácido nucleico. Generalmente, el término “colorante fluorescente de ADN” se refiere a un colorante que llega a ser fluorescente tras la unión al ADN. Generalmente, el término “colorante fluorescente sin ácido nucleico” se refiere a un colorante fluorescente que no se une al ácido nucleico. Generalmente, el término “colorante no fluorescente sin ácido nucleico” se refiere a un colorante que ni es fluorescente ni se une al ácido nucleico. Dicho colorante se denomina comúnmente un apagador de la fluorescencia. Frecuentemente, un apagador de la fluorescencia se usa para formar una pareja FRET con un colorante fluorescente. Generalmente, el término “colorante indicador” se refiere a un colorante fluorescente cuya fluorescencia emitida contribuye a la señal final de la fluorescencia detectada.
[0046] Generalmente, el término “reacción en cadena de la polimerasa” o “PCR” se refiere a una técnica para amplificar la cantidad de ADN. Generalmente, el término “PCR cuantitativa en tiempo real” o “qPCR” se refiere a una técnica para vigilar la cantidad que crece el ADN en el curso de la PCR.
[0047] En general, los colorantes fluorescentes de ácido nucleico se pueden clasificar en dos clases principales: intercaladores y enlazantes de ranuras menores. Generalmente, los intercaladores fluorescentes son colorantes que se unen a ADN bicatenario o ARN bicatenario insertándose ellos mismos entre pares de bases adyacentes. Generalmente, los enlazantes de ranuras menores son colorantes que se unen a la ranura menor del ADN bicatenario. Existen además otros colorantes que se pueden unir a ácidos nucleicos mediante múltiples modos, incluyendo la interacción electrostática entre un colorante cargado positivamente y el ácido nucleico cargado negativamente.
[0048] Aunque ha llegado a haber una variedad de colorantes fluorescentes de ácidos nucleicos comercialmente disponibles, y se han desarrollado procedimientos para mejorar los colorantes para usos no de la qPCR, no todos los tintes de ácido nucleico son adecuados para la aplicación de la qPCR. Adicionalmente, se sabe poco acerca de los elementos estructurales que se requieren para un buen colorante de la qPCR.
[0049] En general, desde un punto de vista del rendimiento, un colorante ideal para la qPCR debería cumplir diversos criterios, tal como se describe ahora. El colorante debería ser térmicamente estable a temperatura elevada (entre aproximadamente 60ºC a aproximadamente 96ºC) en un tampón de PCR e hidrolíticamente estable a baja temperatura (entre aproximadamente -20ºC a aproximadamente 4ºC) cuando los medios se vuelven alcalinos. El colorante no debería inhibir el proceso de la PCR, siendo generalmente estos los criterios más importantes, como en los casos más graves de inhibición de la PCR, el proceso de la PCR puede no comenzar incluso, y en los casos más leves, se puede retardar el número Ct, o solo se puede usar una concentración muy baja de colorante, de tal manera que la señal de la fluorescencia es limitada. El colorante debería ser no fluorescente o mínimamente fluorescente en ausencia de ADN, pero llegar a ser muy fluorescentes en presencia de ADN. Las longitudes de onda de absorción y misión del colorante deberían ser compatibles con los instrumentos usados junto con la qPCR, tal como los instrumentos existentes anteriormente descritos. La unión del ADN del colorante deberían tener poca o ninguna preferencia de secuencias. La intensidad de la fluorescencia de los complejos ADN-colorante debería estar linealmente relacionada con la cantidad de ADN presente. Un colorante descrito en la presente memoria descriptiva puede cumplir o no uno o más de los criterios anteriormente descritos.
[0050] Se proporciona, por ejemplo, un procedimiento para diseñar un colorante fluorescente de ácido nucleico, tal como uno adecuado para la qPCR. El procedimiento comprende unir covalentemente dos o tres colorantes monoméricos con un enlazante adecuado para formar un colorante dimérico o un colorante trimérico. Un colorante descrito en la presente memoria descriptiva, cuando está en disolución, puede asumir una conformación de tipo predominantemente en horquilla debido a la formación del dímero intramolecular. Esta conformación o estado de tipo en horquilla del colorante es inactiva con respecto a los ácidos nucleicos, o incapaz de interactuar con los ácidos nucleicos. Se cree que el colorante, cuando está en disolución y en presencia de los ácidos nucleicos, asume también una conformación o estado aleatorio abierto, que existe en pequeña cantidad y en equilibrio sustancial con la conformación en horquilla. La conformación o estado aleatorio abierto del colorante es activa con respecto a los ácidos nucleicos, o capaz de interactuar o unirse con los ácidos nucleicos. Se cree que cuando el colorante está en presencia de una cantidad creciente de ácidos nucleicos, se produce un desplazamiento del equilibrio desde el estado en horquilla hacia el intermedio, el estado aleatorio abierto, o el estado que se une al ADN. Se cree que este mecanismo, denominado algunas veces “mecanismo que se une al ADN con liberación a demanda”, reduce la inhibición de la PCR que se puede asociar de otra forma con el colorante. Como consecuencia, se puede usar el colorante en los procesos de la PCR a una concentración mayor de la que puede ser de otra forma posible, y de esta manera, puede proporcionar una sensibilidad de detección mayor del ácido nucleico de la que puede ser de otra forma posible. La reducción en la inhibición de la PCR puede ser drástica, y el aumento en la sensibilidad de detección del ácido nucleico puede ser significativo.
[0051] Un colorante dimérico o colorante trimérico descrito en la presente memoria descriptiva puede poseer cualquier número de características deseables. Por medio de ejemplo, tal colorante puede tener un fondo de la fluorescencia que está reducido con respecto a los de sus constituyentes del colorante monomérico. Fondos de fluorescencia relativamente bajos corresponden generalmente a una sensibilidad de detección de ácidos nucleicos relativamente aumentada. De esta manea, dicho colorante se asocia generalmente con una sensibilidad de detección aumentada para el ácido nucleico. Además, por medio de ejemplo, un colorante descrito en la presente memoria descriptiva puede ser más térmica y/o hidrolíticamente estable que SYBR Green I. Adicionalmente por medio de ejemplo, un colorante descrito en la presente memoria descriptiva puede tener longitudes de onda de absorción y emisión diferentes de las asociadas con los colorantes de la qPCR existentes.
[0052] Un colorante fluorescente de ácido nucleico dimérico puede tener la estructura general (Estructura 1) que se muestra directamente a continuación.
Estructura 1
[0053]
En la estructura 1, de manera independiente, cada colorante del colorante Q1 y del colorante Q2 se selecciona entre un colorante fluorescente de ácido nucleico, un colorante no fluorescente de ácido nucleico, un colorante fluorescente de ácido no nucleico, y un colorante no fluorescente de ácido no nucleico. Q1 y Q2 se pueden seleccionar y combinarse de manera que estimulen o aseguren las propiedades deseadas del colorante quimérico resultante. Al menos un colorante del colorante Q1 y del colorante Q2 es un colorante indicador. Además, al menos un colorante del colorante Q1 y del colorante Q2 es un colorante fluorescente de ácido nucleico o un colorante no fluorescente de ácido nucleico. El colorante indicador y el colorante fluorescente de ácido nucleico pueden ser iguales o diferentes. PUENTE puede estar positivamente cargado en una extensión relativamente limitada o ser sustancialmente neutro en la carga, y puede ser un constituyente sustancialmente flexible que facilita la formación del dímero intramolecular para producir el colorante quimérico.
[0054] Un colorante fluorescente de ácido nucleico trimérico puede tener la estructura general (Estructura 2) que se muestra directamente a continuación.
Estructura 2
[0055]
[0056] En la estructura 2, de manera independiente, cada colorante del colorante Q1, colorante Q2, y colorante Q3 se selecciona entre un colorante fluorescente de ácido nucleico, un colorante no fluorescente de ácido nucleico, un colorante fluorescente de ácido no nucleico, y colorantes no fluorescentes de ácidos no nucleicos. Q1, Q2, y Q3 se pueden seleccionar u combinarse de manera que estimulen o aseguren las propiedades deseadas del colorante trimérico resultante. Al menos un colorante del colorante Q1, colorante Q2, y colorante Q3 es un colorante indicador. Además, al menos un colorante del colorante Q1, colorante Q2, y colorante Q3 es un colorante fluorescente de ácido nucleico o un colorante no fluorescente de ácido nucleico. El colorante indicador y el colorante fluorescente de ácido nucleico pueden ser iguales o diferentes. PUENTE puede estar positivamente cargado en una extensión relativamente limitada o sustancialmente neutra en carga, y puede ser un constituyente sustancialmente flexible que facilita la formación del dímero intramolecular para producir el dímero trimérico.
[0057] Un colorante fluorescente de ácido nucleico puede tener la estructura general (Estructura 3) que se muestra directamente a continuación
Estructura 3
[0058]
[0059] En la estructura 3, de manera independiente, cada colorante del colorante Q1, colorante Q2, puede ser tal como se describe anteriormente en relación con la Estructura 1 y la Estructura 2; PUENTE puede ser un enlazante sustancialmente alifático, tal como se ha descrito anteriormente; y Rr puede ser un grupo reactivo o un grupo funcional. Meramente a modo de ejemplo, Q1 puede ser un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico; Q2 puede ser un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico; PUENTE puede ser un enlazante sustancialmente alifático que comprende entre aproximadamente 15 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno y hasta una carga positiva; y Rr puede ser un grupo reactivo o un grupo funcional, tal como se describe en la presente memoria descriptiva.
PUENTE
[0060] PUENTE puede ser una molécula enlazante sustancialmente flexible, que no tiene más de una carga positiva. PUENTE puede ser una molécula enlazante sustancialmente neutra y sustancialmente flexible. Los constituyentes del PUENTE se pueden seleccionar para conseguir dicha carga positiva limitada o dicha neutralidad sustancial. La propiedad de neutralidad sustancial, que incluye la neutralidad real, se discute adicionalmente a continuación. La propiedad de flexibilidad sustancial está relacionada generalmente con la naturaleza sustancialmente alifática, que incluye la naturaleza alifática real, de PUENTE. Esta naturaleza sustancialmente alifática se refiere a la no aromaticidad de PUENTE, o a la no rigidez de PUENTE.
[0061] En la Estructura 1, PUENTE está unido covalentemente a Q1 y Q2. En el caso de los colorantes diméricos, PUENTE puede tener, por ejemplo, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 10 átomos no de hidrógeno, entre aproximadamente 12 y aproximadamente 60 átomos no de hidrógeno, o entre aproximadamente 15 o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 o aproximadamente 50 átomos no de hidrógeno. En la Estructura 2, PUENTE se une covalentemente a Q1, Q2 y Q3. En el caso de los colorantes triméricos, PUENTE puede tener, por ejemplo, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 átomos no de hidrógeno, o entre aproximadamente 30 y aproximadamente 70 átomos no de hidrógeno.
[0062] PUENTE puede incorporar al menos un grupo independiente potenciador de la unión de ácido nucleico (NABEG). Un NABEG es un resto capaz de unirse a ácidos nucleicos en la forma de interacciones electrostáticas, hidrófobas, o que se une al hidrógeno. Meramente a modo de ejemplo, se puede seleccionar un NABEG entre aminas primarias; aminas secundarias; aminas terciarias; amonios; amidinas; grupos arilo que comprenden opcionalmente heteroátomos seleccionados entre N, O, S, y cualquiera de sus combinaciones; restos que tienen enlaces que comprenden heteroátomos de elevada electronegatividad; y cualquiera de sus combinaciones.
[0063] Las aminas primarias, secundarias y terciarias y las amidinas son grupos básicos y por tanto, están positivamente cargados o al menos positivamente cargados a pH fisiológico. Los grupos amonio, o los grupos nitrógeno cuaternizados, están positivamente cargados de manera permanente. Hablando en general, los grupos cargados positivamente o cargados de manera parcialmente positiva potencian la unión del ácido nucleico de la interacción electrostática mediante el colorante, una propiedad que se puede aprovechar en el desarrollo de tintes fluorescentes muy sensibles de ácidos nucleicos. Es generalmente indeseable usar PUENTE que tenga excesivas cargas positivas para producir un colorante de la presente invención. Por ejemplo, un PUENTE adecuado de un colorante dimérico o un colorante trimérico de la invención puede comprender no más de una carga positiva. PUENTE puede ser sustancialmente flexible y neutro o enlazante sustancialmente neutro. En este contexto, neutralidad sustancial se refiere carga pequeña. Por medio de ejemplo, PUENTE podría comprender un constituyente débilmente básico, tal como un grupo piridina o un grupo pirazina, por ejemplo, de tal manera que cuando está en disolución acuosa, puede estar presente una cantidad muy pequeña de cargas positivas. Además, por medio de ejemplo, en un caso (opcional) en el que PUENTE comprende al menos un NABEG neutro, la cantidad exacta de carga positiva puede estar relacionada generalmente con el pKa del NABEG. Generalmente el pKa mayor del NABEG, lo más preferiblemente, el NABEG está protonado, y de esta manera, positivamente cargado. Por medio de ejemplo, un grupo NABRG débilmente básico adecuado puede tener un pKa de aproximadamente 11 o menos, aproximadamente 8 o menos, o aproximadamente 7 o menos.
[0064] Puede existir una tendencia a formar un dímero intramolecular, principalmente dímero-H, que puede ser una propiedad particularmente útil en el colorante de ácido nucleico producido. Por ejemplo, en el caso de un colorante dimérico descrito en la presente memoria descriptiva, la formación de dímero-H puede producir una estructura de tipo horquilla, en la que dímero-H forma una porción del talo de la horquilla y PUENTE forma una porción curvada, tal como se ilustra esquemáticamente en la Figura 1. El fenómeno de la formación del dímero-H junto con algunos colorantes se ha descrito en West, y col., J. Phys. Chem. (1965); Rohatgi, y col., J. Phys. Chem. (1966); Rohatgi, y col., Chem. Phys. Lett. (1971); y Khairutdinov, y col., J. Phys. Chem. (1997). La formación de un dímero-H intramolecular puede estar facilitada donde el PUENTE es un enlazante hidrocarburo flexible y neutro o sustancialmente neutro, que comprende opcionalmente uno o más NABEG neutros.
[0065] La formación del dímero-H se puede caracterizar por un gran desplazamiento al azul del espectro de absorción del colorante Por medio de ejemplo, se muestran en la Figura 2 los espectros de absorción de un colorante AO monomérico (naranja de acridina) y un colorante dimérico relacionado, AOAO-7, que forma un dímero intramolecular. El pico a 471 nm asociado con el dímero AOAO-7 indica la formación del dímero-H intramolecular. Los espectros de absorción del monómero y del dímero llegan a ser similares una vez que se produce la unión del ADN, indicando la apertura de la estructura en horquilla. Por medio de ejemplo, tal como se muestra en la Figura 3, la desaparición del pico a 471 nm del dímero AOAO-7 indica la apertura de la estructura en horquilla tras la unión del ADN.
[0066] La formación del dímero-H en el colorante descrito en la presente memoria descriptiva puede asociarse con dos beneficios principales. Uno de los beneficios principales es una reducción, algunas veces drástica, en el fondo de la fluorescencia, acoplado con un sustancial aumento en la fluorescencia tras la unión del ADN, tal como se demostró por una gran ganancia en la señal de la fluorescencia. Se puede apreciar este beneficio comparando los espectros de la fluorescencia de un colorante monomérico de naranja de acridina, DNAO, y un colorante dimérico de naranja de acridina, AOAO-7, en ausencia y presencia de ADN. Por ejemplo, tal como se muestra en la Figura 4, con respecto al colorante DMAO monomérico, el colorante AOAO-7 dimérico está asociado con un fondo más bajo de fluorescencia y una mayor fluorescencia tras la unión con el ADN.
[0067] El apagado de la fluorescencia asociada al dímero intramolecular puede ser tan eficiente como la de un colorante descrito en la presente memoria descriptiva que se puede construir a partir de al menos un colorante monomérico que no se considera normalmente como muy deseable, tal como, por ejemplo, al menos un colorante monomérico que tiene un elevado fondo de fluorescencia. Se muestra un ejemplo de esto en la Figura 4, que caracteriza el naranja de acridina (AO) y uno de sus dímeros. Aunque AO es uno de los colorantes que se une al ácido nucleico conocidos más antiguos y tiene longitudes de onda deseables, no se ha usado ampliamente para la detección del ácido nucleico debido a su relativamente elevado fondo de fluorescencia. Tal como se demostró en la Figura 4, con respecto al colorante AO monomérico, el colorante AOAO.7 dimérico tiene un fondo de fluorescencia mucho más bajo.
[0068] La formación del dímero-H se produce mediante interacción intramolecular, en lugar de intermolecular. La formación del dímero-H se produce mediante el enlace covalente de dos o tres colorantes, tales como, por ejemplo, una pareja de colorantes monoméricos deseables. La formación del dímero-H se puede llevar a cabo, por ejemplo, de manera relativamente fácil, sin necesidad de un reactivo adicional, tal como un reactivo adicional que pueda interferir con una aplicación útil del colorante. Por medio de ejemplo, puede formarse un colorante dimérico a partir de un emparejamiento de un constituyente colorante que se une al ácido nucleico, y un constituyente colorante fluorescente que se une al ácido no nucleico en disolución, sin el uso de un reactivo adicional. Además, por medio de ejemplo, se puede preparar un colorante trimérico a partir de dos constituyentes de colorante que se une al ácido nucleico y un constituyente colorante fluorescente que se une al ácido no nucleico en disolución, de nuevo, sin el uso de un reactivo adicional. La formación del dímero-H proporciona un medio útil para atrapar el colorante en un estado sin unión al ADN, que no tiene efecto inhibidor sobre la PCR y que desplaza a estado aleatorio abierto o al estado que se une al ADN solo cuando está presente el ADN. De esta manera, la concentración eficaz de colorante,
o la concentración del colorante en el estado aleatorio abierto, se puede mantener baja, incluso aunque se use una concentración total elevada de colorante para aumentar la sensibilidad de la qPCR.
[0069] Tal como se ha mencionado anteriormente, la formación del dímero-H en un colorante descrito en la presente memoria descriptiva puede estar asociado a otro beneficio principal. Este beneficio inesperado es que la formación del dímero-H en un colorante puede reducir significativamente el efecto inhibidor del colorante en la PCR en una aplicación en la qPCR. Por medio de ejemplo, normalmente, para una muestra de ADN de una concentración dada, la señal fluorescente de un colorante fluorescente de ADN es proporcional a la concentración del colorante, hasta la saturación del colorante. Por medio de ejemplo, una concentración mayor de colorante se asocia con una formación mayor de complejos de ADN-colorante, y de esta manera, fluorescencia mayor o más brillante, hasta la saturación del colorante. Por tanto, idealmente, se podría querer iniciar con una concentración suficientemente elevada de colorante para la sensibilidad máxima en una aplicación de la qPCR. En la práctica, sin embargo, todos los colorantes de ADN que se han usado anteriormente para que la qPCR inhiba el proceso de amplificación del ADN en grados variables. Normalmente, se ha asociado una concentración mayor de dicho colorante anterior con la mayor inhibición del colorante de la amplificación o del proceso de la PCR. De esta manera, la concentración de dicho colorante anterior se ha preparado normalmente para ser mucho menor para una aplicación de la qPCR de los que sería para una aplicación no de la qPCR.
[0070] Esta disminución de la concentración de colorante en las aplicaciones de la qPCR da como resultado un sacrificio, en términos de fuerza final de la señal fluorescente, lo que se puede discernir de la siguiente discusión del colorante de ADN más ampliamente usado para la qPCR, SYBR Green I, por medio de ejemplo. La concentración de SYBR Green 1 que se usó en la qPCR no fue proporcionada por el fabricante, de tal manera que la comparación precisa con otros colorantes no es fácil o de rutina. Sin embargo, ya que la concentración de un colorante está linealmente relacionada con su densidad óptica de acuerdo con la ley de Beer, las características de la densidad óptica de la disolución de SYBR Green 1 usada en la qPCR y otra disolución de colorante usada en la qPCR se pueden usar al menos para comparar cualitativamente las concentraciones respectivas. Por ejemplo, una densidad óptica típica para la disolución de SYBR Green 1 usada en la qPCR es entre 0,025 y 0,05, mientras que la densidad óptica de una disolución de Colorante Nº 19 de la Tabla 2 en la presente memoria descriptiva usado en la qPCR es normalmente de aproximadamente 0,04 a aproximadamente 0,8, o más normalmente, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,4. El colorante SYBR Green I muestra un efecto de inhibición significativo cuando la concentración de colorante se aumenta de 0,5X, lo que corresponde a una densidad óptica de 0,025 al pico de absorción de 495 nm, a una concentración de 1X, que corresponde a una densidad óptica de 0,05 al mismo pico de absorción. Tal como se muestra en la Figura 8, aunque SYBR Green I a la concentración 1X tiene una mayor señal fluorescente final con respecto a SYBR Green I a la concentración de 0,5X, el número de ciclos, o valor Ct, asociado con la concentración de colorante 1X se retarda. Este valor Ct retardado indica que SYBR Green I inhibe significativamente la PCR a una concentración mayor de colorante. El colorante dimérico, AOAO.12, presenta poca o ninguna inhibición cuando se aumenta la concentración de colorante desde una concentración de 1X, que corresponde a una densidad óptica de 0,1 al pico de absorción de 471 nm a una concentración de colorante de 2X, que corresponde a una densidad óptica de 0,2 al mismo pico de absorción. Debido a que AOAO-12 muestra poca o ninguna inhibición de la PCR, se puede usar a una concentración que es relativamente elevada y proporciona una señal fluorescente que puede ser varias veces mayor que la de SYBR Green I, tal como se muestra en la Figura 9. De manera breve, AOAO-12 muestra poca o ninguna inhibición de la PCR dentro de un amplio intervalo de concentración, y de esta manera, se puede usar a una mayor concentración para una señal fluorescente creciente.
[0071] Se cree que la ausencia sustancial anteriormente descrita de inhibición de la PCR que puede estar asociada con los colorantes descritos en la presente memoria descriptiva, de tal manera que se puede usar una concentración mayor de colorante, se puede explicar mediante un mecanismo de “liberación a demanda” que se ilustra esquemáticamente en la Figura 1. Esto es, se cree que en disolución, un colorante dimérico existe en un equilibrio dinámico entre una conformación en horquilla cerrada y una conformación aleatoria abierta, tal como se muestra en la Figura 1. En general, la conformación en horquilla es mucho más estable que la de la conformación aleatoria abierta y es predominante. La dominancia de la conformación en horquilla del colorante está soportada por los espectros ultravioleta/visible, que muestran un desplazamiento sustancial del espectro del dímero con respecto al espectro del monómero. La conformación en horquilla es una forma inactiva del colorante, mientras que la conformación abierta es una forma activa del colorantes, capaz de unirse al ADN. Cuando está presente el ADN, el colorante en la conformación abierta desplaza a una conformación unida al ADN, más colorante en la conformación en horquilla desplaza a la conformación abierta, y el colorante en la conformación abierta permanece a una concentración muy baja. En otras palabras, la mayoría del colorante está atrapado en la conformación en horquilla sin unión al ADN y se libera solo en la conformación abierta, o en la forma que se une al ADN, en respuesta a una mayor presencia de ADN. Este mecanismo de “liberación a demanda” hace posible que se use para un colorante a una concentración relativamente elevada sin afectar adversamente el proceso mismo de la PCR. A diferencia de un colorante descrito en la presente memoria descriptiva, SYBR Green I no tiene una conformación sin unión al ADN que ayude a disminuir la concentración eficaz del colorante y de esta manera muestra un efecto inhibidor de la PCR dependiente de la concentración elevada.
[0072] Los tintes de ácido nucleico descritos en la presente memoria descriptiva son relativamente sencillos y se pueden preparar en una escala deseable, tal como en cantidades medidas en gramos a decenas de gramos, por ejemplo sobre una base rutinaria equitativa. Estos tintes de ácido nucleico se pueden usar de manera equitativa universalmente para la detección de la amplificación del ADN y para aplicaciones de investigación relativamente rutinarias. Por medio de ejemplo, se pueden usar colorantes fluorescentes de ácido nucleico para detectar la presencia y la cantidad de ADN de una manera sustancialmente no selectiva de secuencia, y de una manera relativamente universal.
[0073] PUENTE puede tener la fórmula (Fórmula 1) que se muestra directamente a continuación.
Fórmula 1 -L1-[A1-(CH2)a-]a[A2-(CH2)k-]b[A3-(CH2)y-]c[A4-(CH2)8-]d[A5-(CH2)k-]e
[A6-(CH2)k-]f[A7-(CH2)k-]g[A8-(CH2)e-]h[A9-(CH2),-]i-A10-L2-
[0074] En la Fórmula 1, cada sustituyente del sustituyente L1 y del sustituyente L2 (cada uno de los cuales se puede denominar como simplemente “L”) es parte de PUENTE. L1 se une covalentemente a un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2, y L2 se une covalentemente al constituyente colorante del constituyente colorante Q1 o del Q2 es diferente de dicho un constituyente colorante. De manera independiente, cada uno de L1 y L2 es un resto que comprende un enlace simple; una unidad de polimetileno que tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un grupo arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S. Los subíndices asociados con las unidades de metileno (CH2), concretamente, a, k, y, 8, k, k, k, e, y ,, pueden ser iguales o diferentes, indicando cada uno de manera independiente el tamaño de la unidad de metileno asociada y siendo cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20 o entre 1 y aproximadamente 12. Los subíndices asociados con las porciones entre paréntesis de la Fórmula 1, concretamente, a, b, c, d, e, f, g, h, e i, pueden ser iguales o diferentes, indicando cada uno de manera independiente el tamaño de la porción entre paréntesis asociada de la fórmula y siendo cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, o entre 1 y aproximadamente 10 o entre 1 y aproximadamente 5.
[0075] A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 pueden ser iguales o diferentes, cada uno, de manera independiente, siendo un grupo potenciador que se une al ácido nucleico (NABEG); un alquilo ramificado que comprende
opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o al menos una anillo saturado de 5 o 6 miembros que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 pueden ser de tal manera que PUENTE comprenda como máximo una carga positiva, o sea sustancialmente neutra, y en el último caso, cada uno de estos constituyentes, de manera independiente, pueda por 5 sí mismo ser sustancialmente neutro, lo cual incluye neutralidad real. Se pueden seleccionar NABEG a partir de restos que comprendan al menos un enlace que comprenda al menos un heteroátomo de elevada electronegatividad
o S; y grupos arilo que comprendan opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado a partir de halógenos, N, O, y S. Ejemplos de restos que comprenden al menos un enlace que comprenda al menos un heteroátomo de elevada electronegatividad o S incluyen, pero no se limitan a restos que comprenden al menos un enlace amida, enlace uretano, enlace urea, enlace tiourea, enlace éter, o enlace tioéter. ‘- [0076] Uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 puede ser una unidad de ramificación covalentemente enlazada a Q3 mediante una rama B’ y un enlazante L, tal como se muestra en la fórmula (Fórmula 2) que se muestra directamente a continuación.
15 Fórmula 2
[0077] En la Fórmula 2, T puede ser un carbono sustituido, un nitrógeno sustituido, o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre O, N y S. B’ tiene la fórmula (Fórmula 3) que se muestra directamente a continuación.
Fórmula 3 25 -(CH2)aW-[A11-(CH2)kW-]a’[A12-(CH2)y’-]b’[A13-(CH2)8’-]c’A14-
[0078] El -(CH2)aW de la Fórmula 3 está enlazado covalentemente con T de la Fórmula 2 y A14 de Fórmula 3 está enlazado covalentemente con L3 de Fórmula 2. De manera independiente cada uno de A11, A12, A13, y A14 puede ser un grupo potenciador de la unión a ácido nucleico neutro o sustancialmente neutro (NABEG); un alquilo ramificado neutro que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o al menos un anillo saturado neutro de 5 o 6 miembros que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S, tal como se ha descrito anteriormente junto con cada uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 de Fórmula 1. Los subíndices asociados con las unidades de metileno (CH2), concretamente, aW, kW, y’, y 8’, pueden ser
35 iguales o diferentes, indicando cada uno de manera independiente el tamaño de la unidad de metileno asociada y siendo cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20. Los subíndices asociados con las porciones entre paréntesis de fórmula 3, concretamente, a’, b’, y c’, pueden ser iguales i diferentes, indicando cada una de manera independiente el tamaño de la porción entre paréntesis asociada y siendo cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20.
[0079] En la Fórmula 2, de manera independiente, L3 puede ser un resto que comprende un enlace simple; una unidad de polimetileno que tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un grupo arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre halógenos, N, O y S, tal como se ha descrito anteriormente junto con cada uno de
45 los componentes L de Fórmula 1. La molécula resultante es un tinte de ácido nucleico trimérico.
[0080] Uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 puede ser una unidad de ramificación enlazada covalentemente con un grupo reactivo Rr, mediante una rama B’ y un enlazante L3, tal como se muestra en la fórmula (Fórmula 4) que se muestra directamente a continuación
Fórmula 4
[0081] En la Fórmula 4, T, B’ y L3 se definen como se muestra anteriormente junto con la Fórmula 2 y la Fórmula 3, con la excepción que L3 se une covalentemente con Rr. La molécula resultante puede ser un tinte de ácido nucleico tal como se representa por la Estructura 3 anterior.
[0082] Se puede usar un colorante con un grupo reactivo –Rr para marcar cualquiera de una amplia variedad de moléculas que comprenden un grupo funcional adecuado o están derivatizadas para comprender un grupo funcional adecuado. Se entiende que el término “grupo reactivo” se puede usar para referirse a un “grupo reactivo” o a un “grupo funcional” y que el término grupo funcional se puede usar para referirse a un “grupo reactivo” o a un “grupo funcional”. Cualquier término puede referirse, y ambos términos pueden referirse, a un grupo formador de enlace en un colorante, o a un grupo formador de enlace en la molécula sustrato que se va a marcar. Aquí, por medio de conveniencia, pero sin limitación, un grupo formador de enlace en el colorante se denominará generalmente como un grupo reactivo y un grupo formador de enlace en la molécula sustrato se denominará generalmente como grupo funcional. Meramente a modo de ejemplo, un colorante con un grupo reactivo o un grupo funcional Rr puede tener hasta una carga positiva
[0083] En general, la conjugación de un colorante con una molécula sustrato puede conferir una propiedad de detección de ácido nucleico del colorante en la molécula sustrato conjugada. El grupo reactivo y el grupo funcional son normalmente un electrófilo y un nucleófilo, respectivamente, que pueden formar un enlace covalente. De acuerdo con una alternativa, el grupo reactivo es un grupo fotoactivable capaz de reaccionar con una molécula de hidrocarburo tras la activación ultravioleta o fotolisis. De acuerdo con otra alternativa, el grupo reactivo es un diofenilo capaz de reaccionar con un dieno conjugado mediante una reacción de Diels-Alder. De acuerdo con otra alternativa más, el grupo reactivo es un 1,3-dieno capaz de reaccionar con un diofenilo. Otras parejas de grupo reactivo/grupo funcional adicionales se pueden seleccionar basándose en la química de Staudinger o la reacción entre un grupo azido y un alcalino terminal (la así denominada química de Click). Meramente a modo de ejemplo, los ejemplos de grupos reactivos útiles, grupos funcionales y enlaces correspondientes se relacionan a continuación en la Tabla 1
Tabla 1: Ejemplos de Grupos Reactivos, Grupos Funcionales, y Enlaces Covalentes
Grupo Electrófilo
Grupo nucleófilo Enlace Covalente Resultante
Ésteres activados *
Aminas/anilinas Carboxamidas
Acrilamidas
Tioles Tioéteres
Azidas de acilo **
Aminas/anilinas Carboxamidas
Haluros de acilo
Aminas/anilinas Carboxamidas
Haluros de acilo
Alcoholes/fenoles Ésteres
Nitrilos de acilo
Alcoholes/fenoles Ésteres
Nitrilos de acilo
Aminas/anilinas Carboxamidas
Aldehídos
Aminas/anilinas Iminas
Aldehídos o cetonas
Hidrazinas Hidrazonas
Aldehídos o cetonas
Hidroxilaminas Oximas
Haluros de alquilo
Aminas/anilinas Alquil aminas
Haluros de alquilo
Ácidos carboxílicos Ésteres
Haluros de alquilo
Tioles Tioéteres
Haluros de alquilo
Alcoholes/fenoles Ésteres
Alquil sulfonatos
Tioles Tioéteres
Alquil sulfonatos
Ácidos carboxílicos Ésteres
Alquil sulfonatos
Alcoholes/fenoles Ésteres
Anhídridos
Alcoholes/fenoles Ésteres
Anhídridos
Aminas/anilinas Carboxamidas
Haluros de arilo
Tioles Tiofenoles
Haluros de arilo
Aminas Aril aminas
Aziridinas
Tioles Tioéteres
Boronatos
Glicoles Ésteres de boronato
Ácidos carboxílicos
Aminas/anilinas Carboxamidas
Ácidos carboxílicos
Alcoholes Ésteres
Ácidos carboxílicos
Hidrazinas Hidrazidas
Carbodiimidas
Ácidos carboxílicos N-acilureas o anhídridos
Diazoalcanos
Ácidos carboxílicos Ésteres
Epóxidos
Tioles Tioéteres
Haloacetamidas
Tioles Tioéteres
Halotriazinas
Aminas/anilinas Aminotriazinas
Halotriazinas
Alcoholes/fenoles Éteres de triazinilo
Imidoésteres
Aminas/anilinas Amidinas
Isocianatos
Aminas/anilinas Ureas
Isocianatos
Alcoholes/fenoles Uretanos
Isotiocianatos
Aminas/anilinas Tioureas
Maleimidas
Tioles Tioéteres
Fosforamiditas
Alcoholes Ésteres de fosfito
Haluros de sililo
Alcoholes Éteres de sililo
Ésteres de sulfonato
Aminas/anilinas Alquil aminas
Ésteres de sulfonato
Tioles Tioéteres
Ésteres de sulfonato
Ácidos carboxílicos Ésteres
Ésteres de sulfonato
Alcoholes Éteres
Haluros de sulfonilo
Aminas/anilinas Sulfonamidas
Haluros de sulfonilo
Fenoles/alcoholes Ésteres de sulfonato
* Ésteres activados, como se entiende en la técnica, generalmente tienen la fórmula -COn, en el que n es un buen grupo saliente, tal como succinimidiloxi (-OC4H4O2), sulfosuccinimidiloxi (-OC4H3O2-SO3H), o -1oxibenzotriazolilo (-OC6H4N3), por ejemplo; o un grupo ariloxi o ariloxi sustituido una o más veces por sustituyente(s) que retira(n) electrón(es) tales como nitro, flúor, cloro, ciano, trifluorometilo, o sus combinaciones, por ejemplo, usados para formar ésteres de arilo activados; o un ácido carboxílico activado mediante una carbodiimida para formar un anhídrido o anhídrido mixto –OCORa u –OCNRaNHRb, en el que Ra y Rb, que pueden ser iguales o diferentes, son independientemente alquilo C1-C6, perfluoroalquilo C1-C6, o alcoxilo C1-C6, o ciclohexilo, 3-dimetilaminopropilo, o N-morfolinoetilo. ** Azidas de acilo, pueden también reordenarse a isocianatos.
[0084] El grupo reactivo puede ser uno que reaccionará con una amina, un tiol, o un aldehído, El grupo reactivo puede ser un grupo reactivo de amina, tal como un éster de succinimidilo, por ejemplo, o un grupo reactivo de tiol, tal como maleimida, una haloacetamida, o un metanetiosulfonato (MTS), por ejemplo, o un grupo reactivo de aldehído, tal como una amina, un aminooxi, o una hidrazida, por ejemplo.
[0085] Se puede conjugar un colorante reactivo con cualquiera de una amplia variedad de moléculas sustrato. Por ejemplo, un sustrato adecuado puede ser un nucleótido, un oligonucleótido, un péptido, una proteína, un hapteno, un fármaco, una micropartícula, un polímero sintético, un polímero natural, una célula biológica, un virus, una molécula de una superficie sólida, tal como la superficie de una oblea de silicio, la superficie o el recipiente de un sustrato de polipropileno, o similar, por ejemplo. Una molécula que se va a marcar puede ser un nucleótido, un oligonucleótido, un péptido, o una molécula que puede interactuar con un ácido nucleico. Por ejemplo, se han usado colorantes que se une al ADN para marcar una sonda basada en oligonucleótido para aplicaciones de la qPCR. Shiguro, T., y col, Nucleic Acids Res. 24: 4992-7 (1996).
[0086] A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10, que pueden ser iguales o diferentes, pueden, de manera independiente, ser NABEG seleccionados a partir de restos que comprenden al menos un enlace que comprende al menos un heteroátomo de elevada electronegatividad o S; y grupos arilo que comprenden opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre halógenos, N, O, y S. Los ejemplos de restos que comprenden al menos un enlace que comprende al menos un heteroátomo de elevada electronegatividad o S incluyen, pero no se limitan a restos que comprenden al menos un enlace amida, enlace uretano, enlace urea, enlace tiourea, enlace éter, o enlace tioéter. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 pueden ser tal que PUENTE comprenda como máximo una carga positiva, o sea sustancialmente neutro, y en el último caso, cada uno de estos constituyentes pude por sí mismo ser sustancialmente neutro, lo que incluye neutralidad real.
[0087] PUENTE puede comprender cualquier número adecuado de átomos no de hidrógeno, tal como se ha descrito anteriormente, tal como entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 átomos no de hidrógeno, por ejemplo, o entre aproximadamente 12 y aproximadamente 60 átomos no de hidrógeno para los colorantes diméricos, y entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 átomos no de hidrógeno para los colorantes triméricos. Por ejemplo, PUENTE puede tener entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 átomos no de hidrógeno para los colorantes diméricos, y entre aproximadamente 30 y aproximadamente 70 átomos no de hidrógeno para los colorantes triméricos.
[0088] Meramente a modo de ejemplo, PUENTE puede tener la fórmula (Fórmula 5) que se muestra directamente a continuación.
Fórmula 5
-
(CH2)x-C(=O)NH-(CH2)a-[O-(CH2)k]b-[O-(CH2)y]c-NH(O=C)-(CH2)x-
En uno de dicho caso, por ejemplo, L1 de PUENTE es –(CH2)x- y L2 de PUENTE es –(CH2)x-, en el que cada x, de manera independiente, es un entero seleccionado entre 1 y 11, inclusive; A1 de PUENTE es –C(=O)NH; a de PUENTE es 1; A2 de PUENTE es -0-; A3 de PUENTE es –O-; a puede ser un entero seleccionado entre 2 y aproximadamente 20, inclusive; cada uno de k y y, de manera independiente, puede ser 2 o 3; b puede ser cero o un entero seleccionado entre 2 y aproximadamente 20; y c puede ser cero o 1; cada uno de d, e, f, g, h e i de PUENTE es 0; y A10 de PUENTE es –NH(O=C)C-. Meramente a modo de ejemplo, PUENTE puede ser tal como se ha descrito, en el que c es 1. Además, Meramente a modo de ejemplo, PUENTE puede ser tal como se ha descrito, en el que c es 1, y además, en el que x puede ser 5; a y y pueden ser iguales y pueden ser 2 o 3; k puede ser 2; y b puede ser 0, 1, 2 o 3.
Colorantes monoméricos
[0089] De manera independiente, cada uno de los colorantes monoméricos constituyentes o moléculas funcionales, Q1, Q2, y Q3, usados para los colorantes diméricos y triméricos se pueden seleccionar a partir de: 1) colorantes fluorescentes de ácido nucleico, 2 moléculas no fluorescentes que se une al ácido nucleico; 3) colorantes fluorescentes sin ácido nucleico, y 4) colorantes no fluorescentes sin ácido nucleico. En general, Q1, Q2 y q3 se pueden seleccionar y unirse covalentemente mediante PUENTE de una manera que estimule o asegure la formación del dímero intramolecular en ausencia de ADN y la formación de complejos de ADN-colorante muy fluorescente tras la unión del ADN. La formación del dímero intramolecular puede ser suficiente para proporcionar la conformación útil en horquilla de un colorante dimérico, tal como se ha descrito anteriormente. Dicho colorante dimérico puede poseer propiedades deseables, tales como bajo fondo de fluorescencia y baja inhibición de la PCR, por ejemplo. Tal como se ha descrito anteriormente, es posible usar un colorante dimérico tal como se describe en la presente memoria descriptiva a una concentración relativamente elevada para generar para generar una señal fluorescente deseable, o fuerte.
[0090] La formación del dímero intramolecular se puede confirmar comparando los espectros de absorción de un colorante dimérico o colorante trimérico en una disolución acuosa con los espectros de absorción del colorante o colorantes monoméricos relacionados en una disolución acuosa. Cualquier colorante de formación del dímero intramolecular debe producir los espectros de los colorantes monoméricos del componente en el dímero o trímero que se va a desplazar significativamente con respecto a los espectros del(de los) colorante(s) monomérico(s) relacionado(s). A este respecto, por medio de ejemplo, un desplazamiento significativo puede ser de aproximadamente 10 nm o más. Por ejemplo, en la Figura 2, los espectros asociados con AOAO-7 se desplazan significativamente con respecto a los espectros de DMAO.
[0091] Cuando la formación del dímero intramolecular es una formación del dímero-H, los espectros
5 experimentarán usualmente un desplazamiento al azul significativo. A este respecto, por medio de ejemplo, un desplazamiento significativo puede ser aproximadamente de 10 nm o más. Otros tipos de formación del dímero intramolecular son también posibles y pueden dar como resultado un desplazamiento espectral en otra dirección, en desplazamientos espectrales en direcciones separadas para cada uno de los componentes de los colorantes monoméricos, en un desplazamiento espectral significativo, o sin desplazamiento espectral. A este respecto, por
10 medio de ejemplo, un desplazamiento significativo puede ser aproximadamente de 5 nm o menos. En general cuando no existe desplazamiento espectral significativo observado, se pueden emplear otras técnicas analíticas para confirmar la formación de cualquier dímero intramolecular. Dichas técnicas analíticas incluyen, pero no se limitan a, espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), espectroscopía infrarroja, y espectroscopía de fluorescencia, por ejemplo. Cualquier agregación de colorante intramolecular que de cómo resultado una estructura
15 en horquilla es generalmente deseable.
[0092] Diversas combinaciones de Q1, Q2, y Q3 pueden ser útiles o deseables. Meramente a modo de ejemplo, se puede construir un colorante dimérico mediante cinco diferentes combinaciones de Q1 y Q2, tal como se muestra esquemáticamente en la Figura 10. Además, por medio de ejemplo, se relacionan a continuación en la Tabla 2 los
20 ejemplos de colorantes preparados e intermedios asociados.
Tabla 2: Colorantes fluorescentes preparados de ácido nucleico
Nº
Nombre Estructura PM LONGITUD SEPARADOR (ÁTOMOS)
1
DMAO 478,41 N/A
2
TMAO 620,35 N/A
3
AO-3N 705,16 N/A
4
AO-2N 493,43 N/A
5
PMAO 691,47 N/A
6
AOAO-1 926,76 10
7
AOAO-2 1124,03 21
8
AOAO-3 1038,88 16
9
AOAO-2Q 1252,71 11
10
AOAO-4 1041,95 14
11
AOAO-5 896,73 8
12
AOAO-6 1010,92 16
13
AOAO-7 1080,96 19
14
TOTO-3 1088,94 16
15
AOAO-8 1064,92 16*
16
AOAO-9 1229 25
17
AOAO-10 1313,24 31
18
AOAO-11 1123 22
19
AOAO-12 1082,94 19
20
AOAO-13 1215,14 27
21
AOAO-14 1621,61 53
22
AOAO-12R 1132,95 19
23
AOTO-3 1094,99 16
24
TOTO-12 1146,23 20
25
TO(3) TO(3)-12 1245,34 20
26
TO(3) TO(3)-2 1302,44 22
27
AORO-7 1320,25 21
28
RORO-12 1550,51 22
29
TOTO.13 1248 27
30
STST-27 1116 27
31
STST-19 1000,8 19
32
AOAO-47 1547,6 47
33
AOAO-67 1864 67
33
AOAO-113 2541 113
35
ET-27 1239 27
36
STST-21N 1041 21
[0093] Aunque muchas de las estructuras que se muestran en la Tabla 2 muestran uno o más anión(es) de yoduro, cualquier otro anión(es) apropiado(s), tales como los descritos en la presente memoria descriptiva, tal como el(los) anión(es) cloruro, Meramente a modo de ejemplo, se puede usar en lugar de los aniones yoduro que se
5 muestran.
[0094] Un colorante dimérico de la invención puede comprender un colorante fluorescente de ácido nucleico Q1 y un colorante fluorescente de ácido nucleico Q2, en el que Q1 y Q2 pueden ser iguales o diferentes. Cuando Q1 y Q2 son iguales, el colorante resultante es un homodímero, tal como, Meramente a modo de ejemplo, cualquiera de los 10 colorantes Nos 6-22, 24-26, y 28-36 de la Tabla 2. Cuando Q1 y Q2 son colorantes fluorescentes de ácidos nucleicos diferentes que tienen espectros de absorción y emisión similares, el dímero resultantes es un heterodímero, tal como, Meramente a modo de ejemplo, el del colorante Nº 23 de la Tabla 2. Tal como un heterodímero es funcionalmente similar a un homodímero. En cualquier caso, Q1 y Q2 son colorantes indicadores, de tal manera que tras la unión al ADN, contribuyen a la señal fluorescente detectada, tal como se ilustra esquemáticamente en la
15 Combinación A de la Figura 10. Alternativamente, un colorante heterodimérico puede comprender dos colorantes fluorescentes de ácido nucleico diferentes que tienen espectros de absorción y emisión sustancialmente diferentes. En este caso, solo uno de los dos colorantes se selecciona como colorante indicador.
[0095] Q1 y Q2 pueden formar una pareja de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). En este caso, el colorante con la longitud de onda más corta actúa como colorante donante de fluorescencia, mientras que el colorante con la longitud de onda más larga actúa como un colorante aceptor o indicador. Para que se produzca un FRET eficaz, el espectro de emisión y la absorción del colorante donante necesitan solaparse suficientemente. Se proporcionan discusiones adicionales de FRET en Förster, Ann. Phys. (1948) y Stryer, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1967). Un colorante basado en FRET permite la excitación a una longitud de onda y la reemisión de fluorescencia a una longitud de onda sustancialmente más larga.
[0096] Cuando un heterodímero que comprende Q1 y Q2 de espectros sustancialmente diferentes no es un colorante basado en FRET, uno cualquiera de Q1 y Q2, pero no de ambos al mismo tiempo, se puede seleccionar como colorante indicador. El otro colorante no indicador sirve como compañero para la formación necesaria del dímero intramolecular y proporciona capacidad que se une adicionalmente al ácido nucleico para el colorante dimérico. Un ejemplo de un colorante heterodimérico que tiene un colorante indicador, un colorante fluorescente de ácido nucleico Q1, y un colorante no indicador, una molécula no fluorescente que se une al ácido nucleico Q2, se ilustra esquemáticamente en la Combinación B de la Figura 10.
[097] Un colorante heterodimérico puede comprender una molécula no fluorescente que se une al ácido nucleico Q1 y un colorante fluorescente sin ácido nucleico Q2. Aquí, Q2 es el colorante indicador, mientras que Q1 sirve como colorante de anclaje del ADN y un compañero de emparejamiento necesario para la formación del dímero intramolecular. El modo que se une al ADN para este tipo de heterodímero se ilustra esquemáticamente en la Combinación C de la Figura 10.
[098] Un colorante heterodimérico puede comprender un colorante fluorescente de ácido nucleico Q1 y un colorante no fluorescente sin ácido nucleico Q2. En dicho caso, Q1 es el colorante indicador y Q2 sirve como un compañero para la formación necesaria del dímero intramolecular. El modo que se une al ADN para este tipo de heterodímero se ilustra esquemáticamente en la Combinación D de la Figura 10.
[099] Un colorante heerodimérico puede comprender un colorante fluorescente de ácido nucleico Q1 y un colorante fluorescente sin ácido nucleico Q2. Si Q1 y Q2 tienen espectros de absorción y emisión similares, Q1 y Q2 son colorantes indicadores, aunque solo Q1 se une a los ácidos nucleicos. El modo que se une al ADN para este tipo de heterodímero se ilustra esquemáticamente en la Combinación E de la Figura 10. Cuando Q1 y Q2 forman una pareja FRET, el colorante con la longitud de onda más corta actúa como el colorante donante de fluorescencia, mientras que el colorante con la longitud de onda más larga actúa como el colorante aceptor o indicador. Cuando Q1 y Q2 son sustancialmente diferentes en los espectros y no son una pareja FRET, uno cualquiera de Q1 y Q2, pero no ambos al mismo tiempo, se puede seleccionar como colorante indicador. Un ejemplo de este último caso es el heterodímero AORO-7 (Colorante Nº 27 de la Tabla 2), que comprende AO con un pico de absorción y un pico de emisión a 503 nm y 523 nm (ADN), respectivamente, y un colorante de rosamina con un pico de absorción y un pico de emisión a 600 nm y ~ 620 nm, respectivamente, tal como se muestra en las Figuras 12 y 13. La Figura 14 muestra una gráfica de amplificación de la PCR que usa AORO-7 con el componente de colorante de rosamina fluorescente no nucleico escogido como colorante indicador usando el canal nº 3 en un Sistema de Detección de la PCR en tiempo real iCycler IQ Multiple-Color de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA).
[0100] Un colorante dimérico puede comprender una pareja de colorantes monoméricos seleccionados entre dos colorantes fluorescentes idénticos de ácido nucleico y dos colorantes fluorescentes diferentes de ácido nucleico.
[0101] Un colorante trimérico puede comprender un colorante fluorescente de ácido nucleico Q1, un colorante fluorescente de ácido nucleico Q2, un colorante fluorescente de ácido nucleico Q3, en el que Q1, Q2, y Q3 pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, Q1, Q2, y Q3 pueden ser el mismo colorante fluorescente de ácido nucleico. Un colorante trimérico puede comprender un colorante fluorescente de ácido nucleico Q1, un colorante fluorescente de ácido nucleico Q2, y un colorante fluorescente sin ácido nucleico Q3, en el que Q1 y Q2 sirven como moléculas de anclaje del ADN y Q3 es un colorante indicador. Un colorante trimérico de la invención puede comprender una molécula no fluorescente que se une al ácido nucleico Q1, una molécula no fluorescente que se une al ácido nucleico Q2, y un tercer colorante fluorescente sin ácido nucleico Q3, en el que Q1 y Q2 sirven como moléculas de anclaje del ADN y Q3 es un colorante indicador.
[0102] Se describen adicionalmente a continuación colorantes fluorescentes de ácido nucleico, moléculas no fluorescentes que se une al ácido nucleico, colorantes fluorescentes sin ácido nucleico, colorantes no fluorescentes sin ácido nucleico, y ejemplos de los mismos.
Colorantes fluorescentes de ácido nucleico
[0103] Los ejemplos de un colorante fluorescente de ácido nucleico monomérico adecuado para construir colorantes incluyen, pero no se limitan a, un colorante de acridina, un tinte de ácido nucleico basado en cianina asimétrica, un colorante de fenantridinio, un tinte nucleico de cianina simétrica, un derivado de DAPI, y un derivado de un colorante Hoescht. Los colorantes DAPI y Hoescht no se pueden unir generalmente directamente a PUENTE debido a que no poseen un grupo reactivo para la formación del enlace. En este contexto, por medio de ejemplo, un derivado se refiere a un colorante base, tal como un colorante DPI o Hoechst, que está suficientemente modificado para la formación del enlace, tal como mediante la adición de un grupo reactivo
Colorantes de acridina
5 [0104] Meramente a modo de ejemplo, el colorante fluorescente de ácido nucleico monomérico puede ser un colorante de acridina que tiene la estructura general (Estructura 4) que se muestra directamente a continuación.
Estructura 4 10
[0105]
15 [0106] Naranja de acridina (AO) es un colorante de acridina que tiñe el ADNds con fluorescencia verde y tiñe el ARN con fluorescencia roja. Traganos, y col., J. Histochem. Cytochem. 25(1), 46 (1977). A diferencia de algunos otros colorantes de acridina, AO tiene un elevado coeficiente de extinción (>50.000) y una longitud de onda de absorción larga (Aabs = 500 nm (ADN unido). Sin embargo, la afinidad de AO por el ácido nucleico es muy baja y el colorante tiene una fluorescencia intrínseca significativa en ausencia de ácidos nucleicos. A este respectos, el nivel
20 de fluorescencia intrínseca puede ser significativo en que impide que el colorante se use en la detección del ácido nucleico a un nivel bajo, tal como en un intervalo bajo de nanogramos/ml; por ejemplo, o, por ejemplo, en la detección del ácido nucleico en geles sin una etapa de desteñido. Consiguientemente, AO por sí mismo es de poca utilidad para la cuantificación del ADN o del ARN, particularmente por la elevada sensibilidad de detección del ADN asociada con aplicaciones tales como la qPCR en tiempo real.
25 [0107] Un colorante de acridina puede comprender cualquier variedad de sustituyentes en diversas posiciones en la estructura del anillo. La naturaleza de un sustituyente y su posición de sustitución puede afectar fuertemente las propiedades espectrales del colorante producido. En general, los sustituyentes donantes de electrones en las posiciones 3 y 6 y un sustituyente de retirada de electrones en la posición 9 normalmente los espectros de absorción
30 y emisión del colorante con desplazamiento al rojo. Los ejemplos de un grupo donante de electrones típico incluyen, pero no se limitan a, un grupo amino, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo, y un grupo alquilmercapto. Los ejemplos de un grupo atrayente de electrones típico incluyen, pero no se limitan a, un grupo ciano, un grupo perfluoroalquilo, un grupo carboxamido, un grupo sulfonamida, un grupo nitro, y un grupo halógeno. Cualquier estructura de anillo adicional fusionada con la estructura del núcleo aumentará también las longitudes de onda del colorante producido.
35 [0108] Se describen ahora diversas porciones de la Estructura 4. En la Estructura 4, como en otras diversas estructuras del colorante monomérico proporcionado o descrito en la presente memoria descriptiva, un símbolo de “R” seguido por un subíndice, tal como R1, Meramente a modo de ejemplo, puede indicar un sustituyente de la estructura que no es parte de PUENTE, o puede representar donde el PUENTE se une a la estructura, en cuyo
40 caso, no es un sustituyente de la estructura. Cada R1, de manera independiente, puede ser H; un alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos; un halógeno; -OR4; -SR5; -NR6R7; -CN; -NH(C=O)R8; -NHS(=O)2R9; o -C(=O)NHR10; cualquier pareja adyacente de R1s forma opcionalmente un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente además al menos un heteroátomo asociado seleccionado entre N, O y S; y uno del R1s es –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente, o uno de los R1s representa el lugar donde el
45 PUENTE se une a la estructura, en cuyo caso, este R1 es meramente representativo y no un sustituyente real del colorante monomérico. En cualquier caso, cuando R1 implica al menos uno de R4, R5, R6, R7, R8, R9, y R10, cualquiera de las aplicables de una de las mismas es de manera independiente H o alquilo que tiene de 1 carbono a 6 carbono, y para cualquier pareja aplicable de R6 y R7 adyacentes, de manera independiente, R6 y R7 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un
50 heteroátomo seleccionado entre N y O.
[0109] Normalmente R2 es H; un alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos; un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre halógenos, N, O y S; un halógeno; -OR11; -SR12; -NHR13; -CN; o -C(=O)NHR14; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura. En cualquier caso,
55 cuando R2 implica al menos uno de R11, R12, R13 y R14, cualquier uno de los mismos aplicable es de manera independiente H o alquilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos.
[0110] Normalmente, R3 es H; o un alquilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos; o representa el lugar donde el
PUENTE se une a la estructura.
[0111] \ es un anión, tal como un anión que equilibra la(s) carga(s) positiva(s) asociada(s) con el colorante, por ejemplo. \ puede ser biológicamente compatible. Los ejemplos de anión adecuado incluyen, pero no se limitan a, un 5 haluro, un sulfato, un fosfato, un perclorato, un tetrafluoroborato, y un hexafluorofosfato. Meramente a modo de ejemplo, el anión puede ser cloruro o yoduro.
[0112] Solo uno de R1, R2 y R3 debe representar donde el PUENTE se une a la estructura. Meramente a modo de ejemplo, uno de R2 y R3 puede representar donde el PUENTE se une a la estructura. Tal como se describe en la
10 presente memoria descriptiva, PUENTE se puede unir covalentemente a un colorante de acridina monomérico, tal como cualquiera de dichos colorantes descritos en la presente memoria descriptiva, y a otros colorante monomérico adecuado, para formar un colorante dimérico, o a dos u otros colorantes monoméricos adecuados para formar un colorante trimérico. Generalmente, solo uno de R1, R2 y R3 puede ser opcionalmente –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente Un colorante dimérico o un colorante trimérico puede comprender solo un L-Rr.
15 [0113] Meramente a modo de ejemplo, el colorante de acridina monomérico puede tener la estructura (Estructura 5) que se muestra directamente a continuación.
Estructura 5 20
[0114]
25 [0115] En la estructura 5, generalmente, cada R1, de manera independiente, es H, o alquilo C1-C2; uno de R2 y R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; opcionalmente, uno de R2 y R3 es –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente; cuando R2 no representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura y no es L-Rr, R2 se selecciona entre H, -CH3, -NH2, - NHCH3, -CN, y -C(=O)NH2; cuando R3 no representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura y no es L-Rr, R3 se selecciona entre H o –CH3; cada uno de R6 y R7, de manera
30 independiente, es H, o un alquilo C1-C2; y \ es un anión, tal como se ha descrito anteriormente. Meramente a modo de ejemplo, para cada pareja de R6 o R7 y R1 adyacente, de manera independiente, R6 o R7 y R1 puede, en combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros.
[0116] En un ejemplo, el colorante de acridina monomérico, tal como se represente mediante la Estructura 5,
35 puede ser tal que cada R1 es H; R2 es H; R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cada R6 es –CH3; cada R7 es –CH3; y \ es un anión, tal como se ha descrito anteriormente.
[0117] Meramente a modo de ejemplo, un colorante dimérico puede comprender dos moléculas idénticas de colorante de acridina monomérico de Estructura 5 y PUENTE de Fórmula 5.
40 Colorantes de cianina asimétrica
[0118] Meramente a modo de ejemplo, el colorante de ácido nucleico fluorescente monomérico puede ser un colorante de cianina asimétrica que tiene la estructura general (Estructura 6) que se muestra directamente a
45 continuación
Estructura 6
[0119]
50 [0120] La estructura general (Estructura 6, anterior) de colorantes de cianina asimétrica comprende un anillo heterocíclico que es un anillo de benzazolio sustituido; un puente de metano o polimetina; y un anillo heterocíclico que es un anillo de piridinio o quinolinio sustituido. La línea punteada en la estructura representa los átomos necesarios para formar uno o más anillo(s) fusionado(s), incorporando opcionalmente uno o más nitrógeno(s), que puede(n) estar o no cuaternizado(s). Cuando la línea punteada representa un anillo de 6 miembros que comprende uno o más átomo(s) de nitrógeno, el anillo fusionado resultante se denomina una anillo azabenzol.
[0121] En la estructura 6, en general, cada uno de R1 y R1’ en el anillo de benzazolio, de manera independiente, es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos; un halógeno; -OR9;-SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; o -C(=O)NHR15. Meramente a modo de ejemplo, uno de R1 y R1’ puede ser un sustituyente que es meta de X o del nitrógeno de benzazol, en el que el sustituyente confiere al menos una propiedad deseada tal como se describe adicionalmente a continuación. En cualquier caso, cuando R1 o R1’ implica al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15,, cualquier uno de los mismos aplicable, de manera independiente, es H; o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s); o un arilo; y cualquier R11 y R12 puede en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O.
[0122] Tal como se ha mencionado anteriormente, uno de R1 y R1’ de la Estructura 6 puede ser un sustituyente que confiera al menos una propiedad deseable al colorante. Una de dicha propiedad deseable es la unión a la ranura menor del ADN. Una molécula que se une a la ranura menor tiene normalmente una estructura con una forma creciente que se ajusta en el interior de la ranura menor de un ADN bicatenario Los ejemplos de una molécula de colorante que se une a la ranura menor del ADN o sin molécula de colorante, que pueden incluir una molécula natural, incluyen, pero no se limitan a, DAPI, un colorante Hoechst, distamicina A, netropsina, y cualquiera de numerosos enlazantes sintéticos a la ranura menor basados en poliamidas de N-metilpirrol y N-metilimidazol. Catálogo de Biotium, Inc. (Hayward, California (CA)), 2005-2006; Boger, y col., Acc. Chem. Res. 37, 61 (2004); y Dervan, P.B., Bioorg. & Med. Chem. 9, 2215 (2001). La forma creciente de un enlazante de la ranura menor se crea normalmente mediante metasustitución de un anillo de 5 o 6 miembros con un sustituyente de enlazante de ranura menor, que incluye, pero no se limita a, un benzoxazol-2-ilo sustituido o no sustituido, un benzimidazol-2-ilo sustituido o no sustituido, un benzotiazol-2-ilo sustituido o no sustituido, un imidazol-2-ilo sustituido o no sustituido, un oxazol-2-ilo sustituido o no sustituido, un tiazol-2-ilo sustituido o no sustituido un N-metilpirrolil-2-aminocarbonilo sustituido o no sustituido, un N-metilpirrolil-3-carboxamido sustituido o no sustituido, un 1-metilimidazol-2carboxamido sustituido o no sustituido, un 1-metilimidazol-4-aminocarbonilo sustituido o no sustituido, un fenilo sustituido o no sustituido, un piridilo sustituido o no sustituido, un pirazinilo sustituido o no sustituido, y un triazinilo sustituido o no sustituido. Un colorante de ADN puede ser metasustituido por un sustituyente enlazante de ranura menor tal como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº 2004/0132046.
[0123] Uno de R1 y R1’ puede ser –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente. Uno de R1 y R1’ puede representar donde el PUENTE se une a la estructura.
[0124] X se selecciona entre O y S. En general, un colorante en el que X es S tiene longitudes de onda de absorción y emisión más largas que un colorante similar en el que X es O.
[0125] R2 puede ser metilo o etilo, o puede representar donde el PUENTE se une a la estructura, Meramente a modo de ejemplo, R2 puede ser metilo o etilo
[0126] El subíndice n representa un número de unidades de doble enlace en cualquier puente de metino y se selecciona entre 0, 1, y 2. Normalmente, un colorante con un puente de metino más largo tendrá longitudes de onda más largas que un colorante con un puente de metino más corto. Meramente a modo de ejemplo, n puede ser 0 o 1.
[0127] Los sustituyentes R3, R4, y R5 son de manera independiente H o –CH3. Opcionalmente, cualquier pareja adyacente de estos sustituyentes puede formar un anillo de 5 o 6 miembros. Meramente a modo de ejemplo, R3, R4 y R5 pueden ser H.
[0128] En general, de manera independiente, cada uno de los sustituyentes R6, R8, y R8’ pueden ser H; un alquilo
o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s) seleccionados entre halógenos, N, O, y S. R8 y R8’ pueden en combinación formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 veces(s), de manera independiente, por alquilo C1-C2, alcoxilo C1-C2, alquilmercapto C1-C2, o un halógeno. En cualquier caso en el que cualquiera de R6, R8, y R8’ implican al menos uno de R16 y R17, cualquier uno del mismo aplicable, de manera independiente, es H; o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s); o un arilo; y cualquier R16 y R17 aplicable puede en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O.
[0129] R6 puede representar donde el PUENTE se une a la estructura. R6 puede ser un –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente.
[0130] R7 se selecciona entre H, un alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un arilo sustituido o no sustituido 5 que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s) seleccionados entre halógenos, N, O, y S; un –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente; o puede representar donde el PUENTE se une a la estructura
[0131] \ es un anión, tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria descriptiva.
[0132] Solo uno de R1, R1’, R6, R7 y R8 deber representar donde el PUENTE se une a la estructura. Tal como se describe en la presente memoria descriptiva, el PUENTE se puede unir covalentemente al colorante de cianina asimétrica monomérico para formar un colorante dimérico, o el colorante de cianina asimétrica monomérico y otros dos colorantes monoméricos adecuados para formar un colorante trimérico. Generalmente, solo uno de R1, R1’, R6, R7 y R8 puede ser opcionalmente –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente. Más normalmente, un colorante
15 dimérico o un colorante trimérico puede comprender solo uno –L-Rr.
[0133] Meramente a modo de ejemplo, un colorante de cianina asimétrica puede tener la estructura (Estructura 7) que se muestra directamente a continuación, en la que cada uno de R1’, R6, R7, R8 y R8’ es tal como se ha descrito anteriormente junto con la Estructura 6.
Estructura 7
[0134]
[0135] Por medio de ejemplo, el colorante de cianina asimétrica, tal como se representa por la Estructura 7, puede ser tal que R1’ sea H, alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos; un halógeno; -OR9; -SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; -C(=O)NHR15; un sustituyente asociado con la unión a la ranura menor; o –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente, o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura. Además, cuando R1’ comprende al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, cualquiera de dicho uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, de manera independiente, es H o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) , o un arilo; y cuando R1’ comprende R11 y R12, R11 y R12 pueden, en combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un 35 heteroátomo seleccionado entre N y O. X se puede seleccionar entre *O y S y n se puede seleccionar entre 0, 1, y 2. R6 puede ser H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O; y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s) seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente; o puede representar donde PUENTE se une a la estructura. R7 puede ser H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un arilo sustituido o no sustituido que comprende 1 a 3 heteroátomo(s) seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente; o puede representar donde el PUENTE se une a la estructura. R8 puede ser H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; 45 NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s) seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente; o puede representar donde el PUENTE se une a la estructura. R8’ puede ser H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s) seleccionados entre halógenos, N, O, y S. R8 y R8’ pueden, en combinación, formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 vez(ces), de manera independiente, por alquilo C1-C2, alcoxilo C1-C2, alquilmercapto C1-C2,
o un halógeno. Para cualquier R6, R8, o R8’ que comprende al menos uno de R16 y R17, cualquiera de dicho uno de los mismos R16 y R17, de manera independiente, puede ser H; alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) y un arilo. Para cualquier R6, R8 y R8’ que comprende R16 y R17, Los
55 mismos R16 y R17 puede, en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O. Solo uno de R1’, R6, R7 y R8 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura. Generalmente, solo uno de R1’, R6, R7 y R8 puede ser opcionalmente –L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente. \ es un anión, tal como se ha descrito anteriormente
[0136] En un ejemplo, un colorante de cianina asimétrica tiene la estructura (Estructura 8) que se muestra directamente a continuación, en el que R7 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura y \ es un anión, tal como se ha descrito anteriormente.
Estructura 8
[0137]
10 [0138] Meramente a modo de ejemplo, un colorante dimérico comprende dos moléculas de colorante de cianina asimétrica monoméricas de Estructura 8 y el PUENTE de la Fórmula 5.
[0139] Meramente a modo de ejemplo, en un colorante fluorescente de ácido nucleico, tal como el de la Estructura
15 1, por ejemplo, cuando el constituyente colorante Q1 es un colorante de cianina asimétrica, tal como cualquiera de las Estructuras 6-8, por ejemplo, y el constituyente colorante Q2 es un colorante de cianina asimétrica, tal como cualquiera de las Estructuras 6-8, por ejemplo, una suma de a, b, c, d, e, f, g, h e i del PUENTE, tal como el PUENTE de la Fórmula 1, por ejemplo, puede ser mayor que tres, o al menos uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 del PUENTE, tal como el PUENTE de la Fórmula 1, por ejemplo, puede ser un NABEG que comprende un
20 resto que comprende al menos un enlace que comprende al menos un enlace amina, enlace uretano, enlace urea, o enlace tiourea; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre halógenos, N, O, y S.
Colorantes de fenantridinio
25 [0140] Meramente a modo de ejemplo, el colorante fluorescente de ácido nucleico monomérico puede ser un derivado de fenantridinio, que tiene la estructura general (Estructura 9) que se muestra directamente a continuación.
Estructura 9 30
[0141]
35 [0142] En general, R1 puede representar donde el PUENTE se une a la estructura, aunque se entenderá que son posibles muchas variaciones de la Estructura 9 anterior y se contemplan en la presente memoria descriptiva, mediante una variedad de técnicas, tales como las técnicas de síntesis que pueden proporcionar la unión del PUENTE con cualquier otra parte de la estructura o que pueden modificar la estructura para proporcionar un colorante con cualquiera de las diversas longitudes de onda. \ es un anión, tal como se ha descrito anteriormente.
40 [0143] Meramente a modo de ejemplo, dos moléculas de colorante de fenantridinio monomérico de Estructura 9 en combinación con el PUENTE de la Fórmula 5 pueden formar un colorante dimérico.
[0144] Meramente a modo de ejemplo, el colorante fluorescente de ácido nucleico monomérico puede ser un 45 derivado de xanteno, que tiene la estructura general (Estructura 10) que se muestra directamente a continuación.
Estructura 10
[0145]
[0146] Se conocen algunos colorantes de xanteno cargados catiónicamente que se unen a ácidos nucleicos. Por ejemplo, pironina Y, en que R1, R2, R1’, y R2 y R3, R3’, R4, R4’, y A son H, es un colorante fluorescente que se une al ADN conocido que se ha usado para teñir el gel de ADN. Adkin, S., y Burmeister, M., Anal. Biochem. 240(1),
10 17(1996). Un colorante que tiene el esqueleto general que se muestra en la Estructura 10 se espera que tenga propiedades similares de tinción del ácido nucleico y que proporcione otros colores fluorescentes. Por ejemplo, pironina Y tiene un máximo de absorción a 548 nm y un máximo de emisión a 565 nm, lo que proporciona un color fluorescente rojo.
15 [0147] Meramente a modo de ejemplo, en general, cada uno de R1, R2, R1’, y R2’, de manera independiente, puede ser H, o alquilo C1-C6 inclusive, incorporando opcionalmente de 1 a 2 heteroátomo(s) seleccionados entre N y O. Además, Meramente a modo de ejemplo, de manera independiente, al menos uno de la pareja R1 y R2 y la pareja R1’ y R2’ pueden en combinación formar un anillo de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente un heteroátomo seleccionado entre N y O. R1 y R1’ pueden ser iguales y R2 y R2’ pueden ser iguales.
20 [0148] Uno de R1, R2, R1’, y R2’ puede representar donde el PUENTE se une a la estructura. Opcionalmente, uno de R1, R2, R1’, y R2’ es -L-Rr, tal como se ha descrito anteriormente.
[0149] Meramente a modo de ejemplo, R3, R3’, R4, y R4’, de manera independiente, pueden ser H o alquilo C1-C3
25 inclusive. R3, R3’, R4, y R4’ pueden ser iguales. De manera independiente, al menos uno de la pareja R3 y R1, la pareja R2 y R4, la pareja R3’ y R1’ y la pareja R4 y R2’ pueden, en combinación, formar un anillo de 5 o 6 miembros, que puede estar saturado o insaturado, sustituido o no sustituido.
[0150] A es un alquilo C1-C3; o –L-Rr, en el que L es un enlazante alifático C1-C12 y Rr es un grupo reactivo, tal 30 como se ha descrito anteriormente; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura.
[0151] Solo uno de R1, R2, R1’, R2 y A puede representar donde el puente se une a la estructura.
[0152] \ es un anión, tal como se ha descrito anteriormente.
35 [0153] Dos moléculas de colorante de xanteno monoméricas de la Estructura 10 en combinación con el PUENTE de la Fórmula 5 pueden formar un colorante dimérico.
[0154] Otras cadenas fluorescentes de ácido nucleico monomérico, tales como DAPI, DIPI, un colorante Hoechst,
40 LDS 751, hidroxiestilbamidina, un colorante de estirilo, un colorante de merocianina, un colorante de cianina, o FluoroGold, Meramente a modo de ejemplo, pueden ser adecuadas para el uso o se pueden derivatizar para ser adecuadas para el uso tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 9ª edición. Se entenderá que un gran número de otros colorantes de ácido nucleico monomérico pueden ser adecuados para el uso p se pueden derivatizar de tal manera que se puedan
45 conjugar con el PUENTE usando el conocimiento de la síntesis.
[0155] Colorantes no fluorescentes de ácido nucleico
[0156] En general, moléculas no fluorescentes que se une al ácido nucleico que son no fluorescentes o son
50 demasiado débilmente fluorescentes para ser útiles como colorantes fluorescentes de ácido nucleico. Las moléculas no fluorescentes que se une al ácido nucleico incluyen colorantes no fluorescentes que se une al ácido nucleico y moléculas que se une al ácido nucleico sintéticas o naturales incoloras
[0157] Se han usado numerosos colorantes no fluorescentes como tintes colorimétricos de geles de ácidos
55 nucleicos, Con respecto al tinte fluorescente de ácido nucleico de bromuro de etidio, estos colorantes no fluorescentes tienen usualmente mucha menor sensibilidad de detección, pero se considera que son más seguros para el uso, tales como más seguros en términos de toxicidad para el uso por seres humanos, por ejemplo. Los ejemplos de colorantes no fluorescentes que se une al ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, Azul Nilo, Violeta Cristal; Azul de Metileno, Tionina, Verde de Metilo, Azul Básico 66, Rojo Básico 29, Azul de Indolina, Verde Jano B, Pinacianol y todos los tintes. Adkins, y col., Anal. Biochem. 240, 17 (1996). La mayor parte de estos colorantes están disponibles de Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, Wisconsin).
Colorantes fluorescentes sin ácido nucleico
[0158] Uno de los colorantes monoméricos Q1, Q2, y Q3 puede ser un colorante fluorescente sin ácido nucleico. En general, todos los colorantes fluorescentes que no se consideran normalmente colorantes fluorescentes de ácido nucleico se consideran colorantes fluorescentes sin ácido nucleico. En la presente memoria descriptiva, el término “colorante fluorescente sin ácido nucleico” se refiere generalmente a un colorante fluorescente que no se considera normalmente un colorante de ácido nucleico. Por medio de ejemplo, el colorante no se puede considerar normalmente un enlazante fluorescente a la ranura menor o un intercalador fluorescente. Además, por medio de ejemplo, aunque algún colorante fluorescente sin ácido nucleico puede presentar algunas interacciones débiles con ácidos nucleico, estas interacciones no son generalmente suficientes para producir cambios espectrales de fluorescencia significativos para volver a los colorantes útiles para la detección del ácido nucleico.
[0159] Están disponibles algunos colorantes fluorescentes sin ácidos nucleico de diversas fuentes, tales como Biotium, Inc. (Hayward, CA). Los ejemplos de colorantes fluorescentes sin ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, colorante de fluoresceína, colorante de fluoresceína sulfonada, colorante de rodamina, u colorante de rodamina sulfonada, un colorante de cianina, un colorante de cianina sulfonada, un colorante de cumarina, un colorante de pireno, un colorante de oxazina, y un colorante de Bodipy (Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)). Un colorante fluorescente sin ácido nucleico puede comprender un grupo reactivo Rr, tal como se ha descrito anteriormente. Se pueden derivar colorantes fluorescentes sin ácido nucleico adecuados de tal manera que comprendan un grupo reactivo Rr. Un colorante reactivo adecuado se une covalentemente al PUENTE mediante Rr, y un grupo funcional adecuado procedente del PUENTE.
[0160] La selección de un colorante fluorescente sin ácido nucleico adecuado puede depender del otro emparejamiento del colorante o colorantes monoméricos. En general, un colorante fluorescente sin ácido nucleico adecuado debería ser capaz de formar un dímero intramolecular con el colorante o colorantes emparejados. La formación del dímero intramolecular se confirma normalmente mediante un cambio significativo en el espectro de absorción de al menos uno de los colorantes monoméricos del componente en medios acuosos antes y después de que el colorante monomérico se una covalentemente al(a los) otro(s) colorante o colorantes monoméricos por el PUENTE.
Colorantes no fluorescentes sin ácido nucleico
[0161] En general, el término “colorante no fluorescente sin ácido nucleico” se refiere a un colorante que ni es fluorescente ni se une al ácido nucleico. Dicho colorante se usa generalmente como un apagador de la fluorescencia en una aplicación basada en FRET. Por medio de ejemplo, se ha construido un sustrato de peptidasa fluorógena uniendo covalentemente un colorante donante fluorescente a un extremo de un péptido, y un colorante no fluorescente sin ácido nucleico, el apagador, al otro extremo del péptido para apagar la fluorescencia del donante. Tras la escisión enzimática del péptido, el donante y el apagador se separan, liberando por tanto la señal de fluorescencia. Además, por medio de ejemplo, se ha usado un colorante no fluorescente sin ácido nucleico para diseñar las sondas TaqMan denominadas de esta manera para la qPCR. Una sonda TaqMan consiste en un oligonucleótido, que es complementario con una secuencia de ADN diana, un colorante donante de fluorescencia unido a un extremo del oligonucleótido, y un apagador unido al otro extremo del oligonucleótido para apagar la fluorescencia del colorante donante. Durante la PCR en tiempo real, el oligonucleótido marcado se une al ADN diana, lo que produce que el oligonucleótido se escinda enzimáticamente, generando por tanto una señal fluorescente.
[0162] Un colorante no fluorescente sin ácido nucleico se puede usar principalmente como compañero de emparejamiento para la formación del dímero intramolecular, que es responsable del mecanismo que se une al ADN con liberación a demanda. El colorante no fluorescente sin ácido nucleico debería escogerse de esta manera para asegurar un FRET mínimo entre éste y el colorante fluorescente que se une al ácido nucleico al que se une tras la unión del ADN. En general, la pérdida de fluorescencia de colorante fluorescente de ácido nucleico debida al FRET debe ser mínima, de tal manera que no sea, por ejemplo, más de aproximadamente un 70% de la fluorescencia total emitida. La selección del colorante no fluorescente sin ácido nucleico puede estar basada en una evaluación del espectro de emisión del colorante fluorescente que se une al ácido nucleico y el espectro de absorción del colorante no fluorescente. Idealmente, estos espectros deben tener un mínimo solapamiento de tal manera que la pérdida de la señal de fluorescencia debida a FRET sea mínima, tal como se ha descrito anteriormente. Otro posible medio de minimizar el FRET es usar el PUENTE suficientemente largo de tal manera que la pérdida de la señal de fluorescencia debida al FRET sea mínima, tal como se ha descrito anteriormente, ya que la eficiencia del FRET es dependiente de la inversa de la potencia a la sexta de la separación intermolecular entre los colorantes constituyentes
[0163] Los ejemplos de apagadores no fluorescentes comercialmente disponibles que pueden ser útiles incluyen, pero no se limitan a, DABCYL de Fluka (Buchs, Suiza), Apagador Black Hole (BHQ) de Biosearch Technologies, Inc. (Novato, CA), Apagador Eclipse Dark (DQ) de Epoch Biosciences (Bothell, Washington), IOWA Black (IWB) de Integrated DNA Technologies (Skokie, Illinois), y QSY de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR).
Procedimiento de uso
[0164] Un colorante de ácido nucleico descrito en la presente memoria descriptiva puede ser particularmente útil en la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Usando la PCR acoplada con la detección del ADN basada en la fluorescencia mediante un colorante fluorescente de ácido nucleico, se puede determinar la cantidad de un producto de un proceso de la PCR sin que se tenga que detener el avance de la PCR o muestrear la reacción durante un ciclo de la PCR. Usando la qPCR, se puede no solo cuantificar la cantidad original de la muestra de ADN, sino que también se puede obtener información de la secuencia. La sensibilidad y la especificidad de la qPCR hace esta muy útil en numerosas aplicaciones prácticas que incluyen el diagnóstico y el pronóstico de enfermedades, y la identificación de especies en agricultura y ciencia forense.
[0165] El uso de un colorante en la qPCR puede implicar añadir una disolución del colorante y otros componentes adecuados para una reacción de la PCR (tal como una enzima o enzimas de amplificación, un cebador o cebadores suficientes para la amplificación de la secuencia del ácido nucleico diana, y los desoxinucleósidos trifosfatos, por ejemplo) a una disolución que comprende una muestra de ADN en un tubo, colocando el tubo sellado en un instrumento de la qPCR, y registrando la señal fluorescente detectada. Se puede registrar el valor Ct, o el número de ciclos requerido por la señal de la fluorescencia para alcanzar un valor umbral arbitrariamente determinado. El valor Ct está linealmente relacionado con el log del número de copias de la muestra de ADN. Usando una gráfica estándar del valor Ct y del log del número de copias de ADN, se puede determinar el número de copias de ADN basado en una muestra de ADN sobre el valor Ct. Meramente a modo de ejemplo, las gráficas de amplificación de la PCR usando colorantes seleccionados se muestran en las Figuras 8, 9, 11, y 14.
[0166] Otros usos de un colorante fluorescente de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, cuantificación del ADN en disoluciones o geles, tinción de ácidos nucleico en células vivas o muertas, y detección del ácido nucleico en micromatrices. Generalmente, el uso de un colorante fluorescente de ácido nucleico puede comprender poner en contacto el colorante, opcionalmente en combinación con cualquier reactivo adicional(es) con una muestra que comprenda o que se piense que comprenda un polímero de ácido nucleico; incubar la mezcla resultante del colorante y la muestra durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos de colorante-ácido nucleico; y detectar la señal fluorescente de los complejos de colorante-ácido nucleico.
[0167] Se puede preparar el colorante para uso adecuado tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Meramente a modo de ejemplo, el colorante se puede preparar en una disolución madre usando un disolvente acuoso o miscible en agua y un disolvente orgánico biológicamente compatible a una concentración de más de aproximadamente 100 veces que se usó en la disolución final de la tinción. Los ejemplos de disolventes acuosos adecuados que se pueden usar solos o en combinación con un disolvente orgánico adecuado en la preparación de una disolución madre de colorante incluyen, pero no se limitan a, agua, tampón PBS, y tampón Tris. Los ejemplos de disolventes orgánicos adecuados para la preparación de una disolución madre de colorante, incluyen, pero no se limitan a, DMSO, DMF, metanol o etanol. La disolución madre se diluye a continuación en una disolución de tinción con una concentración final de colorante deseada usando un disolvente acuoso adecuado, tal como agua o un tampón biológico, por ejemplo. En general, la concentración específica de colorante para la disolución de tinción se puede determinar por la naturaleza de la muestra que se va a analizar y la naturaleza del análisis que se está llevando a cabo. Por medio de ejemplo, en general, una disolución de tinción para uso junto con una muestra celular puede tener una concentración de colorante de aproximadamente 1 nM o más, o hasta aproximadamente 100 μM. Además, por medio de ejemplo, en general, una disolución de tinción para uso junto con un gel electroforético puede tener una concentración de colorante de aproximadamente 1 μM o más, o hasta aproximadamente 50 μM.
[0168] Un procedimiento de tinción de ácidos nucleicos que usa un colorante se puede determinar por la naturaleza del análisis que se está llevando a cabo. En la tinción de los ácidos nucleicos en muestras celulares o de tejido, que puede estar o no prefijada, las muestras se incuban normalmente en disolución de tinción durante unos pocos minutos a 2 horas para dejar al colorante permear las membranas celulares y combinar con los ácidos nucleico. En algunos casos, los ácidos nucleicos pueden estar presentes en la forma de una disolución que comprende ácidos nucleicos purificados o extractos celulares brutos. En dichos casos, en general, la adición de la disolución madre de colorante a una disolución de ácido nucleico debe dar como resultado una señal de fluorescencia detectable de manera instantánea, la fuerza de la cual es proporcional a la cantidad de ácido nucleico. Por medio de ejemplo, se muestra en la Figura 7una curva de valoración del ADN. La relación sustancialmente lineal entre la cantidad de ADN y la intensidad de la fluorescencia se puede usar para la cuantificación del ADN, o cuando el extracto celular se usa, la estimación del número de células. En algunos ejemplo, se puede incluir un ácido nucleico en una matriz inerte, tal como una mancha o gel, una tira de ensayo, por ejemplo, o unida a una superficie sólida, tal como un chip de micromatriz o cualquier otra superficie sólida, por ejemplo. En dichos casos, en general, la tinción se lleva a cabo aplicando una disolución de tinción a la superficie de la matriz que comprende el ácido nucleico, o a la superficie de un chip de micromatriz u otra superficie sólida, e incubar durante un periodo suficiente para permitir la formación de complejos de colorante-ácido nucleico.
5 [0169] Un complejo fluorescente de ácido nucleico-colorante se puede detectar mediante su emisión o excitación. Por medio de ejemplo, el complejo fluorescente de ácido nucleico-colorante puede ser, y normalmente se, excita por una luz con una longitud de onda a o próxima a la longitud de onda de absorción máxima del complejo. Además, por medio de ejemplo, el complejo de ácido nucleico-colorante se puede excitar mediante luz UV con una longitud de onda de 300 nm a 400 nm, que es una fuente común de luz de excitación disponible en la mayor parte de los transluminadores usados para las aplicaciones de visualización de geles. Por medio de ejemplo, la señal fluorescente se puede detectar mediante diversos instrumentos, tales como lectores de placas. Microscopios, fluorómetros, contadores cuánticos, y citómetros de flujo, por ejemplo. Además, por medio de ejemplo, se puede realizar la señal fluorescente mediante procedimientos visuales, tales como inspección visual o registro fotográfico, por ejemplo.
15 Síntesis
[0170] La síntesis de un colorante se puede describir en términos de síntesis de los constituyentes monoméricos del colorante, síntesis del PUENTE, y conjugación de los constituyentes monoméricos del colorante con el PUENTE. Se describirán ahora las síntesis de los colorantes monoméricos y los colorantes monoméricos que comprenden un grupo funcional o grupo reactivo
Síntesis de los colorantes monoméricos y moléculas funcionales
25 [0171] Los colorantes monoméricos adecuados y los colorantes monoméricos que comprenden un grupo funcional
o un grupo reactivo se pueden preparar desde sus componentes básicos mediante un procedimiento conocido o cualquier procedimiento adecuado, o modificando material comercialmente disponible que ya tiene una estructura de núcleo deseable o adecuada. Se pueden preparar muchos colorantes de acridina monoméricos a partir de colorantes de acridina comercialmente disponibles. Unos pocos ejemplos de un colorante de acridina comercialmente disponible que puede servir como material de partida adecuado para la síntesis se muestra directamente a continuación
35 [0172] Se pueden preparar otras estructuras de núcleos de acridina de acuerdo con procedimientos conocidos o cualquier procedimiento adecuado. Albert, A., The acridines: their preparation, physical, chemical, and biological properties and uses, Edward Arnold Ltd., London; Eldho, y col., Synth. Commun. 29, 4007 (1999); y Joseph, y col., Bioconjugate Chem. 15, 1230 (2004). Se puede formar una estructura de núcleo de acridina condensando una difenilamina adecuada con un ácido carboxílico adecuado o un ácido carboxílico equivalente en presencia de un ácido de Lewis, tal como se ilustra esquemáticamente en la Reacción 1 directamente a continuación.
[0173] Reacción 1
[0174] En la Reacción 1, R’, R’’ y R’’’ son sustituyentes adecuados, como se describe a continuación adicionalmente. El material de partida de difenilamina está tanto comercialmente disponible como se puede sintetizar a partir de un haluro de arilo adecuado y una arilamina adecuada usando un procedimiento conocido o cualquier procedimiento adecuado. Yang, y col., J. Organomet. Chem. 576, 125 (1999); Hartwig, y col., J. Org. Chem. 64, 5575 (1999); y Wolfe, y col., J. Org. Chem. 65, 1158 (2000).
[0175] La naturaleza de los sustituyentes y la posición en la que los sustituyentes se unen pueden tener un profundo efecto sobre la propiedad espectral del colorante. En general, los grupos donantes de electrones en las posiciones 2, 3, 6, y 7 aumentarán las longitudes de onda de absorción y emisión del colorante. Un grupo donante de electrones típico puede ser, por medio de ejemplo, un grupo amino, un grupo alquilamino, un grupo dialquilamino, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo, un grupo tiol, o un grupo alquiltio. Un grupo donante de electrones más típico puede ser, por medio de ejemplo, un grupo amino, un grupo alquilamino, un grupo dialquilamino o un grupo alcoxilo.
5 En general, un grupo atrayente de electrones en la posición 9 aumentara las longitudes de onda de absorción y emisión del colorante. Un grupo atrayente de electrones típico puede ser, por medio de ejemplo, un grupo ciano, un grupo perfluoroalquilo, un grupo aminocarbonilo, un grupo alquilaminocarbonilo, un grupo alquilcarbonilo, un grupo aldehído, un grupo alcoxicarbonilo, un grupo aminosulfato, un grupo alquilaminocarbonilo, un grupo haluro. Un grupo atrayente de electrones más típico puede ser un grupo ciano, un grupo perfluoroalquilo, o un grupo haluro.
10 [0176] En general, una vez que se construye la estructura del núcleo de acridina, el nitrógeno 10 se alquila con un grupo haloalquilo, que comprende normalmente un grupo reactivo adicional o un grupo funcional que se puede convertir en un grupo reactivo. El grupo reactivo adicional sirve para conjugar el colorante de acridina con el PUENTE. En el Esquema 1 directamente a continuación, se ilustran esquemáticamente algunos medios de preparar
15 colorantes monoméricos de naranja de acridina con un grupo reactivo adecuados
Esquema 1
[0177] La posición 9 de la acridina 10 alquilada se puede sustituir fácilmente con un grupo ciano, que se puede hidrolizar adicionalmente con un grupo carboxamida, tal como se ilustra esquemáticamente en el Esquema 2 directamente a continuación
Esquema 2
5 [0178] Se han descrito procedimientos para preparar colorantes de cianina asimétrica monoméricos reactivos. Carreon, y col., Org. Lett. 6(4), 517 (2004). Dicho colorante puede tener la estructura (Estructura 11) que se muestra directamente a continuación.
Estructura 11 10
[0179]
15 [0180] La Patente Nº 5.863.753 da a conocer la preparación de una serie de colorantes reactivos de cianina asimétrica, incluyendo los que tienen un sustituyente orto en el nitrógeno del quinolinio o piridinio. Dicho sustituyente, especialmente un sustituyente cíclico, orto en el nitrógeno del quinolinio o piridinio, se dice que confiere las propiedades deseadas a los colorantes de cianina asimétrica., de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos Nº 5.436.134. Estos colorantes de cianina asimétrica cíclicamente sustituida se denominan comúnmente como
20 colorantes SYBR. Zipper, y col., Nucleic Acids Res. 32(12), e103 (2004). Algunos de los colorantes SYBR reactivos están comercialmente disponibles de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), aunque las estructuras exactas de estos colorantes no se conocen. Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 9ª edición.
[0181] La Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº 2004/0132046 da a conocer
25 procedimientos para preparar colorantes monoméricos de cianina asimétrica con capacidad de unirse a la ranura menor. En general, estos colorantes poseen una estructura con forma creciente en virtud de tener un sustituyente de benzazolilo adicional en el anillo de benzazolilo de los colorantes. Se pueden preparar colorantes monoméricos similares que tienen un grupo reactivo adecuado usando procedimientos similares, por ejemplo, tal como se ilustra esquemáticamente en el Esquema 3 directamente a continuación.
Esquema 3
[0182] Se pueden preparar colorantes de fenantridinio reactivos a partir de 3,8-diamino-6-fenilfenantridina comercialmente disponible, tal como se ilustra esquemáticamente en el Esquema 4 directamente a continuación.
Esquema 4
10 [0183] Meramente a modo de ejemplo, el Colorante Nº 35 de la Tabla 2 se puede preparar usando el fenantridinio intermedio con un grupo reactivo que se muestra en el esquema 4 anterior.
[0184] Se pueden llevar a cabo preparaciones de derivados de pironina con un grupo reactivo en la posición 9 15 condensando dos equivalentes de derivado de m-aminofenol con un equivalente de anhídrido dicarboxílico, tal como se ilustra esquemáticamente en el Esquema 5 directamente a continuación.
Esquema 5
[0185] Muchos colorantes no fluorescentes que se unen a ácido nucleico monomérico son pigmentos conocidos usados en las industrias textil y de la tinta y están comercialmente disponibles. Se pueden encontrar referencias de preparaciones de estos colorantes en la bibliografía. Muchos colorantes fluorescentes sin ácido nucleico monoméricos y colorantes no fluorescentes sin ácido nucleico están comercialmente disponibles o se pueden preparar fácilmente usando procedimientos conocidos.
Síntesis del PUENTE
[0186] El PUENTE se forma usualmente cuando los colorantes monoméricos se acoplan a un grupo bi o trifuncional, que está a menudo comercialmente disponible. En general, las porciones terminales del PUENTE están entre los propios colorantes monoméricos, mientras que la porción media del PUENTE procede de una molécula bi o trifuncional disponible de una fuente comercial. En algunos casos, una porción significativa del PUENTE, tal como de hasta el 90%, por ejemplo, puede preunirse a los colorantes monoméricos antes del ensamblaje final del colorante dimérico o trimérico. En algunos otros casos, la mayor parte del PUENTE se puede preparar por separado antes de que los colorantes monoméricos se unan. En el caso de la síntesis del heterodímero, un grupo enlazante bifuncional monoprotegido se une usualmente en primer lugar a un colorante monomérico, seguido por la desprotección y el acoplamiento del segundo colorante monomérico. Se pueden sintetizar colorantes heterotriméricos usando una estrategia de protección-desprotección por etapas similar.
Conjugación de colorantes monoméricos con el PUENTE
[0187] En general, los colorantes diméricos y triméricos se pueden ensamblar conjugando colorantes monoméricos que tienen un grupo reactivo adecuado con un enlazante bi o trifuncional en una reacción de acoplamiento en una etapa para alguno de los homodímeros, o en reacciones multietapa para los heterodímeros y trímeros o alguno de los homodímeros que comprenden múltiples elementos A del puente. Se ilustran esquemáticamente en el Esquema 6 directamente a continuación ejemplos de rutas sintéticas de homodímeros y heterodímeros seleccionados.
Esquema 6
[0188] Un ejemplo de preparación de un colorante homotrimérico se ilustra esquemáticamente en el Esquema 7 directamente a continuación.
Esquema 7
[0189] Los ejemplos de procedimientos para preparar un colorante dimérico que tiene un grupo reactivo se ilustran en el Esquema 8 directamente a continuación.
Esquema 8
5 EJEMPLOS
Ejemplo 1: Preparación de yoduro de naranja de 10-(3-yodopropil)acridina
[0190] Se añadió un equivalente de 1,3-diyodopropano a una suspensión de 5 g de naranja de acridina (Aldrich)
10 en 10 ml de clorobenceno. La mezcla resultante se agitó a 90-100ºC durante la noche. La mezcla de reacción caliente se vertió en ~ 200 ml de EtOAc. Se recogió el precipitado de color naranja mediante filtración y se secó a vacío, dando como resultado ~ 8 g.
Ejemplo 2: Preparación de sal de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil)acridina
15 [0191] Se preparó bromuro de 10-(5 etoxicarbonilpentil)acridina usando el procedimiento del Ejemplo 1, con la excepción de que se sustituyó el 1,3-diyodopropano por ácido 6-bromohexanoico. El producto bruto (5 g) se suspendió en ~ 100 ml de metanol y se disolvieron e equivalentes de NaOH en 30 ml de H2O. Se agitó la suspensión a temperatura ambiente durante 24 h. Se eliminó el metanol mediante evaporación, y la disolución acuosa restante
20 se acidificó con HCl concentrado. Se añadieron aproximadamente 50 ml de NaCl saturado para precipitar el producto. Se recogió el producto mediante filtración y a continuación se secó a vacío a 45ºC durante 24 horas.
Ejemplo 3: Preparación de DMAO (Colorante Nº 1 de la Tabla 2)
[0192] Se suspendió yoduro de naranja de 10-(3-yodopropil)acridina (100 mg) en 20 ml de dimetilamina 2 M en metanol en un tubo sellado y a continuación se agitó a 60ºC durante la noche. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente y a continuación se vertió en 50 ml de EtOAc. Se recogió el precipitado mediante centrifugación y a continuación se secó a vacío a 40ºC durante 24 horas.
Ejemplo 4: Preparación de TMAO (Colorante Nº 2 de la Tabla 2)
[0193] Una mezcla de DMAO (Colorante Nº 1 de la Tabla 2) (11 mg, 0,023 mmol) y CH3I (0,5 ml) en CH3OH (2 ml) se mantuvo a reflujo suavemente durante 4 días. El producto naranja (10 mg) se recogió mediante filtración por succión.
Ejemplo 5: Preparación de PMAO (Colorante Nº 5 de la Tabla 2)
[0194] Una mezcla de sal de yoduro de naranja de 10-(3-yodopropil)acridina (100 mg, 0,18 mmol) y N,N,N’N’tetrametil-1,3.propanodiamina (0,3 ml, 1,8 mmol) en CH3OH (10 ml) se mantuvo a reflujo durante la noche. Tras enfriar a temperatura ambiente, se recogió el precipitado mediante filtración por succión. Se volvió a suspender el precipitado en CH3OH (5 ml) y se mantuvo a reflujo durante la noche y se recogió mediante filtración por succión. Se secó a un peso constante a vacío para dar un sólido oscuro (14 mg)
Ejemplo 6: Preparación de AOAO-2Q (Colorante Nº 9 de la Tabla 2):
[0195] Una mezcla de sal de yoduro de naranja de 10-(3-yodopropilo)acridina (81 mg, 0,15 mmol) y PMAO (100 mg, 0,15 mmol) en DMF (1,5 ml) se calentó a 130ºC durante 7 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, se añadió CH3OH (15 ml) y se calentó la suspensión a reflujo durante 1 hora. La filtración por succión proporcionó el producto como un sólido de color rojo oscuro (83,1 mg).
Ejemplo 7: Preparación de AOAO-2 (Colorante Nº 7 de la Tabla 2)
[0196] Se añadieron Et3N (0,15 ml, 1,05 mmol) y TSTU (320 mg, 1,05 mmol) a una suspensión de sal de cloruro de naranja de 10-(5-carbocxipentil)acridina (438 mg, 1,03 mmol) en DMF (5 ml) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido por la adición de Et3N (0,1 ml) y 3,3’-diamino-Nmetildipropilamina (50 mg, 0, 344 mmol). Después, se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche, se añadió EtOAc (20 ml) para precipitar el producto. Se volvió a disolver el producto bruto en DMF y se precipitó de nuevo con EtOAc. Se separó el sólido (250 mg) mediante centrifugación
Ejemplo 8: Preparación de AOAO-3 (Colorante Nº 8 de la Tabla 2)
[0197] Se preparó el colorante (393 mg) usando el procedimiento para sintetizar AOAO-2 a partir de naranja de 10(5-carboxipentil) acridina (432 mg, 1,03 mmol) y etilendiamina (25 mg, 0,42 mmol).
Ejemplo 9: Preparación de bromuro de naranja de 10-(8-bromooctil) acridina
[0198] Se calentó una mezcla de naranja de acridina (2 g, 7,53 mmol) y 1,8-dibromooctano (12 ml, 67,8 mmol) en clorobenceno (15 ml) a 110ºC durante la noche. Se añadió EtOAc (50 ml) y se mantuvo a reflujo la suspensión durante 1 hora. Después de enfriar a temperatura ambiente, la filtración por succión proporcionó el producto como un sólido de color naranja (3,56 g).
Ejemplo 10: Preparación de AOAO-5 (Colorante Nº 11 de la Tabla 2)
[0199] Una mezcla de bromuro de 10-(8-bromoactil) acridina (0,5 g, 0,94 mmol) y naranja de acridina (0,3 g, 11,2 mmol) en DMF (5 ml) se calentó a 130ºC durante la noche. Se añadió EtOAc para precipitar el producto. La repetición del precipitado a partir de DMF y EtOAc proporcionó el producto como un sólido de color rojo oscuro (214 mg).
Ejemplo 11: Preparación de AOAO-7 (Colorante Nº 13 de la Tabla 2)
[0200] Se sintetizó el colorante (30 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir de una sal de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (121 mg, 0,29 mmol) y diclorhidrato de 1,5-diamino-pentano (20 mg, 0,12 mmol).
Ejemplo 12: Preparación de AOAO8 (Colorante Nº 15 de la Tabla 2)
[0201] El colorante (182 mg) se sintetizó usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir de una sal de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (241 mg, 0,58 mmol) y piperazina (20 mg, 0,23 mmol).
Ejemplo 13: Preparación de AOAO-11 (Colorante Nº 18 de la Tabla 2)
5 [0202] El colorante (112 mg) se sintetizó usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir de una sal de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (180 mg, 0,43 mmol) y 1,8-diamino-octano (25 mg, 0,17 mmol)
Ejemplo 14: Preparación de AOAO-12 (Colorante Nº 19 de la Tabla 2)
[0203] Se sintetizó el colorante (76 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir de una sal de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (147 mg, 0,35 mmol) y diclorhidrato de 2,2’oxibis(etilamina) (25 mg, 0,14 mmol).
Ejemplo 15: Preparación de AOAO-13 (Colorante Nº 20 de la Tabla 2)
15 [0204] Se sintetizó el colorante (64 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir de una sal de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (96 mg, 0,23 mmol) y 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (20 mg, 0,09 mmol).
Ejemplo 16: Preparación de 1,3-Di-((2-N-t-Boc-amino)etil)aminocarbonil) benceno (Colorante Nº 101, que se muestra directamente a continuación
[0205]
[0206] Se añadieron Et3N (0,4 ml, 2,71 mmol) y TSTU (820 mg, 2,71 mmol) a una disolución de ácido isoftálico (220 mg, 1,32 mmol) en DMF (2 ml) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se siguió por la adición de Et3N (1 ml) y mono-tBoc-etilendiamina (460 mg, 2,86 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche y se repartió entre HCl 1 N (100 ml) y EtOAc (50 ml). Se extrajo la capa acuosa con EtOAc (50 ml) y se lavaron las capas orgánicas combinadas con HCL 1 N (2 x 50 ml), H2O (50 ml), y NaCl saturado (50 ml), y se secaron con Na2SO4 anhidro. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna usando EtOAc:hexanos (9:1) como eluyente para dar el producto sólido incoloro (356 mg)
35 Ejemplo 17. Preparación de la sal del ácido trifluoroacético de1,3-di-((2-aminoetil)aminocarbonil)benceno (Colorante Nº 102, que se muestra directamente a continuación)
[0207]
[0208] Se añadió 1,3-di-((2-(N-t-Boc-amino)etil)aminocarbonil) benceno (356 mg, 0,79 mmol) a TFA (5 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 1 hora y se concentró la disolución hasta sequedad a vacío. El residuo incoloro se disolvió en CH3OH (2 ml) y se añadió gota a gota a Et2O (30 ml). El precipitado se recogió mediante centrifugación y
45 se secó a un peso constante a vacío para dar el producto sólido (425 mg)
Ejemplo 18: Preparación de AOAO-9 (Colorante Nº 16 de la Tabla 2)
[0209] Se preparó el colorante (55 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir de una sal de cloruro de naranja de 10-(5.carboxipentil) acridina (109 mg, 0,26 mmol) u y una sal del ácido trifluoroacético del 1-3di((2-aminoetil)aminocarbonil) benceno (50 mg, 0,1 mmol).
Ejemplo 19: Preparación de 1,3-Di((5-(N-t-Boc-amino)aminocarbonil) benceno (Colorante Nº 103, que se muestra directamente a continuación)
55 [0210]
[0211] El colorante (555 mg) se preparó de acuerdo con el procedimiento para preparar el 1,3-di-((2-(N-t-Bocamino)aminocarbonil)benceno a partir de ácido isoftálico (254 mg, 1,53 mmol) y mono-tBoc cadaverina (640 mg, 5 3,15 mmol).
Ejemplo 20: Preparación de la sal del ácido trifluoroacético del 1,3-di-((5-aminopentil)aminocarbonil) benceno (Colorante Nº 104, que se muestra directamente a continuación)
10 [0212]
[0213] Se preparó el colorante (560 mg) de acuerdo con el procedimiento para el Colorante Nº 102 (555 mg, 1,04 15 mmol).
Ejemplo 21: Preparación de AOAO-10 (Colorante Nº 17 de la Tabla 2)
[0214] Se preparó el colorante (22 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir del cloruro de 20 naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (95 mg, 0,23 mmol) y el Colorante Nº 104 (50 mg, 0,09 mmol).
Ejemplo 22: Preparación de AOAO-14 (Colorante Nº 21 de la Tabla 2)
[0215] Se preparó el colorante (150 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir del cloruro de 25 naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (166 mg, 0,40 mmol) y la diamido-dPEG-diamina (QuantaBiodesign of Powell, Ohio) (100mg, 0.15mmol).
Ejemplo 23: Preparación de diyoduro de 10-((((3-(N-Boc-amino)propil-N,N-dimetil)amonio)propil) acridina (Colorante Nº 105, que se muestra directamente a continuación) 30
[0216]
35 [0217] Una mezcla de yoduro de naranja de 10-(3-yodopropil) acridina (500 mg, 0,89 mmol) y 3-(N-t-Boc-amino) propil-N,N-dimetilamina (1,8 g, 8,9 mmol) en CH3OH (50 ml) se mantuvo a reflujo durante la noche. Tras enfriar a temperatura ambiente, se recogió el precipitado mediante filtración por succión y se secó a peso constante para dar el Colorante Nº 105 como un sólido de color naranja (292 mg)
40 Ejemplo 24: Preparación de la sal de trifluoroacetato de 10-((((3-amonio)propil)-N,N-dimetil)amonio) propil acridina (colorante Nº 106, que se muestra directamente a continuación)
[0218]
[0219] Se añadió el colorante Nº 105 (50 mg, 0,06 mmol) a TFA (2 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 30 minutos. Se concentro la disolución hasta sequedad a vacío y se disolvió el residuo en CH3OH (3 ml). Se añadió 5 gota a gota la disolución a Et2O (30 ml) y se recogió el precipitado mediante centrifugación y se secó a peso constante a vacío para dar el Colorante Nº 106 como un sólido de color naranja (28 mg)
Ejemplo 25: Preparación de AOAO-4 (Colorante Nº 10 de la Tabla 2)
10 [0220] Se preparó el colorante (23 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 a partir de la sal de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (31 mg, 0,075 mmol) y el Colorante Nº 106 (28 mg, 0,036 mmol).
Ejemplo 26: Preparación de la sal de bromuro de naranja de 10-(6-(N-Ftalimido)hexil)acridina (Colorante Nº 107, que se muestra directamente a continuación) 15
[0221]
20 [0222] Una mezcla de naranja de acridina (2 g, 7,54 mmol) y N-(6-bromohexil)ftalimida (4,7 g, 15,1 mmol) en clorobenceno (20 ml) se calentó a 110ºC durante 2 días. Se añadió EtOAc (50 ml) y se calentó la suspensión a reflujo durante 1 hora. Tras enfriar a temperatura ambiente, el producto del Colorante Nº 107 se recogió mediante filtración por succión como un sólido de color naranja (3,76 g)
25 Ejemplo 27: Preparación del yoduro de naranja de 10-(5-((5-carboxipentil)aminocarbonil)pentil acridina (Colorante Nº 108, que se muestra directamente a continuación)
[0223]
[0224] Et3N (40 μl, 0,28 mmol) y TSTU (81 mg, 0,27 mmol) se añadieron a una suspensión de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (107 mg, 0,258 mmol) en DMF (3 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se siguió por la adición de Et3N (0,2 ml) y una disolución de ácido 6-aminohexanoico (67 mg,
35 0,51 mmol) en H2O (1 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora y se concentró hasta sequedad a vacío. Se trituró el residuo con H2O para dar el Colorante Nº 108 como un sólido de color naranja (125 mg).
Ejemplo 28: Preparación de cloruro de naranja de 9-ciano-10-(5-carboxipentil) acridina (Colorante Nº 109, que se
muestra directamente a continuación)
[0225]
[0226] Una mezcla de naranja de 10-(5-carboxipentil)acridina (0,15 g, 0,362 mmol) y cianuro de sodio (35 mg, 0,722 mmol) en DMF (3 ml) se agitó a temperatura ambiente al aire libre durante 2 días. Se añadió CH3CN (10 ml) y la suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El precipitado de color azul oscuro se
10 recogió mediante centrifugación y se secó a peso constante a vacío para dar el Colorante Nº 109 (130 mg).
Ejemplo 29: Preparación de AOAO-12R (Colorante Nº 22 de la Tabla 2)
[0227] Se añadieron Et3N (32 μl, 0,23 mmol) y TSTU (68 mg, 0,227 mmol) a una disolución de Colorante Nº 109
15 (98,3 mg, 0,223 mmol) en DMF (2 ml) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se siguió por la adición de Et3N (100 μl) y diclorhidrato de 2,2’-oxibis-(etilamina) (16 mg, 0,09). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 días. Se concentró la disolución a aproximadamente 1 ml y se añadió EtOAc (2 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación. Se volvió a disolver el producto en DMF y se precipitó de nuevo con EtOAc para dar el Colorante Nº 22 como un sólido de color azul oscuro (54,4 mg)
20 Ejemplo 30: Preparación de 9-aminocarbonil-10-(5-carboxipentil) acridina (Colorante Nº 110, que se muestra directamente a continuación)
[0228]
[0229] Una disolución del Colorante Nº 109 (30 mg, 0,068 mmol) en H2SO4 al 75% (1 ml) se calentó a 60ºC durante 2 días. Tras enfriar a temperatura ambiente, se añadió la mezcla a Et2O (10 ml). Se recogió el precipitado
30 mediante centrifugación y se volvió a disolver en CH3OH (1,5 ml). Se añadió EtOAc (10 ml) y se recogió el precipitado sólido mediante centrifugación y se secó hasta un peso constante a vacío para dar el Colorante Nº 110 como un sólido de color rojo oscuro (20,4 mg).
Ejemplo 31: Preparación de naranja de N-Carboxipentil tiazol (que se muestra directamente a continuación) 35
[0230]
40 [0231] Se preparó el colorante usando el procedimiento publicado (Carreon, y col., Org. Let. 6(4), 517 (2004)). Ejemplo 32: Preparación de TOTO-3 (Colorante Nº 14 de la Tabla 2) [0232] Se preparó el colorante (354 mg) usando el procedimiento para sintetizar AOAO-2 a partir de naranja de N
45 carboxipentil tiazol (460 mg, 1,04 mmol) y etilendiamina (25 mg, 0,42 mmol).
Ejemplo 33: Preparación de sal de cloruro de naranja de 10-(5-((2-(N-t-Boc-amino)etil)aminocarbonil)pentil) acridina (Colorante Nº 111, que se muestra directamente a continuación)
[0233]
[0234] Se añadieron Et3N (106 μl, 0,76 mmol) y TSTU (230 mg, 0,76 mmol) a una suspensión de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (302 mg, 0,73 mmol) en DMF (3 ml). Se agitó la mezcla a temperatura
10 ambiente durante 15 minutos. Se siguió por la adición de Et3N (350 μl) y mono t-BOC-etilendiamina (150 mg, 0,92 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora y a continuación se concentró hasta sequedad a vacío. Se disolvió el residuo en CH3CN (2 ml) y se precipitó mediante la adición de EtOAc (20 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se secó a un peso constante para dar el Colorante Nº 111 como un sólido de color naranja (365 mg)
15 Ejemplo 34: Preparación de trifluoroacetato de naranja de 10-(5-((-2-amoniometil)aminocarbonil)pentil) acridina (Colorante Nº 112, que se muestra directamente a continuación)
[0235]
[0236] Se añadió el colorante Nº 111 (347 mg, 622 mmol) en una porción a ácido trifluoroacético (3 ml) a 5ºC. se agitó la mezcla a 5ºC durante 1 hora y se concentró hasta sequedad a vacío. Se disolvió el residuo en CH3OH (3 ml) 25 y se añadió gota a gota a Et2O (50 ml). El precipitado se recogió mediante centrifugación para dar el Colorante Nº 112 como un sólido de color naranja (297 mg)
Ejemplo 35: Preparación de AOTO-3 (Colorante Nº 23 de la Tabla 2)
30 [0237] Se añadieron Et3N (20 μl, 0,142 mmol) y TSTU (42,2 mg, 0,142 mmol) a una disolución de naranja de Ncarboxipentiltiazol (62 mg, 0,142 mmol) en DMF (1 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se siguió por la adición de Et3N (70 μl) y Colorante Nº 112 (50 mg, 0,095 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas y a continuación se concentró hasta sequedad a vacío. Se volvió a disolver el residuo en DMF (1 ml) y se añadió EtOAc (2 ml). Se recogió el precipitado mediante centrifugación. La precipitación
35 repetida a partir de DMF y EtOAc proporcionó el producto cono un sólido de color rojo anaranjado (50,4 mg).
Ejemplo 36: Preparación de TOTO-12 (Colorante Nº 24 de la Tabla 2)
[0238] Se preparó el colorante (19,4 mg) usando el procedimiento para sintetizar AOAO-2 a partir de naranja de N40 carboxipentiltiazol (94,5 mg, 0,2145 mmol) y diclorhidrato de 2,2’oxibis(etilamina) (15 mg, 0,085 mmol).
Ejemplo 37: Preparación de TO(3)TO(3)-12 (Colorante Nº 25 de la Tabla 2)
[0239] Se preparó el colorante (32,6 mg) usando el procedimiento para sintetizar AOAO-2 a partir de azul de N45 carboxipentiltiazol (Carreon, y col., Org. Let. 6(4), 517 (2004); y Benson, y col., Nucleic Acid Res. 21(24), 5727 (1993)) (99mg, 0,212mmol) y diclorhidrato de 2,2’oxibis(etilamina) (15 mg, 0,085 mmol)
Ejemplo 38: Preparación de TO(3)TO(3)-2 (Colorante Nº 26 de la Tabla 2)
50 [0240] Se preparó el colorante (28,4 mg) usando el procedimiento para sintetizar AOAO-2 a partir de azul de Ncarboxipentiltiazol (76 mg, 0,173 mmol) y 3,3’-diamino-N-metildipropilamina (10 mg, 0,069 mmol).
Ejemplo 39: Preparación de cloruro de naranja de 10-(5-((5-(N-t-Boc-amino)pentil)aminocarbonil)pentil)-acridina (Colorante Nº 113, que se muestra directamente a continuación)
[0241]
[0242] Se preparó el colorante usando el procedimiento para sintetizar el Colorante Nº 111 a partir de cloruro de naranja de 10-(5-carboxipentil) acridina (200 mg, 0,483 mmol) y mono t-BOC-cadaverina (130 mg, 0,628 mmol).
10 Ejemplo 40: Preparación de trifluoroacetato de naranja de 10-(5-((5-amoniopentil)aminocarbonil)pentil) acridina (Colorante Nº 114, que se muestra directamente a continuación)
[0243]
[0244] Se preparó el Colorante Nº 114 (234 mg) usando el procedimiento para sintetizar el Colorante Nº 112 a partir del Colorante Nº 113 (280 mg, 0,467 mmol).
20 Ejemplo 41: Preparación de AORO-7 (Colorante Nº 27 de la Tabla 2)
[0245] Se preparó el compuesto (29 mg) usando el procedimiento para sintetizar AOTO-3 a partir del compuesto Nº 114 (35 mg, 0,061 mmol) y el colorante de rosamina (Biotium, Inc. (Hayward, CA)) (40 mg, 0,063 mmol).
25 Ejemplo 42: Absorbancia y fluorescencia de DMAO y AOAO-7
[0246] Se midieron por separado los espectros de la absorbancia, tal como se muestran en la Figura 2 y la Figura 3, y los espectros de emisión de la fluorescencia, tal como se muestran en la Figura 4, de DMAO y AOAO-7, sin 30 presencia de ADN, o con presencia de ADN (2 mg/ml de ADN de esperma de salmón), en tampón PBS. Todas las concentraciones de colorante se ajustaron para proporcionar una densidad óptica de 0,05 a 495 nm. Se normalizaron los espectros a 1 en la gráfica de la absorbancia. Con respecto a DMAO, AOAO-7 presenta un pico de longitud de onda más corta a 471 nm en la absorbancia, indicando agregación de los dos monómeros de acridina dentro de AOAO-7. Tras la unión al ADN, las absorbancias de AOAO-7 y DMAO mostraron desplazamientos de 5
35 nm y 10 nm, respectivamente, con respecto a los colorantes libres. La fluorescencia de AOAO-7 libre es aproximadamente 5 veces menor que la de DMAO. El menor fondo de fluorescencia de AOAO-7 es ventajoso en la qPCR en tiempo real. La fluorescencia por monómero de acridina de AOAO-7 es cercana a la de DMAO, indicando que los dos monómeros de AOAO-7 ya no quedan apagados entre sí cuando se unen al ADN y el enlazante entre los dos no presenta efecto negativo sobre el campo cuántico.
40 Ejemplo 43: Espectros de absorción de TOTO-1 y TOTO-3
[0247] De una manera similar a la descrita junto con el Ejemplo 42, se midieron los espectros de la absorbancia de TOTO-1 y TOTO-3 sin presencia de ADN, tal como se muestra en la Figura 5, o en presencia de 2 mg/ml de ADN de 45 esperma de salmón, tal como se muestra en la Figura 6, en tampón PBS. Tal como se muestra en la Figura 5, los espectros de los colorantes libres indican que TOTO-3 que tiene el puente que es neutro o sustancialmente dedicado a cargas positivas, forma un dímero-H intramolecular, o una estructura en horquilla, mientras que TOTO-1, que tiene múltiples cargas positivas, tiene menos desplazamiento espectral. Tal como se muestra en la Figura 6, los espectros de absorción de TOTO-1 y TOTO-3 en presencia de ADN se desplazan a aproximadamente la misma
50 posición, indicando que la estructura en horquilla del dímero de TOTO-3 se abre tras unirse al ADN, y que TOTO-1 y TOTO-3 forman tipos similares de complejos de ADN-colorante.
Ejemplo 44: Fluorescencia de AOAO-12 en respuesta a una cantidad diferente de ADN
[0248] Se midió la fluorescencia de AOAO-12 0,1 μM en 200 ml de PBS en presencia de 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 y 10 μg/ml de concentraciones finales de ADN de esperma de salmón o una mezcla de un oligonucleótido 20 mer monocatenario en un lector de placas de microvaloración (SpectraMax de Molecular Devices Corporation (Sunnyvale, CA)). Se representó gráficamente la fluorescencia frente a la concentración de ADN, tal como se muestra en la Figura 7. Se puede observar que la fluorescencia respondió linealmente hasta 2,0 μg/ml (inserción). A mayores concentraciones de ADN, la respuesta se volvió no lineal. AOAO-12 fluoresce ,más intensamente cuando se une a ADN bicatenario que cuando se une a ADN monocatenario
Ejemplo 45: Comparación de fuerzas de señal de AOAO-12 y SUBR Green I en la qPCR
[0249] Este ejemplo demuestra la propiedad superior de AOAO-12 respecto de SUBR Green I en la fuerza de la señal de fluorescencia en la qPCR. Todas las amplificaciones en tiempo real se llevaron a cabo en 20 μl de disolución de reacción que comprendía Tris 10 mM (pH 8,0), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, 2 mM cada uno de dNTP, y 1 unidad de ADN polimerasa AmpliTaq (ABI, Foster City, CA) y diversas concentraciones de un colorante de control fluorescente. Se amplificó un fragmento ATPB (SEQ ID NO: 1) en el plásmido pTOPO con 0,5 μM del cebador directo 5’-GAGGTCTTCACAGGTCATA-3’ (SEQ ID NO: 2), 0,5 μM del cebador inverso 5’-CTCTTCAGCCAGCTTATC-3’ (SEQ ID NO: 3). Se configuró el régimen térmico a 95ºC durante 1 minuto seguido por 50 ciclos de 15 segundos de duración a 95ºC, de 15 segundos de duración a 55ºC, y de 15 segundos de duración a 72ºC. se midió la fluorescencia en la etapa de 55ºC. Consistente con un informe más inicial (Nath, K., et al., Effects of ethidium bromide and SYBR Green I on different polymerase chain reaction systems, J. Biochem Biophys Methods 42, 15 (2000)), SYBR Green I presentó inhibición de las reacciones de la PCR, tal como se muestra en la Figura 8, en la que Ct se retardó a mayores concentraciones de SYBR Green I. Con respecto a las concentraciones de SYBR Green I, se podrían añadir mayores concentraciones de AOAO-12 a las reacciones sin presentar inhibición. Como resultado, la fuerza final de fluorescencia con AOAO-12 podría ser varias veces mayor, permitiendo una detección más sensible. Alternativamente, con AOAO-12, se podría usar un dispositivo óptico menos sensible en los fluorómetros de ciclación térmica, lo que conduciría a instrumentos menos caros.
Ejemplo 46: Valoración de ADN genómico
[0250] Se llevaron a cabo amplificaciones de un fragmento UBC (SEQ ID NO:8) procedente de ADN genómico humano en condiciones similares a las que se muestran en el Ejemplo 45, con cualquiera de SYBR Green I (el pico final de absorción a 495 nm corresponde a una densidad óptica de 0,025, o A495 = 0,025) o AOAO-12 (A495 final = 0,1) excepto que (1) se usaron diferentes configuraciones de cebadores directo e inverso (5’-ACTGGTAAGACCATCACC-3’ (SEQ ID NO: 9) and 5’-GCAATGAAATTTGTTGAA-3’ (SEQ ID NO: 10)), y (2) una serie de diluciones de 10 veces de ADN humano sirvió como moldes. La Figura 8 muestra las graficas de amplificación de las reacciones de partida con 105 copias de ADN humano hasta 10 copias tanto con SYBR Green I
o con AOAO-12. La inserción muestra que el valor de Ct está reversiblemente correlacionado con el logaritmo del número de copias de partida controlado con ambos colorantes. AOAO-12 es evidentemente superior a SYBR Green I en fuerza de la señal.
Ejemplo 47: TO, TOTO-1 y TOTO-12 en la qPCR
[0251] Este ejemplo demuestra la propiedad mejorada de TOTO-12 sobre TO (naranja de tiazol, un colorante de cianina asimétrica), o TOTO-1 en la qPCR. Todas las amplificaciones en tiempo real se llevaron a cabo como en el Ejemplo 5, excepto que se usaron TO, TOTO-1 y TOTO-12. Tal como se muestra en la Figura 11, TOTO-1 inhibió completamente la reacción de la PCR, mientras que TOTO-12 proporcionó Ct mejorada y aumentó la intensidad de la fluorescencia con respecto a TO en la qPCR. El colorante TOTO-12 dimérico es superior a cada uno de los colorantes TO y TOTO-1.
Ejemplo 48: Absorbancia y fluorescencia de AORO-7
[0252] De una manera similar a la descrita junto con el Ejemplo 42, se tomaron los espectros de la absorbancia de AORO-7 solo o en presencia de 2 μg/ml de ADN de esperma de salmón en tampón PBS, tal como se muestra en la Figura 12. En la Figura 13, se muestran los espectros de emisión de AORO-7 unido al ADN. El colorante heterodimérico AORO-7 comprende un colorante AO monomérico y un colorante RO de rosamina de ácido nucleico fluorescente. Se registraron dos picos de emisión, contribuidos por los restos AO y RO respectivamente. Fue posible para registrar la qPCR con AORO-7 en el Canal 1 con la configuración de excitación a 490 nm y la emisión recogida a 530 nm, o Ex490/Em530, o en el Canal 3 con Ex580/Em630, en un Chromo4 de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA), pero solo débilmente en el Canal 2 (Ex520/Em570) (no se muestran los datos). Como el efecto de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es despreciable, cualquier constituyente de colorante monomérico, AO o RO, se puede escoger como colorante indicador.
Ejemplo 49: Colorante heterodímero AORO-7 en la qPCR
[0253] El ejemplo demuestra la utilidad de AORO-7 en la qPCR. Se llevaron a cabo amplificaciones en tiempo real como en el Ejemplo 5, excepto que se usó AORO-7 con una densidad óptica de 0,025 a 600 nm en la disolución final. Tal como se muestra en la Figura 14, AORO-7 se puede usar eficazmente para controlar el curso de la reacción de la qPCR y para detectar la curva de fusión del amplicón (inserción). El hallazgo de que esta qPCR se controlaba en el Canal 3 (Ex580/Em630) en un Sistema de Detección de la PCR en Tiempo Real iCycle IQ Multiple-Color de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) proporciona un ejemplo de que casi cualquier colorante de longitud de onda deseable se puede hacer a medida en un colorante indicador de ADN en la qPCR mediante los procedimientos dados a conocer en la presente memoria descriptiva, ampliando de esta manera el uso espectral para el control de la qPCR. Actualmente, la mayor parte de las sondas TaqMan usan FAM o VIC, que ocupan los mismo canales de SYBR Green I. sería ventajoso usar una sonda específica de la secuencia, tal como una sonda TaqMan, y un colorante no específico de la secuencia de diferente longitud de onda, tal como AORO-7, en la qPCR, en el que la sonda proporciona la especificidad de la secuencia y el colorante proporciona otros parámetros del amplicón, tales como las temperaturas de fusión
Ejemplo 50: Picos de fusión controlados con AOAO-12
[0254] Se informó que SYBR Green I era ventajoso porque se podría detectar la temperatura de fusión de un amplicón después de la amplificación de la qPCR. La temperatura de fusión proporciona información valiosa acerca del amplicón, ya que esta es una función del tamaño y del contenido de GC del amplicón. No se registraron temperaturas de fusión de las reacciones TaqMan. Se midieron las curvas de fusión de los cuatro amplicones, es decir, HMBS (SEQ ID NO: 4), RPL4 (SEQ ID NO: 5), SDHA (SEQ ID NO: 6), y TBP (SEQ ID NO: 7) procedentes de las reacciones amplificadas en presencia de AOAO-12 (Panel A) o SYBR Green (Panel B) y se presentaron en la Figura 15. Los picos de fusión recogidos con AOAO-12 se correlacionaron bien con los recogidos con SYBR Green
I. Ya que AOAO-12 se une al ADN con elevada afinidad pero menos estrechamente que SYBR Green I, las temperaturas de fusión de AOAO-12 son aproximadamente 2 grados inferiores que las de SYBR Green I. Ya que podrían usarse concentraciones mayores de AOAO-12 en reacciones de la PCR en tiempo real, los picos de fusión son marcadamente mayores. Los datos demuestran la utilidad relativa de AOAO-12.
[0255] Se ha informado que las reacciones de la qPCR con SYBR Green I tienden a formar dímeros de cebadores, y la tendencia está estrechamente relacionada con la concentración de SYBR Green I. Se ha postulado que SUBR Green I se une al ADN estrechamente de tal manera que interfiere con el rendimiento de la ADN polimerasa Taq. Ya que AOAO-12 tiene menos afinidad con el ADN, debería mejorarse la interferencia. Esta propiedad de AOAO-12 es evidente a partir de la Figura 15, en que la reacción de amplificación de HMBS en presencia de SYBR Green I tiene un pico extra del dímero de cebador, mientras que la misma amplificación en presencia de AOAO-12 presenta solo un único pico, limpio y específico.
Ejemplo 51: Estabilidad de los colorantes AOAO
[0256] Se demostró la estabilidad de los colorantes diméricos que comprendían AO monomérico. Específicamente, AOAO-12 se mantuvo en los tampones de reacción de la PCR con productos de la PCR. Se calentó la mezcla a 86ºC durante 40 minutos. Durante el curso del calentamiento, La mezcla se llevó a 60ºC de manera breve para controlar la fluorescencia. Tal como se muestra en la Figura 16, AOAO-12 es estable a 96ºC durante 40 minutos sustancialmente sin pérdida de fluorescencia. Los datos demuestras la robustez de AOAO-12 en la PCR.
Ejemplo 52: Preparación de TOTO-13 (Colorante Nº 29 de la Tabla 2)
[0257] Se preparó el colorante (102 mg) usando el procedimiento para sintetizar AOAO-2 (Colorante Nº 7 de la Tabla 2) a partir de naranja de N-carboxipentiltiazol (102 mg, 0,23 mmol) (Ejemplo 31) y 4,7,10-trioxa-1,13tridecanodiamina (23 mg, 0,1 moles)
Ejemplo 53: Preparación de bromuros de N-(5-carboxipentil)-4-(4-(dimetilamino)estiril) piridinio
[0258] Una mezcla de 4-N,N-dimetilaminobenzaldehído (3 g, 20 mmoles), bromuro de N-(5-carboxi-pentil)picolinio (5,6 g, 20 mmoles) y piperidina (2 ml) en etanol (100 ml) se calentó a 60ºC durante la noche. La mezcla se evaporó hasta sequedad a vacío. El residuo se volvió a disolver en metanol y a continuación se precipitó con éter para dar el producto (6,7 g).
[0259] Ejemplo 54: Preparación de sTST-19 (Colorante Nº 31 de la Tabla 2)
[0260] Se preparó el colorante (85 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 (Ejemplo 7) a partir de bromuro de N-(5-carboxipentil)-4-(4-(dimetilamino)estiril)piridinio (Ejemplo 53) (200 mg, 0,5 mmoles) y diclorhidrato de 2,2’-oxibis(etilamina) (36 mg, 0,2 mmoles).
Ejemplo 55: Preparación de STST-27 (Colorante Nº 30 de la Tabla 2)
[0261] Se preparó el colorante (81,8 mg) usando el procedimiento para preparar AOAO-2 (ejemplo 7) a partir de bromuro de N-(5-carboxipentil)-4-(4-(dimetilamino)estiril)piridinio (Ejemplo 53) (200 mg, 0,5 mmoles) y 4,7,10-trioxa1,13-tridecanodiamina (44 mg, 0,2 mmoles)
[0262] Se ha descrito en la presente memoria descriptiva un colorante útil, tal como un colorante dimérico o un colorante trimérico. Dicho colorante puede tener cualquiera de un número de propiedades deseables, tal como un fondo de fluorescencia relativamente bajo, una inhibición de la PCR relativamente baja, una buena fuerza de la señal fluorescente, y una buena estabilidad, por ejemplo. Generalmente, un colorante que tiene como máximo una carga positiva puede tener cualquiera de numerosas aplicaciones, tales como uso, por ejemplo, en el marcado de otra molécula, y tales como uso en la detección de la presencia o la ausencia de ácido nucleico. Además, generalmente, dicho colorante que es sustancialmente neutro, tiene cualquiera de numerosas aplicaciones, tales como uso en procesos de la PCR o uso en la detección de la presencia o la ausencia de ácido nucleico, o uso, por ejemplo, en la PCR cuantitativa en tiempo real.
[0263] Se han descrito numerosos colorantes diméricos y triméricos útiles. Por medio de ejemplo, se ha descrito un colorante que es adecuado para la conjugación covalente con, o el marcado de, otra molécula para conferir la capacidad de detectar el ácido nucleico del colorante en la molécula; un colorante que es adecuado para detectar la presencia o la ausencia de ácido nucleico en una muestra que puede comprender o no ácido nucleico; y un colorante que es adecuado para detectar la formación de ácido nucleico o la carencia del mismo en una muestra, tal como una muestra que experimenta un proceso adecuado para la amplificación del ácido nucleico debe comprender la muestra un ácido nucleico diana. Cualquier procedimiento para usar una composición descrita en la presente memoria descriptiva se contempla en la presente memoria descriptiva. Se contempla en la presente memoria descriptiva un kit adecuado para determinar la formación de ácido nucleico o la ausencia del mismo en una muestra, que comprende un colorante adecuado de la presente invención, y una composición adecuada suficiente para la amplificación de un ácido nucleico diana en una muestra debe comprender un ácido nucleico diana, tal como en cualquier kit que comprende una composición descrita en la presente memoria descriptiva que tiene una aplicación útil.
[0264] Diversas modificaciones, procesos, así como numerosas estructuras relacionadas con la descripción de la presente memoria descriptiva pueden ser aplicables, como será rápidamente fácilmente evidente para las personas normalmente expertas en la técnica, tras la revisión de la memoria descriptiva. Diversos aspectos y características que pueden haberse explicado o descrito en relación con los conocimientos, creencias, teorías, suposiciones subyacentes y/o ejemplos de trabajo o previstos, aunque se entenderá que cualquier conocimiento, valor, teoría, suposición subyacente, y/o ejemplo de trabajo o previstos no se consideran vinculantes. Aunque se han descrito diversos aspectos y características con respecto a diversas realizaciones y ejemplos en la presente memoria descriptiva, se entenderá que cualquiera de los mismos no es limitante.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0265]
<110> Biotum Inc. 5 Allelogic Biosciences Corporation
<120> Colorantes de ácidos nucleicos diméricos y triméricos y sistemas y procedimientos asociados
<130> WJW/FP6493266
<140> EP 06738900.7
<141>
<150> PCT/US2006/009910
<151>
<150> US 60/663.613
<151>
<150> US 11/377.253 15 <151> 2006-03-16
<160> 10
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 164
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3 35 <211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 249
<212> ADN 45 <213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 231
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 139
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 229
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 140
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10

Claims (41)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para determinar la formación de ácido nucleico o la ausencia del mismo en una muestra que puede comprender o no un ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una disolución de ensayo que comprende la muestra y un colorante fluorescente de ácido nucleico, teniendo el colorante fluorescente de ácido nucleico la fórmula:
    en el que el PUENTE es un enlazante sustancialmente alifático que es neutro o tiene hasta una carga positiva, y comprende entre aproximadamente 8 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno; Q1 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico; Q2 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente
    15 colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de acido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico, al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y el constituyente colorante Q2 es un constituyente colorante indicador, al menos un constituyente del constituyente colorante Q1 y el constituyente colorante Q2 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico o un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico; y el constituyente colorante indicador y el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico son opcionalmente el mismo. b) llevar a cabo un proceso usando la disolución de ensayo que sería suficiente para la amplificación del ácido nucleico diana en el que la muestra debe comprender el ácido nucleico diana; e c) iluminar la disolución de ensayo con luz a una longitud de onda suficiente para la absorción por el constituyente
    25 colorante indicador y determinar la emisión fluorescente o una ausencia de la misma;
    en el que el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico se selecciona entre un colorante de acridina, un colorante de cianina asimétrica, un colorante de cianina simétrica, un colorante de fenantridinio, y un colorante de pironina, y un colorante de estirilo;
    y en el que
    dicho colorante de acridina tiene la estructura:
    en el que cada R1, de manera independiente, es H o alquilo C1-C2, inclusive; uno de R2 y R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R2 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R3 es H o –CH3; cuando R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R2 se selecciona entre H, -CH3, -NH2, -NHCH3, -CN, y -C(=O)NH2; cada uno de R6, de manera independiente, es H o un alquilo C1-C2, inclusive; cada uno de R7, de manera independiente, es H o un alquilo C1-C2, inclusive; para cada pareja de R6 o R7 y R1 adyacentes, de manera independiente, R6 o R7 y R1 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, y \ es un anión;
    dicho colorante de cianina asimétrica tiene la estructura:
    en la que cada uno de R1 y R1’ de manera independiente es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos; un halógeno; -OR9;-SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; o -C(=O)NHR15; o un sustituyente asociado con unión a la ranura menor; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura: cuando R1’ comprende al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, cualquiera de dicho uno de R9, R10, R11,
    5 R12, R13, R14 y R15, de manera independiente, es H o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s), inclusive, o un arilo; cuando R1’ comprende R11 y R12, R11 y R12 pueden, en combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; X se selecciona entre O y S;
    10 n se selecciona entre 0, 1 y 2; R2 puede ser metilo o etilo, o puede representar donde el PUENTE se une a la estructura; R3, R4, y R5 son, de manera independiente, H o –CH3, u, opcionalmente, cualquier pareja adyacente de estos sustituyentes puede formar un anillo de 5 o 6 miembros; R6 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al
    15 menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomos(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R7 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o un arilo sustituido o no sustituido que comprende
    20 opcionalmente de 1 a 3 heteroátomos(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y
    25 S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8’ es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 100 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; - OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomos(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S;
    30 R8 y R8’ pueden, en combinación formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 vez(ces), inclusive, de manera independiente, por alquilo C1-C2, inclusive, alcoxilo C1-C2, inclusive, alquilmercapto C1-C2, inclusive, o un halógeno; para cualquiera de R6, R8, o R8’ que comprende al menos uno de R16 y R17, cualquiera de dicho uno de los mismos R16 y R17, de manera independiente, es H; alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora
    35 opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) o un arilo; para cualquier R6, R8, y R8’ que comprende R16 y R17, los mismos R16 y R17 pueden, en combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O;
    40 solo uno de R1, R1’, R6, R7 y R8 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; y
    \ es un anión; y
    dicho colorante de fenantridinio tiene la estructura: 45
    en la que R1 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; y \ es un anión.
  2. 2. Un procedimiento para determinar la formación de ácido nucleico o la ausencia del mismo en una muestra que puede comprender o no un ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una disolución de ensayo que comprende la muestra y un colorante fluorescente de ácido nucleico, teniendo el colorante fluorescente de ácido nucleico la fórmula:
    en la que PUENTE es un enlazante sustancialmente alifático que es neutro o tiene hasta una carga positiva, y comprende entre aproximadamente 15 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno, Q1 es un constituyente 5 colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico; Q2 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido 10 nucleico; Q3 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico; al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1, el constituyente colorante Q2, y el constituyente colorante Q3 es un constituyente colorante indicador; al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1, el constituyente colorante
    15 Q2, y el constituyente colorante Q3 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico o un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, y el constituyente colorante indicador y el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico son opcionalmente el mismo. b) llevar a cabo un proceso usando la disolución de ensayo que sería suficiente para que la amplificación del ácido nucleico diana deba comprender la muestra del ácido nucleico diana; e
    20 c) iluminar la disolución de ensayo con luz a una longitud de onda suficiente para la absorción por el constituyente colorante indicador y determinar la emisión fluorescente o una ausencia de la misma;
    en la que el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico se selecciona entre un colorante de acridina, un colorante de cianina asimétrica, un colorante de cianina simétrica, un colorante de fenantridinio, y un colorante de 25 pironina y un colorante de estirilo:
    dicho colorante de acridina tiene la estructura:
    en la que cada R1, de manera independiente, es H, o alquilo C1-C2, inclusive;
    uno de R2 y R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura;
    cuando R2 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R3 es H o –CH3;
    cuando R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R2 se selecciona entre H, -CH3, 35 NH2, -NHCH3, -CN, y -C(=O)NH2;
    cada R6, de manera independiente, es H o alquilo C1-C2, inclusive;
    cada R7, de manera independiente, es H o alquilo C1-C2, inclusive;
    para cada pareja de R6 o R7 y R1 adyacentes, de manera independiente, R6 o R7 y R1 pueden, en
    combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros; y 40 \ es un anión.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho colorante de cianina asimétrica tiene la estructura:
    en la que R1’ es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbono, inclusive; un halógeno; -OR9; -SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; NHS(=O)2R14; -C(=O)NHR15; o un sustituyente asociado con la unión a la ranura
    menor; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R1’ comprende al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, cualquiera de dicho uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, de manera independiente, es H o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s), inclusive, o un arilo;
    5 cuando R1’ comprende R11 y R12, R11 y R12 pueden, en combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; X se selecciona entre O y S; n se selecciona entre 0, 1, y 2; R6 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al
    10 menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R7 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o un arilo sustituido o no sustituido que comprende
    15 opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8 es H, alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y
    20 S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8’ es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S;
    25 R8 y R8’ pueden en combinación formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 vez(ces), inclusive, de manera independiente, por alquilo C1-C2, inclusive, alcoxilo C1-C2, inclusive, alquilmercapto C1-C2, inclusive, o un halógeno, para cualquiera de R6, R8 o R8’ que comprende al menos uno de R16 y R17, cualquiera de dicho uno de R16 y R1 de los mismos, de manera independiente, es H; alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) o un arilo;
    30 Para cualquier R6, R8 y R8’ que comprende R16 y R17, R16 y R17 de los mismo pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; uno solo de R1’, R6, R7 y R8 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; y \ es un anión.
    35 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho colorante de fenantridinio tiene la estructura:
    en la que R1 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e 40 \ es un anión
  4. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha realización comprende llevar a cabo un proceso de la PCR en tiempo real.
    45 6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    50 en la que R1 es H; R2 es H; R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cada R6 es –CH3; y cada R7 es –CH3.
  5. 7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    5 en la que R7 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; y \ es un anión.
  6. 8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el PUENTE tiene la fórmula:
    10 -L1-[A1-(CH2)a-]a[A2-(CH2)k-]b[A3-(CH2)y-]c[A4-(CH2)8-]d[A5-(CH2)k-]e
    [A6-(CH2)k-]f[A7-(CH2)k-]g[A8-(CH2)e-]h[A9-(CH2),-]i-A10-L2-
    15 en la que cada uno de L1 y L2, de manera independiente, es un resto que comprende un enlace simple, una unidad de polimetileno que tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; Cada uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10, de manera independiente, es un grupo potenciador de la unión
    20 del ácido nucleico (NABEG), un alquilo ramificado que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o al menos un anillo saturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; cada uno de a, k, y, 8, k, k, k, e, y ,, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y
    25 cada uno de a, b, c, d, e, f, g, h, e i, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive.
  7. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el PUENTE comprende entre aproximadamente 8 y
    aproximadamente 100 átomos no de hidrógeno, inclusive. 30
  8. 10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que cada uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10, de manera independiente, es un NABEG que comprende un resto que comprende al menos un enlace que comprende al menos un enlace amina, un enlace uretano, un enlace tiourea, un enlace éter, o un enlace tioéter; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre halógenos, N, O, y S:
  9. 11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el PUENTE tiene la fórmula:
    -
    (CH2)x-C(=O)NH-(CH2)a-[O-(CH2)k]b-[O-(CH2)y]c-NH(O=C)-(CH2)x-
    40 en la que cada x, de manera independiente, es un entero seleccionado entre 1 y 11, inclusive; a es un entero seleccionado entre 2 y aproximadamente 20, inclusive; cada uno de k y y, de manera independiente, es 2 o 3; b es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y c es cero o 1.
  10. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que x es 5, a y y son iguales y son 2 o 3; k es 2; bis 0, 45 1, 2, o 3; y c es 1.
  11. 13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que Q1 y Q2 son iguales.
  12. 14.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que cada constituyente colorante del constituyente 50 colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    en la que cada R1 es H R2 es H; R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cada R6 es –CH3; cada R7 es –CH3; y \ es un anión.
  13. 15. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que cada constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    en la que R1’ es H, alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos; un halógeno; -OR9; -SR10; -NR11R12; -CN; NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; -C(=O)NHR)15; o un sustituyente asociado con la unión a la ranura menor; o
    15 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R1’ comprende al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, cualquier uno de dicho R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, de manera independiente, es H o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s), inclusive, o un arilo; cuando R1’ comprende R11 y R12, R11 y R12 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; X se selecciona entre O y S; n se selecciona entre 0, 1, y 2; R6 es H, alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; - OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no
    25 sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R7 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o un arilo sustituido o no sustituido que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; - OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura;
    35 R8’ es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; - OR16; -SR16; NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; R8 y R8’ pueden en combinación formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 vez(ces), inclusive, de manera independiente, por alquilo C1-C2, inclusive, alcoxilo C1-C2, inclusive, alquilmercapto C1-C2, inclusive, o un halógeno; para cualquier R6, R8, o R8’ que comprende al menos uno de R16 y R17, uno cualquiera de dichos R16 y R17 de manera independiente, es H; alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) o un arilo; para cualquier R6, R8 y R8’ que comprende R16 y R17, los mismos R16 y R17 pueden en combinación formar un anillo
    45 saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; solo uno de R1’, R6, R7 y R8 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; y \ es un anión.
  14. 16.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que cada constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    en la que R7 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e \ es un anión
  15. 17.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que cada constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    en la que R1 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e 10 \ es un anión.
  16. 18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5, en el que el colorante fluorescente del ácido nucleico tiene la estructura:
    15 en la que \ es I-o Cl-
  17. 19. Un compuesto colorante que tiene la fórmula
    en la que Q1 es un constituyente colorante seleccionado entre un colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, 25 y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico; Q2 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico; al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y el constituyente colorante Q2 es un constituyente colorante indicador; al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y el
    30 constituyente colorante Q2 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico o un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico; y el constituyente de colorante indicador y el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico son opcionalmente iguales; y
    el PUENTE comprende aproximadamente 8 a aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno y es neutro o tiene 35 hasta una carga positiva, y
    -
    L1-[A1-(CH2)a-]a[A2-(CH2)k-]b[A3-(CH2)y-]c[A4-(CH2)8-]d[A5-(CH2)k-]e
    tiene la fórmula: 40 [A6-(CH2)k-]f[A7-(CH2)k-]g[A8-(CH2)e-]h[A9-(CH2),-]i-A10-L2-
    en la que cada uno de L1 y L2, de manera independiente, es un resto que comprende un enlace simple, una unidad de polimetileno que tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al
    45 menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; cada uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10, de manera independiente, es un grupo potenciador de la unión del ácido nucleico (NABEG), un alquilo ramificado que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo
    seleccionado entre N, O, y S; o al menos un anillo saturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; cada uno de a, k, y, 8, k, k, k, e, y ,, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y
    5 cada uno de a, b, c, d, e, f, g, h, e i, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive. en el que cada uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10, de manera independiente, es un NABEG que comprende un resto que comprende al menos un enlace que comprende al menos un enlace amida, un enlace uretano, un enlace urea, un enlace tiourea; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre halógenos, N, O, y S: en el que Q1 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico seleccionado entre un colorante de acridina, un colorante de cianina asimétrica, un colorante de cianina simétrica, un colorante de fenantridinio, un colorante de pironina, y un colorante de estirilo, y Q2 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico seleccionado entre un colorante de acridina, un colorante de cianina asimétrica, un colorante de cianina simétrica, un
    15 colorante de fenantridinio, y un colorante de pironina, y un colorante de estirilo; y en el que; dicho colorante de acridina tiene la estructura:
    en la que cada R1, de manera independiente, es H, o un alquilo C1-C2, inclusive; uno de R2 y R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R2 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R3 es H o –CH3; cuando R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R2 se selecciona entre H, -CH3, - NH2, -NHCH3, -CN, y -C(=O)NH2; cada R6, de manera independiente, es H o un alquilo C1-C2, inclusive; cada R7, de manera independiente, es H, o un alquilo C1-C2, inclusive; para cada pareja de R6 o R7 y R1, de manera independiente, R6 o R7 y R1 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros; e \ es un anión.
  18. 20. El compuesto del colorante de la reivindicación 19, en el que dicho colorante de cianina asimétrica tiene la estructura:
    en la que R1’ es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos, inclusive; un halógeno; -OR9; -SR10; - NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; NHS(=O)2R14; -C(=O)NHR15; o un sustituyente asociado con la unión a la ranura menor; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R1’ comprende al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, cualquiera de dicho uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, de manera independiente, es H o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s), inclusive, o un arilo; cuando R1’ comprende R11 y R12, R11 y R12 pueden en combinación formar un anillo, saturado o insaturado de 5 o 6
    45 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; X se selecciona entre O y S; n se selecciona entre 0,1, y 2 R6 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R7 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o un arilo sustituido o no sustituido que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; O un arilo sustituido o no
    5 sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8’ es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; - OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y
    10 S; R8 y R8’ pueden en combinación formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 vez(ces), inclusive, de manera independiente, por alquilo C1-C2, inclusive, alcoxilo C1-c2, inclusive, alquilmercapto C1-C2, o un halógeno; para cualquier R6, R8 o R8’ que comprende al menos uno de R16 y R17, cualquiera de dicho uno de los mismos R16 y
    15 R17, de manera independiente, es H; alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) o un arilo; para cualquier R6, R8 o R8’ que comprende R16 y R17, los mismos R16 y R17 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O;
    20 solo uno de R1’, R6, R7 y R8 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e \ es un anión.
  19. 21. El compuesto colorante de la reivindicación 19, en el que dicho colorante de fenantridinio tiene la
    estructura:
    en la que R1 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e \ es un anión
    30 22. El compuesto colorante de la reivindicación 19, en el que el aproximadamente 12 a aproximadamente 60 átomos no de hidrógeno, inclusive.
  20. 23. El compuesto colorante de la reivindicación 19, en el que el
    aproximadamente 15 a aproximadamente 40 átomos no de hidrógeno, inclusive. 35
    PUENTE comprende entre PUENTE comprende entre
  21. 24. El compuesto colorante de la reivindicación 19, en el que dicho colorante de acridina tiene la estructura:
    40 en la que cada R1 es H; R2 es H; R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cada R6 es –CH3; y cada R7 es –CH3
  22. 25. El compuesto colorante de la reivindicación 19, en el que dicho colorante de cianina asimétrica tiene la 45 estructura:
    en la que R7 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e \ es un anión.
  23. 26. El compuesto colorante de la reivindicación 19, en el que el PUENTE tiene la fórmula:
    -
    (CH2)x-C(=O)NH-(CH2)a-[O-(CH2)k]b-[O-(CH2)y]c-NH(O=C)-(CH2)x-
    10 en la que cada x, de manera independiente, es un entero seleccionado entre 1 y 11, inclusive; a es un entero seleccionado entre 2 y aproximadamente 20, inclusive; cada uno de k y y, de manera independiente, es 2 o 3; b es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y c es cero o 1.
  24. 27.
    El compuesto colorante de la reivindicación 26, en el que x es 5; a y y son iguales y son 2 o 3; k es 2; 15 b es 0,1, 2, o 3; y c es 1.
  25. 28. El compuesto colorante de la reivindicación 26, en el que Q1 y Q2 son iguales.
  26. 29.
    El compuesto colorante de la reivindicación 26, en el que cada constituyente colorante del 20 constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    en la que cada R1 es H;
    25 R2 es H; R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cada R6 es –CH3; Cada R7 es –CH3; e \ es un anión.
    30 30. El compuesto colorante de la reivindicación 26, en el que cada constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    35 en la que R1’ es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos, inclusive; un halógeno; -OR9; -SR10; -NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; -C(=O)NHR15; o un sustituyente asociado con la unión a la ranura menor; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R1’ comprende al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, y uno cualquiera de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, de manera independiente, es H o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora
    40 opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s), inclusive, o un arilo; cuando R1’ comprende R11 y R12, R11 y R12 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; X se selecciona entre O y S; n se selecciona entre 0,1, y 2;
    45 R6 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s) inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R7 es H, alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o un arilo sustituido o no sustituido que comprende
    5 opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; - OR16; -SR16; NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y
    10 S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8’ es H, alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo8s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S;
    15 R8 y R8’ pueden en combinación, formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 vez(ces), inclusive, de manera independiente, por alquilo C1-C2, inclusive, alcoxilo C1-C2, inclusive, alquilmercapto C1-C2, inclusive, o un halógeno; para cualquier R6, R8, o R8’ que comprende al menos uno de R16 y R17, cualquiera de dicho uno de los mismos R16 y R17, de manera independiente, es H; alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora
    20 opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) o un arilo; para cualquier R6, R8, y R8’ que comprende R16 y R17, los mismos R16 y R17 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; solo uno de R1’, R6, R7 y R8 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e
    25 \ es un anión.
  27. 31. El compuesto colorante de la reivindicación 26, en el que cada constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    30 en la que R7 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura: e \ es un anión.
  28. 32. El compuesto colorante de la reivindicación 26, en el que cada constituyente colorante del 35 constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2 tiene la estructura:
    en la que R1 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e \ es un anión.
  29. 33.
    Un colorante que tiene la estructura:
    en la que \ es I-o Cl-.
  30. 34.
    Un colorante que tiene la estructura:
    en la que \ I- o Cl-.
  31. 35. Un colorante que tiene la estructura:
    en la que \ I- o Cl-. 15 36. Un colorante que tiene la estructura:
    en la que \ I- o Cl-.
  32. 37. Un compuesto colorante que tiene la fórmula:
    25 en el que el puente es un enlazante sustancialmente alifático que comprende entre aproximadamente 15 y aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno y es neutro o tiene hasta una carga positiva; Q1 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico; Q2 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante
    30 fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescentes sin ácido nucleico; Q3 es un constituyente colorante seleccionado entre un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico, un constituyente colorante fluorescente sin ácido nucleico, y un constituyente colorante no fluorescente sin ácido nucleico; al menos un constituyente colorante del
    35 constituyente colorante Q1, el constituyente colorante Q2, y el constituyente colorante Q3 es un constituyente colorante indicador; al menos un constituyente colorante del constituyente colorante Q1, el constituyente colorante Q2, y el constituyente colorante Q3 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico o un constituyente colorante no fluorescente de ácido nucleico; y el constituyente colorante indicador y el constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico son opcionalmente iguales;
    40 en la que el constituyente de colorante fluorescente de ácido nucleico se selecciona entre un colorante de acridina, un colorante de cianina asimétrica, un colorante de cianina simétrica, un colorante de fenantridinio, y un colorante de
    pironina, y un colorante de estirilo; y en el que dicho colorante de acridina tiene la estructura:
    5 en la que cada R1, de manera independiente, es H o un alquilo C1-C2, inclusive. uno de R2 y R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R2 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R3 es H o –CH3; cuando R3 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura, R2 se selecciona entre H, -CH3, -NH2, NHCH3, -CN, y -C(=O)NH2; cada R6, de manera independiente, es H o un alquilo C1-C2, inclusive; cada R7, de manera independiente, es H o un alquilo C1-C2, inclusive; para cada de R6 o R7 y R1 adyacentes, de manera independiente, R6 o R7 y R1 pueden en combinación, formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros; e \ es un anión.
    15 38. El compuesto colorante de la reivindicación 37, en el que dicho colorante de cianina asimétrica tiene la estructura:
    en la que R1’ es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 6 carbonos, inclusive; un halógeno; -OR9; -SR10; - NR11R12; -CN; -NH(C=O)R13; -NHS(=O)2R14; -C(=O)NHR15; o un sustituyente asociado con la unión a la ranura menor; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; cuando R1’ comprende al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13, R14 y R15, y uno cualquiera de R9, R10, R11, R12, R13,
    25 R14 y R15, de manera independiente, es H o alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s), inclusive, o un arilo; cuando R1’ comprende R11 y R12, R11 y R12 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N y O; X se selecciona entre O y S; n se selecciona entre 0, 1, y 2; R6 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s) inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura;
    35 R7 es H, alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente un arilo y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o un arilo sustituido o no sustituido que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8 es H; alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; - OR16; -SR16; NR16R17; o un arilo sustituido o no sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; o representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; R8’ es H, alquilo o alquenilo que tiene de 1 carbono a 10 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; un halógeno; -OR16; -SR16; -NR16R17; o un arilo sustituido o no
    45 sustituido, que comprende opcionalmente de 1 a 3 heteroátomo(s), inclusive, seleccionados entre halógenos, N, O, y S; R8 y R8’ pueden en combinación, formar un anillo aromático fusionado, que se puede sustituir además 1 a 4 vez(ces), inclusive, de manera independiente, por alquilo C1-C2, inclusive, alcoxilo C1-C2, inclusive, alquilmercapto C1-C2, inclusive, o un halógeno; para cualquier R6, R8, o R8’ que comprende al menos uno de R16 y R17, cualquiera de dicho uno de los mismos R16 y R17, de manera independiente, es H; alquilo que tiene de 1 carbono a 12 carbonos, inclusive, que incorpora opcionalmente de 1 a 2 nitrógeno(s) o un arilo; para cualquier R6, R8, y R8’ que comprende R16 y R17, los mismos R16 y R17 pueden en combinación formar un anillo saturado o insaturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado
    entre N y O; solo uno de R1’, R6, R7 y R8 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e \ es un anión.
  33. 39. El compuesto colorante de la reivindicación 37, en el que dicho colorante de fenantridinio tiene la estructura:
    en la que R1 representa el lugar donde el PUENTE se une a la estructura; e \ es un anión. 10
  34. 40. El compuesto colorante de la reivindicación 37, en el que el PUENTE comprende:
    -
    L1-[A1-(CH2)a-]a[A2-(CH2)k-]b[A3-(CH2)y-]c[A4-(CH2)8-]d[A5-(CH2)k-]e
    15 [A6-(CH2)k-]f[A7-(CH2)k-]g[A8-(CH2)e-]h[A9-(CH2),-]i-A10-L2-
    en la que cada uno de L1 y L2, de manera independiente, es un resto que comprende un enlace simple, una unidad de polimetileno que tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un
    20 heteroátomo seleccionado entre N, O y S; L1 está unido covalentemente a un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2; L2 está unido covalentemente al constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del Q2 que es diferente de dicho un constituyente;
    25 cada uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10, de manera independiente, es un grupo potenciador de la unión del ácido nucleico (NABEG), un alquilo ramificado que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o al menos un anillo saturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; cada uno de a, k, y, 8, k, k, k, e, y ,, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20,
    30 inclusive; y cada uno de a, b, c, d, e, f, g, h, e i, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y; uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 tiene la fórmula:
    en la que T es un carbono sustituido, un nitrógeno sustituido, o un arilo que comprende opcionalmente un heteroátomo seleccionado entre O, N y S; L3 está unido covalentemente a Q3 y es un resto que comprende un enlace simple; una unidad de polimetileno que
    40 tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; y B’ tiene la fórmula:
    -
    (CH2)aW-[A11-(CH2)kW-]a’[A12-(CH2)y’-]b’[A13-(CH2)8’-]c’A14-,
    45 en la que –(CH2)a, está unido covalentemente a T y A14 está unido covalentemente a L3; cada uno de A11, A12, A13, y A14 es, de manera independiente un grupo potenciador de la unión a ácido nucleico (NABEG), un alquilo ramificado que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o al menos un anillo saturado de 5 o 6 miembros que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S;
    50 cada uno de aW, kW, y’ y 8’ es, de manera independiente, cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y cada uno de a’, b’, y c’ es, de manera independiente, cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive.
  35. 41. Un compuesto colorante que tiene la fórmula:
    en la que PUENTE es un enlazante sustancialmente alifático que comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 150 átomos no de hidrógeno, y es neutro o tiene hasta una carga positiva; Q1 es un constituyente 5 colorante fluorescente de ácido nucleico; Q2 es un constituyente colorante fluorescente de ácido nucleico; y Rr es un grupo reactivo o un grupo funcional.
  36. 42. El compuesto colorante de la reivindicación 41 en el que el PUENTE comprende:
    -
    L1-[A1-(CH2)a-]a[A2-(CH2)k-]b[A3-(CH2)y-]c[A4-(CH2)8-]d[A5-(CH2)k-]e
    [A6-(CH2)k-]f[A7-(CH2)k-]g[A8-(CH2)e-]h[A9-(CH2),-]i-A10-L2-
    en la que cada uno de L1 y L2, de manera independiente, es un resto que comprende un enlace simple, una unidad
    15 de polimetileno que tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; L1 está unido covalentemente a un constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del constituyente colorante Q2; L2 está unido covalentemente al constituyente colorante del constituyente colorante Q1 y del Q2 que es diferente de dicho un constituyente; cada uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10, de manera independiente, es un grupo potenciador de la unión del ácido nucleico (NABEG), un alquilo ramificado que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; o al menos un anillo saturado de 5 o 6 miembros, que comprende opcionalmente al
    25 menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; cada uno de a, k, y, 8, k, k, k, e, y ,, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y cada uno de a, b, c, d, e, f, g, h, e i, de manera independiente, es cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y; uno de A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, y A10 tiene la fórmula:
    en la que T es un carbono sustituido, un nitrógeno sustituido, o un arilo que comprende opcionalmente un
    35 heteroátomo seleccionado entre O, N y S; L3 está unido covalentemente a Rr y es un resto que comprende un enlace simple; una unidad de polimetileno que tiene de 1 carbono a aproximadamente 12 carbonos, inclusive, que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o un arilo que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; y B’ tiene la fórmula:
    -
    (CH2)aW-[A11-(CH2)kW-]a’[A12-(CH2)y’-]b’[A13-(CH2)8’-]c’A14-,
    en la que –(CH2)a, está unido covalentemente a T y A14 está unido covalentemente a L3; cada uno de A11, A12, A13, y A14 es, de manera independiente un grupo potenciador de la unión a ácido nucleico (NABEG), un alquilo ramificado
    45 que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S; o al menos un anillo saturado de 5 o 6 miembros que comprende opcionalmente al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, y S; cada uno de aW, kW, y’ y 8’ es, de manera independiente, cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive; y cada uno de a’, b’, y c’ es, de manera independiente, cero o un entero entre 1 y aproximadamente 20, inclusive.
  37. 43.
    Un procedimiento de usar un colorante, que comprende: conjugar el compuesto colorante de la reivindicación 42 con una molécula sustrato.
  38. 44.
    El procedimiento de la reivindicación 43, en el que la molécula sustrato se selecciona entre un
    nucleótido, un oligonucleótido, un péptido, una proteína, un hapteno, un fármaco, una micropartícula, un polímero 55 sintético, un polímero natural, una célula biológica, un virus, y una molécula de una superficie sólida.
  39. 45. Un procedimiento de preparación de una muestra que puede comprender o no ácido nucleico, que comprende: proporcionar una combinación de la muestra y el compuesto colorante de cualquiera de las reivindicaciones 19, 26 y 37, en el que si el ácido nucleico está presente en la muestra, se forma un complejo de ácido nucleico-colorante.
  40. 46.
    El procedimiento de la reivindicación 45, que comprende adicionalmente incubar la combinación.
  41. 47.
    Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de ácido nucleico en una muestra, que comprende:
    10 proporcionar una combinación de la muestra y del compuesto colorante de cualquiera de las reivindicaciones 19, 26 y 37, en el que si el ácido nucleico está presente en la muestra, se forma un complejo de ácido nucleico-colorante; e iluminar la combinación con luz a una longitud de onda suficiente de tal manera que si se forma el complejo con el ácido nucleico, por consiguiente se absorbe la luz y determinar la emisión fluorescente o la ausencia de la misma.
    15 48. Un kit para determinar la formación de ácido nucleico o la ausencia del mismo en una muestra que puede comprender o no un ácido nucleico diana, comprendiendo el kit: al menos una composición suficiente para la amplificación del ácido nucleico diana en la muestra debe comprender la muestra el ácido nucleico diana; y
    un compuesto colorante de cualquiera de las reivindicaciones 19, 26 y 37.
ES06738900T 2005-03-17 2006-03-17 Colorantes de ácidos nucleicos diméricos y triméricos, y sistemas y procedimientos asociados. Active ES2374966T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US66361305P 2005-03-17 2005-03-17
US663613P 2005-03-17
US11/377,253 US7776567B2 (en) 2005-03-17 2006-03-16 Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods
US377253 2006-03-16
PCT/US2006/009910 WO2006099605A2 (en) 2005-03-17 2006-03-17 Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2374966T3 true ES2374966T3 (es) 2012-02-23

Family

ID=36992471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06738900T Active ES2374966T3 (es) 2005-03-17 2006-03-17 Colorantes de ácidos nucleicos diméricos y triméricos, y sistemas y procedimientos asociados.

Country Status (11)

Country Link
US (3) US7776567B2 (es)
EP (2) EP2428586B1 (es)
JP (1) JP5249013B2 (es)
KR (1) KR101333434B1 (es)
CN (2) CN101142326B (es)
AT (1) ATE527382T1 (es)
AU (1) AU2006225134B2 (es)
CA (1) CA2601455C (es)
DK (1) DK1863933T3 (es)
ES (1) ES2374966T3 (es)
WO (1) WO2006099605A2 (es)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7776567B2 (en) * 2005-03-17 2010-08-17 Biotium, Inc. Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods
US7601498B2 (en) * 2005-03-17 2009-10-13 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology
EP2099930B1 (en) 2006-12-13 2015-02-18 Luminex Corporation Systems and methods for multiplex analysis of pcr in real time
EP2507220B1 (en) * 2009-12-04 2016-10-05 Biotium Inc. Heterocycle-substituted xanthene dyes
US8877437B1 (en) 2009-12-23 2014-11-04 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection
CN103108921B (zh) * 2010-03-15 2015-02-25 普渡研究基金会 具有增强的光学特征的高阶结构化染料
CA2794522C (en) 2010-04-05 2019-11-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
WO2012083235A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Universal reference dye for quantitative amplification
WO2012088007A1 (en) 2010-12-21 2012-06-28 Pierce Biotechnology, Inc. Fluorescent compounds
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
US8889884B1 (en) 2011-07-14 2014-11-18 Pierce Biotechnology, Inc. Phosphine derivatives of fluorescent compounds
US9249307B2 (en) 2011-08-16 2016-02-02 Pierce Biotechnology, Inc. Benzocyanine compounds
US20130052650A1 (en) 2011-08-29 2013-02-28 Thermo Fisher Scientific Inc. Dye blends
US9751868B2 (en) 2012-02-28 2017-09-05 Pierce Biotechnology, Inc. Benzocyanine compounds
CN104395306B (zh) 2012-03-02 2019-04-23 皮尔斯生物科技有限公司 作为生物分子的标记染料的吲哚衍生物
US9682970B2 (en) 2012-06-29 2017-06-20 Biotium, Inc. Fluorescent compounds and uses thereof
WO2014035712A1 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Pierce Biotechnology, Inc. Benzopyrylium compounds
US10557853B2 (en) * 2012-12-31 2020-02-11 Yeda Research And Development Co. Ltd. Molecular sensor and methods of use thereof
US20140249037A1 (en) 2013-03-04 2014-09-04 Fry Laboratories, LLC Method and kit for characterizing microorganisms
CN105452487B (zh) 2013-05-31 2020-02-14 美国健康及人类服务部 用于检测hiv-1对抗病毒药物的抗性的实时pcr点突变分析
US9879313B2 (en) 2013-06-25 2018-01-30 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
MX2016009867A (es) * 2014-01-28 2017-01-11 Medivation Technologies Inc Terapias dirigidas.
CN105001665B (zh) * 2014-04-15 2017-05-31 苏州嘉恒生物科技有限公司 一种新型核酸染料的制备及其应用
WO2016069922A1 (en) * 2014-10-29 2016-05-06 Biotium, Inc. Nucleic acid modifying agents and uses thereof
CN104448898B (zh) * 2014-12-04 2016-09-07 延边大学 一种派洛宁衍生物染料的合成方法
EP4119677B1 (en) 2015-04-10 2023-06-28 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
WO2017019830A1 (en) * 2015-07-29 2017-02-02 Medivation Technologies, Inc. Methods and compositions for targeted therapeutics
WO2017019817A1 (en) * 2015-07-29 2017-02-02 Medivation Technologies, Inc. Methods and compositions for targeted therapeutics
EP3430160A1 (en) * 2016-03-17 2019-01-23 Delta Instruments B.V. Detection of cells in a liquid sample
KR102608609B1 (ko) * 2016-04-26 2023-12-04 에스에프씨 주식회사 아크리딘계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물
CN106009761B (zh) * 2016-05-31 2017-08-15 延边大学 一种派洛宁染料的制备方法
CN110426442B (zh) * 2016-06-13 2022-02-11 苏州优逸兰迪生物科技有限公司 一种核酸凝胶电泳测试的方法
JP2020066637A (ja) * 2017-02-27 2020-04-30 富士フイルム株式会社 病理診断用染色剤、細胞核染色方法、病理標本の製造方法、及び色素
WO2019106684A1 (en) * 2017-11-30 2019-06-06 INDIAN INSTITUTE OF TECHNOLOGY MADRAS (IIT Madras) Method for direct quantification of nucleic acids in real time qpcr
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US20220025447A1 (en) 2018-12-10 2022-01-27 10X Genomics, Inc. Generating spatial arrays with gradients
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
EP4055185A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
CN111363377B (zh) * 2020-03-13 2021-11-30 苏州优逸兰迪生物科技有限公司 核酸染料及其制备方法与应用
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
AU2021283174A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
CN116249785A (zh) 2020-06-02 2023-06-09 10X基因组学有限公司 用于抗原-受体的空间转录组学
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021254321A1 (zh) * 2020-06-15 2021-12-23 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种具有大范围斯托克斯位移的新型荧光化合物
AU2021294334A1 (en) 2020-06-25 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
AU2022238446A1 (en) 2021-03-18 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4883867A (en) * 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US5118801A (en) * 1988-09-30 1992-06-02 The Public Health Research Institute Nucleic acid process containing improved molecular switch
US5401847A (en) * 1990-03-14 1995-03-28 Regents Of The University Of California DNA complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers
US5763162A (en) * 1990-03-14 1998-06-09 The Regents Of University Of California Multichromophore fluorescent DNA intercalation complexes
EP0529002B1 (en) * 1990-05-15 2001-10-04 Hyperion, Inc. Fluorescent porphyrin, and fluorescent phthalocyanine - polyethylene glycol, polyol, and saccharide derivatives as fluorescent probes
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
WO1993006482A1 (en) * 1991-09-16 1993-04-01 Molecular Probes, Inc. Dimers of unsymmetrical cyanine dyes
US5321130A (en) * 1992-02-10 1994-06-14 Molecular Probes, Inc. Unsymmetrical cyanine dyes with a cationic side chain
US5410030A (en) * 1993-04-05 1995-04-25 Molecular Probes, Inc. Dimers of unsymmetrical cyanine dyes containing pyridinium moieties
US5658751A (en) * 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
US5534416A (en) * 1993-04-13 1996-07-09 Molecular Probes, Inc. Fluorescent viability assay using cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5436134A (en) * 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US6277570B1 (en) * 1993-04-13 2001-08-21 Naxcor Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents
US5545535A (en) * 1993-04-13 1996-08-13 Molecular Probes, Inc. Fluorescent assay for bacterial gram reaction
US5445946A (en) * 1993-04-13 1995-08-29 Molecular Probes, Inc. Intravacuolar stains for yeast and other fungi
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
CA2148140C (en) * 1994-04-29 2010-08-10 John W. Sutherland Homogeneous method for assay of double-stranded nucleic acids using fluorescent dyes and kit useful therein
US5656449A (en) * 1995-03-06 1997-08-12 Molecular Probes, Inc. Neutral unsymmetrical cyanine dyes
CA2219891C (en) * 1995-05-05 2002-01-29 The Perkin-Elmer Corporation Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay
JP3898228B2 (ja) * 1996-04-12 2007-03-28 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク 検出プローブ、キット及びアッセイ
CA2257109C (en) * 1996-06-04 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
US6037137A (en) * 1997-02-20 2000-03-14 Oncoimmunin, Inc. Fluorogenic peptides for the detection of protease activity
US5846726A (en) * 1997-05-13 1998-12-08 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids by fluorescence quenching
GB9813062D0 (en) * 1998-06-18 1998-08-19 Univ Wales Medicine An anthraquinone and its derivatives
US6664047B1 (en) * 1999-04-30 2003-12-16 Molecular Probes, Inc. Aza-benzazolium containing cyanine dyes
CA2417986C (en) * 2000-08-11 2013-11-26 University Of Utah Research Foundation Single-labeled oligonucleotide probes
JP4265134B2 (ja) * 2001-01-11 2009-05-20 東ソー株式会社 新規蛍光色素及び核酸の測定方法
DE60122784T2 (de) 2001-03-30 2007-09-20 Council Of Scientific And Industrial Research Viologen gebundenes acridin-molekül und verfahren zu seiner herstellung
SE519116C2 (sv) * 2001-05-10 2003-01-14 Lightup Technologies Ab Syntes och utvärdering av nya cyaninfärgämnen som binder till minor groove
US9261460B2 (en) * 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US20030092062A1 (en) 2001-10-24 2003-05-15 Reddy M. Parameswara Immobilizing biological molecules
US7166478B2 (en) 2002-03-12 2007-01-23 Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses
EP2772552B1 (en) * 2002-10-23 2018-10-10 University of Utah Research Foundation Amplicon melting analysis with saturation dyes
WO2005033342A1 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Molecular Probes, Inc. Detection of immobilized nucleic acid
US7387887B2 (en) * 2004-04-20 2008-06-17 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
EP1781675B1 (en) * 2004-08-13 2014-03-26 Epoch Biosciences, Inc. Phosphonate fluorescent dyes and conjugates
US7601498B2 (en) * 2005-03-17 2009-10-13 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology
US7776567B2 (en) * 2005-03-17 2010-08-17 Biotium, Inc. Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods
US8877437B1 (en) 2009-12-23 2014-11-04 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection

Also Published As

Publication number Publication date
US8530195B2 (en) 2013-09-10
EP2428586A1 (en) 2012-03-14
US20140106349A1 (en) 2014-04-17
CN101142326A (zh) 2008-03-12
US20060211028A1 (en) 2006-09-21
CA2601455A1 (en) 2006-09-21
EP1863933A2 (en) 2007-12-12
WO2006099605A3 (en) 2007-05-18
AU2006225134B2 (en) 2012-04-12
KR20070116118A (ko) 2007-12-06
US9580749B2 (en) 2017-02-28
ATE527382T1 (de) 2011-10-15
EP2428586B1 (en) 2013-05-08
DK1863933T3 (da) 2012-02-13
AU2006225134A1 (en) 2006-09-21
CA2601455C (en) 2014-10-14
EP1863933B1 (en) 2011-10-05
CN102942566A (zh) 2013-02-27
JP5249013B2 (ja) 2013-07-31
CN101142326B (zh) 2015-09-30
KR101333434B1 (ko) 2013-11-26
CN102942566B (zh) 2016-04-20
US7776567B2 (en) 2010-08-17
EP1863933A4 (en) 2009-04-08
JP2008533491A (ja) 2008-08-21
WO2006099605A2 (en) 2006-09-21
US20100317016A1 (en) 2010-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2374966T3 (es) Colorantes de ácidos nucleicos diméricos y triméricos, y sistemas y procedimientos asociados.
US6323337B1 (en) Quenching oligonucleotides
ES2209492T3 (es) Colorantes de transferencia energetica.
US6706879B2 (en) Fluorescent dye
US6967250B1 (en) Energy transfer dyes
CN111801340A (zh) 新型淬灭剂和报告基因染料组合
US20210079225A1 (en) Monoazo dyes with cyclic amine as fluorescence quenchers
RU2795062C2 (ru) Новые комбинации гасителя и репортерного красителя
JP7507696B2 (ja) 新規のクエンチャーおよびレポーター染料の組み合わせ