UA82684C2 - Гідрофільні, реакційні відносно тіол-групи ціанінові барвники, спосіб їх одержання, їх кон'югати з біомолекулами, спосіб одержання останніх та їх застосування, а також діагностичний набір - Google Patents

Abstract

Винахід стосується нових флюоресцентних барвників із класу ціанінових барвників, зокрема індотрикарбоціанінів, з абсорбційним і флюоресцентним максимумом у спектральній області від 700 до 900 нм, зі специфічною у відношенні тіольної групи реакційною групою й трьома, переважно чотирма, сульфонатними групами, а також підвищення розчинності у воді та одержання барвників. Даний винахід стосується також кон'югатів цих барвників з біомолекулами і їх застосування.

Description

Даний винахід стосується нових флюоресцентних барвників із класу ціанінових барвників, зокрема індотрикарбоціанінів з абсорбційним і флюоресцентним максимумом у спектральній області від 700 до 90Онм, з реакційною групою, специфічною відносно тіол-групи, і трьома, переважно чотирма, сульфонатними групами, збільшення розчинності у воді, а також одержання барвників. Даний винахід стосується також кон'югатів цих барвників з біомолекулами і їх застосування.

Останнім часом набуло значення використання світла в медичній діагностиці (див., наприклад, Віотеаісаї

РПпоїопісх Напароок (Едйог т. Мо-Оіпи)), САС Ргевз5). При проведенні експериментальних досліджень розроблена велика кількість різноманітних діагностичних методів для застосування в різних медичних галузях, наприклад, ендоскопії, мамографії, хірургії й гінекології. Базовані на застосуванні світла процеси мають високу інструментальну чутливість й уможливлюють молекулярне виявлення й візуалізацію найменших кількостей хромофорів й/або флюорофорів (МУеїз5іІєдег еї аї. (2001) МоІесшаг Ітадіпо, Надіоіоду 219, 316-333).

Барвники, які вводять у тканини як екзогенні контрастні середовища із метою флюоресцентної діагностики й візуалізації особливо флюоресцентні барвники з абсорбційним і флюоресцентним максимумом у спектральній області 700-900нм (діагностичне вікно тканин), представляють особливий інтерес для застосування в умовах іп мімо. Протони цих довжин хвиль порівняно мало абсорбуються тканинами й можуть тому проникати в тканини на декілька сантиметрів перед тим, як абсорбційний процес (головним чином, за допомогою дії оксигемоглобіну й деоксигемоглобіну) зупинить переміщення світла. Абсорбція може відбуватися, крім того, за допомогою флюоресцентних барвників, які вводяться в тканину, але які випромінюють абсорбовану енергію у вигляді більш довгохвильового флюоресцентного випромінювання.

Флюоресцентна радіація може бути виявлена спектрально й уможливлює локалізацію барвників і кореляцію з молекулярними структурами, до яких барвник приєднаний (див. у зв'язку із цим Гіса, К. (2002) Сопігаві Адепів тюг Оріїса! Ітадіпдо (Веміем). В: Торісв іп Ситепі Спетівігу - Сопігаві Адепів ІІ (Едіюг: МУ. Ктгаизе), Моїште 222, зЗрііпдег НеїдеІрего, стор. 1-31.|.

Щоб дося!їти діагностично істотної відмінності між хворобливими структурами й здоровими тканинами, введений барвник повинен приводити, до високої, наскільки це можливо, різниці концентрацій між тканинами.

Це може бути здійснене, виходячи з фізіологічних властивостей пухлини (кровопостачання, кінетика локалізації, пізнє видалення). Для молекулярного маркірування хворобливо-специфічних структур можуть бути використані кон'югати, які складаються із флюоресцентних барвників з біомолекулами, спорідненими мішеням, такими як, білки, пептиди й антитіла. Після ін'єкції певна частина цих кон'югатів зв'язується з такими структурами молекулярної - мішені, як рецептори або матричні білки, у той час як незв'язана частина виводиться з організму. Таким чином, при здійсненні флюоресцентної діагностики більш висока концентраційна різниця приводить до більшої візуальної контрастності.

Флюоресцентні барвники класу ціанінових барвників потрапляють у категорію перспективних представників і були синтезовані з використанням багатьох різних структур. Зокрема, карбоціаніни з індокарбоціаніновими, індодикарбоціаніновими й індотрикарбоціаніновими структурами мають високі коефіцієнти екстинкції й гарні флюоресцентні квантові виходи (іспа, К. (2002) Сопігаві Адепів ог Оріїсаї!

Ітадіпд (Аеміему). В: Торісв іп Сштепі Спетівігу -Сопігазі Адепів ІІ (Едіюг: МУ. Кгаизе), Моїште 222, Зрііпдег

Неїдеїрего, стор.1-31, і наведені в них посилання).

ГУ заявці УМО 96/17628| описаний діагностичний процес, проведений в умовах іп мімо, за допомогою використання ближнього інфрачервоного випромінювання. У цьому випадку водорозчинні барвники і їх біомолекулярні аддукти зі специфічними фото-фізичними й фармакохімічними властивостями є контрастними середовищами для флюоресцентної і транс-ілюмінаційної діагностики.

Синтез ціанінових барвників з індокарбоціаніновими, індодикарбоціаніновими й індотрикарбоціаніновими структурами добре відомий з рівня техніки. Зв'язана із цим відповідна література представлена, наприклад, в:

ІВіосопіцдаїє Спет. 4, 105-111, 1993; Віосопіцдає Спет. 7, 356-62, 1996; Віосопіпдаге Спет. 8, 751-56, 1997; Суютейу 10, 11-19, 1989 й 11, 418-30, 1990; 9. Неїегосусі. Спет. 33, 1871-6, 1996; 9. Огд. Спет. 60, 2391-5, 1995; Оуез апа Рідтепів 17, 19-27, 1991, буез апа Рідтепів 21, 227-34, 1993; 9. Ріпогезс. З, 153-155, 1993; і Апа!. Віоспет. 217, 197-204, 1994).

Додаткові методи |описані в патентних публікаціях. 5 4 981 977; 05 5 688 966; 05 5 808 044; МО 97/42976; МО 97/42978; МО 98/22146; УМО 98/26077;1ЕР 0 800 8311.

Крім того, індотрикарбоціаніни з іншими замісниками синтезовані й приєднані до біомолекул (описані, наприклад, в Рпоїоспет. РПогобіо!. 72, 234, 2000; Віосопійдаїеє Спет. 12, 44, 2001; Майшге Віоїесппої. 19, 237, 2001; у. Віотеа. Оріїйсз 6, 122, 2001; 9. Мед. Спет. 45, 2003, 20021. Інші приклади можна знайти, зокрема, у публікаціях ЇМО 00/61194 ("5Зпоп-Снаіп Реріїде ЮОує Сопіцдайсез аз Сопігаві Адепів Гог Оріїса! Оіадповіїсв"), МО 00/71162, УМО 01/52746, УО 01/52743 й МО 01/621561.

Однак, відомі індотрикарбоціаніни, які використовували раніше фахівці в галузі техніки, мають недоліки, які погіршують їх ефективне застосування.

Низькі флюоресцентні квантові виходи індотрикарбоціанінів завжди виникають після приєднання до біомолекули. Так, Стирег й ін. (Віосопіпдаїє Спетп. 11, 696-704, 2000) відзначають, що для комерційно доступного барвника Су7 втрата флюоресцентної ефективності має місце після приєднання до біомолекули.

ВесКег й ін. (Рпоїоспет. РПоїобіоі. 72, 234, 2000) описують кон'югати індотрикарбоціаніну з НАЗ5 і трансферином із флюоресцентними квантовими виходами 2,995 або 2,895 і деформованим абсорбційним спектром у фізіологічному середовищі.

Крім того, кон'югати барвників мають тенденцію до агрегації. ВескКег й ін. (Рпоїоспет. РПоїобіо!. 72, 234, 2000) для кон'югатів індотрикарбоціаніну з НА5 і трансферином й І сна й ін. (Віосопійдагє Спет. 12, 44-50, 2001) для рецептор-зв'язувальних пептидів описали їх, як такі, що мають деформований абсорбційний спектр у фізіологічному середовищі. Ці деформації вказують на утворення агрегацій і флюоресцентну екстинкцію, які є результатом цього. Подібна проблема існує у випадку неадекватної водної розчинності барвників.

Що стосується реакційних груп, завжди існує також проблема неефективного доступу до похідних. Так,

Сіпбег й ін. (Віосопіпдаїє Спетп. 11, 696-704, 2000) описують використання Су7-біфункціональних НА5-ефірів із двома реакційними групами, які потенційно можуть приводити до утворення поперечних зв'язків між двома біомолекулами. Однак, при наявності двох карбоксильних груп у молекулі синтетичний доступ до похідних утруднений тільки з однією реакційною групою й приводить до побічних продуктів (наприклад, до вмісту порції монореакційних НАб-ефірів Су7 неактивованої й подвійно-активованої молекули Су?7).

Таким чином, існує постійна потреба в ефективних й легко одержуваних ціанінових барвниках для флюоресцентної діагностики, у яких знижені або зовсім відсутні згадані вище недоліки. Крім того, ці барвники повинні бути в достатній мірі придатними для одержання кон'югатів з біомолекулами.

Першим об'єктом за винаходом є індотрикарбоціаніновий барвник загальної формули (І)

В

Я. ре Її Т рей шк в ве ле: МН НИ М в ! їй й (ї» у якій

Х означає О, 5 або С, тобто заміщений у двох місцях, при цьому замісники можуть бути вибрані з метилу, етилу, пропілу, ізопропілу й/або бутилу; ХУ означає СН»-СН»о або СН»-СНо-СН»г; 7 означає Сі-валкіл, при цьому С атоми необов'язково заміщені О або 5, або (о у

Ї

Ві-Ва, незалежно один від одного означають 5ОзН або Н, за умови, що, принаймні, три з Ві-Ва означають

ЗОЗН, В5 означає -СО-МН-НАв-Но, -МН-С5-МН-На-Неа або -МН-СО-Нв8-Не, де Нв вибраний із групи, яка містить нерозгалужений Сг-1ізалкіл, у якому атоми вуглецю необов'язково заміщені О або 5, і Не вибраний з

ЯН их, З и :

Її. - їх 1 або У- о або ацетихлориду, ацетидброміду, ацетилиодиду, хлорацетамідо-групи, йодацетамідо-групи, хлоралкілу, бромалкілу, йодалкілу, піридилдисульфіду й вінілсульфоаміду, і в якій Нє й Н7 означають СН або зв'язані з радикалами від Сзалкілу до гексильного кільця, яке необов'язково може бути заміщене в п-положенні Сі- 4алкільним радикалом, і солі й сольвати цієї сполуки.

Переважним є індотрикарбоціаніновий барвник за даним винаходом, у якому У означає СНео-СН»е; 7 означає Сі-залкіл, при цьому атоми вуглецю необов'язково заміщені О або 5, і в якому Нв й А; означають СН, і солі й сольвати цієї сполуки.

Найбільш переважним є індотрикарбоціаніновий барвник за даним винаходом, у якому 7 означає Сі- залкіл.

Ще більш переважним є індотрикарбоціаніновий барвник за даним винаходом, у якому й означає 9)

Ти і Ав й А; зв'язані з гексильним кільцем через Сз-алкіл.

Флюоресцентні барвники із класу ціанінових барвників, зокрема індотрикарбоціаніни з абсорбційним і флюоресцентним максимумом у спектральній області від 700 до 900нм, реакційною групою, специфічною відносно тіол-групи й трьома, переважно чотирма, сульфонатними групами, є, таким чином, об'єктами за даним винаходом. Останні використовуються для збільшення розчинності у воді.

Несподівано недавно було знайдено, що індотрикарбоціаніни відповідно до винаходу з вищезгаданою структурою (компактне положення 3-4 сульфонатних груп із сульфонатетильними радикалами) мають високий флюоресцентний квантовий вихід 21595, і що флюоресцентний квантовий вихід після приєднання до біомолекул залишається практично незмінним (максимальна втрата становить близько 1090). Крім того, абсорбційні спектри кон'югатів не виявляють ніякої деформації в ближній інфрачервоній області близько 750нм. Таким чином, отримані барвники з хорошою гідрофільністю, зниженою агрегацією і збільшеним флюоресцентним квантовим виходом у порівнянні зі стандартними індотрикарбоціанінами або Су7 похідними з менше, ніж трьома, сульфонатними групами, зокрема у випадку Су? й інших відомих структур.

Інший цінний аспект в одержанні ціанінових барвників для флюоресцентної діагностики відповідно до винаходу стосується похідних, які мають реакційні функціональні групи, які дають можливість ковалентного зв'язування зі специфічними відносно мішеней біомолекулами. Підходящими похідними є, наприклад, МНО ефіри й ізотіоціанати (Віосопіцдаге Спет. 4, 105-111, 1993; Віосопійдаїе Спет. 8, 751-56, 1997|, які реагують із аміногрупами в таких сполуках, як, наприклад, іміди малонової кислоти, о-галокетони, або ос-галоацетаміди (Віосопіндає Спет. 13, 387-391, 2002; Віосопіидаїє Спет. 11, 161-166, 2000), які реагують із тіольними групами. Інші біфункціональні лінкери (зв'язувальні проміжні групи) можуть походити із групи, яка містить арилендіїзотіоціанати, алкілендіїзотіоціанати, біс-м-гідроксисукцинімідилефіри, гексаметилендіїзоціанат й ефір

М-(у-малеїнімідобутирилокси)сукциніміду.

ЇУ заявці УМО 01/77229| описані ціанінові барвники з комбінацією сульфоарильних груп, алкільних замісників у мезо-положенні метинового ланцюга й, принаймні, однією реакційною групою, яка дає можливість приєднання до біомолекул. Однак, варіанти здійснення стосуються індодикарбоціанінів (поліметиновий ланцюг яких складається з 5 атомів вуглецю) і сполук, які не мають реакційних груп у мезо-положенні.

ГУ заявці УМО 00/16810 ("Меаг-Іпітагей РіІпогезсепі Сопігазі Адепі апа Ріпогезсепсе Ітадіпо")| описані індотрикарбоціаніни, наприклад, із замісниками в мезо-положенні С7-поліметинового ланцюга. Не зазначено, однак, яким чином можуть бути введені або отримані реакційні групи.

Інший аспект даного винаходу стосується індотрикарбоціанінового барвника, у якому НА5 означає СООН або МН».

Опубліковані похідні базуються, головним чином, на СуЗз-, Суб5-, Су5,5- і Су7-базисних структурах (комерційно доступні від Атегепат РНагптасіа Віоїесн; 05 5 268 486; СуЗ - індокарбоціанін, Су5 - індодикарбоціанін, Су7 «- індотрикарбоціанін). Похідні з реакційною групою відносно тіольної становлять особливий інтерес, тому що уможливлюють безпосереднє зв'язування з біотехнологічними цистеїнами, які займають специфічне положення серед біомолекул. Рівень техніки зараз концентрується головним чином на

СуЗз і Суб похідних.

Особливо переважні індотрикарбоціанінові барвники відповідно до винаходу вибрані з барвників з формулами від (ІЇ) до (ХХ), які представлені нижче в таблиці 1.

Таблиця 1: Переважні барвники відповідно до винаходу еле И ПОМ

Ніряковх | ше а : і, | Го :

ЩІ | Фор в ! і ПИШУ ше і і ї і ' | йод же : ж ки й і вх, В

Нрвяьд | Фебуі тя Е

ІФ Н і І

Е РУ | Ки, Й ве щини Зк : : ок. а м т я дет ! ї Н 3 : ешеи Я ї ї Н

В | дей ваш дитя Н

ПІриканя | Яка ит ин ди ик пт ту ! ї Н І іх Я ЕН я за зи є У ще і

В п нн а а и и ЧИ і

Н | и Ох вс

Е | Же Ма

Ілони | , ї ! (Й ! і! З і ДЯ хи щі? 4 і і с Дн ЧЦЯ г Кдвктн, оВМ і ! Е ши ож в с ст і ' ! К, ра понині ртфенннненнннєедкеєенннвенеекккєккн юне ше

Мбхрнхли п - теля ї нях Н і щ

ПО, Й . оо и

Н ї їх., они ще - хі сткохцо щи й гі

Між | . 2

Н Н : с.

Н і ! і ле 4 А і | НИЙ Я х

Н і що і Н їх ще ай Моя ВОМ Е й Гаю їх - Кт ! шини бр Н Сл. ї Н

Й Кот То й Кок : ї : Ех Н кан в ЦИ ЩИ і : 3 с -х щі ' : : 5 Де: : ; ! Н шо ! ї НЯ Щі : : ет ї і : і і і х х уч і і | як йод ї і Шк ! Ї ситет тт теє я ! чт А те | яті

РУКИ 1 у мед а ШУ Н : ди пит ек прин ди тт І

Н жЖуют ни ще ч з і

Геунселюя с І : Я : й Н ! й : Е . ї зу н д я що лж ; і м - в орех :

Я ТОК, сн : Як :

Тодитх ой

У х Н кад ось ЯН ? ' : КОД ет дм ї М дині ; ї Я З ї й х - й : : : хи ху ! ши нини о Я слові х ;

КНУ : г : | З Ж дань і тпзускх І «х, ще ке з-д З і

Тунахзя к : зн ' ї ! щ т Ї ! , 4 ї р : ї я , : Е чих що ' ї є Ко У й й Я

З є хи їй чні ВВ

НксЯ хх і ех х і ї к -к іх : р : ї яр и Н й : ї Н

ГІЯ Г-й т У й Ко хе хх : ї Я хо ї т і ся дж дехто мой !

ЕН х Ка КЕ саван ча й в ї юн Х т ех ? і ї і ї : з Її і ї Я ! т Н : х ач ї рохАи щук ї Ко; ше : ПИШИ ; ПИШИ палили лилия ;

Он і нн ие !

Тед шШ

М нки. п АКА жжА Кук жжжтх ян плоть Н

Н м й й Н АКТА АКА М АААААХАЄАААКА В Х 5 !

Код :

ПІ ! ши Я ий, тити я ятяненя що К т Пракпл : С г | : Щі ! | ! я

Я Н їй - і

Н ! ше І

Н

' г у я У Й кі

Н а їх я - - які ха

Н ії оби хх ; ще щ од | ТЕ і і ев в і ке ї і - і Е ще і і | З Зайти ди і Ь зн х

Н де щі ! і | Н /

Н і Ні и і | я :

Н : :

Н Н і Ще ' | З лем ! ши попе і : клюють мет чь ть тт - ї

Ї | доннннетннтнтттнтотеттнот - де ї ї їх.

НО | а в

Н ск нет ляти он

Н Н тк, т и ит т, я И.

Нрякиа | р, і ; М Н

Н і ! ів Н .

Ії І :

Н і і й ! | г : Н : : й ех ще : і 5 ти и Ж жу ! Гожокннх : тт і

Н не а но а ИН

І Не ї ТО бе дюм их зе : 1 х ве я

Н 1 вн Я : НІ : Е і Н КЕ ре і Н й

В доз ! і і БО йе

Н Н сипати. - уко нннне ши 5 хо 1 . 4 і Н ц ї

Н Н : А інки | Й ! нш сеанс ! Н ит я ння '

НУ Н : З

Н Н . і | : ! ; Щ

Н їв у т ЗАЙ ооо СВО

Н Тобі Ще К Кк

Го х Я Саша р '

Н и ЧК : ме : ! он а з кож З ! ! їж ї ї тк. КЗ ке Я Ка І ! ! НК ІЯ їообдютт дк лі ї З Е се ех ні

Я 3 о ТК Я ! 1 - ? !

Н Н | . і і щ-о и і Н о і Н . : і і : й де КАН і ! аб з гегетений і Й она ниви авник дра фрттхнту ння ! у. У їх : ! пк й о

Н І а ра ш кпк : іч ша ін : о ех» Бо я ше

В Е Н г Н г : ї КЕ Я ї й а Я ї у

З :

Іо хи Що Ї ян лов :

Н Оу хи - дме ях і

РОООЯХ ом : рин ! обу ТЕЗ сш 3 Ї феод отут ще. : х и Е : ї ; !

Н Н : ї

Її Я і : і Н М и :

Н Її Я :

Н Її : о

Н ї мк ще : : - 30

С нин - : що Е ї т м. СН ; Е кача пи дисц хі - хо ї сдттитутку й і

Мірвим ї : с

Н А о

Ще і ;

Де КТ дж ши Я

Н ИН г «ше :

Н а : К ї : ле Пн а а і :

Н я ВУ Ро бод стих дети !

Е М тій с ї НІ й і В і ;

Н ХА хх м ! . : печхтттжтттктткихтнннннннї

Н ї вт пк ють ть св юю ють ть ть в ЮТЬ ть Тв юю ЮТЬ тю юю ють ї на пи

Б і З р. і Мои Я

Мірвххвх | дих ще че ер ! і і Н І ГУ пз : : Ї че !

І" В М їх К: : ! В че Я : ! і Ей ї ч і

В : ї і і Мк і і Н ще

Н хх : : де пк :

Ко т В дюн ди БО : : СВ: Ще З рих я ! п: а і х. й ї Я ' жо ІЗ ' т. й ох и : ІЗ !

ШЕ ние и в в : і В ОШ т ї г що : ! Е я р: й Я

Н Е : її !

Н ІЗ о ще я :

Н : о , : : :

Н Н | : ї вен Яр :

І : :

Н : ше

Н : п

Н : п нд зни як длеттялятнняятт тик палку ; тд Ї : бевнувх : ПА ААУ КА КАК Лу п и тютни

Мудрик тя є 5

НАМ : і : їй з «

І; ся й щи

ІНпнкозя о зи знан СЕ ' і Н х х і Е ї ї шен її й | бу З Ж ї

Н ! ст і .

Н : т я Її

Н 3 х Я В

Н 3 їх І : ! : ЕТ В

Е ой ; ї ї ,

Н Рише її х У ; | як ї

Н іш іще н з ще : : з 7 х ; Мене ІЗ ї : пи рен : Е - х : : Кей Ж ЩІ с Н ща со : З :

НЕ в м в в а ЧИ НИ ї

Н ї ДН ща т і ша :

Н 1 Ух к | : і : ' : : ке й : : я и :

Н : : : м і. :

І І ст у : й пан тт

Н К о я х ї

ТЕШТТТТТТТТ С

ЖУК і

В г го Т ї

В Ма оо ав ї

Гу емо: ох а дити, Я

Пернкма у ц ША.

З : м вся : їх ї ; у Х .

Е 3 Е і : ше

Н їж їх А Жди КДМ :

Н нь ско ї карих у В ! То затих чия сій З : : І МО тт се В

Н т Кк ї Н х : : : ее і :

В де Ми Е

Кедр ннннннннннннннннннняя на Е

ЇХУНЕ я ї с Ж ї

Є щи: в: щеня ї

НЕбвнк пи шк

Н : Н З Ч З : па І їх і: : : А: й !

Е КЕ. Е

І КУ Н

Н ї тако й

Н їащ ДЕ 5. Й о . ще Е і Тобі и й ва: ! : Клея М, : й - ! : :

РК ї ї дже аа чик Е Н і нн о о п : : ше і | й : : : шк : : : : С зо є Е ' Ї : Н ї

Н ї НИ песня ! :

НЕ ов : уж жк у у УК У У У У У пуху ух

Пряклва : й вки бе ;

Н х їх - Н . 3

Я рей в с Сас Тр і

Елихаде ! их хи ин ик зи Е і | Кок ік ер (рик | Х і й й Н щу ! ши ШІшк о т т ко, пиття :

ХМ ц Ух щ- є

Інший аспект даного винаходу стосується способу одержання індотрикарбоціанінового барвника за даним винаходом. У цьому випадку був знайдений простий доступ через 4-заміщені піридини. Як не дивно, різні 4- заміщені піридини з високими виходами можуть бути перетворені за допомогою реакції Цинке (реакція 2іпсКе-

Копід, див. Котрр5 Спетіє І ехікоп |Потрр5 Снетіса! Оісіопагу|, 10 Еайоп, стор.5067) у тиезо-заміщений глутакональдегід-діанілід (попередник ціанінового барвника).

Крім того, простий й ефективний синтез 4-заміщених піридинів, симетричні структури барвників за цим винаході відкривають можливість певної дериватизації з реакційною групою, селективною відносно тіольної групи, у симетричному мезо-положенні молекули.

Таким чином була проведена подальша дериватизація до сполук з реакційною групою відносно тіольної.

Функціональними реакційними групами відносно тіольної є, наприклад, »малеїнімідна (малеімід), хлорацетильна, бромацетильна, йодацетильна, хлорацетамідна, бромацетамідна, йодацетамідна, хлоралкільна, бромалкільна, йодалкільна, піридилдисульфідна й вінілсульфонамідна групи.

Ще один аспект даного винаходу стосується способу одержання кон'югатів, який включає приєднання індотрикарбоціанінового барвника за даним винаходом до біомолекули. В обсязі цього винаходу під терміном «біомолекула» слід розуміти будь-яку молекулу органічного походження, яка має біологічну активність, зокрема ферментативну активність, або зв'язувальні речовини синтетичного або біологічного походження такі, як наприклад, фармацевтичні агенти, пептиди, білки, рецептори або нуклеїнові кислоти. У свою чергу, переважними біомолекулами є білки, як наприклад, ферменти, пептиди, антитіла й фрагменти антитіл (такі, як наприклад, одиночний ланцюг, Раю, Е(ар)», діародієз і т.п.), ліпопротеїни, нуклеїнові кислоти такі, як наприклад, олігонуклеотиди або полінуклеотиди із ДНК або РНК, аптамери, РНК, і цукри такі, як наприклад, моно-, ди-, три-, оліго- і полісахариди.

Синтез і біологічна характеристика кон'югатів ціанінових барвників з біомолекулами такими, як пептиди, антитіла і їх фрагменти й білки для флюоресцентної діагностики пухлин в умовах іп ммо описані раніше в багатьох публікаціях. У цьому випадку переважно були використані згадані вище СуЗ, Су5, Су5,5 і Су 7 Ідив. у зв'язку із цим, наприклад, Майшге Віогесппої. 15, 1271, 1997; Сапсег Оеєїесі. Ргем. 22, 251, 1998; 9. Іттипо).

Мей. 231, 239, 1999; Маштге Віотесппої. 17, 375, 1999; Машге Медісіпе 7, 743, 2001).

Інший аспект даного винаходу зв'язаний з отриманим відповідно до способу за винаходом кон'югатом індотрикарбоціанінового барвника з біомолекулою. Цей кон'югат може бути охарактеризований тим, що він включає біомолекулу, як визначено вище, причому як біомолекула, принаймні, одна біомолекула, вибрана з пептидів, білків, ліпопротеїнів, антитіл або фрагментів антитіл, нуклеїнових кислот таких, як наприклад, олігонуклеотиди або полінуклеотиди ДНК або РНК, аптамерів, РНК, і цукрів таких, як наприклад, моно-, ди-, три-, оліго- і полісахариди, є найбільш переважною. Приєднаний білок може бути охарактеризований тим, що він вибраний із групи структурних білків або розчинних білків організму. Абсолютно переважними є сироваткові білки (наприклад, Н5А), антитіла/фрагменти антитіл, як, наприклад, зсЕу-фрагмент або К(аб), а також пептиди, В5А, яєчний альбумін або отримана з них пероксидаза.

Так, з рівня техніки відомі, наприклад, антитіла, які спрямовані проти молекул, які інтенсивно експресують в ангіогенетично активної тканини й тільки на дуже низькому рівні в прилеглій тканині |див. УУО 96/016531.

Особливий інтерес представляють антитіла рецепторів факторів судинного росту, рецепторів з ендотеліальними клітинами, з якими зв'язані медіатори запалення, і матричних білків, які особливо експресують при формуванні нових судин. Переважними є інші антитіла й фрагменти антитіл, які протистоять матричному білку ЕОВ-фібронектину і його кон'югатам відповідно до винаходу. ЕОВ-фібронектин, відомий також як онкофетальний фібронектин, є варіантом сплайсингу фібронектину, який формується, зокрема, навколо знову утворених судин у процесі ангіогенезису. Особливо переважними є антитіла 119, Ев, АРЗ8 й

АРЗ9 проти ЕОВ-фібронектину (Сапсег ВНез 1999, 59, 347; ) Іттипо! Меїй 1999, 231, 239; Ргоївїп Ехрг Ригії 2001, 21, 156).

Переважним є кон'югат відповідно до винаходу, який характеризується тим, що індотрикарбоціаніновий барвник приєднаний до біомолекули через 5Н-групу, зокрема через 5Н-групу до цистеїну. Необов'язково навіть більш переважно одержуваними з них є такі антитіла і їх фрагменти, які одержують за допомогою рекомбінантної технології так, що на С- або М-кінцях (у межах 1-10 крайніх амінокислот) вони містять цистеїн, який не утворює ніяких внутрішньомолекулярних 5-5-містків, і тому може бути використаний для приєднання до барвників відповідно до винаходу.

Інший аспект даного винаходу стосується діагностичного комплекту, який включає індотрикарбоціаніновий барвник за даним винаходом й/або кон'югат за даним винаходом. Крім того, набір може містити додаткові ад'юванти для здійснення діагностики, зокрема пухлин, в умовах іп мімо. Ці ад'юванти являють собою, наприклад, підходящі буфери, посудини, реагенти для виявлення або інструкції для застосування. Набір переважно містить всі матеріали для внутрішньовенного введення барвників відповідно до винаходу.

Спеціальний вміст таких наборів відповідно до винаходу є, наприклад, наступний.

Перша посудина містить антитіло (біомолекулу) з вільною ЗН-групою й стандартними буфером/добавками у вигляді розчину або ліофілізованого матеріалу. Інша посудина містить барвники відповідно до винаходу у вигляді розчину (звичайні добавки) або ліофілізований матеріал у молярному співвідношенні 0,1:1 (10-кратний дефіцит в еквімолярній кількості). Вміст посудини, яка містить барвник, необов'язково змішують з буфером або дистильованою водою, додають до вмісту посудини, яка містить біомолекулу, інкубується протягом 1- 10хв, і використовують як ін'єкційний розчин.

В іншому варіанті набір являє собою 2-х-камерну систему (наприклад, , шприц), у якій одна камера, яка містить розчин антитіла, фізично відділена перегородкою, яка руйнується, від другої камери, яка містить барвник у вигляді розчину або твердої речовини. Після зламування перегородки відбувається змішування й утворення ін'єкційного розчину.

Останній аспект даного винаходу стосується застосування кон'югата відповідно до винаходу як флюоресцентного контрастного середовища для діагностування пухлин в умовах іп мімо. Абсорбційний максимум Су7 у зв'язку із цим лежить в області 745нм й є тому особливо підходящим для виявлення флюоресценції в умовах іп мімо у більш глибоких шарах тканин (див. вище). Однак, Су? похідні з реакційними групами, селективними відносно тіольної групи, ще не описані. Крім того, використання кон'югатів з антитілами для виявлення меж поширення пухлини вже описані в (МО 01/23005 (Апіроду ЮОує Сопіидасез юг Віпаїпд

Тагдеї Біписішгез ої Апдіодепевів іп Огаеєг ю Іпігаорегаймеїу Оерісї Титог Регірпегіез)), але без застосування перспективних барвників відповідно до винаходу.

Винахід описаний далі в термінах наступних прикладів і фігур, які, однак, не обмежують його.

На Ффіг.1 представлені стандартизовані абсорбційні й флюоресцентні спектри кон'югата К11 (А) і К15 (Б) (див. таблицю 2) в РВ5 (фізіологічний розчин з фосфатним буфером).

На Ффіг.2 показані результати візуалізованих властивостей кон'югатів прикладу 24 відповідно до винаходу: речовина: кон'югат К15, пухлина: Е9 тератокарцинома в правому нижньому боці миші, доза: 5Онмол/кг маси тіла (дані стосуються барвника), збудження: 74Онм (діодний лазер), виявлення: ССО-камера (Нататаїви) з 802,5--5нм і смугово-пропускним фільтром, час: перед ін'єкцією, 1Тгод., бгод. й 24год. після ін'єкції.

Положення пухлини вказане стрілками.

Приклади 1-16: Синтез індотрикарбоціанінових барвників з малеімідними групами

Приклад 1: Тринатрій 3,3-диметил-2-17-І(ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4- (2-Ц2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)етилікарбамоїлі|етил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)-1-(2- сульфонатетил)-2,3-дигідро-1 Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула Ії) 6) й. МН р, ; ! ре й ро, Ма х - Ї о. х р А ши є 7 Ки я ве й х ;

Щ то,

ОВО О0-58-0 Ма

ІЗ. о а) 1-(2-Сульфонатетил)-2,3,3-триметил-ЗН-індоленін-5-сульфокислота, внутрішня сіль 10г (0,04мл) 2,3,3-триметил-ЗН-індоленін-5-сульфокислоти (Віосопіпдає Спет 1993, 4, 105), 6,вг (0,04мл) хлорангідриду 2-хлоретансульфокислоти й 4,2г (0,04мл) триетиламіну перемішують в 200мл ацетонітрилу протягом бгод. Осад відсмоктують і висушують. Вихід 5,0г (3595 від теоретичного). Апаї. Віоспет. 1994217, 197. б) Трет-бутиловий ефір З-піридин-4-ілпропіонової кислоти 20г (89ммол) трет.-бутил-Р,Р-диметилфосфонацетату в 5О0мл ТГФ додають по краплях при 0"С до суспензії 3,9 г (98 ммол) гідриду натрію (6095-на в мінеральному маслі) в 250мл ТГФ. Після перемішування протягом 1год. при 0"С, додають по краплях розчин 10г (9Зммол) піридин-карбальдегіду в 5Омл ТІФ, і перемішують реакційну суміш протягом Тгод. при 0"7С і протягом 18год. при кімнатній температурі. Тверду речовину, яка випала, видаляють фільтруванням, і розчин концентрують випарюванням. Залишок при нагріванні розчиняють в ізопропанолі, нерозчинну частину відфільтровують, і розчин охолоджують до 0"С для кристалізації Тверду речовину відфільтровують, перемішують із гексаном, відфільтровують гексан і висушують. Проміжний продукт (15,3г) гідрують в 150мл етанолу з 0,15г 10956-ного паладію на активованому вугіллі протягом бгод. Каталізатор відфільтровують, розчин концентрують випарюванням, і залишок фільтрують на силікагелі (рухома фаза - діетиловий ефір). Одержують 13,0г злегка жовтого масла (вихід 71905 від теоретичного). в) 3-(2-(трет.-Бутилоксикарбоніл)етил|глутакональдегід-діанілід-гідробромід

Розчин 10г (48ммол) трет-бутилового ефіру З-піридин-4-ілпропіонової кислоти в 150 мл діетилового ефіру перемішують із 8,9г (9бммол) аніліну й потім перемішують при 0"С з розчином 5,4г (48ммол) бромціану в 2мл діетилового ефіру. Після Згод. перемішування при 0"С відфільтровують червону тверду речовину, яка утворилася, промивають ефіром і висушують у вакуумі.

Вихід: 20,3г (9295 від теоретичного). г) Три натрій 3,3-диметил-2-17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл1|-4-(2- карбоксіетил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Суспензію 1,0г (2,2ммол) 3-(2-(трет-бутилоксикарбоніл)етил|-глутакональдегід-діанілід гідроброміду (приклад їв) і 1,5г (4,4ммол) 1-(2-сульфонатетил)-2,3,3-триметил-ЗН-індоленін-5-сульфокислоти (приклад 1а) в 20мл ангідриду оцтової кислоти й 5 мл оцтової кислоти змішують із 0,75г (9, 1ммол) ацетату натрію й перемішують протягом год. при 120"С. Після охолодження перемішують із діетиловим ефіром, тверду речовину, яка випала в осад, відфільтровують, очищають хроматографічно (АР-С18-силікагель, рухома фаза вода/метанол) і ліофілізують (0,5г). Відщеплення захисної групи проводять за допомогою перемішування проміжного продукту в 4 мл дихлорметану/1 мл трифтороцтової кислоти протягом 1год. Після концентрування випарюванням і хроматографічного очищення (АР-С18-силікагель, рухома фаза вода/метанол), одержують 0,45г (2395 від теоретичного) блакитного ліофілізату. д) Тринатрій 3,3-диметил-2-17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4-(2-Ц2- (2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)етилікарбамоїл)етил)гепта-2,4,6-триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3- дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

О,4г (0,45ммол) сполуки, названої в заголовку прикладу г, і 45мг (0,45ммол) триетиламіну розчиняють в 10мл ДМФ, змішують при 0"С з 0,15г (045ммол) ТВТИи і перемішують протягом 10хв. Потім додають розчин 0,17г (О0,68ммол). М-(2-аміноетил)малеімід-трифторацетату (Іпі. 9У. Рері. Ргоїєїп Нев. 1992, 40, 445) і б8мг (0бдммол) триетиламіну в О0,5мл ДМФ, і перемішують протягом год. при кімнатній температурі. Потім додають 10мл діетилового ефіру, тверду речовину відокремлюють центрифугуванням, висушують й очищають за допомогою хроматографії (АР С-18 силікагель, градієнт метанол/вода). Вихід: 0,30 г блакитного ліофілізату (6595 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 47,24; Н 4,26; М 5,51; 512,61; Ма 6,78

Знайдено: С 47,74; Н 4,47; М 5,40; 511,99; Ма 7,02

Приклад 2: Тринатрій 3,3-диметил-2-(7-І(ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4- (2-116-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)гексилікарбамоїл)етил)гепта-2,4,6-триєн-1-іліден)-1-(2- сульфонатетил)-2,3-дигідро-1 Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ІП)

СН: шини тн кт 3 є в. Ве й оо

УСТ лАЙК ау ей й й уть ї пох отвко ен че в З

Синтез проводять аналогічно до прикладу Тд з 0,4г (0,45ммол) названої в заголовку прикладу 1г сполуки й 0,21г (0,6д8ммол) М-(6б-аміногексил)малеїнмідтрифторацетату (Іпі. У. Рері. Ргоївєїп Нез. 1992, 40, 445). Вихід: 0О,38г блакитного ліофілізату (8195 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 49,25; Н 4,79; М 5,22; 5 11,95; Ма 6,43 Знайдено: С 48,96; Н 4,92; М 5,32;

З 11,88; Ма 6,56

Приклад 3: Тринатрій 3,3-диметил-2-17-І(ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4- (2-ЩЧ13-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-4,7,10-триоксатридецилікарбамоїл)етил)гепта-2,4,б-триєн-1- іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ІМ)

о н х

Оу о;

Г Ї в (9) зл К- Г ре дк 8 Сорим КК і Ма о-і-в сні нк о 19)

Синтез проводять аналогічно до прикладу їд з 0,4г (0,45ммол) названої в заголовку прикладу 1г сполуки й 0,28 г (0,68 ммол) М-(13-аміно-4,7,10-триоксатридецил)малеїнімідтрифторацетату (Іпі. у). Рері. Ргоїєїп Нез., 1992, 40, 445). Вихід: 0,27 г блакитного ліофілізату (5195 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 49,97; Н 5,05; М 4,76; 5 10,89; Ма 5,86

Знайдено: С 49,22; Н 5,16; М 4,62; 510,67; Ма 5,66

Приклад 4: Тринатрій 3,3-диметил-2-17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|- 4-(4-Ц2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)у-етилікарбамоїлібутил)гепта-2,4 б-триен-1-іліден)-1-(2- сульфонатетил)-2,3-дигідро-Ш-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула М) о ! І а ав т у ра й в) в) Г і оц й ПО жен м Шк - тов о-Вко о-5-о це о Го а) (З-трет.-Бутоксикарбонілпропіл)-трифенілфосфоніум бромід 50г (0,30мл) 4-броммасляної кислоти по краплях змішують в 400мл ТГФ при -40"С з 187г (0,89мл) ангідриду трифтороцтової кислоти. Після З0хв перемішування при -40"С, додають по краплях 400мл суміші трет.-бутанол/ЗОмл ТГФ протягом год. Після 1бгод. перемішування при кімнатній температурі реакційну суміш переносять в охолоджений льодом розчин карбонату натрію, водну фазу тричі екстрагують діетиловим ефіром, органічну фазу висушують над сульфатом натрію й концентрують випарюванням. Залишок переганяють у вакуумі (температура кипіння 727"С/0,9мбар; вихід: 41г). Для утворення солі фосфонію реакцію проводять, нагріваючи зі зворотним холодильником 41г (0,1З3мл) проміжного продукту, 44,бг (0,17мл) трифенілфосфіну й 32,5г (0,3бмл) бікарбонату натрію в 250мл ацетонітрилу протягом 20год. Реакційну суміш фільтрують, концентрують випарюванням і залишок для кристалізації перемішують із діетиловим ефіром.

Вихід: 58,5г (4095 від теоретичного, відносно 4-броммасляної кислоти) білої твердої речовини. б) трет.-Бутиловий ефір 5-піридин-4-ілпентанової кислоти

Розчин 14г (28ммол) (3-трет-бутоксикарбонілпропілутрифенілфосфоній броміду (приклад 4а) в 100мл безводного ТГФ змішують при -40"С у вакуумі протягом 20хв із 17,5мл (28ммол) бутиллітію (1,6-молярний у гексані) і перемішують протягом 1 год при -40"С. Розчин 2,78г (2б6ммол) 4-піридинкарбальдегіду в 20мл ТГФ додають по краплях і перемішують протягом 16бгод. при кімнатній температурі, потім переносять у льодяну воду, водну фазу тричі екстрагують діетиловим ефіром, органічні фази висушують над сульфатом натрію й концентрують випарюванням. Після хроматографічного очищення (силікагель, рухома фаза гексан/етилацетат)), одержують продукт у вигляді Е,2-суміші (4:11 за даними ЯМР; 5,0г). Для гідрування подвійного зв'язку проміжний продукт розчиняють в 200 мл метанолу й перемішують із 100мг РЮ» каталізатора при кімнатній температурі в атмосфері водню. Після фільтрування й концентрування випарюванням одержують жовте масло. Вихід: 4,9г (74905 від теоретичного). в) 3-(4-«трет-Бутилоксикарбоніл)бутил|глютакональдегід-діанілід гідробромід

Розчин 4,0г (17ммол) трет-бутилового ефіру 5-піридин-4-ілпентанової кислоти в З5мл діетилового ефіру змішують із 3,2г (ЗАммол) аніліну й потім при 0"С з розчином 1,9г (17ммол) бромціану в Змл діетилового ефіру.

Після перемішування протягом Згод. при 0"С червону тверду речовину, яка утворилася, відфільтровують, промивають ефіром і висушують у вакуумі. Вихід: 7,9г (9595 від теоретичного). г) Три натрій 3,3-диметил-2-17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл1|-4-(4- карбоксибутил)гепта-2,4,6-триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Синтез проводять аналогічно до прикладу 1г з названої в заголовку прикладу 4в сполуки (2,5ммол) і 1-(2- сульфонатетил)-2,3,3-триметил-ЗН-індоленін-5-сульфонової кислоти (бммол). Вихід: 0,85г (3795 від теоретичного) блакитного ліофілізату. д) Три натрій 3,3-диметил-2-(7-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл1-4-(4-(2- (2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)-етилікарбамоїлібутил)гепта-2,4,6-триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатетил)- 2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Синтез проводять аналогічно до прикладу їд з 0,4г (0,4Зммол) сполуки, названої в заголовку прикладу 4г.

Вихід: 0,31г (69905 від теоретичного) блакитного ліофілізату.

Елементний аналіз: Обчислено: С 48,27; Н 4,53; М 5,36; 5 12,27; Ма 6,60

Знайдено: С 48,01; Н 4,44; М 5,56; 512,10; Ма 6,81

Приклад 5: Тринатрій 3,3-диметил-2-(17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4- (4-16-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)-гексилІікарбамоїлібутил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)-1-(2- сульфонатетил)-2,3-дигідро-1 Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула МІ) н о ан ов я у т о о о

О- - жив) вва зргу о а а 9 не дк ан ї ня щі ме ото бш8-о Я й Ге Ма

Синтез проводять аналогічно до прикладу їд з 0,4г (0,4Зммол) сполуки, названої в заголовку прикладу 1г й 0,20г (0,6бммол) М-(б-аміногексил)малеіїміду трифтороцтової кислоти. Вихід: 0,35г блакитного ліофілізату (7495 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 50,17; Н 5,03; М 5,36; 5 11,65; Ма 6,26

Знайдено: С 49,83; Н 4,89; М 5,34; 5 12,05; Ма 6,42

Приклад 6: Тринатрій 3,3-диметил-2-17-І(ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4- (4-413-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-4,7,10-триоксатридецилікарбамоїл)бутил)гепта-2,4,б-триєн-1- іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула МІЇ) (9) я т

Ор вийти отит йти

В б с. х | ; по

КАК АЙК о Ї я о. ад аоі щі в)

Ше т Ма, а-8хо бхв-о 00 й й ма

Синтез проводять аналогічно до прикладу Ід з 0,4г (0,4Зммол) сполуки, названої в заголовку прикладу г, і 0,30г (0,72ммол) М-(13-аміно-4,7,10-триоксатридецил)малеімід-трифторацетату. Вихід: 0,27г блакитного ліофілізату (5295 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 49,83; Н 5,27; М 4,65; 5 10,64; Ма 5,72

Знайдено: С 49,45; Н 5,19; М 4,66; 5 10,85; Ма 5,80

Приклад 7: Тринатрій 3,3-диметил-2-(17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4- (6-Щ2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-трол-1-іл)-етилікарбамоїлугексил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)-1-(2- сульфонатетил)-2,3-дигідро-1 Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула МІ) о)

Н о чани

ІЙ я ши ре; ї

Ох в Х ре ше зо о» с жк | р, дк | 5 і пак ак са р Ї ш г. о-бко бевно Ма у З Ма а) (З-трет.-Бутоксикарбоніллентилутрифенілфосфоніум бромід Одержання проводять аналогічно до описаного в прикладі 4а, при цьому проміжний продукт трет-бутиловий ефір З-піридин-4-ілпропіонової кислоти вводять у реакцію у вигляді сирого продукту. Одержують 79г продукту (6995 від теоретичного) у вигляді в'язкого безбарвного масла з 50г б-бромгексанової кислоти. б) трет-Бутиловий ефір 7-піридин-4-ілгептанової кислоти

Одержання проводять аналогічно до описаного в прикладі 46. трет-Бутиловий ефір 7-піридин-4- ілгептанової кислоти (7,5г, 6595 від теоретичного) одержують у вигляді жовтого масла з 25г (48,7ммол) (3- трет.-бутоксикарбонілпентил)-трифенілфосфоній броміду (приклад 7а). в) 3-(4-«трет-Бутилоксикарбоніл)гексил|глютакональдегід-діанілід гідробромід

Розчин 5,0г (19ммол) трет.-бутилового ефіру 5-піридин-4-ілгептанової кислоти в ЗОмл діетилового ефіру змішують із 3,6бг (Звммол) аніліну й потім при 0"С з розчином 2,1г (19ммол) бромціану в 5мл діетилового ефіру.

Після перемішування протягом 2,5год. при 0"С червону тверду речовину, яка утворилася, відфільтровують, промивають ефіром і висушують у вакуумі. Вихід: 8,9г (9195 від теоретичного). г) Три натрій 3,3-диметил-2-17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл1|-4-(6- карбоксигексил)гепта-2,4,б-триен-1-іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Синтез проводять аналогічно до прикладу 1г з названої в заголовку прикладу 4в сполуки (Зммол) і 1-(2- сульфонатетил)-2,3,3-триметил-ЗН-індоленін-5-сульфонової кислоти (бммол). Вихід: 1,5 (54905 від теоретичного) блакитного ліофілізату. д) Тринатрій 3,3-диметил-2-17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4-(6-Ц2- (2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)-етилікарбамоїл)гексил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатетил)- 2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Синтез проводять аналогічно до прикладу Ід з 0,4г (0,4З3ммол) названої в заголовку прикладу 4 г сполуки.

Вихід: 0,31 г (6995 від теоретичного) блакитного ліофілізату.

Елементний аналіз: Обчислено: С 49,25; Н 4,79; М 5,22; 5 11,95; Ма 6,43

Знайдено: С 48,98; Н 4,86; М 5,12; 5 11,76; Ма 6,77

Приклад 8: Тринатрій 3,3-диметил-2-17-І(ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4- (6-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)-гексилікарбамоїл)гексил)гепта-2,4,6-триєн-1-іліден)-1-(2- сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ІХ) а М ит

Т / й г

Й їх. Й що 9 шо

С ке ер ет о Х ще !

З пл х о-вкО ото ча: о о а

Синтез проводять аналогічно до прикладу Ід з 0,5г (0,53 ммол) сполуки, названої в заголовку прикладу 7г, і 0,23г (0,75ммол) М-(6б-аміногексил)малеїмід-трифторацетату. Вихід: 0,42г блакитного ліофілізату (7095 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 51,05; Н 5,27; М 4,96; 5 11,36; Ма 6,11

Знайдено: С 50,74; Н 5,55; М 4,76; 511,38; Ма 6,35

Приклад 9: Тринатрій 3,3-диметил-2-17-І(ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4- (6-113-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-4,7,10-триоксатридециліІкарбамоїл)гексил)гепта-2,4,б-триєн-1- іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула Х) й -

Бе: Куди дк ет ик дитя к. І: г во щу хи - ж Н м БК й Соя СЯ Кая е її про ву Й Як

Синтез проводять аналогічно до прикладу їд з 0,5г (0,53ммол) сполуки, названої в заголовку прикладу г, і 0,44г (1,0бммол) М-(13-аміно-4,7,10-триоксатридецил)малеїнмід-трифторацетату. Вихід: 0,24г блакитного ліофілізату (3795 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 50,64; Н 5,48; М 4,54; 5 10,40; Ма 5,59

Знайдено: С 50,30; Н 5,56; М 4,34; 510,15; Ма 5,73

Приклад 10: Тринатрій 3,3-диметил-2-(7-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл1- 4-(5-Ц2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)-етилікарбамоїл|)-З-оксапентил)гепта-2,4,6-триєн-1-іліден)-1-(2- сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХІ) (о) о;

Їх пен о о

Гей о

М ьо м

З Ще 0-80 о-8-0о М 8 0 Ма а) трет.--Бутиловий ефір 3-окса-6-(4-піридиніл)гексанової кислоти Розчин 75г (0,4мл) 3-(4-піридиніл)-1-

пропанолу в 400мл толуолу/50мл ТГФ змішують із 10г сульфату тетрабутиламонію й З50мл 3295-ного розчину гідроксиду натрію. Потім по краплях додають 123г (0,68мл) трет.-бутилового ефіру бромоцтової кислоти й перемішують протягом 18год. при кімнатній температурі. Органічну фазу відокремлюють, водну фазу тричі екстрагують діетиловим ефіром. Об'єднані органічні фази промивають розчином МасСі, висушують над сульфатом натрію й концентрують випарюванням. Після хроматографічного очищення (силікагель, рухома фаза: розчин гексан : етилацетат), одержують 5бг продукту у вигляді коричнюватого масла (4195 від теоретичного). б) 3-(4-Окса-5-(трет-Бутилоксикарбоніл)пентил|глютакональдегід-діанілід гідробромід

Розчин 5,0г (2доммол) трет.-бутилового ефіру 3-окса-6-(4-піридиніл)-гексанової кислоти в бОмл діетилового ефіру змішують із 3,7г (40ммол) аніліну й потім при 0"С з розчином 2,2г (20ммол) бромціану в мл діетилового ефіру. Після перемішування протягом ї7год. при 0"С тверду речовину, яка утворилася, відфільтровують, промивають ефіром і висушують у вакуумі. Вихід: 8,5г (8595 від теоретичного) твердої речовини фіолетових кольорів. в) Тринатрій 3,3-диметил-2-(7-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4-(6- карбокси-4-оксагексил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1 Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Суспензію 3,0г (бммол) 3-(2-(трет.-бутилоксикарбоніл)етил|-глутакональдегід-діанілід гідроброміду (приклад 106) і 4,2г (12ммол) 1-(2-сульфонатетил)-2,3,3-триметил-ЗН-індоленін-5о--сульфонової кислоти (приклад Та) в 5О0мл ангідриду оцтової кислоти й 1Омл оцтової кислоти змішують із 2,5г (ЗОммол) ацетату натрію й перемішують протягом 50хв при 120"С. Після охолодження перемішують із діетиловим ефіром, тверду речовину, яка випала в осад, відфільтровують, абсорбційно осаджують в ацетоні й висушують у високому вакуумі. Після хроматографічного очищення (АР-С18-силікагель, рухома фаза вода/метанол) видаляють метанол у вакуумі й ліофілізують (0,5г). Після концентрування випарюванням і хроматографічного очищення (АР-С18-силікагель, рухома фаза вода/метанол), відразу одержують названу в заголовку сполуку.

Вихід: 2,3г (4195 від теоретичного) блакитного ліофілізату. г) Тринатрій 3,3-диметил-2-17-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4-(5-Ц2- (2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)-етилікарбамоїл)-3-оксапентил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден|-1-(2- сульфонатетил)-2,3-дигідро-1 Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Синтез проводять аналогічно до прикладу їв з 1,0г (1,1ммол) сполуки, названої в заголовку прикладу 10в.

Вихід: 0,85 г блакитного ліофілізату (7395 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 47,54; Н 4,46; М 5,28; 5 12,09; Ма 6,50

Знайдено: С 47, 97; Н 4,65; М 5,10; 5 12,02; Ма 6,68

Приклад 11: Тринатрій 3,3-диметил-2-(7-ІЗ.,з-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2- іл1-4-(5-116-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-ілу-гексил|карбамоїл)-3-оксапентил)гепта-2,4,6-триєн-1-іліден)-1- (2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХІЇ)

З о З

Аулотьтьий

А !

Ох а ше і о - у с фо: в Кия Гая м -

І « я б. ж о-8х0 О-х8-О й о а ме

Синтез проводять аналогічно до прикладу їд з 0,5г (0,55 ммол) сполуки, названої в заголовку прикладу 1Ов, і 0,23г (0,75ммол) М-(б-аміногексил)малеімід-трифторацетату. Вихід: 0,42г блакитного ліофілізату (6890 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 49,46; Н 4,96; М 5,01; 5 11,48; Ма 6,17

Знайдено: С 48,95; Н 5,21; М 5,22; 511,23; Ма 6,60

Приклад 12: Тринатрій 3,3-диметил-2-(7-ІЗ,З-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|- 4-(5-Ц13-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-4,7,10-триоксатридецилікарбамоїл)-4-оксапентил)гепта-2,4,6- триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХІЇЇ) (в) певна 4 Й о о (Я подолу Ф 9 ча о оС на б о Ма

Синтез проводять аналогічно до прикладу їд з 0,5г (0,55ммол) сполуки, названої в заголовку прикладу 10в, і 0,Абг (1,06ммол) М-(13-аміно-4,7,10-триоксатридецил)малеімід-трифторацетату. Вихід: 0,34г блакитного ліофілізату (5695 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 49,17; Н 5,20; М 4,59; 5 10,50; Ма 5,65

Знайдено: С 49,34; Н 5,32; М 4,45; 510,28; Ма 5,56

Приклад 13: Тринатрій 3,3-диметил-2-(2-(1-|3,3-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-

ілІ-вінілен)-2-І4-(2-Ц2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)етилікарбамоїл)етил)-фенокси|циклогекс-1-ен-3- іліден)етіліден|-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХІМ) н ман ) / о і (в) о о у о

Щ м" й чай - б о-8-0 о-8-07 ма і М м а) Три натрій 3,3-диметил-2-(2-(141І3,3-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл|вінілен)- 2г-хпорциклогекс-1-ен-3-іліден)етіліден|-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль 5,0г (14,4ммол) 1-(2-сульфонатоетил)-2,3,3-триметил-ЗН-індоленін-5-сульфокислота (приклад Та) і 2,6г (7,2ммол) М-(З3-(анілінометилен)-2-хлор-1-циклогексен-1-ілуметилєн|анілін гідрохлориду (АїЇдгісн Сотрапу) нагрівають зі зворотним холодильником разом з 2,5г (ЗОммол) безводного ацетату натрію в 100мл метанолу протягом 1год., охолоджують, змішують із 150мл діетилового ефіру й перемішують протягом ночі. Осад відсмоктують, висушують й очищають за допомогою хроматографії (силікагель, градієнт: дихлорметан/метанол). Вихід: 3,8г блакитної твердої речовини (5895 від теоретичного). б) Тринатрій 3,3-диметил-2-(2-(1-|3,3-диметил-5-сульфонато-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум-2-іл|- вінілен)-2-(4-(2-карбоксіетилуфенокси|циклогекс-1-ен-3-іліден)етіліден|-1-(2-сульфонатоетил)2,3-дигідро-1 Н- індол-5-сульфонат, внутрішня сіль 0,37г (2,2ммол) 3-(4-Гідроксифеніл)пропіонової кислоти в ЗОмл ДМФ змішують із 0,18г (4,5ммол) гідриду натрію (6095-на мінеральна дисперсія). Після перемішування при кімнатній температурі протягом ЗОхв суміш охолоджують до 0"С, додають по краплях розчин 2,0г (2,2ммол) названої в заголовку прикладу 12а сполуки в 100мл ДМФф і перемішують протягом 2год при кімнатній температурі. Суміш гасять сухим льодом і розчинник видаляють у вакуумі. Залишок розчиняють у метанолі, перемішують із 200мл ефіру й твердий осад відфільтровують. Проводять хроматографічне очищення (силікагель, градієнт: етилацетат/метанол). Вихід: 1,9г блакитної твердої речовини (8395 від теоретичного). в) Тринатрій 3,3-диметил-2-|2-(1-І3,3-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2-іл1- вінілен)-2-(4-(2-Ц2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)етилікарбамоїл)етил)-фенокси|циклогекс-1-ен-3- іліден)етіліден1-1-(2-сульфонатетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

О,їмг (0,10ммол) названої в заголовку прикладу 126 сполуки вводять у реакцію з ТВТИ й М-(2- аміноетил)малеімід--рифторацетатом у присутності триетиламіну й отриманий продукт очищають хроматографічно. Вихід: 9Змг блакитного ліофілізату (8195 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 51,21;Н4,47;М4,88; 511,16; Ма 6,00

Знайдено: С 51,50; Н 4,55; М 4,95; 510,93; Ма 6,15

Приклад 14: Тринатрій 3,3-диметил-2-(2-(1-ЇІ3,3-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатетил)-ЗН-індоліум-2- іл|-вінілен)-2-І4-(2-16-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)угексилІікарбамоїліетил)-фенокси|циклогекс-1-ен-3- іліден)етіліден1-1-(2-сульфонатоетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХМ) аа

М

Щі / о (в; о ще 5 52 (в) у о

АКА АННИ в Ох о-8-0 О-в-о Ма ї І ма

Синтез проводять аналогічно до прикладу їд з 0,7г (0,68ммол) сполуки, названої в заголовку прикладу 14а, і 0,53г (1,22ммол) М-(13-аміно-4,7,10-триоксатридецил)малеімід-трифторацетату. Вихід: 0,56г блакитного ліофілізату (6895 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 48,27; Н 4,53; М 5,36; 5 12,27; Ма 6,60

Знайдено: С 48,01; Н 4,44; М 5,56; 512,10; Ма 6,81

Приклад 15: Тринатрій 3,3-диметил-2-(2-(1-Ї3,3-диметил -5-сульфонат-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум- 2-іл|вінілен)-2-(4-(2-(113-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-4,7,10- триоксатридецилікарбамоїліетил)фенікси|циклогекс-1-ен-З-іліден)етіліден|-1-(2-сульфонатоетил)-2,3-дигідро- 1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХМІ)

(04 у оте ів) о о о го ! : ма (9) о

Синтез проводять аналогічно до прикладу їд з 0,7г (0,68ммол) сполуки, названої в заголовку прикладу 14а, і 0,59 (1,3бммол) М-(13-аміно-4,7,10-триоксатридецил)малеімід-трифторацетату. Проводять два хроматографічних очищення. Вихід: 0,67г блакитного ліофілізату (7595 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 52,29; Н 5,16; М 4,28; 5 9,79; Ма 5,27

Знайдено: С 51,88; Н 5,40; М 4,34; 5 9,53; Ма 5,68

Приклад 16: Тринатрій 3,3-диметил-2-(2-(1-(І3,3-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум- 2-ілівінілен)-2-І4-(2-((2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-етилІкарбамоїліетилуфенокси|-5-трет.-бутил- циклогекс-1-ен-3-іліден)етіліден|-1-(2-сульфонатоетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-б5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХМІЇ)

Ми ) / (г)

І о (9) т о во в) ; о во ай - т ма, о-в-о о-8-0 о

Ге) о а) М-((3-(Анілінометилен)-2-хлор-5-трет.-бутил-1-циклогексен-1-іл)уметиленіанілін гідрохлорид 6б,7мл (73,4ммол) оксихлориду фосфору додають по краплях при 0"С до Змл ДМФ. Потім додають по краплях розчин 5,0г (32,4 ммол) 4-трет.-бутилциклогексанону в ЗОмл дихлорметану, і реакційну суміш перемішують при нагріванні зі зворотним холодильником протягом Згод. Після охолодження до 0"С, повільно по краплях додають бг (64,9ммол) аніліну в 5,5мл етанолу, суміш переносять в 200г льоду й при перемішуванні додають 5мл конц. хлористовододневої кислоти. Тверду речовину, яка випала в осад, відфільтровують, промивають ефіром і висушують. Вихід: б,8г (5095 від теоретичного) червоної твердої речовини. б) Тринатрій 3,3-диметил-2-|2-(1-|І3,3-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум-2- іл|вінілен)-2-хлор-5-трет.-бутил-циклогекс-1-ен-3-іліден)етіліден|-1-(2-сульфонатоетил)-2,3-дигідро-1 Н-індол-5- сульфонат, внутрішня сіль 5,0г (14,4ммол) 1-(2-сульфонатоетил)-2,3,3-триметил-ЗН-індоленін-5-сульфокислота (приклад Та) і З,0г (7,2ммол) М-(З-(анілінометилен)-2-хлор-5-трет.-бутил-1-циклогексен-1-іл)уметиленіанілін гідрохлориду (приклад 16ба) нагрівають зі зворотним холодильником разом з 2,5г (ЗОммол) безводного ацетату натрію в 100мл метанолу протягом 1,5год., охолоджують, змішують із 150мл діетилового ефіру й перемішують протягом ночі. Осад відсмоктують, висушують й очищають за допомогою хроматографії (силікагель, градієнт: дихлорметан/метанол). Вихід: 4,7г блакитної твердої речовини (6895 від теоретичного). в) Тринатрій 3,3-диметил-2-|2-(1-|І3,3-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум-2- іл|вінілен)-2І4-(2-карбоксіетил)фенокси!1-5-трет.-бутил-циклогекс-1-ен-3-іліден)етіліден|-1--2-сульфонатоетил)- 2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Реакцію проводять із 2,0г (2,1ммол) названої в заголовку прикладу 166 сполуки, як описано в прикладі 136. Вихід: 1,5г (6690 від теоретичного). г) Тринатрій 3,3-диметил-2-|(2-(1-|І3,3-диметил-5-сульфонат-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум-2- іл|вінілен)-2-(4-(2-Щ2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)-етилІкарбамоїліеєтил)фенокси|-5-трет.-бутил- циклогекс-1-ен-3-іліден)етіліден|-1-(2-сульфонатоетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Реакцію проводять із 1,0 г (0,92ммол) названої в заголовку прикладу 16 у сполуки, як описано в прикладі 138. Очищення хроматографічно проводять двічі, використовуючи АР-С18-силікагель, (рухома фаза ацетонитрил/вода). Вихід: 0,24г (2295 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 52,82; Н 4,93; М 4,65; 5 10,64; Ма 5,72

Знайдено: С 52,23; Н 5,20; М 4,31; 510,30; Ма 6,15

Приклади 17-19: Синтез індотрикарбоціанінових барвників із бромацетиламідними групами

Приклад 17: Тринатрій 3,3-диметил-2-(7-ІЗ,З-диметил-5-сульфонато-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум-2- іл|-4-(5-Ц6-(бромацетиламіно)гексилікарбамоїл|-4-оксапентил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)- 1-(2- сульфонатоетил)-2,3-дигідро-1 Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХІХ)

о н

Муляр о о о (о) (в) ) о

ЩІ м Оу м Ф

В ох орто ото це а) Тринатрій 3,3-диметил-2-(17-І,З-диметил-5-сульфонато-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4-(5-(6- аміногексилгексил)карбамоїл)-4-оксапентил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатоетил)-2,3-дигідро-1 Н- індол-5-сульфонат, внутрішня сіль

Синтез проводять аналогічно до прикладу Тд з 0,5г (0,55ммол) названої в заголовку прикладу 10 у сполуки й 0,15г (0,70ммол) М-рос-гександіаміну (Рішка). Реакційний продукт очищають за допомогою хроматографії (АР

СІб5-хроматографія, градієнт метанол/вода) і після ліофілізації перемішують при охолодженні льодом у суміші 2мл трифтороцтової кислоти/дмл дихлорметану протягом 15хв. Після центрифугування у вакуумі залишок розчиняють у метанолі, осаджують діетиловим ефіром і виділяють. Вихід: 0,26г блакитної твердої речовини (2295 від теоретичного). б) Три натрій 3,3-диметил-2-(7-ІЗ,З-диметил-5-сульфонато-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум-2-іл|-4-(5-(6- (бромацетиламіно)гексилІкарбамоїл)-4-оксапентил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден)-1-(2-сульфонатоетил)-2,3- дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль 0,26г (0,23ммол) названої в заголовку прикладу 18а сполуки охолоджують в Зхмл ДМФ до -20"С, змішують із 2д3мг (0,28ммол) триетиламіну й розчином 0,10г (0,46ммол) бромацетилброміду в 0,2мл диметилформаміду.

Після перемішування протягом 5год. при максимальній температурі 0О"С, осаджують додаванням діетилового ефіру й одержують продукт після переосадження із суміші диметилформамід/діетиловий ефір і висушування.

Вихід: 0,23г блакитної твердої речовини (8695 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 45,63; Н 4,87; М 4,84; 5 11,07; Ма 5,96

Знайдено: С 45,13; Н 4,66; М 4,67; 5 10,83; Ма не визначали

Приклад 18: Тринатрій 3,3-диметил-2-(7-ІЗ,З-диметил-5-сульфонато-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум-2- іл|-4-(3-І3-(бромацетиламіно)пропіл|карбамоїл)-етил)гепта-2,4,б-триєн-1-іліден-1-(2-сульфонатоетил)-2,3- дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХМ)

Н кори з я ак и о о Й о ця их С. ва ви з Ач 9 й

І Ї ча . гу їз) 9

Синтез проводять із названої в заголовку прикладу 1г сполуки (0,5г; 0,5бммол) і М-рос-пропілендіаміну аналогічно до прикладу 17. Вихід за всіма стадіями: 0,22г (3795 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 43,70; Н 4,33; М 5,23; 5 11,96; Ма 5,96 5 Знайдено: С 43,21; Н 4,14; М 5,53; 5 10,89; Ма не визначали

Приклад 19: Тринатрій З3,3-диметил-2-(2-(1-|3,3-диметил-5-сульфонато-1-(2-сульфонатоетил)-ЗН-індоліум- 2-іл|вінілен-2-(4-І3-(бромацетиламіно)пропілікарбамоїл)етил)фенокси|циклогекс-1-ен-3-Зіліден)етілідені-1-(2- сульфонатоетил)-2,3-дигідро-1Н-індол-5-сульфонат, внутрішня сіль (формула ХХ)

Нн Н а а. о в) ох в оо тв (в) ЕЯ о » о (я М - Ф 7 4 М Фе

Ше т ма а -в-7 Ма о йо о ї (в) ма

Синтез проводять із названої в заголовку прикладу 136 сполуки (0,5г; 049ммол) і М-рос-пропілендіаміну аналогічно до прикладу 17. Вихід за всіма стадіями: 0,31г (5395 від теоретичного).

Елементний аналіз: Обчислено: С 47,88; Н 4,52; М 4,65; 5 10,65; Ма 5,73

Знайдено: С 48,04; Н 4,43; М 4,69; 5 10,72; Ма 5,84

Приклади 20-23: Синтез кон'югатів з біомолекулами й фотофізична характеристика кон'югатів

Приклад 20: Маркірування В5А (альбумін бичачої сироватки) сполуками, названими в заголовках прикладів 1-16

Загальні інструкції: Розчин 5мг (0,074мкмол) ВБА (бідта Сотрапу) в 5мл фосфатного буфера (0,1- молярний Маг?НРО4/МагРОЯ4, рн 6,8) змішують у кожному випадку з 0,74мкмол сполук, названих у заголовках прикладів 1-16 (вихідні розчини для розведення 0,5мг/мл в РВ5 (фізіологічний розчин з фосфатним буфером), і інкубують протягом ЗОхв при 25"С. Очищення кон'югатів проводять за допомогою гель-хроматографії (колонка: Зерпадех 250, діаметр 1,5см, Рпаптасіа, елюент: РВ5).

Приклад 21: Маркірування В5А сполуками, названими в заголовках прикладів 17-19

Загальні інструкції: Розчин 5мг (0,074мкмол) В5А (від фірми бідта Сотрапу) в Змл фосфатного буфера (0,1-молярний боратний буфер, рН 8,5) змішують у кожному випадку з 1,10мкмол сполук, названих у заголовках прикладів 17-19 (вихідні розчини для розведення 0,5мг/мл в РВ5), і інкубують протягом 5год. при 25"С. Очищення кон'югатів проводять за допомогою гель-хроматографії (колонка: Зерпадех 250, діаметр 1,5см, Ріаптасіа, елюент: РВ5).

Приклад 22: Маркірування зсЕм антитіла АРЗО (фрагмент одиночного ланцюга) до ЕЮО-В-фібронектину сполуками, названими в заголовках прикладів 1-16.

АРЗОУ є зсЕм із С-кінцевим цистеїном й є присутній у вигляді 5-5-димеру з молярною масою близько 56,000г/мл (Си. Оріп. Огид Оівзсом. ЮОемеї. 2002 Маг; 5(2): 204-13). При відновленні дисульфідних містків утворюються два мономери з доступними 5Н-групами (молярна маса 28 00оОг/мл).

Загальні інструкції: О0,Змл розчину АРЗ39 в РВ5 (концентрація 0,93мг димеру/мл) змішують із бомкл розчину трис(карбоксіетил)уфосфіну (ТСЕР) в РВ5 (2,8мг/мл) і інкубують в атмосфері азоту протягом 1 год при 25760.

Надлишок ТСЕР відокремлюють за допомогою гель-фільтрації на МАР-5 колонці (елюент: РВ5). Кількість отриманого АРЗО-мономера (ООгвони-1,4), певне за допомогою фотометрії, становить 230-250мкг (об'єми 0,5-

О,бмл). Розчин змішують із 0,0Змкмол сполук, названих у заголовках прикладів 1-16, (вихідні розчини для розведення 0,5мг/мл в РВ5), і інкубують протягом З0хв при 25"С. Кон'югат очищають за допомогою гель- хроматографії на МАР-5 колонці (елюент: РВ5/1095 гліцерин). Імунореактивність розчину кон'югата визначають за допомогою афінної хроматографії (ЕЮО-В-фібронектин смола) (У. Іттипої. Меїй., 1999, 231, 239).

Імунореактивність отриманих кон'югатів становить 28095 (АРЗ39 перед кон'югацією 29595).

Приклад 23: Маркірування зсЕм антитіла АРЗО (фрагмент одиночного ланцюга) до ЕО-В-фібронектину сполуками, названими в заголовках прикладів 17-19

Загальні інструкції: О0,Змл розчину АРЗО в РВ5 (концентрація 0,93мг димеру/мл) змішують із 60 мкл розчину трис(карбоксіетилуфосфіну (ТСЕР) в РВ5 (2,8мг/мл) і інкубують в атмосфері азоту протягом 1год. при 25"Сб. Надлишок ТСЕР відокремлюють за допомогою гель-фільтрації на МАР-5 колонці (елюент: 5бммол боратного буфера, рН 8,5). Кількість отриманого АРЗО-мономера (ОЮгвонм-1,4) визначене за допомогою фотометрії, становить 230-250мкг (об'єми 0,5-0,6мл). Розчин змішують із 0,0бмкмол сполук, названих у заголовках прикладів 1-16, (вихідні розчини для розведення 0,5мг/мл в РВ5), і інкубують протягом 4год. при 25"С. Кон'югат очищають за допомогою гель-хроматографії на МАР-5 колонці (елюант: РВ5/1095 гліцерин).

Імунореактивність розчину кон'югата визначають за допомогою афінної хроматографії (ЕЮО-В-фібронектин смола) (9У.Іттипої. Мей., 1999, 231, 239). Імунореактивність отриманих кон'югатів становить 275956 (АРЗ39 перед кон'югацією 29590).

Фотофізична характеристика барвник-В8ВА-кон'югатів прикладів 21 й 22 і кон'югатів барвник-5сЕм антитіло прикладів 23 й 24.

Ступінь концентрації (молярне співвідношення барвник/антитіло) визначають фотометрично, грунтуючись на коефіцієнті екстинкції 75000л мл'/см-! у короткохвильовому плечі спектральної лінії (близько 690-710Онм); абсорбція антитіла (АРЗ39) визначають із ОЮгвонм--1,4; і/або абсорбція білка (В5А) визначають із ОЮгттнм -0,58.

Флюоресцентний квантовий вихід визначають за допомогою 5РЕХ Пиогоїюд (залежна від довжини хвилі чутливість калібрується лампою й детектором) відносно індоціанінового зеленого (0-0,13 у ДМСО, 9У.Спет.

Епа. Оаїйа, 1977, 22, 379, Віосопіцдаге Спет., 2001, 12, 44).

Таблиця 2

Властивості кон'югатів відповідно до винаходу

Ступінь Асорбцій Флюорес- Флюорес

Субстанція (біомолекула/зразок сполуки) концерн ний центний центний трації максимум | максимум квантовий пт (нм) вихід оК2|Конюгатз ВЗА ісполуки, названоївзаголовкуприкладує | 06 | 77/67 | 7/9 | 016 (

К1'|Конюгатз В5Аісполуки, названої взаголовкуприкладу4 | 0,8 | 767 | 792 | 02

К2ІКон'югатз ВЗА сполуки, названоїв заголовкуприкладу5 | 09 | /68 | 7/9 | 014

К16|Конюгатз ВЗА ісполуки, названої в заголовкуприкладуї! | ІД | 767 | 789.4 | 015 (

К17|Конюгатз В5Аісполуки, названої в заголовкуприкладуї2 | 09 | 766 | 790 | ол ( к19|Конюгатз В5Аісполуки, названої в заголовку прикладут4 | 1,1 | 772 | 796 | 009

К21|Конюгатз ВЗА сполуки, названоїв заголовкуприкладут9 | 08| 773 | 754 | 03

Приклад 24:

Візуалізаційні властивості кон'югатів відповідно до винаходу досліджують в умовах іп мімо після ін'єкції безшерстої миші, яка має пухлину. Із цією метою кон'югати вводять внутрішньовенно й за концентрацією в ділянці розташування пухлини спостерігають протягом 24год. після введення. Флюоресценцію субстанцій збуджують на ділянці опромінення тварин за допомогою близького інфрачервоного світла з довжиною хвилі 740О0нм, яке одержують за допомогою діодного лазера (0,5УУ вихід). Флюоресцентну радіацію виявляють за допомогою посиленої ССО камери, а флюоресцентні зображення зберігають у цифровому виді. Ефективність в умовах іп мімо кон'югатів барвників зображена на фіг.2, заснованому на прикладі.

Можна вважати, що будь-який фахівець в галузі техніки без подальшої розробки, використовуючи попередній опис, може використовувати даний винахід у найповнішому ступені. Тому наступні переважні специфічні варіанти слід тлумачити тільки як ілюстративні і як такі, що не лімітують будь-яким шляхом інший обсяг винаходу.

Повний опис(и) всіх заявок, патентів і публікацій, процитованих при цьому, включені в даний опис за допомогою посилань.

Попередні приклади можуть бути повторені з подібним успіхом при заміні загальних або специфічно описаних регентів або технічних умов за даним винаходом для їх застосування в попередніх прикладах.

З наведеного вище опису будь-який фахівець у даній галузі техніки може легко встановити істотні характеристики за даним винаходом й, без відхилення від його сутності й обсягу, може зробити різні зміни й модифікації винаходу, щоб адаптувати його до різних варіантів застосування й умов.

А

Конта 3) о А ш й " ї : те кох "ШУ ї

Ен чо пи а КК і З аб: я

ЕН Пи Окиюрдесненців 1 ї х ча й

Зк ж ! тав ще в Ов ! щі

Ме ІЗ х і

ЗУ "її їх

В п Н , Н ВІ з | Гй НЕ у : дя ; ще -Е Х з Ь с. - й о енречеініаі тить т дим

ЕЕ ОО У т ТЕ глнадкттсььитя я ; ї- «00 жо З ча ЩО - КВ) ОО в)

Канігат 15 Ї п нн нин ин нн нн сна ник щ Ї їзяяею ДО ЖЮВІЯ і ІКї В ш Ек дігуткннхує. їж їх

І 4 Н пе я нище ПЕН і , І 5-0 Ї сх і

У ї ! і

Е Е Кі в Н чі Е

У В Е А 1 1 що БВ 1 і х ї її х і ї ! р

КУ Е « І

Ко Н з і м. ние 8 Н пи и і

КЗЯ ї 1 ЕЯ з

Ка ї /й Н . х і що : КЕ да,

ЖЕ Ї І" Її

В я | Е зак «Вся а ЕХ ринний о ргогтев КОКогапрго годен ого гекавоегсттьнаяжн| ОХ

Т БО: : ; ; ; : : : : ! щ в ЗО 45а ОО в 7 ща!

Е 3 й ууячкх чи :

Довжина хек н Я ддхклдчача лучна дцнннп нин цуднентти нати нати антнтянннинтннн цк ниня ки тнннтеюктини ян кккина жк енниптжксннинтякккиннаиннникининиий

Фіг кріт? через Її год після Кі вісти ін'єкції через КЕ газ піс їн'єкі

Не І Я ото о НКИ ню

І: пт вй Х ха КН. Ще ОК - ж Пт аа

КО с АХА ще 7 УВК сов В Ох.

ЕІ Ме шщ- юф х в за а ПОП ХМ

МО Б5Х с. ОО о от ща - М

Ке ше с В ОБО о Б ПО опе ОВО ко ж ОКОМ НН КІ УКХ ШИНИ ПИШИ ня ПОПІЛ вм У

Ж З ХХ нео ПВХ З ХХ й КЗ АК, ПИШИ ППП ОТИТОВ ше «Омвьмт я ццщц цнцо нн я п« яв їм . шо НЕО ПЕдНв в, сек ХМ ХК ХХ УМО я ПАТ ЗК шо М, что о, : З ОКХ сс он Кі й ке - 5 - . осей т ї с як що Б. ще . . - Ж дув ярильоу Ж ків увісствях фа кяхкуїу через я ох нія й'єкий через же код воли ян є

ХУ т КУ шк У ше К. - К Зк ЗМ

К. "Ж СКК З о хн Б с ій Я 7 : ХХ 5 их о, «ХВ П

Коли ие КІНО ЗВ Манн нь. - УООВвя ОПО

Ве по око вх ва СО но,

ОЗ зва ПЕ я а ПОП. дово

КОХ, ОМ ОК МКК ВЕ ПЕК п о ве

В МОМ В о ХОМ а

СВ Б. при ее М нн оннппллпннС со ОО ВХ ОМ

ОКХ Я ПНІ х т УКОоо и ВН и ОН,

Я МЕ е «чу ЗЛ УК днонов», той УКХ КК ий з КК, ще "ОБО х Ше и вай я 5 і ж іє Кот . -

Фіг.

Claims (1)

1. Індотрикарбоціаніновий барвник формули (І) Кк Деу М Ко Кк, М ! ! Я Кк, ; (0) де Х означає двічі заміщений атом вуглецю, при цьому замісники вибрані з метильної, етильної, пропільної, ізопропільної й/або бутильної груп, У означає СН»АСН» або СНОАСНО-СН»,

7. означає Сі-залкіл, при цьому атоми вуглецю необов'язково заміщені О або 5, або є о. 2 Кі-Ка незалежно один від одного означають 5ОзН або Н, за умови, що принаймні три з Кі-К/а означають 5ОЗН, К5 означає -СО-МН-Ка-К»о, -МН-С5-МН-К»-Ко або -МН-СО-Ка»-Ко, у яких Ку» вибраний із групи, яка складається з нерозгалуженого Со ізалкілу, у якому С-атоми необов'язково заміщені О або 5,1 Ко вибраний із о -й є) ; -М Н й: (в) або хлорацетилу, бромацетилу, йодацетилу, хлорацетамідо-, йодацетамідо-, хлоралкілу, бромалкілу та йодалкілу, І у якій Кб й К7 означають СН або С, зв'язані між собою через триметиленову ланку, яка необов'язково може бути заміщена Сілалкілом, з утворенням необов'язково заміщеного у и-положенні Сілалкілом шестичленного кільця, або солі й сольвати цієї сполуки.

2. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 1, який відрізняється тим, що У означає СНо-СН», 7, означає Сі-залкіл, при цьому атоми вуглецю необов'язково заміщені О або 5, і в якому Ке й К7 означають СН, 1 солі й сольвати цієї сполуки.

3. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що 7 означає Сі- залкіл.

4. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що 7 означає о. і Кб й К7 кожен означає атоми С, зв'язані між собою через триметиленову ланку з утворенням шестичленного кільця.

5. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (П) в) М ще, о) МН о о, р о вон ДА АЦ М А ОН ОН (1) або солі й сольвати цієї сполуки.

6. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ПШ) р (в) М (в) МН ул о р КЗ ОН ПОДА А АЮ М А ОН ОН (ФП) або солі й сольвати цієї сполуки.

7. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ІМ) (о) в) МН (в) в) мл лис лих Ї ох р хе вон в) (в) Ди М А ОН зОЗН (М) або солі й сольвати цієї сполуки.

8. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (У) (о) Ох МН о (в) о, /9 З) вон ПОДА Ме А ЗОН ЗОН (У) або солі й сольвати цієї сполуки.

9. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (МІ) (о) а а а Мі (в) оХ ,/9 7 вон ПОД иС М А ОН ОН «УУ або солі й сольвати цієї сполуки.

10. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (УП) (о) (в) МН в) (в) М (в) о, р Ж ЗОН (в) Ди М" А ОН ОН (лу або солі й сольвати цієї сполуки.

11. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (М Ш)

(о) Ге) МН (в) о- ОХ и в он (в) ока М А вон ОН (УП або солі й сольвати цієї сполуки.

12. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ІХ) (о) о МН ит Мі (в) о- Оу и 58 вон ПДАА ААТ М А ОН ОН (у або солі й сольвати цієї сполуки.

13. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (Х) (о) (в) МН в) (в) М жи ета ил ї (в) ОХ р 7 вон шо ов М А вон вон су або солі й сольвати цієї сполуки.

14. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 2, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХІ)

(о) (в) М о о о- Оу и вон (в) ДАО М А вон вон с) або солі й сольвати цієї сполуки.

15. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 2, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХП) (о) (в) ул А, о о о- Оу и о ОН ДАО М А вОЗН вон Оса) або солі й сольвати цієї сполуки.

16. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 2, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХШ) о (о) (в) тет (в) (в) о- Оу и в вон (в) Ди М А ОН ЗОН , (ХХ) або солі й сольвати цієї сполуки.

17. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 4, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХІМ)

(в) Мн и І (в) (в) ОХ р КЗ ів) он ПО М А ОН ОН «СаУ) або солі й сольвати цієї сполуки.

18. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 4, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХУ) (о); М ит Мі (в) (в) ох рі КЗ о он овен М" А ОН ОЗН СУ) або солі й сольвати цієї сполуки.

19. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 4, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХМ) (о) М и тати ки о о о- Ох и 58 о ОН о Й орав СО А ОН ОН У або солі й сольвати цієї сполуки.

20. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 4, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХМП)

(в) МН ям (в) (в) о- Ох, 58 о вон (в) СД СО А вон вон ХМ) або солі й сольвати цієї сполуки.

21. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 3, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХМ) Мн (я це Ге) МН є) о- ОХ и 58 вон ПО АА Ме А ОН ОН з З ХУ) або солі й сольвати цієї сполуки.

22. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 2, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХІХ) в) лу МН те о о о- Оу и в вон (в) ДАТ М А ОН ОН сг) або солі й сольвати цієї сполуки.

23. Індотрикарбоціаніновий барвник за п. 4, який відрізняється тим, що відповідає наступній формулі (ХХ)

МНН ув (в) (в) о- ее о вон пОБАДАКО ее ОН он су або солі й сольвати цієї сполуки.

24. Сполука формули (І) Кк, А

Кк. х 7 Х Я Дю М Ко Кк, М ! ! к Кк, , () у якій Х означає двічі заміщений атом вуглецю, при цьому замісники вибрані з метильної, етильної, пропільної, ізопропільної й/або бутильної груп, У означає СН»АСН» або СНОАСНО-СН», 7 означає Сізалкіл, при цьому атоми вуглецю необов'язково заміщені О або 5, або є оксифенільним фрагментом о. 2 Кі-Ка незалежно один від одного означають 5ОзН або Н, за умови, що принаймні три з Кі-К/а означають 5ОЗН, Ко означає -СООН, і Ко й К7 означають СН або С, зв'язані між собою через триметиленову ланку, яка необов'язково може бути заміщена Сі-залкілом, з утворенням необов'язково заміщеного у п- положенні Сі-далкілом шестичленного кільця, або солі й сольвати цієї сполуки.

25. Спосіб одержання індотрикарбоціанінового барвника за будь-яким з пп. 1-16 або 21-23, що має наступну загальну формулу (1) Кк є А Х 7 х Кк, Повх оавй М Я Кк, М І ! я Кк, ,; 0 який відрізняється тим, що включає наступні стадії: а) одержання індолінінового похідного,

б) одержання одного або більше 4-заміщених піридинів, в) перетворення одного або більше 4-заміщених піридинів у мезо-заміщені глутакональдегіддіаніліди за допомогою реакції Цинке-Кеніга, 1 г) взаємодію сполуки, одержаної на стадії а), зі сполукою, одержаною на стадії в), та д) введення фрагменту 7-К5 до сполуки, одержаної на стадії г).

26. Спосіб одержання кон'югатів, який відрізняється тим, що включає приєднання індотрикарбоціанінового барвника за будь-яким з пп. 1-23 до біомолекули, яка містить 5Н- групу.

27. Кон'югат індотрикарбоціанінового барвника з біомолекулою, який відрізняється тим, що отриманий згідно із п. 26.

28. Кон'югат за п. 27, який відрізняється тим, що як біомолекулу включає принаймні одну біомолекулу, вибрану з пептидів, білків, ліпопротеїнів, антитіл або фрагментів антитіл, нуклеїнової кислоти, такої, як, наприклад, оліго- або полінуклеотиди із ДНК або РНК, аптамерів та РНК.

29. Кон'югат згідно із п. 28, який відрізняється тим, що білок вибраний із групи структурних білків або розчинних білків організму.

30. Кон'югат за пп. 28 або 29, який відрізняється тим, що розчинний білок є сироватковим білком, таким, як, наприклад, Н5А, В5А, яєчний альбумін, ферментом, як, наприклад, пероксидаза, або антитілом, 5сЕу фрагментом або К(аб).

31. Кон'югат за будь-яким з пп. 27-30, який відрізняється тим, що розчинний білок має спорідненість по відношенню до ЕО-В-фібронектину.

32. Кон'югат за будь-яким з пп. 27-31, який відрізняється тим, що індотрикарбоціаніновий барвник приєднаний до біомолекули через 5Н-групу, зокрема через 5Н-групу до цистеїну.

33. Діагностичний набір, який відрізняється тим, що включає індотрикарбоціаніновий барвник за будь-яким з пп. 1-23 й/або біомолекулу, яка містить 5Н-групу, разом з додатковими ад'ювантами для здійснення діагностики в умовах іл уї»о, зокрема пухлин.

34. Застосування кон'югата за будь-яким з пп. 27-31 як флюоресцентного контрастного середовища для /л уїуо діагностики пухлин.