CN101022835A - 用于诊断微转移的与抗体缀合的花青染料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及花青染料与血管发生特异性结合成分，优选与EB－D纤连蛋白特异性结合成分的缀合物用于诊断微转移和小的增生性病变，尤其是与血管发生相关的原发性肿瘤、初癌状态、发育不良、化生、炎性病变，例如银屑病、银屑病关节炎和/或类风湿性关节炎、子宫内膜异位病变和眼病的用途。

Description

用于诊断微转移的与抗体缀合的花青染料
本发明涉及花青染料与血管生成特异性结合成分，优选与EB-D纤连蛋白特异性结合成分的缀合物用于诊断微转移和小的增生性病变，尤其是与血管发生相关的原发性肿瘤、初癌状态、发育不良、化生、炎性病变如银屑病、银屑病关节炎和/或类风湿性关节炎、子宫内膜异位病变和眼病的用途。
发明背景
光在医学诊断中的用途近来已受到重视(参见例如BiomedicalPhotonics Handbook(Editor：T.Vo-Dinh)，CRC Press)。正在实验测试多种诊断方法以在各种医疗学科，例如内镜检查术、乳房X线照相术、外科或妇科中应用。为此目标，将染料供给组织作为用于荧光诊断和成像的外源造影剂，并且这里尤其是最大吸收和最大荧光光谱范围在700-900nm范围内(组织的诊断窗口)的荧光染料已经被用于体内成像。这种波长的光子较少被组织吸收，因此在吸收过程(主要通过氧合血红蛋白和去氧血红蛋白)终结光传输前渗入组织几厘米。此外，被引入所述组织中的荧光染料能够产生吸收，但以更长波长荧光辐射的形式发射所吸收的能量。可以通过光谱分离检测这种荧光辐射，从而可能定位染料并与染料所结合的分子结构相关联(这方面还参见Licha，K.(2002)Contrast Agents for Optical Imaging(Review).In：Topics in Current Chemistry-Contrast Agents II(Editor：W.Krause)，Volume 222，Springer Heidelberg，pp.1-31.)。
来自花青染料类的荧光染料是有希望的代表性种类，并且可以以许多不同的结构范围合成它们。具体而言，具有吲哚碳菁、吲哚二碳菁和吲哚三碳菁骨架的碳菁具有高消光系数和良好的荧光量子产率(Licha，K.(2002)，见上，及其中引用的文献)。
为了获得患病结构和健康组织之间的诊断上的显著差异，所给予的染料必须在所述两种组织类型之间产生尽可能高的浓度差。这可以基于肿瘤生理学或形态学性质(血供、分布动力学、延迟消除、血管结构)以及基于肿瘤和血管细胞或相邻组织的分子性质来实现。对于疾病特异性结构的分子标记而言，可以使用由荧光染料和靶亲合(target-affine)分子如蛋白质、肽或抗体组成的缀合物。在注射后，这些缀合物的某些部分结合到分子靶结构如受体、细胞表面结构或基质蛋白上，而未结合的部分在体液中被稀释或代谢或排泄出体外。以此方式，可能导致更高的浓度差，从而在进行荧光诊断时导致更大的图像对比(高信噪比)。
已经描述许多疾病如肿瘤(Folkman J.(1974).Symp.Soc.Dev.Biol.30：43-52)、关节炎(Colville-Nash PR，Scott DL(1992)Ann.Rheum.Dis.51：919-25)、银屑病(Folkman J.(1972)J.Invest.Dermatol.59：40-43)、眼病(Adamis AP等人(1999)Angiogenesis，3：9-14)与血管发生相关。与血管发生相关的各种疾病综述于例如Longo R等人(2002)Angiogenesis 5：237-56。另一方面，在健康组织中极少发生新血管的形成，其中少数例外包括伤口愈合和子宫内膜组织在月经周期或妊娠过程中的变化。因此，新血管发生成为重要的治疗靶和诊断靶。
已经描述了优先存在或仅存在于生长中的血管细胞内或附近的许多分子结构(其综述参见例如Alessi P等人(2004)Biochim.Biophys.Acta.1654：39-49以及Nanda A和St.Croix B(2004)Curr.Opin.Oncol.16：44-49)，包括内皮细胞上的受体如血管内皮生长因子受体(VEGF-R)和基质蛋白如额外结构域B(ED-B)纤连蛋白。纤连蛋白的ED-B结构域是91个氨基酸的序列，其在小鼠、大鼠和人内相同，其通过可变剪接插入纤连蛋白分子中，已证明其在新血管结构周围特异性地累积(Castellani等人(1994).Int.J.Cancer 59：612-618)。
微转移是＞0.2mm的恶性细胞内聚丛，＜0.2mm的恶性细胞丛被称为亚微转移(Van der Westhuizen N.(2002)Laboratory Report；Rampaul RS等人(2001)Breast Cancer Res.3：113-116；Bitterman A.等人(2002)IMAJ 4：803-809)。目前仅能在体外用显微镜检测的微转移可以是生血管或非生血管的。大多数人肿瘤，包括原发性肿瘤和转移没有生血管活性地发生，并以直径0.2至＜2mm的显微病变在原位存在数月至数年，然后小百分比可能转变为生血管表型(Folkman J和Becker K(2000)Acad.Radiol.7：783-785；Folkman J(2001)Angiogenesis.在Braunwald E等人，Harrison′sTextbook of Internal Medicine，15th Edition，McGraw-Hill，517-530中)。在细胞水平上已确定了人和小鼠肿瘤中生血管转变的至少四种机理：(1)通过刺激邻近宿主血管床中的新血管化，无血管的原位癌可以募集它们自身的血供-人肿瘤中最常见的过程；(2)来自骨髓的循环前体内皮细胞可能进入生血管病灶；(3)肿瘤可能诱导宿主成纤维细胞和/或肿瘤床中的巨噬细胞过度表达生血管因子(例如血管内皮生长因子(VEGF))；和(4)先存在的血管可以被肿瘤细胞同化(coopted)。生血管转变还可能包括这些机理的组合(Folkman J(2001)Angiogenesis.In Braunwald E等人，Harrison′sTextbook of Internal Medicine，15th Edition，McGraw-Hill，517-530)。现已广泛接受，当前生血管分子的作用被抗生血管分子的作用平衡时，“生血管转变”是“关闭的”，而当净平衡偏向于血管发生时，则是“开启的”。已经发现了引发这种转变的多种信号。血管发生激活物为分子结构例如VEGF家族成员、VEGFR、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BB和受体、TGF-β1、endoglin、TGF-β受体、FGF、HGF、MCP-1、整联蛋白(αvβ3、αvβ5、α5β1)、VE-钙粘着蛋白、PECAM(CD31)、Ephrins、纤溶酶原激活物、MMP、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、趋化因子或Id1/Id3。血管发生抑制剂为分子结构例如VEGFR-1、Ang2、TSP-1、TSP-2、血管生长抑素和相关的纤溶酶原kringles、内皮生长抑素(胶原XVII片段)、血管抑素(Vasostatin)、血小板因子4、TIMP、MMP抑制剂、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、促乳素(M，16K)、VEGI、SPARC的片段、骨桥蛋白片段或Maspin(Carmeliet P和Jain RK.(2000)Nature 407：249-257；Yancopoulos GD等人(2000)Nature 407：242-248；Bergers G.和Benjamin LE(2002)Nature Reviews Cancer 3：401-410；Hendrix MJC等人(2002)Nature Reviews Cancer 3：411-421)。
Ntziachristos V等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：2767-2772描述了具有吲哚花青绿增强的纤维腺瘤漫射光X线断层照相术。所分辨的肿瘤是大小超过1cm的原发性肿瘤。
WO 01/23005 A1描述了ED-B特异性抗体和多种染料的缀合物以及它们在描绘肿瘤外周中的用途。没有教导用这些缀合物可以获得的空间分辨率。
McDonald D.M.和Choyke P.L(2003)Nat.Med.9：713-25综述了血管发生成像的进展。他们讨论了核共振成像(MRI)、计算机X线断层照相术(CT)、正电子发射X线断层照相术(PET)、超声检查和光学成像如何提供非侵入性方法以获得动物和人中的血管发生图像。他们教导，这些方法对保存的组织样品提供它们最高的分辨率，而临床方法以低得多的分辨率和特异性提供活组织图像，并且不能分辨微循环血管。结论是，未来的挑战包括开发能够填补这种分辨率缺口并特异性识别生血管血管的新的成像方法。目前没有这种方法。
发明详述
已知现有技术中难以成像微转移和新血管化或正在血管化的结构，即主要包括微血管系统的结构或处于发展微血管系统过程中的结构，本发明的发明人惊讶地发现，使用血管发生特异性结合成分(尤其是ED-B纤连蛋白特异性结合成分)和花青染料的缀合物，通过基于光的诊断可以辨别这些结构。这一观察展现了近红外荧光成像在新的诊断领域中的用途，所述诊断领域需要检测小的患病结构。因此，在第一方面，本发明提供通式(I)的缀合物用于制备诊断微转移和小的增生性病变的诊断剂的用途：
                        B-(D)n
                         (I)
其中
B表示血管发生特异性结合成分，
D表示花青染料，且
n为1-5。
所述血管发生特异性结合成分与如下结构结合，所述结构优先存在或仅存在于微转移中，位于新形成的微血管中或其附近，或者所述结构在微血管系统结构生长之前或生长过程中存在。这些分子结构在例如WO96/01653，Alessi P等人(2004)以及Nanda A和St Croix B.(2004)中得到综述。如上所述，形成微转移的细胞和小的增生性病变的类似细胞表达血管发生因子和抗血管发生因子，只要血管发生抑制剂抵抗血管发生因子的作用，其就导致血管发生的抑制。一旦血管发生因子的作用占优，它们就导致血管发生的开始。因此，参与调节血管发生的两种结构，即血管发生激活物和血管发生抑制剂都可以是本发明意义内的血管发生特异性结合成分。血管发生激活物包括但不限于如下分子结构，例如ED-B纤连蛋白(ED-BF)、endoglin(CD105)(Burrows FJ等人(1995)Clin.Cancer Res.1：1623-1634)、VEGF家族成员、血管内皮生长因子(VEGFR)、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BB和受体、TGF-β1、TGF-β受体、FGF、HGF、MCP-1、整联蛋白(αvβ3、αvβ5、α5β1)、VE-钙粘着蛋白、PECAM(CD31)、Ephrins、纤溶酶原激活物、MMP、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、趋化因子或Id1/Id3。血管发生抑制剂包括但不限于如下分子结构，例如VEGFR-1、Ang2、TSP-1、TSP-2、血管生长抑素和相关的纤溶酶原kringles、内皮生长抑素(胶原XVII片段)、血管抑素、血小板因子4、TIMP、MMP抑制剂、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、促乳素(M，16K)、VEGI、SPARC的片段、骨桥蛋白片段或Maspin(CarmelietP和Jain RK(2000)Nature 407：249-257；Yancopoulos GD等人(2000)Nature407：242-248；Bergers G.和Benjamin LE(2002)Nature Reviews Cancer 3：401-410；Hendrix MJC等人(2002)Nature Reviews Cancer 3：411-421)。在优选的实施方案中，所述血管发生特异性结合成分包括ED-BF、VEGFR或endoglin。其中ED-BF是特别优选的靶结构。ED-BF是纤连蛋白的剪接变体，也称为肿瘤胚胎(oncofoetal)纤连蛋白，其在血管发生过程中，在新长成的微血管结构中特异性地形成。
与这些结构结合的成分优选为肽(具有2-50个氨基酸残基的氨基酸链)、蛋白质(具有多于50个氨基酸残基的氨基酸链)、核酸、小分子或糖。
优选的蛋白质或肽是受体的配体，它们优先在或仅在微转移和/或新近血管化或正在血管化的结构中表达，尤其是血管内皮生长因子(VEGF)和抗体，包括人抗体、人源化抗体和嵌合抗体；包括抗体结合结构域的片段如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Facb；单链抗体如单链Fvs(scFvs)；和二价抗体(diabodies)。
文献中已经描述了多种这样的抗体，包括ED-BF L19和E8(参见VitiF.等人(1999)Cancer Res.59：347-352)、EP 0 344 134 B1中描述的可以从保藏在European Collection of Animal Cell Cultures，Porton Down，Salisbury，UK的编号为88042101的杂交瘤获得的BC-1单克隆抗体或其嵌合变体或人源化变体、WO 97/45544 A1中公开的具有特异性VL和VH序列的针对ED-BF的抗体、WO 99/5857 A2中公开的具有特异性VL和VH序列的针对ED-BF的抗体、WO 01/62800 A1中公开的具有特异性VL和VH序列的针对ED-BF的抗体以及AP38和AP39(Marty C等人(2001)Protein Expr.Purif.21：156-64)。在Ebbinghaus C等人(2004)Curr Pharm Des.10：1537-49中综述了对ED-BF具有特异性的抗体。所有这些抗体或其抗体结合片段都可以用作本发明的优选用途中的血管发生特异性结合成分。特别优选的抗体是L19、E8、AP38和AP39或包含其片段的结合结构域。
VEGF-R的抗体包括贝伐单抗(AvastinTM，由Genentech and Roche开发的rhumAb-VEGF)、抗VEGFR-1抗体mAb 6.12、全人抗VEGFR-2抗体IMC-2C6和IMC-1121、全人抗VEGFR-3 mAb HF4-3C5(均属于ImcloneSystems Inc.)和KM-2550(Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd)，一种抗VEGFR-1抗体(Salgaller ML(2003)Current Opinion in Molecular Therapeutics 5(6)：657-667)。endoglin的抗体包括：SN6h、SN6、SN6a、SN6j、P3D1、P4A4、44G4、GRE、E-9、CLE-4、RMAC8、PN-E2、MAEND3、TEC4、TEC11、A11、8E11。克隆SN6h已经广泛用于通过免疫组织化学研究endoglin在不同肿瘤实体中的表达(Wikstrm P.等人(2002)The Prostate 51：268-275；Li C.等人(2003)Br.J.Cancer 88：1424-1431；Saad R.S.等人(2004)ModemPathol.17：197-203)。已经描述了同一SN6系列的抗体SN6、SN6a和SN6j(She X.等人(2004)Int.J.Cancer 108：251-257)。对于抗体克隆P3D1、P4A4、44G4、GRE、E-9、CLE-4、RMAC8、PN-E2、MAEND3、TEC4、TEC11，已经确定了endoglin的结合表位(Pichuantes S.等人(1997)Tissue antigens 50：265-276)。对于这些抗体和抗体克隆A11中的一些，已经在来源于人的正常组织和肿瘤组织中研究了endoglin的差异表达(Duff S.E.等人(2003)FASEB J.17：984-992)。WO 02/02614公开了其它endoglin特异性抗体，例如scFv C4。在一篇关于针对CD 105的抗体的最近的出版物中，通过免疫组织化学研究了克隆8E11在乳癌患者中对转移危险的预测(Dales J.P.等人(2004)Br.J.Cancer 90：1216-1221)。所有这些抗体或其抗体结合片段都可以用作本发明的优选用途中的血管发生特异性结合成分。
本领域公知核酸可以具有特异性结合性质，因此，所述血管发生特异性结合成分也可以是核酸。优选地，这些核酸包括DNA、RNA、适体和PNA，其中特别优选适体。识别特异性结合适体的方法在本领域中是公知的，并且描述于例如WO 93/24508 A1、WO 94/08050 A1、WO 95/07364 A1、WO 96/27605 A1和WO 96/34875 A1中。本文特别参考这些文件中公开的方法，所述方法可以用于识别可用于本发明的血管发生特异性结合适体。在本发明的用途中所用的优选适体特异性识别ED-BF、endoglin或VEGFR。
随着小分子，即分子量低于1.000g/mol，优选低于500g/mol的非肽非核酸化合物的高通量筛选的出现，已经可能识别具有特定结合性质的小分子。这些小分子同样可以用作根据本发明可用的缀合物的一个成分。优选的小分子为2，2-二苯基乙胺，已经确定它与ED-BF特异性结合(Scheuermann J.(2002)Isolation of binding molecules to the EDB domain offibronectin，a marker of angiogenesis.Dissertation submitted to Swiss FederalInst，of Technology，Zurich)。
在本发明的优选用途中，所述花青染料选自碳菁、二碳菁和三碳菁。可以使用本领域已知的例如以下文献中示例的方法进行根据本发明可用的花青染料的合成：Hamer F.M.The Cyanine Dyes and Related Compounds，John Wiley and Sons，New York 1964；Ernst LA等人(1989)Cytometry 10：3-10；Southwick PL等人(1990)Cytometry 11：418-430；Lansdorp PM等人(1991)Cytometry 12：723-730；Mujumdor RB等人(1993)Bioconjugate Chem.4：105-11；Mujumdor SR等人(1996)Bioconjugate Chem.7：356-62；FlanaganJH等人(1997)Bioconjugate Chem.8：751-56；Keil D等人(1991)Dyes andPigments 17：19-27；Terpetschnig E和Lakowicz JR(1993)Dyes and Pigments21：227-34；Terpetschnig E等人(1994)Anal.Biochem.217：197-204；LindseyJS等人(1989)Tetrahedron 45：4845-66；Górecki T等人(1996)J.Heterocycl.Chem.33，1871-6；Narayanan N和Patonay G(1995)J.Org.Chem.60：2391-5，1995；和Terpetschnig E等人(1993)J.Fluoresc.3：153-155。其它方法描述于专利公开US 4,981,977；US 5,688,966；US 5,808,044；EP 0 591 820 A1；WO 97/42976；WO 97/42978；WO 98/22146；WO 98/26077；和EP 0 800 831中。
此外，合成了具有其它取代基的吲哚三碳菁并将其偶联到生物分子上(描述于例如Becker A等人，Photochem.Photobiol.72，234，2000；Licha K等人，Bioconjugate Chem.12，44，2001；Becker A等人，Nature Biotechnol.19，327，2001；Bugaj JE等人，J.Biomed.Optics 6，122，2001；Achilefu S等人，J.Med.Chem.45，2003，2002)。其它实例可见于尤其是公开WO00/61194(“Short-Chain Peptide Dye Conjugates as Contrast Agents forOptical Diagnostics”)、WO 00/71162、WO 01/52746、WO 01/52743和WO01/62156中。用于制备吲哚三碳菁染料的另一种方法是通过4-取代吡啶的简单方法。通过Zincke反应(Zincke-Knig反应，参见Rmpps ChemieLexikon[Rmpps Chemical Dictionary]，第10版，5067页)，可以以高收率将各种4-取代吡啶转化为间位取代的戊烯二醛-二酰苯胺，它是花青染料的前体。
在本发明特别优选的实施方案中，所述花青染料为通式(II)的化合物和这些化合物的药学可接受的盐和溶剂合物：
Figure A20058003190800171
其中C表示基团(III)或(IV)
Figure A20058003190800181
其中标有星号的位置表示与基团A相连的点，C也可以表示基团(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)
其中
R1和R2彼此独立地表示C1-C4磺烷基链，例如磺甲基、磺乙基、正磺丙基、异磺丙基、磺丁基、异磺丁基、仲磺丁基、叔异丁基；或者饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任选被0-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氧原子和/或被0-3个羰基，例如1、2或3个羰基取代，和/或被0-5个，例如1、2、3、4、5个羟基取代，或者任选被0-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氧原子和/或被0-3个，例如1、2或3个羰基间断，和/或可以被0-5个，例如1、2、3、4或5个羟基取代；
R3表示B或连接于B的连接基，其中所述连接基是具有多达20个碳残基的支链或直链糖链，尤其是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基，其被一个或多个-OH、-COOH、-SO3基团取代，和/或任选被-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CONH、-NHCO-、NHCSNH-、-SO2-、-PO4 --、-芳基-和/或-NH-基团间断一次或多次(优选2、3、4、5或6次)；
R4表示基团-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中
E1和E2彼此独立地表示氢原子、C1-C4磺烷基链，例如磺甲基、磺乙基、正磺丙基、异磺丙基、磺丁基、异磺丁基、仲磺丁基、叔异丁基；饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任选被0-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氧原子和/或被0-3个，例如1、2或3个羰基间断，和/或被0-5个，例如1、2、3、4或5个羟基取代；
R5表示氢原子或氟原子、氯原子、溴原子或碘原子、甲基、乙基、丙基或异丙基；
b表示数字2或3；且
X和Y彼此独立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-。
在更优选的实施方案(i)中，根据本发明可用的花青染料为通式(X)化合物和这些化合物的药学可接受的盐及溶剂合物：
其中C′表示基团(XI)或(XII)
Figure A20058003190800202
其中标有星号的位置表示与基团A′相连的点，C′也可以表示基团(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)或(XVII)
Figure A20058003190800203
其中基团(XV)或(XVII)可以任选被C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基取代，
其中
R1′表示C1-C4磺烷基链，例如磺甲基、磺乙基、正磺丙基、异磺丙基、磺丁基、异磺丁基、仲磺丁基、叔异丁基；饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任选被0-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氧原子和/或被0-3个，例如1、2或3个羰基取代，和/或可以被0-5个，例如1、2、3、4、5个羟基取代，或者任选被0-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氧原子和/或被0-3个，例如1、2或3个羰基间断，和/或可以被0-5个，例如1、2、3、4或5个羟基取代；或M′-R6′；
R2′表示C1-C4磺烷基链，例如磺甲基、磺乙基、异磺丙基、磺丁基、异磺丁基、仲磺丁基、叔异丁基、饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任选被0-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氧原子和/或被0-3个，例如1、2或3个羰基取代，和/或可以被0-5个，例如1、2、3、4、5个羟基取代，或者任选被0-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氧原子和/或被0-3个，例如1、2或3个羰基间断，和/或可以被0-5个，例如1、2、3、4或5个羟基取代；或M′-R7′；
R3′、R4′、R6′和R7′彼此独立地表示基团-COOE1′、-CONE1′E2′、-NHCOE1′、-NHCONHE1′、-NE1′E2′、-OE1′、-OSO3E1′、-SO3E1′、-SO2NHE1′或-E1′，其中
E1′和E2′彼此独立地表示氢原子、C1-C4磺烷基链，例如磺甲基、磺乙基、异磺丙基、磺丁基、异磺丁基、仲磺丁基、叔异丁基、饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任选被0-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氧原子和/或被0-3个，例如1、2、3个羰基间断，和/或被0-5个，例如1、2、3、4、5个羟基取代；
M′表示CH2-CH2或CH2-CH2-CH2；
R5′表示-Q′-CH2-R8′；
Q′表示C1-C5烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-二甲基丙基、新戊基，其中C原子任选被O或S取代；或者表示
Figure A20058003190800221
R8′表示-CO-NH-R9′-R10′、-NH-CS-NH-R9′-R10′或-NH-CO-R9′-R10′，
其中
R9′选自无支链的C2-C13烷基，例如乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基和十三烷基，其中一个或多个，例如1、2、3、4个C原子任选被O或S替代，且
R10′为B或连接于B的偶联基团的残余部分，且
b′表示数字2或3；且
X′和Y′彼此独立地表示O、S、＝C(CH3)2、＝C(C2H5)2、＝C(C3H7)2、＝C(异C3H7)2、＝C(C4H9)2或-(CH＝CH)-。
在根据本发明可用的花青染料的更优选的实施方案(ii)中，R5′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′和Q′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，且
A′表示基团(XVI)或(XVII)，其中基团(XVII)可以任选在对位被C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、仲丁基或叔丁基取代；
C′表示基团(XII)；
R1′表示M-R6′；
R2′表示M-R7′；
R3′、R4′、R6′和R7′彼此独立地表示SO3H或H，条件是R3′、R4′、R6′和R7′中的至少三个为SO3H，且
X′和Y′彼此独立地表示O、S、＝C(CH3)2、＝C(C2H5)2、＝C(C3H7)2、＝C(异C3H7)2或＝C(C4H9)2，
b′为3。
在根据本发明可用的花青染料的更优选的实施方案(iii)中，C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、X′、Y′和b′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义；或者R5′、R8′、R9′、R10′、E1′和E2′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，且C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b′具有如上面关于实施方案(ii)所述的含义，且
A′表示式(XVI)的基团；
M′表示CH2-CH2；且
Q′表示C1-C5烷基，其中C原子任选被O或S取代。
在根据本发明可用的花青染料的更优选的实施方案(iv)中，A′、C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′、X′、Y′和b′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义；R5′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′和M′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，且A′、C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b′具有如上面关于实施方案(ii)所述的含义；C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、X′、Y′和b′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，且A′和M′具有如上面关于实施方案(iii)所述的含义；或者R5′、R8′、R9′、R10′、E1′和E2′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b′具有如上面关于实施方案(ii)所述的含义，且A′和M′具有如上面关于实施方案(iii)所述的含义，且
Q′表示C1-C5烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-二甲基丙基、新戊基。
在根据本发明可用的花青染料的更优选的实施方案(v)中，C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′、X′、Y′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义；且R5′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′和M′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，且C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′和Y′具有如上面关于实施方案(ii)所述的含义，且
A′表示式(XVII)的基团，
b′表示3，且
Q′表示
Figure A20058003190800241
在根据本发明可用的花青染料的更优选的实施方案(vi)中，A′、C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′、Q′、X′、Y′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义；R5′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′和Q′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，且A′、C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b具有如上面关于实施方案(ii)所述的含义；C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R9′、R10′、E1′、E2′、X′、Y′和b′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，A′、M′和Q′具有如上面关于实施方案(iii)所述的含义；或者R5′、R9′、R10′、E1′和E2′具有如上面关于实施方案(i)所述的含义，C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b′具有如上面关于实施方案(ii)所述的含义，且A′、M′、Q′具有如上面关于实施方案(iii)所述的含义，且
R8′表示CO-B或NH-B。
可以用于本发明的特别优选的吲哚三碳菁染料选自下面表1所列式(XVIII)至(XXXVI)的染料，表1显示在偶联至B之前的染料结构，并且包含马来酰亚胺(顺丁烯二酰亚胺)或溴乙酰偶联基团，所述偶联基团促进偶联至含有硫醇基的血管发生特异性结合成分。在所得缀合物中，如果偶联基团是离去基团，则在一些实施方案中各自的偶联基团将不再存在，或者其仅有一部分会保留在所述缀合物中，称为偶联基团的残余部分。本领域技术人员将明白，代替下面描述的马来酰亚胺(顺丁烯二酰亚胺)或溴乙酰偶联基团，其它基团可以在以下结构中取代，包括例如氯乙酰基、碘乙酰基、氯乙酰氨基、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺，以实现与B的偶联反应。
表1
可以用于偶联至血管发生特异性结合成分的优选染料：
Figure A20058003190800251
Figure A20058003190800261
Figure A20058003190800271
Figure A20058003190800281
Figure A20058003190800291
Figure A20058003190800301
通过花青染料中部的R5偶联至B的花青染料显示特别好的量子产率，并且一旦偶联至血管发生特异性结合成分，所述量子产率令人惊讶地很少降低或者甚至不降低。因此，在本发明中，使用实施方案(i)至(vi)的花青染料和结构(XVIII)至(XXXVI)的特定花青染料是特别优选的。
用于偶联各花青染料和各血管发生特异性结合成分的适当方法主要取决于所述血管发生特异性结合成分的化学性质。现有技术中已知多种残基或基团，它们是天然存在的，或者可以被引入各种血管发生特异性结合成分中，所述残基或基团例如-NH2、-COOH、-SH、-OH等。然后这些基团可以与连接于所述花青染料的基团形成共价键，后者对另一基团显示良好的反应性，导致该两种成分的偶联。当然也可能逆转该顺序，即将该可反应的基团连接到所述花青染料上，而将该反应性基团连接到所述血管发生特异性结合成分上。基于这种教导，本领域技术人员能够为每对花青染料和血管发生特异性结合成分选择合适的反应性和可反应基团。
许多蛋白质或肽包含硫醇基如半胱氨酸残基的硫醇基，或者能被修饰以包含硫醇基。因此，如果用于本发明中的缀合物包含肽或蛋白质和花青染料，则优选上述花青染料在偶联至所述蛋白或肽之前包含硫醇基反应性偶联基团。硫醇基反应性官能团在本领域中是公知的，并且包括例如马来酰亚胺(顺丁烯二酰亚胺)、氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基、氯乙酰氨基、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺。因此，在优选的实施方案中，在连接至B之前，上述实施方案中的R3或R10′表示这种偶联基团。如果R3是连接于B的连接基，则所述连接基在偶联之前包含这种偶联基团。
对于在偶联反应过程中不完全被替代的一些偶联基团，例如在所述偶联反应中不是离去基团的偶联基团，所述偶联基团的一部分可能仍然连接于R3、连接于所述连接基或连接于R10′。可以保留在所述花青染料和所述血管发生特异性结合成分的连接中的这部分被称为“偶联基团的残余部分”。
药学可接受的盐可以是任何盐，只要它与上述花青化合物形成无毒的盐。实例包括碱金属盐如钠盐、钾盐；碱土金属盐如镁盐、钙盐等；有机铵盐如三乙铵盐、三丁铵盐、吡啶鎓盐等；氨基酸如赖氨酸、精氨酸的盐等。优选的盐是钠盐。
在优选的实施方案中，小的增生性病变是与血管发生相关的原发性肿瘤；初癌状态；发育不良；化生；由于例如银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎的自身免疫疾病或感染的炎性病变；子宫内膜异位；微病变，优选皮肤微病变和/或眼病。在本发明的优选用途中，将所述缀合物用于体内诊断上述疾病和/或微转移。
本发明的用途可以用于常规诊断，即用于筛查各所述的疾病。但是，在优选的实施方案中，一旦在用例如标准X-射线操作如乳房X线照相术、全身扫描或MRI诊断疾病后，才使用所述缀合物。然后检查患者的其它微转移和/或小的(额外)原发性肿瘤。为了确定最佳治疗选择和/或在一种治疗程序(例如药物、辐射或手术)之前、过程中和/或之后，可以进行这种检查以更好地评价严重程度，例如疾病的阶段。如果在一种治疗程序之前进行，使用本发明的诊断能够确定例如是否已经在原发性肿瘤附近形成了微转移，因而能够确定，以乳腺癌为例，是需要进行乳房肿瘤切除术还是需要进行乳房切除术。在治疗后，使用本发明的诊断能够评价治疗程序的成功性，并确定随后的治疗方案，例如辐射或化疗。当在手术操作中使用时，可能例如检测所述原发性肿瘤周围的组织如淋巴结中的微转移。在该实施方案中，使用本发明能够更完全地在所述操作中除去肿瘤或微转移。
本发明的用途能够检测血管发生初现之前的事件、血管发生初现或血管发生，即已经形成的微血管系统，即使是在其出现在非常小的组织结构中时。在本发明的优选实施方案中，用本发明检测的微转移和/或小的增生性病变，尤其是微转移、初癌状态、发育不良、化生、子宫内膜异位和/或原发性肿瘤的直径小于10mm，优选小于8mm，更优选小于6mm，更优选小于5mm，更优选小于4mm，更优选小于3mm，更优选小于2mm，且最优选小于1mm。根据本发明的用途可检测的微转移和/或小的增生性病变，尤其是微转移、初癌状态、发育不良、化生、炎性病变、子宫内膜异位和/或原发性肿瘤的特别优选的范围为约10mm至约0.1mm，更优选约10mm至约0.2mm，更优选约8mm至约0.1mm，更优选约8mm至约0.2mm，更优选约6mm至约0.1mm，更优选约6mm至约0.2mm，更优选约5mm至约0.1mm，更优选约5mm至约0.2mm，更优选约4mm至约0.1mm，更优选约4mm至约0.2mm，更优选约3mm至约0.1mm，更优选约3mm至约0.2mm，且最优选约2mm至约0.2mm。
优选地，根据本发明的用途检测的微转移为医原性微转移、血源性微转移、空腔微转移、管腔内微转移、淋巴微转移、局部微转移和/或区域微转移。
所诊断的微转移优选源自原发性肿瘤，包括但不限于胃肠道或结肠直肠道的恶性瘤(malignomas)(例如癌、肉瘤)、肝癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、黑素瘤、口腔粘膜发育不良(dysplastic oral mucosa)、侵入性口腔癌(invasive oral cancer)、小细胞和非小细胞肺癌；乳房肿瘤，例如激素依赖性乳癌、非激素依赖性乳癌；过渡型和扁平细胞癌；神经恶性肿瘤，包括成神经细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤；软组织肉瘤；hemangioamas和内分泌肿瘤。根据本发明的用途可检测的小的原发性肿瘤优选为上述肿瘤中的一种。在特别优选的实施方案中，所述小的原发性肿瘤或所述微转移为乳房肿瘤，特别是激素依赖性乳癌或非激素依赖性乳癌。
根据本发明的用途可检测的初癌状态优选选自皮肤的初癌状态，尤其是光化性角化病、皮角、光化性唇炎、焦油角化病、砷角化病、x-射线角化病、鲍恩病、鲍恩样丘疹病、恶性雀斑样痣、硬化性苔藓和lichen rubbermucosae；消化道的初癌状态，尤其是粘膜红斑、白斑、巴雷特食管、普-文综合征、脚溃疡、gastropathia hypertrophica gigantea、边缘癌(borderlinecarcinoma)、肿瘤性肠息肉、直肠息肉、瓷样胆囊；妇科初癌状态，尤其是原位导管癌(CDIS)、宫颈上皮内瘤形成(CIN)、白斑、子宫内膜增生(III级)、外阴营养不良改变、外阴上皮内瘤形成(VIN)、葡萄胎；泌尿道初癌状态，尤其是膀胱乳头状瘤病、凯拉特增殖性红斑、睾丸上皮内瘤形成(TIN)、白斑；原位癌(CIS)；由慢性炎症，尤其是脓皮病、骨髓炎、聚合性痤疮、寻常狼疮和瘘引起的初癌状态。
发育不良通常是癌症的预兆，其主要出现在上皮中；它是非肿瘤细胞生长的最混乱形式，包括单个细胞均匀性的丧失和细胞构造取向(architectural orientation)的丧失。发育不良的细胞通常具有异常巨大的深色染色核，并表现出多形性。当存在慢性刺激或炎症时，发育不良特征性地发生。可以根据本发明诊断的发育不良疾病包括但不限于无汗性外胚层发育不良、前颜面发育异常(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓发育不良、心-手综合征(atriodigital dysplasia)、支气管肺发育不良、大脑发育不良、宫颈结构不良、软骨外胚层发育不良、锁颅发育不全、先天性外胚层发育不良、颅面骨干发育不全、颅腕跖骨发育不全、颅干骺发育不全、牙本质发育不全、骨干发育不全、外胚层发育不良、釉质发育不全、脑眼球发育不全、骺发育不全半肢畸形、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮发育不良、面-指-生殖器发育不良(faciodigitogenital dysplasia)、家族性颌骨纤维性结构不全、家族性白色皱襞性发育不良、肌纤维结构不良、骨纤维性结构不良、红润色骨发育不全、遗传性肾-视网膜发育不良、多汗性外胚层发育不全、少汗性外胚层发育不全、淋巴细胞性(lymphopenic)胸腺发育不全、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良(mandibulofacial dysplasia)、骨骺端发育不全、蒙迪尼发育不良(Mondini dysplasia)、单骨型(monostotic)纤维结构不良、粘液上皮(mucoepithelial)发育不良、多发性骺发育不全、眼耳脊椎发育不良、眼牙指发育不良、眼脊椎发育不良、牙源性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质发育不良、多骨纤维结构不良、pseudoachondroplastic脊椎骺发育不良、视网膜发育不良、眼及透明隔发育不良、脊椎骺发育不良和ventriculoradial发育不良。
化生是受控细胞生长的形式，其中一种类型的成熟细胞或完全分化的细胞取代另一种类型的成熟细胞。根据本发明可检测的化生疾病优选选自特发性骨髓外化生、大汗腺化生(apocrine metaplasia)、非典型化生(atypicalmetaplasia)、自身实质性(autoparenchymatous)化生、结缔组织化生、上皮化生、肠化生、化生性贫血、化生性骨化、化生性息肉、骨髓外化生、原发性骨髓外化生、继发性骨髓外化生、鳞状化生、羊膜鳞状化生、症状性(symptomatic)骨髓外化生和再生性(regenerative)化生。
根据本发明可检测的眼病优选选自沙眼、早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、新生血管性青光眼和年龄相关性黄斑变性。
炎性病变的特征是许多病理过程，包括但不限于免疫细胞，尤其是T细胞和肥大细胞的浸润、细胞因子的释放和细胞增殖。例如，在银屑病中已证明试图逃避被免疫细胞破坏的角质形成细胞开始增殖，该过程伴有新血管发生。不希望受任何理论的约束，本发明的发明人相信，这种新血管发生使得能够使用本发明检测这些小的病变。根据本发明可检测的炎性病变可以是对许多刺激或疾病，包括自身免疫疾病的响应，所述自身免疫疾病通常的特征是炎性病变的形成、感染、机械刺激等。一方面，如果明显的炎症是可检测的，则可以将检测这些小的炎性病变的能力用于更精确地描绘受影响的区域，或者另一方面，可以在其中各疾病的典型症状，例如银屑病的变红和起鳞屑(scaling)或关节炎的关节疼痛和/或四肢变形还不可检测的病期更早地诊断炎性疾病的发展。可以用本发明的用途诊断的小的炎性病变优选为发生在选自以下的疾病或病症中的小的炎性病变：类风湿性关节炎、炎性肠病、感染性休克、骨质疏松症、骨关节炎、神经性疼痛、病毒感染(例如病毒性心肌炎)、细菌感染、胰岛素依赖型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、牙周病、再狭窄、局限性脱发、银屑病、银屑病关节炎、急性胰腺炎、同种异体移植物排斥、变态反应、变应性肺炎、动脉粥样硬化、多发性硬化、恶病质、阿尔茨海默病、中风、克罗恩病、炎性肠病、缺血、充血性心力衰竭、肺纤维化、肝炎、成胶质细胞瘤、吉-巴综合征和系统性红斑狼疮。
子宫内膜异位是妇产科疾病，其定义为子宫内膜组织在子宫腔外的增生。增生的子宫内膜细胞可以散布于整个机体，病期已经在肺和其它器官中发现了子宫内膜病变，就此而言子宫内膜病变的散布类似于微转移的散布。在本发明的用途的优选实施方案中，所检测的子宫内膜病变，例如子宫内膜细胞丛(cell cluster)是血源性细胞丛、空腔细胞丛、管腔内细胞丛、淋巴细胞丛、局部细胞丛和/或区域细胞丛。因为本发明方法的灵敏性，可能检测远远小于现有技术中所检测的子宫内膜病变的子宫内膜病变。用本发明检测的子宫内膜病变的直径小于10mm，优选小于8mm，更优选小于6mm，更优选小于5mm，更优选小于4mm，更优选小于3mm，更优选小于2mm，最优选小于1mm。根据本发明的用途可检测的子宫内膜病变的特别优选的范围为约10mm至约0.2mm，更优选约8mm至约0.2mm，更优选约6mm至约0.2mm，更优选约5mm至约0.2mm，更优选约4mm至约0.2mm，更优选约3mm至约0.2mm，最优选约2mm至约0.2mm。
对所述缀合物的剂量没有特别的限制，只要所述剂量能够检测最终要诊断的位置即可。根据要使用的化合物的种类、年龄、体重和靶器官或组织等对其进行适当调整。通常剂量为0.002-100mg/kg体重，优选0.005-10mg/kg体重，更优选0.01-2mg/kg体重，且最优选0.02-1mg/kg体重。
按照已知方法实施本发明的荧光成像方法，病期可以为每个要给予的缀合物适当地确定每个参数如激发波长和要检测的荧光波长，以获得最佳的成像和分辨率。从给予所述缀合物到通过所述荧光成像方法确定病变的时间消耗取决于所述缀合物和给药靶而变。例如，当将所述缀合物用于肿瘤成像时，流逝时间通常将在给药后约2至120小时的范围内，优选为给药后约2至约10小时。当流逝时间太短时，荧光太强以至于不能清楚地分辨血管发生组织和非血管发生组织(低信噪比)。用于所述荧光成像方法的装置在本领域中是公知的，并且描述于例如EP 0 868 143、EP 1 146 811A1、EP 1 408 824 A2、EP 1 409 995 A1和EP 1 410 330 A2。
如上所述，本发明还可以与手术操作联合使用，因此可以用外科显微镜、显微镜、放大镜等进行荧光的检测。这些装置可以用于多种手术操作中，包括切开操作和内窥镜操作。还可能将本发明与通常用于常规筛查癌症的装置和操作如结肠镜检查术和胃镜检查术联合使用。
附图简述
图1：在给予物质后6h，染料缀合物在隔膜Capan-1微转移中的效力。上图A表示原始图像，而下图B表示反转的图像。白色和黑色的点或区域分别表示微转移。两幅图像都包括指示cm尺寸比例的尺子。
图2：在给予物质后24h，实验性子宫内膜异位病变的体外成像实施例。图A显示原始图像，而图B显示反转的图像。两幅图像都包括指示cm尺寸比例的尺子。
图3：在给予物质6h后，皮肤自发性微小病变的体内成像实施例。图A显示原始图像，而图B显示反转的图像。两幅图像都包括指示cm尺寸比例的尺子。
实施例
实施例1-16：合成具有马来酰亚胺基的吲哚三碳菁染料
实施例1：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XVIII)
Figure A20058003190800371
a)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸，内盐
将10g(0.04mol)2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(Bioconjugate Chem1993，4，105)、6.8g(0.04mol)2-氯乙磺酰氯和4.2g(0.04mol)三乙胺在200ml乙腈中回流6小时。抽滤掉沉淀物并干燥。收率5.0g(理论值的35％)。Anal Biochem 1994，217，197
b)3-吡啶-4-基-丙酸叔丁酯
在0℃下，将在50ml THF中的20g(89mmol)叔丁基-P，P-二甲基磷酰基乙酸酯滴加到3.9g(98mmol)氢化钠(60％，在矿物油中)在250ml THF中的悬浮液中。在0℃下搅拌1小时后，滴加10g(93mmol)吡啶-4-甲醛在50ml四氢呋喃中的溶液，并将反应混合物在0℃下搅拌1小时，在室温下搅拌18小时。通过过滤除去所沉淀的固体，并蒸发浓缩溶液。在加热下将残余物溶于异丙醇中，滤除不溶部分，并将溶液冷却至0℃进行结晶。滤除所产生的固体，与己烷一起搅拌，过滤并干燥。在150ml乙醇中，用0.15g 10％钯/活性炭将中间产物(15.3g)氢化6小时。滤除晶体，蒸发浓缩溶液，并在硅胶(流动溶剂为乙醚)上过滤残余物。获得13.0g浅黄色的油(理论值的71％)。
c)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐
将10g(48mmol)3-吡啶-4-基-丙酸叔丁酯在150ml乙醚中的溶液与8.9g(96mmol)苯胺混合，然后在0℃下与5.4g(48mmol)溴化氰在2ml乙醚中的溶液混合。在0℃下搅拌3小时后，滤除所产生的红色固体，用醚洗涤，并真空干燥。收率：20.3g(理论值的92％)
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-羧基乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将1.0g(2.2mmol)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]-戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐(实施例1c))和1.5g(4.4mmol)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(实施例1a))在20ml乙酸酐和5ml乙酸中的悬浮液与0.75g(9.1mmol)乙酸钠混合，并在120℃下搅拌1小时。冷却后，将它与乙醚混合，滤除所沉淀的固体，并通过色谱法纯化(RP-C18-硅胶，流动溶剂水/甲醇)，将产物冻干(0.5g)。通过将中间产物在4ml二氯甲烷/1ml三氟乙酸中搅拌1小时裂解保护基。在蒸发浓缩和色谱法纯化(RP-C18-硅胶，流动溶剂水/甲醇)后，获得0.45g(理论值的23％)的蓝色冻干物。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将0.4g(0.45mmol)实施例1d)的标题化合物和45mg(0.45mmol)三乙胺溶于10ml二甲基甲酰胺中，在0℃下与0.15g(0.45mmol)TBTU混合，并搅拌10分钟。然后，添加0.17g(0.68mmol)N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐(Int J Pept Protein Res 1992，40，445)和68mg(0.68mmol)三乙胺在0.5ml二甲基甲酰胺中的溶液，并将其在室温下搅拌1小时。在添加10ml乙醚后，离心除去固体，干燥并通过色谱法纯化(RP-C18-硅胶，梯度水/甲醇)。
收率：0.30g蓝色冻干物(理论值的65％)。
元素分析：计算值：C 47.24 H 4.26 N 5.51 S 12.61 Na 6.78
          实测值：C 47.74 H 4.47 N 5.40 S 11.99 Na 7.02
实施例2：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XIX)
Figure A20058003190800391
与实施例1e)类似，从0.4g(0.45mmol)实施例1d)的标题化合物和0.21g(0.68mmol)N-(6-氨基己基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐(Int J Pept ProteinRes 1992，40，445)进行合成。收率：0.38g蓝色冻干物(理论值的81％)。
元素分析：计算值：C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
          实测值：C 48.96 H 4.92 N 5.32 S 11.88 Na 6.56
实施例3：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XX)
Figure A20058003190800401
与实施例1e)类似，从0.4g(0.45mmol)实施例1d)的标题化合物和0.28g(0.68mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐(Int J Pept Protein Res 1992，40，445)进行合成。收率：0.27g蓝色冻干物(理论值的51％)
元素分析：计算值：C 48.97 H 5.05 N 4.76 S 10.89 Na 5.86
          实测值：C 49.22 H 5.16 N 4.62 S 10.67 Na 5.66
实施例4：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXI)
Figure A20058003190800411
a)(3-叔丁氧羰基-丙基)-三苯基-溴化鏻
在-40℃下，将50g(0.30mol)4-溴丁酸在400ml THF中与187g(0.89mol)三氟乙酸酐逐滴混合。在-40℃下搅拌30分钟后，在1小时内滴加400ml叔丁醇/30ml THF。在室温下搅拌16小时后，将反应混合物倾入冰冷的碳酸钠溶液中，用乙醚将水相萃取三次，用硫酸钠干燥有机相，并蒸发浓缩。将残余物在真空中蒸馏(沸点72℃/0.9mbar；收率：41g)。通过将41g(0.18mol)中间产物、44.6g(0.17mol)三苯基膦和32.5g(0.36mol)碳酸氢钠在250ml乙腈中加热回流20小时来进行形成膦盐的反应。将反应混合物过滤，蒸发浓缩，并通过与乙醚一起搅拌使残余物结晶。收率：58.5g(相对于4-溴丁酸为理论值的40％)白色固体。
b)5-吡啶-4-基-戊酸叔丁酯
在-40℃下在无空气的环境中，在20分钟内将14g(28mmol)(3-叔丁氧羰基-丙基)-三苯基-溴化鏻(实施例4a))在100ml无水THF中的溶液与17.5ml(28mmol)丁基锂(1.6M，在己烷中)混合，并在-40℃下搅拌1小时。滴加2.78g(26mmol)4-吡啶甲醛在20ml THF中的溶液，并在室温下搅拌16小时，然后倾入冰水中，用乙醚将水相萃取三次，用硫酸钠干燥有机相，并蒸发浓缩。在色谱法纯化(硅胶，流动溶剂己烷/乙酸乙酯)后，获得的产物是E，Z-混合物(在1H-NMR后为4∶1；5.0g)。为了氢化双键，将中间产物溶于200ml甲醇中，并在氢气中和室温下与100mg PtO2催化剂一起搅拌。在过滤和蒸发浓缩后，获得黄色的油。收率：4.9g(理论值的74％)。
c)3-[4-(叔丁氧羰基)丁基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐
将4.0g(17mmol)5-吡啶-4-基-戊酸叔丁酯在35ml乙醚中的溶液与3.2g(34mmol)苯胺混合，然后在0℃下与1.9g(17mmol)溴化氰在8ml乙醚中的溶液混合。在0℃下搅拌3小时后，滤除所产生的红色固体，用醚洗涤，并真空干燥。收率：7.8g(理论值的95％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-羧基丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
与实施例1d)类似，从实施例4c)的标题化合物(2.5mmol)和1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(5mmol)进行合成。收率：0.85g(理论值的37％)蓝色冻干物。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
与实施例1e)类似，从0.4g(0.43mmol)实施例4d)的标题化合物进行合成。收率：0.31g(理论值的69％)蓝色冻干物。
元素分析：计算值：C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60
          实测值：C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81
实施例5：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXII)
Figure A20058003190800431
与实施例1e)类似，从0.4g(0.43mmol)实施例4d)的标题化合物和0.20g(0.66mmol)N-(6-氨基己基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐进行合成。收率：0.35g蓝色冻干物(理论值的74％)。
元素分析：计算值：C 50.17 H 5.03 N 5.09 S 11.65 Na 6.26
          实测值：C 49.83 H 4.89 N 5.34 S 12.05 Na 6.42
实施例6：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXIII)
Figure A20058003190800432
与实施例1e)类似，从0.4g(0.43mmol)实施例1d)的标题化合物和0.30g(0.72mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐进行合成。收率：0.27g蓝色冻干物(理论值的52％)。
元素分析：计算值：C 49.83 H 5.27 N 4.65 S 10.64 Na 5.72
          实测值：C 49.45 H 5.19 N 4.66 S 10.85 Na 5.80
实施例7：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXIV)
Figure A20058003190800441
a)(3-叔丁氧羰基-戊基)-三苯基-溴化鏻
如实施例4a)中所述进行制备，其中中间产物6-溴己酸叔丁酯以粗产物反应。从50g 6-溴己酸获得79g产物(理论值的69％)，为粘稠无色的油。
b)7-吡啶-4-基-庚酸叔丁酯
如实施例4b)中所述进行制备。从25g(48.7mmol)(3-叔丁氧羰基-戊基)-三苯基-溴化鏻(实施例7a)获得7.5g 7-吡啶-4-基-庚酸叔丁酯(理论值的65％)，为黄色的油。
c)3-[6-(叔丁氧羰基)己基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐
将5.0g(19mmol)7-吡啶-4-基-庚酸叔丁酯在30ml乙醚中的溶液与3.6g(38mmol)苯胺混合，然后在0℃下与2.1g(19mmol)溴化氰在5ml乙醚中的溶液混合。在0℃下搅拌2.5小时后，滤除所产生的红色固体，用醚洗涤，并真空干燥。收率：8.9g(理论值的91％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
与实施例1d)类似，从实施例7c)的标题化合物(3mmol)和1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(6mmol)进行合成。收率：1.5g(理论值的54％)蓝色冻干物。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
与实施例1e)类似，从0.4g(0.43mmol)实施例7d)的标题化合物进行合成。收率：0.31g(理论值的69％)蓝色冻干物。
元素分析：计算值：C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
          实测值：C 48.98 H 4.86 N 5.12 S 11.76 Na 6.77
实施例8：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXV)
Figure A20058003190800451
与实施例1e)类似，从0.5g(0.53mmol)实施例7d)的标题化合物和0.23g(0.75mmol)N-(6-氨基己基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐进行合成。收率：0.42g蓝色冻干物(理论值的70％)。
元素分析：计算值：C 51.05 H 5.27 N 4.96 S 11.36 Na 6.11
          实测值：C 50.74 H 5.55 N 4.76 S 11.38 Na 6.35
实施例9：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXVI)
与实施例1e)类似，从0.5g(0.53mmol)实施例7d)的标题化合物和0.44g(1.06mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐进行合成。收率：0.24g蓝色冻干物(理论值的37％)。
元素分析：计算值：C 50.64 H 5.48 N 4.54 S 10.40 Na 5.59
          实测值：C 50.30 H 5.56 N 4.34 S 10.15 Na 5.73
实施例10：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-3-氧杂-戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXVII)
Figure A20058003190800462
a)3-氧杂-6-(4-吡啶基)己酸叔丁酯
将75g(0.4mol)3-(4-吡啶基)-1-丙醇在400ml甲苯/50ml THF中的溶液与10g四丁基硫酸铵和350ml 32％氢氧化钠溶液混合。然后滴加123g(0.68mol)溴乙酸叔丁酯，并在室温下搅拌18小时。分离有机相，并用乙醚将水相萃取三次。用NaCl溶液洗涤合并的有机相，用硫酸钠干燥，并蒸发浓缩。在色谱法纯化(硅胶∶流动溶剂己烷∶乙酸乙酯)后，获得56g产物(理论值的41％)，为褐色的油。
b)3-[4-氧杂-5-(叔丁氧羰基)戊基]戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐
将5.0g(20mmol)3-氧杂-6-(4-吡啶基)己酸叔丁酯在60ml乙醚中的溶液与3.7g(40mmol)苯胺混合，然后在0℃下与2.2g(20mmol)溴化氰在8ml乙醚中的溶液混合。在0℃下搅拌1小时后，与50ml乙醚混合，并滤除所产生的红色固体，用醚洗涤，并真空干燥。收率：8.5g(理论值的85％)紫色固体。
c)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基-4-氧杂己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将3.0g(6mmol)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]-戊烯二醛-二酰苯胺-氢溴酸盐(实施例10b))和4.2g(12mmol)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(实施例1a))在50ml乙酸酐和10ml乙酸中的悬浮液与2.5g(30mmol)乙酸钠混合，并在120℃下搅拌50分钟。在冷却后，将它与乙醚混合，滤除所沉淀的固体，在丙酮中吸收性地沉淀，并在高真空下干燥。在色谱法纯化(RP-C18-硅胶，流动溶剂水/甲醇)后，在真空中除去甲醇，并冻干，立即获得标题化合物。收率：2.3g(理论值的41％)蓝色冻干物。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-3-氧杂-戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
与实施例1c)类似，从1.0g(1.1mmol)实施例10c)的标题化合物进行合成。收率：0.85g(理论值的73％)蓝色冻干物。
元素分析：计算值：C 47.54 H 4.46 N 5.28 S 12.09 Na 6.50
          实测值：C 47.97 H 4.65 N 5.10 S 12.02 Na 6.68
实施例11：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}-3-氧杂-戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXVIII)
Figure A20058003190800481
与实施例1e)类似，从0.5g(0.55mmol)实施例10c)的标题化合物和0.23g(0.75mmol)N-(6-氨基己基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐进行合成。收率：0.42g蓝色冻干物(理论值的68％)。
元素分析：计算值：C 49.46 H 4.96 N 5.01 S 11.48 Na 6.17
          实测值：C 48.95 H 5.21 N 5.22 S 11.23 Na 6.60
实施例12：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}-4-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXIX)
与实施例1e)类似，从0.5g(0.55mmol)实施例10c)的标题化合物和0.46g(1.06mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐进行合成。收率：0.34g蓝色冻干物(理论值的56％)。
元素分析：计算值：C 49.17 H 5.20 N 4.59 S 10.50 Na 5.65
          实测值：C 49.34 H 5.32 N 4.45 S 10.28 Na 5.56
实施例13：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXX)
Figure A20058003190800492
a)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-氯-环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将5.0g(14.4mmol)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(实施例1a))和2.6g(7.2mmol)N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐(Aldrich Company)与2.5g(30mmol)无水乙酸钠一起在100ml甲醇中回流1小时，冷却，与150ml乙醚混合，并搅拌过夜。抽吸掉沉淀物，干燥，并通过色谱法纯化(硅胶，梯度：二氯甲烷/甲醇)。收率：3.8g(理论值的58％)蓝色固体。
b)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将在30ml二甲基甲酰胺中的0.37g(2.2mmol)3-(4-羟基苯基)丙酸与0.18g(4.5mmol)氢化钠(60％矿物油分散体)混合。在室温下搅拌30分钟后，将它冷却到0℃，滴加2.0g(2.2mmol)实施例12a)的标题化合物在100ml二甲基甲酰胺中的溶液，并在室温下搅拌2小时。用干冰终止混合物的反应，并在真空中除去溶剂。将残余物溶于甲醇中，与200ml醚一起搅拌，并滤除所沉淀的固体。进行色谱法纯化(硅胶，梯度：乙酸乙酯/甲醇)。收率：1.9g蓝色固体(理论值的83％)。
c)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
如实施例1e)所述，在三乙胺存在下，使0.1mg(0.10mmol)实施例12b)的标题化合物与TBTU和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐反应，并通过色谱法纯化所获得的产物。收率：93mg蓝色冻干物(理论值的81％)。
元素分析：计算值：C 51.21 H 4.47 N 4.88 S 11.16 Na 6.00
          实测值：C 51.50 H 4.55 N 4.95 S 10.93 Na 6.15
实施例14：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXXI)
Figure A20058003190800511
与实施例1e)类似，从0.7g(0.68mmol)实施例14a)的标题化合物和0.53g(1.22mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐进行合成。收率：0.56g蓝色冻干物(理论值的68％)。
元素分析：计算值：C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60
          实测值：C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81
实施例15：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧杂十三烷基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXXII)
与实施例1e)类似，从0.7g(0.68mmol)实施例14a)的标题化合物和0.59g(1.36mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基)马来酰亚胺-三氟乙酸盐进行合成。进行两次色谱法纯化。收率：0.67g蓝色冻干物(理论值的75％)。
元素分析：计算值：C 52.29 H 5.16 N 4.28 S 9.79 Na 5.27
          实测值：C 51.88 H 5.40 N 4.34 S 9.53 Na 5.68
实施例16：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]-5-叔丁基-环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXXIII)
a)N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-5-叔丁基-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐
在0℃下，将6.7ml(73.4mmol)磷酰氯滴加到8ml二甲基甲酰胺中。然后滴加5.0g(32.4mmol)4-叔丁基环己酮在30ml二氯甲烷中的溶液，并将反应混合物回流搅拌3小时。在冷却至0℃后，缓慢滴加6g(64.8mmol)苯胺在5.5ml乙醇中的溶液，将混合物倾至200g冰上，并在搅拌下添加5ml浓盐酸。滤除所沉淀的固体，用醚洗涤，并干燥。收率：6.8g(理论值的50％)红色固体。
b)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-氯-5-叔丁基环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
将5.0g(14.4mmol)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(实施例1a))和3.0g(7.2mmol)N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-5-叔丁基-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐(实施例16a))于2.5g(30mmol)无水乙酸钠一起在100ml甲醇中回流1.5小时，冷却，与200ml乙醚混合，并搅拌过夜。抽滤掉沉淀物，干燥并通过色谱法纯化(硅胶，梯度：二氯甲烷/甲醇)。收率：4.7g(理论值的68％)蓝色固体。
c)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]-5-叔丁基环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
如实施例13b)所述，从2.0g(2.1mmol)实施例16b)的标题化合物进行反应。收率：1.5g(理论值的66％)。
d)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]-5-叔丁基-环己-1-烯-3-亚基)亚乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
如实施例13c)所述，从1.0g(0.92mmol)实施例16c)的标题化合物进行反应。通过色谱法用RP C-18硅胶纯化两次(流动溶剂：乙腈/水)。收率：0.24g(理论值的22％)。
元素分析：计算值：C 52.82 H 4.93 N 4.65 S 10.64 Na 5.72
          实测值：C 52.23 H 5.20 N 4.31 S 10.30 Na 6.15
实施例17-19：合成具有溴乙酰胺基团的吲哚三碳菁染料
实施例17：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(溴乙酰氨基)己基]氨基甲酰基}-4-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXXIV)
Figure A20058003190800541
a)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{(6-氨基己基)氨基甲酰基}-4-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
与实施例1e)类似，从0.5g(0.55mmol)实施例10c)的标题化合物和0.15g(0.70mmol)N-boc-己二胺(Fluka)进行合成。通过色谱法纯化反应产物(RP C18-色谱法，梯度：甲醇/水)，并且在冻干后，在冰冷却下将它在2ml三氟乙酸/8ml二氯甲烷中搅拌15分钟。在真空中旋转后，将残余物溶于甲醇，用乙醚沉淀，并分离。收率：0.26g蓝色固体(理论值的41％)。
b)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(溴乙酰氨基)己基]氨基甲酰基}-4-氧杂戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐
在5ml二甲基甲酰胺中，将0.26g(0.23mmol)实施例18a)的标题化合物冷却到-20℃，与28mg(0.28mmol)三乙胺和0.10g(0.46mmol)溴乙酰溴在0.2ml二甲基甲酰胺中的溶液混合。在最高0℃下搅拌5小时后，通过添加乙醚沉淀产物，并通过重复从二甲基甲酰胺/乙醚中再沉淀和随后的干燥获得产物。收率：0.23g(理论值的86％)蓝色固体。
元素分析：计算值：C 45.63 H 4.87 N 4.84 S 11.07 Na 5.96
          实测值：C 45.13 H 4.66 N 4.67 S 10.83 Na未测定
实施例18：3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(3-{[3-(溴乙酰氨基)丙基]氨基甲酰基}-乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXXV)
Figure A20058003190800551
与实施例17类似，从实施例1d)的标题化合物(0.5g；0.56mmol)和N-boc-丙二胺进行合成。所有阶段的收率：0.22g(理论值的37％)。
元素分析：计算值：C 43.70 H 4.33 N 5.23 S 11.96 Na 6.43
          实测值：C 43.21 H 4.14 N 5.53 S 10.89 Na未测定
实施例19：3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亚乙烯基}-2-[4-(2-{[3-(溴乙酰氨基)丙基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]环己-1-烯-3-亚基)亚乙基-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(式XXXVI)
Figure A20058003190800552
与实施例17类似，从实施例13b)的标题化合物(0.5g；0.49mmol)和N-boc-丙二胺进行合成。所有阶段的收率：0.31g(理论值的53％)。
元素分析：计算值：C 47.88 H 4.52 N 4.65 S 10.65 Na 5.73
          实测值：C 48.04 H 4.43 N 4.69 S 10.72 Na 5.84
实施例20-23：合成与生物分子的缀合物及所述缀合物的光物理特性
实施例20：用实施例1-16的标题化合物标记BSA(牛血清白蛋白)
一般规程：在每种情况下，将5mg(0.074μmol)BSA(Sigma Company)在5ml磷酸盐缓冲液(0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4，pH6.8)中的溶液与0.74μmol实施例1-16的标题化合物(0.5mg/ml在PBS中的贮备液)混合，并在25℃下温育30分钟。通过凝胶色谱法纯化缀合物(柱：Sephadex G50，直径1.5cm，Pharmacia，洗脱剂：PBS)。
实施例21：用实施例17-19的标题化合物标记BSA
一般规程：在每种情况下，将5mg(0.074μmol)BSA(Sigma Company)在5ml磷酸盐缓冲液(0.1M硼酸盐缓冲液，pH8.5)中的溶液与1.10μmol实施例17-19的标题化合物(0.5mg/ml在PBS中的贮备液)混合，并在25℃下温育5小时。通过凝胶色谱法纯化缀合物(柱：Sephadex G50，直径1.5cm，Pharmacia，洗脱剂：PBS)。
实施例22：用实施例1-16的标题化合物标记抗ED-B-纤连蛋白scFv抗体AP39(单链片段)
AP39是具有C-末端半胱氨酸的scFv，并以摩尔质量为约56000g/mol的共价S-S二聚体存在(Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2002 Mar；5(2)：204-13)。通过还原二硫桥，产生具有可接近的SH基团的两个单体(摩尔质量28000g/mol)。
一般规程：将AP39在PBS中的0.3ml溶液(浓度：0.93mg二聚体/ml)与60μl三(羧乙基)膦(TCEP)在PBS中的溶液(2.8mg/ml)混合，并在25℃和氮气下温育1小时。通过在NAP-5柱上进行凝胶过滤来分离过量的TCET(洗脱剂：PBS)。通过光度法测定所获得的AP39单体(OD280nm＝1.4)量为230-250μg(体积0.5-0.6ml)。将溶液与0.03μmol实施例1-16的标题化合物(0.5mg/ml在PBS中的贮备液)混合，并在25℃下温育30分钟。通过在NAP-5柱上进行凝胶色谱法来纯化缀合物(洗脱剂：PBS/10％甘油)。通过亲和色谱法(ED-B-纤连蛋白树脂)测定缀合物溶液的免疫活性(J.Immunol.Meth.1999，231，239)。所得缀合物的免疫活性＞80％(在缀合前AP39的免疫活性＞95％)。
实施例23：用实施例17-19的标题化合物标记抗ED-B-纤连蛋白scFv抗体AP39(单链片段)
一般规程：将0.3ml AP39在PBS中的溶液(浓度：0.93mg二聚体/ml)与60μl三(羧乙基)膦(TCEP)在PBS中的溶液(2.8mg/ml)混合，并在25℃和氮气下温育1小时。通过在NAP-5柱上进行凝胶过滤来分离过量的TCET(洗脱剂：50mmol硼酸盐缓冲液，pH8.5)。通过光度法测定所获得的AP39单体(OD280nm＝1.4)量为230-250μg(体积0.5-0.6ml)。将溶液与0.06μmol实施例17-19的标题化合物(0.5mg/ml在PBS中的贮备液)混合，并在25℃下温育4小时。通过在NAP-5柱上进行凝胶色谱法纯化缀合物(洗脱剂：PBS/10％甘油)。通过亲和色谱法(ED-B-纤连蛋白树脂)测定缀合物溶液的免疫活性(J.Immunol.Meth.1999，231，239)。所得缀合物的免疫活性＞75％(在缀合前AP39的免疫活性＞95％)。
实施例24：不同染料结构和AP39的靶特异性缀合物的光物理性质和免疫活性(ELISA)
通过光度法并基于短波吸收肩峰(约690-710nm)消光系数为75000 Lmol-1cm-1确定生物分子负载程度(染料对生物分子摩尔比)；用抗体吸收(抗CD105 IgG)为OD280nm＝1.4进行计算。用SPEX fluorolog(校正灯和检测器的波长依赖性灵敏度)相对于吲哚花青绿确定荧光量子产率(在DMSO中Q＝0.13，J Chem.Eng.Data 1977，22，379，Bioconjugate Chem.2001，12，44)。
通过ELISA测量免疫活性，并描述与靶(ED-B-纤连蛋白)结合的生物分子相对于在与实施例1-19的样品染料缀合前未标记生物分子AP39的百分比。结果总结于下面表2中。
表2
物质(生物分子/样品化合物) 染料对生物分子比  最大吸收(nm)  最大荧光(nm)  荧光子量收率 免疫活性(ELISA)％
AP39与实施例1的标题化合物的缀合物 1.1  768  794  0.14 ＞75
AP39与实施例2的标题化合物的缀合物 1.0  767  793  0.12 ＞80
AP39与实施例4的标题化合物的缀合物 0.8  767  792  0.12 ＞80
AP39与实施例5的标题化合物的缀合物 0.9  768  794  0.14 ＞80
AP39与实施例6的标题化合物的缀合物 1.1  769  792  0.10 ＞80
AP39与实施例7的标题化合物的缀合物 1.0  769  792  n.d. ＞85
AP39与实施例10的标题化合物的缀合物 1.1  767  790  0.13 ＞85
AP39与实施例11的标题化合物的缀合物 1.1  767  789  0.15 ＞90
AP39与实施例12的标题化合物的缀合物 0.9  766  790  0.11 ＞75
AP39与实施例13的标题化合物的缀合物 1.2  771  795  0.10 ＞80
AP39与实施例14的标题化合物的缀合物 1.1  772  796  0.09 ＞85
AP39与实施例17的标题化合物的缀 0.7  767  790  0.18 ＞90
合物
AP39与实施例19的标题化合物的缀合物 0.8  773  794  0.13 ＞85
实施例25：用染料标记抗CD105抗体(抗Endoglin IgG)和光物理性质的确定
本实施例描述针对靶CD105(endoglin)的不同生物分子类型(全长IgG抗体)。
染料合成：用于缀合至抗体的染料是3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基-4-氧杂己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(实施例10c)。通过在室温下，在二甲基甲酰胺中，使该染料与5当量N-羟基琥珀酰亚胺、4当量N，N′-二环己基碳二亚胺反应5h而将其转化为相应的N-羟基琥珀酰亚胺酯。在用乙醚沉淀后，将粗产物直接用于与抗CD105抗体缀合。
标记反应：用0.17μmol上述N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.2mg/mL在蒸馏水中的贮备液)处理1ml抗体抗CD105 IgG在磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中的溶液(浓度为1mg/mL)，并在25℃想温育5小时。通过凝胶色谱法进行纯化(NAP10即用型脱盐柱，洗脱剂：PBS)，得到10μmol/ml染料浓度/1.4μmol/ml抗体浓度的溶液。
如上所述测量理化性质，并示于下面表3中。
表3
物质(生物分子/样品化合物) 染料对生物分子比  最大吸收(nm)  最大荧光(nm)   荧光量子产率  免疫活性(ELISA)％
来自抗CD105 IgG和实施例10c中化合物的N-羟基琥珀酰亚胺酯的缀合物 7.1  769  795   0.08  n.d.
实施例26：带有Capan-1肿瘤的裸鼠中的微转移成像
将在培养物中亚铺满(subconfluently)生长的Capan-1肿瘤细胞胰蛋白酶化，离心并再悬浮于PBS中。在用锥虫蓝染色并计算细胞浓度后，将细胞悬浮液的浓度设置为3×107ml。将所述细胞悬浮液在冰上冷却直到使用。麻醉三只雌性裸鼠(NMRI裸鼠，体重24-25g)，在腹部切口后，将30μl(1×106细胞/动物)细胞悬浮液囊下接种到每只动物的胰腺中。每只动物接受0.05μmol/kg体重(1.3mg/kg体重)的包括实施例10，即结构如式XXVII所示的花青染料的物质，其已经按照实施例22的方法被缀合到EB-DF抗体AP39上。在可触知清楚的肿瘤生长的时间点(在肿瘤细胞植入后约12至14周)静脉内给予该物质。在给予物质后6小时处死动物，并用强化CCD相机在体外拍摄包含微转移的肠系膜的荧光信号。通过用波长为740nm的近红外光照射肠系膜来激发所述物质的荧光，用激光二极管(0.5W输出)产生所述近红外光。数字化地贮存荧光图像。然后，用低倍率显微镜(Stemi2000-C，Fa.Carl Zeis)评价微转移的大小。从0.5至2.0mm直径范围的微转移和从更大的肠系膜转移接收荧光信号，并使其与显微评价相对应。基于实施例在图1中显示了染料缀合物的效力。
实施例27：裸鼠中小的子宫内膜异位病变的体外成像
通过手术在4只NMRI裸鼠中诱导子宫内膜异位。用腹膜内注射赛拉嗪/氯胺酮(体积比2∶10，1ml/kg体重)将所述小鼠麻醉。通过2cm中线切口打开腹部，并将两个人子宫内膜异位组织样品(样品大小约1mm3)固定到腹腔每侧上的腹膜上。在诱导子宫内膜异位后9天，在所有小鼠中进行成像。为了成像，2只小鼠静脉内接受0.05μmol/kg体重(1.3mg/kg b.w.)的实施例20的缀合物(AP39+结构如式XXVII所示的实施例10的标题化合物)。其它两只小鼠接受从BSA和3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3-H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基-4-氧杂己基)庚-2，4，6-三烯-1-亚基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸三钠，内盐(实施例10c)合成的对照缀合物。在给予物质后24小时处死所有动物，并用强化CCD相机体外拍摄包含子宫内膜异位病变的腹膜荧光信号。通过用波长为740nm的近红外光照射包含子宫内膜异位病变的肠系膜来激发所述物质的荧光，用激光二极管(0.5W输出)产生所述近红外光。数字化地贮存荧光图像。在用实施例20的缀合物(AP39+结构如式XXVII所示的实施例10的标题化合物)处理的两只小鼠的子宫内膜异位病变中都观察到了清楚的荧光信号增强，而在用对照物质处理的小鼠中并未观察到。包含病变的荧光的大小小于2mm。基于代表性实施例在图2中显示了染料缀合物的效力。
实施例28：裸鼠中皮肤的自发性微小病变的体内成像
在两只NMRI裸鼠中观察多个自发性微小皮肤病变。每只小鼠静脉内接受0.05μmol/kg体重(1.3mg/kg b.w.)的实施例20的缀合物(AP39+结构如式XXVII所示的实施例10的标题化合物)。在给予物质后6小时，在麻醉的小鼠中进行成像。用吸入麻醉剂异氟烷(Isofluran Curamed，CuramedPharma GmbH，Karlsruhe，Germany)诱导短时间麻醉。通过二极管激光器激发所述物质的荧光(激发波长742nm)，并用强化CCD相机检测荧光。数字化地保存荧光图像。然后，用低倍率显微镜(Stemi 2000-C，Fa.Carl Zeis)评价微小病变的大小。从小至小于＜1mm的微小病变接收到了荧光信号。基于代表性实施例在图3中显示了所述染料缀合物的效力。
不需要进一步的说明，相信本领域技术人员使用前面的描述能够最大范围地利用本发明。因此，下列的优选具体实施方案将理解为仅仅是说明性的，并非以任何方式限制本发明的剩余部分。
除非另有说明，在前面的实施例中，所有的温度都是未校正的摄氏度，并且所有份和百分比都是按重量计。
本文引用的所有申请、专利和公开的全部内容都被引入本文作为参考。
通过取代本发明前面实施例中常规或具体描述的反应物和/或操作条件，可以同样成功地重复前面的实施例。
从前面的描述中，本领域技术人员能够容易地确定本发明的基本特征，在不背离本发明精神和范围的情况下，他们能够对本发明做出各种改变和修改以将本发明用于各种用途和情况。

Claims (29)

1.通式(I)的缀合物用于制备诊断微转移或小的增生性病变的诊断剂的用途：
                         B-(D)n
                           (I)
其中
B表示血管发生特异性结合成分，
D表示花青染料，且
n为1-5。
2.权利要求1的用途，其中所述血管发生特异性结合成分针对纤连蛋白的ED-B结构域(ED-BF)、endoglin、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、VEGF家族成员、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BB和受体、TGF-β1、endoglin、TGF-β受体、FGF、HGF、MCP-1、整联蛋白(αvβ3、αvβ5、αvβ1)、VE-钙粘着蛋白、PECAM(CD31)、Ephrins、纤溶酶原激活物、MMP、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、趋化因子、Id1/Id3、VEGFR-1、Ang2、TSP-1、TSP-2、血管生长抑素和相关的纤溶酶原kringles、内皮生长抑素(胶原XVII片段)、血管抑素、血小板因子4、TIMP、MMP抑制剂、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、促乳素(M，16K)、VEGI、SPARC的片段、骨桥蛋白片段或Maspin。
3.权利要求1或2的用途，其中所述血管发生特异性结合成分选自肽、蛋白质、核酸、小分子和糖。
4.权利要求1-3之一的用途，其中所述蛋白质选自抗体、抗体片段和单链抗体。
5.权利要求1-4之一的用途，其中所述抗体选自L19、E8、AP38和AP39。
6.权利要求1-5之一的用途，其中所述核酸选自DNA、RNA、适体和PNA。
7.权利要求1-6之一的用途，其中所述小分子是2，2-二苯基乙胺。
8.权利要求1-7之一的用途，其中所述花青染料选自碳菁、二碳菁和三碳菁。
9.权利要求1-6之一的用途，其中所述花青染料是具有通式(II)的化合物和这些化合物的盐和溶剂合物：
Figure A2005800319080003C1
其中C表示基团(III)或(IV)
Figure A2005800319080003C2
其中标有星号的位置表示与基团A相连的点，C也可以表示基团(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)
Figure A2005800319080003C3
其中
R1和R2彼此独立地表示C1-C4磺烷基链或饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，其任选被0-15个氧原子和/或被0-3个羰基取代，和/或被0-5个羟基取代，或者任选被0-15个氧原子和/或被0-3个羰基间断，和/或可以被0-5个羟基取代；
R3表示B或连接于B的连接基，其中所述连接基是具有多达20个碳残基的支链或直链糖链，其被一个或多个-OH、-COOH、-SO3基团取代，和/或任选被-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CONH、-NHCO-、NHCSNH-、-SO2-、-PO4 --、-芳基-和/或-NH-基团间断一次或多次；
R4表示基团-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中
E1和E2彼此独立地表示氢原子、C1-C4磺烷基链、饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，其任选被0-15个氧原子和/或被0-3个羰基羰基间断，和/或被0-5个羟基取代；
R5表示氢原子或氟原子、氯原子、溴原子或碘原子、甲基、乙基、丙基或异丙基；
b表示数字2或3；且
X和Y彼此独立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-。
10.权利要求1-8之一的用途，其中所述花青染料是具有通式(X)的化合物和这些化合物的盐及溶剂合物：
Figure A2005800319080004C1
其中C′表示基团(XI)或(XII)
Figure A2005800319080004C2
其中标有星号的位置表示与基团A′相连的点，并且C′也可以表示基团(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)或(XVII)
Figure A2005800319080005C1
其中基团(XV)或(XVII)可以任选被C1-C4烷基取代，
其中
R1′表示C1-C4磺烷基链；饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，其任选被0-15个氧原子和/或被0-3个羰基取代，和/或可以被0-5个羟基取代，或者任选被0-15个氧原子和/或被0-3个羰基间断，和/或可以被0-5个羟基取代；或M′-R6′；
R2′表示C1-C4磺烷基链；饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，其任选被0-15个氧原子和/或被0-3个羰基取代，和/或可以被0-5个羟基取代，或者任选被0-15个氧原子和/或被0-3个羰基间断，和/或可以被0-5个羟基取代；或M′-R7′；
R3′、R4′、R6′和R7′彼此独立地表示基团-COOE1′、-CONE1′E2′、-NHCOE1′、-NHCONHE1′、-NE1′E2′、-OE1′、-OSO3E1′、-SO3E1′、-SO2NHE1′或-E1′，其中
E1′和E2′彼此独立地表示氢原子、C1-C4磺烷基链、饱和或不饱和、支链或直链C1-C50烷基链，其任选被0-15个氧原子和/或被0-3个羰基间断，和/或被0-5个羟基取代；
M′表示CH2-CH2或CH2-CH2-CH2；
R5′表示-Q′-CH2-R8′；
Q′表示C1-C5烷基，其中C原子任选被O或S取代，或者表示
Figure A2005800319080006C1
R8′表示-CO-NH-R9′-R10′、-NH-CS-NH-R9′-R10′或-NH-CO-R9′-R10′，
其中
R9′选自无支链的C2-C13烷基，其中C原子任选被O或S替代，且
R10′为B或连接于B的偶联基团的残余部分，且
b′表示数字2或3；且
X′和Y′彼此独立地表示O、S、＝C(CH3)2、＝C(C2H5)2、＝C(C3H7)2、＝C(异C3H7)2、＝C(C4H9)2或-(CH＝CH)-。
11.权利要求10的用途，其中
A′表示基团(XVI)或(XVII)，其中基团(XVII)可以任选在对位被C1-C4烷基取代；
C′表示基团(XII)；
R1′表示M-R6′；
R2′表示M-R7′；
R3′、R4′、R6′和R7′彼此独立地表示SO3H或H，条件是R3′、R4′、R6′和R7′中的至少三个为SO3H，且
X′和Y′彼此独立地表示O、S、＝C(CH3)2、＝C(C2H5)2、＝C(C3H7)2、＝C(异C3H7)2或＝C(C4H9)2，
b′为3。
12.权利要求10或11的用途，其中
A′表示式(XVI)的基团；
M′表示CH2-CH2；且
Q′表示C1-C5烷基，其中C原子任选被O或S取代。
13.权利要求10-12之一的用途，其中
Q′表示C1-C5烷基。
14.权利要求10或11的用途，其中
A′表示式(XVII)的基团，
b′表示3，且
Q′表示
Figure A2005800319080007C1
15.权利要求10-14之一的用途，其中
R8′表示CO-B或NH-B。
16.权利要求1-15之一的用途，其中所述小的增生性病变选自小的原发性肿瘤、初癌状态、发育不良、化生、炎性病变、子宫内膜异位和/或眼病。
17.权利要求1-16之一的用途，用于体外诊断。
18.权利要求1-17之一的用途，其中在治疗程序之前、过程中和/或之后诊断所述微转移和/或所述小的增生性病变。
19.权利要求1-18之一的用途，其中所述微转移和/或所述小的增生性病变的直径小于10mm，优选小于8mm。
20.权利要求1-18之一的用途，其中所述微转移和/或所述小的增生性病变的直径小于6mm，优选小于5mm。
21.权利要求1-18之一的用途，其中所述微转移和/或所述小的增生性病变的直径小于4mm，优选小于3mm。
22.权利要求1-18之一的用途，其中所述微转移和/或所述小的增生性病变的直径为2.0-0.2mm。
23.权利要求1-22之一的用途，其中所述微转移为医原性微转移、血源性微转移、空腔微转移、管腔内微转移、淋巴转移、局部微转移和/或区域微转移。
24.权利要求1-22之一的用途，其中所述初癌状态选自皮肤的初癌状态，尤其是光化性角化病、皮角、光化性唇炎、焦油角化病、砷角化病、x-射线角化病、鲍恩病、鲍恩样丘疹病、恶性雀斑样痣、硬化性苔藓和lichenrubber mucosae；消化道的初癌状态，尤其是粘膜红斑、白斑、巴雷特食管、普-文综合征、脚溃疡、gastropathia hypertrophica gigantea、边缘癌、肿瘤性肠息肉、直肠息肉、瓷样胆囊；妇科初癌状态，尤其是原位导管癌(CDIS)、宫颈上皮内瘤形成(CIN)、白斑、子宫内膜增生(III级)、外阴营养不良改变、外阴上皮内瘤形成(VIN)、葡萄胎；泌尿道初癌状态，尤其是膀胱乳头状瘤病、凯拉特增殖性红斑、睾丸上皮内瘤形成(TIN)、白斑；原位癌(CIS)；由慢性炎症，尤其是脓皮病、骨髓炎、聚合性痤疮、寻常狼疮和瘘引起的初癌状态。
25.权利要求1-22之一的用途，其中所述化生选自特发性骨髓外化生、大汗腺化生、非典型化生、自身实质性化生、结缔组织化生、上皮化生、肠化生、化生性贫血、化生性骨化、化生性息肉、骨髓外化生、原发性骨髓外化生、继发性骨髓外化生、鳞状化生、羊膜鳞状化生、症状性骨髓外化生和再生性化生。
26.权利要求1-22之一的用途，其中所述发育不良选自无汗性外胚层发育不良、前颜面发育异常、窒息性胸廓发育不良、心-手综合征、支气管肺发育不良、大脑发育不良、宫颈结构不良、软骨外胚层发育不良、锁颅发育不全、先天性外胚层发育不良、颅面骨干发育不全、颅腕跖骨发育不全、颅干骺发育不全、牙本质发育不全、骨干发育不全、外胚层发育不良、釉质发育不全、脑眼球发育不全、骺发育不全半肢畸形、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮发育不良、面-指-生殖器发育不良、家族性颌骨纤维性结构不全、家族性白色皱襞性发育不良、肌纤维结构不良、骨纤维性结构不良、红润色骨发育不全、遗传性肾-视网膜发育不良、多汗性外胚层发育不全、少汗性外胚层发育不全、淋巴细胞性胸腺发育不全、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、骨骺端发育不全、蒙迪尼发育不良、单骨型纤维结构不良、粘液上皮发育不良、多发性骺发育不全、眼耳脊椎发育不良、眼牙指发育不良、眼脊椎发育不良、牙源性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质发育不良、多骨纤维结构不良、pseudoachondroplastic脊椎骺发育不良、视网膜发育不良、眼及透明隔发育不良、脊椎骺发育不良和ventriculoradial发育不良。
27.权利要求1-22之一的用途，其中所述炎性病变由选自以下的疾病或病症引起：类风湿性关节炎、炎性肠病、感染性休克、骨质疏松症、骨关节炎、神经性疼痛、病毒感染、细菌感染、胰岛素依赖型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、牙周病、再狭窄、局限性脱发、银屑病、银屑病关节炎、急性胰腺炎、同种异体移植物排斥、变态反应、变应性肺炎、动脉粥样硬化、多发性硬化、恶病质、阿尔茨海默病、中风、克罗恩病、炎性肠病、缺血、充血性心力衰竭、肺纤维化、肝炎、吉-巴综合征和系统性红斑狼疮。
28.权利要求1-22之一的用途，其中所述子宫内膜异位包括血源性细胞丛、空腔细胞丛、管腔内细胞丛、淋巴细胞丛、局部细胞丛和/或区域细胞丛。
29.权利要求1-22之一的用途，其中所述眼病选自沙眼、早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、新生血管性青光眼和年龄相关性黄斑变性。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101518528B (zh) * 2008-02-29 2014-02-26 史春梦 一组碳花青染料类的近红外荧光化合物的用途
CN101946171B (zh) * 2007-12-14 2014-03-12 拜奥蒂乌姆股份有限公司 荧光化合物
CN108410202A (zh) * 2018-02-12 2018-08-17 成都驷博生物科技有限公司 一种喹啉七甲川菁染料的制备方法
CN110201189A (zh) * 2019-06-03 2019-09-06 沈阳药科大学 白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1679082A1 (en) * 2005-01-07 2006-07-12 Schering AG Use of cyanine dyes for the diagnosis of proliferative diseases
EP1745739A3 (en) * 2005-07-14 2009-04-22 Bundesrepublik Deutschland, vertr. d.d. Bundes- ministerium f. Wirtschaft- und Technologie, dieses vertr. d.d. Präs. d. Phys.-Techn. Bundesanstalt Optical imaging of rheumatoid arthritis
DE102007037008B4 (de) * 2007-08-06 2015-09-10 Siemens Aktiengesellschaft Diagnosesubstanz zur Anwendung in einem Verfahren zur Bestimmung der Aggressivität eines Prostatatumors
DE102007038730A1 (de) * 2007-08-16 2009-02-19 Carl Zeiss Meditec Ag Nachweis des menschlichen Vascular Endothelial Growth Factor
WO2009103312A1 (en) * 2008-02-19 2009-08-27 Ludwig-Maximilians-Universität Ezrin, serpin b5, peroxiredoxin-2 and heat shock protein beta-1 as autoantigens for psoriasis and poststreptococcal diseases
JP2012517434A (ja) * 2009-02-06 2012-08-02 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 血管病変を治療する方法
CA2766861A1 (en) * 2009-07-09 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag In vivo tumor vasculature imaging
US8658434B2 (en) 2009-10-28 2014-02-25 Biotium, Inc. Fluorescent pyrene compounds
GB0922014D0 (en) 2009-12-17 2010-02-03 Ge Healthcare Ltd Novel integrin binders
WO2014122228A1 (en) 2013-02-07 2014-08-14 Westfaelische Wilhelms-Universitaet Muenster Labelled compounds that bind to alpha-v-beta-3 integrin
JP6752582B2 (ja) * 2016-02-08 2020-09-09 キヤノン株式会社 光音響イメージング用造影剤
TWI617281B (zh) * 2017-01-12 2018-03-11 財團法人工業技術研究院 傷口狀態分析方法與系統
CN112994990B (zh) * 2021-05-20 2021-07-30 蚂蚁金服（杭州）网络技术有限公司 一种环路检测方法、装置、电子设备与存储介质

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1144688A (en) * 1987-03-17 1988-09-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. A pharmaceutical composition comprising cyanine dye
GB9708265D0 (en) * 1997-04-24 1997-06-18 Nycomed Imaging As Contrast agents
DE19947559A1 (de) * 1999-09-24 2001-04-19 Schering Ag Antikörper-Farbstoffkonjugate gegen Zielstrukturen der Angiogenese zur intraoperativen Tumorranddarstellung
US6180086B1 (en) * 2000-01-18 2001-01-30 Mallinckrodt Inc. Hydrophilic cyanine dyes
JP2003524018A (ja) * 2000-02-24 2003-08-12 アイトゲネーシシェ テクニシェ ホッホシューレ チューリッヒ フィブロネクチンのｅｄ‐ｂドメインに特異的な抗体、前記抗体を含む複合体、および血管形成を検出および治療するためのその使用
RU2352582C2 (ru) * 2002-01-03 2009-04-20 Шеринг Акциенгезельшафт Конъюгаты, содержащие антитело, специфическое для ed-в-домена фибронектина, и их применение для обнаружения и лечения опухолей
ES2337566T3 (es) * 2002-03-11 2010-04-27 Philogen S.P.A. Anticuerpos derivados de anti ed-b l19 y vasculatura tumoral objetivo.
CA2514131A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-05 Schering Ag Hydrophilic, thiol-reactive cyanine dyes and conjugates thereof with biomolecules for fluorescence diagnosis
WO2006073314A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Ge Healthcare As Optical imaging
EP1679082A1 (en) * 2005-01-07 2006-07-12 Schering AG Use of cyanine dyes for the diagnosis of proliferative diseases

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101946171B (zh) * 2007-12-14 2014-03-12 拜奥蒂乌姆股份有限公司 荧光化合物
CN101518528B (zh) * 2008-02-29 2014-02-26 史春梦 一组碳花青染料类的近红外荧光化合物的用途
CN108410202A (zh) * 2018-02-12 2018-08-17 成都驷博生物科技有限公司 一种喹啉七甲川菁染料的制备方法
CN110201189A (zh) * 2019-06-03 2019-09-06 沈阳药科大学 白蛋白结合型近红外荧光染料-马来酰亚胺共轭物

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