CN105158125A - 一种端粒长度测量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种端粒长度测量方法，该方法需使用到两种表面增强拉曼散射探针粒子，一种为能与端粒序列杂交的端粒SERS探针粒子，另一种为能与着丝粒序列杂交的着丝粒SERS探针粒子。将端粒SERS探针和着丝粒SERS探针加入到用固定剂固定好的细胞样品上，使端粒SERS探针和着丝粒SERS探针能分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到染色体中的端粒和着丝粒上。利用端粒SERS探针的SERS信号强度与着丝粒SERS探针的SERS信号强度之比表征端粒的相对长度。RT/C越大表示细胞的端粒越长，RT/C越小表示细胞的端粒越短。采用原位杂交表面增强拉曼散射法，具有实验成本低、周期短、特异性好、准确度高的优点。

Description

一种端粒长度测量方法
技术领域
本发明涉及纳米材料制备及生物分子检测技术，尤其涉及一种单细胞内高灵敏度的端粒长度测量方法，借助表面增强拉曼散射(SERS)的高灵敏度以及光谱信息丰富的特点，通过原位杂交技术实现单细胞内的端粒长度测量，该方法也可称为原位杂交表面增强拉曼散射法。
背景技术
端粒是位于真核细胞线性染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，其作用是保护染色体DNA的末端，避免染色体DNA的降解、末端融合以及非正常重组等。在哺乳动物细胞中，端粒DNA由TTAGGG序列重复串联组成。由于DNA的末端复制问题，细胞的每次分裂都伴随着端粒DNA一小段序列的丢失。细胞的每次分裂都会伴随着染色体末端端粒的缩短，细胞也因此逐渐老化、直至丧失增殖能力而死亡。端粒长度的变化与多种疾病密切相关，如癌症、早衰综合征等。因此测量端粒长度能提供与疾病相关的重要信息。
目前已有的端粒长度测量方法包括：Southern印迹法、杂交保护法(HPA)、实时荧光定量PCR法(qPCR)和荧光原位杂交(FISH)法。用Southern印迹法分析的DNA是没有被打碎和纯度较高的，但该方法得到的数据还包括了部分亚端粒区长度，因此Southern印迹法不能提供端粒的实际长度。HPA法中，直接将基因组DNA与端粒特异性的吖啶酯探针杂交，通过化学发光法测定端粒长度。该方法中不需要用到放射性同位素，大大降低了对实验操作人员的伤害，同时对基因组完整性和纯度没有苛刻要求。但HPA法没有给出详细的细胞或染色体水平的端粒信息，也不能直接测定端粒长度。PCR法使用PCR扩增的方式，有效降低了细胞基因组DNA的用量。FISH法利用端粒特异性肽核酸荧光探针，结合荧光显微镜技术，能实现单细胞水平的端粒长度分析。尽管这些方法在端粒研究中做出了重要的贡献，但它们或多或少具有一些不足，比如灵敏度低、程序复杂、成本高等，因此，目前仍需设计出灵敏度高、准确性好、适用性广泛、可操作性强的端粒长度测量技术。
在生物研究中，除传统生物学检测方法外，光学检测技术以其简单、可靠的特点获得了较为广泛的应用。现有的光学测试方法以荧光技术为主流获得了较为广泛的应用。作为另一种光谱技术，拉曼光谱携带有被测分子的结构“指纹”信息，因而具有更重要的生物学应用价值。但由于其光谱信号强度太弱，限制了它的应用。表面增强拉曼散射(SERS)现象的发现彻底解决了这个问题，从而使得它成为一种强有力的技术分析手段。SERS一方面继承了拉曼光谱的诸多优点，如对生物组织损伤小、光谱信息丰富等；另一方面，它弥补了传统拉曼散射信号强度弱、不利于检测的缺点。其巨大的增强作用使得基于SERS的光谱检测具有超高的灵敏度，甚至可实现单分子水平的分析研究。SERS光谱的“指纹”特性使人们能在复杂的生物环境中跟踪、检测目标分子。SERS效应产生在纳米尺度粗糙的金属表面，纳米技术的飞速发展为构筑多功能化的SERS纳米探针/基底提供了丰富的技术途径。这些基于SERS光谱技术的纳米探针/基底在生物成像、核酸或蛋白检测、肿瘤识别、药物输运等诸多生物医学领域展现出了优异的应用前景。
发明内容
发明目的：为解决目前端粒长度测量方法灵敏度不高、操作复杂、成本高的问题，，本发明提供一种用于细胞端粒长度测量的原位杂交SERS法，借助SERS的高灵敏度以及光谱信息丰富的特点，通过原位杂交技术实现单细胞内的端粒长度测量。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种端粒长度测量方法，使用端粒SERS探针粒子与着丝粒SERS探针粒子分别标记待测细胞的端粒与着丝粒，并使用端粒SERS探针粒子与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/C表征待测细胞的端粒长度，即使用长度保持不变的端粒序列作为内部参照，消除SERS探针、染色体或细胞的浓度的影响；该方法具体为：将端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子加入到用固定剂固定好的待测细胞上，使端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上，利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/C表征待测细胞的端粒长度，RT/C越小表示待测细胞的端粒长度越短；所述端粒SERS探针粒子是一种能与细胞的端粒序列杂交的SERS探针粒子，所述着丝粒SERS探针粒子是一种能与细胞的着丝粒序列杂交的SERS探针粒子。
上述方法具体包括如下步骤：
步骤一：制备球形金纳米粒子A；
步骤二：在粒子A表面修饰与细胞的端粒互补的DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3'，得到能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子B1；在粒子A表面修饰与细胞的着丝粒互补的DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3'，得到能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子B2；
步骤三：在粒子B1表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子C1；在粒子B2表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子C2；要求在粒子B1和粒子B2表面修饰的拉曼报告分子不同，使得粒子C1和粒子C2产生的SERS信号不同；
步骤四：在粒子C1表面包覆一层银壳形成端粒SERS探针粒子D1，银壳将粒子D1上的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列(即SH(CH2)6TTTTTTTTTTT)包埋在内，而用于杂交的一段DNA序列(即CCCTAACCCTAACCCTAA)仍旧暴露在银壳外；在粒子C2表面包覆一层银壳形成着丝粒SERS探针粒子D2，银壳将粒子D2上的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列(即SH(CH2)6TTTTTTTTTTT)包埋在内，而用于杂交的一段DNA序列(即AGCTTCTGTCTAGTTT)仍旧暴露在银壳外；银壳的厚度为2～3nm(厚度不可超过3.4nm)，通过银壳进一步增强SERS信号，但同时又不影响DNA序列的杂交功能；
步骤五：用固定剂固定好待测的细胞；
步骤六：将粒子D1和粒子D2同时加入到用固定剂固定好的待测细胞中，使粒子D1和粒子D2分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上；
步骤七：洗去待测细胞上多余的粒子D1和粒子D2；
步骤八：利用共焦拉曼显微镜分析待测细胞上的SERS光谱信号，进行SERS光谱和图像的采集；
步骤九：利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/C表征待测细胞的端粒长度，RT/C越小表示待测细胞的端粒长度越短。
所述步骤二中，DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3'和DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3'的5'端均修饰了巯基，以使得两种DNA序列能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面。
所述步骤三中，两种拉曼报告分子均含巯基，以使得拉曼报告分子能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面；要求使用的两种拉曼报告分子的拉曼散射截面较大，便于产生强SERS信号。
有益效果：本发明提供的端粒长度测量方法，相对于现有技术，具有如下优势：1、本发明中的探针粒子能提供SERS信号，具有超高的灵敏度，可用于单细胞水平的分析研究；2、本发明中采用长度不变的着丝粒作为内部参考，能有效避免探针、细胞、染色体浓度等因素的影响，提高端粒长度测量的准确性；3、本发明采用SERS探针原位杂交实现端粒长度测量，具有实验成本低、周期短、特异性好、定位准确的优点。
附图说明
图1为本发明提出的原位杂交SERS法测量端粒长度的示意图；
图2为本发明中使用的SERS探针的结构示意图；
图3为实施例1中端粒SERS探针的SERS光谱；
图4为实施例1中着丝粒SERS探针的SERS光谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
如图1所示为一种端粒长度测量方法，将端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子加入到用固定剂固定好的待测细胞上，使端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上，利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/C表征待测细胞的端粒长度，RT/C越小表示待测细胞的端粒长度越短；如图2所示，所述端粒SERS探针粒子是一种能与细胞的端粒序列杂交的SERS探针粒子，所述着丝粒SERS探针粒子是一种能与细胞的着丝粒序列杂交的SERS探针粒子。该方法包括如下步骤：
步骤一：制备球形金纳米粒子A；
步骤二：在粒子A表面修饰与细胞的端粒互补的DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3'，得到能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子B1；在粒子A表面修饰与细胞的着丝粒互补的DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3'，得到能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子B2；两种DNA序列的5'端均修饰了巯基，以使得两种DNA序列能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面；
步骤三：在粒子B1表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子C1；在粒子B2表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子C2；要求在粒子B1和粒子B2表面修饰的拉曼报告分子不同，使得粒子C1和粒子C2产生的SERS信号不同；两种拉曼报告分子均含巯基，以使得拉曼报告分子能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面。
步骤四：在粒子C1表面包覆一层银壳形成端粒SERS探针粒子D1，银壳将粒子D1上的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列包埋在内，而用于杂交的一段DNA序列仍旧暴露在银壳外；在粒子C2表面包覆一层银壳形成着丝粒SERS探针粒子D2，银壳将粒子D2上的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列包埋在内，而用于杂交的一段DNA序列仍旧暴露在银壳外；银壳的厚度为2～3nm，通过银壳进一步增强SERS信号，但同时又不影响DNA序列的杂交功能；
步骤五：用固定剂固定好待测的细胞；
步骤六：将粒子D1和粒子D2同时加入到用固定剂固定好的待测细胞中，使粒子D1和粒子D2分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上；
步骤七：洗去待测细胞上多余的粒子D1和粒子D2；
步骤八：利用共焦拉曼显微镜分析待测细胞上的SERS光谱信号，进行SERS光谱和图像的采集；
步骤九：利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/C表征待测细胞的端粒长度，RT/C越小表示待测细胞的端粒长度越短。
下面结合实施例对本发明作出进一步的说明。
实施例1：
以3,5-二氯苯硫酚(3,5-DCT)分子为着丝粒SERS探针粒子的拉曼报告分子，以5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)分子为端粒SERS探针粒子的拉曼报告分子，以人子宫颈癌细胞(HeLa)为待测细胞，利用本发明的方法进行端粒长度测量。
1)制备球形金纳米粒子
在200mL去离子水中加入200μL10％HAuCl4溶液，剧烈搅拌并加热至沸腾。随后加入8mL1％柠檬酸钠水溶液，继续加热搅拌15min。停止加热，搅拌至溶液冷却至室温，即得到酒红色的金纳米粒子溶液。
2)制备SERS探针粒子
端粒SERS探针粒子：在1mL球形金纳米粒子溶液中加入140μL10μM溶解在PBS缓冲液中的DNA序列(5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3')，该混合溶液室温静置12h后，加入1μL10mMDTNB溶液，该混合溶液继续静置6h，随后每隔1h加入100μL含有0.3MNaCl和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的PBS缓冲液，共加5次。该混合液继续静置12h，随后用7500rpm，30min离心清洗1次，沉淀分散至1mL去离子水中。
在得到的1mL连有DNA序列和DTNB分子的纳米粒子中加入10μL10mM的硝酸银溶液，包裹银壳层，搅拌30分钟后加入22μL10mM的抗坏血酸溶液反应6h，随后用7000rpm，30min离心清洗1次，沉淀分散在1mL含有0.4μg/mL鲑鱼精DNA的PBS缓冲液中，4℃保存待用，即得到端粒SERS探针。
着丝粒SERS探针粒子的制备与端粒SERS探针粒子类似，仅将DNA序列替换为(5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3')，将DTNB替换为3,5-DCT，其余步骤用量相同。即得到着丝粒SERS探针粒子。
3)原位杂交细胞样品准备
将HeLa细胞接种于35mm玻底培养皿，培养24小时。用4％多聚甲醛溶液室温固定细胞20分钟。用PBS缓冲液轻轻冲洗两次。加入1mL100μg/mLRNase并于37℃孵育20分钟，用PBS轻轻冲洗两次。加入2mL0.005％胃蛋白酶(溶剂为10mMHCl，使用前预热至45℃)并于37℃孵育5分钟，用PBS轻轻冲洗两次。向两个样品中加入2mL含0.4μg/mL鲑鱼精DNA的PBS溶液4℃封闭4h，随后用PBS轻轻冲洗3次。
5)SERS探针原位杂交
各取200μL端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子加入到1.6mL含0.4μg/mL鲑鱼精DNA的PBS溶液中混合均匀，于85℃预热5分钟。向两个玻底培养皿样品中分别加入2mL预热好的SERS探针，使其均匀覆盖玻底。85℃加热10分钟后，室温杂交6小时。用清洗溶液(2×SSC，0.1％吐温20)室温清洗两次，每次清洗15分钟，以去除未杂交的SERS探针粒子。去离子水清洗一次后用氩气将玻底培养皿吹干。
6)端粒长度测量
使用具有mapping功能的共焦拉曼显微镜采集细胞内的着丝粒SERS探针和端粒SERS探针的SERS光谱和图像，并分析端粒SERS探针与着丝粒SERS探针的SERS信号之比，获取端粒相对长度的信息。
该实施例中制备出的端粒SERS探针的SERS光谱如图3所示，着丝粒SERS探针的SERS光谱如图4所示。
实施例2：
按照实施例1中的方法制备端粒SERS探针粒子与着丝粒SERS探针粒子。使用HeLa细胞和MRC-5细胞，按照实施例1中的方法制备细胞样品。按照实施例1中的方法进行原位杂交以及SERS光谱和图像的采集。分析结果发现，MRC-5细胞的RT/C大于HeLa细胞的RT/C，说明MRC-5细胞的端粒比HeLa细胞的端粒长。
实施例3：
按照实施例1中的方法制备端粒SERS探针粒子与着丝粒SERS探针粒子。使用HeLa细胞进行实验。一组HeLa细胞与0.8mM端粒酶抑制剂叠氮胸苷(AZT)共培养2周，一组HeLa细胞未与端粒酶抑制剂共培养。按照实施例1中的方法制备细胞样品并进行原位杂交以及SERS光谱和图像的采集。分析结果发现，未与AZT共培养的HeLa细胞的RT/C大于与AZT共培养的HeLa细胞的RT/C，说明前者的端粒比后者长，即AZT有效地抑制了端粒酶的功能从而是的HeLa细胞的端粒发生缩短。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>东南大学
<120>一种端粒长度测量方法
<130>2015
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<223>端粒互补的DNA序列
<400>1
ttttttttttccctaaccctaaccctaa28
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<223>端粒互补的DNA序列
<400>2
tttttttttttagcttctgtctagttt27

Claims (4)

1.一种端粒长度测量方法，其特征在于：将端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子加入到用固定剂固定好的待测细胞上，使端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上，利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/C表征待测细胞的端粒长度，RT/C越小表示待测细胞的端粒长度越短；所述端粒SERS探针粒子是一种能与细胞的端粒序列杂交的SERS探针粒子，所述着丝粒SERS探针粒子是一种能与细胞的着丝粒序列杂交的SERS探针粒子。
2.根据权利要求1所述的端粒长度测量方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
步骤一：制备球形金纳米粒子A；
步骤二：在粒子A表面修饰与细胞的端粒互补的DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3'，得到能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子B1；在粒子A表面修饰与细胞的着丝粒互补的DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3'，得到能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子B2；
步骤三：在粒子B1表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子C1；在粒子B2表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子C2；要求在粒子B1和粒子B2表面修饰的拉曼报告分子不同，使得粒子C1和粒子C2产生的SERS信号不同；
步骤四：在粒子C1表面包覆一层银壳形成端粒SERS探针粒子D1，银壳将粒子D1上的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列包埋在内，而用于杂交的一段DNA序列仍旧暴露在银壳外；在粒子C2表面包覆一层银壳形成着丝粒SERS探针粒子D2，银壳将粒子D2上的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列包埋在内，而用于杂交的一段DNA序列仍旧暴露在银壳外；银壳的厚度为2～3nm，通过银壳进一步增强SERS信号，但同时又不影响DNA序列的杂交功能；
步骤五：用固定剂固定好待测的细胞；
步骤六：将粒子D1和粒子D2同时加入到用固定剂固定好的待测细胞中，使粒子D1和粒子D2分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上；
步骤七：洗去待测细胞上多余的粒子D1和粒子D2；
步骤八：利用共焦拉曼显微镜分析待测细胞上的SERS光谱信号，进行SERS光谱和图像的采集；
步骤九：利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/C表征待测细胞的端粒长度，RT/C越小表示待测细胞的端粒长度越短。
3.根据权利要求2所述的端粒长度测量方法，其特征在于：所述步骤二中，DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3'和DNA序列5'-SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3'的5'端均修饰了巯基，以使得两种DNA序列能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面。
4.根据权利要求2所述的端粒长度测量方法，其特征在于：所述步骤三中，两种拉曼报告分子均含巯基，以使得拉曼报告分子能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面。
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