CN106146398B - 一种化合物及其作为低迁移率核酸染料的应用 - Google Patents
一种化合物及其作为低迁移率核酸染料的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种化合物及其作为低迁移率核酸染料的应用,为具有桥接的对称结构,其分子结构稳定,携带电荷多、分子量大,制备方法简易可控,作为核酸染料应用时,具有高的灵敏度,对DNA的迁移率几乎没有影响,从而能保证DNA迁移的真实水平,可以体现真实测试结果;用于凝胶测试时避免了现有荧光染料在浓度大的水溶液中会形成二聚体从而导致明显的荧光猝灭问题,而且本发明化合物由于携带电荷多、分子量大从而不会透过细胞膜进入人体产生伤害即无毒。因此本发明的化合物是一种高度灵敏性、安全无毒的核酸染料。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,具体涉及一种化合物及其作为低迁移率核酸染料的应用。
背景技术
琼脂糖(核酸)凝胶电泳普遍应用用分子生物学,为基因重组、分子杂交以及DNA序列研究等提供了强大有力的手段。近十年来荧光染料作为核酸探针得到了广泛的应用。这些荧光核酸染料不仅可以应用在电泳核酸凝胶染色,也可以用来定量检测实时聚合酶链式反应(即qPCR)的DNA。从化学结构上来说,这些核酸荧光染料主要可以分为吖啶、菲啶、菁类、荧光素和罗丹明类等。EB(Ethidium bromide,溴化乙锭)是一种高度灵敏的核酸荧光染料,用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。在琼脂糖(核酸)凝胶电泳过程中,最常用的核酸染色剂是溴化乙锭(EB),染色效果好,操作方便,但是稳定性差,具有非常大的毒性(致癌性),EB是强诱变剂,具有高致癌性。基于EB的分子结构,在充分利用了EB分子的荧光基团(即菲啶鎓)基础上,对于EB进行了结构上的改变,但是保留甚至达到了比EB更好的核酸染色效果。同EB相比,这些新型核酸染料还具备毒性较低的优势。核酸染色剂又被称之为分子生物学实验室的“食用盐”。作为能够取代EB的核酸染料,主要有两款产品,分别为美国拜奥蒂乌母股份有限公司(Biotium. Inc.)用一个小分子把两个EB发光基团(phenyl-phenanthridine)连接而成所制备的化合物以及美国Molecular Probes,Inc.所生产的SYBR Green 系列染料。SYBR 系列染料有灵敏度不够强且具备低毒等缺陷。美国拜奥蒂乌母股份有限公司的产品无毒且灵敏性高,但是对DNA的迁移率影响比较大,即不能保证DNA迁移的真实水平,从而使实验结果出现偏差。这种对迁移率的影响,相同条带位移会出现明显偏差。
发明内容
本发明的目的是公开一种化合物及其作为低迁移率核酸染料的应用;在同等的条件下,与现有技术,比如美国拜奥蒂乌母股份有限公司的产品相比,本发明的化合物作为低迁移率核酸染料不仅保持了无毒灵敏性高的特点,而且对DNA的迁移率影响很低。
为达到上述发明目的,本发明采用的技术方案是:一种化合物,含有如下化学结构式:
其中B的化学结构式为:
其中a、b、c、d、e、f独立的选自0~12之间的整数。
本发明的化合物中,桥含有合适数量的非氢原子,其中a、b、c、d、e、f独立的选自0~12之间的整数,R为-SO3H、-SO3 -或者H。
本发明的化合物还可以呈化合物盐的形式,具有如下化学结构式:
其中R'为阴离子,一般为氯、溴、碘等负离子;桥可以为含有酰胺键连接或者非酰胺键连接,或者含有X,X为O、N、NHCH3、NCH3CH3、S原子的支链烷烃。阴离子不会对本发明化合物的性质产生影响,尤其不会影响本发明化合物作为核酸染料时,保持了特有的高度灵敏性,而且更加安全无毒的效果。
本发明的化合物作为核酸染料时,同现有的产品相比较,不仅保持了特有的高度灵敏性,而且更加安全无毒,尤其解决了原来在做核酸电泳时的拖尾现象。因此本发明进一步公开了上述化合物作为核酸染料的应用。
根据本发明实施例的记载,本发明公开的化合物与现有产品相比,不仅具有相当甚至更高的染料亮度,而且又能获得更高的染色效果;由电泳图可知,现有产品电泳后,对不同上样量的核酸电泳迁移率存在明显影响,本发明的化合物在同样条件下获得的凝胶电泳测试结果显示,其作为核酸染料对核酸迁移率的影响微乎其微,可以保证电泳测试的准确性与灵敏度。因此本发明进一步公开了上述化合物在核酸凝胶电泳测试中的应用。
进一步的,本发明公开了一种核酸染料,所述核酸染料包括上述的化合物或其盐,比如氯化盐、溴化盐或者碘化盐。
本发明还公开了利用上述核酸染料进行核酸凝胶电泳测试的方法,包括以下步骤,首先配置琼脂凝胶,然后加入核酸染料,接着进行电泳测试,得到电泳图。优选的,核酸染料的添加量为每50 mL琼脂凝胶中加入0.01~0.015微摩尔核酸染料;利用本发明的化合物作为核酸染料,用量较少,但是灵敏度高,检测结果准确。
本发明公开了一种新型化合物,其分子结构稳定,制备方法简易可控,作为核酸染料应用时,具有高的灵敏度,对DNA的迁移率几乎没有影响,从而能保证DNA迁移的真实水平,可以体现真实测试结果;用于凝胶测试时避免了现有荧光染料在浓度大的水溶液中会形成二聚体从而导致明显的荧光猝灭问题,而且本发明化合物由于携带电荷多、分子量大从而不会透过细胞膜进入人体产生伤害即无毒。因此本发明的化合物是一种高度灵敏性、安全无毒的核酸染料。
附图说明
图1是化合物1的分子量测试图;
图2是化合物8的分子量测试图;
图3是现有产品凝胶电泳测试图;
图4是本发明化合物凝胶电泳测试图。
具体实施方式
实施例一
1000ml三口圆底烧瓶中放入60.0g 3,8-二氨基-6-苯基菲啶,360ml DMF和37.2mlPyridine,机械搅拌,冰水浴降温至0-5℃;逐滴滴加42ml II,滴加过程保温0-5℃;滴加完毕后继续反应十小时直到反应完成;抽滤,滤饼加入到约2L纯水中,机械搅拌30min,抽滤;滤饼用2L纯水再洗涤一次,抽滤至干;减压干燥至恒重,得黄色固体48克;称取6-碘己酸乙酯347g,置2000ml三颈烧瓶中,机械搅拌下加入39.4g中间体I,油浴加热至100-110℃,反应3天直到反应完成;降温至80℃,加入1500mlEA,回流1h,停止加热,自然降至室温;抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤3次;减压抽干至恒重,得到产品中间体II 36克;125毫升发烟硫酸冷却至零度,12克中间体III 加入冷却的发烟硫酸中;上述混合液在搅拌的情况下慢慢升温至室温,继续搅拌12个小时直到反应结束;上述混合液被冷却至零下20度,然后被倾倒进零下10度的碘化钠溶液(250克碘化钠溶解在250毫升水中);上述混合液在零度左右搅拌1个小时,大量沉淀析出,过滤上述混合液,沉淀固体被干燥至恒重,得到4.6克;称取12.5g I 中间体IV,置200ml三颈烧瓶中,加入DMF65ml,机械搅拌,降温至0-10℃;滴加12 ml二异丙基乙胺,保温0-10℃;分批加入TSTU,直至原料完全反应;根据TSTU用量,计算2,2'-氧代双(乙胺)二盐酸盐的用量,先加入计算量的70%-80%,每次加2,2'-氧代双(乙胺)二盐酸盐之前,加入10ml左右二异丙基乙胺, 直至反应完全;常温下,减压抽干DMF和过量的二异丙基乙胺;完全抽干后,加入1000ml乙腈,搅拌析晶过夜;抽滤,滤饼加入1000ml乙腈,搅拌过夜,再洗涤一次;抽滤,滤饼减压干燥至恒重,得到8.3g红黑色固体。
实施例二
在装有回流冷凝管的100 mL三口烧瓶中,加入40 mL 氯苯,将SM(10克)加入其中,同时搅拌。加入硫酸二甲酯(4 mL),三者混合,升温到回流状态,TLC跟踪,展开剂:甲醇(5%)乙酸乙酯(95%)并加少量乙酸,到反应结束(大约2-3小时)。加入10 mL乙醇继续回流15min,停止加热并冷却至室温,直接过滤除去溶剂,滤饼用乙醚洗涤2-3次,固体进行真空干燥即得产品中间体I (8 g)。
在装有机械搅拌和回流冷凝器的250 mL三口烧瓶中加入中间体I (7 g)、100 mL乙腈、20 mL水,逐步加热至回流状态,随后还原铁粉 (15 g)和三氯化铁 (200 mg)加入到反应体系中,继续回流反应2个小时。在砂芯漏斗中放入滤纸和硅藻土,热过滤除去铁粉和铁盐,所得滤液冷却至室温,固体析出。 固体用过滤的方法得到,进行真空干燥即为产品中间体II (5 g)。
在装有机械搅拌和回流冷凝管的1 L三口烧瓶中,加入6-碘己酸乙酯 (30 g),然后将中间体II(4.67 g)加入其中,同时搅拌。逐步升温至110 ℃反应,TLC跟踪,展开剂:氯仿:甲醇:乙酸乙酯:乙酸 = 15:2:2:1,到反应结束(大约需要3-4天)。降温至80℃,加入150mL乙酸乙酯回流反应1小时。冷却至室温,搅拌过夜。直接进行过滤除去乙酸乙酯及6-碘己酸乙酯,滤饼用乙酸乙酯洗涤2-3次,所得固体真空干燥即是产品中间体III (4.2 g)。
在带有回流冷凝管和机械搅拌的100 mL三口烧瓶中,加入24 mL 48%的溴化氢水溶液,缓慢将原料中间体III (2.4 g)加入到烧瓶中。加入后,室温搅拌一小时。加热到110oC,直到TLC检测反应结束(大约反应需要3-4小时)。展开剂:10%水90%乙腈。反应结束,将反应物降至室温,放4℃冰箱过夜。有固体析出,过滤除去溴化氢水溶液, 滤饼用少量冰水洗涤。固体进行冻干即得产品中间体IV (1.3 g)。
25 mL单口瓶中加入中间体IV (430 mg)、DMF (15 mL)、Et3N (1 mL),放入冰水浴中搅拌30 分钟。然后加入TSTU (330 mg),继续搅拌反应。直到TLC检测反应结束(大约反应需要0.5-1小时),展开剂:甲醇:二氯甲烷=2:8。反应结束,加入乙二胺 (30 µL)、三乙胺 (1mL),逐步回到室温反应。TLC检测,展开剂:水:乙腈=1:9(Al2O3板)。反应结束后减压抽去DMF、Et3N,剩余物用甲醇溶解,制备过Al2O3柱的样品,淋洗剂:3%-8% H2O/CH3CN。收集各管的产物,旋除溶剂,所得固体进行真空干燥即得最终产品 (300 mg)。
实施例三
在装有回流冷凝管的250 mL 三口烧瓶中加入2-氨基-4,4’-二硝基联苯 (17.2g)和3-氰基苯甲酰氯 (11 g),随后加入60 mL氯苯,磁力搅拌并逐渐升温至回流状态,反应4个小时。反应结束冷却至室温,直接进行过滤除去氯苯,得到的滤饼用乙酸进行重结晶提纯,所得固体进行真空干燥烘干即是产品中间体I (24.1 g)。
在装有回流冷凝管的250 mL单口烧瓶中加入中间体I (18 g) 和60 mL硝基苯,磁力搅拌下加入6 mL POCl3,逐步加热至200℃反应3个小时,然后冷却至室温,减压蒸馏除去硝基苯和POCl3,剩余的固体用乙醇进行重结晶,得到的固体进行真空干燥即为产品中间体II (13.2 g)。
在装有机械搅拌和回流冷凝器的500 mL三口烧瓶中加入中间体II (14 g)、200mL乙腈、40 mL水,逐步加热至回流状态,随后还原铁粉 (30 g) 和三氯化铁 (400 mg) 加入到反应体系中,继续回流反应2个小时。在砂芯漏斗中放入滤纸和硅藻土,热过滤除去铁粉和铁盐,所得滤液冷却至室温,固体析出。 固体用过滤的方法得到,进行真空干燥即为产品中间体III (8.5 g)。
在装有机械搅拌的1 L三口烧瓶中,加入25 mL DMF,将中间体III (6.2 g)加入其中,同时搅拌,(注意:不能先加入固体再加入DMF,会出现结块无法搅拌)。加入吡啶 (3.67mL),三者混合,冰浴降温到0℃-5℃,开始滴加氯甲酸乙酯 (6.14 mL),滴加过程中温度不能超过15℃,TLC跟踪,展开剂:石油醚:乙酸乙酯=1:1,到反应结束。在室温下继续搅拌30分钟以利于充分反应。得到的粘稠状固体,直接先进行过滤除去吡啶及DMF,过滤得到的溶剂倒入废液桶或者倒入水中回收产物(注意:回收的产物稍微不纯,需分开放置),滤饼倒入水中,洗涤2-3次到无吡啶气味为止,先放于室温下干燥1-2星期后放入真空干燥,得到产品中间体IV (8.2 g)。
在装有回流冷凝管的100 mL三口烧瓶中,加入40 mL 氯苯,将中间体IV (5 g)加入其中,同时搅拌。加入硫酸二甲酯 (2.1 mL),三者混合,升温到回流状态,TLC跟踪,展开剂:甲醇(5%)乙酸乙酯(95%)并加少量乙酸,到反应结束(大约2-3小时)。加入10 mL乙醇继续回流15 min,停止加热并冷却至室温,直接过滤除去溶剂,滤饼用乙醚洗涤2-3次,固体进行真空干燥即得产品中间体V (4.3 g)。
在带有回流冷凝管和机械搅拌的100 mL三口烧瓶中,加入24 mL 48%的溴化氢水溶液,缓慢将原料中间体V (2.4 g)加入到烧瓶中。加入后,室温搅拌一小时。加热到110℃,直到TLC检测反应结束(大约反应需要3-4小时)。展开剂:10%水90%乙腈。反应结束,将反应物降至室温,放4℃冰箱过夜。有固体析出,过滤除去溴化氢水溶液, 滤饼用少量冰水洗涤。固体进行冻干即得产品中间体VI (1.23 g)。
25 mL单口瓶中加入中间体VI (86 mg)、DMF ( 5 mL)、Et3N (0.2 mL),放入冰水浴中搅拌30 分钟。然后加入TSTU (66 mg) ,继续搅拌反应。直到TLC检测反应结束(大约反应需要0.5-1小时),展开剂:甲醇:二氯甲烷=2:8。反应结束,加入己二胺 (6 µL)、三乙胺(0.2 mL),逐步回到室温反应。TLC检测,展开剂:水:乙腈=1:9(Al2O3板)。反应结束后减压抽去DMF、Et3N,剩余物用甲醇溶解,制备过Al2O3柱的样品,淋洗剂:2%-6% H2O/CH3CN。收集各管的产物,旋除溶剂,所得固体进行真空干燥即得最终产品 (54 mg)。
更换一些原料依据上述的制备方法可以制备其他的染料化合物,具体结构式如下:
化合物1:
化合物2:
化合物3:
化合物4:
化合物5:
化合物6:
化合物7:
化合物8:
化合物9:
化合物10:
其中化合物编号为7和 9两种化合物是依据实施例一中的最后一步中分别用乙二胺和DAPEE(H2NCH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NH2)作为桥进行连接,而化合物8则是起始物3,8-二氨基-6-苯基菲啶直接进行磺化后用TDIEEA进行连接而成;化合物4、5和6则是依据实施例二,最后一步分别用2,2'-氧代双乙胺二盐酸盐 (2,2-oxybis (ethylamine)dihydrochloride)、己二胺和DAPEE作为桥进行连接而成;化合物1、2和10则是依据实施例三中的最后一步分别用DAPMA、DAPEE与乙二胺作为桥连接而成。
TDIEEA的化学结构式为:
DAPMA的化学结构式为:
附图1、附图2分别是化合物1、化合物8的分子量测试图,显示分子量正确,说明本发明的产物符合理论设计。化合物1至化合物10 分子量依次为1051.79、1126387、1022.76、1181.01、1193.06、1297.17、969.14、1072.14、1143.38、966.8。
本发明的化合物作为核酸染料,同现有的同类产品相比较,不仅保持了其特有的高度灵敏性,更加安全无毒,而且解决了现有技术在做核酸电泳时的拖尾现象。
以如下结构式的化合物(化合物1)、美国Biotium公司的同类产品为例进行凝胶电泳成像,见附图3、附图4,对比结果说明本发明的产品与现有同类产品相比,不仅具有相当的染料亮度,而且能获更高的染色效果;由附图3可知,使用现有产品电泳后,其对不同上样量的核酸电泳迁移率存在明显影响;而从附图4来看,采用本发明的产品在同样条件下获得的凝胶电泳测试结果显示,其作为染料对核酸迁移率的影响微乎其微。
具体实验条件如下:
凝胶浓度,配置1%浓度的琼脂糖凝胶(如1%,即1 g琼脂糖加入100 mL 1×TBE);核酸染料浓度,琼脂糖溶液加入10000×核酸染料,每50 mL胶中加入5 ul核酸染料(2.6微摩尔每毫升);
电泳条件:1×TBE的电泳缓冲液中,100 V电压下电泳60 min;
从左到右上样顺序为:Super DNA Marker(5 ul,2.5 ul,1.25 ul)、100bp Ladder(5 ul,2.5 ul,1.25 ul)、1kb Ladder (5 ul,2.5 ul,1.25 ul)、DM2000(5 ul,2.5 ul,1.25 ul),所有上样产品来自康为世纪;
结果观察:通过标准的透视器(302 nm)观察染色凝胶,400ms曝光下进行拍照获得电泳图。
Claims (3)
1.一种化合物,含有如下化学结构式:
其中R为-SO3H或者-SO3 - ,B的化学结构式为:
其中a、b、d、e、f独立的选自0~12之间的整数,c选自1~12之间的整数;X为+NHCH3、+NCH3CH3;
或者化合物含有如下化学结构式:
B的化学结构式为:
其中a、b、d、e、f独立的选自0~12之间的整数,c选自1~12之间的整数;X为+NHCH3或者+NCH3CH3;
或者化合物含有如下化学结构式:
其中B的化学结构式为:
其中a、b、d、e、f独立的选自0~12之间的整数,c选自1~12之间的整数;X为+NHCH3、+NCH3CH3;
或者化合物含有如下化学结构式:
其中B的化学结构式为:
其中a、b、d、e、f独立的选自0~12之间的整数,c选自1~12之间的整数;X为+NHCH3、+NCH3CH3;
所述化合物还含有阴离子。
2.根据权利要求1所述的化合物,其特征在于:所述阴离子包括氯离子、溴离子或者碘离子。
3.一种核酸染料,其特征在于:所述核酸染料包括权利要求1或者2所述的化合物。
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