CN108727245B - 一种水杨酸类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有式(Ⅰ)所示结构的水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子。该类化合物具有较好的水溶性，其对肿瘤细胞具有较好的靶向性和显著的抑制作用，且其对正常细胞的毒性小，在抗肿瘤药物方面具有较好的应用前景。本发明还公开了该类化合物的制备方法，本发明制备方法的可控性好，产率高，其产率为80％以上。

Description

一种水杨酸类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种靶向肿瘤细胞的水杨酸类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，是世界范围最主要的死亡原因之一，我国的恶性肿瘤发病率也一直呈上升趋势。由于传统放疗、化疗等治疗方法，都是使用杀死肿瘤细胞的基本原理，这些方法对病人的毒副作用大，易产生耐药等，最终导致肿瘤复发率高、临床治疗效果不理想。因此，探索高效低毒的抗肿瘤靶向药物，一直是科学界积极攻关并希望取得突破的重大难题。

自半个世纪前，Ras蛋白被发现以来，Ras已被深入研究并成为最为熟知的癌基因蛋白类，它们在细胞增殖、分化和凋亡等生物进程中扮演着十分重要的角色。Ras蛋白在肿瘤细胞中广泛的致瘤性突变使它成为抗肿瘤药物研究的热门靶点。在肿瘤细胞中，ras基因突变引起Ras蛋白的持续活化而发生异常Ras信号级联最终致使生物功能紊乱。水杨酸类化合物(法尼基硫代水杨酸(farnesylthiosalicylic Acid，FTS))可以竞争性阻断活性的Ras蛋白与细胞膜半乳凝素(galectin)疏水性口袋结合，发挥Ras抑制作用。国内外研究数据表明，FTS对多种肿瘤具有化学治疗作用，如胰腺癌、肺癌、肝癌等，其目前用于治疗肺癌和胰腺癌已处于Ⅱ期临床研究阶段。但是，FTS的活性较低，疏水性强，水溶性较差，使用剂量大，不易被机体吸收，治疗效果有限。因此，以FTS为先导化合物，寻找更高效安全的靶向抗肿瘤药物具有重要意义。

IR 783是一种七次甲基荧光染料，它既可被激发出近红外荧光，又可作为靶标配体，能够被癌细胞摄取并富集，而不需要通过化学偶联的途径，具有成像和靶分子的双重功能。IR 783的化学结构式如下所示：

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种靶向肿瘤细胞的水杨酸类化合物及其制备方法和应用，所述水杨酸类化合物对肿瘤细胞具有显著的靶向性和抑制效果，水溶性好。

为达到其目的，本发明所采取的技术方案为：

一种水杨酸类化合物，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：

此外，本发明的目的还在于提供式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物的制备方法。为达到其目的，本发明所采取的技术方案为：

式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物的制备方法，包括如下步骤：

将式(Ⅲ)所示化合物与IR 783溶解于溶剂中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)反应即得式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物。

优选地，所述式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物的制备方法，包括如下步骤：将式(Ⅲ)所示化合物和IR 783溶解于溶剂中，冰浴下加入N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌反应，得到式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物。优选地，所述溶剂包括甲醇和二氯甲烷。优选地，所述甲醇与二氯甲烷的体积比为3:1。优选地，所述式(Ⅲ)所示化合物与IR-783的摩尔比为1:1。优选地，所述搅拌反应2h。

优选地，所述式(Ⅲ)所示化合物采用以下方法制备而成：

将式(Ⅱ)所示化合物和2-巯基乙胺(C2H7NS)加入溶剂中，并在溶剂中加入碱性试剂，反应生成式(Ⅲ)所示化合物。优选地，所述碱性试剂为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。优选地，所述溶剂为二氯甲烷。

优选地，所述式(Ⅲ)所示化合物的制备方法为：将式(Ⅱ)所示化合物和2-巯基乙胺加入二氯甲烷中，混合均匀，冰浴下加入N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌反应，得到式(Ⅲ)所示化合物。

优选地，所述式(Ⅱ)所示化合物采用以下方法制备而成：

将法尼基硫代水杨酸(farnesylthiosalicylic Acid，FTS)、N-羟基丁二酰亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和反应溶剂混合均匀，冰浴下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下搅拌反应，得到式(Ⅱ)所示化合物。优选地，所述反应溶剂为二氯甲烷。

优选地，本发明式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物的合成总路线如下所示：

优选地，本发明式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物的合成总路线的反应温度均控制在0～40℃。

此外，本发明的目的还在于提供式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物的用途。

本发明提供了式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供了式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子在制备抗乳腺癌药物中的应用。

本发明人经过一系列研究后证实，式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物对癌细胞具有较好的抑制作用，且对正常细胞的毒性小，同时，其在水中的溶解度为FTS的80倍以上。因此，本发明式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物有望成为新一代的抗肿瘤药物。

另外，本发明的目的还在于提供一种含有式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子的药物组合物。

在下文中，为了表述方便，发明人将上述式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物称为“FTS-IR783”。

FTS结构中的羧酸基团难以直接与IR 783结构中的六元环连接，为此，本发明通过以下技术手段解决了该技术问题：本发明将FTS的羧酸基团与N-羟基丁二酰亚胺反应生成式(Ⅱ)所示的FTS活化酯后，再借助2-巯基乙胺结构中的氨基和巯基来使FTS与IR 783连接成一体，最终得到式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物，即FTS-IR783。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明所述的FTS-IR783的水溶性得到明显改善，其对肿瘤细胞具有较好的靶向性和显著的抑制作用，且其对正常细胞的毒性小，在抗肿瘤药物方面具有较好的应用前景。

2.本发明所述FTS-IR783的制备方法的可控性好，产率高，产率为80％以上。

附图说明

图1为本发明FTS-IR783的化学结构式；

图2为本发明FTS-IR783、FTS及IR 783对人乳腺癌细胞MCF7的抑制活性的曲线图；

图3为本发明FTS-IR783、FTS及IR 783对人正常乳腺细胞MCF 10A的毒性的曲线图；

图4为本发明FTS-IR783及FTS对小鼠体内乳腺癌转移的小鼠肺组织图片、肺部肿瘤数和肿瘤转移抑制率。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例而已。

值得注意的是，本发明实施例的合成反应均在0～40℃下进行。

实施例1

式(Ⅱ)所示FTS活化酯的合成：

在反应瓶中加入FTS(200.0mg，0.558mmol)、N-羟基丁二酰亚胺(77.11mg，0.669mmol)、N,N’-二环己基碳二亚胺(138.21mg，0.669mmol)和干燥的二氯甲烷(10mL)，搅拌均匀，冰浴下加入4-二甲氨基吡啶(6.8mg，0.056mmol)，恢复至室温，搅拌3小时，过滤掉反应中的固体，收集滤液并除去反应液中的有机溶剂，得到式(Ⅱ)所示FTS活化酯的粗产物。

实施例2

式(Ⅲ)所示化合物的合成：

取0.557mmol式(Ⅱ)所示FTS活化酯溶解在10mL的二氯甲烷中，冰浴下加入2.509mmol的2-巯基乙胺与3.025mmol的N,N-二异丙基乙胺，恢复至室温，反应3小时，除去反应液中的溶剂得粗产物，粗产物过硅胶柱纯化得到无色油状液体。

按常规方法对上述得到的无色油状液体进行了质谱、核磁共振氢谱分析。结果如下：

质谱(MALDI-TOF)为[m/z 419(M+H)⁺]

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δppm：7.72(d,J＝7.7Hz,1H,ArH),7.45(d,J＝7.7Hz,1H,ArH),7.38(t,J＝7.6Hz,1H,ArH),7.31(d,J＝7.6Hz,1H,ArH),5.30(t,J＝7.9Hz,1H,＝CH),5.10(q,J＝7.8Hz,2H,2x＝CH),3.69(q,J＝6.3Hz,2H,N-CH2),3.58(d,J＝7.8Hz,2H,S-CH2),2.84(dt,J＝8.3,6.4Hz,2H,S-CH2),2.03(dq,J＝28.6,7.2Hz,8H,4xCH2),1.70(s,3H,CH3),1.62(s,3H,CH3),1.61(s,3H,CH3),1.56(s,3H,CH3).

由上述鉴定结果可知，所得无色油状液体为式(Ⅲ)所示化合物。

实施例3

FTS-IR783的合成，其结构如式(Ⅰ)所示：

将0.576mmol式(Ⅲ)所示化合物和0.576mmol IR 783溶解在20mL溶剂中(所述溶剂由甲醇和二氯甲烷组成，甲醇与二氯甲的体积比为3:1)，冰浴下加入1.21mmol N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌2小时，除去反应液中的溶剂得到粗产物，粗产物过硅胶柱纯化得到深绿色固体521.1mg，经计算本实施例的合成方法的产率为80.17％。

按常规方法对上述得到的深绿色固体进行了质谱、核磁共振氢谱分析。结果如下：

质谱(MALDI-TOF)为[m/z1106.47(M-H-Na)^2-，1107.47(M-H-Na)^-]

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δppm：8.79(d,J＝13.8Hz,2H,ArH),7.64(d,J＝7.7Hz,1H,NH),7.54(d,J＝10.1Hz,1H,ArH),7.37(t,J＝7.7Hz,2H,ArH),7.32(d,J＝8.0Hz,3H,ArH),7.21(t,J＝7.2Hz,2H,ArH),7.11(d,J＝8.0Hz,2H,ArH),6.28(d,J＝14.0Hz,2H,2x＝CH),5.22(t,J＝7.7Hz,1H,＝CH),5.05(dd,J＝12.8,6.8Hz,2H,2x＝CH),4.09(brs,4H,2x N-CH₂),3.67(pd,J＝6.6,4.0Hz,2H,N-CH₂),3.48(d,J＝7.7Hz,2H,S-CH₂),3.11(m,2H,S-CH₂),2.97(s,2H,S-CH₂),2.68(brs,4H),2.05(m,10H),1.99–1.88(m,8H),1.68(s,9H),1.67(s,3H),1.59(s,3H),1.56(s,3H),1.55(s,3H),1.52(s,3H).

由上述鉴定结果可知，所得深绿色固体为FTS-IR783。

实验例

一、对上述实施例合成的FTS-IR783的溶解度进行测定

方法：称取0.36mgFTS，将其溶解在500μL的正辛醇中，超声处理5min后待其溶液变澄清再向其中加入500μL的水。称取1.11mg本发明实施例合成的FTS-IR783，将其溶解在500μL水中，待其溶液变澄清后再向其中加入500μL正辛醇。将以上两种溶液以4000rpm离心5min，再从以上两种溶液中分别取50μL的正辛醇层和50μL的水层加入到200μL的DMSO中，平行取三次，放置在96孔板中。取50μL正辛醇和50μL水分别加入到200μLDMSO中配制成空白对照组，用酶标仪在245nm条件下监测UV吸收值。

按2015年版《中华人民共和国药典》凡例溶解度测定，在25℃±2℃条件下，每隔5min强力振摇30s，30min观察溶解情况，如看不见溶质颗粒时，即认为已完全溶解。结果发现FTS在100mL的水中的极限溶解量为0.002mg；本发明的FTS-IR783在100mL的水中的极限溶解量为0.0179g。可见，本发明的FTS-IR783的溶解度是FTS的89.5倍。说明：本发明通过将FTS与IR 783相连接而结构改造后的FTS-IR783的水溶性得到明显改善。

二、检测上述实施例合成的FTS-IR783对人乳腺癌细胞MCF7的抑制作用

(1)细胞种板：取人乳腺癌细胞MCF7的对数生长期的细胞，将细胞配置成4×10⁴cell/mL密度的细胞悬液，接种到96孔板中，每孔200μL，约8000个细胞，放置到培养箱中培养过夜。

(2)药物配置：吸取培养液，分别加入以下三种化合物IR 783、FTS和FTS-IR783，浓度分别为0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、25μM、37.5μM、75μM。

(3)药物处理：轻轻吸去旧的培养基，加入含有相应浓度药物的含药培养基，每孔200μL，每个浓度平行设定6个孔板，给药处理48h。

(4)MTT处理：细胞经药物处理48h后，弃去含药培养基，加入0.5mg/mL的MTT溶液，每孔200μL。于培养箱中孵育4～6h。

(5)OD值检测：吸走孔中MTT溶液，加入DMSO 150μL/孔，在震荡仪上以300rpm转速避光震荡10min，待完全溶解后，于多功能酶标仪中用490nm波长测定其OD值。

(6)重复以上实验3次，采用Graph Pad 5.0绘制细胞生长曲线，如图2所示(图2中，FTS IR783即为“FTS-IR783”)。

从图2可看出，本发明实施例合成的FTS-IR783对人乳腺癌细胞MCF7的抑制作用明显优于IR 783和FTS；FTS-IR783的浓度较低时(10μM～20μM)，其即对人乳腺癌细胞MCF7具有较强的抑制效果。

三、检测上述实施例合成的FTS-IR783对人正常乳腺细胞MCF 10A的作用

(1)细胞种板：取人正常乳腺细胞MCF 10A的对数生长期的细胞，将细胞配置成4×10⁴cell/mL密度的细胞悬液，接种到96孔板中，每孔200μL，约8000个细胞，放置到培养箱中培养过夜。

(2)药物配置：吸取培养液，分别加入以下三种化合物IR 783、FTS和FTS-IR783，浓度分别为5μM、10μM、25μM、50μM、75μM。

(3)药物处理：轻轻吸去旧的培养基，加入含有相应浓度药物的含药培养基，每孔200μL，每个浓度平行设定6个孔板，给药处理48h。

(4)MTT处理：细胞经药物处理48h后，弃去含药培养基，加入0.5mg/mL的MTT溶液，每孔200μL。于培养箱中孵育4～6h。

(5)OD值检测：吸走孔中MTT溶液，加入DMSO 150μL/孔，在震荡仪上以300rpm转速避光震荡10min，待完全溶解后，于多功能酶标仪中用490nm波长测定其OD值。

(6)重复以上实验3次，采用Graph Pad 5.0绘制细胞生长曲线，如图3所示。

从图3可看出，FTS-IR783的浓度为75μM时，人正常乳腺细胞MCF 10A仍能保持较高活性，说明本发明实施例合成的FTS-IR783对人正常乳腺细胞MCF 10A的毒性小。

四、检测上述实施例合成的FTS-IR783对小鼠体内乳腺癌转移的影响

(1)细胞悬液制备：将鼠源乳腺癌荧光细胞4T1-luc2传代扩增，待细胞生长到融合率达到80％～90％时，消化细胞，离心后，弃上清，采用PBS清洗细胞2～3次，以清除残余的血清。将细胞混合后，加入无血清培养基重悬，计数，配置成5×10⁵cell/mL细胞悬液，将细胞置于冰上。

(2)动物接瘤：将细胞悬液一次性从小鼠尾静脉注射入体内，每只裸鼠注射1×10⁵个细胞。注射后第二天开始给药。

(3)实验分组：将小鼠随机分成5组。

(4)给药处理：模型组(溶剂)，FTS组(10mg)，紫杉醇(PTX)阳性药组(10mg)，FTS-IR783处理组(10，20mg)。PTX每三天给药一次，FTS和FTS-IR783每天1次。

(5)检测指标：测量并记录体重，每三天1次。两周后，进行小动物荧光成像检测，并拍照，待观察到小鼠肺部有明显的转移灶后，解剖小鼠。数据以Mean±SD表述，结果如图4所示。

图4中，A为小鼠肺组织图片；B为肺部肿瘤数；C为肿瘤转移抑制率。FTS表示法尼基硫代水杨酸，FTSIR783-L表示FTS-IR783低剂量(10mg)，FTSIR783-H表示FTS-IR783高剂量(20mg)，PTX表示紫杉醇。数据以Mean±SD表述。与Model组比较，*P<0.05，**P<0.01。

结果分析：从图4可看出，本发明的FTS-IR783能有效抑制肿瘤细胞的生长，且能有效抑制肿瘤的转移，FTS-IR783的给药量越大，其对肿瘤细胞的抑制效果越好，特别是高剂量FTS-IR783的对肿瘤抑制率明显优于FTS，对肿瘤的转移或抑制都有很好抗肿瘤作用，而且对正常细胞的毒性比FTS小，因此，FTS-IR783具有靶向抗肿瘤作用的效果明显。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制。尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种水杨酸类化合物，其特征在于，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：

2.一种如权利要求1所述的水杨酸类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将式(Ⅲ)所示化合物与IR 783溶解于溶剂中，加入N,N-二异丙基乙胺反应即得式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物；

3.如权利要求2所述的水杨酸类化合物的制备方法，其特征在于，在冰浴下加入N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌反应，得到式(Ⅰ)所示的水杨酸类化合物；

所述溶剂为甲醇和二氯甲烷，且所述甲醇与二氯甲烷的体积比为3:1；

所述式(Ⅲ)所示化合物与IR 783的摩尔比为1:1。

4.如权利要求2或3所述的水杨酸类化合物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅲ)所示化合物采用以下方法制备而成：

将式(Ⅱ)所示化合物和2-巯基乙胺加入溶剂中，并在溶剂中加入碱性试剂，反应生成式(Ⅲ)所示化合物；

5.如权利要求4所述的水杨酸类化合物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅲ)所示化合物的制备方法中，所述溶剂为二氯甲烷，在冰浴下加入碱性试剂，所述碱性试剂为N,N-二异丙基乙胺。

6.如权利要求4所述的水杨酸类化合物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅱ)所示化合物采用以下方法制备而成：

将法尼基硫代水杨酸、N-羟基丁二酰亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺和反应溶剂混合均匀，冰浴下加入4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌反应，得到式(Ⅱ)所示化合物。

7.如权利要求6所述的水杨酸类化合物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅱ)所示化合物的制备方法中，所述反应溶剂为二氯甲烷。

8.如权利要求1所述的水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗乳腺癌药物中的应用。

9.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，其活性成分包括权利要求1所述的水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐。

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