CN105452487B - 用于检测hiv-1对抗病毒药物的抗性的实时pcr点突变分析 - Google Patents

Abstract

公开了包括引物和探针的组合物，其能够与公开的核酸相互作用，如本文公开的编码HIV的逆转录酶、蛋白酶或整合酶的核酸。因此，提供了包括SEQ ID NOS:1‑89、96‑122和124‑151所示的核苷酸序列中的任何一种的寡核苷酸。还提供了由SEQ ID NOS:1‑89、96‑122和124‑151所示的核苷酸组成的寡核苷酸。所公开的寡核苷酸中的每一种是探针或引物。还提供了引物和探针的混合物并用于本文公开的RT‑PCR和初级PCR反应中。提供了用于同时或连续地特异性检测HIV中几个突变的方法。可以使用本文描述的方法检测HIV的逆转录酶、蛋白酶或整合酶中的突变。

Description

用于检测HIV-1对抗病毒药物的抗性的实时PCR点突变分析

相关申请的交叉引用

本申请依赖于并要求2013年5月31日提交的美国临时申请第61/829,473号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

政府利益

本文所描述的发明可以由或为美国政府制造、使用并许可。

发明背景

现在HIV流行超过4千万人并且其扩展正面临用于照料那些受感染者生命的抗HIV药物的使用增加。由于用于HIV-1感染人群的临床管理的这些药物的使用在世界范围内增加，预期抗药性的出现增加。含有三种抗逆转录病毒药物组合的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是目前推荐的并且已有效降低死亡率和发病率。四类药物是可利用的：抑制病毒体进入(如，T-20)、通过病毒逆转录酶抑制核苷酸延伸(如3TC、d4T)、抑制逆转录酶酶活性(如，奈韦拉平、依法韦仑)或抑制病毒蛋白酶(如，奈非那韦、洛匹那韦)的药物。突变所赋予的抗药性通常在来自抗逆转录病毒治疗失败的患者的病毒中进行选择，并且被认为是治疗失败的主要原因。

目前的治疗方针建议对开始抗逆转录病毒治疗的患者进行最佳用药方案选择的基准耐药测试。对人所携带的任何有抗性(resistant)的病毒的准确识别将有助于指导对使用全活性药物的治疗方案的选择。通过利用表型分析或基因型分析进行耐药测试。表型分析对源于患者的病毒的药物敏感性进行测量，并提供耐药的直接证据。然而，表型分析是基于培养、复杂、费力且成本高的。基因型分析通常用于通过对来自血浆的病毒RNA进行序列分析来检测与耐药相关的突变。这些分析同样是复杂的并且对低水平突变体的检测不敏感，如可能早期存在于抗性的出现中或在缺乏治疗的情况下可能在低设定点处存留的。常用的测序方法并不能可靠地检测以低于样品内总病毒种群量的20-30％的水平存在的突变体。本申请中描述了基于PCR的耐药检测分析，其能够检测受感染者血浆内出以低至0.5％-0.04％的频率存在的耐药病毒。这些敏感度比通过常规序列测试所达到的敏感度高40-500倍。

尽管抗药性经常在抗逆转录病毒治疗失败的患者中见到，但在未用药物的群体中发现传播耐药HIV-1的实质患病率(～8-25％)，这支持对基准耐药测试的需要。由于在缺乏药物的情况下抗药性突变体通常比野生型病毒更不适合，所以许多抗药性突变随时间回复至野生型，并且逐渐地变得不能在血浆中检测。然而，在血浆中不能检测的抗药性病毒继续存于患者内，并且当使用药物时被重新选择。因此，具有能够准确检测低频率耐药突变体存在的敏感性分析是重要的。来自使用本专利申请中描述的敏感性实时PCR分析的数据清楚地表明，对未用药物的人的常规测序低估了传播抗药性的患病率(Johnson et al.,13thHDR Workshop,Tenerife,Spain,2004)。通过敏感性分析测试附加突变的传播耐药病毒识别出新的突变体，其增加了另外2-8％的群体中的抗性患病率。所述增加暗示以比先前报道高20-80％的频率传播抗药性突变。因此，这些数据证明了用于基准抗药性测试的测序方法的较差灵敏度。

抗药性测试还指示用于接收HAART的患者控制治疗失败并有助于指导对具有活性药物的新HAART方案的选择。最近的数据指出对该测试的敏感抗药性分析的重要性并使通过常规测序不能检测的低频率抗药性病毒与差的治疗结果相关联(Mellors等,11th CROI,2004；Jourdain et al.,JID 2004)(1)。这些研究报道了，暴露于非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)的人——其产生仅通过敏感性分析可检测的而通过常规测序不可检测到的抗性突变——对随后包括NNRTI的方案响应更差。来自本文报道的C亚型HIV-1分析的数据显示，无法通过常规群体测序对多于三分之一的从分娩期单剂量奈韦拉平干预中出现的抗药性病毒进行识别(Johnson et al.,12th CROI 2005)。对大量低频率耐药病毒的检测将对选择使用完全有活性药物的方案是重要的。

在受治疗人群的临床监测中，该实时PCR抗性分析相对于常规测序的更高灵敏度可允许对在治疗过程中出现的抗性突变进行早期检测，并提供响应治疗的可能下降的预先通知。早期检测将有助于指导医生修改给药方案以防止治疗失败和高水平抗药性的出现。在检测低水平抗性病毒中(低于通过常规序列分析能够检测的水平)具有更高敏感度的方法对改善处于HAART的患者的临床管理是重要的。本发明实时PCR耐药分析的相当高的灵敏度、简单性、高通量能力和低成本相对于常规测序分析更加具有优势。

发明概述

提供以下发明概述以便于理解本发明所特有的一些创新性特征，且并不意图完整描述。对发明各个方面的全面理解可以通过将整个说明书、权利要求书、附图和摘要作为一个整体考虑而获得。

公开了包括引物和探针的组合物以及对生物样品中抗药性HIV进行高灵敏度突变特异性检测的方法，所述引物和探针能够与编码HIV-1的一种或多种蛋白质的核酸——如编码HIV的逆转录酶、蛋白酶或整合酶的核酸——相互作用。因此，本发明的第一目的是提供可用于选择性和突变特异性检测HIV-1的一种或多种蛋白质或编码蛋白质(一种或多种)的基因中的突变的组合物。因此，提供了包括SEQ ID NOs:142-151中所示的核苷酸序列中的任一种的寡核苷酸。还提供了由SEQ ID NOs:142-151中所示的核苷酸序列中的任一种组成的寡核苷酸。所公开的寡核苷酸中的每一种都是探针或引物。还提供了引物的混合物以及引物和探针的混合物并用于本文公开的RT-PCR和初级PCR反应。提供了包括引物或探针的试剂盒。提供了用于特异性检测HIV中若干突变(如赋予抗药性的突变)的方法。可以使用本文所描述的方法检测HIV逆转录酶或蛋白酶中的突变。

附图简述

图1A和1B是根据本发明一些实施方式用于检测一个或多个编码HIV-1逆转录酶或蛋白酶的蛋白质的基因中是否存在一个或多个突变的分析的原理示意图。

图2A显示184V的分析灵敏度；

图2B显示临床样品中184V检测的下限；

图3显示针对临床样品的184V分析的性能；

图4显示临床样品的ΔCT频率分布；

图5显示在先-NVP和后-NVP血浆样品中103N突变的实时PCR分析的ΔCT值；

图6显示检测HIV-1C亚型65R突变的方法的临床和绝对检测限；

图7显示检测HIV-1整合酶148R突变的方法的绝对检测限；

图8图示使用用于检测扩增产物的嵌入染料突变特异性扩增HIV-1逆转录酶219Q突变；

图9A图示使用用于检测扩增产物的嵌入染料突变特异性检测HIV-1蛋白酶中的I50V突变；

图9B图示使用包括SEQ ID NO:148、为扩增产物的检测提供意料不到增加的特异性的探针突变特异性检测HIV-1蛋白酶中的I50V突变；

图10A图示仅使用41L突变的引物组正确识别单重反应中41L突变；

图10B图示使用与90M、103N和215Y突变的引物组组合的41L突变的引物组正确识别多重反应中41L突变；

图11A图示使用针对所有90M、41L、103N和215Y突变的引物组在多重反应中对含有90M突变的HIV-1的样品中HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图11B图示使用针对所有90M、41L、103N和215Y突变的引物组在多重反应中对含有41L突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图11C图示使用针对所有90M、41L、103N和215Y突变的引物组在多重反应中对含有41L、103N和215Y突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图11D图示使用针对所有90M、41L、103N和215Y突变的引物组在多重反应中对含有41L和215S突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图11E图示使用针对所有90M、41L、103N和215Y突变的引物组在多重反应中对含有103N突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图11F图示使用针对所有90M、41L、103N和215Y突变的引物组在多重反应中对含有219Q突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图11G图示使用针对所有90M、41L、103N和215Y突变的引物组在多重反应中对含有41L和215Y突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图12A图示使用针对所有90M、65R、103N和184V突变的引物组在多重反应中对含有65R突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图12B图示使用针对所有90M、65R、103N和184V突变的引物组在多重反应中对含有41L、103N和215Y突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别；

图12C图示使用针对所有90M、65R、103N和184V突变的引物组在多重反应中对含有219Q突变的HIV-1的样品中的HIV-1抗药性突变的阳性识别。

发明实施方式详述

对具体实施方式(一个或多个)的以下描述本质上仅是示例性的，决不意图限制本发明的范围、其应用或用途——当然这些可能变化。参考本文所包括的非限制性限定和术语对发明进行描述。这些限定和术语并不是为对发明的范围或实施起限定作用而设计，而仅仅是为说明性和描述性目的而提出。尽管该过程被描述为单独步骤的顺序或者是使用特定材料，但理解的是，所描述的步骤或材料是可以互换的，以使发明的说明包括以本领域技术人员容易理解的多种方式排列的多个部分或步骤。

为了改进对与HIV-1抗药性相关的突变的检测，提供了基于PCR的点突变分析。该方法学允许以大于常规测序1-2个对数的可达到的灵敏度对患者样品中的不同点突变进行测试。因此，本发明具有检测HIV抗药性株存在或不存在的实用性。该分析原理是对突变特异性PCR和全复制(total copy)(通用(普通，common))PCR的差异扩增进行比较，所述全复制PCR检测所有存在的序列。分析可以使用由病毒RNA的RT-PCR或由来自感染细胞的原病毒DNA的PCR生成的模板(图1)。

显著损害用逆转录酶抑制剂治疗成功的两种重要的HIV-1逆转录酶突变为103N和184V。在使用非核苷RT抑制剂(如奈韦拉平、依法韦仑)治疗失败的患者中103N突变被频繁选择。同样地，在暴露于核苷抑制剂拉米夫定(3TC)、恩曲他滨(FTC)和阿巴卡韦之后184V突变的频繁出现以及其在停止治疗后在表面上迅速消失使得迅速衰变突变的精确测量对于监测和临床管理变得重要。

本发明的实时PCR方法学的简单性、较大灵敏度以及高通量性能使其对于筛选大量样品是有用的，这允许实现对抗性突变的通用抗性测试和长期监视。

本文公开的方法具有多种应用，包括(1)对接收抗HIV药物的HIV感染人群的临床管理进行的抗性测试(用于检测受治疗人群中抗性病毒的出现，并作为患者基准HIV的预治疗评估以调整最适药物组合)，(2)由于分析的高灵敏度和高通量性能，在血库筛选中用作核酸测试(NAT)，(3)测量血浆病毒负载的能力，因为分析本来是定量的，(4)用作监测抗性HIV扩散的筛选工具，(5)用作研究抗药性突变的出现和生物学的研究工具，(6)对HIV-1的B亚型和非B亚型中抗性突变的检测，(7)对HIV-2中抗性突变的可能检测，和(8)对突变的特定组实验对象的识别，所述组实验对象为解决每种所描述的用途而设计。这里开发的试剂及具体用法都是特有的。

如说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括多个指示物，除非该内容清楚地表示其他含义。因此，例如，提及“引物”则包括两种或更多种此类引物的混合物等。

组合物

公开了包括引物和探针的组合物，其能够与公开的核酸相互作用，如在本文以及文献中公开的编码HIV逆转录酶或蛋白酶的核酸。

因此，提供了包括SEQ ID NOS:1-89、96-122和124-151中任何一种所示的核苷酸序列的寡核苷酸。还提供了由SEQ ID NOS:1-89、96-122和124-151所示的核苷酸序列中的任何一种组成的寡核苷酸。因此，提供了包括选自如SEQ ID NOS:1-89、96-122和124-151列出的序列中所示的核苷酸的序列的寡核苷酸。公开的寡核苷酸中的每一种都是探针或引物。每一种都可以独立于其它寡核苷酸用于扩增法或杂交/探针法。探针或引物中的一种或多种可以在组合物和方法中一起使用用于检测突变。本文描述了此类组合物和方法的具体实例。

核苷酸是含有碱基部分、糖部分和磷酸酯部分的分子。核苷酸可以通过其产生核苷间连键的磷酸酯部分和糖部分连接在一起。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸酯部分是五价磷酸酯。核苷酸的非限制性实例将是3'-AMP(3'-腺苷单磷酸)或5'-GMP(5'-鸟苷单磷酸)。术语“核苷酸”包括核苷酸和核苷酸类似物，优选包括寡核苷酸的核苷酸的组，并且是指含有通过N-糖基键结合至磷酸化糖的杂环化合物的任何化合物或者能够互补碱基配对的任何单体或者能够与寡核苷酸杂交的任何聚合物。

术语“核苷酸类似物”是指可以用于代替核酸合成和加工——优选酶促——以及化学合成和加工中天然存在的碱基的分子，尤其是能够碱基配对的修饰核苷酸。核苷酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸酯部分中的一种进行某种类型修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域熟知且将包括如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及糖或磷酸酯部分处的修饰。该术语包括但不限于经修饰的嘌呤和嘧啶、稀有碱基、可转化的核苷、嘌呤和嘧啶的结构类似物、被标记、衍生和修饰的核苷和核苷酸、缀合的核苷和核苷酸、序列修饰物、末端修饰物、间隔区修饰物以及具有主链修饰的核苷酸，所述核苷酸包括但不限于核糖修饰的核苷酸、磷酰胺酯、硫代磷酸酯、亚膦酰胺、甲基磷酸脂、甲基亚磷酰胺(methyl phosphoramidites)、甲基亚膦酰胺(methylphosphonamidites)、5'-β-氰乙基亚磷酰胺、亚甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、肽核酸、非手性和中性核苷酸间键合以及非核苷酸桥接，如聚乙二醇、聚芳酰胺和脂质。任选地，核苷酸类似物是不包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或稀有碱基的合成碱基。这些及其它核苷酸和核苷衍生物、类似物以及主链修饰都是本领域已知的(例如，Piccirilli J.A.等.(1990)Nature 343:33-37；Sanghvi等(1993)In:Nucleoside和Nucleotides asAntitumor and Antiviral Agents,(Eds.C.K.Chu和D.C.Baker)Plenum,New York,pp.311-323；Goodchild J.(1990)Bioconjugate Chemistry 1:165-187；Beaucage等.(1993)Tetrahedron 49:1925-1963)。

核苷酸替代物包括具有与核苷酸相似的功能性质、但不包含磷酸酯部分的分子，如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是能以沃森-克里克(Watson-Crick)或Hoogsteen方式识别核酸、而通过除磷酸酯部分之外的部分连接在一起的分子。当与适当的靶核酸相互作用时，核苷酸替代物能够符合双螺旋型结构。

本文公开的多种分子都是以核酸为基础。例如，所公开的核酸是由核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物构成。本文讨论了这些及其它分子的非限制性实例。

术语“寡核苷酸”意思是天然存在或合成的核苷酸聚合物，优选包括至少三种核苷酸的聚合物，更优选能够杂交的聚合物。寡核苷酸可以是单链、双链、部分单链或部分双链的核糖核酸或脱氧核糖核酸，包括所选的核酸序列、异源双链体、嵌合和杂交的核苷酸以及与一种或多种非寡核苷酸分子缀合的寡核苷酸。一般而言，包括寡核苷酸的核苷酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸，如与2'-脱氧核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸，如与核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。然而，寡核苷酸还可以包括核苷酸类似物，其包括非天然存在的合成核苷酸或经修饰的天然存在的核苷酸。此类核苷酸类似物是本领域熟知且商业上可得到的，如含有此类核苷酸类似物的多核苷酸(Lin等,Nucl.Acids Res.22:5220-5234(1994)；Jellinek等,Biochemistry 34:11363-11372(1995)；Pagratis等,Nature Biotechnol.15:68-73(1997)，其中的每一篇通过引用并入本文)。

术语“多核苷酸”在本文中广泛用来表示通过磷酸二酯键连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。因此，术语“多核苷酸”包括RNA和DNA——其可以是基因或其部分、cDNA、合成的多脱氧核糖核酸序列等，并且可以是单链或双链的——以及DNA/RNA杂合体。此外，如本文使用的术语“多核苷酸”包括可以从细胞分离的天然存在的核酸分子，以及可以例如通过化学合成方法或通过酶法诸如通过聚合酶链式反应(PCR)制备的合成分子。在各种实施方式中，本发明的多核苷酸可以包括核苷或核苷酸类似物，或除磷酸二酯键以外的主链键。通常，包括多核苷酸的核苷酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸，如与2'-脱氧核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸，如与核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。然而，多核苷酸还可以包括核苷酸类似物，其包括非天然存在的合成核苷酸或经修饰的天然存在的核苷酸。此类核苷酸类似物是本领域熟知且商业上可得到的，如含有此类核苷酸类似物的多核苷酸(Lin等,Nucl.Acids Res.22:5220-5234(1994)；Jellinek等,Biochemistry 34:11363-11372(1995)；Pagratis等,NatureBiotechnol.15:68-73(1997)，其中的每一篇通过引用并入本文)。

连接多核苷酸的核苷酸的共价键通常是磷酸二酯键。然而，共价键也可以是许多其它键中的任何一种，包括硫二酯键、硫代磷酸酯键、肽样键或任何其它本领域已知的、用于连接核苷酸以生成合成多核苷酸的键(例如，参见Tamd等,Nucl.Acids Res.22:977-986(1994)；Ecker and Crooke,BioTechnology 13:351360(1995)，其中的每一篇都通过引用并入本文)。在多核苷酸将要暴露于可以含有溶核活性的环境时，例如包括组织培养基或在向活体给药后，非天然存在的核苷酸类似物或连接核苷酸或类似物的键的并入可以特别有用，因为经修饰的多核苷酸可以较不易降解。天然存在的多核苷酸的功能性类似物可以结合至RNA或DNA，并且包括肽核酸(PNA)分子。

“探针”是通常能够以序列特异性方式(例如通过杂交)与靶核酸相互作用的分子。核酸杂交是本领域充分理解的并在本文进行讨论。通常，探针可以由本领域可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任意组合制成。

“引物”是能够支持某些类型的酶操作(enzymatic manipulation)且可以与靶核酸杂交使得可以发生酶操作的探针的亚型。引物可以由本领域可得到的、不干扰酶操作的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任意组合制成。

SEQ ID NOS:1-89、96-122和124-147的寡核苷酸可以以非实质性方式进行修饰，但要保留本文所述的实质上相同的杂交强度和特异性。在分析中容易测量这些参数，如本文所教导的那些。因此，本领域技术人员将能够考虑对所公开的序列的许多核苷酸取代，只要它们保留与具体公开的序列的80％序列相似性。本发明的引物和探针可以包括与SEQ IDNOS:1-89、96-122和124-150中的一种具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列，这些是考虑的。更具体地，由于这些可选序列是本领域技术人员考虑的，考虑具有以HIV-1蛋白酶、逆转录酶或整合酶的已知序列为基础的取代的引物和探针。

在某些实施方式中，引物用于支持DNA扩增反应。通常，引物能够以序列特异性方式延伸。以序列特异性方式的引物延伸包括任何方法，其中与引物杂交或以其他方式相结合的核酸分子的序列和/或组成指导或影响由引物延伸产生的产物的组成或序列。因此以序列特异性方式的引物延伸包括但不限于PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或逆转录。优选以序列特异性方式对引物进行扩增的技术和条件。在某些实施方式中，引物用于DNA扩增反应，如PCR或直接测序。应理解，在某些实施方式中，还可以使用非酶促技术延伸引物，例如，对用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸进行修饰，使得它们将发生化学反应从而以序列特异性方式延伸引物。通常，公开的引物与公开的核酸或核酸区域杂交，或者它们与核酸的互补序列(complement)或核酸区域的互补序列杂交。

在适于聚合酶链式反应的条件下，所公开的引物和或探针适于与靶核酸序列杂交。这种条件在本文被认为是在严格条件下进行杂交。如本文使用的，术语“在严格条件下进行杂交”描述了杂交和洗涤条件，在所述条件下，彼此具有至少30％，35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的碱基对匹配的核苷酸序列通常保持与彼此的杂交。例如，说明性杂交条件被描述在，但不限于，Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.16.3.6.；Basic Methods inMolecular Biology,Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,N.Y.(1986),pp.7578,和8487；和Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1982),pp.387389中，并且是本领域技术人员熟知的。严格杂交条件的非限制性实例是在约60℃下6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，0.5％SDS中杂交，随后在室温下在2×SSC、0.5％SDS中进行一次或多次洗涤。严格杂交条件的另一个非限制性实例是在约45℃下在6×SSC中杂交，随后在50至65℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。在本领域的公知常识以及本说明书的基础上，其它严格杂交条件对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

“分离的”或“纯化的”核苷酸或寡核苷酸基本上不含细胞物质或其它来自衍生核苷酸的细胞或组织来源的污染蛋白质，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。术语“基本上不含细胞物质”包括核苷酸/寡核苷酸的制备，其中从其分离或生成的细胞的细胞组分中分离出核苷酸/寡核苷酸。因此，基本上不含细胞物质的核苷酸/寡核苷酸包括具有小于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)污染物质的核苷酸的制备。当通过化学合成生成核苷酸/寡核苷酸时，任选地基本上不含化学品前体或其它化学品，即，其由涉及分子合成的化学前体或其它化学品分离。因此，核苷酸/寡核苷酸的这种制备具有小于约30％、20％、10％或5％(干重)的化学前体或除感兴趣核苷酸/寡核苷酸之外的化合物。在本发明的一些实施方式中，核苷酸/寡核苷酸是分离的或纯化的。

如本文使用的，术语“样品”是较大来源的部分。样品任选地为固体、气体或流体样品。样品说明性地为环境或生物样品。环境样品说明性地为但不限于水、污水、土壤或空气。“生物样品”是作为从生物有机体、组织、细胞、细胞培养基或适合于模拟生物条件的任何培养基中获得的样品。非限制性实例包括唾液、牙龈分泌物、脑脊液、胃肠液、黏液、泌尿生殖分泌物、滑液、血液、血清、血浆、尿液、胆囊液、淋巴液、腹水、胸膜积液、组织液、细胞内液、眼液、精液、乳腺分泌物和玻璃体液(vitreal fluid)、和鼻分泌物、喉咙或鼻物质。在一些实施方式中，靶向剂包括在下述中：CSF；血清；全血；咽喉流体；鼻咽流体；或其它呼吸道流体。

如本文使用的，术语“培养基”是指存在或不存在细菌情况下的任何液体或流体样品。培养基说明性地为经悬浮、溶解或以其他方式与流体结合形成流体样品的固体样品。非限制性实例包括缓冲盐水溶液、细胞培养基、乙腈、三氟乙酸、其组合或任何其它本领域认可的适于与细菌或其它细胞组合或适于稀释生物样品或扩增产物用于分析的流体。

本文所述的寡核苷酸任选地包括对交叉亚型反应性PCR(cross subtypereactive PCR)有效的引物和探针，因此，它们能够检测多种HIV亚型中的突变。下列引物和探针还可以包括本领域技术人员已知的添加物。此类添加物的实例包括但不限于将引物与底物连接的分子等。此外，如果需要，本发明的核酸分子可以并入可检测部分。如本文使用的，术语“可检测部分”意指任何合适的标记物，包括但不限于酶、荧光团、生物素、发色团、放射性同位素、着色颗粒、电化学、化学改性的部分或化学发光部分。实例包括(i)可以催化发色或发光(荧光)反应的酶和(ii)荧光团。对可检测部分的检测可以是直接的，条件是可检测部分自身是可检测的，如在荧光团的情况下。可选地，对可检测部分的检测可以是间接的。在后一种情况下，优选使用可与可检测部分反应的第二部分——其自身是直接可检测的。可检测部分可以是分子探针所固有的。通用(普通，common)荧光部分包括：荧光素、氰蓝染料、香豆素、藻红蛋白、藻胆蛋白、丹磺酰氯、德克萨斯红和镧系络合物。

提供了下列物质：包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:4所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:5所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:8所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:9所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:10所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:11所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:12所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:13所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:14所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:15所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:16所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:17所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:18所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:19所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:20所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:21所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:22所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:23所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:24所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:25所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:26所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:27所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:28所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:29所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:30所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:31所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:32所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:33所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:34所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:35所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:36所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:37所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:38所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:39所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:40所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:41所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:42所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:43所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:44所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:45所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:46所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:47所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:48所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:49所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:50所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:51所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:52所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:53所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:54所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:55所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:56所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:57所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:58所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:59所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:60所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:61所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:62所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:63所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:64所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:65所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:66所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:67所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:68所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:69所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:70所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:71所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:72所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:73所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:74所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:75所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:76所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:77所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:78所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:79所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:80所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:81所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:82所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:83所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:84所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:85所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:86所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:87所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:88所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:89所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:96所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:97所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:98所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:99所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:100所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:101所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQID NO:102所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:103所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:104所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:113所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:114所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:115所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:116所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:117所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:118所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:119所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:120所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:121所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:122所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:124所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:125所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:126所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:127所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:128所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:129所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ IDNO:130所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:131所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQID NO:132所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:133所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:134所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:135所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:136所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:137所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:138所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:139所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:141所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:142所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:143所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:144所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:145所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:146所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:147所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:148所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:149所示的核苷酸的寡核苷酸；包括SEQ ID NO:150所示的核苷酸的寡核苷酸；和包括SEQ ID NO:151所示的核苷酸的寡核苷酸。因此，提供了任选分离的寡核苷酸，其包括选自SEQ ID NO:1-89、96-104、113-122和124-151所列序列所示的核苷酸的序列。

还提供了用于本文公开的RT-PCR和初级PCR反应的引物混合物。因此，提供了包括SEQ ID NO:1和3的引物混合物。该混合物可以用于HIV的逆转录-PCR(RT-PCR)反应和初级PCR反应。除包括本文所述突变的逆转录酶基因的区域之外，其还逆转录并扩增包括位置30和90的HIV蛋白酶区域。

提供了包括SEQ ID NOS:2和3的引物混合物。该混合物并不逆转录或扩增感兴趣蛋白酶区域，但可用于逆转录酶的分析。

提供了包括SEQ ID NOS:4和6的引物混合物。该混合物用于HIV的RT-PCR和初级PCR反应。除包括本文所述突变的逆转录酶基因的区域之外，其还逆转录并扩增包括位置30和90的HIV蛋白酶区域。

还提供了包括SEQ ID NOS:5和6的引物混合物。该混合物并不逆转录或扩增感兴趣蛋白酶区域，但可用于逆转录酶的分析。

提供了包括SEQ ID NOS:124和125的引物混合物。该混合物用于HIV的RT-PCR和初级PCR反应。其还逆转录并扩增包括位置138、140、148和155的HIV整合酶区域。

还提供了包括SEQ ID NOS:127和128的引物混合物。该混合物并不逆转录或扩增感兴趣蛋白酶区域，但可用于逆转录酶的分析。

提供了用于本文公开的突变特异性PCR反应的寡核苷酸混合物。只要所公开的正向引物中的任何一种与反向引物中的任何一种配对用于给定的突变，则可以实现检测。

因此，提供了包括选自SEQ ID NOS:22、23、24和25的一种或多种引物的引物混合物。这是用于103N突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是由SEQ ID NO:26组成的引物。

还提供了包括选自SEQ ID NOS:59、60和61的一种或多种引物的引物混合物。这是用于103N突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是由SEQ ID NO:26组成的引物。

提供了包括选自SEQ ID NOS:33、34和35的一种或多种引物的引物混合物。这是用于184V突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:36或由SEQ ID NO:36组成的引物。

提供了包括选自SEQ ID NOS:88、89、102、103和104的一种或多种引物的引物混合物。这是用于184V突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成的引物。

提供了包括选自SEQ ID NOS:62、63、64、65、96和97的一种或多种引物的引物混合物。这是用于41L突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:66或由SEQ ID NO:66组成的引物。

提供了包括SEQ ID NOS:10和98的引物混合物和反向引物。该混合物包括用于65R突变特异性PCR反应的正向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成的引物。

提供了包括SEQ ID NOS:113的引物混合物和反向引物。该混合物包括用于65R突变特异性PCR反应的正向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:114或由SEQ ID NO:114组成的引物。

提供了包括SEQ ID NOS:117和118的引物混合物和反向引物。该混合物包括用于65R突变特异性PCR反应的正向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:119或由SEQ IDNO:119组成的引物。

提供了包括SEQ ID NOS:117、118、122的引物混合物和反向引物。该混合物包括用于65R突变特异性PCR反应的正向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:119或由SEQID NO:119组成的引物。

提供了包括SEQ ID NOS:69和70的引物混合物。这是用于67N突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ IDNO:8或由SEQ ID NO:8组成的引物。

提供了包括选自SEQ ID NOS:12、13和71的一种或多种引物的引物混合物。这是用于69T特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NOS:8和14或由SEQ ID NOS:8和14组成的引物。

提供了包括选自SEQ ID NOS:2、16、17、18、19和100的一种或多种引物的引物混合物。这是用于70R突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NOS:20、72或73或由SEQ ID NOS:20、72或73组成的引物。

提供了包括SEQ ID NOS:28和29的引物混合物。这是用于181C突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ IDNO:30或由SEQ ID NO:30组成的引物。

提供了包括SEQ ID NOS:83和84的引物混合物。这是用于蛋白酶181C突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成的引物。

提供了包括选自SEQ ID NOS:38、39、74、75和101的一种或多种引物的引物混合物。这是用于215T突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:40的引物混合物和反向引物。这是用于215Y突变特异性PCR反应的引物混合物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:41的引物混合物和反向引物。这是用于215F突变特异性PCR反应的引物混合物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:42的引物混合物和反向引物。这是用于215S突变特异性PCR反应的引物混合物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:43的引物混合物和反向引物。这是用于215C突变特异性PCR反应的引物混合物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:44的引物混合物和反向引物。这是用于215D突变特异性PCR反应的引物混合物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

提供了包括SEQ ID NOS:48和49的引物混合物。这是用于蛋白酶30N突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成的引物。

提供了包括选自SEQ ID NOS:3、54、55、78、79和80的一种或多种引物的引物混合物。这是用于蛋白酶90M突变特异性PCR反应的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NOS:56和81或由SEQ ID NOS:56和81组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:133的引物混合物和反向引物。该混合物包括用于HIV-1整合酶138K突变特异性PCR反应的正向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:130或由SEQ ID NO:130组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:134的引物混合物和反向引物。该混合物包括用于HIV-1整合酶140S突变特异性PCR反应的正向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:130或由SEQ ID NO:130组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:137的引物混合物和正向引物。该混合物包括用于HIV-1整合酶155H突变特异性PCR反应的反向引物。正向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:126或由SEQ ID NO:126组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:138的引物混合物和正向引物。该混合物包括用于HIV-1整合酶148R突变特异性PCR反应的反向引物。正向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:126或由SEQ ID NO:126组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:139的引物混合物和正向引物。该混合物包括用于HIV-1整合酶148H突变特异性PCR反应的反向引物。正向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:126或由SEQ ID NO:126组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:142、任选地SEQ ID NO:118的引物混合物和反向引物。该混合物包括用于HIV-1逆转录酶65R突变特异性PCR反应的反向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:119或由SEQ ID NO:119组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:143的引物混合物和正向引物。该混合物包括用于HIV-1逆转录酶70E突变特异性PCR反应的正向引物。正向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:144或由SEQ ID NO:144组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:72和任选地SEQ ID NO:73的引物混合物和正向引物。该混合物包括用于HIV-1逆转录酶70R突变特异性PCR反应的正向引物。正向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:144或由SEQ ID NO:144组成的引物。

提供了包括SEQ ID NO:146和的引物混合物反向引物。该混合物包括用于HIV-1蛋白酶50V突变特异性PCR反应的反向引物。反向引物可以是例如，包括SEQ ID NO:147或由SEQ ID NO:147组成的引物。

还提供了用于逆转录酶和蛋白酶的突变特异性PCR反应的引物混合物。这些混合物可以包括用于逆转录突变的正向和反向引物以及用于蛋白酶突变的正向和反向引物。混合物中的正向引物可以包括用于待检测特异性RT突变的任何正向引物和用于待检测蛋白酶突变的任何正向引物。这些混合物可以用于同时检测RT突变和蛋白酶突变。此类引物混合物的实例包括SEQ ID NOS:113、117、118和122或由SEQ ID NOS:113、117、118和122组成。这是用于逆转录酶65R和90M蛋白酶突变的正向引物混合物。该混合物可以进一步包括反向引物。例如，反向引物可以包括SEQ ID NOS:114、119和81或由SEQ ID NOS:114、119和81组成。

可用各种组合方式将另外的引物混合物(如上文所指的那些引物或引物混合物)组合用于在同步反应流程中多重检测多于一个突变。可在多重反应中组合上文所指的引物混合物的任意组合。正如一个非限制性实例，可在单个多重反应中组合用于突变L90M、M41L、K103N和T215Y的引物。在另一个非限制性实施方式中，在单个多重反应中将用于逆转录酶K65R、K103N和M184V突变的引物(单独地或进一步与用于K70E、K70R的引物组合)与用于蛋白酶L90M、I50V的引物或其组合进行组合。用于具体靶突变的引物混合物的说明性实例显示在表1和2中。

表1:用于多重反应的引物混合物的实例，其中将A组中所列的突变靶点中的一个与用于B组和任选地C、D、E和F组中的一个或多个突变的引物组合。

针对突变的引物:

在多重反应中组合涉及两栏或更多栏的每一个中所指的突变之一的一个突变特异性引物组

表2:用于多重反应的引物组合的具体实例。

针对突变的引物:

应理解，其它组合也是可能的并且被理解为本公开的部分。任何公开的引物、引物组、包括探针的组或以其他方式在本文描述的都任选地用于表1或2中所显示的组合。

多重反应任选地组合用于2个或更多个突变，任选地2、3、4、5、6、7、8或更多个突变的引物。这种分析任选地将扩增子长度缩短为200bp或者更少，以使背景荧光最小化并防止干扰重叠扩增子。通过调节非突变特异性引物位置来实现缩短扩增子长度，如本领域普通技术人员容易实现的。

检测任选地是通过与扩增产物特异性杂交的一种或多种探针或任选地使用DNA嵌入染料进行。可使用任何在本领域中用于检测PCR扩增产物的嵌入染料。在一些实施方式中，嵌入染料是EVAGREEN(Biotium美国专利号7,776,567)、SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-64、SYTO-82、PO-PRO-1(λex/em＝435/455nm)、BO-PRO-1(λex/em＝462/481nm)、YO-PRO-1(λex/em＝491/509nm)、TO-PRO-1(λex/em＝515/531nm)、SYTO-60和SYTO-62、美国专利申请公开号：2013/0052650中举例的其它染料和染料的组合等。用于前述商品名称的化学实体是本领域普通技术人员理解的。

在一些实施方式中，用可差异观察的染料分子对不同探针进行标记。例如，用第一标记物对用于检测第一突变特异性扩增子的探针进行标记，而用不同于第一标记物的第二标记物对用于检测不同于第一突变特异性扩增子的第二突变特异性扩增子进行标记。标记物任选地为荧光团，如荧光素。荧光标记物和如何将这些荧光标记物与寡核苷酸结合以及此类标记物的商业来源是本领域熟知的。

本文公开的混合物(和方法)可以利用用于除所示例的那些之外的正向或反向引物。发现所示例的突变非特异性正向或反向引物良好地起作用。然而，本方法中对突变非特异性正向或反向引物的需求代表常规设计和使用的突变非特异性正向或反向引物，并且其它突变非特异性正向或反向引物可以被常规制备和使用。期望突变非特异性正向或反向引物在自突变特异性正向或反向引物的约40到250个碱基以内，任选地200个碱基或更少。期望突变非特异性正向或反向引物定位在缺乏将阻碍结合的变化程度的稳定位置。突变非特异性正向或反向引物最有可能位于RT基因、蛋白酶基因或整合酶基因中，但根据对突变非特异性正向或反向引物定位的常规标准准确位置是可变的。

提供了包括探针的扩增混合物，用于实时PCR反应。因此，混合物可以包括正向引物、反向引物和探针。例如，提供包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，所述正向引物混合物扩增103N、65R、和70R突变并用于69T，其中所述混合物进一步包括具有SEQ IDNO:9、115、120、121或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以用于这些突变特异性PCR反应中任何一种的探针的实例。该探针还可以用于全复制PCR反应。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增41L突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NO:67所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增65R和67N突变并用于69T，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NO:68、115、116、120、121或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以用于这些突变特异性PCR反应中任何一种的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增70R突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NOS:9或67所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增181C和184V突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NO:32所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以用于这些突变特异性PCR反应中任意一种的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增215突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NOS:47、76或77所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以用于这些突变特异性PCR反应中的任何一种的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增蛋白酶30N突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NO:52所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增蛋白酶90M突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NOS:58或82所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增103N突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增181C突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NOS:86或87所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增184V突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NOS:86或87所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增整合酶138K突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NO:131或132所示的核苷酸的寡核苷酸。任选地分别以20％和80％的浓度百分比将SEQ ID NO:131和132的探针任选地组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增整合酶140S突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NO:131或132所示的核苷酸的寡核苷酸。任选地分别以20％和80％的浓度百分比将SEQ ID NO:131和132的探针任选地组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增整合酶155H突变，其中所述混合物进一步包括具有SEQ ID NOS:140或141所示的核苷酸的寡核苷酸。任选地分别以80％和20％的浓度百分比将SEQ ID NO:140和141的探针任选地组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增逆转录酶65R突变，其中所述混合物包括具有SEQ ID NOS:142和任选地118、119或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。将SEQ ID NO:120和121的探针任选地组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增逆转录酶70E突变，其中所述混合物包括具有SEQ ID NOS:143和任选地144所示的核苷酸的寡核苷酸。将SEQID NO:67的探针任选地组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增逆转录酶70R突变，其中所述混合物包括具有SEQ ID NOS:144和任选地72、73或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。将SEQ ID NO:67的探针任选地组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增蛋白酶70E突变，其中所述混合物包括具有SEQ ID NOS:143和任选地144所示的核苷酸的寡核苷酸。将SEQ IDNO:67、145或其组合的探针任选地组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增混合物，其扩增蛋白酶50V突变，其中所述混合物包括具有SEQ ID NOS:146和任选地147所示的核苷酸的寡核苷酸。将SEQ IDNO:148的探针任选地组合使用。

单重或多重反应中使用的探针任选地并入可检测部分——其与术语标记物的同义地使用。如本文使用的，术语“可检测部分”意指任何合适的标记物，其包括但不限于酶、荧光团、生物素、发色团、放射性同位素、着色颗粒、电化学、化学改性或化学发光部分。实例包括(i)可以催化发色或发光(荧光)反应的酶和(ii)荧光团。对可检测部分的检测可以是直接的，条件是可检测部分自身是可检测的，如例如在荧光团的情况下。可选地，对可检测部分的检测可以是间接的。后一种情况下，优选使用与可检测部分可反应的第二部分——其自身是可直接检测的。可检测部分可以是分子探针所固有的。常见的荧光部分包括：荧光素、氰蓝染料、香豆素、藻红蛋白、藻胆蛋白、丹磺酰氯、德克萨斯红和镧系络合物。

用于与核酸相互作用的引物或探针的大小可以是支持引物的期望酶操作(enzymatic manipulation)诸如DNA扩增或探针或引物的简单杂交的任何大小。典型的引物或探针可能是至少、少于或等于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68，69，70、71、72、7374，75，76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475，500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸长。指定数目之间的任何长度的引物或探针是具体考虑的。

用于逆转录酶基因、蛋白酶基因或整合酶基因的引物通常将用于生成扩增的DNA产物，所述DNA产物含有包含感兴趣突变(一个或多个)的相关位点(一个或多个)的逆转录酶基因、蛋白酶基因或整合酶基因的区域。一般而言，通常产物的大小将是这样的，大小可以准确确定为在3或2或1个核苷酸以内。产物可以是至少、少于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸长。

在本文所述的混合物和方法中，所描述的特异性探针仅仅是实例。将常规技术应用于本文的教导，则本领域人员可以考虑并作出另外的将在所描述的PCR组合物和方法中起作用的探针。

包括天然存在的核苷酸和磷酸二酯键的多核苷酸可以化学合成或者可以使用重组DNA方法、使用适当的多核苷酸作为模板生成。相比之下，包括核苷酸类似物或除磷酸二酯键之外的共价键的多核苷酸通常将以用化学方法合成，尽管酶诸如T7聚合酶可以将某些类型的核苷酸类似物并入多核苷酸中，并且因此可以用于从适当的模板中重组生产这种多核苷酸(Jellinek等，在上，1995)。

例如，核酸，如要用作引物的寡核苷酸，可以使用标准化学合成方法制成或者可以使用酶法或任何其它已知方法生成。这种方法的范围可以是从标准酶消化法随后进行核苷酸片段分离(例如，参见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEdition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)第5、6章，通过引用并入本文)到完全合成方法，例如，使用Milligen或Beckman系统1加(Plus)DNA合成仪(例如，Milligen-Biosearch,Burlington,MA的8700型自动合成仪或ABI 380B型)通过氰乙基亚磷酰胺方法。可用于制造寡核苷酸的合成方法同样由Ikuta等,Ann.Rev.Biochem.53:323-356(1984),(磷酸三酯和亚磷酸-三酯法)和Narang等,MethodsEnzymol.,65:610-620(1980)(磷酸三酯法)所描述。蛋白质核酸分子可以使用已知方法如Nielsen等,Bioconjug.Chem.5:3-7(1994)所描述的那些方法制成。

本文还公开了涉及(drawn to)可用于实施本文公开的方法的试剂的试剂盒。试剂盒可以包括本文讨论的或者可以被理解为在所公开方法的实施中需要或有益的任何试剂或试剂组合。例如，试剂盒可包括进行在方法的某些实施方式中讨论的扩增反应的引物以及按预期使用引物所需的缓冲液和酶。本文提供了关于试剂盒组分的具体指导，其包括缓冲液、引物和探针。例如，公开了用于检测HIV逆转录酶基因或蛋白酶基因中突变的试剂盒，其包括SEQ ID NOs:1-92、114-122或124-141所示的寡核苷酸中的一种或多种，或其任何部分。

为了更多的全面信息，在下文提供了HIV-1蛋白酶和HIV-1逆转录酶的编码序列的实例。还提供了这些及其它HIV-1蛋白酶和HIV-1逆转录酶编码序列的登录号。还提供了HIV-1逆转录酶和HIV-1蛋白酶的氨基酸序列的登录号。该信息连同有关HIV-1蛋白酶和逆转录酶蛋白质和编码序列的更多实例的序列信息都在本领域中。因此，它们构成了本申请公开内容的部分。

HIV-1B亚型基因组

登录号：NC_001802、K03455

HIV-1蛋白酶

示例性序列

1 cctcaggtca ctctttggca acgacccctc gtcacaataa agataggggg gcaactaaag

61 gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag aagaaatgag tttgccagga

121 agatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat

181 cagatactca tagaaatctg tggacataaa gctataggta cagtattagt aggacctaca

241 cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg actcagattg gttgcacttt aaatttt(SEQ ID NO:90)

基因组定位：1799..2095

其它相似的核苷酸实例：登录号：U31398、AJ279618、AJ279682、AJ279683、AJ279684

蛋白质：登录号：NP_705926

HIV-1逆转录酶

示例性序列

1 cccattagcc ctattgagac tgtaccagta aaattaaagc caggaatgga tggcccaaaa

61 gttaaacaat ggccattgac agaagaaaaa ataaaagcat tagtagaaat ttgtacagag

121 atggaaaagg aagggaaaat ttcaaaaatt gggcctgaaa atccatacaa tactccagta

181 tttgccataa agaaaaaaga cagtactaaa tggagaaaat tagtagattt cagagaactt

241 aataagagaa ctcaagactt ctgggaagtt caattaggaa taccacatcc cgcagggtta

301 aaaaagaaaa aatcagtaac agtactggat gtgggtgatg catatttttc agttccctta

361 gatgaagact tcaggaagta tactgcattt accataccta gtataaacaa tgagacacca

421 gggattagat atcagtacaa tgtgcttcca cagggatgga aaggatcacc agcaatattc

481 caaagtagca tgacaaaaat cttagagcct tttagaaaac aaaatccaga catagttatc

541 tatcaataca tggatgattt gtatgtagga tctgacttag aaatagggca gcatagaaca

601 aaaatagagg agctgagaca acatctgttg aggtggggac ttaccacacc agacaaaaaa

661 catcagaaag aacctccatt cctttggatg ggttatgaac tccatcctga taaatggaca

721 gtacagccta tagtgctgcc agaaaaagac agctggactg tcaatgacat acagaagtta

781 gtggggaaat tgaattgggc aagtcagatt tacccaggga ttaaagtaag gcaattatgt

841 aaactcctta gaggaaccaa agcactaaca gaagtaatac cactaacaga agaagcagag

901 ctagaactgg cagaaaacag agagattcta aaagaaccag tacatggagt gtattatgac

961 ccatcaaaag acttaatagc agaaatacag aagcaggggc aaggccaatg gacatatcaa

1021 atttatcaag agccatttaa aaatctgaaa acaggaaaat atgcaagaatgaggggtgcc

1081 cacactaatg atgtaaaaca attaacagag gcagtgcaaa aaataaccacagaaagcata

1141 gtaatatggg gaaagactcc taaatttaaa ctgcccatac aaaaggaaacatgggaaaca

1201 tggtggacag agtattggca agccacctgg attcctgagt gggagtttgttaatacccct

1261 cccttagtga aattatggta ccagttagag aaagaaccca tagtaggagcagaaaccttc

1321 tatgtagatg gggcagctaa cagggagact aaattaggaa aagcaggatatgttactaat

1381 agaggaagac aaaaagttgt caccctaact gacacaacaa atcagaagactgagttacaa

1441 gcaatttatc tagctttgca ggattcggga ttagaagtaa acatagtaacagactcacaa

1501 tatgcattag gaatcattca agcacaacca gatcaaagtg aatcagagttagtcaatcaa

1561 ataatagagc agttaataaa aaaggaaaag gtctatctgg catgggtaccagcacacaaa

1621 ggaattggag gaaatgaaca agtagataaa ttagtcagtg ctggaatcaggaaagtacta(SEQ ID NO:91)

基因组定位:2096..3775

其它相似的核苷酸实例：登录号:U28646，U28647，U28648，U28649，U53870，U53871

蛋白质：登录号：NP_705927

HIV-1C亚型基因组

登录号：AY162225，AY158533，DQ011180，DQ011173，AY049710

HIV-1蛋白酶

示例性序列

1 cctcaaatca ctctttggca gcgacccctt gtcacaataa aagtaggggg tcagataaag

61 gaggctctct tagatacagg agcagatgat acagtattag aagacataaa tttgccagga

121 aaatggaaac caaaaatgat aggaggaatt ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat

181 caaatactta tagaaatttg tggaaaaaag gctataggta cagtattagt gggacccaca

241 cctgtcaaca taattggaag aaatatgttg actcagcttg gatgcacact aaatttt(SEQ ID NO:92)

基因组定位：2215…2511

其它相似的核苷酸实例：登录号：AY510039，AY510043，AY589869。

蛋白质：登录号：AAR92431

HIV-1整合酶

示例性序列

1 fldgidkaqe ehekyhsnwr amasdfnlpp vvakeivasc dkcqlkgeam hgqvdcspgi

61 wqldcthleg kvilvavhva sgyieaevip aetgqetayf llklagrwpv ktihtdngsn

121 ftsatvkaac wwagikqefg ipynpqsqgv vesmnkelkk iigqvrdqae hlktavqmav

181 fihnfkrkgg iggysageri vdiiatdiqt kelqkqitki qnfrvyyrds rdplwkgpak

241 llwkgegavv iqdnseikvv prrkvkiird ygkqmagddc vasrqded(SEQ ID NO:123)

蛋白质登录号：AAC83493

HIV-1逆转录酶

示例性序列

1 CCAATTAGTCCYATTGAAAC TGTACCAGTA AAATTAAAGC CAGGGATGGA TGGCCCAAAG

61 GTCAAACAAT GGCCATTGAC AGAAGAAAAA ATAAAAGCAT TAATAGCAAT TTGTGAAGAG

121 ATGGAGAAGG AAGGAAAAAT TACAAAAATT GGGCCTGAAA ATCCATATAA CACCCCAGTA

181 TTTGCCATAA AAAAGAAGGA CAGTACTAAG TGGAGAAAAT TAGTAGATTT CAGGGAACTC

241 AATAAAAGAA CTCAAGACTT TTGGGAAGTT CAATTAGGGA TACCACACCC AGCAGGGTTA

301 AAGAAAAAGA AATCAGTAAC AGTACTGGAT GTGGGGGATG CATATTTTTC AGTTCCTTTA

361 GATAAAGACT TCAGAAAATA TACTGCATTC ACCATACCTA GTATAAACAA TGAGACACCA

421 GGGATTAGAT ATCAATATAA TGTGCTTCCA CAGGGATGGA AAGGATCACC ATCAATATTC

481 CAAAGTAGTA TGACAAAAAT CTTAGAGCCC TTTAGGGCAC AAAATCCAGA ATTGGTTATT

541 TATCAATATA TGGATGACTT GTATGTAGGA TCCGACTTAG AAATAGGGCA GCATAGAGCA

601 AAAATAGAGG AGTTAAGAAA ACATCTATTG AGGTGGGGAT TTACCACACC AGACAAGAAA

661 CATCAGAAAG AACCTCCATT TCTTTGGATG GGGTATGAAC TCCATCCTGA CAAATGGACA

721 GTACAGCCTA TAAAGCTGCC AGAAAAGGAT AGCTGGACTG TTAATGATAT ACAGAAGTTA

781 GTGGGAAAAC TAAACTGGGC AAGTCAGATT TACAAAGGGA TTAAAGTAAG GCAGCTGTGT

841 AGACTCCTTA GGGGAGCCAA AGCACTAACA GACATAGTAC CACTGACTGA AGAAGCAGAA

901 TTAGAATTGG CAGAGAACAG GGAAATTCTA AAAGAACCAG TACATGGAGT ATATTATGAC

961 TCA(SEQ ID NO:93)

基因组定位：2512…3477

其它相似的核苷酸实例：登录号：AY510056，AY510047，AY589935，AF468458

蛋白质：登录号：AAR92448

HIV-1D亚型基因组

登录号：AY322189，AY773341，AJ320484

HIV-1蛋白酶

示例性序列

1 CCTCAAATCA CTCTTTGGCA ACGACCCCTT GTCACAGTAA RGATAGGGGG ACAACTAAAG

61 GAAGCTCTAT TAGATACAGG AGCAGATGAT ACAGTATTGG AAGAAATGAA TTTGCCAGGA

121 AAATGGAAAC CAAAAATGAT AGGGGGAATT GGAGGCTTTA TCAAAGTAAG ACAGTATGAT

181 CAAATACTTG TAGAAATCTG TGGATATAAG GCTATAGGTA CAGTGTTAGT AGGACCTACA

241 CCTGTCAACA TAATTGGAAG AAATTTGTTG ACTCAGATTG GTTGCACTTT AAATTTT

(SEQ ID NO:94)

基因组定位：1719…2015

其它相似的核苷酸实例：登录号：AJ296664

蛋白质：登录号：CAC03695

HIV-1逆转录酶

示例性序列

1 CCAATTAGTC CTATTGAAAC TGTACCAGTA AAATTAAAGC CAGGGATGGA TGGCCCAAAA

61 GTTAAACAAT GGCCGTTAAC AGAAGAAAAA ATAAAAGCAC TAACAGAAAT TTGTACAGAA

121 ATGGAAAAGG AAGGAAAAAT TTCAAGAATT GGGCCTGAAA ATCCATACAA TACTCCAATA

181 TTTGCCATAA AGAAAAAAGA CAGTACTAAR TGGAGAAAAT TAGTAGATTT TAGAGAACTT

241 AATAAGAGAA CTCAAGACTT CTGGGAAGTT CAACTAGGAA TACCACATCC TGCAGGGCTA

301 AAAAAGAAAA AATCAGTAAC AGTACTGGAT GTGGGWGATG CATATTTTTC AGTTCCCTTA

361 TATGAAGACT TTAGAAAATA TACTGCATTC ACCATACCYA GTATAAATAA TGAGACACCA

421 GGAATTAGAT ATCAGTACAA TGTGCTTCCA CAAGGATGGA AAGGATCACC GGCAATATTT

481 CAAAGTAGCA TGACAAAAAT CTTAGAACCT TTTAGAAAAC AAAATCCAGA AATGGTGATC

541 TATCAATACA TGGATGATTT GTATGTAGGA TCTGACTTAG AAATAGGGCA GCATAGAATA

601 AAAATAGAGG AATTAAGGGA ACACTTATTG AAGTGGGGAT TTACCACACC AGACAAAAAG

661 CATCAGAAAG AACCCCCATT TCTTTGGATG GGTTATGAAC TCCATCCGGA TAAATGGACA

721 GTACAGCCTA TAAAACTGCC AGAAAAAGAA AGCTGGACTG TCAATGATAT ACAGAAGTTA

781 GTGGGAAAAT TAAATTGGGC AAGTCAGATT TATCCAGGAA TTAAAGTAAG ACAATTATGC

841 AAATGCATTA GGGGAGCCAA AGCACTGACA GAAGTAGTAC CACTGACAGAAGAAGCAGAA

901 TTAGAACTGG CAGAAAACAG AGAAATTCTA AAAGAACCAG TACATGGAGT GTATTATGAT

961 CCA(SEQ ID NO:95)

基因组定位：2016…2978

其它相似的核苷酸实例：登录号：AF388101

蛋白质：登录号：AAL84043

方法

提供了用于单独或同时特异性检测HIV中数个突变的方法。可以使用本文描述的方法检测HIV的逆转录酶、蛋白酶或整合酶中的突变。该方法是高度灵敏和特异的。描述了这种方法的具体实例。然而，应认识到，可以按常规实现使用公开的可选方法对例举方法的改变。任何来源的病毒RNA都可以用于本发明。此类RNA并不限于从血浆或血清中获得，还可以是未经包装的细胞内RNA。只要公开的引物中的任何一个与指定突变的突变特异性正向或反向引物(一种或多种)中的任何一个配对，就可以完成检测。下述方法描述了尤其达到灵敏水平检测的具体引物组。理解的是，本文描述的其它突变特异性引物同样适用。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中103N突变的方法，其包括(a)用选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6的引物逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1、2、4和5的引物组接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与反向引物和选自SEQ ID NOS:22、23、24和25以及SEQ ID NOS:59、60和61的引物组接触，以扩增含有103N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的用于这种选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:26或由SEQID NO:26组成的引物。在所公开的方法中，在全复制PCR反应中的信号检测之后，一定数量循环内的扩增信号的存在指示各自突变的存在。该方法——与RNA模板一起使用——检测B亚型和C亚型的任一种或两者中的103N突变。SEQ ID NOS:4和5是用于C亚型的正向RT-PCR(用于RNA)和初级PCR(用于DNA)引物。SEQ ID NO:4包括蛋白酶序列，而SEQ ID NO:5仅用于逆转录酶。SEQ ID NOS:1和2是用于B亚型的正向RT-PCR(用于RNA)和初级PCR(用于DNA)引物。SEQ ID NO:1包括蛋白酶序列，而SEQ ID NO:2仅用于逆转录酶。

实施例中描述了用于以RNA起始的检测方法的RT-PCR(步骤(a)和(b))和次级PCR(步骤(c))的细节。在这些方法的步骤(c)中，使用一组至少包括引物对的引物，所述引物对包括反向引物和公开的用于各自突变的正向引物中的一种。在以RNA起始的方法的步骤(b)中，扩增逆转录酶和蛋白酶两者的选择由包括蛋白酶的示例性初级PCR正向引物和仅用于逆转录酶的示例性初级正向引物提供。

用于所公开方法中的RT-PCR反应或初级PCR反应的公开的每种正向引物独立地起作用。如果要完成蛋白酶分析，则必须将F1引物用于RT-PCR或初级PCR步骤。可以单独从F2+反向引物产物进行逆转录酶分析(F2引物比F1引物略微更敏感，因此可以提供给使用者更灵敏的测试)。在以RNA起始的方法的步骤(b)中，在步骤(a)的反应产物中保留有反向引物。

本方法的RT步骤可以利用除所描述的之外的RT引物。唯一的要求是，该引物在逆转录酶基因的相关区域或在蛋白酶基因或二者中生成模板。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中103N突变的另外的方法，其包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1、2、4和5的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:22、23、24和25以及SEQ ID NOS:59、60和61的引物组接触，以扩增含有103N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的用于这种选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成的引物。该方法——与DNA模板一起使用——检测B亚型和C亚型的任一种或两者中的103N突变。

实施例中描述了用于以DNA起始的检测方法的初级PCR和次级PCR步骤的细节。在这些方法的步骤(b)中，使用一组至少包括引物对的引物，所述引物对包括反向引物和公开的用于各自突变的正向引物中的一种。在以DNA起始的方法的步骤(a)中，扩增逆转录酶、蛋白酶和整合酶的选择是由包括蛋白酶的示例性初级PCR正向引物和用于逆转录酶的示例性正向引物以及仅用于整合酶的正向引物提供。所公开的用于以DNA起始的方法中的初级PCR反应的每种正向引物独立地起作用。因此，仅RT的引物和包括蛋白酶的引物可以单独与反向引物一起使用。如果要完成蛋白酶分析，则必须将F1引物用于RT-PCR或初级PCR步骤。可以单独从F2+反向引物产物进行逆转录酶分析(F2引物比F1引物略微更为敏感，因此可以提供给使用者更灵敏的测试)。

提供了用于实时PCR反应的包括探针的扩增方法。因此，该方法可以包括正向引物、反向引物和探针的使用。例如，提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增蛋白酶90M和逆转录酶103N、65R和70R突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ IDNO:9所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以用于这些突变特异性PCR反应中任何一种的探针的实例。该探针还可以用于全复制PCR反应。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型184V突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:33,34和35的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型184V突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:36或由SEQ ID NO:36组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型184V突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:33、34和35的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型184V突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:36或由SEQ ID NO:36组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型181C和B亚型184V突变，其中该方法进一步包括使用具有SEQ ID NO:32所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以用于这些突变特异性PCR反应中任何一种的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型41L突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:62、63、64和65的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型41L突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:66或由SEQ ID NO:66组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型41L突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:63、96、97、64和65的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型41L突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:66或由SEQ ID NO:66组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型41L突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:62、63、64和65的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型41L突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:66或由SEQ ID NO:66组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型41L突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:63、96、97、64和65的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型41L突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:66或由SEQ ID NO:66组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型41L突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NO:67所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型65R突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NO:10的引物和反向引物接触，以扩增含有B亚型65R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型65R突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NO:98的引物和反向引物接触，以扩增含有B亚型65R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型65R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NO:10的引物和反向引物接触，以扩增含有B亚型65R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQID NO:11或由SEQ ID NO:11组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型65R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NO:98的引物和反向引物接触，以扩增含有B亚型65R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQID NO:11或由SEQ ID NO:11组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型65R突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NO:9、68或99所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中AE亚型65R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成通用的(普通，common)DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DNA与包括SEQ ID NO:113的引物和反向引物接触，以扩增含有AE亚型65R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:114或由SEQ ID NO:114组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型65R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生产通用的DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DNA与包括SEQ ID NOs:117和118的引物和反向引物接触，以扩增含有C亚型65R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:119或由SEQ ID NO:119组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型65R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成通用的DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DNA与包括SEQ ID NOs:117、118和122的引物和反向引物接触，以扩增有C亚型65R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:119或由SEQ ID NO:119组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型65R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成通用的DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DNA与包括SEQ ID NO:142的引物和反向引物接触，以扩增含有C亚型65R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:118、119或其组合或由SEQ ID NO:118、119或其组合组成的引物。探针任选地用于接触该扩增产物。探针任选地包括SEQ ID NOs:120、121或由SEQ ID NOs:120、121组成，或者使用这种探针的组合。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增AE亚型65R突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:115、116或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增C亚型65R突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:120、121或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型67N突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:69和70的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型67N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型67N突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:69和70的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型67N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型67N突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NO:68所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型69T的方法，包括(a)用包括SEQ ID NO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQID NOS:12和13的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型69T的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:14或由SEQ ID NO:14组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型69T的方法，包括(a)用包括SEQ ID NO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQID NOS:12和71的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型69T的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型69T的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQ IDNOS:12和13的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型69T的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQID NO:14或由SEQ ID NO:14组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型69T的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQ IDNOS:12和71的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型69T的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型69T，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:9或68所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型70R突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:16、17、18和19的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型70R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:20或由SEQ ID NO:20组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶B亚型70R突变中的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NO:2的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型70R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NOS:72和73或由SEQ ID NOS:72和73组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型70R突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NO:100的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型70R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NOS:72和73或由SEQ ID NOS:72和73组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型70R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:16，17，18和19的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型70R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:20或由SEQ ID NO:20组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型70R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NO:2的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型70R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQID NOs:72和73或由SEQ ID NOs:72和73组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型70R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NO:100的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型70R突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和在别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NOS:72和73或由SEQ ID NOS:72和73组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型70R突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NO:72、73或二者的引物组和正向引物接触，以扩增含有B亚型70R突变的HIV-1DNA。正向引物通常是基于在本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，正向引物可以是包括SEQ ID NO:144或由SEQ ID NO:144组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中70E突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQ ID NO:143的引物组和正向引物接触，以扩增含有70E突变的HIV-1DNA。正向引物通常是基于在本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，正向引物可以是包括SEQ ID NO:144或由SEQ ID NO:144组成的引物。任选地，探针用于检测扩增产物。探针任选地由SEQ ID NO:145的核苷酸序列组成或包括SEQ ID NO:145的核苷酸序列。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型70R突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NO:9或67所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型103N突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:22、23、24和25的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型103N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型103N突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:22、23、24和25的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型103N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型103N突变，其中所述方法进一步包括使用具有EQ ID NO:9所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型181C突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:28和29的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型181C突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型181C突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOs:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:28和29的引物组和反向引物接触，以扩增含有B亚型181C突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型181C突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NO:32所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型215T突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2或SEQ ID NOS:74和75或SEQ ID NOS:101和75的引物接触，以生成DNA产物；(c)使步骤(b)的DNA产物与反向引物和选自SEQ ID NOS:38和39的引物接触，以扩增含有B亚型215突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型215突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；(c)使步骤(b)的DNA产物与反向引物和选自SEQ ID NOS:40、41、42、43和44的引物接触，以扩增含有B亚型215突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中B亚型215突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:40、41、42、43和44的引物接触，以扩增含有B亚型215突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的引物。

在检测B亚型215位置处的突变的本方法中，可以检测Y、F、S、C或D突变的任一种或全部。因此，为了检测该位置持的任何突变，正向引物可以在反应混合物中一起使用。为了检测特异性突变，可单独使用那种突变的正向引物。可以通过使用公开的正向引物的期望亚型(subset)来识别215处的突变的具体组合。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增B亚型215突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:47、76或77所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1B亚型蛋白酶中30N突变的方法，包括(a)用包括SEQ ID NO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQID NOS:48和49的引物组和反向引物接触，以扩增含有30N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQID NO:50或由SEQ ID NO:50组成的引物。

提供了用于检测HIV-1B亚型蛋白酶中30N突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQ IDNOS:48和49的引物组和反向引物接触，以扩增含有30N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ IDNO:50或由SEQ ID NO:50组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增HIV-1B亚型的蛋白酶30N突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NO:52所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1B亚型蛋白酶中50V突变的方法，包括(a)用包括SEQ ID NO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)任选地使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(a)或(b)的DNA产物与包括SEQ ID NO:146的引物组和反向引物接触，以扩增含有30N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:147或由SEQ ID NO:147组成的引物。探针任选地用于检测扩增产物。探针任选地由SEQ ID NO:148核苷酸序列组成或包括SEQ ID NO:148核苷酸序列。

提供了用于检测HIV-1B亚型蛋白酶中90M突变的方法，包括(a)用包括SEQ ID NO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQID NOS:53、54和55的引物组和反向引物接触，以扩增含有90M突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和北辰描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:56或由SEQ ID NO:56组成的引物。

提供了用于检测HIV-1B亚型蛋白酶中90M突变的方法，包括(a)用包括SEQ ID NO:3的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQID NOS:55、78、79和80的引物组和反向引物接触，以扩增含有90M突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:81或由SEQ ID NO:81组成的引物。

提供了用于检测HIV-1B亚型蛋白酶中90M突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQ IDNOS:53、54和55的引物组和反向引物接触，以扩增含有90M突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQID NO:56或由SEQ ID NO:56组成的引物。

提供了用于检测HIV-1B亚型蛋白酶中90M突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQ IDNOS:55、78、79和80的引物组和反向引物接触，以扩增含有90M突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:81或由SEQ ID NO:81组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增蛋白酶90M突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:58或82所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型103N突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:6的引物逆转录提取自HIV-1的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:3和4的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:59、60和61的引物组和反向引物接触，以扩增含有C亚型103N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型103N突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:59、60和61的引物组和反向引物接触，以扩增含有C亚型103N突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:26或由SEQ ID NO:26组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增C亚型103N突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸的寡核苷酸。这是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型181C突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:6的引物逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:3和4的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:83和84的引物组和反向引物接触，以扩增含有C亚型181C突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型181C突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:3和4的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:83和84的引物组和反向引物接触，以扩增含有C亚型181C突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增C亚型103N突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:86或87所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型184V突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:6的引物逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:3和4的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:88和89的引物组和反向引物接触，以扩增含有C亚型184V突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型184V突变的方法，包括(a)用包括SEQ IDNO:6的引物逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:3和4的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:102、103和104的引物组和反向引物接触，以扩增含有C亚型184V突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型184V突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:88和89的引物组和反向引物接触，以扩增含有C亚型184V突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中C亚型184V突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQID NOS:102、103和104的引物组和反向引物接触，以扩增含有C亚型184V突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增C亚型184V突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:86或87所示的核苷酸的寡核苷酸。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1整合酶中138K突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:126和129的正向引物接触，以生成通用的DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DNA与包括SEQ ID NOS:133的突变特异性正向引物和反向引物接触，以扩增含有整合酶138K突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:130或由SEQ ID NO:130组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增整合酶138K突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:131、132或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。SEQ ID NOS:131和132的寡核苷酸任选地分别以20％和80％的浓度百分比组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1整合酶中140S突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和正向选自SEQ ID NOS:126和129的正向引物接触，以生成通用的DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DNA与包括SEQ ID NO:134的突变特异性正向引物和反向引物接触，以扩增含有整合酶140S突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的众所周知的此类选择的标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:130或由SEQ ID NO:130组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增整合酶140S突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:131、132或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。SEQ ID NOS:131和132的寡核苷酸任选地分别以20％和80％的浓度百分比组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1整合酶中155H突变的方法，包括(a)使DNA与正向引物和选自SEQ ID NOS:124和129的反向引物接触，以生成通用的DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DN与包括SEQ ID NO:137的突变特异性反向引物和正向引物接触，以扩增含有整合酶155H突变的HIV-1DNA。正向引物通常是基于在本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:126或由SEQ ID NO:126组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增整合酶155H突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:140、141或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。SEQ ID NO:140和141的寡核苷酸任选地分别以80％和20％的浓度百分比组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1整合酶中148R突变的方法，包括(a)使DNA与正向引物和选自SEQ ID NOS:124和125的反向引物接触，以生成通用的DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DNA与包括SEQ ID NOS:138的突变特异性反向引物和正向引物接触，以扩增含有整合酶148R突变的HIV-1DNA。正向引物通常是基于在本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:126或由SEQ ID NO:126组成的引物。

提供了包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增整合酶148R突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:140、141或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。SEQ ID NO:140和141的寡核苷酸任选地分别以80％和20％的浓度百分比组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于检测HIV-1整合酶中148H突变的方法，包括(a)使DNA与正向引物和选自SEQ ID NOS:124和125的反向引物接触，以生成通用的DNA扩增产物；和(b)使步骤(a)的DNA与包括SEQ ID NOS:139的突变特异性反向引物和正向引物接触，以扩增含有整合酶148H突变的HIV-1DNA。正向引物通常是基于在本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:126或由SEQ ID NO:126组成的引物。

提供包括正向引物或正向引物混合物的扩增方法，其扩增整合酶148H突变，其中所述方法进一步包括使用具有SEQ ID NOS:140、141或其组合所示的核苷酸的寡核苷酸。SEQ ID NO:140和141的寡核苷酸任选地分别以80％和20％的浓度百分比组合使用。这些是可以在突变特异性PCR反应中使用用于该突变的探针的实例。

提供了用于扩增HIV-1逆转录酶的方法，包括(a)用包括SEQ ID NO:3的引物逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ IDNOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NO:7的引物和反向引物接触，以扩增编码HIV-1逆转录酶的区域。反向引物通常根据本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的引物。这可以是本发明的标准扩增方法。全复制反应可以用于为本文公开的突变特异性实时PCR反应提供基准。可选地，配对的野生型引物可以用作对照，如本领域技术人员已知的。

提供了用于扩增HIV-1逆转录酶的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ IDNOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQ ID NO:7的引物和反向引物接触，以扩增编码HIV-1逆转录酶的区域。反向引物通常根据本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的引物。

本文公开的扩增方法可以利用除所例证的那些之外的反向引物。发现所例证的反向引物良好地起作用。然而，本方法中对反向引物的需求代表常规设计和使用的反向引物，而其它反向引物可以按常规制备和使用。期望的是，反向引物将为来自(在，from)正向引物的约40至250个碱基之内。还期望，反向引物将定位于稳定的位置，所述位置缺少阻碍结合的变化程度。反向引物最有可能位于RT基因或蛋白酶基因中，该确切位置基于反向引物定位的常规标准通常是可变化的

本文公开的方法可以进一步包括在同一混合物中检测指定的RT突变、指定的蛋白酶突变和/或指定的整合酶突变。本文描述的方法根据使用者对检测一种或多种HIV-1序列中一个或多个突变的要求是可互换并可组合的。例如，提供了用于检测HIV-1逆转录酶中184V突变和HIV-1蛋白酶中90M突变的方法，其包括(a)用包括SEQ ID NO:3的引物逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成逆转录反应产物；(b)使步骤(a)的逆转录产物与选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以生成DNA产物；和(c)使步骤(b)的DNA产物与包括SEQ ID NOS:33、34、35、55、78、79和80的引物组和反向引物接触，以扩增含有184V和90M突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NOS:36和81或由SEQ ID NOS:36和81组成的引物。

提供了用于检测HIV-1逆转录酶中184V突变和HIV-1蛋白酶中90M突变的方法，包括(a)使DNA与反向引物和选自SEQ ID NOS:1和2的引物接触，以扩增DNA；和(b)使步骤(a)的扩增DNA与包括SEQ ID NOS:33、34、35、55、78、79和80的引物组和反向引物接触，以扩增含有184V和90M突变的HIV-1DNA。反向引物通常根据本文和别处描述的此类选择的熟知标准而选择。例如，反向引物可以是包括SEQ ID NOS:36和81或由SEQ ID NOS:36和81组成的引物。

与实时(或动态)PCR相关的各种技术已经适用于进行点突变和SNP检测。使用实时扩增的突变检测依赖于它们在扩增反应过程时检测核酸扩增片段的能力。存在三种基础实时检测方法：(ⅰ)双链DNA特异性染料结合的荧光增加，(ⅱ)在扩增过程中荧光猝灭降低，以及(iii)在扩增过程中荧光能量转移增加(Wittwer,C等.Biotechniques 22:130-138,1997)。所有这些技术都是基于非凝胶的，并且每种策略都被公开。

已知多种染料响应于结合双链DNA表现出增加的荧光。通过染料(如溴化乙锭或Syber Green)结合到累积的PCR产物时其增加的荧光进行连续监测野生型或含有突变的PCR产物的产生。注意，染料结合对PCR产物的序列没有选择性，并且高非特异性背景可以随着该技术一起产生错误信号。

用于实时PCR的第二种检测技术——通常称为核酸外切酶引物(如

探针)——利用热稳定性聚合酶的5'核酸外切酶活性如Taq来切割存在于扩增反应中的双标记探针(Wittwer,C等，Biotechniques 22:130-138,1997；Holland,P等，PNAS 88:7276-7280,1991,其通过引用并入本文)。当与PCR产物互补时，用于该分析的探针与PCR引物不同，并且用能够发荧光的分子和能够淬灭荧光的分子进行双重标记。当探针完整时，DNA探针内荧光信号的分子内猝灭导致信号很小。当荧光分子在扩增过程中被聚合酶的核酸外切酶活性释放时，猝灭大大降低，从而导致荧光信号增加。

实时PCR的另一种形式也通过使用连接的(tethered)淬灭部分利用荧光分子的分子内淬灭。分子信标技术利用与内部猝灭荧光团一起的发夹分子，其荧光通过结合到感兴趣DNA靶点恢复(Kramer,R等，Nat.Biotechnol.14:303-308,1996,其通过引用并入本文)。分子信标探针与累积中的PCR产物结合的增加可以用于特异性检测存在于基因组DNA的SNPs。

用于实时检测点突变和SNP的最终、常规荧光检测策略与称为荧光共振能量转移(FRET)的方法结合利用称为杂交探针的合成DNA片段(Wittwer,C.等，Biotechniques 22:130-138,1997；Bernard,P.等，Am.J.Pathol.153:1055-1061,1998,其通过引用并入本文)。该技术依赖于对靶序列上标记的DNA探针的独立结合。靶序列上的两种探针的接近增加了从一个探针到另一个的共振能量转移，导致独特的荧光信号。由干扰探针中的任一个结合的SNP引起的错配可用于检测存在于DNA样品中的突变序列。

两种核酸分子之间选择性杂交的参数是本领域技术人员熟知的。例如，在一些实施方式中，选择性杂交条件可被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格程度受杂交步骤和洗涤步骤中的任一个或两者的温度和盐浓度控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可包括在Tm(一半分子与其杂交伙伴分离的解链温度)以下约12-25℃温度下在高离子强度溶液(6×SSC或6×SSPE)中的杂交，随后所选的温度和盐浓度的组合下洗涤，使得洗涤温度为在Tm以下约5℃至20℃。温度和盐条件容易在前期实验中根据实际经验确定，其中固定在过滤器上的参考DNA的样品与感兴趣的标记核酸杂交，然后在不同严格性的条件下洗涤。杂交温度通常对DNA-RNA和RNA-RNA杂交而言是较高的。可以按上面的描述使用该条件以达到严格程度，或者如本领域已知的。(Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989；Kunkel等，Methods Enzymol.1987:154:367,1987，通过引用至少与核酸杂交相关的材料并入本文，其全部并入本文)。DNA:DNA杂交的优选严格杂交条件可以是在约68℃(水溶液中)在6×SSC或6×SSPE中，随后在68℃下进行洗涤。如果需要，当所需互补程度降低时，可以相应地降低杂交和洗涤的严格程度，并进一步，取决于其中可变性被搜索的任何区域的G-C或A-T丰富度。同样地，如果需要，当所需同源性增加时，可以相应地增加杂交和洗涤的严格程度，并进一步，取决于其中期望高同源性的任何区域的G-C或A-T丰富度，所有都是本领域已知的。

本文描述了涉及常规生物技术的方法。这种技术通常是本领域公知的，并在方法论文中进行了详细描述，如分子克隆：实验室手册，第3版，1-3卷，Sambrook等人编，冷泉港实验室出版社冷泉港，纽约，2001；分子生物学通用方法，Ausubel等人编,GreenePublishing and Wiley-Interscience,纽约，1992(定期更新)；和Short Protocols inMolecular Biology,Ausubel等人编,52版,Wiley-Interscience，纽约，2002。例如，在免疫学实验指南，Coligan等人编,John Wiley&Sons，纽约，1991；以及免疫学分析方法，Masseyeff等人编，John Wiley&Sons，纽约，1992，中描述了免疫学方法(例如，抗原特异性抗体的制备、免疫沉淀和免疫印迹)。

通过以下非限制性实施例对本发明的各个方面进行说明。这些实施例仅用于说明目的，并不是对本发明任何实践的限制。应当理解，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出变化和修改。

实施例

提出以下实施例以提供给本领域普通技术人员如何制得或评估本文要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的全面公开及描述，并且意图对本发明的纯粹示例且不意图限制发明人视其发明的范围。已作出努力确保对于数值(如数量、温度等)而言的精确，但应考虑一些误差及偏差。除非另有指示，否则份数是按重量计份，温度是℃或者是环境温度，并且压力是处于或接近大气压。

实施例1:

本实施例描述了针对HIV-1逆转录酶(RT)中103N和184V突变的基于实时PCR的点突变分析的开发和应用。分析测量了全复制和靶向感兴趣密码子的突变特异性反应的差异扩增。在评估野生型质粒背景中稀释的含有突变的质粒时，分析能够分别达到0.04％和0.2％的103N和184V的突变检测极限。为了用临床样品评估这些分析的性能，首先对77个已知的野生型样品进行分析。没有野生型样品对184V突变呈阳性，而一个样品(1.3％)对于103N打分为阳性。相反地，在已知具有携带103N突变和/或184V突变的病毒的血浆样品中，55个阳性样品中的54个检测出103N(98％)，并且67个中的65个检测出184V(97％)。为确定任何含有含突变的样品是否通过常规序列分析都未被检测出，将本分析应用于被证明为具有除103N和184V以外的RT突变的HIV-1阳性未治疗的人群的测试群体。103N分析在先前发现无103N的165个血浆样品中检测出4个阳性样品(2.4％)(克隆目前正在经低水平突变体存在的筛选)。同样地，在先前确定为对184V突变呈阴性的173个样品中，通过该分析，三个样品打分为对184V呈阳性(1.1％)。两个之后通过克隆序列分析被证实具有突变(以1.4％和5.5％的频率)。数据表明，当前使用的序列分析未能检测出以少数种类(形式，species)存在于临床样品中的抗性HIV-1。数据还表明，用于检测103N和184V突变的这些实时PCR分析是敏感且特异的。考虑到低成本、高通量性能以及比常规测试高的灵敏度，这些分析将适用于检测抗药性相关的突变并且可以帮助HIV-1感染的临床管理。

临床样品

从23位未治疗的人群(没有可检测的抗性突变)的血浆和在开发抗逆转录病毒药物之前、80年代早期收集的54份血清获得野生型HIV-1B亚型样品。通过序列分析证实67个样品具有携带突变的病毒——包括突变阳性样品。测试群体包括第二组173位未治疗的患者(在2中部分涉及，partially referenced in 2)，都具有除103N或184V以外的RT突变。大约17％的未治疗样本来自被证明为近期感染的人群。从对野生型和确认突变的样品评估中获得的结果用于限定分析截断值(cutoffs)截断。

逆转录酶-PCR

从患者血浆或血清中提取HRV-1基因组RNA(Qiagen UltraSens RNA试剂盒)。使用界定前半段RT序列的引物通过逆转录酶-PCR生成HIV-1模板的初级扩增，或者当需要时，正向引物移动在上游以还包括整个蛋白酶区域。这些反应可以成功扩增的最低拷贝数分别为5和10个RNA拷贝。

实时PCR

使用带有全复制探针的HIV-1RT全复制引物确定测试样品中病毒拷贝的基线测量(图1A)。使用补偿引物结合位点中多态变化的引物混合物进行用于检测突变存在的初步分析。103N特异性混合物并入四种不同的引物，而184V特异性反应使用三种引物。引物可以以最佳比例进行混合，以平衡引物亲和力中的差异。下面提供了这种比例的实例。应认识到，考虑到引物和引物的混合物本身的教导，引物比例的优化是常规的。技术人员可以考虑可选比例。

突变特异性引物被设计以使退火对突变核苷酸(一个或多个)的特异性最大化，从而具有对野生型序列(3、4)的降低的亲和力。用于每个反应的探针经FAM5'标记和用QSY-7淬灭。荧光团和猝灭剂的选择可被常规改变。常见的荧光团包括HEX、ROX、德克萨斯红、TAMRA、JOE、Cy3、Cy5、SYBR和VIC。存在通常与上述光谱重叠的其它荧光团并且可以使用。Bio-Rad荧光团表包括可以用于该方法的更完整的荧光团列表。

链延伸过程中荧光探针的降解将荧光团从猝灭剂的附近除去，并产生荧光信号，被报告为相对荧光单位(RFU)，其随每次扩增循环而增加(图1B)。荧光发射超过软件衍生的阈值时的循环数被称作循环阈值(CT)并且是比较全复制和突变特异性反应的扩增水平的差异(ΔCT)的测量单位。

使用iCycler实时PCR系统(Bio-Rad)和AmpliTaq Gold聚合酶(AppliedBiosystems)进行所有反应。任何热启动聚合酶将在该方法中起作用。它们之间的差异在于它们从错配引物延伸的能力。为每一种聚合酶建立分析截断值(cutoffs)。其他可用的聚合酶包括但不限于AmpliTaq Platinum(Applied Biosystems)和ITAQ(Bio-Rad公司)。在50℃进行PCR退火15秒，在60℃下延伸30秒(详见下面的PCT程序)。使用用于突变的单独引物对刚超出截断值(<2CT)的样品再次进行分析，以增加测试的灵敏度。

分析灵敏度

针对含有突变的质粒克隆的稀释物和从来自实验室适应的HIV-1以及掺入野生型病毒模板背景的源自患者的突变病毒的PCR产物测试分析检测限。突变体输入量占总病毒群体的100％-0.001％。

HIV实时PCR点突变分析方案

I.样品制备

分别从100-1000μL血浆提取病毒RNA或从～7.5×10⁵细胞中提取原病毒DNA(Qiagen Ultrasensitive ViralAmp或Promega Wizard Genomic DNA试剂盒)

II.对于RNA模板

初级(常规)RT-PCR–

每RT-PCR使用5μL提取的RNA如下：

(RT步骤)-

每个反应，将5μL RNA加至总计为40：1的试剂，制备如下：

*在添加核糖核酸酶抑制剂和RT之前，在94℃下加热等分试样中的RNA 2

分钟，然后立即放在冰上。

(PCR步骤)-

将全部RT反应物加至60:l PCR混合物，每个反应制备如下:

PCR对照(两份):1)水＝空白,

2)未受感染的人DNA＝(-),

3)质粒以1000拷贝/rxn掺入(spiked in)人DNA＝(+),或者10⁵→10²/10μL质粒拷贝系列用于定量(另见IV.)。

III.对于DNA模板

初级(常规)PCR-

每个反应，将10:l DNA(较高浓度的模板增加遭受抗性原病毒的可

能性)加至总计100:l的试剂，制备如下:

在实时PCR反应之前可将100μL初级PCR反应物稀释(1:10-1:20)，以确保次级反应的模板不过载并为进一研究提供足够的模板。

IV.突变特异性(次级)实时PCR

原理—用荧光团和猝灭剂标记的序列特异性探针退火至位点-特异性引物的侧翼区域。从引物的PCR延伸使从荧光团附近释放猝灭剂的介入探针降解，从而增加可检测荧光的水平。扩增循环——在该循环，产物水平(即，降解探针的数量)可测量为在背景以上——为循环阈值(TC)。该值与起始模板的量直接相关并且是在扩增水平之间进行比较时的测量单位。

程序-

将2μL每种初级反应物用于全复制和突变特异性热启动实时PCR的二重反

应。通过下列反应参数中的一个或两者为每个次级反应做准备：

突变特异性测试(c)可以是定性的，通过仅使用1000拷贝引物阳性对照与通用(全复制)引物(b)进行比较，或者是定量的，通过使用野生型和包含突变的质粒拷贝数稀释系列。可以在没有单独的独立于突变(mutation-independent)(mi)的测试或与单独的独立于突变(mi)的测试(d)结合的情况下进行定量，通过将突变反应的CT与互补于共有重叠序列(即，相同的基因座)的引物的CT(例如，mi引物的，参见下面的引物列表)比较进行定量。

质粒标准可以被制备并等分为40-循环的反应物，其中2μL用于在每个次级反应板中的拷贝标准。

相对于伴随的全复制(或野生型)反应，对所有突变特异性PCR进行评估，差为ΔCT。具有低于实验获得的截断值的ΔCT的突变特异性反应打分为阳性。

本发明的优势在于来自世界各国的各种HIV亚型的检测灵敏度。例如，引物组中公开的以下组对跨越HIV谱的HIV亚型的检测尤为敏感。

ReTi-HIV分析寡核苷酸列表:

^a用于RT-PCR反应的引物:

以下引物用于所列突变。针对每种突变的所有正向引物可以混合用于一般监测测试，或者引物可以单独使用或混合使用，并且匹配用于检测/监测与该突变相关联的不同多态性。使用该领域通常实行的最优方法可以常规地调整这些混合物示例引物比例。

IUPAC代码:M＝A或C；R＝A或G；W＝A或T；S＝C或G；Y＝C或T；K＝G或T

注意:FAM＝6-羧基荧光素，但是，可使用任何荧光团；“”标记是猝灭的所在位置。

#67和69REV与通用REV(comREV)引物相同

§反方向进行的测试，其中反向引物检测突变

&对野生型密码子(不存在突变)进行测试

与41L探针相同

￡与RT-PCR引物RTPF2相同

整合酶

(引物和探针)

HIV-IN GEN.3F,GTG ATA AAT GTC ARY TAA AAG GRG AAG C(SEQ ID NO:124)用于RT-PCR

HIV-IN GEN.3R,CTT TCC AAA STG GRT CTC TGC TG:(SEQ ID NO:125)用于RT-PCR

HIV-IN GEN.4F,CAT GGA CAA GTA GAC TGT AGY CCA(SEQ ID NO:126)：用于通用反应和148以及155突变的正向引物。

HIV-IN SEQ.3R,GTC CCT GTA ATA AAC YCG AAA ATT TTG(SEQ ID NO:127)：测序

HIV-IN GEN.4R,CTY TRG TYT GTA TGT CTG TTG CTA TYA TG(SEQ ID NO:128)：用于巢式PCR

HIV-IN COM.1BR,CAG CYT GMT CTC TTA CYT GTC CTA(SEQ ID NO:129):与GEN.4F一起用于通用反应

HIV-IN 138.1R,CTA YTA TTC TTT CYC CTG CAC TGT A(SEQ ID NO:130):对于138和140突变为反向

HIV-B-IN 138.2P,TCA AGC TGA ACA TC“T”YAA RAC AGC AGT ACA RAT GGC(SEQID NO:131):

HIV-B-IN 138.1P,TCA GGC TGA ACA TC“T”YAA RAC AGC AGT ACA RAT GGC(SEQID NO:132):用于138和140突变的138探针

HIV-B IN 138K.1F,GTG GGC RGG RAT CAA RCT GA(SEQ ID NO:133)

HIV-B IN 140S.1F,GGC RGG RAT CAA GCA GRA ATC TA(SEQ ID NO:134)

HIV-B-IN SEQ.3F,GTA GCC AGT GGA TAY ATA GAA GCA G(SEQ ID NO:135)：测序

HIV-IN SEQ.3R,GTC CCT GTA ATA AAC YCG AAA ATT TTG(SEQ ID NO:136)：测序

HIV-B-IN 155H.1R,ACC TGT CCT ATA ATT TTC TTT AAT TCY TTC TG(SEQ IDNO:137)

HIV-B-IN 148R.1R,CTT TAT TCA TAG ATT CTA CTA CYC GTC(SEQ ID NO:138)

HIV-B-IN 148H.2R,CTT TAA TTC TTT ATT CAT AGA TTC TAC TAC YCG A(SEQ IDNO:139)

HIV-B IN COM.4.3P,TCT TAA AAT“T”AG CAG GAA GAT GGC CAG TRA MAA CAATAC ATA C(SEQ ID NO:140)

HIV-B IN COM.4.4P,TTT TAA AAC“T”AG CAG GAA GAT GGC CAG TRA MAA CAATAC ATA C(SEQ ID NO:141)

通用(普通，common)探针(COM probes)用于通用(普通，common)反应和148和155突变测试。

应理解，在引号中标记的核苷酸(如“T”)任选地结合猝灭分子。探针任选地用荧光团在5’核苷酸处进行标记，所述荧光团与猝灭分子匹配。

猿免疫缺陷病毒(SIV)与人HIV感染的临床、病理、病毒学和免疫学具有强的相似之处。猕猴感染SIV为探索与HIV感染的发病机理和预防相关的关键性问题提供了有价值的模型。该模型为突变检测测试、药物的临床前评估、抗HIV疫苗和基因疗法提供了独特的环境，并且可以识别多种病毒和慢病毒疾病的宿主决定因素。因此，本发明可与SIV核苷酸序列结合使用。下面提供了与本发明一起使用的示例性SIV序列。可以针对以与在先描述的HIV寡核苷酸相同的方法的全复制(通用)反应对SlVmac 65R突变特异性反应进行比较。

猕猴SIV逆转录酶

登录号：AY588945、M33262、AY599201、AY597209、M19499

示例性序列

基因组定位:1954…4907

另外的相似核苷酸实例：登录号：U65787

蛋白质：登录号：AAV65312

SIVmac

RT-PCR反应:

RTP F1 5’-CAA AAG AAA AGA TAG TTG CAT TAA GAG AAA T(SEQ ID NO:106)

RTP REV 5’-GCC ACA ATT CGT ACC CCA TCC A(SEQ ID NO:107)

逆转录酶

寡核苷酸混合物比例

下面是具有这些引物的比率/比例的实例的突变特异性引物的列表，所述引物可以用于特异地和灵敏地检测各自的突变。

下面是具有这些探针的比率/比例的实例的探针的列表，所述探针可以用于特异地和灵敏地检测各自的突变。

使用病毒混合物的103N和184V分析灵敏度

当针对质粒克隆进行测试时，103N的混合引物分析能够在野生型背景中区分少至0.04％的103N。当含有少至群体的0.2％时，针对184V的分析产生184V质粒的可辩别CT(图2A)。

对临床样品的103N和181C分析性能

为测定对临床样品的总体分析性能并建立分析截断值，对用于源自已知患者的野生型和103N和184V突变体的数据进行整理(比较，collated)。对携带突变的临床样品以及只有野生型病毒的样品的184V分析的性能的实例显示在图3中。由此产生的整理ΔCT的分布显示103N截断值的最佳位置是12ΔCT而184V截断值的最佳位置是8.5ΔCT。也就是说，在这些值以下的ΔCT对各个突变的评分为阳性，而在这些值之上的ΔCT被打分为仅有野生型(图4)。作为组，证明有突变的样品的ΔCT显著不同于野生型样品和具有其它突变的样品的ΔCT(P<0.001)(表I)。在77个被证明野生型样品的任一个中，184V分析都没有检测到这种突变。然而，对于103N突变分析，1个野生型样品对该突变打分呈阳性(10.6ΔCT)。所述103N不一致的结果可能表明非常低水平(<5％)的天然存在的多态性。针对103N突变的分析能够检测被证明有突变的所有23个样品中的突变。184V分析不能检测已知具有突变的36个样品中的一个的突变(9.8ΔCT)，产生97.2％的分析敏感度。从经历治疗的人群(在引物结合位点有五个多态性的混合病毒群体)中获得该异常值(outlier)。

将12.0ΔCT截断值用于103N分析，被证明具有除103N之外的突变的69个样品都没有评分为阳性。对于184V的8.5ΔCT截断值，先前证明对184V呈阴性的一个样品评分为阳性(7.1的ΔCT)，得到总特异性为98.6％的分析。这种不一致的样品来自慢性感染的、被携带41L和215D RT突变的病毒感染的未治疗人群。

对传输抗药性病毒的70R、70E、90M和67N分析的性能

B亚型70R分析截断值＝9.0循环，70E分析截断值＝7.0循环，90M分析截断值＝10.0循环和67N分析截断值＝9.0循环。

为减少假阳性结果的几率和对天然存在的抗性相关多态性的检测，0.2-0.5％突变体病毒的分析截断值用于筛选目的。发现对携带感兴趣突变的基因型临床样品分析的灵敏度和特异性在95-99％之间的范围。对携带抗性相关突变的147个传播HIV-1的实时PCR筛选检测出另外的突变，该突变扩展了病毒有抗性的药物的范围。所增加的突变体使90M发病率从8％增加至10％(+25％)、184V从10％增加至12％(+20％)、70R从9％增加至14％(+56％)和67N从7％增加至12％(+71％)。

来自检测分娩期接收单剂量奈韦拉平的妇女中抗性出现的研究的HIV-1C亚型103N和181C的结果

C亚型HIV-1103N分析截断值＝11.0循环，而181C分析截断值＝9.0循环。

103N实时分析确认在所有50个在先-NVP基线样品中没有可检测的103N(ΔCT的范围为12.0-23.0个循环，平均ΔCT＝15.9个循环)(图5)。该分析在所有10个在后-NVP阳性对照标本中成功地检测到103N(ΔCT范围为2.8-9.8个循环，平均ΔCT＝6.6个循环)。在通过测序没有可检测的NVP-相关突变的40个在后-NVP标本中，实时PCR分析发现有16个(40％)对103N呈阳性(ΔCT范围为6.9-10.6个循环，平均ΔCT＝8.9个循环)(图3，表1)。新发现的103N阳性标本的ΔCT值显著低于在先-NVP标本(ΔΔCT)(成对图5显示在先-NVP和在后-NVP血浆样品中103N突变的实时PCR分析。Seq+/-，对103N的序列分析呈阳性/阴性；PCR+/-，对103N的实时PCR呈阳性/阴性。处于或高于截断值的ΔCT值指示没有检测到103N，在之下的值指示103N的存在。T检验，P<0.0001，范围＝-(3.2-8.3)循环，平均ΔΔCT＝-6.0个循环)。相反，在在先-NVP标本和阴性在后-NVP标本之间无显著差异(P＝0.61)。从整个36周产后期收集的样品中确定了抗性变体。

用于103N和184V RT突变的该实时PCR引物-混合点突变分析能够在HIV-1质粒稀释中分别检测到低至0.04％和0.2％的突变体病毒。引物设计是耐用的并且对检测的临床标本中非常高的序列变异性良好地起作用。突变阳性标本的ΔCT从野生型样品和具有其它突变的样品形成明显的聚簇(cluster)。这些分析已经显示对282个血浆来源的HIV-1样本的可接受性能，提供了97.2-100％的灵敏度和98.6％的特异性。

以实时PCR为基础的测试的优势包括以下：1)实时反应需要一步法设置，降低了使用者错误的可能性；2)高通量：在96孔板中进行的反应允许每个板多达40个患者样品，其结果在<3小时内；3)使用引物混合物可以降低“无呼叫”的频率——由于相邻多态性错配的结果，对于其它点突变分析经常看到；4)该基于扩增的技术远比常规测序更加敏感，并且可以用作初级筛选工具并用于后处理评估；5)该技术目前在公共卫生实验室环境中使用，并可以转移到当前基因分型被成本阻止(cost-prohibited)的位置；和6)实时PCR是可以同时获得病毒学测量(例如，病毒负载和抗性负载)的有力工具。

实施例2:针对HIV-1C亚型逆转录酶突变65R的筛选:

基本上按Johnson JA等，(2007)PLoS ONE 2(7):e638.doi:10.1371/journal.pone.0000638所描述进行针对HIV-1C亚型RT突变65R的筛选。从200μL血浆或血清中提取HIV-1基因组RNA(Qiagen UltraSens RNA试剂盒)，并在随试剂盒提供的50μL缓冲液中重构。为确保充足的模板用于重复测试，首先使用SEQ ID NO:6的反向引物和SEQ ID NO:5的正向引物通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从5μLHIV-1RNA扩增病毒序列。PCR扩增条件为95℃45秒、50℃30秒和72℃2分钟，40个循环。

用于HIV-1C亚型中65R突变的基于实时PCR的突变特异性分析。利用2μL1:20稀释的RT-PCR产物——除了具有5000拷贝/mL以下的病毒负载的样品不被稀释之外——在96孔板中进行突变测试。实时PCR分析的原理是比较突变特异性PCR和扩增样品中所有病毒的PCR(全病毒复制反应)的差异扩增(图1)。HIV-1全复制引物，正向SEQ ID NO:7和反向SEQID NO:8，其以逆转录酶产生跨越核苷酸258-420的产物并且与通用的(common)探针，SEQID NO:9，一起使用。荧光发射超过背景荧光阈值的循环数是循环阈值(CT)并且是用于比较全复制和突变特异性反应之间的扩增信号差异(ΔCT)的测量单位(图1B)。所有样品以全复制和突变特异性CT的方式进行重复测试，用于确定ΔCT。

SEQ ID NOs:117、122和142的突变特异性引物被设计为优先与靶向核苷酸(一种或多种)退火，从而具有对野生型序列的降低的亲和力。为适应大群体中的各种多态性，将简并核苷酸放置在引物的互补位置。通过在距引物3'端的核苷酸(一个或多个)-2至-4位置产生设计的错配来增强特异性。此外，为覆盖存在的多态性范围，通常需要多个简并引物的混合物。对突变特异性引物混合物进行实验性评估，并选择在引物亲合力中具有最佳平衡差异和在引物退火中最小化交叉干扰的比例。突变特异性正向引物与每种引物的百分比总引物浓度——即，SEQ ID NO:118(20％)、SEQ ID NO:122(20％)和SEQ ID NO:142(20％)——组合使用。

实时PCR始于在94℃热启动温育11分钟，之后继续进行94℃溶解30秒、50℃退火15秒和60℃延伸30秒，45个循环。利用光单元(Bio-Rad)的iCycler实时PCR热循环仪和AmpliTaq Gold聚合酶(2.5U/反应；Applied Biosystems)在96孔PCR板中以25或50μL/孔的总体积进行所有反应。最终试剂浓度为：320nM正向和反向引物、160nM探针(一种或多种)和400μΜdNTPs。低病毒负载的样品——其产生在26个循环之后出现的全复制CT——有时产生假阳性结果。为了避免这种复杂情况，在实时PCR测试之前通过巢式PCR对CT在26个循环之上的所有样品进行进一步扩增。为充分减去背景荧光，高病毒负载的样品——其产生在小于10个循环出现的全复制CT——在无RNase/DNase试剂级水中被1：100-1000稀释并重新进行测试。我们发现，来自所有样品——除了病毒负载在5000拷贝/ml以下的样品——的RT-PCR产物的1:20稀释为实时PCR测试提供了充足的模板。

利用野生型模板背景中克隆突变体模板的连续稀释液在简单实验室环境中对相对检测限进行比较。相当于在稀释曲线上比野生型平均ΔCT大0.5对数反应性的ΔCT被用于比较分析灵敏度(图6)。该方法产生2％的临床检测限和0.01％的绝对检测限。

实施例3:对HIV-1逆转录酶K70E突变的筛选。

使用对K70R突变具有选择性的引物差别组重复实施例2的方法。简言之，从200μL血浆或血清提取HIV-1基因组RNA(Qiagen UltraSens RNA试剂盒)，并在与试剂盒一起提供的50μL缓冲液中重构。为确保充足的模板用于重复测试，首先使用SEQ ID NO:6的反向引物和SEQ ID NO:5的正向引物通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)从5μL HIV-1RNA扩增病毒序列。PCR扩增条件为95℃45秒、50℃30秒和72℃2分钟，40个循环。

然后使用SEQ ID NO:143的突变特异性反向引物连同相应的SEQ ID NO:144的正向引物对所得DNA产物进行qRT-PCR(实时PCR)。通过两种单独的方法独立地检测反应产物。方法1使用嵌入染料EVAGREEN或使用SEQ ID NO:67的探针。获得优异的突变特异性结果。

实施例4:针对HIV-1逆转录酶K70R突变的筛选。

使用对K70R突变具有选择性的引物差别组重复实施例2的方法。简言之，从200μL血浆或血清提取HIV-1基因组RNA(Qiagen UltraSens RNA试剂盒)，并在与试剂盒一起提供的50μL缓冲液中重构。为确保充足的模板用于重复测试，首先使用SEQ ID NO:6的反向引物和SEQ ID NO:5的正向引物通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)从5μL HIV-1RNA扩增病毒序列。PCR扩增条件为95℃45秒、50℃30秒和72℃2分钟，40个循环。

然后使用SEQ ID NO:144的正向引物连同相应的SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73的突变特异性反向引物对所得DNA产物进行实施例2中所述的qRT-PCR。通过两种单独的方法独立地检测反应产物。方法1使用嵌入染料EVAGREEN。方法2使用SEQ ID NO:145或SEQ IDNO:67的探针。获得优异的突变特异性结果。

实施例5:针对HIV-1逆转录酶219Q突变的筛选。

使用对219Q突变具有选择性的引物差别组重复实施例2的方法。简言之，从200μL血浆或血清提取HIV-1基因组RNA(Qiagen UltraSens RNA试剂盒)，并在与试剂盒一起提供的50μL缓冲液中重构。为确保充足的模板用于重复测试，首先使用SEQ ID NO:6的反向引物和SEQ ID NO:5的正向引物通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)从5μL HIV-1RNA扩增病毒序列。PCR扩增条件为95℃45秒、50℃30秒和72℃2分钟，40个循环。

然后使用SEQ ID NO:150的正向引物连同相应的SEQ ID NO:151的反向引物对所得DNA产物进行实施例2中所述的qRT-PCR。使用嵌入染料EVAGREEN对反应产物进行检测。用图8中所示的稀释分析获得优异的突变特异性结果。

实施例5：针对HIV-1蛋白酶I50V突变的筛选

使用对HIV-1蛋白酶150V突变具有选择性的引物差别组重复实施例2的方法。简言之，从200μL血浆或血清提取HIV-1基因组RNA(Qiagen UltraSens RNA试剂盒)，并在与试剂盒一起提供的50μL缓冲液中重构。为确保充足的模板用于重复测试，首先使用SEQ ID NO:6的反向引物和SEQ ID NO:5的正向引物通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)从5μLHIV-1RNA扩增病毒序列。PCR扩增条件为95℃45秒、50℃30秒、72℃2分钟，40个循环。

然后使用SEQ ID NO:146的突变特异性正向引物连同相应的SEQ ID NO:147反向引物对所得DNA产物进行实施例2中所述的qRT-PCR。通过两种单独的方法独立地检测反应产物。方法1使用嵌入染料EVAGREEN。方法2使用SEQ ID NO:148的探针。结果表明，具有I50V突变的样品显示出少于或等于4个PCR循环的反应性。具有I50L突变的序列或野生型I50序列的样品显示出只有在大于18个循环之后的反应性。七个重复的结果和对照显示在表4中：

表4:

示例性结果显示在图9A中，其图解使用嵌入染料的检测。图9B图解使用SEQ IDNO:148序列的探针令人惊讶地改进的特异性。总而言之，检测对新突变特异性引物是高度突变特异的，在缺少特异性突变时产生小于4且大于18的ΔCT。

实施例6:针对HIV-1整合酶突变的筛选。

使用特异性检测HIV-1整合酶148R突变的引物和探针重复实施例2的方法。使用SEQ ID NOs:124和125的引物进行逆转录。然后将生成的DNA用于扩增两个区域的化合反应中：1)使用通用引物SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:129产生通用(common)扩增子；和2)使用突变特异性反向引物SEQ ID NO:138和正向引物SEQ ID NO:126进行148R突变的突变特异性扩增反应。用于通用扩增子和148R反应的探针为SEQ ID NOs:140(80％)和141(20％)。利用这些引物和探针得到的检测的绝对限为0.4％(图7)。

使用本文鉴定具有类似结果的引物和探针组进行用于整合酶中140S、155H和148R突变的类似反应。

可以在以下出版物中找到其它实施例：Li等,J.Infect.Dis.,2011,203(6):798-802和Johnson JA等，(2007)PLoS ONE 2(7):e638.doi:10.1371/journal.pone.0000638。

实施例7:针对抗药性病毒筛选临床样品

CAPRISA 004研究从城市和农村地区招收899名年龄在18至40岁未怀孕的、性生活活跃的妇女，并随机分配给他们同样的1％替诺福韦羟乙基纤维素(HEC)凝胶组(arm)或安慰剂凝胶组(arm)。八百四十三名(94％)参与者完成该研究，分别是422名替诺福韦组和421名安慰剂组。在替诺福韦凝胶上的38名妇女(9％)中和在安慰剂上的60名妇女(14％)中出现HIV C亚型血清转换。来自65个CAPRISA 004的PCR扩增子将血浆样品血清转化——28(74％)来自替诺福韦组，而37(62％)来自安慰剂组，使用基本上如实施例2中所述的方法对是否存在表达抗药性65R或70E突变的HIV-1进行敏感抗性测试。

利用如实施例2中所述验证C亚型HIV的基于实时PCR的(等位基因特异性)点突变分析对由血液和阴道拭子产生的PCR病毒模板进行K65R和K70E诺福韦抗性突变筛选。然而，就本研究而言，我们利用针对K65R突变的适时分析(updated assay)，其采用三种突变特异性引物——包括那些SEQ NOs:117、118和122，以进一步提供引物区域中的多态性。反向引物包括SEQ ID NO:119，而所使用的检测探针包括SEQ ID NOs:120和121。此外，筛选截断值增至2％的K65R频率，以更好地避免已知随着C亚型RT密码子65区域扩增发生的错误多态性的检测。而且，在进行该分析时正在取得新的实时热循环模型(Bio-Rad CFX96)，其需要将反应体积从50uL调整至25uL。K70E分析利用包括SEQ ID NO:149的反向突变特异性引物连同正向引物(RTFWD.6F SEQ ID NO:144)，并利用7个循环的最大ΔCT截断值(相当于0.3％K70E)。

使用K65R分析测试拭子，没有识别出高于2％截断值的反应性的样品(ΔCTs≥9.7循环，中值＝12.8循环)。这些结果与测试安慰剂组拭子样品中获得的相似(ΔCTs≥9.1循环，中值＝13.1循环)。从任何拭子标本中未识别出K70E其中，替诺福韦的ΔCTs为≥9.7循环，安慰剂组的血清转化为≥10.0循环。这些结果表明，经阴道施用的替诺福韦凝胶几乎不造成替诺福韦抗性紧急情况的直接风险以及在其中凝胶使用者被密切监测HIV血清转化的环境中抗替诺福韦HIV-1的正向传输。

实施例8:多重反应

采用实施例1的程序用于在多重反应机制。调整非突变特异性引物的特性和位置，使得整个扩增子长度为200个碱基或更少。

在单反应室中组合用于蛋白酶(L90M)和逆转录酶(M41L、K103N和T215Y)中突变的引物。对于L90M突变，引物是SEQ ID NOs:53、54和55，或78、79、55和80组的那些。

对于41L突变，引物是具有SEQ ID NOs:62、63、64和65的核苷酸序列，或SEQ IDNOs:63、96、97、64和65的组的引物的组合。

对于103N突变，引物是一组具有SEQ ID NO:22、23、24和25序列的寡核苷酸。

对于215Y突变，引物是一组具有SEQ ID NO:40、41、42、43和44序列的寡核苷酸。

反向非突变特异性引物被选择使扩增子大小减少至200个碱基长度或更少。添加DNA嵌入染料EVAGREEN用于同时检测样品中是否存在L90M、M41L、K103N和T215Y突变中的一种或多种。在单重和多重反应中使用用于41L突变的引物的结果分别显示在图10A和B中。直接序列分析阳性范围中的多重反应，以验证存在突变并检查抗性突变结合。

四重突变反应保持特异性而丧失一些灵敏度可能是由于与染料的试剂竞争和非特异性荧光。对不同突变的检测下限在1％-10％的范围内。新确诊有单个和多个靶向突变的个体被正确扩增，并识别出与非靶向突变的结合(如215Y→M184V)。无靶向突变的样品产生差的扩增。

以多重方式进行另外的反应以检测逆转录酶中是否存在K65R、K103N、M184V和蛋白酶L90M中是否存在突变。K65R突变特异性引物被用于下组中的一个或多个：1)SEQ IDNOs:117或118；2)SEQ ID NOs:117、118或122；3)SEQ ID NOs:118或142；4)SEQ ID NO:113；5)SEQ ID NOs:10和11；或6)SEQ ID NO:98。

M184V突变特异性引物是一组具有SEQ ID NO:33、34或35序列的引物。

对于103N突变，引物是一组具有SEQ ID NO:22、23、24和25序列的寡核苷酸。

L90M突变特异性引物是一组具有SEQ ID NO:53、54或55序列或具有SEQ ID NOs:78、79、55或80序列的组的引物。

结果显示在图11中。

总体而言，多重突变反应保持特异性而丧失一些敏感性可能是由于与染料的试剂竞争和非特异性荧光。对不同突变的检测下限是在1％-10％的范围内。新诊断有单个和多个靶向突变的个体被正确扩增，并识别出与非靶向突变的结合(如，215Y→M184V)。无靶向突变的样品产生差的扩增。

多重筛选法成功地识别出新确定的感染中常见的传播突变；对于患者管理而言，那些样品可以通过常规或深度测序选择用于完整的基因分型。灵敏度的降低是微不足道的，并维持抗药性监测的值和对紧急抗药性的检测。该方法允许交换引物组以靶向其它感兴趣特异性突变(例如，图12A-C中所示的K65R-K103N-M184V+/-PI组(panel))。用复杂且昂贵的探针替代嵌入染料并结合一个孔中的测试反应使识别具有耐药突变的HIV阳性个体的组分的复杂性和成本降低。

本发明的各种修饰，除了在本文显示和描述的那些，将对以上描述的本领域技术人员来说是显而易见的。此类修饰同样意图落入所附权利要求的范围之内。

应理解，所有试剂都可通过本领域已知的来源获得，除非另有说明。核苷酸扩增、细胞转染以及蛋白质表达和纯化的方法同样地在本领域技术人员的水平之内。

参考文献

1.J.Mellors,et al..Abstract from the 11th CROI,San Francisco,CA(Feb9-11,2004).

2.H.S.Weinstock,I.et al.,J Infect Dis.2004Jun 15；189(12):2174-80.

3.Hance AJ,et al.,J Virol 2001Jul；75(14):6410-7.

4.S Palmer,et al.Abstract from the ThirdHIVDRP Symposium:AntiviralDrug Resistance,Chantilly,VA(Dec 8-11,2002).

说明书中提到的专利和出版物指示本发明所属领域技术人员的水平。这些专利及出版物通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的申请或出版物被具体和单独地通过引用并入本文。

前述描述是对本发明具体实施方式的说明，并不意在是对其实施的限制。以下权利要求(包括其所有等价物)都旨在限定本发明的范围。

Claims (10)

1.突变特异性引物和反向引物在制备用于特异性检测HIV-1的一个或多个基因或蛋白质中存在或不存在一个或多个单核苷酸突变的试剂或试剂盒中的应用，所述检测包括：

（a）逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成DNA产物；

（b）在适于聚合酶链式反应的条件下使步骤（a）的所述DNA产物与突变特异性引物和反向引物接触，所述突变是在：

HIV-1逆转录酶或HIV-1逆转录酶和HIV-1蛋白酶两者中，其中用于HIV-1逆转录酶中的突变的所述突变特异性引物包括选自SEQ ID NO: 143和149的核苷酸序列，其中用于HIV-1蛋白酶中的突变的所述突变特异性引物包括选自SEQ ID NO: 146的核苷酸序列，所述接触同时进行；和

（c）通过检测作为步骤（b）的所述接触结果而生成的扩增产物的存在或不存在来检测所述突变的存在或不存在。

2. 权利要求1所述的应用，其中所述突变是逆转录酶中的K70E突变，并且所述突变特异性引物包括SEQ ID NO: 143或SEQ ID NO: 149的核苷酸序列。

3. 权利要求1所述的应用，其中所述突变是蛋白酶中的I50V突变，并且所述突变特异性引物包括SEQ ID NO: 146的核苷酸序列。

4. 正向引物和包括SEQ ID NO: 143或SEQ ID NO: 149的突变特异性反向引物在制备用于检测HIV-1 C亚型的逆转录酶中K70E突变的存在或不存在的试剂或试剂盒中的应用，所述检测包括：

（a）逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成DNA产物；

（b）在适于聚合酶链式反应的条件下使步骤（a）的所述DNA产物与正向引物和包括SEQID NO: 143或SEQ ID NO: 149的突变特异性反向引物接触；和

（c）通过检测作为步骤（b）的所述接触的结果而生成的扩增产物的存在或不存在来检测所述K70E突变的存在或不存在。

5. 对HIV-1逆转录酶中的K70E突变具有选择性的寡核苷酸引物，其包括SEQ ID NO:143或SEQ ID NO: 149。

6.权利要求5所述的寡核苷酸引物，其中所述寡核苷酸是分离的。

7.用于检测与逆转录酶的HIV-1蛋白相关的突变的试剂盒，其包括：

寡核苷酸组合物，所述寡核苷酸组合物选自SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 149的寡核苷酸，或其组合。

8.权利要求7所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸组合物具有小于20%的针对所述突变的检测限。

9.用于选择性检测HIV-1逆转录酶中的K70E突变的寡核苷酸混合物，其包括：

包括SEQ ID NO: 143的寡核苷酸反向引物；

包括SEQ ID NO: 144的寡核苷酸正向引物；和

包括SEQ ID NO: 67的寡核苷酸探针。

10.突变特异性引物在制备用于同时检测HIV-1的一种或多种蛋白质中的两个或更多个突变的试剂或试剂盒中的应用，所述检测包括：

（a）逆转录从HIV-1提取的RNA，以生成编码所述蛋白质的DNA产物；

（b）在适于聚合酶链式反应的条件下使步骤（a）的所述DNA产物与突变特异性引物接触；和

（c）检测作为步骤（b）的所述接触的结果而生成的200个碱基对或更少的扩增产物中是否存在突变；

其中所述蛋白质是HIV-1逆转录酶或HIV-1逆转录酶和HIV-1蛋白酶两者；和

其中所述检测步骤使用包括SEQ ID NO: 143或SEQ ID NO: 149的序列的突变特异性引物检测是否存在所述逆转录酶突变K70E，或所述检测步骤检测是否存在L90M、I50V的蛋白酶突变与所述逆转录酶突变的任意组合。

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