WO2014136776A1 - 蛍光標識用樹脂粒子 - Google Patents

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    • G01N2800/7028—Cancer

Definitions

  • the present invention relates to a resin particle for fluorescent labeling that can be used in pathological diagnosis and the like.
  • Pathological diagnosis is performed as one of medical diagnoses.
  • the pathologist diagnoses the disease from a piece of tissue collected from the human body and tells the clinician whether treatment or surgery is necessary.
  • the medical doctor determines the drug treatment policy, and the surgical doctor determines whether or not to perform the operation.
  • tissue specimens obtained by organ excision and needle biopsy are sliced to a thickness of several microns to create tissue specimens, and they are widely observed with an optical microscope to obtain various findings. It has been broken.
  • a specimen is prepared by dehydrating and collecting a paraffin block to fix the collected tissue, then slicing it to a thickness of several ⁇ m, and removing the paraffin.
  • DAB staining is a dye staining method using peroxidase with diaminobenzidine (DAB) as a substrate as an enzyme label.
  • staining with an enzyme label such as DAB staining has a problem that it is difficult to estimate the actual antibody expression level from the staining concentration, because the staining concentration greatly depends on environmental conditions such as temperature and time. For this reason, in immunological observation in pathological diagnosis, a fluorescent labeling method using a fluorescent label excellent in quantitative performance instead of enzyme labeling has recently been used in pathological diagnosis.
  • Patent Document 1 discloses fluorescent particles containing one or more organic dyes and an organic fluorescent dye (FRET donor dye and acceptor dye) having an excitation wavelength longer than that of the organic dye.
  • FRET donor dye and acceptor dye organic fluorescent dye
  • Patent Document 2 describes fluorescent organic dye-encapsulated silica nanoparticles containing a fluorescent organic dye (Texas Red is used in the examples) used in a pathological diagnosis information generation method (system).
  • Patent Document 3 discloses one or more hydrophilic organic dyes or organic fluorescent dyes (in the examples, 8-hydroxy-1,3,6-pyrenetrisulfonic acid sodium salt is used). Melamine-formaldehyde particles containing are described.
  • the phosphor is likely to fade due to the excitation light collected by the lens. There is a problem that it is difficult.
  • a significant decrease in emission intensity due to discoloration causes a decrease in the number of bright spots and deteriorates quantitativeness.
  • the phosphors based on silica as described in Patent Documents 1 and 2 generally have low fluorescence intensity and low light resistance.
  • fluorescent dye-containing particles based on melamine / formaldehyde (melamine resin) using organic fluorescent dyes specifically described in Patent Document 3 have room for improvement in fluorescence intensity and light resistance.
  • 8-hydroxy-1,3,6-pyrenetrisulfonic acid sodium salt used in Examples of Patent Document 3 is not a fluorescent dye that satisfies the specific criteria of the present invention described later.
  • the present inventors select a fluorescent dye that can solve the above-mentioned problems by selecting a fluorescent dye to be immobilized on the resin particle that satisfies a specific standard related to the concentration of the fluorescent dye aqueous solution and its emission intensity.
  • the present invention was completed. That is, a fluorescent dye that does not easily cause concentration quenching is selected according to a specific standard, and typically, the resin synthesis reaction proceeds while mixing with the resin raw material, and the fluorescent dye is encapsulated in the formed resin particles.
  • the resin particles for fluorescent labeling obtained by this method do not cause concentration quenching while fixing (encapsulating) a relatively large amount of fluorescent dye, so that they are difficult to fade even if the fluorescence is applied for a certain period of time during fluorescence observation. .
  • [Claim 1] A fluorescent dye resin particle, wherein a fluorescent dye satisfying both of the following conditions (1) and (2) is immobilized on a resin particle.
  • the peak of the emission intensity depending on the concentration of the fluorescent dye alone in the aqueous solution is in the range of 30 to 80 ⁇ M (M: molar concentration mol / liter).
  • M molar concentration mol / liter
  • the emission intensity at a concentration of 100 ⁇ M is 80% or more of the peak emission intensity.
  • [Section 2] Item 2.
  • the fluorescent labeling resin particle according to Item 1, wherein the Stokes shift in the aqueous solution of the fluorescent dye is 25 nm or more.
  • Luminance Molar extinction coefficient ⁇ Quantum yield ⁇ 1/1000
  • the resin particles for fluorescent labeling of the present invention are superior in light resistance and difficult to fade compared to conventional particles, it is possible to suppress a decrease in fluorescence intensity with the passage of observation (excitation light irradiation) time. Moreover, the resin particle for fluorescent labeling of the present invention satisfies a high level in terms of initial emission intensity. As a result, bright spot measurement can be performed while maintaining quantitativeness without being affected by the observation time. Such an effect is particularly useful for improving the accuracy of pathological diagnosis.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the concentration of an aqueous solution and the emission intensity when the five typical fluorescent dyes used in Examples and Comparative Examples are not subjected to water solubilization treatment.
  • the fluorescent labeling resin particle is a term that collectively refers to substances having a structure in which a plurality of fluorescent dye molecules are immobilized on the resin particle by a chemical or physical action, and the form thereof is not particularly limited.
  • encapsulated type in which the fluorescent dye is mainly encapsulated in the resin particles, which is obtained by a production method in which a polymerization reaction of the resin proceeds while mixing a resin raw material such as melamine resin and the fluorescent dye.
  • fluorescent labeling resin particles examples include fluorescent labeling resin particles.
  • Such encapsulated fluorescent labeling resin particles can immobilize a large number of fluorescent dye molecules, but by selecting an appropriate fluorescent dye according to the present invention, concentration quenching can be suppressed and high fluorescence intensity and light resistance can be achieved. Can be achieved.
  • resin particles for fluorescent labeling in which a fluorescent dye is encapsulated in resin particles for example, resin particles made of melamine resin) containing a thermosetting resin in which a dense cross-linked structure is formed are preferable.
  • the fluorescent dye is mainly adsorbed on the surface of the resin particles obtained by a manufacturing method of adding the fluorescent dye to the dispersion.
  • the fluorescent labeling resin particles in the form (adsorption type) are also included.
  • the fluorescent dye is confined in the particle by at least the molecular structure of the resin (for example, a three-dimensional network structure possessed by a thermosetting resin such as melamine resin). Furthermore, an electrostatic interaction (ionic bond) works between the functional group or part of the fluorescent dye and the functional group or part of the resin, or a covalent bond is formed between them. It is preferable that the fluorescent dye is more firmly fixed to the resin particles since the fluorescent dye can be prevented from being eluted out of the particles by the organic solvent (xylene) used in the tissue staining penetration process.
  • the organic solvent xylene
  • the above “electrostatic interaction” works when the fluorescent dye has a positively or negatively charged substituent or site, and the resin molecule has an oppositely charged substituent or site.
  • having a positively or negatively charged substituent or moiety only needs to be in such a state when the fluorescent dye or resin is dissolved in neutral, acidic or basic water.
  • the negatively charged substituent or moiety is typically a sulfo group (—SO 3 ⁇ ), but other examples include a phosphoryl group, a phenolic hydroxyl group, and a carboxyl group.
  • the positively charged substituent or moiety is typically an amino group (—NH 3 + ), but in addition, an aromatic amino group, a cyclic amino group (pyridinyl group, triazolyl group, etc.), a hydrazinyl group, etc. Is mentioned.
  • Substituents or sites as described above for the resin may be those introduced into the fluorescent dye and the resin raw material (monomer) prior to the production process of the resin particle for fluorescent labeling, for example, melamine resin, An amino group contained in a urea resin or the like may be formed in a process in which H + is attached to the amino group and protonated.
  • substituents or sites for the fluorescent dye may be those previously possessed by a fluorescent dye molecule that is commercially available as a commercial product, or “water-soluble treatment” ( It may be introduced by acid treatment). Since the electrostatic interaction tends to become stronger as the number of charged substituents and the like possessed by the resin and the fluorescent dye (per molecule or per molecular weight of a predetermined unit) increases, the electrostatic interaction of the desired strength It is preferable to adjust their number so that the action works.
  • examples of the “covalent bond” include an amide bond, an ester bond, an ether bond, and a CN bond.
  • a fluorescent dye and a resin raw material (monomer) having a functional group or a site capable of forming a covalent bond as described above are selected, and a pre-reaction is performed in advance prior to the resin synthesis reaction. What is necessary is just to make the obtained derivatized resin raw material react in a superposition
  • the unreacted product reacts with the resin raw material or the produced resin to form a covalent bond with the fluorescent dye added to the resin raw material in the polymerization process.
  • a style may be used.
  • the fluorescent labeling resin particles are of the adsorption type
  • the functional group or site on the surface of the resin particle and the functional group or site of the fluorescent dye have There must be an electrostatic interaction between them, or a covalent bond must be formed between them.
  • the same electrostatic interaction as in the case of the inclusion type described above can be used.
  • the process for forming the covalent bond similar to the case of the inclusion type mentioned above may be provided after the synthesis of the resin particles.
  • the particle diameter of the fluorescent labeling resin particles is not particularly limited as long as it is a particle diameter suitable for an application such as immunostaining of a tissue section, but is usually 10 to 500 nm, and preferably 50 to 200 nm. Further, the coefficient of variation indicating the variation in particle diameter is not particularly limited, but is usually 20% or less, and preferably 5 to 15%.
  • the fluorescent labeling resin particles having such a particle diameter can be obtained, for example, by a manufacturing method as described later.
  • the particle diameter of the fluorescent labeling resin particles is obtained by taking an electron micrograph using a scanning electron microscope (SEM), measuring the cross-sectional area of the fluorescent labeling resin particles, and measuring the measured value with the corresponding circle area. Can be measured as the diameter (area circle equivalent diameter).
  • the average (average particle size) and coefficient of variation of the particle size of the fluorescent labeling resin particle population are measured as described above for a sufficient number (for example, 1000) of fluorescent labeling resin particles. After that, the average particle diameter is calculated as its arithmetic average, and the coefficient of variation is calculated by the formula: 100 ⁇ standard deviation of particle diameter / average particle diameter.
  • the fluorescent labeling resin particles of the present invention have a sufficient initial emission intensity at the start of excitation light irradiation, and can maintain a constant emission intensity even after irradiation with excitation light for a predetermined time. It can be manufactured as an excellent one.
  • the initial emission intensity and the retention rate of the emission intensity vary depending on various conditions and materials selected for the production of the fluorescent labeling resin particles, and the evaluation method, and an absolute evaluation standard cannot be established. .
  • the fluorescent labeling resin particles of the present invention are preferably Has a retention of emission intensity of 60% or more, more preferably 75% or more.
  • the fluorescent dye in the present invention has (1) the peak of the emission intensity depending on the concentration of the fluorescent dye alone in the aqueous solution is in the range of 30 to 80 ⁇ M, and (2) the emission intensity at the concentration of 100 ⁇ M is the peak. There is no particular limitation as long as both the conditions of 80% or more of the emission intensity are satisfied.
  • Whether or not the condition (1) is satisfied indicates a peak of the emission intensity when a multi-stage dilution of an aqueous solution of a fluorescent dye alone is prepared and the emission intensity of each dilution is measured and compared under the same conditions. Whether the concentration of the diluted solution is within the range of 30 to 80 ⁇ M can be determined.
  • Whether or not the condition (2) is satisfied is determined by preparing a diluted solution having a concentration of 100 ⁇ M at the time of measurement related to the above condition (1), and whether or not the emission intensity is 80% or more of the emission intensity of the peak. Can be determined.
  • the condition (2) is preferably such that the emission intensity at a concentration of 100 ⁇ M is 85% or more of the peak emission intensity, more preferably 90% or more.
  • the method for measuring the emission intensity is not particularly limited, and it may be measured under general measurement conditions using a general fluorometer.
  • the wavelength of the excitation light to be irradiated and the emission wavelength to be measured are respectively set to the maximum excitation wavelength and the maximum emission wavelength for the fluorescent dye, or a wavelength in the vicinity thereof.
  • the slit widths for excitation light and light emission may be adjusted within an appropriate range.
  • the maximum excitation wavelength and the maximum emission wavelength can be measured by a general method. If the fluorescent dye is a commercial product, it may be regarded as the wavelength described in the catalog.
  • the larger the Stokes shift of the fluorescent dye that is, the difference between the maximum excitation wavelength and the maximum emission wavelength, the smaller the overlap between the absorption spectrum and the emission spectrum (self-absorption).
  • concentration quenching is suppressed, and resin particles for fluorescent labeling with high emission intensity can be easily obtained, and quantitative sensitivity is also improved.
  • the magnitude of the Stokes shift of the fluorescent dye used is not particularly limited.
  • a fluorescent dye having a Stokes shift of 25 nm or more It is preferable because it is easy to satisfy (1) and (2) and it is easy to produce fluorescent labeling resin particles having appropriate fluorescence intensity according to the application.
  • Fluorescent dyes can easily satisfy the conditions (1) and (2) when subjected to water-solubilization treatment. That is, among fluorescent dyes that do not normally satisfy the conditions (1) and (2), the conditions (1) and (2) are satisfied by performing the water-solubilization treatment, and the conditions ( Similar to the fluorescent dyes that satisfy 1) and (2), there are those that become fluorescent dyes that can be used in the present invention.
  • the fluorescent dye that satisfies the conditions (1) and (2) without being subjected to the water-solubilization treatment is also the one after the water-solubilization treatment (usually, the fact that the conditions (1) and (2) are naturally satisfied is maintained). It may be used.
  • the water-solubilization treatment of fluorescent dyes improves the dispersity and emission intensity of dyes, especially in encapsulated fluorescent labeling resin particles. As a result, particles with higher emission intensity and higher light resistance can be obtained, and quantification in pathological observation Sensitivity can be improved.
  • the Stokes shift of the fluorescent dye may spread to 25 nm or more by performing the water-solubilization treatment.
  • a fluorescent dye having a Stokes shift of less than 25 nm may be used with a Stokes shift of 25 nm or more due to the water-solubilization treatment.
  • the water-solubilization treatment is not particularly limited as long as it is a technique that can solubilize the fluorescent dye, that is, improve the solubility in water.
  • Specific examples of the water solubilization treatment include a method in which a fluorescent dye is treated with an acid (concentrated sulfuric acid, concentrated hydrochloric acid, acetic acid, formic acid, etc.) or an aldehyde (formaldehyde, acetaldehyde, etc.), and these are reacted with the fluorescent dye.
  • acid treatment which is generally excellent in effect is preferred.
  • the compound used for the water-solubilization treatment for example, the preferred acid used for the acid treatment varies depending on the fluorescent dye to be treated.
  • concentrated hydrochloric acid is suitable for HiLyte Fluor, and when concentrated sulfuric acid is used, it is quenched.
  • Concentrated sulfuric acid is suitable for Dylight 594, and when concentrated hydrochloric acid is used, it will fade.
  • those skilled in the art can select an appropriate one from candidate compounds (acids) without undue trial and error.
  • the measured value of the luminescence intensity can be a relative numerical value expressed in arbitrary units au (arbitrary unit) as long as the measurement conditions of the comparison objects match.
  • the measured value of the luminescence intensity can be a relative numerical value expressed in arbitrary units au (arbitrary unit) as long as the measurement conditions of the comparison objects match.
  • luminance represented by the following formula.
  • Luminance Molar extinction coefficient ( ⁇ ) ⁇ Quantum yield ( ⁇ ) ⁇ 1/1000
  • the brightness represented by the above formula of the fluorescent dye used in the present invention is not particularly limited as long as it can produce fluorescent labeling resin particles having appropriate fluorescence intensity according to the application.
  • a fluorescent dye having a luminance at the peak of emission intensity as described above of 100,000 or more is preferable because it is easy to produce such fluorescent labeling resin particles.
  • Fluorescent dyes that can be generally obtained or produced include, for example, rhodamine dye molecules, squarylium dye molecules, cyanine dye molecules, aromatic hydrocarbon dye molecules, oxazine dye molecules, carbopyronine dye molecules, and pyromesene dyes.
  • Dye molecules Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecule, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecule, Cy (registered trademark, manufactured by GE Healthcare) dye molecule, DY dye Molecules (registered trademark, manufactured by DYOMICICS), HiLyte (registered trademark, manufactured by Anaspec) dye molecule, DyLight (registered trademark, manufactured by Thermo Scientific) dye molecule, ATTO (registered trademark, manufactured by ATTO-TEC) ) Dye molecules, MFP (registered trademark, manufactured by Mobitec) It can be classified into molecular iodine.
  • the generic names of such dye molecules are named based on the main structure (skeleton) in the compound or the registered trademark, and the range of fluorescent dyes belonging to each is appropriate for those skilled in the art without undue trial and error. Can be grasped.
  • rhodamine dye molecules include 5-carboxy-rhodamine, 6-carboxy-rhodamine, 5,6-dicarboxy-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine (ROX), 5-carboxy-X. -Rhodamine (5-ROX), Texas Red (Texas Red), Spectrum Red, LD700 PERCHLORATE, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 615, and the like.
  • squarylium dye molecule examples include SRfluor 680-Carboxylate, 1,3-Bis [4- (dimethylamino) -2-hydroxyphenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 1,3-Bis, dimethylyl)) phenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 2- (4- (Dithylamino) -2-hydroxy-4-hydroxy, 4- (dithyrimino) -2-hydryloxy-2-hydroxy-3-2-hydroxy-3 oxocyclobut-1-eno ate, 2- (4- (Dibutylamino) -2-hydroxyphenyl) -4- (4- (dibutylimino) -2-hydroxycyclohexa-2,5-diylenedene) -3-oxycyclobut-1-enolate, 2- (8-Hydroxy) -1,1,7,7-tetramethyl
  • cyanine dye molecules include 1-Butyl-2- [5- (1-butyl-1,3-dihydro-3,3-dimethyl-2H-indol-2-ylidene) -penta-1,3. -Dienyl] -3,3-dimethyl-3eiti-indolium hexafluorophosphate, 1-Butyl-2- [5- (1-butyl-3,3-dimethyl-1,3-dihydro-indol-2-ylidene) -3- chloro-penta-1,3-dienyl] -3,3-dimethyl-3H-indolium hexafluorophosphate, 3-Ethyl-2- [5- (3-ethyl-3H-benzothiazol-2-ylide e) -penta-1,3-dienyl] -benzothiazol-3-ium iodide, and the like.
  • aromatic hydrocarbon dye molecule examples include N, N-Bis- (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12- (4-tert-butylphenoxy) -perylene-3,4,9 , 10-tetracarbonbonide diimide, N, N′-Bis (2,6-diisopropenylphenyl) -1,6,7,12-tetraphenylperylene-3, 4: 9,10-tetracarboximide, N, N′-Bis (2,6 -Diisopropylphenyl) perylene-3,4,9,10-bis (dicarbide), 16, N, N'-Bis (2,6-dimethylphenyl) perylene-3,4,9,10-tetracar boxylic diimide, 4,4 '-[(8,16-Dihydro-8,16-dioxodibenzo [a, j] perylene-2,10-diyl) di
  • oxazine dye molecule examples include Cresyl violet, Oxazine 170, EVOblue 30, Nile Blue, and the like.
  • carbopyronine dye molecules include CARBOPIRONIN 149.
  • dipyrromethene (pyromesene) dye molecule examples include PYRROMETHENE650.
  • Alexa Fluor dye molecules mainly having a rhodamine skeleton
  • Alexa Fluor 555 Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635 Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, etc. (manufactured by Invitrogen).
  • BODIPY dye molecules mainly having a dipyrromethene skeleton
  • BODIPY FL BODIPY TMR
  • BODIPY TR BODIPY TR
  • BODIPY 530/550 BODIPY 558/568
  • BODIPY 564/570 BODIPY 589
  • BODIPY 581/591 BODIPY 630/650
  • BODIPY 650/665 manufactured by Invitrogen
  • Cy-based dye molecule examples include Cy3.5, Cy5, Cy5.5 (manufactured by GE Healthcare).
  • DY dye molecule (mainly having a rhodamine skeleton) include DY-590, DY-610, DY-615, DY-630, DY-631, DY-632, DY-633, DY-634 ( As mentioned above, manufactured by DYOMICS).
  • HiLyte dye molecules include HiLyte 594, HiLyteFluor® TR (manufactured by Anaspec).
  • DyLight-based dye molecule mainly having a rhodamine skeleton
  • DyLight 594 mainly having a rhodamine skeleton
  • DyLight 633 manufactured by Thermo Scientific
  • ATTO dye molecules mainly having a rhodamine skeleton
  • ATTO 590 ATTO 590
  • ATTO 610 ATTO 610
  • ATTO 620 ATTO 633
  • ATTO 655 ATTO 655
  • ATTO-TEC ATTO-TEC
  • MFP dye molecules include MFP590 and MFP631 (manufactured by Mobitec).
  • the dye examples include C-Phycocyanin, Phycocyanin, APC (Allophycocyanin), APC-XL, and NorthernLights 637 (manufactured by R & D Systems).
  • the present invention among the above-mentioned known fluorescent dye molecules (compounds) or water-soluble processed products thereof, those satisfying the above-mentioned conditions (1) and (2), preferably the above-mentioned Stokes shift and / or Alternatively, it is possible to select and use one that satisfies the conditions regarding luminance. Such a selection can be made by a person skilled in the art without undue trial and error according to the condition determination method as described above.
  • the desired emission wavelength of the fluorescent dye can be selected according to the application.
  • the emission wavelength of the fluorescent dye is preferably from red to near infrared so as not to cover the emission wavelength of eosin that emits fluorescence.
  • a fluorescent dye having an excitation maximum wavelength in the range of 555 to 620 nm and an emission maximum wavelength in the range of 580 to 770 nm is preferable.
  • fluorescent dyes that can be used in the present invention are as follows, but the present invention is not limited to the embodiment using these fluorescent dyes.
  • fluorescent dyes examples include 5-carboxy-X-rhodamine (5-ROX), Spectrum Red, Alexa Fluor 594, ATTO 590, DY-590, CAL Fluor Red 610. , DyLight 594.
  • 5-carboxy-X-rhodamine 5-ROX
  • Spectrum Red Alexa Fluor 594
  • ATTO 590 ATTO 590
  • DY-590 DY-590
  • DyLight 594 examples include 5-carboxy-X-rhodamine (5-ROX), Spectrum Red, Alexa Fluor 594, ATTO 590, DY-590, CAL Fluor Red 610.
  • fluorescent dyes examples include BODIPY 576/589, PYRROMETHENE 650, Cresyl violet, DY-610, and Texas Red.
  • the resin constituting the fluorescent labeling resin particles of the present invention may be a thermosetting resin or a thermoplastic resin.
  • a thermosetting resin such as a melamine resin that can fix the fluorescent dye inside a dense cross-linked structure is used.
  • a resin containing (consisting of) is preferred.
  • thermosetting resin is selected from the group consisting of melamine, urea, guanamines (including benzoguanamine, acetoguanamine, etc.), phenols (including phenol, cresol, xylenol, etc.), xylene, and derivatives thereof.
  • the thing containing the structural unit formed from at least 1 type of monomer is mentioned. Any of these monomers may be used alone or in combination of two or more. If desired, a comonomer other than one or two or more of the above compounds may be used in combination.
  • thermosetting resins include melamine / formaldehyde resins, urea / formaldehyde resins, benzoguanamine / formaldehyde resins, phenol / formaldehyde resins, and metaxylene / formaldehyde resins.
  • thermosetting resins As a raw material for these thermosetting resins, not only the monomer itself as described above but also a prepolymer obtained by reacting a monomer with a compound such as formaldehyde or other crosslinking agent in advance may be used.
  • a prepolymer obtained by reacting a monomer with a compound such as formaldehyde or other crosslinking agent in advance
  • methylol melamine prepared by condensing melamine and formaldehyde under alkaline conditions is generally used as a prepolymer, and the compound is further alkyl etherified (in water).
  • methylation for improving the stability of the resin butylated for improving the solubility in an organic solvent, etc.
  • thermosetting resin may be one in which at least a part of hydrogen contained in the structural unit is replaced with a charged substituent or a substituent capable of forming a covalent bond.
  • a thermosetting resin can be synthesized by using, as a raw material, a monomer in which at least one hydrogen is replaced by the above substituent (derivatized) by a known method.
  • melamine resin, urea resin, benzoguanamine resin, etc. usually have cations generated from amino groups or sites derived therefrom, and phenol resins, xylene resins, etc. usually generate anions from hydroxyl groups or sites derived therefrom.
  • thermosetting resin can be synthesized according to a known method.
  • a melamine / formaldehyde resin can be synthesized by heating and polycondensing methylolmelamine prepared in advance as described above, with a reaction accelerator such as acid added as necessary.
  • thermoplastic resin for example, at least one monofunctional monomer selected from the group consisting of styrene, (meth) acrylic acid and its alkyl ester, acrylonitrile, and derivatives thereof (involved in the polymerization reaction in one molecule).
  • thermosetting resins include polystyrene, styrene resins composed of styrene and other monomers, polymethyl methacrylate, (meth) acrylic acid and alkyl esters thereof, and other acrylic resins composed of other monomers, poly Examples thereof include acrylonitrile, AS resin (acrylonitrile-styrene copolymer), ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer), acrylonitrile resin composed of acrylonitrile and other monomers.
  • the thermoplastic resin is a structural unit formed from a polyfunctional monomer such as divinylbenzene (a group that participates in a polymerization reaction in one molecule, a monomer having two or more vinyl groups in the above example), that is, a crosslink.
  • a site may be included.
  • a cross-linked product of polymethyl methacrylate is exemplified.
  • thermoplastic resin may be one in which at least a part of hydrogen contained in the structural unit is replaced with a substituent having a charge or a covalent bond.
  • a thermoplastic resin can be synthesized by using, as a raw material, a monomer in which at least one hydrogen is replaced by the above substituent, such as 4-aminostyrene.
  • the thermoplastic resin may contain a structural unit having a functional group for surface-modifying the obtained fluorescent labeling resin particles.
  • a monomer such as glycidyl methacrylate having an epoxy group as a raw material
  • fluorescent labeling resin particles having an epoxy group oriented on the surface can be prepared.
  • This epoxy group can be converted to an amino group by reacting with excess ammonia water.
  • Various amino molecules can be introduced into the amino group thus formed according to a known method (via a molecule that serves as a linker, if necessary).
  • the fluorescent labeling resin particles of the present invention can be produced according to a known polymerization step (1) for various resins after using a fluorescent dye that satisfies specific conditions.
  • the fluorescent labeling resin particles obtained by such a method may be further linked with a biologically relevant binding substance in the modification step (2).
  • the encapsulated fluorescent labeling resin particles using a thermosetting resin can be basically produced according to an emulsion polymerization method, but are produced by the following polymerization step using a surfactant and a polymerization reaction accelerator. It is preferable.
  • most of the fluorescent dye is desirably immobilized in a state where substantially all of the fluorescent dye is encapsulated in the resin particles. It is not excluded that the fluorescent dye is immobilized on the surface of the resin particle in a bound or attached state.
  • the fluorescent dye is immobilized on the resin particles in the state where the fluorescent dye is encapsulated.
  • a derivatization step for covalently bonding the resin raw material and the fluorescent dye in advance or for introducing a positively charged substituent into the resin raw material (that Even if such a step is not used, fluorescent labeling resin particles having excellent light emission intensity and light resistance can be obtained), but it is not excluded to use such a step in combination as desired.
  • the polymerization step proceeds the polymerization reaction of the resin by heating a reaction mixture containing a fluorescent dye, a resin raw material (monomer or oligomer or prepolymer), preferably a surfactant and a polymerization reaction accelerator. This is a step of generating resin particles containing a fluorescent dye.
  • the order of addition of each component contained in the reaction mixture is not particularly limited. Typically, an order is used in which a surfactant is added to an aqueous solution of a fluorescent dye, a resin raw material is added, and finally a polymerization reaction accelerator is added. Alternatively, the order may be such that the resin raw material is added to the surfactant aqueous solution, and then the polymerization reaction accelerator is added to advance the resin particle synthesis reaction while the fluorescent dye aqueous solution is added. It should be noted that the concentration of the aqueous solution of the specific fluorescent dye according to the present invention used in such a polymerization process can be adjusted within a relatively high range (for example, 250 to 450 ⁇ M) than the concentration of the aqueous solution of the conventional fluorescent dye. it can.
  • Polymerization reaction conditions can be appropriately set in consideration of the type of resin and the composition of the raw material mixture.
  • the reaction temperature is usually 70 to 200 ° C.
  • the reaction time is usually 20 to 120 minutes.
  • the reaction temperature is a temperature at which the performance of the fluorescent dye does not deteriorate (within a heat resistant temperature range).
  • the heating may be performed in a plurality of stages. For example, the reaction may be performed at a relatively low temperature for a certain time, and then the temperature may be raised and the reaction may be performed at a relatively low temperature for a certain time.
  • Surfactant A known emulsifier for emulsion polymerization can be used as the surfactant.
  • Surfactants include anionic (anionic), nonionic (nonionic), and cationic (cationic) types. When synthesizing a (cationic) thermosetting resin having a positively charged substituent or moiety, it is preferable to use an anionic or nonionic surfactant. Conversely, when synthesizing a (anionic) thermosetting resin having a negatively charged substituent or moiety, it is preferable to use a cationic or nonionic surfactant.
  • anionic surfactant examples include sodium dodecylbenzenesulfonate (product name “Neopelex” series, Kao Corporation).
  • nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ether-based (product name “Emulgen” series, Kao Corporation) compounds, polyvinylpyrrolidone (PVP), and polyvinyl alcohol (PVA).
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • PVA polyvinyl alcohol
  • cationic surfactant examples include dodecyltrimethylammonium bromide.
  • the particle diameter of the resin particles can be adjusted, and the coefficient of variation of the particle diameter is small, that is, it is possible to produce fluorescent labeling resin particles having a uniform particle size. it can.
  • the amount of the surfactant added is, for example, 10 to 60% by weight based on the resin raw material, or 0.1 to 3.0% by weight based on the entire raw material mixture.
  • the polymerization reaction accelerator accelerates the polycondensation reaction of a thermosetting resin such as a melamine resin, and charges the functional group such as an amino group contained in the resin or fluorescent dye by adding a proton (H + ). , Has a function of facilitating electrostatic interaction.
  • a polymerization reaction accelerator include acids such as formic acid, acetic acid, sulfuric acid, paratoluenesulfonic acid, and dodecylbenzenesulfonic acid.
  • the fluorescent dye is a compound having a carboxyl group or a sulfo group, the fluorescent dye can also donate a proton in the same manner as the above acid.
  • the modification step performed as necessary is a step for connecting a biologically relevant binding substance or the like to the surface of the fluorescent labeling resin particle according to the use of the fluorescent labeling resin particle.
  • a fluorescent label one reactive functional group present on the surface
  • a biologically relevant binding substance the other reactive functional group present in the molecule
  • bonded directly it can also couple
  • Such a reaction can be performed by adding necessary reagents and allowing a predetermined time to elapse.
  • an amino group is introduced by reacting a fluorescent labeling resin particle having a hydroxyl group on the surface with a silane coupling agent (for example, aminopropyltrimethoxysilane), while a thiol group introducing reagent (for example, N is added to streptavidin).
  • a silane coupling agent for example, aminopropyltrimethoxysilane
  • a thiol group introducing reagent for example, N is added to streptavidin.
  • -Succimidyl S acetylthioacetic acid is reacted to introduce a thiol group
  • a PEG (polyethylene glycol) based linker molecule having a maleimide group that is reactive with both an amino group and a thiol group at both ends is reacted.
  • a method of linking fluorescent labeling resin particles and streptavidin is reacted.
  • an epoxy group derived from the monomer appears on the surface of the resin particle for fluorescent labeling.
  • the epoxy group can be converted into an amino group, and a desired biologically relevant binding substance or the like can be further linked to the amino group.
  • thermosetting resin particles containing no fluorescent dye are prepared in the same manner as in the polymerization step (1) of the encapsulated fluorescent labeling resin particles described above, except that the fluorescent dye is not used as a raw material. Subsequently, the obtained resin particles (its dispersion liquid) and a fluorescent dye (its aqueous solution) are mixed, and the fluorescent dye is adsorbed on the surface of the resin particles.
  • the thermosetting resin and the fluorescent dye of the resin particles preferably have substituents or sites having opposite charges and are adsorbed by electrostatic interaction.
  • thermoplastic resin inclusion type
  • the thermoplastic resin can be synthesized according to a known method such as radical polymerization or ionic polymerization (anionic polymerization, etc.).
  • Encapsulated fluorescent labeling resin particles using a thermoplastic resin can also be produced according to these methods, but it is preferred to produce them by, for example, a polymerization step according to a soap-free emulsion polymerization method.
  • the polymerization step (1) typically involves heating a reaction mixture containing a fluorescent dye, a resin raw material, and a polymerization initiator (benzoyl peroxide, azobisisobutyronitrile, etc.) to form a resin.
  • a polymerization initiator benzoyl peroxide, azobisisobutyronitrile, etc.
  • the polymerization initiator and polymerization reaction conditions can be appropriately set in consideration of the type of resin.
  • the reaction temperature is usually 20 to 150 ° C.
  • the reaction time is usually 10 to 240 minutes.
  • thermoplastic resin particles not containing a fluorescent dye are prepared in the same manner as in the polymerization step (1) of the encapsulated fluorescent labeling resin particles described above, except that the fluorescent dye is not used as a raw material. Subsequently, the obtained resin particles (its dispersion liquid) and a fluorescent dye (its aqueous solution) are mixed, and the fluorescent dye is adsorbed on the surface of the resin particles.
  • the thermoplastic resin and the fluorescent dye of the resin particle preferably have substituents or sites having opposite charges and are adsorbed by electrostatic interaction.
  • ⁇ Use of resin particles for fluorescent labeling (Fluorescent labeling agent)
  • the use of the resin particle for fluorescent labeling of the present invention is not particularly limited, but typically, the detection target substance contained in a sample (tissue section) is labeled so that fluorescence observation can be performed in immunostaining.
  • the substance to be detected is not particularly limited, but in pathological diagnosis, an antigen is generally selected according to the purpose.
  • an antigen is generally selected according to the purpose.
  • HER2 can be used as a detection target substance in pathological diagnosis related to breast cancer.
  • an antibody that specifically binds to the detection target substance
  • the complex composed of the resin particles for fluorescent labeling and the primary antibody can be directly bound to the detection target substance and fluorescently labeled (primary antibody method).
  • an antibody that binds to an antibody (primary antibody) that specifically binds to the substance to be detected
  • the primary antibody is an antibody (IgG) produced from a rabbit
  • the secondary antibody is an anti-rabbit IgG antibody.
  • the detection target substance can be indirectly fluorescently labeled by binding a complex composed of the fluorescent dye-immobilized resin particles and the secondary antibody to the primary antibody bound to the detection target substance (secondary antibody). Law).
  • the secondary antibody is complexed with a substance that can bind to the substance complexed with the fluorescent labeling resin particles.
  • a complex of resin particles for fluorescent labeling and avidin or streptavidin is used, a complex of a secondary antibody and biotin is used in combination.
  • a secondary antibody and biotin complex is bound to the primary antibody bound to the detection target substance, and a complex composed of a fluorescent dye-immobilized resin particle and avidin or streptavidin is further bound to the complex.
  • the substance to be detected can be indirectly fluorescently labeled (biotin-avidin method or sandwich method).
  • a complex of fluorescent labeling resin particles and biotin can be used in combination with a complex of a secondary antibody and avidin or streptavidin.
  • the primary antibody may be selected according to the selected substance to be detected, which specifically binds to it.
  • an anti-HER2 monoclonal antibody can be used as the primary antibody.
  • Such a primary antibody can be produced by a general technique using mice, rabbits, cows, goats, sheep, dogs, chickens and the like as immunized animals.
  • the secondary antibody may be selected in accordance with the selected primary antibody.
  • the primary antibody is a rabbit anti-HER2 monoclonal antibody
  • an anti-rabbit IgG antibody can be used as the secondary antibody.
  • Such secondary antibodies can also be produced by general techniques.
  • nucleic acid molecule having a base sequence complementary to the nucleic acid molecule as a biologically relevant binding substance corresponding to the detection target substance as a nucleic acid molecule.
  • the complex in which the biologically relevant binding substance is linked to the fluorescent labeling resin particles may be prepared by any known technique. For example, amidation by reaction of amine and carboxylic acid, sulfidation by reaction of maleimide and thiol, imination by reaction of aldehyde and amine, amination by reaction of epoxy and amine can be used.
  • the functional group involved in such a reaction may be one existing in advance on the surface of the resin particle (functional group derived from the raw material monomer of the resin), or a known functional group existing on the surface of the resin particle. It may be a functional group converted according to a technique or a functional group introduced by surface modification or the like. An appropriate linker molecule may be used as necessary.
  • a tissue immunostaining kit using the fluorescent labeling resin particles of the present invention includes at least the fluorescent labeling resin particle of the present invention, a complex in which a biorelevant binding substance is linked to the fluorescent labeling resin particle, or the fluorescent labeling resin particle for preparing the complex, the biorelevant binding Includes chemical substances and reagents.
  • the kit further includes a primary antibody, a secondary antibody, another biologically relevant binding substance (for example, biotin) used in combination with the biologically relevant binding substance (for example, streptavidin), and a desired complex as necessary. Reagents for forming and other reagents used for immunohistochemical staining may be included.
  • the fluorescent labeling agent using the fluorescent labeling resin particles of the present invention is, for example, a biological substance detection method using immunostaining and morphological observation staining in combination in order to enhance information, and more specifically, (1) a fluorescent label A step of immunostaining a tissue section using (2) a step of observing and staining a tissue section using a staining agent for morphological observation, and (3) a step of fluorescently observing the tissue section after staining. It can be used in the method for detecting a biological material containing. Note that either the immunostaining step (1) or the morphological observation staining step (2) may be performed first.
  • the tissue section is subjected to deparaffinization and antigen activation according to conventional methods.
  • the detection target substance can be appropriately labeled according to the form of the fluorescent labeling agent (complex of fluorescent labeling resin particles and biologically relevant binding substance) as described above. What is necessary is just to add a required substance to a tissue slice sequentially, and to make it react.
  • the fluorescent labeling agent complex of fluorescent labeling resin particles and biologically relevant binding substance
  • the morphological observation staining step (2) can be performed according to a conventional method.
  • staining using eosin in which cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinocytes are stained from red to dark red
  • eosin in which cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinocytes are stained from red to dark red
  • hematoxylin in which cell nuclei, lime, cartilage tissue, bacteria, and mucus are stained blue-blue to light blue
  • the method of performing these two stainings simultaneously is hematoxylin, Known as eosin staining (HE staining)).
  • a dehydration treatment immersed in ethanol a penetration treatment immersed in an organic solvent such as xylene, and an encapsulation treatment using an encapsulant are performed.
  • the tissue section that has been subjected to immunostaining and morphological observation staining by the above-described step is irradiated with excitation light having an appropriate wavelength according to the fluorescent dye used, whereby the fluorescent labeling is performed. Observe the fluorescence emitted by the body.
  • a predetermined biomolecule such as an antigen present in the tissue section can be detected, and a molecular target drug (for example, an antibody drug “Herceptin” (trademark) which is a humanized anti-HER2 monoclonal antibody) It can be used as information for determining the suitability of application.
  • a molecular target drug for example, an antibody drug “Herceptin” (trademark) which is a humanized anti-HER2 monoclonal antibody
  • irradiation of excitation light it is only necessary to use the same irradiation means as in general fluorescence observation, for example, using a filter that selectively transmits a predetermined wavelength as necessary from a laser light source provided in a fluorescence microscope, What is necessary is just to irradiate the dye
  • the fluorescence observation may be performed from a lens barrel of a fluorescence microscope, or may be performed by separately displaying an image taken by a camera installed on the fluorescence microscope on a display means (a monitor or the like).
  • both the immunostaining and the morphological observation staining are applied to the same tissue section, but when observing an image by the morphological observation staining, the fluorescent dye for immunostaining is excited. It is not necessary to irradiate the excitation light, and the observation may be performed under the same observation conditions as the optical microscope.
  • Fluoramine-encapsulated melamine resin Particulate surfactant was added to 22 mL of particle water so that it might become 0.5 vol%.
  • An untreated product or a water-solubilized product of a predetermined fluorescent dye was added to the solution so as to have a predetermined concentration as a charged amount, and the mixture was heated to 70 ° C. while stirring on a hot stirrer.
  • a predetermined amount of a predetermined melamine resin raw material (such as MX-035) was added, and a predetermined amount of a predetermined polymerization reaction accelerator having a concentration of 10 vol% was further added.
  • a predetermined amount of a predetermined melamine resin raw material such as MX-035
  • a predetermined amount of a predetermined polymerization reaction accelerator having a concentration of 10 vol% was further added.
  • the temperature was raised to 90 ° C. and the reaction was performed by heating and stirring for 20 minutes, whereby fluorescent dye-encapsulated melamine resin particles were generated.
  • the dispersion was centrifuged (20000 G for 15 minutes) to collect particles, washed with ultrapure water and purified.
  • Fluorescent dye-encapsulated urea resin particles A predetermined surfactant was added to 22 mL of water in an amount of 0.5 vol%. An untreated product or a water-solubilized product of a predetermined fluorescent dye was added to the solution so as to have a predetermined concentration as a charged amount, and the mixture was heated to 70 ° C. while stirring on a hot stirrer. Subsequently, a predetermined amount of urea was added, and further a predetermined amount of formalin having a concentration of 10 vol% was added. After heating and stirring at 70 ° C.
  • the temperature was raised to 90 ° C., and the reaction was performed by heating and stirring for 20 minutes, whereby fluorescent dye-encapsulated urea resin particles were generated.
  • the dispersion was centrifuged (20000 G for 15 minutes) to collect particles, washed with ultrapure water and purified.
  • an aqueous solution of 0.1 nM concentration of fluorescent labeling resin particles was prepared, and its emission intensity was measured with a fluorescence spectrophotometer F-7000 manufactured by Hitachi (measurement conditions: Photovoltaic voltage 300 V, excitation light slit 20 nm, emission slit 5 nm). ).
  • this aqueous solution was diluted to 0.01 nM, and 5 ⁇ L was spread on APS coated glass.
  • xanthane encapsulant Enteran New manufactured by Merck & Co., Ltd. was added dropwise and covered with a cover glass.
  • the APS-coated glass was placed on the stage of a fluorescence microscope and excited at the maximum excitation wavelength of ⁇ 5 nm of the fluorescent dye, and a fluorescence image was acquired (initial emission intensity). Thereafter, after continuing to irradiate the excitation light for 10 minutes, a fluorescence image after 10 minutes was obtained. The relative value of the light emission intensity after 10 minutes to the initial light emission intensity was calculated.

Abstract

　本発明は、褪色しにくく、若干の褪色があった場合でも輝点数の評価に影響しない、優れた初期発光強度および耐光性を有する蛍光体を提供することを目的とする。本発明に係る蛍光標識用樹脂粒子は、（１）水溶液中の蛍光色素単独の濃度に依存する発光強度のピークが、３０～８０μＭの範囲内にあること、および（２）濃度１００μＭにおける発光強度が前記ピークの発光強度の８０％以上であること、の両方の条件を満たす蛍光色素が樹脂粒子に固定化されていることを特徴とする。前記蛍光色素の水溶液中でのストークスシフトは２５ｎｍ以上であることが好ましい。前記蛍光色素は水溶化処理（たとえば酸処理）されたものであってもよい。前記蛍光色素は、熱硬化性樹脂を含有する樹脂粒子に内包されているものが好ましい。

Description

蛍光標識用樹脂粒子
　本発明は、病理診断等において使用することのできる蛍光標識用樹脂粒子に関する。
　医学的診断の１つとして、病理診断が行なわれている。病理医は人体から採取した組織片から病気を診断し、治療や手術の要不要を臨床医に伝える。患者の状態と病理診断によって、内科系医師は薬物治療方針を、外科系医師は手術を行うか否かを決定する。
　病理診断では、臓器摘出や針生検によって得た組織検体を厚さ数ミクロン程度に薄切して組織標本を作成し、様々な所見を得るために光学顕微鏡を用いて拡大観察することが広く行われている。多くの場合、標本は、採取した組織を固定するため脱水し、パラフィンブロック化した後、数μｍの厚さに薄切りし、パラフィンを取り除いて作製される。
　このような病理診断において、特定の疾患に関連する分子（抗原）の標本内における発現状況を観察するために、当該分子とそれに対する抗体および標識体からなる複合体との免疫反応を利用した免疫染色が行なわれている。免疫染色には従来、特定の基質と反応して発色する酵素を標識体として用いた色素染色法が用いられていた。たとえば、ＤＡＢ染色は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質とするペルオキシダーゼを酵素標識として用いる色素染色法である。しかしながら、ＤＡＢ染色のような酵素標識による染色は、染色濃度が温度・時間などの環境条件により大きく左右されるため、染色濃度から実際の抗体の発現量を見積もることが難しいという課題がある。そのため、病理診断における免疫観察では、酵素標識の代わりに、定量性に優れる蛍光標識体を用いる蛍光標識法が、近年病理診断において用いられるようになってきている。
　蛍光標識体としては、蛍光色素や無機ナノ粒子（半導体ナノ粒子、量子ドット等と称されることもある）、またはそれらの集積体の利用が知られている。たとえば、特許文献１には、１種または２種以上の有機色素および該有機色素よりも励起波長の長い有機蛍光色素（ＦＲＥＴの供与色素および受容色素）を含有する蛍光粒子であって、色素分子を閉じ込める固体粒子（母体）の主成分としてシリカを用いたものが記載されている。特許文献２には、病理診断情報生成方法（システム）において用いられる、蛍光有機色素（実施例ではテキサスレッドが用いられている）を含有する蛍光有機色素内包シリカナノ粒子が記載されている。また、特許文献３には、１種または２種以上の親水性の有機色素または有機蛍光色素（実施例では８－ヒドロキシ－１，３，６－ピレントリスルホン酸ナトリウム塩が用いられている）を含有する、メラミン・ホルムアルデヒド粒子が記載されている。
特開２００９－３００３３４号公報 特開２０１２－２０８１０６号公報 特表２００８－５４３９８２号公報
　顕微鏡により蛍光観察を行う蛍光標識法については、一般的に、レンズにより集光された励起光により蛍光体が褪色しやすいことが知られており、そのため蛍光体の蛍光強度を指標とした定量が困難であるという問題がある。また、蛍光体の輝点数を指標とする場合も、褪色による大幅な発光強度の減少は輝点数の減少を引き起こし、定量性を悪化させる。これらのことは、特に病理診断において大きな問題となる。
　特許文献１および２に記載されているようなシリカを母体とする蛍光体は、一般的に蛍光強度が弱く耐光性も低かった。また、特許文献３に具体的に記載されている有機蛍光色素を用いた、メラミン・ホルムアルデヒド（メラミン樹脂）を母体とする蛍光色素内包粒子にも、蛍光強度および耐光性について改善の余地があった。なお、特許文献３の実施例で用いられている８－ヒドロキシ－１，３，６－ピレントリスルホン酸ナトリウム塩は、後述する本発明の特定の基準を満たす蛍光色素ではない。
　本発明は、褪色しにくく、若干の褪色があった場合でも輝点数の評価に影響しない、優れた初期発光強度および耐光性を有する蛍光体を提供することを課題とする。
　本発明者らは、樹脂粒子に固定化させる蛍光色素として、蛍光色素水溶液の濃度とその発光強度に関する特定の基準を満たすものを選択することにより、上記の課題を解決しうる蛍光標識用樹脂粒子を作製できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、特定の基準に従って濃度消光を起こしにくい蛍光色素を選択し、典型的には樹脂原料と混合しながら樹脂の合成反応を進行させ、形成される樹脂粒子に当該蛍光色素を内包させるような製造方法により得られる蛍光標識用樹脂粒子は、比較的多量の蛍光色素を固定化（内包）しつつも濃度消光を起こさないため、蛍光観察時に一定時間蛍光を当て続けても褪色しにくいものとなる。このような知見に基づき完成された本発明は、以下の事項を包含する。
［項１］
　下記（１）および（２）の両方の条件を満たす蛍光色素が樹脂粒子に固定化されていることを特徴とする、蛍光標識用樹脂粒子。
（１）水溶液中の蛍光色素単独の濃度に依存する発光強度のピークが、３０～８０μＭ（Ｍ：モル濃度　モル／リットル）の範囲内にあること。
（２）濃度１００μＭにおける発光強度が前記ピークの発光強度の８０％以上であること。
［項２］
　前記蛍光色素の水溶液中でのストークスシフトが２５ｎｍ以上である、項１に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
［項３］
　前記蛍光色素が水溶化処理されたものである、項１または２に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
［項４］
　前記水溶化処理が酸処理である、項３に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
［項５］
　前記蛍光色素の水溶液中でのピーク発光強度が、下記式で表される輝度として１００，０００以上である、項１～４のいずれか一項に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
輝度＝モル吸光係数×量子収率×１／１０００
［項６］
　前記蛍光色素が熱硬化性樹脂を含有する樹脂粒子に内包されている、項１～５のいずれか一項に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
［項７］
　粒子表面に生体関連結合性物質が連結されている、項１～６のいずれか一項に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
　本発明の蛍光標識用樹脂粒子は、従来のものに比べて耐光性に優れ、褪色しにくいので、観察（励起光照射）時間の経過に伴う蛍光強度の低下を抑制することができる。また、本発明の蛍光標識用樹脂粒子は初期発光強度についても高い水準を満たす。その結果、観察時間に影響されずに定量性を保ったまま輝点計測が可能となる。このような効果は、特に病理診断の精度を高める上で有用である。
図１は、実施例および比較例において用いた代表的な５つの蛍光色素について、それぞれ水溶化処理をしなかった場合とした場合の、水溶液の濃度と発光強度の関係を示すグラフである。
　―蛍光標識用樹脂粒子―
　蛍光標識用樹脂粒子は、複数の蛍光色素分子が化学的または物理的な作用により樹脂粒子に固定化された構造を有する物質を総称する用語であり、その形態は特に限定されるものではない。
　たとえば、メラミン樹脂等の樹脂原料と蛍光色素とを混合しながら当該樹脂の重合反応を進行させる製造方法により得られる、蛍光色素が主に当該樹脂粒子中に内包されている形態（内包型）の蛍光標識用樹脂粒子が挙げられる。このような内包型の蛍光標識用樹脂粒子は多数の蛍光色素分子を固定化することができるが、本発明により適切な蛍光色素を選択することで、濃度消光を抑えて高い蛍光強度および耐光性を達成することができるため好ましい。特に、緻密な架橋構造が形成されている熱硬化性樹脂を含有する樹脂粒子（たとえばメラミン樹脂からなる樹脂粒子）に蛍光色素が内包されている蛍光標識用樹脂粒子が好ましい。
　一方で、先にメラミン樹脂等の樹脂原料を用いて樹脂粒子を調製した後、その分散液に蛍光色素を添加する製造方法により得られる、蛍光色素が主に当該樹脂粒子の表面に吸着している形態（吸着型）の蛍光標識用樹脂粒子も挙げられる。
　蛍光標識用樹脂粒子が内包型のものである場合、蛍光色素は少なくとも樹脂の分子構造（たとえばメラミン樹脂のような熱硬化性樹脂が有する三次元的な網目構造）によって粒子内に閉じ込められる。さらに、蛍光色素が有する官能基ないし部位と樹脂が有する官能基ないし部位との間に静電的相互作用（イオン結合）が働いているか、あるいはそれらの間で共有結合が形成されていることにより、蛍光色素がより強固に樹脂粒子に固定化されていることは、組織染色の透徹工程で用いられる有機溶媒（キシレン）によって蛍光色素が粒子外に溶出してしまうことを抑制できるため好ましい。
　上記の「静電的相互作用」は、蛍光色素が正または負に荷電した置換基ないし部位を有し、樹脂分子がそれとは逆に荷電した置換基ないし部位を有している場合に働く。ここで、正または負に荷電した置換基ないし部位を有するとは、蛍光色素または樹脂が、中性、酸性または塩基性の水に溶解したときにそのような状態になっていればよい。負に荷電した置換基ないし部位としては、スルホ基（－ＳＯ3 -）が代表的であるが、そのほかにもフォスフォリル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基などが挙げられる。正に荷電した置換基ないし部位としては、アミノ基（－ＮＨ3 +）が代表的であるが、そのほかにも、芳香族アミノ基、環状アミノ基（ピリジニル基、トリアゾリル基等）、ヒドラジニル基などが挙げられる。樹脂についての上記のような置換基ないし部位は、蛍光標識用樹脂粒子の製造工程に先立って、蛍光色素および樹脂原料（モノマー）に導入されていたものであってもよいし、たとえばメラミン樹脂、尿素樹脂等に含まれるアミノ基にＨ+がついてプロトン化されるような過程で形成されたものであってもよい。また、蛍光色素についての上記のような置換基ないし部位は、商品として市販されているような蛍光色素分子があらかじめ有しているものであってもよいし、本発明における「水溶化処理」（酸処理）によって導入されたものであってもよい。樹脂および蛍光色素（一分子あたり、あるいは所定の単位の分子量あたり）が有する荷電置換基等の数が多いほど静電的相互作用は強くなる傾向にあるので、所望の強さの静電的相互作用が働くようそれらの数を調節することが好ましい。
　また、上記の「共有結合」としては、たとえば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、Ｃ－Ｎ結合が挙げられる。たとえば、蛍光色素および樹脂原料（モノマー）として上記のような共有結合を形成しうる官能基ないし部位を有するものを選択し、樹脂の合成反応に先立ってあらかじめ反応させる前工程を設け、当該工程によって得られた誘導体化された樹脂原料を、必要に応じて他の樹脂原料（コモノマー）とともに、重合工程において反応させればよい。また、そのような前工程を設けず、あるいは設けたとしてもその未反応物について、重合工程において樹脂原料に添加されている蛍光色素が樹脂原料または生成した樹脂と反応して共有結合を形成するような様式であってもよい。
　一方、蛍光標識用樹脂粒子が吸着型のものである場合、蛍光色素を樹脂粒子に固定化するためには、樹脂粒子の表面にある官能基ないし部位と蛍光色素が有する官能基ないし部位との間に静電的相互作用が働いている、あるいはそれらの間で共有結合が形成されている必要がある。吸着型の場合にも、上述した内包型の場合と同様の静電的相互作用を利用することができる。共有結合については、樹脂粒子の合成後に、上述した内包型の場合と同様の共有結合を形成させるための工程を設ければよい。
　蛍光標識用樹脂粒子の粒径は、組織切片の免疫染色等、用途に適した粒径であれば特に限定されないが、通常１０～５００ｎｍであり、好ましくは、５０～２００ｎｍである。また、粒径のばらつきを示す変動係数も特に限定されないが、通常は２０％以下であり、好ましくは５～１５％である。このような粒径の蛍光標識用樹脂粒子は、たとえば後述するような製造方法により得られる。
　なお、蛍光標識用樹脂粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、蛍光標識用樹脂粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。蛍光標識用樹脂粒子の集団の粒子サイズの平均（平均粒径）および変動係数は、十分な数（たとえば１０００個）の蛍光標識用樹脂粒子について上記のようにして粒子サイズ（粒径）を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
　本発明の蛍光標識用樹脂粒子は、励起光照射開始時に十分な初期発光強度を有しつつ、所定の時間励起光を照射した後にも一定の発光強度を保持することができる、つまり耐光性に優れたものとして作製することができる。初期発光強度や発光強度の保持率は、蛍光標識用樹脂粒子に製造に係る様々な条件や材料の選択、また評価手法等によって変動するものであり、絶対的な評価基準を設けられるものではない。一例として、後述する実施例に示すような実施形態で、蛍光標識用樹脂粒子を製造し、耐光性（励起光１０分間照射後）を評価した場合、本発明の蛍光標識用樹脂粒子は、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上の発光強度の保持率を有する。
　（蛍光色素）
　本発明における蛍光色素は、（１）水溶液中の蛍光色素単独の濃度に依存する発光強度のピークが、３０～８０μＭの範囲内にあること、および（２）濃度１００μＭにおける発光強度が前記ピークの発光強度の８０％以上であること、の両方の条件を満たすものであれば、特に限定されるものではない。
　条件（１）を満たすか否かは、蛍光色素単独の水溶液の多段階希釈液を調製し、各希釈液の発光強度を同一条件下で測定して比較したときに、発光強度のピークを示す希釈液の濃度が３０～８０μＭの範囲内にあるか否かで判定することができる。
　条件（２）を満たすか否かは、上記の条件（１）に関する測定の際に濃度１００μＭの希釈液を調製しておき、その発光強度が前記ピークの発光強度の８０％以上であるか否かで判定することができる。
　条件（２）は、好ましくは、濃度１００μＭにおける発光強度が前記ピークの発光強度の８５％以上であること、より好ましくは同９０％以上とすることもできる。
　発光強度の測定方法は特に限定されるものではなく、一般的な蛍光光度計を用いて、一般的な測定条件において測定すればよい。通常、照射する励起光の波長および測定する発光波長は、それぞれその蛍光色素についての極大励起波長および極大発光波長ないしその近傍の波長に設定される。また、励起光および発光のスリット幅は適切な範囲で調整すればよい。極大励起波長および極大発光波長は一般的な方法で測定することができ、蛍光色素が市販品である場合にはカタログに記載された波長とみなしてもよい。
　一般的に、蛍光色素のストークスシフト、すなわち極大励起波長と極大発光波長との差が大きいほど、吸収スペクトルと発光スペクトルの重なり（自家吸収）が小さくなる。その結果、濃度消光を抑制し、発光強度の高い蛍光標識用樹脂粒子が得やすくなり、定量感度も向上する。本発明においては、前述した条件（１）および（２）を満たす限り、用いる蛍光色素のストークスシフトの大きさは特に限定されるものではないが、たとえばストークスシフトが２５ｎｍ以上の蛍光色素は、条件（１）および（２）を満たしやすいと共に、用途に応じた適切な蛍光強度を有する蛍光標識用樹脂粒子を作製しやすいため好ましい。
　蛍光色素は、水溶化処理を施すことにより条件（１）および（２）を満たしやすくなる。すなわち、通常では条件（１）および（２）を満たさない蛍光色素のなかには、水溶化処理を施すことにより条件（１）および（２）を満たすようになり、水溶化処理を施さなくとも条件（１）および（２）を満たす蛍光色素と同様に、本発明で用いることのできる蛍光色素となるものがある。なお、水溶化処理を施さなくとも条件（１）および（２）を満たす蛍光色素についても、水溶化処理後のもの（通常自ずと条件（１）および（２）を満たすことは保持される）を用いてもよい。蛍光色素の水溶化処理は、特に内包型の蛍光標識用樹脂粒子において、色素の分散度と発光強度が向上し、その結果より発光強度が高く耐光性の高い粒子が得られ、病理観察における定量感度を向上させることができる。
　また、水溶化処理を施すことにより、蛍光色素のストークスシフトが２５ｎｍ以上に広がる場合もある。通常ではストークスシフトが２５ｎｍ未満の蛍光色素について、水溶化処理によりストークスシフトが２５ｎｍ以上になったものを用いてもよい。
　上記の水溶化処理は、蛍光色素を水溶化できる、つまり水に対する溶解性を向上させることのできる手法であれば特に限定されるものではない。水溶化処理の具体例としては、酸（濃硫酸、濃塩酸、酢酸、ギ酸等）またはアルデヒド（ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等）で蛍光色素を処理し、それらと蛍光色素とを反応させる方法が挙げられるが、このうち概して効果に優れる酸処理が好ましい。
　ここで、水溶化処理に用いる化合物、たとえば酸処理に用いる酸として好ましいものは、処理の対象とする蛍光色素によって変化する。たとえば、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒに対しては濃塩酸が適しており、濃硫酸を用いると消光してしまう。Ｄｙｌｉｇｈｔ５９４に対しては濃硫酸が適しており、濃塩酸を用いると褪色してしまう。しかしながら当業者であれば、候補となる化合物（酸）の中から適切なものを選択することは、過度の試行錯誤を要することなく行える。
　条件（１）および（２）の判定を行う限り、発光強度の測定値は、比較対象同士の測定条件が一致している限り、任意単位a.u.（arbitrary unit）で表される相対的な数値でも問題ないが、たとえば下記式で表される輝度のような絶対的な数値であってもよい。
　輝度＝モル吸光係数（ε）×量子収率（φ）×１／１０００
　本発明で用いる蛍光色素の上記式で表れる輝度は、用途に応じた適切な蛍光強度を有する蛍光標識用樹脂粒子を作製できるものであればよく、特に限定されるものではない。たとえば、前述したような発光強度のピークにおける輝度が１００，０００以上の蛍光色素は、そのような蛍光標識用樹脂粒子を作製しやすいため好ましい。
　一般的に入手または作製が可能な蛍光色素は、たとえば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香族炭化水素系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子、さらに、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子などに分類することができる。このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
　ローダミン系色素分子の具体例としては、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン　６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、５－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（５－ＲＯＸ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ、ＬＤ７００ ＰＥＲＣＨＬＯＲＡＴＥ、ＣＡＬ　Ｆｌｕｏｒ　Ｒｅｄ　６１０、ＣＡＬ　Ｆｌｕｏｒ　Ｒｅｄ　６１５などが挙げられる。
　スクアリリウム系色素分子の具体例としては、ＳＲｆｌｕｏｒ ６８０－Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，　ｂｉｓ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，　ｂｉｓ、２－（４－（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（４－（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（８－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１，２，３，５，６，７－ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－９－ｙｌ）－４－（８－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２，３，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ－９（５Ｈ）－ｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、などが挙げられる。
　シアニン系色素分子の具体例としては、１－Ｂｕｔｙｌ－２－［５－（１－ｂｕｔｙｌ－１，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２Ｈ－ｉｎｄｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－ｐｅｎｔａ－１，３－ｄｉｅｎｙｌ］－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３ｅｉｔｉ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１－Ｂｕｔｙｌ－２－［５－（１－ｂｕｔｙｌ－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｉｎｄｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｃｈｌｏｒｏ－ｐｅｎｔａ－１，３－ｄｉｅｎｙｌ］－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｉｎｄｏｌｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３－Ｅｔｈｙｌ－２－［５－（３－ｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－ｐｅｎｔａ－１，３－ｄｉｅｎｙｌ］－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－３－ｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ、などが挙げられる。
　芳香族炭化水素系色素分子の具体例としては、Ｎ, Ｎ－Ｂｉｓ－（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－（４－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）－ｐｅｒｙｌｅｎ－３，４，９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄ ｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４：９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４，９，１０－ｂｉｓ（ｄｉｃａｒｂｉｍｉｄｅ）、１６，Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３,４,９,１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｄｉｉｍｉｄｅ、４，４'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｂｕｔｙｒｉc  ａｃｉｄ、２，１０－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ、２，１０－Ｂｉｓ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ, ３，３'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ、１７－ＢＩＳ（Ｏｃｔｙｌｏｘｙ）Ａｎｔｈｒａ［９，１，２－ｃｄｅ－］Ｂｅｎｚｏ［ＲＳＴ］Ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－５－１０－Ｄｉｏｎｅ、Ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ, ５，１０－ｄｉｈｙｄｒｏ－５,１０－ｄｉｏｘｏａｎｔｈｒａ[９，１，２－ｃｄｅ]ｂｅｎｚｏ[ｒｓｔ]ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－１６,１７－ｄｉｙｌｅｓｔｅｒ、Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ４，４'，４''，４'''－[[２，９－ｂｉｓ[２，６－ｂｉｓ(１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ-，Ｂｅｎｚｅｎｅｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ、 ４，４'，４''，４'''－［［２，９－ｂｉｓ［２，６－ｂｉｓ（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ[Ｎ,Ｎ,Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－］、などが挙げられる。
　オキサジン系色素分子の具体例としては、Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ、Ｏｘａｚｉｎｅ１７０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、Ｎｉｌｅ Ｂｌｕｅなどが挙げられる。
　カルボピロニン系色素分子の具体例としては、ＣＡＲＢＯＰＹＲＯＮＩＮ　１４９などが挙げられる。
　ジピロメテン（ピロメセン）系色素分子の具体例としては、ＰＹＲＲＯＭＥＴＨＥＮＥ６５０などが挙げられる。
　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ系色素分子（主にローダミン骨格を有する）の具体例としては、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６１０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６６０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７５０など（以上インビトロジェン社製）が挙げられる。
　ＢＯＤＩＰＹ系色素分子（主にジピロメテン骨格を有する）の具体例としては、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ　４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ　５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ　５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ　５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）などが挙げられる。
　Ｃｙ系色素分子の具体例としては、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（以上ＧＥヘルスケア社製）などが挙げられる。
　ＤＹ系色素分子（主にローダミン骨格を有する）の具体例としては、ＤＹ－５９０、ＤＹ－６１０、ＤＹ－６１５、ＤＹ－６３０、ＤＹ－６３１、ＤＹ－６３２、ＤＹ－６３３、ＤＹ－６３４（以上ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、などが挙げられる。
　ＨｉＬｙｔｅ系色素分子の具体例としては、ＨｉＬｙｔｅ５９４、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ ＴＲ（以上アナスペック社製）などが挙げられる。
　ＤｙＬｉｇｈｔ系色素分子（主にローダミン骨格を有する）の具体例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ６３３（以上サーモサイエンティフィック社製）などが挙げられる。
　ＡＴＴＯ系色素分子（主にローダミン骨格を有する）の具体例としては、ＡＴＴＯ５９０、ＡＴＴＯ６１０、ＡＴＴＯ６２０、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６５５など（以上ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）が挙げられる。
　ＭＦＰ系色素分子の具体例としては、ＭＦＰ５９０、ＭＦＰ６３１（以上Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）などが挙げられる。
　その他色素としては、Ｃ－Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＡＰＣ－ＸＬ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ６３７（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、等が挙げられる。
　本発明では、上記のような公知の蛍光色素分子（化合物）、またはその水溶化処理物の中から、前述した条件（１）および（２）を満たすもの、好ましくはさらに前述したストークスシフトおよび／または輝度に関する条件を満たすものを選択して用いることができる。そのような選択は、前述したような条件の判定方法に従えば、当業者が過度の試行錯誤を要することなく行えるものである。
　また、蛍光色素の発光波長は用途に応じて所望のものを選択することができる。たとえば、病理診断において、エオジン等を用いた形態観察用の染色と同時に蛍光色素を用いた免疫染色を行う用途が想定される場合は、蛍光色素からの発光を目視で観察することができ、かつ蛍光を発するエオジンの発光波長と被らないよう、蛍光色素の発光波長は赤～近赤外とすることが好適である。たとえば、励起極大波長が５５５～６２０ｎｍ、発光極大波長が５８０～７７０ｎｍの範囲にある蛍光色素が好ましい。
　本発明において用いることのできる蛍光色素の具体例は次の通りであるが、本発明はこれらの蛍光色素を用いる実施形態に限定されるものではない。
　水溶化処理をしないものも、したものも使用できる蛍光色素としては、たとえば、５－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（５－ＲＯＸ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、ＡＴＴＯ５９０、ＤＹ－５９０、ＣＡＬ　Ｆｌｕｏｒ　Ｒｅｄ　６１０、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４が挙げられる。
　一方、水溶化処理をすることによって使用できるものとなる蛍光色素としては、たとえば、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＰＹＲＲＯＭＥＴＨＥＮＥ６５０、Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ、ＤＹ－６１０、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄが挙げられる。
　上記の蛍光色素を下記表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（樹脂）
　本発明の蛍光標識用樹脂粒子を構成する樹脂は、熱硬化性樹脂であっても、熱可塑性樹脂であってもよい。たとえば、キシレンのような有機溶媒を用いる透徹工程において蛍光色素が溶出しにくいという観点からは、緻密な架橋構造の内部に蛍光色素を固定化することができる、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂を含有する（のみからなる）樹脂が好ましい。
　熱硬化性樹脂としては、たとえば、メラミン、尿素、グアナミン類（ベンゾグアナミン、アセトグアナミンなどを含む）、フェノール類（フェノール、クレゾール、キシレノールなどを含む）、キシレン、およびこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーから形成される構成単位を含むものが挙げられる。これらのモノマーは、何れか一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。所望によりさらに、一種または二種以上の上記化合物以外のコモノマーを併用してもよい。
　熱硬化性樹脂の具体例としては、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂、尿素・ホルムアルデヒド樹脂、ベンゾグアナミン・ホルムアルデヒド樹脂、フェノール・ホルムアルデヒド樹脂、メタキシレン・ホルムアルデヒド樹脂が挙げられる。
　これらの熱硬化性樹脂の原料としては、上述したようなモノマーそのもののみならず、モノマーとホルムアルデヒドやその他の架橋剤等の化合物とをあらかじめ反応させて得られるプレポリマーを用いてもよい。たとえば、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂の製造においては一般的に、メラミンとホルムアルデヒドとをアルカリ条件下で縮合して調製されるメチロールメラミンがプレポリマーとして用いられており、当該化合物はさらにアルキルエーテル化（水中での安定性を向上させるためのメチル化、有機溶媒中での溶解性を向上させるためのブチル化等）されたものであってもよい。
　また、上記の熱硬化性樹脂は、その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が、電荷を持つ置換基、または共有結合を形成しうる置換基に置き換えられたものでもよい。このような熱硬化性樹脂は、公知の手法により少なくとも一つの水素が上記の置換基に置き換えられた（誘導体化された）モノマーを原料として用いることにより合成することができる。なお、メラミン樹脂、尿素樹脂、ベンゾグアナミン樹脂などは通常自ずとアミノ基またはこれに由来する部位から生成するカチオンを有し、フェノール樹脂、キシレン樹脂などは通常自ずと水酸基またはこれに由来する部位から生成するアニオンを有する。
　このような熱硬化性樹脂は、公知の手法に従って合成することができる。たとえば、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂は、前述したようにしてあらかじめ調製されたメチロールメラミンを、必要に応じて酸等の反応促進剤を添加した上で加熱して重縮合させることにより合成することができる。
　一方、熱可塑性樹脂としては、たとえば、スチレン、（メタ）アクリル酸およびそのアルキルエステル、アクリロニトリル、ならびにこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種の単官能モノマー（一分子中に重合反応に関与する基、上記の例ではビニル基を一個持つモノマー）から形成される構成単位を含むものが挙げられる。これらのモノマーは、何れか一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。所望によりさらに、一種または二種以上の上記化合物以外のコモノマーを併用してもよい。
　熱硬化性樹脂の具体例としては、ポリスチレン、スチレンとその他のモノマーとからなるスチレン系樹脂、ポリメタクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸およびそのアルキルエステルとその他のモノマーとからなるアクリル系樹脂、ポリアクリロニトリル、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）、アクリロニトリルおよびその他のモノマーとからなるアクリロニトリル系樹脂が挙げられる。
　上記の熱可塑性樹脂は、たとえばジビニルベンゼンのような多官能モノマー（一分子中に重合反応に関与する基、上記の例ではビニル基を二個以上持つモノマー）から形成される構成単位、つまり架橋部位を含んでいてもよい。たとえば、ポリメタクリル酸メチルの架橋物が挙げられる。
　また、上記の熱可塑性樹脂は、その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が、電荷を持つ置換基、または共有結合を形成しうる置換基に置き換えられたものでもよい。このような熱可塑性樹脂は、たとえば４－アミノスチレンのように、少なくとも一つの水素が上記の置換基に置き換えられた（誘導体化された）モノマーを原料として用いることにより合成することができる。
　さらに、上記の熱可塑性樹脂は、得られた蛍光標識用樹脂粒子を表面修飾するための官能基を有する構成単位を含んでいてもよい。たとえば、エポキシ基を有するメタクリル酸グリシジルのようなモノマーを原料とすることにより、エポキシ基が表面に配向した蛍光標識用樹脂粒子を調製することができる。このエポキシ基は、過剰のアンモニア水と反応させることによりアミノ基に変換することができる。このようにして形成されるアミノ基には、公知の手法に従って（必要に応じてリンカーとなる分子を介して）、各種の生体分子を導入することができる。
　―蛍光標識用樹脂粒子の製造方法―
　本発明の蛍光標識用樹脂粒子は、蛍光色素として特定の条件を満たすものを用いた上で、各種の樹脂について公知の重合工程（１）に準じて製造することができる。また、そのような方法により得られた蛍光標識用樹脂粒子は、さらに修飾工程（２）により、生体関連結合性物質を連結させてもよい。
　［熱硬化性樹脂：内包型］
　熱硬化性樹脂を用いた内包型の蛍光標識用樹脂粒子は、基本的に乳化重合法に従って製造することができるが、界面活性剤および重合反応促進剤を用いる次のような重合工程により製造することが好ましい。なお、このような製造方法により得られる内包型の蛍光標識用樹脂粒子において、蛍光色素の大部分が、望ましくは実質的に全てが樹脂粒子に内包された状態で固定化されるが、一部の蛍光色素が樹脂粒子の表面に結合ないし付着した状態で固定化されることが排除されるものではない。また、蛍光色素が内包された状態において、どのような化学的または物理的な作用で蛍光色素が樹脂粒子に固定化されているかは限定されるものではない。本発明では、重合工程に先立って、樹脂原料と蛍光色素とをあらかじめ共有結合させたり、樹脂原料に積極的に荷電した置換基を導入したりするための誘導体化工程を設ける必要はない（そのような工程を用いなくても、発光強度や耐光性に優れた蛍光標識用樹脂粒子が得られる）が、所望によりそのような工程を併用することも排除されるものではない。
　（１）重合工程
　重合工程は、蛍光色素、樹脂原料（モノマーまたはオリゴマーないしプレポリマー）、好ましくはさらに界面活性剤および重合反応促進剤を含有する反応混合物を加熱して樹脂の重合反応を進行させ、蛍光色素を内包する樹脂粒子を生成させる工程である。
　反応混合物に含まれる各成分の添加順序は特に限定されるものではない。典型的には、蛍光色素の水溶液に界面活性剤を添加し、続いて樹脂原料を添加し、最後に重合反応促進剤を添加するという順序が用いられる。あるいは、界面活性剤の水溶液に樹脂原料を添加し、続いて重合反応促進剤を添加して樹脂粒子の合成反応を進行させながら、蛍光色素の水溶液を添加するという順序であってもよい。なお、このような重合工程に用いられる、本発明による特定の蛍光色素の水溶液の濃度は、従来の蛍光色素の水溶液の濃度よりも比較的高めの範囲（たとえば２５０～４５０μＭ）で調節することができる。
　重合反応の条件（温度、時間等）は、樹脂の種類、原料混合物の組成などを考慮しながら適切に設定することができる。メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の合成については、反応温度は通常７０～２００℃、反応時間は通常２０～１２０分間である。なお、反応温度は蛍光色素の性能が低下しない温度（耐熱温度範囲内）とすることが適切である。加熱は複数の段階に分けて行ってもよく、たとえば、相対的に低温で一定時間反応させた後、昇温して相対的に降温で一定時間反応させるようにしてもよい。
　重合反応の終了後は、反応液から余剰の樹脂原料、蛍光色素、界面活性剤等の不純物を除去し、生成した蛍光標識用樹脂粒子を回収して精製すればよい。たとえば、反応液を遠心分離にかけ、不純物が含まれている上澄みを除去した後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させて洗浄する。これらの操作は、上澄みに樹脂や蛍光色素に由来する吸光、蛍光が見られなくなるまで複数回繰り返し行うことが好ましい。
　（界面活性剤）
　界面活性剤としては、公知の乳化重合用乳化剤を用いることができる。界面活性剤には、アニオン系（陰イオン系）、ノニオン系（非イオン系）、カチオン系（陽イオン系）のものがある。正に荷電した置換基ないし部位を有する（カチオン系の）熱硬化性樹脂を合成する場合は、アニオン系またはノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。逆に負に荷電した置換基ないし部位を有する（アニオン系の）熱硬化性樹脂を合成する場合は、カチオン系またはノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。
　アニオン系の界面活性剤としては、たとえば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（製品名「ネオペレックス」シリーズ、花王株式会社）が挙げられる。ノニオン系の界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系（製品名「エマルゲン」シリーズ、花王株式会社）の化合物、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、たとえば、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。
　界面活性剤の添加量を調節することにより、樹脂粒子の粒子径を調節することができるとともに、その粒子径の変動係数が小さい、つまり粒子サイズの揃った蛍光標識用樹脂粒子を製造することができる。界面活性剤の添加量は、たとえば、樹脂原料に対して１０～６０重量％の割合、あるいは原料混合物全体に対して０．１～３．０重量％である。界面活性剤の添加量を増やすと粒径が小さくなる傾向にあり、逆に界面活性剤の添加量を減らすと粒径が大きくなる傾向にある。
　（重合反応促進剤）
　重合反応促進剤は、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の重縮合反応を促進するとともに、当該樹脂または蛍光色素に含まれるアミノ基のような官能基にプロトン（Ｈ+）を付与して荷電させ、静電的相互作用を起こしやすくする機能を有する。熱硬化性樹脂の反応は加温のみでも進行するが、重合反応促進剤を加えるとより低温で進行するので、反応や性能を制御できる範囲で添加することができる。このような重合反応促進剤としては、たとえば、ギ酸、酢酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸などの酸が挙げられる。なお、蛍光色素がカルボキシル基やスルホ基を有する化合物である場合、当該蛍光色素も上記の酸と同様にプロトンを供与することもできる。
　（２）修飾工程
　必要に応じて行われる修飾工程は、蛍光標識用樹脂粒子の用途に応じて、蛍光標識用樹脂粒子の表面に生体関連結合性物質などを連結するための工程である。
　本発明の属する技術分野においては、蛍光標識体と生体関連結合性物質などとを連結するための様々な手法が知られており、本発明においてもそのような手法を利用することができる。
　たとえば、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、マレイミド基等の反応性官能基同士の間で起きる反応を利用して、蛍光標識体（その表面に存在する一方の反応性官能基）と生体関連結合性物質（その分子中に存在するもう一方の反応性官能基）とを結合させることができる。また、これらが有する官能基同士を直接的に結合することができない場合は、分子の両末端にそれぞれ所定の官能基を有する「リンカー分子」を介して結合させることもできる。このような反応は、必要な試薬類を添加して所定の時間経過させることにより行うことができる。
　具体例としては、表面に水酸基を有する蛍光標識用樹脂粒子にシランカップリング剤（たとえばアミノプロピルトリメトキシシラン）を反応させてアミノ基を導入し、一方でストレプトアビジンにチオール基導入試薬（たとえばＮ－スクシミジルＳアセチルチオ酢酸）を反応させてチオール基を導入し、最後に、アミノ基とチオール基の両方と反応性を有するマレイミド基を両端に有するＰＥＧ（ポリエチレングリコール）系のリンカー分子を反応させて、蛍光標識用樹脂粒子とストレプトアビジンとを連結させる方法が挙げられる。
　また、たとえばグリシジルメタクリレートを原料モノマーとして用いて樹脂（アクリル系樹脂）を合成した場合、蛍光標識用樹脂粒子の表面には当該モノマーに由来するエポキシ基が表れている。この蛍光標識用樹脂粒子にアンモニア水を添加することにより、そのエポキシ基をアミノ基に変換し、さらにそのアミノ基に所望の生体関連結合性物質などを連結させることができる。
　［熱硬化性樹脂：吸着型］
　熱硬化性樹脂を用いた吸着型の蛍光標識用樹脂粒子の製造方法は次のようなものとなる。まず、蛍光色素を原料として配合しないこと以外は上述した内包型の蛍光標識用樹脂粒子の重合工程（１）と同様にして、蛍光色素を含有しない熱硬化性樹脂粒子を調製する。続いて、得られた樹脂粒子（その分散液）と蛍光色素（その水溶液）とを混合し、当該樹脂粒子の表面に蛍光色素を吸着させる。この場合、樹脂粒子の熱硬化性樹脂および蛍光色素は、互いに反対の電荷を有する置換基ないし部位を有しており、静電的相互作用により吸着するものであることが好適である。
　［熱可塑性樹脂：内包型］
　熱可塑性樹脂は、ラジカル重合、イオン重合（アニオン重合、他）など、公知の手法に従って合成することができる。熱可塑性樹脂を用いた内包型の蛍光標識用樹脂粒子もそれらの手法に準じて製造することができるが、たとえば、ソープフリー乳化重合法に従った重合工程により製造することが好ましい。
　この場合の重合工程（１）は、典型的には、蛍光色素と、樹脂原料と、重合開始剤（過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリルなど）とを含有する反応混合物を加熱して樹脂の重合反応を進行させ、蛍光色素を内包する樹脂粒子を生成させる工程となる。重合開始剤、重合反応の条件（温度、時間等）は、樹脂の種類などを考慮しながら適宜設定することができる。熱可塑性樹脂の合成については、反応温度は通常２０～１５０℃、反応時間は通常１０～２４０分間である。
　［熱可塑性樹脂：吸着型］
　熱可塑性樹脂を用いた吸着型の蛍光標識用樹脂粒子の製造方法は次のようなものとなる。まず、蛍光色素を原料として配合しないこと以外は上述した内包型の蛍光標識用樹脂粒子の重合工程（１）と同様にして、蛍光色素を含有しない熱可塑性樹脂粒子を調製する。続いて、得られた樹脂粒子（その分散液）と蛍光色素（その水溶液）とを混合し、当該樹脂粒子の表面に蛍光色素を吸着させる。この場合、樹脂粒子の熱可塑性樹脂および蛍光色素は、互いに反対の電荷を有する置換基ないし部位を有しており、静電的相互作用により吸着するものであることが好適である。
　―蛍光標識用樹脂粒子の用途―
　（蛍光標識剤）
　本発明の蛍光標識用樹脂粒子の用途は特に限定されるものではないが、典型的には、試料（組織切片）に含まれる検出対象物質を標識し、免疫染色において蛍光観察できるようにするための、蛍光標識剤としての用途が挙げられる。すなわち、上述したような本発明の蛍光標識用樹脂粒子は、免疫染色の実施形態に応じた生体関連結合性物質を連結させて、複合体（コンジュゲート）として使用することが好適である。
　検出対象物質は特に限定されるものではないが、病理診断においては一般的に、その目的に応じた抗原が選択される。たとえば、乳癌に関する病理診断においてはＨＥＲ２を検出対象物質とすることができる。
　生体関連結合性物質の第一の例として、検出対象物質と特異的に結合する抗体（一次抗体）が挙げられる。蛍光標識用樹脂粒子と一次抗体とからなる複合体は、検出対象物質に直接結合して蛍光標識することができる（一次抗体法）。
　生体関連結合性物質の第二の例として、検出対象物質と特異的に結合する抗体（一次抗体）に結合する抗体（二次抗体）が挙げられる。たとえば、一次抗体がウサギから産生した抗体（ＩｇＧ）である場合、二次抗体は抗ウサギＩｇＧ抗体となる。検出対象物質に結合している一次抗体に、蛍光色素固定化樹脂粒と二次抗体とからなる複合体が結合することにより、検出対象物質を間接的に蛍光標識することができる（二次抗体法）。
　生体関連結合性物質の第三の例として、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンが挙げられる。この場合、二次抗体は、蛍光標識用樹脂粒子と複合体化している物質と結合しうる物質と複合体化される。たとえば、蛍光標識用樹脂粒子とアビジンまたはストレプトアビジンとの複合体を用いる場合は、二次抗体とビオチンとの複合体が組み合わされて用いられる。検出対象物質に結合している一次抗体に、二次抗体とビオチンとの複合体が結合し、当該複合体にさらに蛍光色素固定化樹脂粒とアビジンまたはストレプトアビジンとからなる複合体が結合することにより、検出対象物質を間接的に蛍光標識することができる（ビオチン－アビジン法またはサンドイッチ法）。これとは逆に、蛍光標識用樹脂粒子とビオチンとの複合体を、二次抗体とアビジンまたはストレプトアビジンとの複合体と組み合わせて用いることもできる。
　一次抗体は、選択された検出対象物質に応じて、それと特異的に結合するものを選択すればよい。たとえば、検出対象物質がＨＥＲ２である場合、一次抗体としては抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を用いることができる。このような一次抗体（モノクローナル抗体）は、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、チキンなどを免疫動物とする一般的な手法により産生することができる。
　二次抗体は、選択された一次抗体に応じて、それと結合するものを選択すればよい。たとえば、一次抗体がウサギ抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である場合、二次抗体としては抗ウサギＩｇＧ抗体を用いることができる。このような二次抗体も一般的な手法により産生することができる。
　その他にも、検出対象物質を核酸分子とし、それに対応する生体関連結合性物質として、当該核酸分子と相補的な塩基配列を有する核酸分子を用いることも可能である。
　蛍光標識用樹脂粒子に生体関連結合性物質が連結した複合体は、公知のいかなる手法によって作製されたものであってもよい。たとえば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化を利用することができる。このような反応に関与する官能基は、樹脂粒子の表面にあらかじめ存在するもの（樹脂の原料モノマーに由来する官能基）であってもよいし、樹脂粒子の表面に存在する官能基を公知の手法に従って変換した官能基や、表面修飾等により導入された官能基であってもよい。必要に応じて適切なリンカー分子を利用してもよい。
　したがって、本発明の別の側面において、本発明の蛍光標識用樹脂粒子を使用した組織免疫染色用キットが提供される。このキットは少なくとも、本発明の蛍光標識用樹脂粒子、蛍光標識用樹脂粒子に生体関連結合性物質が連結された複合体、または当該複合体を調製するための蛍光標識用樹脂粒子、生体関連結合性物質および試薬類を含む。このキットはさらに、必要に応じて、一次抗体、二次抗体、前記生体関連結合性物質（たとえばストレプトアビジン）と組み合わせて用いられる他の生体関連結合性物質（たとえばビオチン）、所望の複合体を形成するための試薬類、その他の免疫組織染色に用いられる試薬類などを含んでいてもよい。
　（生体物質検出方法）
　本発明の蛍光標識用樹脂粒子を用いた蛍光標識剤は、たとえば、情報性を高めるために免疫染色と形態観察染色を併用する生体物質検出方法、より具体的には、（１）蛍光標識体を用いて組織切片を免疫染色する工程と、（２）形態観察用の染色剤を用いて組織切片を形態観察染色する工程と、（３）染色後の組織切片を蛍光観察する工程、とを含む生体物質検出方法において使用することができる。なお、（１）の免疫染色工程および（２）の形態観察染色工程はどちらを先におこなってもよい。
　通常、上記の生体物質検出方法の工程（１）に先だって、常法に従って、組織切片の脱パラフィン処理、および抗原の賦活化処理が行われる。
　免疫染色工程（１）は、前述したような蛍光標識剤（蛍光標識用樹脂粒子および生体関連結合性物質の複合体）の形態に応じて、検出対象物質を適切に標識することができるよう、必要な物質を順次組織切片に添加して反応させればよい。
　形態観察染色工程（２）は、常法に従って行うことができる。組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。また、細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら2つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
　通常、工程（１）および（２）の後、工程（３）の前に、エタノールに浸漬する脱水処理、キシレン等の有機溶媒に浸漬する透徹処理、封入剤を用いる封入処理などが行われる。
　蛍光観察工程（３）では、上記工程により免疫染色および形態観察染色が施された組織切片に、用いられている蛍光色素に応じた適切な波長を有する励起光を照射することにより、その蛍光標識体が発する蛍光を観察する。このような工程により、その組織切片内に存在する抗原等の所定の生体分子を検出することができ、分子標的薬（たとえばヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である抗体医薬「ハーセプチン」（商標））の適用の適否を判定するための情報として利用することができる。
　励起光の照射には、一般的な蛍光観察と同様の照射手段を用いればよく、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるレーザ光源から、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルタを用いて、適切な波長および出力の励起光を染色された組織切片に照射すればよい。蛍光観察は、蛍光顕微鏡の鏡筒から行ってもよいし、蛍光顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示して行ってもよい。蛍光色素によるが、蛍光顕微鏡の鏡筒からの目視によっては十分に蛍光を観察することができない場合であっても、カメラによる画像の撮影を通じて蛍光を観察することが可能な場合もある。必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルタを用いてもよい。
　なお、本発明においては同一の組織切片に対して免疫染色および形態観察染色の両方が施されているが、形態観察染色による像を観察する際には、免疫染色用の蛍光色素を励起させるための励起光を照射する必要はなく、光学顕微鏡と同様の観察条件下で観察すればよい。
　［製品情報］
・エポスター（登録商標）（株式会社日本触媒）
　　ＭＸ０３０ｗ：ポリメタクリル酸メチル系架橋物（エマルション濃度７．５～１０％、平均粒径０．０３～０．０５μｍ）
・ニカラック（登録商標）（株式会社三和ケミカル）
　　ＭＸ－０３５：メチル化メラミン樹脂（重量平均重合度１．５）
　　ＭＳ－１１：メチル化メラミン樹脂（重量平均重合度１．８）
　　ＭＸ－４１０：メチル／ｎーブチル化メラミン樹脂（重量平均重合度１．８）
　　ＭＷ－０２２：メチル化メラミン樹脂（重量平均重合度１．８）
　　ＭＸ－７３０：メチル化メラミン樹脂（重量平均重合度２．４）
・エマルゲン（登録商標）（花王株式会社）
　　エマルゲン　１５０：ポリオキシエチレンラウリルエーテル、有効成分量：１００％
　　エマルゲン　４３０：ポリオキシエチレンオレイルエーテル、有効成分量：１００％
・ネオペレックス（登録商標）（花王株式会社）
　ネオペレックス　Ｇ－１５：ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、有効成分量：１６％
・その他
　ＰＶＰ３００００：ポリビニルピロリドン（重合度約３００００）
　ＰＶＡ２０００：ポリビニルアルコール（重合度約２０００）
　ＰＶＡ５００：ポリビニルアルコール（重合度約５００）
　［蛍光色素の水溶化処理］
　蛍光色素を１００ｍｇ程度用意し、濃硫酸、濃塩酸、酢酸、ギ酸、ホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒドを１００ｍＬ添加して、水溶化処理を行った。その後、飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、水溶化処理された蛍光色素を塩析させ、０．１μｍの濾紙を用いた濾過により回収した。
　［蛍光色素の選択］
　下記表に示す蛍光色素（水溶化処理物および無処理物を含む）について、それぞれの分子量から算出した必要量が溶解した４００μＭの水溶液（ミリＱ希釈）を調製し、さらにこの水溶液を希釈して２００，１００，９０，８５，５０，７５，５０，６５，６０，５５，５０，４５，４０，３０，２０μＭの水溶液を調製した。各濃度の蛍光色素水溶液の発光強度を、Ｈｉｔａｃｈｉ社製蛍光光度計Ｆ－７０００で測定した（測定条件：ホトマル電圧３００Ｖ、励起光スリット２０ｎｍ、発光スリット５ｎｍ）。代表的な５種類の蛍光色素の無処理物および水溶化処理物についての結果を図１に示す。この測定結果より、（１）発光強度がピークとなるときの濃度、および（２）そのピーク発光強度に対する濃度１００μＭ時の発光強度の比率（発光強度比）を求めた。これらの結果を下記表に示す。本発明で規定する（１）の条件（発光強度のピークが３０～８０μＭの範囲内にある）および（２）の条件（濃度１００μＭにおける発光強度が前記ピークの発光強度の８０％以上である）の両方を満たす蛍光色素を実施例、そうでない蛍光色素を比較例として取り扱うことにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　［蛍光色素固定化粒子の合成］
　各実施例および比較例の蛍光標識用樹脂粒子を、下記表に示す所定の条件に従って作製した。具体的には次の通りである。
　［比較例１，１０，１７および実施例４，６，１２，１７，１９］蛍光色素内包架橋ＰＭＭＡ粒子
　水２２ｍＬに所定の蛍光色素の無処理物または水溶化処理物を、仕込み量として所定の濃度になるように添加し、ホットスターラー上で撹拌しながら５０℃に加熱した。続いて、所定の架橋ＰＭＭＡ原料（ＭＸ０３０ｗ）を所定量添加し、さらに１０ｖｏｌ％の濃度の所定の重合反応促進剤等を所定量添加した。５０℃で２０分間加熱撹拌して反応させることで、蛍光色素内包架橋ＰＭＭＡ粒子が生成した。この分散液を遠心分離にかけて（２００００Ｇで１５分間）粒子を回収し、超純水で洗浄して精製した。
　［比較例２～４，６～８，１１～１３，１５～１６および実施例１～３，５，７～１１，１３～１６，１８，２０～２２，２４～２７］蛍光色素内包メラミン樹脂粒子
　水２２ｍＬに所定の界面活性剤が０．５ｖｏｌ％となるように添加した。その溶液に所定の蛍光色素の無処理物または水溶化処理物を、仕込み量として所定の濃度になるように添加し、ホットスターラー上で撹拌しながら７０℃に加熱した。続いて、所定のメラミン樹脂原料（ＭＸ－０３５等）を所定量添加し、さらに１０ｖｏｌ％の濃度の所定の重合反応促進剤を所定量添加した。７０℃で５０分間加熱撹拌した後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌して反応させることで、蛍光色素内包メラミン樹脂粒子が生成した。この分散液を遠心分離にかけて（２００００Ｇで１５分間）粒子を回収し、超純水で洗浄して精製した。
　［比較例５，９，１４および実施例２３］蛍光色素内包尿素樹脂粒子
　水２２ｍＬに所定の界面活性剤が０．５ｖｏｌ％となるように添加した。その溶液に所定の蛍光色素の無処理物または水溶化処理物を、仕込み量として所定の濃度になるように添加し、ホットスターラー上で撹拌しながら７０℃に加熱した。続いて、尿素を所定量添加し、さらに１０ｖｏｌ％の濃度のホルマリンを所定量添加した。７０℃で５０分間加熱撹拌した後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌して反応させることで、蛍光色素内包尿素樹脂粒子が生成した。この分散液を遠心分離にかけて（２００００Ｇで１５分間）粒子を回収し、超純水で洗浄して精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　［蛍光標識用樹脂粒子の耐光性の評価］
　実施例および比較例で作製した蛍光標識用樹脂粒子について、カールツァイス社製蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ　Ｉｍａｇｅｒ　Ｚ２の観察条件下（励起波長：最大励起波長－５ｎｍ、４０倍、１０分）における耐光性を評価した。
　まず、蛍光標識用樹脂粒子の濃度０．１ｎＭの水溶液を調製し、その発光強度をＨｉｔａｃｈｉ社製蛍光光度計Ｆ－７０００で測定した（測定条件：ホトマル電圧３００Ｖ、励起光スリット２０ｎｍ、発光スリット５ｎｍ）。次に、この水溶液を０．０１ｎＭに希釈し、５μＬをＡＰＳコートガラス上に散布した。蒸留水で洗浄後、キシレン系封入剤であるエンテランニュー（メルク社製）を滴下し、カバーガラスを被せ封入した。上記ＡＰＳコートガラスを蛍光顕微鏡のステージに載せ、蛍光色素の最大励起波長の－５ｎｍで励起し、蛍光画像を取得した（初期発光強度）。その後、１０分間励起光を照射し続けた後に１０分後の蛍光画像を取得した。この１０分後の発光強度の、前記初期発光強度に対する相対値を算出した。これらの結果を上記表の「耐光性の評価」に示す。

Claims (7)

  1. 　下記（１）および（２）の両方の条件を満たす蛍光色素が樹脂粒子に固定化されていることを特徴とする、蛍光標識用樹脂粒子。
    （１）水溶液中の蛍光色素単独の濃度に依存する発光強度のピークが、３０～８０μＭの範囲内にあること。
    （２）濃度１００μＭにおける発光強度が前記ピークの発光強度の８０％以上であること。
  2. 　前記蛍光色素の水溶液中でのストークスシフトが２５ｎｍ以上である、請求項１に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
  3. 　前記蛍光色素が水溶化処理されたものである、請求項１または２に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
  4. 　前記水溶化処理が酸処理である、請求項３に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
  5. 　前記蛍光色素の水溶液中でのピーク発光強度が、下記式で表される輝度として１００，０００以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
    　輝度＝モル吸光係数×量子収率×１／１０００
  6. 　前記蛍光色素が熱硬化性樹脂を含有する樹脂粒子に内包された状態で固定化されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
  7. 　粒子表面に生体関連結合性物質が連結されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光標識用樹脂粒子。
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