CN116444588A - 一种双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体提供了一种双乳糖酸‑新吲哚菁绿偶联物及其制备方法和应用。先将新吲哚菁绿和三胺化合物通过亲核取代反应偶联，得到双氨基化新吲哚菁绿，然后将双氨基化新吲哚菁绿与两个乳糖酸分子缩合成酰胺即得到双乳糖酸‑新吲哚菁绿偶联物。得到的偶联物具有较高的肝癌细胞摄取效率，更好的肝癌细胞光动力杀伤作用，更好的体内肝癌靶向性，更好的体内光动力疗效。本发明提供的双乳糖酸‑新吲哚菁绿偶联物具有更好的肝癌光动力治疗和肝癌诊断潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
新吲哚菁绿与吲哚菁绿在功能和化学结构上类似，新吲哚菁绿和吲哚菁绿有着相似的低毒性，与吲哚菁绿相比，新吲哚菁绿有更强的荧光特性和改善的稳定性，在肿瘤光热、光动力和肿瘤荧光成像方向具有潜在应用价值。但是新吲哚菁绿存在肿瘤靶向性不足的缺陷，限制了其在肿瘤治疗和成像方向的广泛应用。纳米载体材料被广泛用于小分子药物的靶向输送，但是基于纳米载体材料的载药系统通常载药量不高，并可能会引起材料相关的不良反应。
专利CN114573645A提供了三种乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物，具有高的载药量，避免了大量载体材料的使用，并表现出增强的肝癌细胞摄取和肝癌细胞光动力杀伤作用，但是这三种乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物中每个偶联物仅含有一个乳糖酸靶向分子，肝癌靶向性提高有限，且在制备过程中需要通过透析纯化，整个制备过程用时较长。因此，如何设计具有更高肝癌靶向性的乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物以及如何更加简便的合成所设计的偶联物这一关键问题亟需解决。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有肝癌高效靶向作用和良好光动力疗效的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物。
为实现该目的，本发明采用如下技术方案实现：双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物，其中，优选的式(Ⅰ)化合物化学结构式如下式所示：
本发明的另一目的是提供双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备方法，其中，式(Ⅰ)化合物的制备反应式如下式所示：
双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备方法，按照下述步骤进行：
(1)双氨基化新吲哚菁绿的制备
以新吲哚菁绿和三胺化合物为原料，以甲醇做溶剂，加热至50℃回流4小时，然后冷却至室温，旋蒸浓缩，加入至乙醚中沉淀，离心分离沉淀，乙醚洗涤，真空干燥得到双氨基化新吲哚菁绿。
其中，三胺化合物可以为：(2-氨基乙基)胺、1,3,5-三氨基苯、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基嘧啶，优选三(2-氨基乙基)胺。
新吲哚菁绿和三胺化合物摩尔比为1:2～8，乙醚用量为浓缩液体积的10倍。
(2)双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备
以双氨基化新吲哚菁绿和乳糖酸为原料，以2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)为缩合剂，以1-羟基苯并三氮唑(HOBT)为催化剂，在N,N-二甲基甲酰胺中加热至40℃反应12小时，然后冷却至室温，加入至乙醚/乙醇混合溶剂中沉淀，离心分离沉淀，乙醚洗涤，真空干燥后即可得到双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物。
其中，双氨基化新吲哚菁绿、乳糖酸、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐和1-羟基苯并三氮唑的摩尔比为1:2～10:2～10:1～2，乙醚/乙醇混合溶剂的体积比为20:1，用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的15倍。
本发明的第三个目的是提供双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物在肝癌光动力治疗和肝癌荧光成像方向的应用，偶联物用作新吲哚菁绿的肝癌高效靶向制剂。
本发明的优点在于：
本发明提供的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物比单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物具有更高的肝癌细胞摄取效率；具有优于单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的肝癌细胞光动力杀伤作用；具有优于单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的体内肝癌靶向性；具有优于单乳糖酸-新吲哚菁绿的体内光动力疗效；通过溶剂沉淀法纯化，避免了透析纯化用时较长的缺陷。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的双氨基化新吲哚菁绿的核磁共振氢谱图。
图2为本发明实施例1制备的双氨基化新吲哚菁绿的高分辨率质谱图。
图3为本发明实施例7制备的式(1)化合物的核磁共振氢谱图。
图4为本发明实施例7制备的式(1)化合物的高分辨率质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明方法作进一步说明。
实施例1：双氨基化新吲哚菁绿的制备
在50mL圆底烧瓶中加入20mL无水甲醇，加入磁子搅拌，加入新吲哚菁绿(340mg，0.4mmol)和三(2-氨基乙基)胺(292mg，2.0mmol)，加热至50℃搅拌回流4小时，然后冷却至室温，旋蒸浓缩至约2mL，加入至20mL乙醚中沉淀，8000rpm离心10分钟分离沉淀，10mL乙醚洗涤2次，真空干燥得到蓝色粉末状固体，产率90％。
通过核磁共振氢谱、高分辨率质谱和高效液相色谱对所合成的双氨基化新吲哚菁绿化新吲哚菁绿进行了表征。如图1所示，与游离新吲哚菁绿相比，双氨基化新吲哚菁绿的核磁共振氢谱中出现了三(2-氨基乙基)胺中亚甲基的特征峰(a,b)，如图2所示，双氨基化新吲哚菁绿的高分辨率质谱显示了M-Na+H特征峰(936.4602)，表明双氨基化新吲哚菁绿的成功合成。通过高效液相色谱(流动相乙腈/水＝60:40，v/v；流速1mL/min；检测波长250nm)测得双氨基化新吲哚菁绿纯度为93％。
实施例2：双氨基化新吲哚菁绿的制备
在50mL圆底烧瓶中加入20mL无水甲醇，加入磁子搅拌，加入新吲哚菁绿(340mg，0.4mmol)和三(2-氨基乙基)胺(117mg，0.8mmol)，加热至50℃搅拌回流4小时，然后冷却至室温，旋蒸浓缩至约2mL，加入至20mL乙醚中沉淀，8000rpm离心10分钟分离沉淀，10mL乙醚洗涤2次，真空干燥得到蓝色粉末状固体，产率81％。
实施例3：双氨基化新吲哚菁绿的制备
在50mL圆底烧瓶中加入20mL无水甲醇，加入磁子搅拌，加入新吲哚菁绿(340mg，0.4mmol)和三(2-氨基乙基)胺(468mg，3.2mmol)，加热至50℃搅拌回流4小时，然后冷却至室温，旋蒸浓缩至约2mL，加入至20mL乙醚中沉淀，8000rpm离心10分钟分离沉淀，10mL乙醚洗涤2次，真空干燥得到蓝色粉末状固体，产率92％。
实施例4：双氨基化新吲哚菁绿的制备
在50mL圆底烧瓶中加入20mL无水甲醇，加入磁子搅拌，加入新吲哚菁绿(340mg，0.4mmol)和1,3,5-三氨基苯(246mg，2.0mmol)，加热至50℃搅拌回流4小时，然后冷却至室温，旋蒸浓缩至约2mL，加入至20mL乙醚中沉淀，8000rpm离心10分钟分离沉淀，10mL乙醚洗涤2次，真空干燥得到蓝色粉末状固体，产率32％。
实施例5：双氨基化新吲哚菁绿的制备
在50mL圆底烧瓶中加入20mL无水甲醇，加入磁子搅拌，加入新吲哚菁绿(340mg，0.4mmol)和1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺(252mg，2.0mmol)，加热至50℃搅拌回流4小时，然后冷却至室温，旋蒸浓缩至约2mL，加入至20mL乙醚中沉淀，8000rpm离心10分钟分离沉淀，10mL乙醚洗涤2次，真空干燥得到蓝色粉末状固体，产率21％。
实施例6：双氨基化新吲哚菁绿的制备
在50mL圆底烧瓶中加入20mL无水甲醇，加入磁子搅拌，加入新吲哚菁绿(340mg，0.4mmol)和2,4,6-三氨基嘧啶(250mg，2.0mmol)，加热至50℃搅拌回流4小时，然后冷却至室温，旋蒸浓缩至约2mL，加入至20mL乙醚中沉淀，8000rpm离心10分钟分离沉淀，10mL乙醚洗涤2次，真空干燥得到蓝色粉末状固体，产率26％。
实施例7：式(Ⅰ)化合物的制备
在50mL圆底烧瓶中加入5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入磁子搅拌，加入乳糖酸(859mg，2.4mmol)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐(912mg，2.4mmol)、1-羟基苯并三氮唑(81mg，0.6mmol)和实施例1制备的双氨基化新吲哚菁绿(287mg，0.3mmol)室温下搅拌溶解，加热至40℃反应12小时，然后冷却至室温，加入至75mL乙醚/乙醇混合溶剂(20:1,v/v)中沉淀，8000rpm离心10分钟离心分离沉淀，20mL乙醚洗涤3次，真空干燥后得到蓝色粉末状固体，产率82％。
通过核磁共振氢谱、高分辨率质谱和高效液相色谱对所合成式(Ⅰ)化合物进行了表征。如图3所示，与实施例1制备的双氨基化新吲哚菁绿相比，式(Ⅰ)化合物的核磁共振氢谱中出现了乳糖酸的特征峰(c)，如图4所示，式(Ⅰ)化合物的高分辨率质谱图中出现了M-Na+H特征峰(1616.6664)，表明式(Ⅰ)化合物的成功合成。通过高效液相色谱(流动相乙腈/水＝60:40，v/v；流速1mL/min；检测波长250nm)测得式(Ⅰ)化合物的纯度为90％。
实施例8：式(Ⅰ)化合物的制备
在50mL圆底烧瓶中加入5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入磁子搅拌，加入乳糖酸(430mg，1.2mmol)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐(456mg，1.2mmol)、1-羟基苯并三氮唑(41mg，0.3mmol)和实施例1制备的双氨基化新吲哚菁绿(287mg，0.3mmol)室温下搅拌溶解，加热至40℃反应12小时，然后冷却至室温，加入至75mL乙醚/乙醇混合溶剂(20:1,v/v)中沉淀，8000rpm离心10分钟离心分离沉淀，20mL乙醚洗涤3次，真空干燥后得到蓝色粉末状固体，产率70％。
实施例9：式(Ⅰ)化合物的制备
在50mL圆底烧瓶中加入5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入磁子搅拌，加入乳糖酸(215mg，0.6mmol)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐(228mg，0.6mmol)、1-羟基苯并三氮唑(41mg，0.3mmol)和实施例1制备的双氨基化新吲哚菁绿(287mg，0.3mmol)室温下搅拌溶解，加热至40℃反应12小时，然后冷却至室温，加入至75mL乙醚/乙醇混合溶剂(20:1,v/v)中沉淀，8000rpm离心10分钟离心分离沉淀，20mL乙醚洗涤3次，真空干燥后得到蓝色粉末状固体，产率57％。
实施例10：以1,3,5-三氨基苯制备产物
在50mL圆底烧瓶中加入5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入磁子搅拌，加入乳糖酸(859mg，2.4mmol)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐(912mg，2.4mmol)、1-羟基苯并三氮唑(81mg，0.6mmol)和实施例4制备的双氨基化新吲哚菁绿(274mg，0.3mmol)室温下搅拌溶解，加热至40℃反应12小时，然后冷却至室温，加入至75mL乙醚/乙醇混合溶剂(20:1,v/v)中沉淀，8000rpm离心10分钟离心分离沉淀，20mL乙醚洗涤3次，真空干燥后得到蓝色粉末状固体，产率27％。
实施例11：肝癌细胞摄取评价
试验溶液配制：以实施例7和实施例10制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物配制2mM的二甲基亚砜溶液，同时以专利CN114573645A中活性最好的单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物(化合物3)配置20mM的二甲基亚砜溶液，以三者的二甲基就亚砜溶液为母液，以DMEM完全培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素&链霉素)为稀释液，分别配制含有20μM各化合物的试验液。
细胞摄取评价：将HepG2肝癌细胞以每孔10万个细胞的密度接种于12孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成上述配制的20μM各化合物试验液(n＝3)，于细胞培养箱中37℃条件下培养2小时、4小时和6小时，然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，加入胰酶消化细胞，然后离心分离细胞，通过流式细胞仪测定细胞摄取量。
表1.HepG2细胞摄取量
如表1所示，双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的细胞摄取均具有时间依赖性，细胞摄取量随着孵育时间的增加而增加，在相同孵育时间条件下，双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的细胞摄取量显著高于单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物，且实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的细胞摄取量高于实施例10。
实施例12：肝癌细胞光动力杀伤作用评价
试验溶液配制：以实施例11配制的20mM双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的二甲基亚砜溶液为母液，以DMEM完全培养基为稀释液，分别配制5μM、10μM、20μM和40μM各化合物的试验液。
使用磷酸盐缓冲液配置浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液，过0.22μm滤膜，得MTT溶液。
光动力杀伤作用评价：将HepG2肝癌细胞以每孔5000个细胞的密度接种于96孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成上述配制的不同浓度各化合物试验液(n＝5)，于细胞培养箱中37℃条件下培养4小时，然后用0.5W/cm2 660nm激光照射3分钟，或者不用激光照射，再于细胞培养箱中37℃条件下培养20小时，加入20μL MTT溶液，于细胞培养箱中37℃条件下培养4小时，吸去培养基，加入150μL二甲基亚砜溶解生成的紫色结晶，通过酶标仪测量各孔在490处的吸光度，将空白培养基培养的细胞存活率设置为100％，计算各试验组细胞存活率。
表2.不加激光照射条件下的细胞存活率
如表2所示，在不加激光照射条件下，双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物(5～40μM)处理后，HepG2肝癌细胞的存活率均高于80％，表明双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物均具有良好的生物相容性。
如表3所示，在0.5W/cm2 660nm激光照射条件下，双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物对HepG2肝癌细胞的杀伤均具有浓度依赖性，双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物处理的HepG2肝癌细胞的存活率显著低于单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物，且实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物处理的HepG2肝癌细胞的存活率低于实施例10，表明实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物具有更好的肝癌细胞光动力杀伤作用。
表3.在0.5W/cm2 660nm激光照射条件下的细胞存活率
实施例13：体内分布评价
试验液配置：以实施例11配制的20mM实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的二甲基亚砜溶液为母液，以磷酸盐缓冲液为稀释，配置得到1mM各化合物试验液。
体内分布评价：按文献方法(Q.N.Zhang et al.,Tumor delivery efficiencyand apoptosis enhancement by EVO nanoparticles on murie hepaticcarcinoma cellline H22,2013,8,1354-1361)建立小鼠肝癌H22皮下瘤模型。当小鼠肝癌H22皮下瘤长到体积约为80mm3时，随机将荷有肝癌H22皮下瘤的小鼠分为2个实验组，每组各3只。将上述配的各个化合物试验液以100微升的剂量分别通过尾静脉注射到相应的实验组。尾静脉注射24小时后处死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，通过小动物活体成像仪NIR-I波段进行活体外荧光成像，分析各组织器官的平均光密度。
如表4所示，实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物在肿瘤中的累积均高于其他组织器官，表明实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物均具有较好的肿瘤主动靶向性，其中实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物肝癌靶向性更好。
表4.体内分布
实施例14：体内抗肿瘤活性
当H22小鼠皮下瘤长到体积约80mm3时，随机将荷瘤小鼠分为3个实验组，每组各5只。将实施例13配置的试验溶液以100微升的剂量通过尾静脉注射到相应实验组的每只小鼠体内，空白对照组注射空白磷酸盐缓冲液。注射24小时后使用0.5W/cm2 660nm激光器照射每只小鼠肿瘤6分钟，然后正常饲养，期间每两天测量一次小鼠肿瘤体积和体重。
如表5所示，实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物加0.5W/cm2 660nm激光照射均表现出明显的肿瘤抑制作用，其中实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物比单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物具有更好的肿瘤抑制作用，表明实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的光动力疗效更好。
如表6所示，所有组小鼠在治疗期间体重均无明显变化，说明实施例7制备的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物和单乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物安全性良好。
表5.0.5W/cm2 660nm激光照射条件下各组抗肿瘤活性
表6.小鼠体重变化
Claims (8)
1.一种双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物，其特征在于，所述偶联物具有下式所示的结构：
2.一种双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：
(1)以新吲哚菁绿和三胺化合物为原料，以甲醇做溶剂，加热至50℃回流4小时，然后冷却至室温，旋蒸浓缩，加入至乙醚中沉淀，离心分离沉淀，乙醚洗涤，真空干燥得到双氨基化新吲哚菁绿；
(2)以双氨基化新吲哚菁绿和乳糖酸为原料，以2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐为缩合剂，以1-羟基苯并三氮唑为催化剂，在N,N-二甲基甲酰胺中加热至40℃反应12小时，然后冷却至室温，加入至乙醚/乙醇混合溶剂中沉淀，离心分离沉淀，乙醚洗涤，真空干燥后即可得到双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物。
3.根据权利要求2所述的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中三胺化合物为：(2-氨基乙基)胺、1,3,5-三氨基苯、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基嘧啶。
4.根据权利要求2所述的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中三胺化合物为：三(2-氨基乙基)胺。
5.根据权利要求2所述的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中新吲哚菁绿和三胺化合物的摩尔比为1:2～8，乙醚用量为浓缩液体积的10倍。
6.根据权利要求2所述的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中双氨基化新吲哚菁绿、乳糖酸、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸盐和1-羟基苯并三氮唑的摩尔比为1:2～10:2～10:1～2。
7.根据权利要求2所述的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的制备方法，其特征在于，步骤(2)混合溶剂中乙醚和乙醇的体积比为20:1，其用量为N,N-二甲基甲酰胺体积的15倍。
8.一种根据权利要求1所述的双乳糖酸-新吲哚菁绿偶联物的应用，其特征在于，所述偶联物用作新吲哚菁绿的肝癌靶向制剂。
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