WO2018155694A1 - 病理診断用染色剤、細胞核染色方法、病理標本の製造方法、及び色素 - Google Patents

病理診断用染色剤、細胞核染色方法、病理標本の製造方法、及び色素 Download PDF

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WO2018155694A1
WO2018155694A1 PCT/JP2018/007050 JP2018007050W WO2018155694A1 WO 2018155694 A1 WO2018155694 A1 WO 2018155694A1 JP 2018007050 W JP2018007050 W JP 2018007050W WO 2018155694 A1 WO2018155694 A1 WO 2018155694A1
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WO
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staining
group
pathological diagnosis
dye
represent
Prior art date
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PCT/JP2018/007050
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English (en)
French (fr)
Inventor
渡辺　康介
晃逸 佐々木
慶子 牧田
Original Assignee
富士フイルム株式会社
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to a stain for pathological diagnosis, a cell nucleus staining method, a method for producing a pathological specimen, and a dye.
  • Pathological diagnosis is performed in order to appropriately diagnose the disease.
  • a tissue specimen or a cell collected from a patient is stained to prepare a pathological specimen, and this pathological specimen is observed under a microscope to make a histopathological diagnosis.
  • Hematoxylin-eosin staining has long been used for cell staining in pathological diagnosis.
  • HE staining first, hematoxylin is oxidized and converted to hematein, and this hematein is in a positively charged state by forming a complex with the metal part of the mordant. The positively charged complex binds to the negatively charged nucleic acid, thereby staining the cell nucleus in blue.
  • Non-Patent Document 1 can be referred to.
  • the hematoxylin constituting the HE staining reagent is generally provided as a solution mixed with a metal salt, an oxidizing agent, etc. in consideration of its usage form.
  • this solution has low storage stability, and the dye precipitates over time. Therefore, in the preparation of a pathological specimen, the hematoxylin solution is used after being filtered, but there is a problem that the pigment concentration decreases due to repeated use. Accordingly, an object of the present invention is to provide a staining agent for pathological diagnosis that is excellent in stainability of cell nuclei, excellent in color contrast with cytoplasmic staining with eosin, and also excellent in storage stability in a solution state. .
  • Another object of the present invention is to provide a method for staining a cell nucleus and a method for producing a pathological specimen using the above-mentioned staining agent for pathological diagnosis. Furthermore, this invention makes it a subject to provide a suitable pigment
  • a stain for pathological diagnosis containing a dye represented by the following formula (1) A stain for pathological diagnosis containing a dye represented by the following formula (1).
  • R 1 to R 8 , R 11 and R 12 represent a hydrogen atom or a substituent.
  • R 13 to R 15 represent a hydrogen atom or a substituent.
  • a 1 and A 2 represent —O—, —S—, —Se—, —NR 16 — or —CR 17 R 18 —, and R 16 to R 18 represent a hydrogen atom or a substituent.
  • n 1 is an integer of 0 to 3
  • m is an integer of 1 to 4.
  • X ⁇ represents an anionic counter ion.
  • [6] The staining agent for pathological diagnosis according to any one of [1] to [5], comprising water.
  • [8] [1] A method for staining cell nuclei, comprising staining cell nuclei with the staining agent for pathological diagnosis according to any one of [1] to [7].
  • [9] [1] A method for producing a pathological specimen, comprising staining cell nuclei using the staining agent for pathological diagnosis according to any one of [1] to [7].
  • the method for producing a pathological specimen according to [9] comprising staining the cytoplasm with eosin staining.
  • R 1 to R 8 represent a hydrogen atom or a substituent
  • R 31 to R 36 represent an alkyl group or an aryl group
  • L 31 and L 32 represent a linking group.
  • a 1 and A 2 represent —O—, —S—, —Se—, —NR 16 — or —CR 17 R 18 —, and R 16 to R 18 represent a hydrogen atom or a substituent.
  • m1 is an integer of 2-4.
  • X ⁇ represents an anionic counter ion.
  • substituents when there are a plurality of substituents, linking groups, repeating structures, etc. (hereinafter referred to as substituents, etc.) indicated by a specific symbol, or when a plurality of substituents etc. are specified simultaneously, there is a special notice. As long as there is no, each substituent etc. may mutually be same or different. The same applies to the definition of the number of substituents and the like. Further, when a plurality of substituents and the like are close to each other (especially when they are adjacent to each other), they may be connected to each other to form a ring unless otherwise specified.
  • a ring such as an aliphatic ring, an aromatic ring, or a hetero ring may be further condensed to form a condensed ring.
  • this number of carbons means the total number of carbon atoms in the group. That is, when this group is a form further having a substituent, it means the total number of carbon atoms including this substituent.
  • the chemical structural formula of the present specification when a chemical structure has a resonance structure, the chemical structure includes the resonance structure.
  • a numerical range represented by using “to” means a range including numerical values described before and after “to” as a lower limit value and an upper limit value.
  • the stain for pathological diagnosis of the present invention can selectively and sufficiently stain cell nuclei, is excellent in color contrast with cytoplasmic staining with eosin, and is also excellent in storage stability in a solution state. Further, according to the cell nucleus staining method of the present invention, cell nuclei can be selectively and sufficiently darkly stained, and the reproducibility of cell nucleus staining can be enhanced. In addition, according to the method for producing a pathological specimen of the present invention, a pathological specimen in which cell nuclei are selectively stained sufficiently deep can be obtained, and the reproducibility of cell nucleus staining in the pathological specimen can be improved.
  • the staining agent for pathological diagnosis of the present invention contains a dye represented by the following formula (1).
  • R 1 to R 8 , R 11 and R 12 represent a hydrogen atom or a substituent.
  • R 13 to R 15 represent a hydrogen atom or a substituent.
  • a 1 and A 2 represent —O—, —S—, —Se—, —NR 16 — or —CR 17 R 18 —, and R 16 to R 18 represent a hydrogen atom or a substituent.
  • n1 is an integer of 0 to 3
  • m is an integer of 1 to 4.
  • X ⁇ represents an anionic counter ion.
  • the group selected from R 1 to R 8 and R 11 to R 18 may have a cationic group within a range where m is 1 to 4, and the group selected from R 13 to R 15 is It may have an anionic group within the range where m is 1 to 4. Details of the cationic group and the anionic group will be described later. Further, R 14s , R 15s , or R 14 and R 15 may be bonded to each other to form a ring.
  • the dye represented by the above formula (1) dissociates into a dye that is an m-valent cation and an anionic counter ion represented by X ⁇ .
  • the dye which is an m-valent cation, interacts with a negatively charged nucleic acid having an anionic group (phosphate group, carboxy group, etc.), and can selectively stain cell nuclei. That is, in the cell nucleus staining using the staining agent for pathological diagnosis of the present invention, it is not necessary to add an oxidizing agent, a mordant or the like necessary for cell nucleus staining using hematoxylin.
  • Examples of the substituent that can be adopted as R 1 to R 8 include a hydroxyl group, a halogen atom, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, an alkyl group, a heteroaryl group, an amino group.
  • R 1 to R 8 are a halogen atom
  • examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom, a chlorine atom or a bromine atom is preferable, and a chlorine atom is more preferable.
  • R 1 to R 8 are an alkoxy group
  • the alkoxy group preferably has 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, more preferably methoxy, ethoxy and propoxy, and methoxy and ethoxy. Is more preferable.
  • R 1 to R 8 are an aryloxy group
  • the aryl group preferably has 6 to 12 ring atoms, more preferably 6 to 10, still more preferably 6 to 8, and particularly preferably a phenyloxy group.
  • the alkylthio group preferably has 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably methylthio and ethylthio.
  • the aryl group preferably has 6 to 12 ring atoms, more preferably 6 to 10, still more preferably 6 to 8, and particularly preferably phenylthio.
  • R 1 to R 8 are an alkenyl group
  • the alkenyl group preferably has 2 to 6 carbon atoms, more preferably 2 to 4, more preferably 2 or 3, and particularly preferably ethenyl.
  • the alkynyl group preferably has 2 to 6 carbon atoms, more preferably 2 to 4, more preferably 2 or 3, and particularly preferably ethynyl.
  • the aryl group preferably has 6 to 18 ring atoms, more preferably 6 to 14, still more preferably 6 to 10, and particularly preferably phenyl.
  • R 1 to R 8 are alkyl groups
  • the alkyl group preferably has 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms, and still more preferably 1 to 3 carbon atoms.
  • the alkyl group preferably has a fluorine atom, more preferably a perfluoroalkyl group, and still more preferably trifluoromethyl.
  • the heteroaryl group is preferably a 5-membered or 6-membered heterocyclic group having any of an oxygen atom, a sulfur atom and a nitrogen atom as a ring constituent atom, It may be condensed, and the number of ring constituting atoms is preferably 2 to 10, more preferably 3 to 7, more preferably 3 to 5, and pyridyl, pyrimidyl, pyrazyl, triazyl, pyrazolyl, imidazolyl, triazolyl, furanyl, thienyl. Is particularly preferred.
  • R 1 to R 8 are amino groups, they are unsubstituted amino groups, amino groups having 1 to 12 carbon atoms (N-alkylamino groups, N, N-dialkylamino groups, N-arylamino groups, N, N -Diarylamino group, N-alkyl-N-arylamino group) are preferable.
  • N-alkylamino groups, N, N-dialkylamino groups, N-arylamino groups, N, N -Diarylamino group, N-alkyl-N-arylamino group are preferable.
  • N, N-dialkylamino group two alkyl groups may be linked to each other via a linking group, and specific examples include morpholino, piperidyl, and pyrrolidyl.
  • R 1 to R 8 are alkylcarbonyl groups
  • the carbon number of the alkylcarbonyl group is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4, still more preferably 1 to 3, and particularly preferably methylcarbonyl.
  • the alkyloxycarbonyl group preferably has 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably methoxycarbonyl.
  • R 1 to R 8 are aminocarbonyl groups
  • an unsubstituted aminocarbonyl group or an aminocarbonyl group having 1 to 12 carbon atoms is preferable.
  • An unsubstituted aminocarbonyl group, an N, N-dimethylaminocarbonyl group, and an N, N-diethylaminocarbonyl group are more preferable.
  • R 1 to R 8 are preferably a hydrogen atom, a halogen atom, an alkoxy group or a hydroxyl group. This alkoxy group may have a form having a cationic group.
  • R 1 to R 8 may be bonded to each other to form a ring.
  • the ring formed is preferably condensed with a benzene ring to which R 1 to R 4 (or R 5 to R 8 ) are bonded to form a naphthalene ring.
  • R 11 and R 12 examples include an alkyl group, an alkylcarbonyl group, and an alkylsulfonyl group.
  • R 11 and R 12 are alkyl groups
  • the alkyl group preferably has 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 10 carbon atoms, and still more preferably 2 to 6 carbon atoms.
  • Specific examples include methyl, ethyl, propyl and butyl, with ethyl or propyl being preferred.
  • R 11 and R 12 are an alkylcarbonyl group or an alkylsulfonyl group
  • preferred embodiments of the alkyl moiety of these groups are the same as the preferred embodiments of the alkyl group that R 11 and R 12 can take.
  • R 11 and R 12 are preferably alkyl groups.
  • the alkyl group is preferably in a form having a cationic group, and R 11 and R 12 both have a cationic group via an ethyl group, or both R 11 and R 12 are cationic via a propyl group. It is more preferable to have a group.
  • R 13 examples include an alkyl group and an aryl group.
  • the alkyl group preferably has 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably methyl and ethyl.
  • the aryl group preferably has 6 to 18 ring atoms, more preferably 6 to 14, and still more preferably 6 to 10. Of these, R 13 is preferably a hydrogen atom.
  • R 14 examples include a formyl group, a thioaldehyde group, an alkyl group, an alkenyl group, and an aryl group.
  • R 14 is an alkyl group
  • the alkyl group preferably has 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably methyl and ethyl.
  • R 14 is an alkenyl group
  • the alkenyl group preferably has 2 to 6 carbon atoms, more preferably 2 to 4, more preferably 2 to 3, and particularly preferably ethenyl.
  • R 14 is an aryl group
  • the aryl preferably has 6 to 18 ring atoms, more preferably 6 to 14, still more preferably 6 to 10, and particularly preferably phenyl.
  • R 14 is preferably a hydrogen atom, a formyl group, a thioaldehyde group, an alkyl group or an alkenyl group.
  • R 15 preferably has an anionic group, and more preferably an anionic group.
  • R 15 is more preferably a hydrogen atom or an anionic group.
  • R 16 examples include an alkyl group and an aryl group.
  • R 16 is an alkyl group or an aryl group
  • preferred forms of the alkyl group and aryl group are the same as the preferred forms of the alkyl group that can be taken as R 11 and the aryl group that can be taken as R 13 , respectively.
  • R 16 is preferably an alkyl group. It is also preferred that the alkyl group has a cationic group.
  • R 17 and R 18 examples include an alkyl group and an aryl group.
  • the alkyl group preferably has 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably methyl.
  • R 17 and / or R 18 is an aryl group, the preferred form of the aryl group is the same as the preferred form of the aryl group that can be employed as R 13 .
  • R 17 and R 18 are preferably alkyl groups, and the alkyl groups preferably have a cationic group.
  • Substituents that can be adopted as R 1 to R 8 and R 11 to R 18 are preferably in the form having a hydroxy group, a carboxy group, a halogen atom, a cyano group, or an amino group.
  • the preferred form of this amino group is the same as the preferred form of the amino group which can be adopted as R 1 to R 8 described above.
  • a 1 and A 2 are preferably —O—, —S—, —NR 16 — or —CR 17 R 18 —.
  • the cationic group that R 1 to R 8 and R 11 to R 18 may have means a group having a cation.
  • This cationic group is preferably a group having a quaternary ammonium ion, and more preferably a group represented by any of the following formulas (K-1) to (K-3).
  • * represents a binding site for incorporation into R 1 to R 8 or R 11 to R 18 .
  • R 21 to R 27 each represents an alkyl group or an aryl group.
  • Ring ⁇ represents a nitrogen-containing aromatic ring.
  • the alkyl group that can be adopted as R 21 to R 27 preferably has 1 to 4 carbon atoms, more preferably 1 or 2, and still more preferably 1. That is, the alkyl group is particularly preferably methyl.
  • the aryl group that can be adopted as R 21 to R 27 preferably has 6 to 12 ring atoms, more preferably 6 to 9, and still more preferably 6. That is, the aryl group is particularly preferably phenyl.
  • two adjacent alkyl groups may be bonded to form a ring, or when bonded, a ring may be formed via an oxygen atom. Examples of the ring formed include a morpholinium ring, a piperidinium ring, and a pyrrolidinium ring.
  • R 21 to R 27 are preferably an alkyl group, and more preferably a methyl group.
  • the nitrogen-containing aromatic ring in the ring ⁇ is preferably a 5- or 6-membered ring having at least one nitrogen atom as a ring constituent atom.
  • examples of other ring-constituting atoms include carbon atoms, sulfur atoms, and oxygen atoms, with carbon atoms being preferred.
  • the nitrogen-containing aromatic ring in the ring ⁇ has a carbon atom, it preferably has 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include a pyridine ring and an imidazole ring.
  • the cationic group is more preferably a group represented by the formula (K-1).
  • a form in which R 21 to R 23 are alkyl groups is preferable, and a form in which R 21 to R 23 are methyl groups is more preferable.
  • R 1 to R 8 and R 11 to R 18 have a cationic group
  • an alkyl group or an alkoxy group having a cationic group is preferable.
  • any of R 1 to R 8 , R 11 , R 12 and R 16 to R 18 preferably has the cationic group, and R 11 , R 12 and R 16 to R 18 It is more preferable that either one has a cationic group, and it is more preferable that both R 11 and R 12 have a cationic group.
  • the anionic group that R 13 to R 15 may have means a group having an anion.
  • the anionic group is preferably —O ⁇ , —S 2 — or —C (CN) 2 — .
  • dye represented by Formula (1) is a form which has one anionic group in the molecule
  • n 1 is preferably 2 or 3 (more preferably 2).
  • the above two R 14s are preferably bonded to each other to form a ring.
  • This ring is preferably a 4- to 6-membered ring, and the following ring structures are particularly preferable.
  • * 1 is a carbon atom to which A 2 and N + —R 12 are bonded (among the five-membered ring carbon atoms shown on the right side of Formula (1), A 2 and N + —R 12 represents a bonding site to the carbon atom to which R 13 is bonded.
  • R 14A represents a residue when R 14 is bonded to each other to form a ring.
  • R 15A- is synonymous with the form having an anionic group among the substituents that can be taken as R 15 , and R 15A- is preferably the anionic group.
  • R 14A is preferably ⁇ O, ⁇ S or ⁇ C (CN) 2 .
  • n 1 is preferably 1 to 3, and more preferably 2 or 3.
  • m is preferably 2 to 4, more preferably 2 or 3, and particularly preferably 2.
  • the anionic counter ion that can be taken as X ⁇ is not particularly limited and may be either an organic or inorganic ion. Typical examples are halogen ion (fluorine ion, chlorine ion, bromine ion, iodine ion), hydroxide ion, perchlorate ion, tetrafluoroborate ion, hexafluorophosphate ion, acetate ion, trifluoro Examples include acetate ion, methanesulfonate ion, trifluoromethanesulfonate ion, paratoluenesulfonate ion, parachlorophenylsulfonate ion, halogen ion (fluorine ion, chlorine ion, bromine ion, iodine ion), acetate ion , Trifluoroacetic acid ions, methanesulfonic acid ions, tri
  • the pigment represented by the above formula (1) is preferably represented by the following formula (2).
  • R 1 ⁇ R 8, R 11, R 12, A 1 and A 2 respectively, R 1 ⁇ R 8 in the formula (1), R 11, R 12, A 1 and A 2 And preferred forms are also the same.
  • R 21- represents —O ⁇ , —S ⁇ , or —C (CN) 2 —
  • R 22 represents ⁇ O, ⁇ S, or ⁇ C (CN) 2 .
  • R 21 is preferably —O 2 —
  • R 22 is preferably ⁇ O.
  • the pigment represented by the above formula (1) is more preferably represented by the following formula (3).
  • R 1 to R 8 represent a hydrogen atom or a substituent
  • R 31 to R 36 represent an alkyl group or an aryl group
  • L 31 and L 32 represent a linking group.
  • a 1 and A 2 represent —O—, —S—, —Se—, —NR 16 — or —CR 17 R 18 —, and R 16 to R 18 represent a hydrogen atom or a substituent.
  • m1 is an integer of 2-4.
  • X ⁇ represents an anionic counter ion.
  • the group selected from R 1 to R 8 and R 16 to R 18 may have a cationic group.
  • R 1 to R 8 , R 16 to R 18 , A 1 , A 2, and X ⁇ are R 1 to R 8 , R 16 to R 18 , A 1 , A in the above formula (1), respectively. is the same as that of the preferred embodiment - 2 and X.
  • the preferred forms of R 31 to R 36 are the same as the preferred forms of R 21 to R 23 in formula (K-1), respectively.
  • the linking groups L 31 and L 32 are preferably alkylene groups.
  • the alkylene group preferably has 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms, and still more preferably 1 to 3 carbon atoms.
  • the m1 is preferably 2 or 3, more preferably 2. When all of R 1 to R 8 , R 16 to R 18 , R 31 to R 36 , and the linking groups L 31 and L 32 do not contain a cationic group, m1 is 2.
  • Me means a methyl group.
  • the molecular weight of the dye represented by the above formula (1) is preferably 400 to 1500, and more preferably 500 to 1000.
  • the staining agent for pathological diagnosis of the present invention may be in the form of a dye represented by the above formula (1), or may contain other components in addition to the dye represented by the above formula (1). Also good.
  • other components include solvents, inorganic salts, and organic compounds (including dyes) other than the dye represented by the above formula (1).
  • the solvent those capable of dissolving the dye represented by the formula (1) are preferable, and this solvent preferably contains water and / or alcohol, more preferably a mixed solvent containing water and alcohol. .
  • the alcohol is not particularly limited and may be a monovalent or polyvalent alcohol.
  • Preferable specific examples include alkylene glycol (preferably ethylene glycol) and glycerin.
  • the water is not particularly limited as long as it is water, and distilled water, ultrapure water, pure water, running water, and the like can be used.
  • the water may contain salts such as sodium chloride, potassium chloride, sodium phosphate and potassium phosphate. Examples of such water include phosphate buffered saline (PBS).
  • the content of the pigment represented by the above formula (1) in the staining agent for pathological diagnosis is, for example, It can be 0.01 to 99% by mass.
  • the content of the dye represented by the above formula (1) in the staining agent for pathological diagnosis is preferably 0.01 to 1% by mass, for example. More preferably, it is 0.05 to 0.5% by mass.
  • the dye may be dissociated into a cation and an anion.
  • the staining agent for pathological diagnosis of the present invention contains components other than the dye represented by the above formula (1), a form of a composition in which each component is present uniformly is preferable.
  • the staining agent for pathological diagnosis of the present invention is more preferably in the form of a staining solution obtained by dissolving the dye represented by the above formula (1) in a solvent.
  • the dye represented by the above formula (1) can be obtained by, for example, a known cyanine dye synthesis method or a known squarylium dye synthesis method.
  • the cell nucleus staining method of the present invention includes staining cell nuclei using the staining agent for pathological diagnosis of the present invention. More specifically, the cell nucleus staining method of the present invention includes the following. That is, a paraffin section containing a target tissue or cells prepared according to a conventional method is deparaffinized and then the stain for pathological diagnosis of the present invention is allowed to act. Usually, after deparaffinization, it is immersed in the staining agent for pathological diagnosis of the present invention which is in the state of a staining solution obtained by dissolving a pigment.
  • Deparaffinization of the section can be performed according to a conventional method. This deparaffinization usually replaces the paraffin in the section with a hydrophilic solvent such as water.
  • the immersion time is not particularly limited as long as the cell nucleus can be brought into a desired staining state, and is, for example, 0.1 to 10 minutes. Can do.
  • the content of the dye represented by the above formula (1) is not particularly limited as long as the cell nucleus can be brought into a desired staining state. 1% by mass is preferable, and 0.05 to 0.5% by mass is more preferable. After immersion in the staining solution, the section is preferably washed with running water.
  • the method for producing a pathological specimen of the present invention includes staining cell nuclei using the staining agent for pathological diagnosis of the present invention. That is, the method for producing a pathological specimen of the present invention includes performing the above-described method for staining a nucleus of the present invention. Moreover, it is preferable that the manufacturing method of the pathological specimen of this invention includes dye
  • an organic solvent-based encapsulating agent is used in the encapsulating step subsequent to edion staining, dehydration and penetration operations are performed according to a conventional method after edion staining.
  • the eosin staining may be performed before or after the cell nucleus staining using the staining agent for pathological diagnosis of the present invention, but from the viewpoint of making the eosin staining into a desired staining state, the pathological diagnosis of the present invention. It is preferably performed after cell nucleus staining using a staining agent.
  • the stain for pathological diagnosis of the present invention By using the stain for pathological diagnosis of the present invention, it is possible to selectively and sufficiently stain cell nuclei.
  • the cell nucleus staining using the staining agent for pathological diagnosis of the present invention is performed in combination with cytoplasm staining by eosin staining, a pathological specimen excellent in contrast between the color of the cell nucleus and the cytoplasm and easy to observe can be obtained. .
  • the stain for pathological diagnosis of the present invention hardly precipitates in a solution state and is excellent in storage stability, it does not require filtration of the staining solution at the time of use after storage, and selective staining of cell nuclei is highly reproducible. It becomes possible.
  • the staining using the staining agent for pathological diagnosis of the present invention may be performed by, for example, PAS (periodic acid-Schiff) staining, PAM (periodic acid meth-enamine silver: It can also be used in combination with (methenamine silver periodate) dyeing or the like.
  • PAS peripheral acid-Schiff
  • PAM peripheral acid meth-enamine silver: It can also be used in combination with (methenamine silver periodate) dyeing or the like.
  • room temperature means 25 ° C.
  • ⁇ -It was immersed in ethanol 2 seconds x 2 times. ⁇ -Immerse in ethanol for 5 minutes x 3 times. ⁇ -Dipped in xylene for 5 minutes x 3 times. ⁇ -A sample was prepared by enclosing with Enteran New (Merck).
  • the staining agent for pathological diagnosis (Nos. 1 to 6) of the present invention when used, HE staining is performed in both evaluation of cell nucleus staining and evaluation of color contrast with eosin staining. As well as excellent results. Further, the staining solutions (Nos. 1 to 6) using the staining agent for pathological diagnosis of the present invention are less likely to cause pigment precipitation even when stored for a long period of time, compared with the staining solution (No. c1) containing hematoxylin. It was much easier to use.
  • PAS staining For the paraffin section of the rat paraffin block (kidney) prepared above, Meyer's hematoxylin solution (manufactured by Muto Chemical Co., Ltd.) or pathological diagnosis staining solution No. 1 was used for PAS (periodic acid-Schiff) staining according to the following procedure.
  • the specimen prepared by the above method was observed using a microscope BX53 (Olympus) and a microscope camera DP70 (Olympus).
  • PAS staining glycogen and mucus were stained red to magenta in staining with Mayer's hematoxylin solution.
  • staining solution No. In the dyeing using No. 1, it was dyed blue-purple and showed the same dyeing property as the Mayer's hematoxylin solution.
  • ⁇ -It was immersed in 0.2% gold chloride aqueous solution for 5 minutes. ⁇ -Washed with running water for 2 minutes. ⁇ -It was immersed in an oxalate formalin solution for 1 minute. ⁇ -Washed with running water for 1 minute. ⁇ -Soaked in diluted acidic dura fixer for 2 minutes. ⁇ -Washed with running water for 5 minutes. ⁇ -Meyer's hematoxylin 10 seconds x 2 times or staining solution No. 1 was immersed for 1 minute. ⁇ -Washed with running water for 5 minutes. ⁇ -Soaked in eosin staining solution for 1 minute. ⁇ -Washed with running water for 2 seconds.
  • the specimen prepared by the above method was observed using a microscope BX53 (Olympus) and a microscope camera DP70 (Olympus).
  • PAM staining staining using Mayer's hematoxylin solution and staining solution No.
  • staining was confirmed in which the basement membrane and reticulofibers were stained black. That is, the staining solution for pathological diagnosis No. No. 1 showed good dyeability like the Mayer's hematoxylin solution.
  • staining solution No. 1, no. 2, no. 3, no. c1 was subjected to fluorescence intensity measurement using RF-5300 (manufactured by Shimadzu Corporation). 1, no. 2, no. As for red, red fluorescence was observed. No fluorescence was observed for c1. From this, it was found that when the stain for pathological diagnosis of the present invention is used, diagnosis by observation using a fluorescence microscope can be performed.

Abstract

下記式（１）で表される色素を含有する病理診断用染色剤、この染色剤を用いた細胞核染色方法及び病理標本の製造方法、並びに上記染色剤の色素成分として好適な色素。 Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１２は水素原子又は置換基を示す。Ｒ１３～Ｒ１５は水素原子又は置換基を示す。Ａ１及びＡ２は－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－ＮＲ１６－又は－ＣＲ１７Ｒ１８－を示し、Ｒ１６～Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｎ１は０～３の整数であり、ｍは１～４の整数である。Ｘ－はアニオン性の対イオンを示す。

Description

病理診断用染色剤、細胞核染色方法、病理標本の製造方法、及び色素
　本発明は、病理診断用染色剤、細胞核染色方法、病理標本の製造方法、及び色素に関する。
　疾患を適切に診断するために病理診断が行われる。この病理診断では、患者から採取した組織ないし細胞を染色して病理標本を作製し、この病理標本を顕微鏡観察して病理組織学的な診断がされる。
　病理診断における細胞染色には、古くからヘマトキシリン－エオジン染色（ＨＥ染色）が用いられている。このＨＥ染色では、まずヘマトキシリンを酸化してヘマテインへと変換し、このヘマテインを、媒染剤の金属部分と錯体を形成させて正に帯電した状態とする。この正に帯電した錯体が、負に帯電している核酸に結合することにより、細胞核が青色に染色される。次いでエオジンにより細胞質を赤く染色することにより、細胞核と細胞質とが異なる色で染色された病理標本が作製される。ＨＥ染色に関する技術に関し、例えば非特許文献１を参照することができる。
Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｃｏｌｏｕｒ　Ｍａｔｅｒ．，２０１３年，第８６巻，第６号，ｐ．２１２－２１６
　ＨＥ染色試薬を構成するヘマトキシリンは、その使用形態を考慮して金属塩、酸化剤等と混合された溶液として提供されるのが一般的である。しかし、この溶液は保存安定性が低く、経時的に色素が析出する。したがって、病理標本の作製においては、ヘマトキシリン溶液をろ過して使用するが、使用を繰り返すことにより色素濃度が低下してしまう問題があった。
　そこで本発明は、細胞核の染色性に優れ、またエオジンによる細胞質染色との色のコントラストにも優れ、さらに溶液状態における保存安定性にも優れた病理診断用染色剤を提供することを課題とする。また本発明は、上記病理診断用染色剤を用いた、細胞核染色方法及び病理標本の製造方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、上記病理診断用染色剤の染色成分として好適な色素を提供することを課題とする。
　本発明の上記の課題は以下の手段により解決された。
〔１〕
　下記式（１）で表される色素を含有する病理診断用染色剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 式中、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１２は水素原子又は置換基を示す。Ｒ１３～Ｒ１５は水素原子又は置換基を示す。Ａ１及びＡ２は－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－ＮＲ１６－又は－ＣＲ１７Ｒ１８－を示し、Ｒ１６～Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｎ１は０～３の整数であり、ｍは１～４の整数である。Ｘ－はアニオン性の対イオンを示す。
〔２〕
　上記式（１）で表される色素が下記式（２）で表される、〔１〕に記載の病理診断用染色剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 上記式中、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２は、それぞれ、式（１）におけるＲ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２と同義である。Ｒ２１－は－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（ＣＮ）２ －を示し、Ｒ２２は＝Ｏ、＝Ｓ又は＝Ｃ（ＣＮ）２を示す。
〔３〕
　上記色素が、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１６～Ｒ１８から選ばれる少なくとも１つの基の中にカチオン性基を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の病理診断用染色剤。
〔４〕
　上記カチオン性基が下記式（Ｋ－１）～（Ｋ－３）のいずれかで表される基である〔３〕に記載の病理診断用染色剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
式中、＊は結合部位を示す。Ｒ２１～Ｒ２７はアルキル基又はアリール基を示す。環αは含窒素芳香族環を示す。
〔５〕
　上記カチオン性基を上記Ｒ１１及びＲ１２が有する、〔３〕又は〔４〕に記載の病理診断用染色剤。
〔６〕
　水を含有する、〔１〕～〔５〕のいずれか１つに記載の病理診断用染色剤。
〔７〕
　アルコールを含有する、〔１〕～〔６〕のいずれか１つに記載の病理診断用染色剤。
〔８〕
　〔１〕～〔７〕のいずれか１つに記載の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む、細胞核染色方法。
〔９〕
　〔１〕～〔７〕のいずれか１つに記載の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む、病理標本の製造方法。
〔１０〕
　エオジン染色により細胞質を染色することを含む、〔９〕に記載の病理標本の製造方法。
〔１１〕
　下記式（３）で表される色素。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 上記式中、Ｒ１～Ｒ８は水素原子又は置換基を示し、Ｒ３１～Ｒ３６はアルキル基又はアリール基を示す。Ｌ３１及びＬ３２は連結基を示す。Ａ１及びＡ２は－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－ＮＲ１６－又は－ＣＲ１７Ｒ１８－を示し、Ｒ１６～Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｍ１は２～４の整数である。Ｘ－はアニオン性の対イオンを示す。
　本明細書において、特定の符号で表示された置換基、連結基、繰り返し構造等（以下、置換基等という。）が複数あるとき、又は複数の置換基等を同時に規定するときには、特段の断りがない限り、それぞれの置換基等は互いに同一でも異なっていてもよい。このことは、置換基等の数の規定についても同様である。また、複数の置換基等が近接するとき（特に、隣接するとき）には、特段の断りがない限り、それらが互いに連結して環を形成してもよい。また、環、例えば脂肪族環、芳香族環、ヘテロ環はさらに縮環して縮合環を形成していてもよい。
　本明細書において、ある基の炭素数を規定する場合、この炭素数は、基全体の炭素数を意味する。つまり、この基がさらに置換基を有する形態である場合、この置換基を含めた全体の炭素数を意味する。
　本明細書の化学構造式において、化学構造式中に共鳴構造を有する場合、その共鳴構造も含む化学構造を意味している。
　本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は、「～」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　本発明の病理診断用染色剤は、細胞核を選択的に、十分に濃く染色することができ、またエオジンによる細胞質染色との色のコントラストにも優れ、さらに溶液状態における保存安定性にも優れる。また本発明の細胞核染色方法によれば、細胞核を選択的に、かつ十分に濃く染色することができ、また細胞核染色の再現性も高めることができる。また本発明の病理標本の製造方法によれば、細胞核が選択的に、十分に濃く染色された病理標本を得ることができ、また病理標本における細胞核染色の再現性も高めることができる。
［病理診断用染色剤］
　本発明の病理診断用染色剤は、下記式（１）で表される色素を含有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記式（１）中、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１２は水素原子又は置換基を示す。Ｒ１３～Ｒ１５は水素原子又は置換基を示す。Ａ１及びＡ２は－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－ＮＲ１６－又は－ＣＲ１７Ｒ１８－を示し、Ｒ１６～Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｎ１は０～３の整数であり、ｍは１～４の整数である。Ｘ－はアニオン性の対イオンを示す。
　Ｒ１～Ｒ８及びＲ１１～Ｒ１８から選ばれる基は、ｍが１～４となる範囲内においてカチオン性基を有していてもよく、またＲ１３～Ｒ１５から選ばれる基は、ｍが１～４となる範囲内においてアニオン性基を有していてもよい。上記カチオン性基及びアニオン性基の詳細については後述する。
　また、Ｒ１４同士、Ｒ１５同士、又はＲ１４とＲ１５とが互いに結合して環を形成してもよい。
　上記式（１）で表される色素は、水等の溶媒中に溶解した際に、ｍ価のカチオンである色素と、Ｘ－で示されるアニオン性対イオンとに解離する。このｍ価のカチオンである色素は、アニオン性基（リン酸基、カルボキシ基等）を有し負に帯電している核酸等と相互作用し、細胞核を選択的に染色することができる。
　すなわち、本発明の病理診断用染色剤を用いた細胞核染色では、ヘマトキシリンを用いた細胞核染色に必要な酸化剤、媒染剤等の添加を要しない。
　上記Ｒ１～Ｒ８として採り得る置換基としては、ヒロドキシ基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルキル基、ヘテロアリール基、アミノ基、シアノ基、アルキルカルボニル基、アルキルオキシカルボニル基及びアミノカルボニル基が挙げられる。
　上記Ｒ１～Ｒ８がハロゲン原子の場合、このハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられ、塩素原子又は臭素原子が好ましく、塩素原子がより好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアルコキシ基の場合、このアルコキシ基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましく、メトキシ、エトキシ、プロポキシが好ましく、メトキシ、エトキシがより好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアリールオキシ基の場合、このアリール基は環構成原子数が６～１２が好ましく、６～１０がより好ましく、６～８がさらに好ましく、フェニルオキシ基が特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアルキルチオ基の場合、このアルキルチオ基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましく、メチルチオ、エチルチオが特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアリールチオ基の場合、このアリール基は環構成原子数が６～１２が好ましく、６～１０がより好ましく、６～８がさらに好ましく、フェニルチオが特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアルケニル基の場合、このアルケニル基の炭素数は２～６が好ましく、２～４がより好ましく、２又は３がさらに好ましく、エテニルが特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアルキニル基の場合、このアルキニル基の炭素数は２～６が好ましく、２～４がより好ましく、２又は３がさらに好ましく、エチニルが特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアリール基の場合、このアリール基は環構成原子数が６～１８が好ましく、６～１４がより好ましく、６～１０がさらに好ましく、フェニルが特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましい。また、このアルキル基はフッ素原子を有することも好ましく、より好ましくはパーフルオロアルキル基であり、さらに好ましくはトリフルオロメチルである。
　上記Ｒ１～Ｒ８がヘテロアリール基の場合、このヘテロアリール基は、環構成原子に酸素原子、硫黄原子及び窒素原子のいずれかを有する５員環または６員環のヘテロ環基が好ましく、縮環していてもよく、環構成原子数が２～１０が好ましく、３～７がより好ましく、３～５がさらに好ましく、ピリジル、ピリミジル、ピラジル、トリアジル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、フラニル、チエニルが特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアミノ基の場合、無置換のアミノ基、炭素数１～１２のアミノ基（Ｎ－アルキルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ基、Ｎ－アリールアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジアリールアミノ基、Ｎ－アルキル－Ｎ－アリールアミノ基）が好ましい。Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ基の場合、２つのアルキル基が連結基を介して互いに連結してもよく、具体例としては、モルホリノ、ピペリジル、及びピロリジルが挙げられる。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアルキルカルボニル基の場合、このアルキルカルボニル基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましく、メチルカルボニルが特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアルキルオキシカルボニル基の場合、このアルキルオキシカルボニル基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましく、メトキシカルボニルが特に好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８がアミノカルボニル基の場合、無置換のアミノカルボニル基、炭素数１～１２のアミノカルボニル基（アルキル基及び／又はアリール基を置換基として有するアミノカルボニル基を含む）が好ましく、無置換のアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノカルボニル基、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノカルボニル基がより好ましい。
　なかでも上記Ｒ１～Ｒ８は、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基又はヒドロキシル基が好ましい。このアルコキシ基はカチオン性基を有する形態であってもよい。
　上記Ｒ１～Ｒ８は、互いに結合して環を形成してもよい。この場合、形成される環は、Ｒ１～Ｒ４（又はＲ５～Ｒ８）が結合するベンゼン環と縮合し、ナフタレン環を形成していることが好ましい。
　上記Ｒ１１及びＲ１２として採り得る置換基としては、アルキル基、アルキルカルボニル基及びアルキルスルホニル基が挙げられる。
　上記Ｒ１１及びＲ１２がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１～１２が好ましく、１～１０がより好ましく、２～６がさらに好ましい。具体例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチルが挙げられ、エチル又はプロピルが好ましい。
　上記Ｒ１１及びＲ１２がアルキルカルボニル基またはアルキルスルホニル基の場合、これらの基のアルキル部位の好ましい態様は、上記Ｒ１１及びＲ１２がとりうるアルキル基の好ましい態様と同様である。
　上記Ｒ１１及びＲ１２はアルキル基であることが好ましい。このアルキル基はカチオン性基を有する形態であることが好ましく、Ｒ１１及びＲ１２がともにエチル基を介してカチオン性基を有すること、あるいはＲ１１及びＲ１２がともにプロピル基を介してカチオン性基を有することがより好ましい。
　上記Ｒ１３として採り得る置換基としては、アルキル基及びアリール基が挙げられる。
　上記Ｒ１３がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましく、メチル、エチルが特に好ましい。
　上記Ｒ１３がアリール基の場合、このアリール基は環構成原子数が６～１８が好ましく、６～１４がより好ましく、６～１０がさらに好ましい。
　なかでも上記Ｒ１３は水素原子であることが好ましい。
　上記Ｒ１４として採り得る置換基は、ホルミル基、チオアルデヒド基、アルキル基、アルケニル基及びアリール基が挙げられる。
　上記Ｒ１４がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましく、メチル、エチルが特に好ましい。
　上記Ｒ１４がアルケニル基の場合、このアルケニル基の炭素数は２～６が好ましく、２～４がより好ましく、２～３がさらに好ましく、エテニルが特に好ましい。
　上記Ｒ１４がアリール基の場合、このアリールは環構成原子数が６～１８が好ましく、６～１４がより好ましく、６～１０がさらに好ましく、フェニルが特に好ましい。
　上記Ｒ１４は、水素原子、ホルミル基、チオアルデヒド基、アルキル基又はアルケニル基であることが好ましい。
　上記Ｒ１５として採り得る置換基は、アニオン性基を有することが好ましく、アニオン性基であることがより好ましい。上記Ｒ１５は、水素原子又はアニオン性基であることがより好ましい。
　上記Ｒ１６として採り得る置換基としては、アルキル基及びアリール基が挙げられる。
　上記Ｒ１６がアルキル基又はアリール基の場合、このアルキル基及びアリール基の好ましい形態は、それぞれ、上記Ｒ１１として採り得るアルキル基及びＲ１３として採り得るアリール基の好ましい形態と同じである。
　上記Ｒ１６はアルキル基であることが好ましい。このアルキル基はカチオン性基を有する形態であることも好ましい。
　上記Ｒ１７及びＲ１８として採り得る置換基としては、アルキル基及びアリール基が挙げられる。
　上記Ｒ１７及び／又はＲ１８がアルキル基の場合、このアルキル基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましく、メチルが特に好ましい。
　上記Ｒ１７及び／又はＲ１８がアリール基の場合、このアリール基の好ましい形態は、上記Ｒ１３として採り得るアリール基の好ましい形態と同じである。
　上記Ｒ１７及びＲ１８はアルキル基が好ましく、このアルキル基はカチオン性基を有する形態であることも好ましい。
　上記Ｒ１～Ｒ８及びＲ１１～Ｒ１８として採り得る置換基は、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ハロゲン原子、シアノ基又はアミノ基を有する形態であることも好ましい。
　このアミノ基の好ましい形態は、上記Ｒ１～Ｒ８として採り得るアミノ基の好ましい形態と同じである。
　上記Ａ１及びＡ２は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ１６－又は－ＣＲ１７Ｒ１８－であることが好ましい。
（カチオン性基）
　上記Ｒ１～Ｒ８及びＲ１１～Ｒ１８が有し得るカチオン性基とは、カチオンを有する基を意味する。このカチオン性基は第四級アンモニウムイオンを有する基が好ましく、より好ましくは下記式（Ｋ－１）～（Ｋ－３）のいずれかで表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
　上記式中、＊はＲ１～Ｒ８又はＲ１１～Ｒ１８中に組み込まれるための結合部位を示す。Ｒ２１～Ｒ２７はアルキル基又はアリール基を示す。環αは含窒素芳香族環を示す。
　上記Ｒ２１～Ｒ２７として採り得るアルキル基は、炭素数は１～４が好ましく、１又は２がより好ましく、１がさらに好ましい。すなわち上記アルキル基はメチルが特に好ましい。
　上記Ｒ２１～Ｒ２７として採り得るアリール基は、環構成原子数は６～１２が好ましく、６～９がより好ましく、６がさらに好ましい。すなわち上記アリール基はフェニルが特に好ましい。
　なお、上記Ｒ２１～Ｒ２７において、隣接する２つのアルキル基が結合して環を形成していてもよく、また結合する際に酸素原子を介して環を形成していてもよい。形成される環としては、例えば、モルホリニウム環、ピペリジニウム環及びピロリジニウム環が挙げられる。
　上記Ｒ２１～Ｒ２７は、アルキル基が好ましく、なかでもメチル基が好ましい。
　上記環αにおける含窒素芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を環構成原子として有する、５又は６員環が好ましい。その他の環構成原子としては、炭素原子、硫黄原子、酸素原子が挙げられ、炭素原子が好ましい。上記環αにおける含窒素芳香族環が炭素原子を有する場合、炭素数１～１２が好ましく、炭素数１～６がより好ましい。具体例としては、ピリジン環及びイミダゾール環が挙げられる。
　上記カチオン性基は、より好ましくは上記式（Ｋ－１）で表される基である。上記式（Ｋ－１）で表される基のなかでも、Ｒ２１～Ｒ２３がアルキル基である形態が好ましく、Ｒ２１～Ｒ２３がメチル基である形態がより好ましい。
　Ｒ１～Ｒ８及びＲ１１～Ｒ１８がカチオン性基を有する形態である場合、カチオン性基を有する、アルキル基又はアルコキシ基が好ましい。
　本発明においては、上記Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１６～Ｒ１８のいずれかが上記カチオン性基を有することが好ましく、上記Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１６～Ｒ１８のいずれかがカチオン性基を有することがより好ましく、上記Ｒ１１及びＲ１２がともにカチオン性基を有することがさらに好ましい。
（アニオン性基）
　式（１）において、上記Ｒ１３～Ｒ１５が有し得るアニオン性基とは、アニオンを有する基を意味する。アニオン性基は－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（ＣＮ）２ －が好ましい。
　本発明においては、Ｒ１４及びＲ１５のいずれか１つがアニオン性基を有する形態であることが好ましい。また、Ｒ１５のうちの少なくとも１つがアニオン性基であることがより好ましい。式（１）で表される色素は、その分子中にアニオン性基を１つ有する形態であることが好ましい。
　式（１）で表される色素は、ｎ１は２又は３（より好ましくは２）が好ましく、この場合、上記２つのＲ１４同士が互いに結合して環を形成する形態が好ましい。この環としては、４～６員環が好ましく、なかでも、下記環構造が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記式中、＊１は、Ａ２及びＮ＋－Ｒ１２が結合する炭素原子（式（１）の右側に示された５員環の環構成炭素原子のうち、Ａ２とＮ＋－Ｒ１２との間に挟まれた炭素原子）との結合部位を示し、＊２は、Ｒ１３が結合する炭素原子との結合部位を示す。Ｒ１４Ａは、Ｒ１４同士が互いに結合して環を形成した際の残基を示す。Ｒ１５Ａ－は、上記Ｒ１５として採り得る置換基のうちアニオン性基を有する形態と同義であり、Ｒ１５Ａ－は上記アニオン性基であることが好ましい。
　Ｒ１４Ａは、＝Ｏ、＝Ｓ又は＝Ｃ（ＣＮ）２が好ましい。
　ｎ１は、１～３が好ましく、２又は３がより好ましい。
　ｍは２～４が好ましく、より好ましくは２又は３であり、特に好ましくは２である。
　Ｘ－として採り得るアニオン性の対イオンとしては、特に制限はなく、有機、無機のいずれのイオンでもよい。代表的な例としては、ハロゲンイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン）、水酸化物イオン、過塩素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、パラトルエンスルホン酸イオン、パラクロロフェニルスルホン酸イオン等を挙げることができ、ハロゲンイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン）、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、パラトルエンスルホン酸イオンが好ましく、ハロゲンイオンがより好ましい。
　上記式（１）で表される色素は、下記式（２）で表されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
　上記式（２）中、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２は、それぞれ、式（１）におけるＲ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２と同義であり、好ましい形態も同じである。Ｒ２１－は－Ｏ－、－Ｓ－、又は－Ｃ（ＣＮ）２ －を示し、Ｒ２２は＝Ｏ、＝Ｓ、又は＝Ｃ（ＣＮ）２を示す。
　上記Ｒ２１は－Ｏ－が好ましく、Ｒ２２は＝Ｏが好ましい。
　上記式（１）で表される色素は、より好ましくは下記式（３）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  
　上記式（３）中、Ｒ１～Ｒ８は水素原子又は置換基を示し、Ｒ３１～Ｒ３６はアルキル基又はアリール基を示す。Ｌ３１及びＬ３２は連結基を示す。Ａ１及びＡ２は－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－ＮＲ１６－又は－ＣＲ１７Ｒ１８－を示し、Ｒ１６～Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｍ１は２～４の整数である。Ｘ－はアニオン性の対イオンを示す。
　Ｒ１～Ｒ８及びＲ１６～Ｒ１８から選ばれる基はカチオン性基を有していてもよい。
　上記Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１６～Ｒ１８、Ａ１、Ａ２及びＸ－の好ましい形態は、それぞれ、上記式（１）におけるＲ１～Ｒ８、Ｒ１６～Ｒ１８、Ａ１、Ａ２及びＸ－の好ましい形態と同じである。また、上記Ｒ３１～Ｒ３６の好ましい形態は、それぞれ、上記式（Ｋ－１）におけるＲ２１～Ｒ２３の好ましい形態と同じである。
　上記連結基Ｌ３１及びＬ３２は、アルキレン基が好ましい。このアルキレン基の炭素数は１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましい。
　上記ｍ１は、２又は３が好ましく、より好ましくは２である。Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１６～Ｒ１８、Ｒ３１～Ｒ３６、連結基Ｌ３１及びＬ３２のいずれもがカチオン性基を含まない場合、ｍ１は２となる。
　上記式（１）で表される色素の具体例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、Ｍｅはメチル基を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　上記式（１）で表される色素の分子量は、４００～１５００が好ましく、５００～１０００がより好ましい。
　本発明の病理診断用染色剤中、上記式（１）で表される色素の含有量に特に制限はなく、目的に応じて適宜に選択される。例えば、本発明の病理診断用染色剤は、上記式（１）で表される色素からなる形態でもよいし、上記式（１）で表される色素に加え、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、溶媒、無機塩及び上記式（１）で表される色素以外の有機化合物（色素を含む）等を挙げることができる。
　溶媒としては、上記式（１）で表される色素を溶解可能なものが好ましく、この溶媒は水及び／又はアルコールを含むことが好ましく、水とアルコールとを含む混合溶媒であることがより好ましい。
　上記アルコールは、特に制限はなく、１価でも多価のアルコールでもよい。好ましい具体例としては、アルキレングリコール（好ましくはエチレングリコール）及びグリセリンが挙げられる。アルコールの種類及び／又は量を調整することにより、染色液の物性、染色の濃さ等をある程度、調節することが可能となる。
　上記水は、水である限り特に制限はなく、蒸留水、超純水、純水及び流水などを用いることができる。さらに、上記水には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムなどの塩を含んでいてもよい。このような水としてはリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate　buffered　saline：PBS)が挙げられる。
　本発明の病理診断用染色剤中において、水及びアルコールの含有量比は、質量比で、水：アルコール＝１００：０～５０：５０が好ましく、１００：０～６０：４０がより好ましい。
　本発明の病理診断用染色剤が、上記式（１）で表される色素以外の成分を含む場合、病理診断用染色剤中の上記式（１）で表される色素の含有量は、例えば０．０１～９９質量％とすることができる。また、本発明の病理診断用染色剤が溶媒を含む場合、病理診断用染色剤中の上記式（１）で表される色素の含有量は、例えば、０．０１～１質量％が好ましく、０．０５～０．５質量％がより好ましい。なお、溶媒中において、上記色素の一部又は全部がカチオンとアニオンとに解離していてもよい。
　本発明の病理診断用染色剤が上記式（１）で表される色素以外の成分を含む場合、各成分が均一に存在する組成物の形態が好ましい。本発明の病理診断用染色剤は、上記式（１）で表される色素が溶媒中に溶解してなる染色液の形態がより好ましい。
　上記式（１）で表される色素は、例えば、公知のシアニン色素の合成方法、公知のスクアリリウム色素の合成方法により得ることができる。
［細胞核染色方法］
　本発明の細胞核染色方法は、本発明の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む。本発明の細胞核染色方法は、より詳細には次のことを含む。
　すなわち、常法に従い作製した、目的の組織ないし細胞を含むパラフィン切片について、切片の脱パラフィン化を行った後に、本発明の病理診断用染色剤を作用させる。通常は、脱パラフィン化後、色素を溶解してなる染色液の状態である本発明の病理診断用染色剤に浸漬させる。必要により余分な色素を洗い流し、あるいは所望の染色レベルまで着色を落とすために洗浄し、細胞核を選択的に染色する。
　切片の脱パラフィン化は常法に従い行うことができる。この脱パラフィン化により通常は、切片中のパラフィンを水等の親水性溶媒に置き換える。
　上記の病理診断用染色液に脱パラフィン化後の切片を浸漬させる場合、浸漬時間は、細胞核を所望の染色状態とすることができれば特に制限されず、例えば、０．１～１０分とすることができる。
　浸漬に使用する本発明の病理診断用染色液中、上記式（１）で表される色素の含有量は、細胞核を所望の染色状態とすることができれば特に制限されず、例えば０．０１～１質量％が好ましく、０．０５～０．５質量％がより好ましい。
　染色液への浸漬後、切片を流水で水洗することが好ましい。
［病理標本の製造方法］
　本発明の病理標本の製造方法は、本発明の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む。すなわち本発明の病理標本の製造方法は、上述した本発明の細胞核染色方法を実施することを含む。
　また、本発明の病理標本の製造方法は、エオジン染色により細胞質を染色することを含むことが好ましい。
　エジオン染色は、常法に従い行うことができる。また、エジオン染色に続く封入工程において、有機溶媒系封入剤を用いる場合には、エジオン染色後、常法に従い、脱水、透徹操作を行う。
　エオジン染色は、本発明の病理診断用染色剤を用いた細胞核染色の前に行ってもよいし、後に行ってもよいが、エオジン染色を所望の染色状態にする観点から、本発明の病理診断用染色剤を用いた細胞核染色の後に行うことが好ましい。
　本発明の病理診断用染色剤を用いることにより、細胞核を選択的に、十分に濃く染色することができる。また、本発明の病理診断用染色剤による細胞核染色を、エオジン染色による細胞質の染色と組合せて実施した場合には、細胞核と細胞質の色のコントラストに優れ、観察しやすい病理標本を得ることができる。しかも、本発明の病理診断用染色剤は溶液状態において析出しにくく、保存安定性に優れるため、保管後の使用時に染色液のろ過等を必要とせず、再現性の高い細胞核の選択的染色が可能となる。
　また、本発明の病理診断用染色剤を用いた染色は、例えば、後述する実施例に示すように、ＰＡＳ（periodic　acid-Schiff：過ヨウ素酸シッフ）染色、ＰＡＭ（periodic　acid　meth-enamine　silver：過ヨウ素酸メテナミン銀）染色等と組合せて用いることもできる。
　以下に実施例に基づき本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの形態に限定されるのではない。以下の実施例において「室温」は２５℃を意味する。
［実施例］
＜１．病理診断用染色剤の合成＞
（１）色素Ｄ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　３００ｍＬ容フラスコに、５－クロロ－２－メチルベンゾチアゾール１０．０ｇ、（３－ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド１５．６ｇ、ｍ－クレゾール２０ｍＬを導入し、１３０℃で４０時間撹拌した。反応液を室温に冷却し、撹拌しながら酢酸エチル２００ｍＬを滴下した。析出した固体を濾過により回収し、化合物Ｄ－１ａを１５．２ｇ得た。
　５００ｍＬ容フラスコに、化合物Ｄ－１ａを８．８９ｇ、スクアリン酸１．１４ｇ、ｎ－ブタノール（ｎ－ＢｕＯＨ）１６０ｍＬ、ピリジン４．０ｍＬを導入し、７時間半加熱還流した。反応液を室温に冷却し、撹拌しながら水１００ｍＬ、テトラヒドロフラン２００ｍＬを滴下した。析出した固体を濾過により回収し、アセトン３００ｍＬを加えて撹拌し、懸濁洗浄した。濾過により固体を回収し、色素Ｄ－１を青色固体として７．０ｇ得た。
　１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：　δ＝７．３７（ｂｒ　ｓ，２Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），５．４９（ｂｒ　ｓ，２Ｈ），４．０３（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ），３．０３（ｓ，１８Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ）．
　また、ＬＣ－ＭＳ(Liquid　Chromatography　Mass　Spectrometry)測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝６８９（［Ｍ－２（Ｂｒ－）＋（ＨＣＯＯ－）］＋）、ネガティブモードでｍ／ｚ＝７７９（［Ｍ－２（Ｂｒ－）＋３（ＨＣＯＯ－）］－）にＭＳシグナルを得た。
（２）色素Ｄ－２の合成
　色素Ｄ－１の合成において、５－クロロ－２－メチルベンゾチアゾールを２－メチルベンゾチアゾールに置き換えた他は、色素Ｄ－１と同様の方法で合成し、色素Ｄ－２を合成した。ＬＣ－ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝６２１（[Ｍ－２（Ｂｒ－）＋（ＨＣＯＯ－）]＋）にＭＳシグナルを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（３）色素Ｄ－３の合成
　色素Ｄ－１の合成において、５－クロロ－２－メチルベンゾチアゾールを２－メチルベンゾオキサゾールに置き換えた他は、色素Ｄ－１と同様の方法で合成し、色素Ｄ－３を合成した。ＬＣ－ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝５８９（［Ｍ－２（Ｂｒ－）＋（ＨＣＯＯ－）］＋）にＭＳシグナルを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（４）色素Ｄ－４の合成
　化合物Ｄ－１ａから色素Ｄ－１を得る合成反応において、化合物Ｄ－１ａを化合物（Ｄ－４Ａ）に置き換えた他は、色素Ｄ－１と同様の方法で合成し、色素Ｄ－４を合成した。ＬＣ－ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝６４１（［Ｍ－２（Ｂｒ－）＋（ＨＣＯＯ－）］＋）にＭＳシグナルを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（５）色素Ｄ－５の合成
　化合物Ｄ－１ａから色素Ｄ－１を得る合成反応において、化合物Ｄ－１ａを化合物（Ｄ－５Ａ）に置き換えた他は、色素Ｄ－１と同様の方法で合成し、色素Ｄ－５を合成した。ＬＣ－ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝６７７（［Ｍ－２（Ｂｒ－）＋（ＨＣＯＯ－）］＋）にＭＳシグナルを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
  
（６）色素Ｄ－６の合成
　化合物Ｄ－１ａから色素Ｄ－１を得る合成反応において、化合物Ｄ－１ａを化合物（Ｄ－６Ａ）に置き換えた他は、色素Ｄ－１と同様の方法で合成し、色素Ｄ－６を合成した。ＬＣ－ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝７７３（［Ｍ－２（Ｂｒ－）＋（ＨＣＯＯ－）］＋）にＭＳシグナルを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（７）色素Ｄ－７の合成
　化合物Ｄ－１ａから色素Ｄ－１を得る合成反応において、化合物Ｄ－１ａを化合物（Ｄ－７Ａ）に置き換えた他は、色素Ｄ－１と同様の方法で合成し、色素Ｄ－７を合成した。ＬＣ－ＭＳ測定（溶媒：テトラヒドロフラン／水、バッファー：ギ酸）において、ポジティブモードでｍ／ｚ＝７８５（［Ｍ－２（Ｂｒ－）＋（ＨＣＯＯ－）］＋）にＭＳシグナルを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
  
（８）病理診断用染色液の調製
　上記で合成した色素Ｄ－１を０．１５ｇと、蒸留水７３ｇとを１００ｍｌナスフラスコにいれ、１２時間撹拌して溶解させた後に、エチレングリコール２７．７５ｇを添加して１時間撹拌し、Ｎｏ．１の病理診断用染色液を調製した。
　色素Ｄ－１を０．１０ｇ、蒸留水を７５ｇ、エチレングリコールを２５．５ｇに変更した以外は上記Ｎｏ．１の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．２の病理診断用染色液を調製した。
　色素Ｄ－１を０．０７５ｇ、蒸留水を７５ｇ、エチレングリコールを２５．５ｇに変更した以外は上記Ｎｏ．１の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．３の病理診断用染色液を調製した。
　Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ－１の０．１０ｇを、色素Ｄ－２の０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．４の病理診断用染色液を調製した。
　Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ－１の０．１０ｇを、色素Ｄ－３の０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．５の病理診断用染色液を調製した。
　Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ－１の０．１０ｇを、色素Ｄ－４の０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．６の病理診断用染色液を調製した。
　Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ－１の０．１０ｇを、色素Ｄ－５の０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．７の病理診断用染色液を調製した。
　Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ－１の０．１０ｇを、色素Ｄ－６の０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．８の病理診断用染色液を調製した。
　Ｎｏ．２の病理診断用染色液の作製において、色素Ｄ－１の０．１０ｇを、色素Ｄ－７の０．１０ｇに置き換えた以外は上記Ｎｏ．２の病理診断用染色液の調製と同様にして、Ｎｏ．９の病理診断用染色液を調製した。
　Ｎｏ．ｃ１の病理診断用染色液として、ヘマトキシリン３Ｇ（サクラファインテックジャパン社製）を用いた。
＜２－１．病理診断用染色液を用いた標本の作製＞
　１０％中性ホルマリン緩衝液にて固定したラット肝臓及び腎臓のそれぞれについて、常法に従い、ティシュー・テック　パラフィン　ワックス　ＩＩ６０（サクラファインテックジャパン社製、商品名）を用いてパラフィンブロックを作製し、ミクロトーム（ＲＥＭ－７１０、大和光機社製）を用いて２μｍの薄さに薄切し、パラフィン切片を作製した。得られたパラフィン切片について、以下の手順で染色し、標本を作製した。
・上記切片の脱パラフィン（順に、キシレンに５分×３回浸漬、エタノールに５分×３回浸漬、９０％エタノールに浸漬、７０％エタノールに浸漬、水洗浄）を行った。
　　　↓
・上記で調製した病理診断用染色液に１分浸漬した。
　　　↓
・流水で５分水洗した。
　　　↓
・１％ＨＣｌ水溶液に５秒浸漬した。
　　　↓
・流水で５分水洗した。
　　　↓
・エオジン染色液に１分浸漬した。
　　　↓
・流水で２秒水洗した。
　　　↓
・９５％エタノールに２秒浸漬した。
　　　↓
・エタノールに２秒×２回浸漬した。
　　　↓
・エタノールに５分×３回浸漬した。
　　　↓
・キシレンに５分×３回浸漬した。
　　　↓
・エンテランニュー（メルク社製）にて封入し、標本を作製した。
＜２－２．標本観察＞
　顕微鏡にＢＸ５３（オリンパス社製）、顕微鏡用カメラにＤＰ７０（オリンパス社製）を用いて、上記の方法で作製した標本を観察し、以下の評価を行った。
（評価１）細胞核染色性
－　評価基準　－
　Ａ：細胞核が選択的に、かつ濃く染色された。
　Ｂ：細胞核の染色濃度が薄い。
（評価２）エオジン染色との色のコントラスト
－　評価基準　－
　Ａ：上記染色液による細胞核染色と、エオジンによる細胞質染色との色の区別が明瞭である。
　Ｂ：上記染色液による細胞核染色と、エオジンによる細胞質染色との色の区別が明瞭でない。
（評価３）染色液の経時安定性
　染色液調製後１時間以内（Ｎｏ．ｃ１の染色液の場合は、開封後１時間以内）の染色液と、２５℃で２週間保管後（Ｎｏ．ｃ１の染色液の場合は、開封してから２５℃で２週間保管後）の染色液との間で染色液の状態（析出の有無）の比較及び吸収スペクトル変化を比較し、以下の評価基準で評価を行った。
　吸収スペクトル変化については、最大吸光波長における吸光度を測定することで評価した。吸光度の測定は、ＵＶ－３６００（島津製作所製）を用いて行った。吸収強度の変化量は下記式により算出した。
 
　吸収強度の変化量（％）＝｛１００×（２週間保存後の吸光度）／（染色液調製後１時間以内の吸光度）｝－１００
 
－　評価基準（析出の有無）　－
　Ａ：２５℃で２週間保管後も色素の析出が認められず、吸収強度の変化も認められない。
　Ｂ：２５℃で２週間保管後に色素の析出が認められる。
－　評価基準（吸収スペクトル変化）　－
　Ａ：吸収強度の変化量が５％未満
　Ｂ：吸収強度の変化量が５％以上、１０％未満
　Ｃ：吸収強度の変化量が１０％以上、２０％未満
　Ｄ：吸収強度の変化量が２０％以上、３０％未満
　Ｅ：吸収強度の変化量が３０％以上、４０％未満
　Ｆ：吸収強度の変化量が４０％以上
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　上記表１に示される通り、本発明の病理診断用染色剤（Ｎｏ．１～６）を用いた場合、細胞核染色性の評価、エオジン染色との色のコントラストの評価のいずれにおいても、ＨＥ染色と同様に優れた結果となった。さらに、本発明の病理診断用染色剤を用いた染色液（Ｎｏ．１～６）は、長期保存しても色素の析出を生じにくく、ヘマトキシリンを含有する染色液（Ｎｏ．ｃ１）に比べて格段に使い勝手がよいものであった。
＜３－１．特殊染色（ＰＡＳ染色）＞
　上記で作製したラットパラフィンブロック（腎臓）のパラフィン切片について、マイヤーヘマトキシリン液（武藤化学社製）又は病理診断用染色液Ｎｏ．１を用いて、下記手順によりＰＡＳ（periodic　acid-Schiff：過ヨウ素酸シッフ）染色を実施した。
・上記切片の脱パラフィン（順にキシレンに５分×３回浸漬、エタノールに５分×３回浸漬、９０％エタノールに浸漬、７０％エタノールに浸漬、水洗浄）を行った。
　　　↓
・１％過ヨウ素酸水溶液に１０分浸漬した。
　　　↓
・流水で５分水洗した。
　　　↓
・コールドシッフ試薬に１０分浸漬した。
　　　↓
・亜硫酸水（３槽×３回）に各３分浸漬した。
　　　↓
・流水で５分水洗した。
　　　↓
・マイヤーヘマトキシリンに１０秒×２回もしくは病理診断用染色液Ｎｏ．１に１分浸漬した。
　　　↓
・流水で５分水洗した。
　　　↓
・エオジン染色液に１分浸漬した。
　　　↓
・流水で２秒水洗した。
　　　↓
・９５％エタノールに２秒浸漬した。
　　　↓
・エタノールに２秒×２回浸漬した。
　　　↓
・エタノールに５分×３回浸漬した。
　　　↓
・キシレンに５分×３回浸漬した。
　　　↓
・エンテランニューにて封入し、標本を作製した。
　上記の方法で作製した標本を、顕微鏡にＢＸ５３（オリンパス社製）、顕微鏡用カメラにＤＰ７０（オリンパス社製）を用いて観察した。
　ＰＡＳ染色において、マイヤーヘマトキシリン液を用いた染色では、グリコーゲン及び粘液は赤～赤紫色に染まった。一方、病理診断用染色液Ｎｏ．１を用いた染色では青紫色に染まり、マイヤーヘマトキシリン液と同等の染色性を示した。
＜３－２．特殊染色（ＰＡＭ染色）＞
　上記で作製したラットパラフィンブロック（腎臓）のパラフィン切片について、マイヤーヘマトキシリン液（武藤化学社製）又は病理診断用染色液Ｎｏ．１を用いて、下記手順によりＰＡＭ（periodic　acid　meth-enamine　silver：過ヨウ素酸メテナミン銀）染色を実施した。
・上記切片の脱パラフィン（順にキシレンに５分×３回浸漬、エタノールに５分×３回浸漬、９０％エタノールに浸漬、７０％エタノールに浸漬、水洗浄）を行った。
　　　↓
・５％重クロム酸カリウム水溶液に３０分浸漬した。
　　　↓
・流水で１０分水洗した。
　　　↓
・１％過ヨウ素酸水溶液に１５分浸漬した。
　　　↓
・流水で５分水洗した。
　　　↓
・５５℃のメセナミン銀液に２時間浸漬した。
　　　↓
・精製水（３槽）に２分浸漬した。
　　　↓
・０．２％塩化金水溶液に５分浸漬した。
　　　↓
・流水で２分水洗した。
　　　↓
・しゅう酸ホルマリン液に１分浸漬した。
　　　↓
・流水で１分水洗した。
　　　↓
・希釈酸性硬膜定着液に２分浸漬した。
　　　↓
・流水で５分水洗した。
　　　↓
・マイヤーヘマトキシリンに１０秒×２回もしくは病理診断用染色液Ｎｏ．１に１分浸漬した。
　　　↓
・流水で５分水洗した。
　　　↓
・エオジン染色液に１分浸漬した。
　　　↓
・流水で２秒水洗した。
　　　↓
・９５％エタノールに２秒浸漬した。
　　　↓
・エタノールに２秒×２回浸漬した。
　　　↓
・エタノールに５分×３回浸漬した。
　　　↓
・キシレンに５分×３回浸漬した。
　　　↓
・エンテランニューにて封入し、標本を作製した。
　上記の方法で作製した標本を、顕微鏡にＢＸ５３（オリンパス社製）、顕微鏡用カメラにＤＰ７０（オリンパス社製）を用いて観察した。
　ＰＡＭ染色において、マイヤーヘマトキシリン液を用いた染色及び病理診断用染色液Ｎｏ．１を用いた染色のいずれも、基底膜及び細網線維が黒色に染まる染色が確認された。すなわち、病理診断用染色液Ｎｏ．１はマイヤーヘマトキシリン液と同様に、良好な染色性を示した。
　また、病理診断用染色液Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．ｃ１について、ＲＦ－５３００（島津製作所製）を用いて蛍光強度測定を行ったところ、病理診断用染色液Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３については赤色蛍光が観測され、病理診断用染色液Ｎｏ．ｃ１については蛍光が観測されなかった。このことから、本発明の病理診断用染色剤を用いた場合には、蛍光顕微鏡を用いた観察による診断もできることがわかった。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、２０１７年２月２７日に日本国で特許出願された特願２０１７－０３４９６６に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (11)

  1. 　下記式（１）で表される色素を含有する病理診断用染色剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式中、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１及びＲ１２は水素原子又は置換基を示す。Ｒ１３～Ｒ１５は水素原子又は置換基を示す。Ａ１及びＡ２は－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－ＮＲ１６－又は－ＣＲ１７Ｒ１８－を示し、Ｒ１６～Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｎ１は０～３の整数であり、ｍは１～４の整数である。Ｘ－はアニオン性の対イオンを示す。
  2. 　前記式（１）で表される色素が下記式（２）で表される、請求項１に記載の病理診断用染色剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     上記式中、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２は、それぞれ、式（１）におけるＲ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２、Ａ１及びＡ２と同義である。Ｒ２１－は－Ｏ－、－Ｓ－又は－Ｃ（ＣＮ）２ －を示し、Ｒ２２は＝Ｏ、＝Ｓ又は＝Ｃ（ＣＮ）２を示す。
  3. 　前記色素が、Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１６～Ｒ１８から選ばれる少なくとも１つの基の中にカチオン性基を有する、請求項１又は２に記載の病理診断用染色剤。
  4. 　前記カチオン性基が下記式（Ｋ－１）～（Ｋ－３）のいずれかで表される基である、請求項３に記載の病理診断用染色剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     式中、＊は結合部位を示す。Ｒ２１～Ｒ２７はアルキル基又はアリール基を示す。環αは含窒素芳香族環を示す。
  5. 　前記カチオン性基を前記Ｒ１１及びＲ１２が有する、請求項３又は４に記載の病理診断用染色剤。
  6. 　水を含有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の病理診断用染色剤。
  7. 　アルコールを含有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の病理診断用染色剤。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む、細胞核染色方法。
  9. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の病理診断用染色剤を用いて細胞核を染色することを含む、病理標本の製造方法。
  10. 　エオジン染色により細胞質を染色することを含む、請求項９に記載の病理標本の製造方法。
  11. 　下記式（３）で表される色素。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     上記式中、Ｒ１～Ｒ８は水素原子又は置換基を示し、Ｒ３１～Ｒ３６はアルキル基又はアリール基を示す。Ｌ３１及びＬ３２は連結基を示す。Ａ１及びＡ２は－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－ＮＲ１６－又は－ＣＲ１７Ｒ１８－を示し、Ｒ１６～Ｒ１８は水素原子又は置換基を示す。ｍ１は２～４の整数である。Ｘ－はアニオン性の対イオンを示す。
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