CN109053710B - 近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂及其制备方法和应用 - Google Patents

近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂及其制备方法和应用。所述聚集诱导发光染料具有式Ⅰ所示结构。另外，本发明还提供了所述Aβ荧光成像剂在脑组织切片荧光标记和活体成像上的应用。测试表明，本发明提供的聚集诱导发光染料具有近红外发射、光稳定性强、生物相容性好以及信噪比高等诸多优点，能够实现对APP/PS1转基因小鼠脑组织切片中Aβ斑块的精确定位，从而高保真地获取关于Aβ斑块数目、实时形态等原位信息。特别值得指出的是，该类成像剂具有良好的血脑屏障穿透性，可应用于APP/PS1转基因小鼠脑部Aβ斑块的在体实时成像。
Figure DDA0001799127010000011

Description

近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于精细化工技术领域，具体涉及一类基于近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂及其制备方法和在脑组织切片上的荧光标记应用。
背景技术
阿尔茨海默症(AD)是一种神经退行性疾病，是造成老年痴呆最主要的原因之一。截止目前为止，仍没有一种经过临床试验的药物对其具有显著疗效，因此阿尔茨海默症(AD)被认为是一种无法治愈的疾病。研究表明，大脑中Aβ斑块的形成和沉积在AD的神经病理学中扮演着极为重要的角色，被认为是该疾病早期诊断和预测的一种生物标记物。因此，发展高性能的Aβ斑块成像剂对阿耳茨海默症的早期诊断和治疗具有非常重要的意义。
荧光成像技术作为一种非侵入性的早期诊断方法，可以实时监测生物分子在生物体内的作用，近年来被广泛运用于生物医学成像领域。众所周知，刚果红(CR)和硫黄素T(ThT)作为市售染料，为Aβ斑块的标记提供了一种标准化的方法。
然而，现有市售Aβ斑块荧光标记染料的发射波长较短(主要位于400-600nm区间)、斯托克斯位移小、以及光稳定性差，导致其成像时背景信号高，并且容易发生光漂白，很难实现对Aβ斑块的准确定位；值得注意的是，大多数商业Aβ斑块荧光成像剂在处于较大浓度时，由于π-π堆积作用的影响，造成染料分子严重的自淬灭。由于其固有的聚集荧光淬灭(aggregation-caused quenching,ACQ)现象，不能够真实反映Aβ斑块的位置和浓度。除此之外，市售染料无法有效穿透血脑屏障到达斑块区域，进一步限制了其在生物活体成像上的应用。
发明内容
针对现有Aβ荧光成像技术存在的瓶颈问题，本发明提供了一类基于聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂。该类聚集增强型近红外荧光染料以N,N-二甲基苯胺结构单元为Aβ斑块的识别、结合基团，通过引入噻吩基团有效拓展其共轭体系，并修饰磺酸基增加染料的亲水性以及调控其聚集态，降低背景荧光，使其具有长发射波长(位于近红外区域)、大斯托克斯位移、光稳定性优异和生物相容性好等诸多优点。特别是由于该类成像剂在水溶液中完全没有荧光，而仅当高选择性与Aβ斑块特异结合后，其初始的聚集状态发生改变，伴随荧光的显著增强变化，使得该成像剂在检测Aβ斑块时表现为极高的信噪比。利用激光共聚焦显微镜，实现了对APP/PS1转基因小鼠脑组织切片中Aβ斑块的精确定位和长时间示踪，从而高保真地获取关于Aβ斑块数目、实时形态等原位信息。特别值得指出的是，该类成像剂具有良好的血脑屏障穿透性，可应用于APP/PS1转基因小鼠脑部Aβ斑块的在体实时成像。
本发明通过下述方案实现：
本发明提出了一种近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂，其结构为式Ⅰ所示：
Figure BDA0001799125990000021
式Ⅰ中，R1独立选自：氰基(-CN)，羧基(-COOH)和式Ⅱ所示基团(其中曲线标记处为取代位，下同)中的任意一种；
Figure BDA0001799125990000022
R2为C1～C4的烃基或烃基磺酸盐；A为N,N-二甲基苯胺，其结构如式Ⅲ所示；
Figure BDA0001799125990000023
本发明还提供了上述近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂的制备方法，其主要步骤包括：由式IV所示化合物与式V所示化合物经Knoevenagel缩合反应，制得目标化合物。
Figure BDA0001799125990000024
Figure BDA0001799125990000031
其中，A和R1，R2的定义与前文所述相同。
本发明还提供了上述近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂在脑组织切片荧光标记和活体成像上的应用。
附图说明
图1.式I-1所示化合物(详见实施例1)在四氢呋喃和水混合溶剂中不断增加水含量的荧光发射光谱图(10-5mol·L-1)；
其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图2.式I-2所示化合物(详见实施例1)在水和乙醇混合溶剂中不断增加乙醇含量的荧光发射光谱图(10-5mol·L-1)；
其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图3.染料I-2(浓度为10-5mol·L-1)随着加入不同浓度的Aβ42蛋白纤维(0-9μM)后荧光光谱的变化；
其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图4.商业染料ThT，染料I-1，染料I-2(浓度为10-6mol·L-1)分别与Aβ42蛋白纤维(3μM)在PBS缓冲液中孵育30min前后荧光强度的变化。
其中，横坐标为三种染料分子，纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图5.染料I-2与商业化染料ThT在相同激光强度下光稳定性曲线。
图6.染料I-2生物相容性表征。
图7.染料I-2与商业化染料ThT在APP/PS1转基因鼠相邻脑组织切片上的荧光共定位标记图。
其中，图7(A)与(E)分别为市售染料ThT与染料I-2染色的APP/PS1脑切片海马区域；图7(B)与(F)分别为市售染料ThT与染料I-2染色的APP/PS1脑切片大脑皮层区域；图7(C)与(G)为对大脑皮层区域染色后放大40倍的图片；图7(D)与(H)为野生型(阴性)小鼠脑切片图片。
图8.染料I-2在野生型(阴性)小鼠与APP/PS1转基因小鼠上的活体成像应用。
具体实施方式
在本发明一个优选的技术方案中：
R1独立选自氰基，羧基或式Ⅱ所示基团的任意一种；
R2为C1～C4的直链或支链烷基，C2～C4的直链或支链炔基，C1-C4的直链烃基磺酸盐；
A为N,N-二甲基苯胺；
在进一步优选的技术方案中，R1独立选自氰基或式Ⅱ所示基团的任意一种，R2为乙基，正丁基和丙磺酸盐；
更进一步优选的R1独立选自氰基，R2为乙基、丙磺酸盐中的一种；
更进一步优选的R2为丙磺酸盐；
本发明所提供的，一种制备式Ⅰ所示化合物的方法，所述方法的主要具体步骤是：在有催化剂(如醋酸铵等)存在条件下，由式IV所示化合物与相应的醛V于甲苯或乙腈等有机溶剂(反应介质)中，在回流状态保持20分钟至2小时，制得目标物(式Ⅰ所示化合物)。
下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围：
实施例1
(1)染料I-1的合成：
Figure BDA0001799125990000041
在100mL圆底烧瓶中，分别加入1-乙基-2-甲基-4-(α,α-二氰基)亚甲基-1,4-二氢喹啉(116.4mg,0.50mmol)，5-(N,N-二甲基苯胺)-2-噻吩醛(104mg,0.50mmol)和甲苯30mL，滴加0.5mL醋酸铵溶液(2M)，氩气保护下150℃反应2h。冷却至室温后，旋蒸除去甲苯，柱色谱分离(200-300目硅胶，PE:CH2Cl2＝5:2)，旋蒸得红色固体50mg，产率38％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ＝1.42(t,J＝8.0Hz,3H,NCH2CH3-H),δ＝2.97(s,6H,CH3-H),δ＝4.54(q,J＝8.0Hz,2H,NCH2CH3-H),δ＝6.77(d,J＝8.0Hz,2H,Ph-H),δ＝7.03(s,1H,Ph-H),δ＝7.07(d,J＝16Hz,1H,alkene-H),δ＝7.38(d,J＝4.0Hz,1H,Ph-H),δ＝7.54(d,2H,J＝4.0Hz,thiophene-H),δ＝7.57(s,1H,Ph-H),7.62(t,J＝8.0Hz,1H,Ph-H),δ＝7.66(d,J＝16Hz,1H,alkene-H),7.93(t,J＝4.0Hz,1H,Ph-H),δ＝8.09(d,J＝8.0Hz,1H,Ph-H),δ＝8.93(d,J＝8.0Hz,1H,Ph-H).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M+H]+calcd.for[C28H24N4S+H]+449.1800；found449.1806.
(2)染料I-2的合成：
Figure BDA0001799125990000051
在50mL单口烧瓶中，分别加入4-二氰亚甲基-2-甲基喹啉腈丙磺酸钠盐(50mg，0.15mmol)、甲苯(10mL)、5-(N,N-二甲基苯胺)-2-噻吩醛(34mg，0.15mmol)，滴加0.5mL醋酸铵溶液(2M)，氩气保护，150℃下反应2h。冷却，旋蒸溶剂，柱色谱分离(300-400目硅胶，DCM:MeOH＝1:2)，旋蒸得深红色固体15mg，产率30％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ＝2.10(m,2H,-CH2SO3 -),δ＝2.67(m,2H,-CH2CH2CH2-),δ＝2.97(s,6H,-N(CH3)2),δ＝4.70(t,J＝8.0Hz,2H,-NCH2CH2-),δ＝6.78(d,J＝8.0Hz,2H,phenyl-H),δ＝7.07(s,1H,pyrroleapp:addword:pyrrole-H),δ＝7.31(d,J＝16.0Hz,1H,alkene-H),δ＝7.38(d,J＝4.0Hz,1H,thiophene-H),δ＝7.51(t,J＝8.0Hz,1H,phenyl-H),δ＝7.62(d,J＝4.0Hz,2H,thiophene-H,Ph-H),δ＝7.67(d,J＝16.0Hz,1H,alkene-H),δ＝7.70(s,1H,pyrroleapp:addword:pyrrole-H),δ＝7.89(t,J＝8.0Hz,1H,phenyl-H),δ＝8.24(d,J＝8.0Hz,1H,phenyl-H),δ＝8.91(d,J＝8.0Hz,1H,phenyl-H).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M]-calcd.for[C29H25N4O3S2]-541.1368；found541.1372.
实施例2
染料I-2在聚集态的吸收和荧光光谱
取实施例1制备的染料I-2溶于分析纯二甲基亚砜中，制成1.0×10-3M的储备液。然后制备乙醇(EtOH)含量为95％的EtOH/H2O混合溶剂2mL。取20μL上述储备液加入到已制备的EtOH/H2O混合溶剂中，混合均匀后转移至光学石英比色皿(10×10mm)中测试其荧光光谱。如图2所示，以500nm作为激发波长，染料I-2的最大发射峰大约位于720nm处位于近红外区域，斯托克斯位移达到200nm；并且染料I-2在混合溶剂中聚集导致其荧光增强，具有典型的聚集荧光增强特性。
实施例3
染料I-2对Aβ42纤维的光谱响应
取实施例1制备的染料I-2溶于分析纯二甲基亚砜中，制成1.0×10-3M的储备液。然后制备PBS缓冲液2.91mL。取3μL上述储备液加入到已制备的PBS缓冲液中，再加入90μL Aβ42纤维储存液(1×10-4M)。混合液在37℃下孵育30min，混合均匀后转移至光学石英比色皿(10×10mm)中测试其吸收和荧光光谱。如图4所示，未加入Aβ42纤维时，染料I-2基本没有荧光信号；当加入Aβ42纤维后，以500nm作为激发波长，在近红外区域660nm处出现最大发射峰，荧光强度增加50倍左右，表现出极高的信噪比。
实施例4
染料I-2光稳定性测试
光稳定性是评价染料在长时间成像等实际应用中重要的性能指标之一。我们对染料进行连续光照然后监测其荧光强度的方法来评价染料的光稳定性，同时选取商业化染料ThT作为参比染料。如图5所示，随着光照时间增长，ThT荧光强度急剧下降，当光照18min左右时，ThT产生严重的光漂白，表明其光稳定性差；然而，在相同光照条件下，染料I-2荧光强度缓慢下降，当光照时间达到40min时，其荧光强度为初始荧光强度的50％，表明染料I-2具有优异的光稳定性。
实施例5
染料I-2生物相容性测试
我们采用标准的MTT方法测试聚集诱导发光染料I-2的细胞毒性。具体实验步骤如下：首先将HeLa细胞铺到96孔板中，细胞密度为1×104细胞/孔，并在细胞培养箱中培养过夜。不同浓度的染料I-2(0-32μM，100μL/孔)分别加入到不同的孔中，培养基稀释的DMSO(0.5％，100μL/孔)作为阴性对照组。细胞在细胞培养箱中培养24h，然后在每孔中加入10μLMTT溶液(5mg/mL)。孵育4小时后，除去96孔板中的液体，并加入DMSO(100μL/孔)，最后用酶标仪进行测定。由图6中细胞毒性数据所示，当染料I-2的浓度增大到32μM时，细胞存活率大约为95％，表明染料I-2具有良好的生物相容性。
实施例6
染料I-2对APP/PS1转基因小鼠脑组织切片的荧光标记
为了研究染料I-2对阿尔茨海默小鼠脑组织切片是否具有荧光标记能力，我们选取APP/PS1转基因小鼠脑组织切片作为切片模型，同时选取商业化市售染料硫黄素T(ThT)作为金标染料。具体实验步骤如下：取实施例2中染料I-2储备液或者硫黄素T(ThT)储备液(1.0×10-3M)在室温条件下滴加到相邻的脑组织切片上孵育30min，(染料I-2最终浓度为100μM，染料ThT最终浓度为200μM)，接着用40％的乙醇溶液浸泡2min，洗涤两次，再用去离子水冲洗一次。最后用荧光共聚焦显微镜进行组织切片成像。成像结果如图7所示，发现染料I-2能够清楚地对Aβ斑块进行荧光标记，定位结果与市售染料硫黄素T(ThT)标记的相邻切片基本一致。证明了染料I-2能够准确的与Aβ斑块结合；相比于市售染料硫黄素T(ThT)，染料I-2具有更高的灵敏度和信噪比。
实施例7
本发明中所有活体实验均遵守实验室动物饲养和使用的规章制度，并得到华东理工大学大学动物饲养和使用委员会批准。实验用带瘤裸鼠购自上海斯莱克动物实验有限公司，饲养在无菌室中层流通风橱内的无菌鼠笼中，使用高压蒸汽处理过的食物和水进行喂食。
对APP/PS1转基因鼠和对照组野生型黑鼠进行一次剂量为2mg/kg的I-2的尾静脉注射。注射后，使用Perkin Elmer In-Vivo Professional Imaging System对APP/PS1转基因鼠进行整体的光学成像，激发波长和接收波长分别为500nm和660nm。成像实验前，对裸鼠进行腹腔注射1％戊巴比妥钠盐溶液(45mg/kg)使之麻醉。
从图8中看出，尾静脉注射化合物I-2后，APP/PS1转基因小鼠的大脑区域出现明显的荧光信号。而对照组野生型黑鼠脑部无明显的荧光信号。表明化合物I-2具有很好的血脑屏障穿透性和活体成像特性，可进一步应用于生物活体测试中。

Claims (7)

1.近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂，其结构为式Ⅰ所示：
Figure FDA0002503625450000011
式Ⅰ中，R1独立选自：氰基(-CN)，羧基(-COOH)和式Ⅱ所示基团中的任意一种；
Figure FDA0002503625450000012
R2为C1～C4的烃基或烃基磺酸盐；式I中A为4-(N，N二甲基氨基)苯基，其结构如式Ⅲ所示；
Figure FDA0002503625450000013
2.根据权利要求1所述的近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂，其特征在于，所述R1为氰基，羧基和式Ⅱ所示基团中的任意一种，R2为乙基，正丁基和丙磺酸盐中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂，其特征在于，所述R1为氰基、式Ⅱ所示基团中的任意一种，R2为乙基、丙磺酸盐中的一种。
4.根据权利要求1所述的近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂，其特征在于，所述R1为氰基，R2为乙基、丙磺酸盐中的一种。
5.根据权利要求1所述的近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂，其特征在于，R1为氰基，R2为丙磺酸盐。
6.一种如权利要求4所述的近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂制备方法，其特征在于，步骤如下：
在有催化剂存在条件下，由式IV所示化合物与相应的醛V于甲苯或乙腈有机溶剂反应介质中，在回流状态保持20分钟至2小时，制得目标物式Ⅰ所示化合物；
Figure FDA0002503625450000021
其中，式中：
R1独立选自氰基；R2独立选自乙基和丙磺酸盐的任意一种；
A为4-(N，N二甲基氨基)苯基。
7.根据权利要求6所述的近红外、高信噪比的Aβ荧光成像剂的制备方法，其特征在于，所述步骤中将1当量的式IV所示结构的化合物与1.5当量的式V所示结构的化合物溶于乙腈中，醋酸铵作为催化剂，回流条件下反应20min～2h；反应结束后，柱层析分离得到式Ⅰ所示结构的荧光成像剂。
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