CN114249696B - 一种鲁米诺类化合物及其制备方法和应用、药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鲁米诺类化合物及其制备方法和应用、药物组合物，属于医学诊断技术领域。本发明提供的鲁米诺类化合物对α‑突触核蛋白具有高亲和力，且能够释放特异性α‑突触核蛋白检测信号，能够有效区分α‑突触核蛋白和其他具有β‑折叠结构的蛋白，实现对α‑突触核蛋白的特异性识别，可以用于制备α‑突触核蛋白检测试剂，尤其可以用于制备化学发光检测和荧光检测α‑突触核蛋白的体外诊断试剂或者用于制备化学发光显像α‑突触核蛋白的体内造影剂。

Description

一种鲁米诺类化合物及其制备方法和应用、药物组合物
技术领域
本发明涉及医学诊断技术领域，尤其涉及一种鲁米诺类化合物及其制备方法和应用、药物组合物。
背景技术
α-突触核蛋白的异常聚集是帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩等神经退行性疾病的重要病理学标志物。研究发现α-突触核蛋白的产生和聚集早于临床症状，与病程密切相关。因此，开发以α-突触核蛋白为靶标的检测试剂，对相关神经退行性疾病的早期诊断、病程监测以及治疗药物的研究等具有重要意义。
光学检测具有灵敏度高、数据采集时间短以及成本低廉等诸多优势，近年在医学诊断等领域中的应用受到广泛重视；尤其是化学发光技术，不受生物组织的自发光干扰，且可穿透深层组织。因此，研发与α-突触核蛋白具有高亲和力的靶向光学探针，并直接应用于制备α-突触核蛋白的检测试剂或显像造影剂，将具有非常重要的科学意义和实际价值。然而，目前国内外有关靶向α-突触核蛋白的光学化合物的研究报道较少，还处于起步阶段。因此，研发性能优异的新型小分子光学化合物，特别是化学发光化合物，具有重大的应用前景和科学意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲁米诺类化合物及其制备方法和应用、药物组合物，本发明提供的鲁米诺类化合物对α-突触核蛋白具有高亲和力和选择性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种鲁米诺类化合物，具有式I所示结构：
Figure BDA0003452309270000011
所述式I中X选自-N＝N-、-N＝CH-、-N＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-或-C≡C-；
Y选自
Figure BDA0003452309270000012
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
优选地，所述鲁米诺类化合物为具有式II～式IX所示结构的化合物中的任一种：
Figure BDA0003452309270000021
优选地，所述鲁米诺类化合物为具有式1～式26所示结构的化合物中的任一种：
Figure BDA0003452309270000022
Figure BDA0003452309270000031
本发明提供了上述技术方案所述鲁米诺类化合物的制备方法，
(a)当X为-CH＝CH-时，包括以下步骤：
将鲁米诺或异鲁米诺与水、第一重氮化试剂混合，进行第一重氮化反应，得到第一重氮化反应产物体系；
将所述第一重氮化反应产物体系、化合物a、第一催化剂与第一有机溶剂混合，进行Meerwein芳基化反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物a具有式a所示结构：
Figure BDA0003452309270000041
所述式a中Y选自
Figure BDA0003452309270000042
Figure BDA0003452309270000043
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2；
(b)当X为-N＝CH-或-N＝CH-CH＝CH-时，包括以下步骤：
将鲁米诺或异鲁米诺与化合物b、第一路易斯碱、第二有机溶剂混合，进行Schiff碱反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物b具有式b所示结构：
Figure BDA0003452309270000044
所述式b中n为0或1，Y选自
Figure BDA0003452309270000045
Figure BDA0003452309270000046
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2；
(c)当X为-N＝N-时，包括以下步骤：
将鲁米诺或异鲁米诺与第三有机溶剂、第二重氮化试剂混合，进行第二重氮化反应，得到第二重氮化反应产物体系；
将所述第二重氮化反应产物体系的pH值调节至中性，将所得体系与尿素、化合物c混合，进行偶合反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物c具有式c所示结构：
H-Y-R式c；
所述式c中Y选自
Figure BDA0003452309270000047
Figure BDA0003452309270000048
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2；
(d)当X为-C≡C-时，包括以下步骤：
将6-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮或5-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮与化合物d、第四有机溶剂、第二催化剂、第二路易斯碱混合，进行偶联反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物d具有式d所示结构：
CH≡C-Y-R式d；
所述式d中Y选自
Figure BDA0003452309270000051
Figure BDA0003452309270000052
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
本发明提供了上述技术方案所述鲁米诺类化合物在制备α-突触核蛋白检测试剂中的应用。
优选地，所述α-突触核蛋白包括α-突触核蛋白单体和/或α-突触核蛋白聚集体。
优选地，所述α-突触核蛋白检测试剂包括体外诊断试剂或体内造影剂。
本发明提供了上述技术方案所述鲁米诺类化合物在制备α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒中的应用。
优选地，所述α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒适用的生物样本包括体液或组织。
本发明提供了一种药物组合物，包括有效成分和药学上可接受的辅料，所述有效成分为上述技术方案所述的鲁米诺类化合物、其药学上可接受的盐或其前药。
本发明提供了一种鲁米诺类化合物，本发明所述鲁米诺类化合物具有平面柔性结构，对α-突触核蛋白具有高亲和力，所述鲁米诺类化合物的结构整体嵌合于α-突触核蛋白空间结构中，导致鲁米诺类化合物微环境改变，分子内旋转受限，荧光量子产率大幅度提高，光强度增强，释放特异性α-突触核蛋白检测信号，能够有效区分α-突触核蛋白和其他具有β-折叠结构的蛋白，实现对α-突触核蛋白的特异性识别，可以用于制备α-突触核蛋白检测试剂，尤其可以用于制备化学发光检测和荧光检测α-突触核蛋白的体外诊断试剂或者用于制备化学发光显像α-突触核蛋白的体内造影剂。体外实验表明，本发明所述鲁米诺类化合物与α-突触核蛋白特异结合并释放化学发光信号；所述鲁米诺类化合物具有良好的入脑能力、靶向结合脑内α-突触核蛋白并释放化学发光信号而被光学成像系统捕获。因此，所述鲁米诺类化合物具有成为帕金森病等与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病的新型诊断试剂和造影剂的巨大潜力。
附图说明
图1为测试例3中实施例1化合物N1和不同种类蛋白脑匀浆的化学发光信号分析图；
图2为测试例4中实施例1化合物N1在不同厚度组织覆盖下所得化学发光信号的半定量分析图；
图3为测试例5中实施例1化合物N1尾静脉注射模型小鼠的活体化学发光成像图(上两行)及离体成像图(下两行)；
图4为测试例5中实施例1化合物N1尾静脉注射模型小鼠的各组织器官内化学发光信号的半定量分析图；
图5为测试例6中实施例1化合物N1在人血清中的化学发光信号图；
图6为测试例6中人血清加入实施例1化合物N1和不同蛋白的化学发光信号变化倍数图。
具体实施方式
本发明提供了一种鲁米诺类化合物，具有式I所示结构：
Figure BDA0003452309270000061
所述式I中X选自-N＝N-、-N＝CH-、-N＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-或-C≡C-；
Y选自
Figure BDA0003452309270000062
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
在本发明中，所述鲁米诺类化合物优选为具有式II～式IX所示结构的化合物中的任一种：
Figure BDA0003452309270000063
在本发明中，所述鲁米诺类化合物进一步优选为具有式1～式26所示结构的化合物中的任一种：
Figure BDA0003452309270000071
Figure BDA0003452309270000081
本发明提供了上述技术方案所述鲁米诺类化合物的制备方法，本发明具体是根据所述鲁米诺类化合物的结构选择不同的制备方法，下面进行具体说明。
在本发明中，当X为-CH＝CH-时，所述鲁米诺类化合物的制备方法包括以下步骤：
将鲁米诺或异鲁米诺与水、第一重氮化试剂混合，进行第一重氮化反应，得到第一重氮化反应产物体系；
将所述第一重氮化反应产物体系、化合物a、第一催化剂与第一有机溶剂混合，进行Meerwein芳基化反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物a具有式a所示结构：
Figure BDA0003452309270000082
所述式a中Y选自
Figure BDA0003452309270000083
Figure BDA0003452309270000084
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
本发明将鲁米诺或异鲁米诺与水、第一重氮化试剂混合，进行第一重氮化反应，得到第一重氮化反应产物体系。在本发明中，所述水优选为超纯水，其作为溶剂，用量保证第一重氮化反应顺利进行即可。在本发明中，所述第一重氮化试剂优选为浓盐酸和亚硝酸钠，所述浓盐酸的浓度优选为20～50wt％，更优选为30wt％；所述浓盐酸具体起到调节pH值的作用；所述亚硝酸钠优选以亚硝酸钠水溶液形式使用，所述亚硝酸钠水溶液的浓度优选为0.05～0.5mol/L，更优选为0.2mol/L；所述亚硝酸钠水溶液优选由亚硝酸钠溶于超纯水中配制得到。
在本发明中，所述鲁米诺(或异鲁米诺)、浓盐酸与亚硝酸钠的用量比优选为1.5mmol：(0.2～0.6)mL：(2～4)mmol，更优选为1.5mmol：0.3mL：3mmol。在本发明中，所述鲁米诺(或异鲁米诺)、水与第一重氮化试剂混合的方式优选为：将鲁米诺(或异鲁米诺)与水混合，0～5℃条件下搅拌25～35min，将所得鲁米诺(或异鲁米诺)水溶液与浓盐酸混合，0～5℃条件下继续搅拌25～35min；之后向所得体系中滴加亚硝酸钠水溶液。在本发明中，所述亚硝酸钠水溶液的滴加速率优选为0.15～0.60mL/min，更优选为0.3mL/min。
在本发明中，所述第一重氮化反应的温度优选为0～5℃；在本发明的实施例中，具体是在冰浴条件下进行所述第一重氮化反应；所述第一重氮化反应的时间优选为50～70min，更优选为60min；所述第一重氮化反应优选在搅拌条件下进行。
得到第一重氮化反应产物体系后，本发明将所述第一重氮化反应产物体系、化合物a、第一催化剂与第一有机溶剂混合，进行Meerwein芳基化反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物。在本发明中，所述第一重氮化反应产物体系无需进行后处理，直接进行后续操作即可。在本发明中，所述第一催化剂优选包括氯化铜，具体为无水氯化铜；所述第一有机溶剂优选为丙酮，其用量没有特殊限定，保证Meerwein芳基化反应顺利进行即可。
在本发明中，所述鲁米诺(或异鲁米诺)、化合物a与第一催化剂的用量比优选为1.5mmol：(1.3～1.7)mmol：(0.13～0.17)mmol，更优选为1.5mmol：1.5mmol：0.15mmol。本发明对所述第一重氮化反应产物体系、化合物a、第一催化剂与第一有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够将各组分混合均匀即可。在本发明中，所述Meerwein芳基化反应优选在室温条件下进行；在本发明的实施例中，所述室温具体为25℃；所述Meerwein芳基化反应的时间优选为30～40h，更优选为36h；所述Meerwein芳基化反应优选在搅拌条件下进行。
所述Meerwein芳基化反应后，本发明优选采用二氯甲烷萃取Meerwein芳基化反应所得产物体系，采用无水硫酸钠对有机相进行干燥除水，旋蒸除去溶剂后进行硅胶柱层析纯化，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；所述纯化采用的试剂优选为石油醚与乙酸乙酯按照20：1的体积比混合得到。
在本发明中，当X为-N＝CH-或-N＝CH-CH＝CH-时，所述鲁米诺类化合物的制备方法包括以下步骤：
将鲁米诺或异鲁米诺与化合物b、第一路易斯碱、第二有机溶剂混合，进行Schiff碱反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物b具有式b所示结构：
Figure BDA0003452309270000101
所述式b中n为0或1，Y选自
Figure BDA0003452309270000102
Figure BDA0003452309270000103
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
在本发明中，所述第二有机溶剂优选为无水乙醇，其用量没有特殊限定，保证Schiff碱反应顺利进行即可。在本发明中，所述第一路易斯碱优选为哌啶。在本发明中，所述鲁米诺(或异鲁米诺)、化合物b与第一路易斯碱的用量比优选为1mmol：(0.8～1.2)mmol：(90～110)μL，更优选为1mmol：1mmol：100μL。本发明对所述鲁米诺(或异鲁米诺)、化合物b、第一路易斯碱与第二有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够将各组分混合均匀即可。在本发明中，所述Schiff碱反应优选在体系回流条件下进行；在本发明的实施例中，具体是在85℃条件下进行所述Schiff碱反应；所述Schiff碱反应的时间优选为10～15h，更优选为12h。所述Schiff碱反应后，本发明优选将所得产物体系冷却至室温，之后采用无水乙醇进行重结晶，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物。
在本发明中，当X为-N＝N-时，所述鲁米诺类化合物的制备方法包括以下步骤：
将鲁米诺或异鲁米诺与第三有机溶剂、第二重氮化试剂混合，进行第二重氮化反应，得到第二重氮化反应产物体系；
将所述第二重氮化反应产物体系的pH值调节至中性，将所得体系与尿素、化合物c混合，进行偶合反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物c具有式c所示结构：
H-Y-R式c；
所述式c中Y选自
Figure BDA0003452309270000104
Figure BDA0003452309270000105
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
本发明将鲁米诺(或异鲁米诺)、第三有机溶剂与第二重氮化试剂混合，进行第二重氮化反应，得到第二重氮化反应产物体系。在本发明中，所述第三有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，其用量没有特殊限定，保证第二重氮化反应顺利进行即可。在本发明中，所述第二重氮化试剂优选为浓盐酸和亚硝酸钠，所述浓盐酸的浓度优选为20～50wt％，更优选为30wt％；所述亚硝酸钠优选以亚硝酸钠水溶液形式使用，所述亚硝酸钠水溶液的浓度优选为0.05～0.5mol/L，更优选为0.2mol/L；所述亚硝酸钠水溶液优选由亚硝酸钠溶于超纯水中配制得到。
在本发明中，所述鲁米诺(或异鲁米诺)、浓盐酸与亚硝酸钠的用量比优选为1.5mmol：(0.2～0.6)mL：(2.8～3.2)mmol，更优选为1.5mmol：0.3mL：3mmol。在本发明中，所述鲁米诺(或异鲁米诺)、第三有机溶剂与第二重氮化试剂混合的方式优选为：将鲁米诺(或异鲁米诺)与第三有机溶剂混合，室温条件下搅拌至完全溶解，之后0～5℃条件下搅拌25～35min，将所得鲁米诺(或异鲁米诺)溶液与浓盐酸混合，0～5℃条件下继续搅拌25～35min；之后向所得体系中滴加亚硝酸钠水溶液。在本发明中，所述亚硝酸钠水溶液的滴加速率优选为0.18～0.22mL/min，更优选为0.2mL/min。
在本发明中，所述第二重氮化反应的温度优选为0～5℃；在本发明的实施例中，具体是在冰浴条件下进行所述第二重氮化反应；所述第二重氮化反应的时间优选为50～70min，更优选为60min；所述第二重氮化反应优选在搅拌条件下进行。
得到第二重氮化反应产物体系后，本发明将所述第二重氮化反应产物体系的pH值调节至中性，将所得体系与尿素、化合物c混合，进行偶合反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物。本发明优选采用饱和碳酸钠水溶液将所述第二重氮化反应产物体系的pH值调节至中性。在本发明中，所述尿素的作用是去除体系中过量的亚硝酸钠，其用量不作特殊限定。在本发明中，所述鲁米诺(或异鲁米诺)与化合物c的摩尔比优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1：1。
本发明优选将所述第二重氮化反应产物体系的pH值调节至中性，然后将所得体系与尿素混合，0～5℃条件下搅拌25～35min，之后将所得体系与化合物c混合，进行偶合反应。在本发明中，所述偶合反应的温度优选为0～5℃；在本发明的实施例中，具体是在冰浴条件下进行所述偶合反应；所述偶合反应的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；所述偶合反应优选在搅拌条件下进行。所述偶合反应后，本发明优选将所得产物体系过滤，过滤得到的固体物料经水洗，之后经重结晶，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物。在本发明中，所述重结晶采用的试剂优选包括无水乙醇或乙酸乙酯，根据目标化合物的结构适应性选择即可。
在本发明中，当X为-C≡C-时，所述鲁米诺类化合物的制备方法包括以下步骤：
将6-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮或5-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮与化合物d、第四有机溶剂、第二催化剂、第二路易斯碱混合，进行偶联反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物d具有式d所示结构：
CH≡C-Y-R式d；
所述式d中Y选自
Figure BDA0003452309270000121
Figure BDA0003452309270000122
R选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
在本发明中，所述第四有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，其用量没有特殊限定，保证所述偶联反应顺利进行即可。在本发明中，所述第二催化剂优选为四三苯基膦钯和碘化铜，所述四三苯基膦钯与碘化铜的摩尔比优选为1：(1.8～2.2)，更优选为1：2。在本发明中，所述第二路易斯碱优选为三乙胺。在本发明中，所述化合物d、6-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮(或5-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮)、四三苯基膦钯与路易斯碱的用量比优选为1:(0.4～0.6)：(0.08～0.12)：(2.2～2.7)，更优选为1：0.5：0.1：2.5。
在本发明中，所述化合物d、第四有机溶剂、6-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮(或5-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮)、第二催化剂与第二路易斯碱混合的方式优选为将化合物d、6-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮(或5-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮)与第二催化剂混合，在氮气保护条件下，将所得体系与第二路易斯碱和第四有机溶剂混合。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为50～60℃，更优选为55℃；时间优选为24～144h，更优选为96h；所述偶联反应优选在搅拌条件下进行。所述偶联反应后，本发明优选利用二氯甲烷萃取偶联反应后所得产物体系，采用无水硫酸钠对有机相进行干燥除水，旋蒸除去溶剂后进行硅胶柱层析纯化，所述纯化采用的试剂优选为石油醚与乙酸乙酯按照100：0.1的体积比混合得到。
本发明提供了上述技术方案所述鲁米诺类化合物在制备α-突触核蛋白检测试剂中的应用。在本发明中，所述α-突触核蛋白优选包括α-突触核蛋白单体和/或α-突触核蛋白聚集体。在本发明中，所述α-突触核蛋白检测试剂优选包括体外诊断试剂或体内造影剂，其中，α-突触核蛋白的体外诊断试剂适用的检测方法优选为光学检测，具体可以为化学发光检测或荧光检测，α-突触核蛋白的体内造影剂适用的显像方法优选为光学显像，具体可以为化学发光显像或荧光显像，包括但不限于荧光显微技术、激光共聚焦显微技术、多光子显微技术、光学投影断层扫描技术(OPT)、光片照明显微技术(SPIM)、光学成像系统、介观荧光断层扫描技术、荧光分子断层扫描成像技术(FMT)、多模态成像系统(荧光成像结合X射线/CT/MRI)、光声成像系统或多光谱光声断层成像(MSOT)。
在本发明中，所述α-突触核蛋白检测试剂的应用过程中，具体是将可检测量的α-突触核蛋白检测试剂通过本领域技术人员公知的方法给药至动物或人体组织内。在本发明的一个实施方案中，以可检测量的α-突触核蛋白检测试剂引入动物或人体内并且在足以使鲁米诺类化合物与α-突触核蛋白结合的时间之后，非创伤性地检测鲁米诺类化合物在靶标部位的光学信号。在本发明的另一实施方案中，将α-突触核蛋白检测试剂引入动物或人体内，经足量的时间以使鲁米诺类化合物与α-突触核蛋白结合，取组织样品，并脱离动物或人体，检测组织样品中的鲁米诺类化合物光学信号。在本发明的另一实施方案中，自动物或人体取组织样品并且将可检测量的α-突触核蛋白检测试剂引入该组织样品，在足以使鲁米诺类化合物结合至α-突触核蛋白的时间之后，检测鲁米诺类化合物光学信号。
在本发明中，所述α-突触核蛋白检测试剂可以诊断与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病，所述与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病包括但不限于帕金森病、路易体痴呆或多系统萎缩。
本发明提供了上述技术方案所述鲁米诺类化合物在制备α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒中的应用。在本发明中，所述α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒优选还包括氧化剂；所述氧化剂优选包括次氯酸根或过氧化物，所述过氧化物优选包括过氧化氢、过氧化氢叔丁醇或超氧阴离子；所述氧化剂的作用是氧化鲁米诺结构成为不稳定的过氧化物。在本发明中，所述α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒优选还包括催化剂；所述催化剂优选包括多价金属离子，如铜离子、铁离子或亚铁离子。在本发明中，所述α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒中鲁米诺类化合物的浓度优选为0.25～10μmol/L，更优选为0.5～1μmol/L；氧化剂的浓度优选为10～1000μmol/L，更优选为50～100μmol/L；多价金属离子的浓度优选为0.01～1μmol/L，更优选为0.1～0.5μmol/L。在本发明中，所述α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒适用的生物样本优选包括体液或组织，所述体液或组织可以为人体的体液或组织，也可以为动物的体液或组织；所述体液优选包括血液、脑脊液、唾液或泪液，所述组织优选包括脑、眼、脊髓、胰腺、肝、肾或肠。
本发明提供了一种药物组合物，包括有效成分和药学上可接受的辅料，所述有效成分为上述技术方案所述的鲁米诺类化合物、其药学上可接受的盐或其前药。在本发明中，所述药学上可接受的辅料优选包括赋形剂和/或稀释剂，进一步优选包括水、生理盐水、甘油和乙醇中的一种或几种。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备化合物N1，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000141
将1.5mmol鲁米诺(265.74mg)与5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，室温(25℃)条件下搅拌至完全溶解，之后冰浴(0～5℃)条件下搅拌30min，加入0.3mL浓度为30wt％的浓盐酸，冰浴条件下继续搅拌30min；之后以0.2mL/min滴加速率加入浓度为0.2mol/L的亚硝酸钠溶液(由207mg亚硝酸钠溶于15mL超纯水配制得到)，冰浴条件下搅拌反应1h；之后采用饱和碳酸钠水溶液调节反应体系pH值为7，加入20mg尿素，冰浴条件下搅拌30min，之后加入1.5mmolN,N-二甲基苯胺(181.64mg)，冰浴条件下搅拌反应2h；将反应后所得产物体系过滤，过滤得到的固体物料经超纯水进行洗涤(5mL×3)，之后经无水乙醇重结晶，得到暗红色固体，为化合物N1。
所述化合物N1的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.36(s,1H),11.88(s,1H),8.06(d,J＝7.6Hz,1H),7.98(d,J＝8.1Hz,1H),7.53(d,J＝8.9Hz,2H),6.96(dd,J＝7.9,5.4Hz,1H),6.53(d,J＝4.2Hz,2H),2.92(s,6H)。
实施例2
制备化合物N2，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000142
按照实施例1中的方法制备化合物N2，不同之处仅在于将“1.5mmol N,N-二甲基苯胺(181.64mg)”替换为“1.5mmol N,N二乙基苯胺(223.68mg)”，将重结晶试剂“无水乙醇”替换为“乙酸乙酯”，最终所得化合物N2为紫红色固体。
所述化合物N2的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.65(s,1H),9.42(s,1H),8.44(d,J＝7.6Hz,1H),8.36(d,J＝8.1Hz,1H),7.81(dd,J＝8.6,3.9Hz,3H),6.77(d,J＝8.8Hz,2H),3.52(q,J＝7.2Hz,4H),1.25(s,6H)。
实施例3
制备化合物N3，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000151
按照实施例1中的方法制备化合物N3，不同之处仅在于将“1.5mmol N,N-二甲基苯胺(181.64mg)”替换为“1.5mmol N,N-二甲基噻吩-2-胺(190.58mg)”，最终所得化合物N3为玫红色固体。
所述化合物N3的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.30(dd,J＝7.7,1.2Hz,1H),8.04(dd,J＝7.8,1.1Hz,1H),7.94–7.88(m,1H),6.80(d,J＝5.8Hz,1H),5.90(d,J＝5.8Hz,1H),3.13(s,6H)。
实施例4
制备化合物N4，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000152
按照实施例1的方法制备化合物N4，不同之处仅在于将“1.5mmolN,N-二甲基苯胺(181.64mg)”替换为“1.5mmol N,N-二甲基-4-噻吩-2-苯胺(304.62mg)”，最终所得化合物N4为红色固体。
所述化合物N4的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.30(dd,J＝7.7,1.2Hz,1H),8.04(dd,J＝7.8,1.1Hz,1H),7.94–7.88(m,1H),7.00(d,J＝6.2Hz,1H),6.87–6.83(m,2H),6.80–6.75(m,3H),2.89(s,6H)。
实施例5
制备化合物N5，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000153
按照实施例1的方法制备化合物N5，不同之处仅在于将“1.5mmolN,N-二甲基苯胺(181.64mg)”替换为“1.5mmol N,N-二甲基-1,1’-联苯-4-胺(295.68mg)”，最终所得化合物N5为红色固体。
所述化合物N5的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.30(dd,J＝7.7,1.2Hz,1H),8.04(dd,J＝7.8,1.1Hz,1H),7.98–7.94(m,2H),7.91(t,J＝7.8Hz,1H),7.65–7.60(m,2H),7.20–7.14(m,2H),6.60–6.55(m,2H),2.89(s,6H)。
实施例6
制备化合物N6，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000161
按照实施例1的方法制备化合物N6，不同之处仅在于将“1.5mmol鲁米诺(265.74mg)”替换为“1.5mmol异鲁米诺(265.74mg)”，最终所得化合物N6为紫红色固体。
所述化合物N6的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.73(d,J＝2.2Hz,1H),8.30(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),8.08(dd,J＝8.1,0.6Hz,1H),7.88–7.82(m,2H),7.06–6.99(m,2H),2.89(s,6H)。
实施例7
制备化合物N7，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000162
按照实施例2的方法制备化合物N7，不同之处仅在于将“1.5mmol鲁米诺(265.74mg)”替换为“1.5mmol异鲁米诺(265.74mg)”，最终所得化合物N7为紫红色固体。
所述化合物N7的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.73(d,J＝2.2Hz,1H),8.30(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),8.08(dd,J＝8.1,0.6Hz,1H),7.87–7.80(m,2H),6.75–6.68(m,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H)。
实施例8
制备化合物N8，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000163
按照实施例3的方法制备化合物N8，不同之处仅在于将“1.5mmol鲁米诺(265.74mg)”替换为“1.5mmol异鲁米诺(265.74mg)”，最终所得化合物N8为玫红色固体。
所述化合物N8的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.73(d,J＝2.2Hz,1H),8.30(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),8.08(dd,J＝8.1,0.6Hz,1H),6.80(d,J＝5.8Hz,1H),5.90(d,J＝5.8Hz,1H),3.13(s,6H)。
实施例9
制备化合物N9，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000171
按照实施例4的方法制备化合物N9，不同之处仅在于将“1.5mmol鲁米诺(265.74mg)”替换为“1.5mmol异鲁米诺(265.74mg)”，最终所得化合物N9为红色固体。
所述化合物N9的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.73(d,J＝2.2Hz,1H),8.30(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),8.08(dd,J＝8.1,0.6Hz,1H),7.00(d,J＝6.2Hz,1H),6.88–6.82(m,2H),6.79–6.75(m,3H),2.89(s,6H)。
实施例10
制备化合物N10，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000172
按照实施例5的方法制备化合物N10，不同之处仅在于将“1.5mmol鲁米诺(265.74mg)”替换为“1.5mmol异鲁米诺(265.74mg)”，最终所得化合物N10为红色固体。
所述化合物N10的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.73(d,J＝2.2Hz,1H),8.30(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),8.08(dd,J＝8.1,0.6Hz,1H),7.99–7.93(m,2H),7.66–7.60(m,2H),7.17(dd,J＝8.1,1.5Hz,2H),6.62–6.55(m,2H),2.89(s,6H)。
实施例11
制备化合物L1，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000173
称取1mmol鲁米诺(177.16mg)和1mmol对二甲氨基苯甲醛(149.08mg)置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水乙醇和100μL哌啶，85℃加热回流反应12h；所述反应结束后，将所得产物体系冷却至室温后，采用无水乙醇重结晶，得到黄色固体，即为化合物L1。
所述化合物L1的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.78(s,2H),7.53(d,J＝2.1Hz，2H),7.16(d,J＝1.2Hz,2H),7.03(dd,J＝5.2,3.5Hz,1H),6.76–6.72(m,2H),3.01(s,6H)。
实施例12
制备化合物L2，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000181
按照实施例11中的方法制备化合物L2，不同之处仅在于将“1mmol对二甲氨基苯甲醛(149.08mg)”替换为“1mmol对二乙氨基苯甲醛(177.12mg)”，最终所得化合物L2为黄色固体。
所述化合物L2核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.59(s,1H),7.97(dd,J＝8.3,1.2Hz,1H),7.79(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.74–7.68(m,1H),7.19–7.13(m,2H),6.75–6.67(m,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H)。
实施例13
制备化合物L3，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000182
按照实施例11中的方法制备化合物L3，不同之处仅在于将“1mmol对二甲氨基苯甲醛(149mg)”替换为“1mmol 5-二甲氨基噻吩-2-甲醛(155.22mg)”，最终所得化合物L3为橙黄色固体。
所述化合物L3核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.91(s,1H),7.97(dd,J＝8.3,1.2Hz,1H),7.79(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.74–7.68(m,1H),6.91–6.87(m,1H),5.90(d,J＝6.2Hz,1H),3.13(s,6H)。
实施例14
制备化合物L4，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000191
按照实施例11中的方法制备化合物L4，不同之处仅在于将“1mmol鲁米诺(177.16mg)”替换为“1mmol异鲁米诺(177.16mg)”，最终所得化合物L4为黄色固体。
所述化合物L4核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.69(d,J＝0.9Hz,1H),7.96(d,J＝2.2Hz,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.52(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),7.18–7.14(m,2H),6.80–6.76(m,2H),2.89(s,6H)。
实施例15
制备化合物L5，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000192
按照实施例12中的方法制备化合物L5，不同之处仅在于将“1mmol鲁米诺(177.16mg)”替换为“1mmol异鲁米诺(177.16mg)”，最终所得化合物L5为黄色固体。
所述化合物L5核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.69(d,J＝0.9Hz,1H),7.96(d,J＝2.3Hz,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.52(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),7.18–7.13(m,2H),6.73–6.69(m,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H)。
实施例16
制备化合物L6，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000193
按照实施例13中的方法制备化合物L6，不同之处仅在于将“1mmol鲁米诺(177.16mg)”替换为“1mmol异鲁米诺(177.16mg)，最终所得化合物L6为橙黄色固体。
所述化合物L6核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.91(s,1H),7.96(d,J＝2.2Hz,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.52(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),6.91–6.87(m,1H),5.90(d,J＝6.2Hz,1H),3.13(s,6H)。
实施例17
制备化合物L7，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000201
按照实施例11的方法制备化合物L7，不同之处仅在于将“1mmol对二甲氨基苯甲醛(149.08mg)”替换为“1mmol对二甲氨基肉桂醛(175.10mg)”，最终所得化合物L7为橙色固体。
所述化合物L7的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.78(s,1H),9.48(s,1H),8.15(d,J＝3.8Hz,1H),8.03(d,J＝4.2Hz,1H),7.95(d,J＝2.9Hz,1H),7.53(d,J＝3.8Hz,2H),7.23(dd,J＝5.2,3.5Hz,1H),6.89(d,J＝3.6Hz,2H),6.60(d,J＝1.2Hz,2H),3.11(s,6H)。
实施例18
制备化合物L8，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000202
按照实施例12中的方法制备化合物L8，不同之处仅在于将“1mmol对二甲氨基苯甲醛(149.08mg)”替换为“1mmol N,N-二乙氨基肉桂醛(203.13mg)”，最终所得化合物L8为橙黄色固体。
所述化合物L8核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.46(t,J＝4.5Hz,1H),7.97(dd,J＝8.3,1.2Hz,1H),7.79(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.74–7.68(m,1H),7.57–7.53(m,2H),6.75(d,J＝4.5Hz,2H),6.60–6.55(m,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H)。
实施例19
制备化合物L9，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000203
按照实施例17的方法制备化合物L9，不同之处仅在于将“1mmol鲁米诺(177.16mg)”替换为“1mmol异鲁米诺(177.16mg)”，最终所得化合物L4为橙色固体。
所述化合物L9的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.78(s,1H),9.48(s,1H),8.15(d,J＝3.8Hz,1H),8.03(d,J＝4.2Hz,1H),7.95(d,J＝2.9Hz,1H),7.53(d,J＝3.8Hz,2H),7.23(dd,J＝5.2,3.5Hz,1H),6.89(d,J＝3.6Hz,2H),6.60(d,J＝1.2Hz,2H),3.11(s,6H)。
实施例20
制备化合物L10，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000211
按照实施例18的方法制备化合物L10，不同之处仅在于将“1mmol鲁米诺(177.16mg)”替换为“1mmol异鲁米诺(177.16mg)”，最终所得化合物L10为橙色固体。
所述化合物L10的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.46(t,J＝4.5Hz,1H),7.96(d,J＝2.3Hz,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.57–7.50(m,3H),6.75(d,J＝4.5Hz,2H),6.60–6.56(m,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H)。
实施例21
制备化合物C1，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000212
将1.5mmol鲁米诺(265.74mg)与5mL超纯水混合，冰浴(0～5℃)条件下搅拌30min，加入0.3mL浓度为30wt％的浓盐酸，冰浴条件下继续搅拌30min；之后以0.3mL/min滴加速率加入浓度为0.2mol/L的亚硝酸钠溶液(由207mg亚硝酸钠溶于15mL超纯水配制得到)，冰浴条件下搅拌反应1h；之后向所得产物体系中加入1.5mmol对二甲氨基肉桂酸(286mg)、0.15mmol无水氯化铜(20mg)和15mL丙酮，室温条件下搅拌反应36h；利用二氯甲烷萃取反应后所得产物体系，采用无水硫酸钠对有机相进行干燥除水，旋蒸除去溶剂后进行硅胶柱层析纯化，所述纯化采用的试剂为石油醚与乙酸乙酯按照20：1的体积比混合得到，最终所得黄色固体为化合物C1。
所述化合物C1的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.85(s,1H),9.51(s,1H),8.52(d,J＝2.8Hz,1H),8.46(d,J＝3.2Hz,1H),7.85(d,J＝4.9Hz,2H),7.23(d,J＝3.8Hz,2H),6.74(dd,J＝5.2,3.5Hz,1H),6.37(d,J＝1.2Hz,2H),2.91(s,6H)。
实施例22
制备化合物C2，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000221
按照实施例21的方法制备化合物C2，不同之处仅在于将“1.5mmol对二甲氨基肉桂酸(286mg)”替换为“1.5mmolN,N-二乙氨基肉桂酸(329mg)”，最终所得化合物C2为橙色固体。
所述化合物C2的核磁数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),7.91(dt,J＝8.3,1.0Hz,1H),7.83–7.74(m,2H),7.69(dd,J＝7.9,1.2Hz,1H),7.50–7.46(m,2H),6.89(dd,J＝16.0,0.8Hz,1H),6.66–6.60(m,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H).
实施例23
制备化合物C3，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000222
按照实施例21中的方法制备化合物C3，不同之处仅在于将“1.5mmol鲁米诺(265.74mg)”替换为“1.5mmol异鲁米诺(265.74mg)”，所得黄色固体即为化合物C3。
所述化合物C3的核磁数据如下:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.23(d,J＝2.1Hz,1H),7.80–7.72(m,2H),7.41–7.35(m,2H),7.02–6.90(m,2H),6.80–6.74(m,2H),2.89(s,6H)。
实施例24
制备化合物C4，反应式如下：
Figure BDA0003452309270000223
按照实施例22的方法制备化合物C4，不同之处仅在于将“1.5mmol鲁米诺(265.74mg)”替换为“1.5mmol异鲁米诺(265.74mg)”，所得黄色固体即为化合物C4。
所述化合物C4核磁数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.23(d,J＝2.1Hz,1H),7.80–7.71(m,2H),7.50–7.46(m,2H),7.02–6.90(m,2H),6.66–6.60(m,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H)。
实施例25
制备化合物C5，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000231
将5-溴异苯并呋喃-1,3-二酮(3.40g，15mmol)置于三颈烧瓶中，氮气保护后加入5mL冰醋酸，在100℃加热搅拌1h；将所得体系冷却至室温后逐滴加入水合肼(1mL，20mmol)，在100℃加热反应30min；反应结束后，将所得产物体系冷却至室温后过滤，将所得白色固体干燥，将干燥后的固体溶解于质量分数为5％的NaOH溶液(100mL)中，采用冰醋酸酸化至体系中不再继续有白色沉淀产生，之后过滤，依次采用水(20mL)和甲醇(20mL)洗涤过滤所得白色固体，干燥，最终所得白色固体即为6-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮；
称取1mmolN,N-二甲基-4-乙炔基苯胺(145.20mg)、0.5mmol 6-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮(120.52mg)、0.1mmol四三苯基膦钯(116mg)和0.2mmol碘化铜(38.09mg)于50mL圆底烧瓶中，在氮气保护条件下，采用注射器加入2.5mmol三乙胺(505.95mg)和1mL DMF，在55℃、搅拌条件下反应96h；利用二氯甲烷萃取反应后所得产物体系，采用无水硫酸钠对有机相进行干燥除水，旋蒸除去溶剂后进行硅胶柱层析纯化，所述纯化采用的试剂为石油醚与乙酸乙酯按照100：0.1的体积比混合得到，最终所得橙色固体即为化合物C5。
所述化合物C5的核磁数据如下:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.78(s,1H),9.48(s,1H),δ8.29(d,J＝2.1Hz,1H),8.12(d,J＝8.2Hz,1H),7.92(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.36–7.30(m,2H),6.64–6.58(m,2H),2.89(s,6H)。
实施例26
制备化合物C6，反应式如下所示：
Figure BDA0003452309270000241
按照实施例25中的方法制备化合物，不同之处仅在于将“1mmol N,N-二甲基-4-乙炔基苯胺(145.20mg)”替换为“1mmolN,N-二乙基-4-乙炔基苯胺(173mg)”，所得橙红色固体即为化合物C6。
所述化合物C6的核磁数据如下:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90(s,2H),8.29(d,J＝2.3Hz,1H),8.12(d,J＝8.3Hz,1H),7.92(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),7.36–7.31(m,2H),6.64–6.59(m,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H)。
测试例1
为了测试实施例中所得鲁米诺类化合物的光学性质，精密称取适量实施例中制备得到的鲁米诺类化合物作为探针，溶于二甲基亚砜(DMSO)中，得到探针储备液，采用PBS缓冲液(pH值为7.4)稀释至鲁米诺类化合物浓度为1μmol·L-1，得到探针溶液，置于紫外-可见分光光度计中扫描吸收光谱，记录最大吸收波长(λabs)；置于荧光分光光度计中扫描激发和发射光谱，记录最大激发波长(λex)和最大发射波长(λem)。向所述探针溶液中加入过氧化氢(终浓度为100μmol·L-1)和硫酸铜(终浓度为0.5μmol·L-1)，置于酶标仪进行化学发光检测，在300～700nm范围连续扫描化学发光发射波长，绘制波形图像，记录化学发光发射波长(λchemiluminescence)。探针的光学测定结果如表1所示，根据表1中测定结果可知，所述探针具有荧光和化学发光性质，且化学发光发射波长向近红外光区延伸，优于短波长的鲁米诺(425nm)，有利于提高组织穿透能力。
表1实施例中鲁米诺类化合物的光学性质
化合物 <![CDATA[λ<sub>abs</sub>(nm)]]> <![CDATA[λ<sub>ex</sub>(nm)]]> <![CDATA[λ<sub>em</sub>(nm)]]> <![CDATA[λ<sub>chemiluminescence</sub>(nm)]]>
N1 439 445 521 547
N2 468 468 549 567
L1 446 447 520 540
L7 512 521 594 612
C1 422 434 530 548
C5 459 465 554 568
测试例2
为了测试实施例中所得鲁米诺类化合物与不同蛋白混合后的化学发光行为，所述蛋白包括α-突触核蛋白(α-syn)、具有类似β-折叠结构的蛋白(tau蛋白、Aβ1-42蛋白)以及牛血清蛋白(BSA)，精密称取适量实施例中的鲁米诺类化合物作为探针，溶于DMSO中，采用PBS缓冲液稀释至鲁米诺类化合物浓度为1μmol·L-1，得到探针溶液，将所述探针溶液分别与α-syn聚集体、α-syn单体、tau单体、tau聚集体、Aβ1-42单体、Aβ1-42聚集体以及BSA混合，各蛋白的终浓度均为2.75μmol·L-1。然后，在每份含有探针和不同蛋白单体或者聚集体的混合液中，加入过氧化氢(终浓度为100μmol·L-1)和硫酸铜(终浓度为0.5μmol·L-1)，置于酶标仪中记录化学发光强度。以探针加过氧化氢和硫酸铜所得混合液的化学发光强度记为1，计算探针与不同蛋白混合后再加过氧化氢和硫酸铜所得混合液的化学发光强度增强倍数，结果如表2所示，实施例中所得鲁米诺类化合物与α-突触核蛋白混合后均具有化学发光信号，且与探针自身的发光强度比，发光强度增强。
表2实施例中鲁米诺类化合物与蛋白混合的溶液化学发光增强倍数
Figure BDA0003452309270000251
测试例3
为了测试实施例中所得鲁米诺类化合物特异识别和检测脑组织中α-突触核蛋白的能力，以实施例1中化合物N1为例：取正常小鼠脑制备脑匀浆，平均分成若干份，装入EP管中，每个EP管内分别加入终浓度为2.75μmol·L-1的α-syn聚集体、α-syn单体、tau单体、tau聚集体、Aβ1-42单体、Aβ1-42聚集体、牛血清蛋白(BSA)，然后每管内加入化合物N1(终浓度为1μmol·L-1)，混合。在每份含有化合物N1和不同蛋白单体或者聚集体的脑匀浆中，加入过氧化氢(终浓度为100μmol·L-1)和硫酸铜(终浓度为0.5μmol·L-1)，转移至96孔板，置于小动物活体成像仪中以化学发光成像模式成像，获取化学发光强度，结果如图1所示，由图1可知，实施例1中化合物N1加入含有α-突触核蛋白的脑匀浆的化学发光强度显著增强，呈化学发光“开”效应，而其他类似结构蛋白无明显发光强度的变化。
测试例4
为了测试实施例中所得鲁米诺类化合物产生的化学发光信号在不同厚度组织中的穿透深度，以实施例1中化合物N1为例：精密称取适量化合物N1和市售所得的鲁米诺，分别配制成相同浓度的溶液(1μmol·L-1)，加入黑色96孔板后，平行操作如下：溶液中加入过氧化氢(100μmol·L-1)和硫酸铜(0.5μmol·L-1)，将鸡胸肉片(每片厚度约1mm)按照不同片数依次覆盖在孔板上方，黑色96孔板置于小动物活体成像仪中以化学发光成像模式成像，化合物N1和鲁米诺在同一厚度的化学发光信号比较结果如图2所示，由图2可知，实施例1中化合物N1的化学发光信号能够穿透比鲁米诺化学发光信号更深的生物组织厚度，有利于深层组织成像。
测试例5
为了测试实施例中所得鲁米诺类化合物化学发光检测脑内α-突触核蛋白的能力，以实施例1中化合物N1为例：精密称取适量化合物N1，按照1mg/kg经尾静脉注射入模型小鼠(脑定位注射α-突触核蛋白)，注射后立即置于小动物活体成像仪中，以化学发光成像模式实时成像。注射后30min时间点心脏灌流处死小鼠，剖离小鼠各组织器官于小动物活体成像仪中观察，获得模型小鼠尾静脉注射探针后的成像性能，活体成像和离体成像结果如图3所示，化学发光信号的半定量分析结果如图4所示。由图3的成像谱图和图4的化学发光信号分析数据可知，经尾静脉注射入模型小鼠体内后，实施例1中化合物N1能够有效入脑、靶向脑内的α-突触核蛋白并释放化学发光信号，与生理盐水组对比呈显著差异。
测试例6
为了测试催化剂对实施例中所得鲁米诺类化合物化学发光检测血中α-突触核蛋白的作用，以实施例1中化合物N1为例：取装有等量人血清的EP管，加入化合物N1(终浓度为1μmol·L-1)，每管按照“N1、N1+过氧化氢、N1+硫酸铜、N1+硫酸铜+过氧化氢；N1+α-突触核蛋白聚集体、N1+α-突触核蛋白聚集体+过氧化氢、N1+α-突触核蛋白聚集体+硫酸铜、N1+α-突触核蛋白聚集体+硫酸铜+过氧化氢”的分组，依次加入相应试剂和/或蛋白，其中蛋白终浓度为2.75μmol·L-1、过氧化氢终浓度为100μmol·L-1、硫酸铜终浓度为0.5μmol·L-1；置于酶标仪中记录化学发光强度，结果如图6所示，由图6可知，实施例1中化合物N1加入含有α-突触核蛋白血清的化学发光强度显著增强，呈化学发光“开”效应，而其他类似结构蛋白无明显发光强度的变化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鲁米诺类化合物，具有式I所示结构：
Figure FDA0004176159970000011
所述式I中X选自-N＝N-、-CH＝CH-或-C≡C-；
Y选自
Figure FDA0004176159970000012
R选自-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2；
且所述鲁米诺类化合物不为具有式7所示结构的化合物：
Figure FDA0004176159970000013
2.根据权利要求1所述的鲁米诺类化合物，其特征在于，所述鲁米诺类化合物为具有式II、式III、式VI或式VII所示结构的化合物中的任一种：
Figure FDA0004176159970000014
3.根据权利要求1所述的鲁米诺类化合物，其特征在于，所述鲁米诺类化合物为具有以下所示结构的化合物中的任一种：
Figure FDA0004176159970000015
Figure FDA0004176159970000021
4.权利要求1～3任一项所述鲁米诺类化合物的制备方法，
(a)当X为-CH＝CH-时，包括以下步骤：
将鲁米诺或异鲁米诺与水、第一重氮化试剂混合，进行第一重氮化反应，得到第一重氮化反应产物体系；
将所述第一重氮化反应产物体系、化合物a、第一催化剂与第一有机溶剂混合，进行Meerwein芳基化反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物a具有式a所示结构：
Figure FDA0004176159970000022
所述式a中Y选自
Figure FDA0004176159970000023
R选自-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2；
(c)当X为-N＝N-时，包括以下步骤：
将鲁米诺或异鲁米诺与第三有机溶剂、第二重氮化试剂混合，进行第二重氮化反应，得到第二重氮化反应产物体系；
将所述第二重氮化反应产物体系的pH值调节至中性，将所得体系与尿素、化合物c混合，进行偶合反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物c具有式c所示结构：
H-Y-R式c；
所述式c中Y选自
Figure FDA0004176159970000031
R选自-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2；
(d)当X为-C≡C-时，包括以下步骤：
将6-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮或5-溴-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮与化合物d、第四有机溶剂、第二催化剂、第二路易斯碱混合，进行偶联反应，得到具有式I所示结构的鲁米诺类化合物；
所述化合物d具有式d所示结构：
CH≡C-Y-R式d；
所述式d中Y选自
Figure FDA0004176159970000032
R选自-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或-N(CH2CH2CH3)2。
5.权利要求1～3任一项所述鲁米诺类化合物在制备α-突触核蛋白检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述α-突触核蛋白包括α-突触核蛋白单体和/或α-突触核蛋白聚集体。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述α-突触核蛋白检测试剂包括体外诊断试剂或体内造影剂。
8.权利要求1～3任一项所述鲁米诺类化合物在制备α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述α-突触核蛋白均相化学发光检测试剂盒适用的生物样本包括体液或组织。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括有效成分和药学上可接受的辅料，所述有效成分为权利要求1～3任一项所述的鲁米诺类化合物或其药学上可接受的盐。
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