CN111253411B - 一种小檗碱亚油酸缀合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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CN111253411B CN202010223471.4A CN202010223471A CN111253411B CN 111253411 B CN111253411 B CN 111253411B CN 202010223471 A CN202010223471 A CN 202010223471A CN 111253411 B CN111253411 B CN 111253411B
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Abstract

本发明公开了一种小檗碱亚油酸缀合物及其制备方法和用途，通过连接烷基的酰胺键或者连接聚乙二醇的酰胺键将小檗碱与亚油酸连接，其结构在生理条件下比现有的酯键连接的小檗碱类药物稳定，在弱酸或弱碱环境下不会水解，更容易制备成各种常规制剂，应用范围广。通过亲脂性的亚油酸的引入，能够增强小檗碱的细胞膜渗透性，从而增强其药理活性，通过诱导脂质过氧化物的形成，调节脂类代谢等途径抑制肿瘤的增长，相比传统单一靶点的抗肿瘤药物，本发明的小檗碱亚油酸缀合物的活性更好，对肿瘤细胞具有非常好的抑制作用，并且在低剂量下，即可具有较好的抗肿瘤活性。

Description

一种小檗碱亚油酸缀合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及有机化学合成和制药工程技术领域，具体说是一种小檗碱亚油酸缀合物及其制备方法和用途。
背景技术
小檗碱是从黄连中提取出的一种结构明确的天然产物，在我国广泛应用于治疗痢疾、肠胃病等疾病，具有一定的消炎、抗氧化性能和抗肿瘤活性。小檗碱作用于炎症细胞能改变肿瘤细胞生存的微环境，同时通过抗氧化作用清除肿瘤细胞周围的自由基，增强患者的免疫力，对肿瘤具有一定的辅助治疗效果。但是，由于小檗碱本身的抗肿瘤活性不高，对肿瘤细胞的治疗效果不理想，并且口服吸收效率非常低，如果口服大部分的药物会随粪便排出体外，这也限定了小檗碱的使用。因此，对小檗碱的结构进行修饰，提高其抗肿瘤活性，同时保持其消炎和抗氧化性能，对研发新型的抗肿瘤药物具有非常重要的意义。
对小檗碱的结构进行修饰，可以获得具有潜在抗肿瘤活性的先导化合物，如专利107417695A和专利108084177B保护了一系列9位和13位修饰的小檗碱衍生物，它们比小檗碱具有更好的抗肿瘤活性。但是，到目前为止，小檗碱抗肿瘤药物的研发仍然没有获得突破，其抗肿瘤活性仍需进一步提高。
另外，目前小檗碱衍生物的合成路线过于复杂，导致终产物的总产率过低，另外现有的小檗碱衍生物的结构不稳定，在弱酸或弱碱环境下即可水解，也限制了小檗碱类化合物的应用。
发明内容
为解决现有小檗碱类化合物结构不稳定，在弱酸或弱碱环境下即可分解的问题，在保证结构稳定的前提下，开发抗肿瘤活性好，对肿瘤细胞的治疗效果明显，并且口服吸收效率高的小檗碱抗肿瘤药物，本发明的目的是提供一种小檗碱亚油酸缀合物及其制备方法和用途。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种小檗碱亚油酸缀合物，结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002426882450000021
式(I)中，Linker为
Figure BDA0002426882450000022
m为1、2、3、4或5；
n为0或2。
优选的，Linker为
Figure BDA0002426882450000023
优选的，m为1或5。
本发明还包括小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，反应方程式为：
Figure BDA0002426882450000031
制备方法包括以下步骤：
①第二小檗碱衍生物的制备：
将小檗红碱溶于第一溶剂中，开启搅拌，在0～30℃下加入二溴代化合物，反应升至50～90℃，搅拌反应3～10小时，得到黄色浑浊液，停止反应，反应液降温至0～30℃，抽滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得第一小檗碱衍生物；
将所得第一小檗碱衍生物溶于第二溶剂中，搅拌下依次加入氨水和氯化铵固体，升温至50～80℃，搅拌反应10～48小时，停止反应，降温至0～30℃，加入二氯甲烷萃取，有机相减压蒸馏除去溶剂，然后用甲醇重结晶，过滤，滤饼为第二小檗碱衍生物；
小檗红碱、第一溶剂、二溴代化合物、第二溶剂、氨水、氯化铵固体、二氯甲烷、甲醇的摩尔体积比为1～2mol：5～10L：5～10mol：5～10L：1～5L：1～2mol：5～10L：8～12L；其中二溴代化合物为二溴代烷烃或二溴代聚乙二醇；
第一溶剂为乙腈或/和N,N-二甲基甲酰胺；
第二溶剂为甲醇或/和乙腈；
二溴代烷烃为1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷、1,4-二溴丁烷、1,5-二溴戊烷或1,6-二溴己烷；
二溴代聚乙二醇为2,2'-二溴二乙醚或溴代-四聚乙二醇-溴代；
氨水的质量浓度为25～28％；
②小檗碱亚油酸缀合物的制备：
将亚油酸和步骤①所得第二小檗碱衍生物溶于第三溶剂，开启搅拌，在10～60℃下加入缩合剂和有机碱，搅拌反应5～10小时，减压蒸馏除去第三溶剂，所得固体残渣经硅胶柱色谱纯化，得到小檗碱亚油酸缀合物；
硅胶柱色谱纯化时的洗脱液为二氯甲烷和甲醇由体积比10：1～3组成；
亚油酸、步骤①中小檗红碱、第三溶剂、缩合剂和有机碱的摩尔体积比为1～3mol：1～2mol：5～10L：1～3mol：0.1～0.5mol；
第三溶剂为二氯甲烷或/和N,N-二甲基甲酰胺；
缩合剂为二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
有机碱为4-二甲基氨基吡啶、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。
优选的制备方法，第一溶剂由乙腈和N,N-二甲基甲酰胺按照体积比1：2～5混合得到。
优选的制备方法，第二溶剂为甲醇和乙腈按照体积比1：4混合得到。
优选的制备方法，缩合剂为二环己基碳二亚胺。
优选的制备方法，有机碱为N,N-二异丙基乙胺。
优选的制备方法，硅胶柱色谱纯化时的洗脱液为二氯甲烷和甲醇由体积比5：1组成。
本发明还包括小檗碱亚油酸缀合物在抗肿瘤中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的小檗碱亚油酸缀合物，通过连接烷基的酰胺键或者连接聚乙二醇的酰胺键将小檗碱与亚油酸连接，其结构在生理条件下比现有的酯键连接的小檗碱类药物稳定，在弱酸或弱碱环境下不会水解，更容易制备成各种常规制剂，应用范围广。
本发明的小檗碱亚油酸缀合物中的亚油酸和小檗碱连接，相当于将具有不同靶点的化合物连接在一起，制备得到的系列衍生物为一药多靶的化合物，既有小檗碱的活性，又有亚油酸的特性：通过亲脂性的亚油酸的引入，能够增强小檗碱的细胞膜渗透性，从而增强其药理活性，通过诱导脂质过氧化物的形成，调节脂类代谢等途径抑制肿瘤的增长，相比传统单一靶点的抗肿瘤药物，本发明的小檗碱亚油酸缀合物的活性更好，对肿瘤细胞具有非常好的抑制作用，并且在低剂量下，即可具有较好的抗肿瘤活性。
本发明的小檗碱亚油酸缀合物通过对小檗碱结构进行修饰提高了其抗肿瘤活性，同时还能保持其消炎和抗氧化性能，对人肺癌细胞(A549)，人肝癌细胞(HepG2)，宫颈癌细胞(HeLa)，人乳腺癌细胞(MCF7)和大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)等多种肿瘤细胞均具有较好的抑制活性，并且在动物体内也有较好的肿瘤抑制率，效果明显优于现有的抗肿瘤药物顺铂和他莫昔芬，对研发和获得新型的抗肿瘤药物具有重要意义。
本发明的小檗碱亚油酸缀合物，的口服吸收率均远远高于小檗碱的口服吸收效率，其中AUC，Cmax等值明显优于小檗碱，解决了现有的小檗碱药物口服吸收效率低的问题，扩大了小檗碱药物的使用范围；
本发明的小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，原料容易获得，合成路线容易操作，采用常规的反应釜即可进行，终产物产率高，能够进行大规模的生产。
附图说明
图1为小檗碱亚油酸缀合物2对A549肿瘤细胞增殖的影响示意图(化合物作用浓度为0，1，2.5，5，7.5和10μM)；
图2为EdU阳性细胞比率示意图；
图3为小檗碱亚油酸缀合物2对MAPK信号通路相关蛋白p-ERK，p-p38和p-JNK表达的影响示意图(化合物作用浓度为0，1，5，和10μM)；
图4为以GAPDH蛋白为基准物，p-ERK，p-p38和p-JNK的相对密度示意图；
图5为小檗碱亚油酸缀合物2对A549肿瘤细胞迁移的影响示意图(化合物作用浓度为0，0.5，1，和2.5μM)；
图6为用小檗碱亚油酸缀合物2处理A549细胞48小时后的迁移率示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种小檗碱亚油酸缀合物及其制备方法和用途，通过以下技术方案实现：
一种小檗碱亚油酸缀合物，结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002426882450000061
Figure BDA0002426882450000071
式(I)中，Linker为
Figure BDA0002426882450000072
m为1、2、3、4或5；
n为0或2。
优选的，Linker为
Figure BDA0002426882450000073
优选的，m为1或5。
本发明还包括小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，反应方程式为：
Figure BDA0002426882450000074
Figure BDA0002426882450000081
制备方法包括以下步骤：
①第二小檗碱衍生物的制备：
将小檗红碱溶于第一溶剂中，开启搅拌，在0～30℃下加入二溴代化合物，反应升至50～90℃，搅拌反应3～10小时，得到黄色浑浊液，停止反应，反应液降温至0～30℃，抽滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得第一小檗碱衍生物；
将所得第一小檗碱衍生物溶于第二溶剂中，搅拌下依次加入氨水和氯化铵固体，升温至50～80℃，搅拌反应10～48小时，停止反应，降温至0～30℃，加入二氯甲烷萃取，有机相减压蒸馏除去溶剂，然后用甲醇重结晶，过滤，滤饼为第二小檗碱衍生物；
小檗红碱、第一溶剂、二溴代化合物、第二溶剂、氨水、氯化铵固体、二氯甲烷、甲醇的摩尔体积比为1～2mol：5～10L：5～10mol：5～10L：1～5L：1～2mol：5～10L：8～12L；其中二溴代化合物为二溴代烷烃或二溴代聚乙二醇；
第一溶剂为乙腈或/和N,N-二甲基甲酰胺；
第二溶剂为甲醇或/和乙腈；
二溴代烷烃为1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷、1,4-二溴丁烷、1,5-二溴戊烷或1,6-二溴己烷；
二溴代聚乙二醇为2,2'-二溴二乙醚或溴代-四聚乙二醇-溴代；
氨水的质量浓度为25～28％；
②小檗碱亚油酸缀合物的制备：
将亚油酸和步骤①所得第二小檗碱衍生物溶于第三溶剂，开启搅拌，在10～60℃下加入缩合剂和有机碱，搅拌反应5～10小时，减压蒸馏除去第三溶剂，所得固体残渣经硅胶柱色谱纯化，得到小檗碱亚油酸缀合物；
硅胶柱色谱纯化时的洗脱液为二氯甲烷和甲醇由体积比10：1～3组成；
亚油酸、步骤①中小檗红碱、第三溶剂、缩合剂和有机碱的摩尔体积比为1～3mol：1～2mol：5～10L：1～3mol：0.1～0.5mol；
第三溶剂为二氯甲烷或/和N,N-二甲基甲酰胺；
缩合剂为二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
有机碱为4-二甲基氨基吡啶、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。
优选的制备方法，第一溶剂由乙腈和N,N-二甲基甲酰胺按照体积比1：2～5混合得到。
优选的制备方法，第二溶剂为甲醇和乙腈按照体积比1：4混合得到。
优选的制备方法，缩合剂为二环己基碳二亚胺。
优选的制备方法，有机碱为N,N-二异丙基乙胺。
优选的制备方法，硅胶柱色谱纯化时的洗脱液为二氯甲烷和甲醇由体积比5：1组成。
本发明还包括小檗碱亚油酸缀合物在抗肿瘤中的应用。
2,2'-二溴二乙醚CAS号:5414-19-7；
溴代-四聚乙二醇-溴代CAS号31255-26-2；
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
Figure BDA0002426882450000101
9-O-(2-氨基乙基)小檗碱盐酸盐的制备：称取小檗红碱(714g，2mol)，溶于10L乙腈中。开启搅拌，在0～5℃下加入1,2-二溴乙烷(1878g，10mol)。反应液升温至70℃，恒温搅拌反应3小时，得黄色浑浊液。停止反应，反应液降至25～30℃，抽滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得黄色粉末状固体；将所得黄色粉末状固体，用5L甲醇溶解，开启搅拌，加入5L 25％的氨水，然后加入氯化铵固体(107g，2mol)。反应液升温至50℃，恒温搅拌反应48小时，此时停止反应，反应液降至室温，加入5L二氯甲烷萃取。有机相旋干，粗品用12L甲醇重结晶，过滤，得9-O-(2-氨基乙基)小檗碱盐酸盐712g，产率89％。
高分辨质谱(m/z)：理论值：C21H21N2O4 +,[M-Cl]+,365.1496；实测值：365.1491。
Figure BDA0002426882450000102
小檗碱亚油酸缀合物1的制备方法如下：称取9-O-(2-氨基乙基)小檗碱盐酸盐(400g，1mol)和亚油酸(420g，1.5mol)，加入10L二氯甲烷，搅拌溶解，在10℃温度条件下加入二环己基碳二亚胺(309g，1.5mol)和N,N-二异丙基乙胺(12.9g，0.1mol)。反应液在30℃温度条件下搅拌5小时，减压蒸馏除去有机溶剂，所得固体残渣经硅胶柱色谱纯化(洗脱液：二氯甲烷︰甲醇＝10体积︰1体积)得小檗碱亚油酸缀合物1537g，产率81％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.01(s,1H,CH＝N),8.76(s,1H,ArH),7.95(d,J＝8.8Hz,1H,ArH),7.77(s,1H,ArH),7.57(d,J＝8.8Hz,1H,ArH),7.08(s,1H,ArH),6.32(t,J＝6.4Hz,1H,NH),6.16(s,2H,-OCH2O-),5.37-5.25(m,4H,-CH＝CH-),4.80(t,J＝5.6Hz,2H,CH2),4.22(t,J＝5.6Hz,2H,CH2),3.98(s,3H,OCH3),3.82-3.77(m,2H,CH2),3.20(t,J＝5.6Hz,2H,CH2),2.71(t,J＝6.8Hz,2H,CH2),2.18(t,J＝7.6Hz,2H,CH2),2.02-1.94(m,4H,2×CH2),1.73-1.70(m,1H),1.64-1.59(m,1H),1.40-1.17(m,14H),0.84(t,J＝7.2Hz,3H,CH3)；高分辨质谱(m/z)：理论值：C39H51N2O5 +,[M-Cl]+,627.3792；实测值：627.3790。
实施例2
Figure BDA0002426882450000111
9-O-(6-氨基己基)小檗碱盐酸盐的制备：称取小檗红碱(357g，1.0mol)，溶于4L乙腈中。开启搅拌，在20～25℃下加入1,6-二溴己烷(1220g，5mol)。反应液升温至70℃，恒温搅拌反应8小时，得黄色浑浊液。停止反应，反应液降至室温，抽滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得黄色粉末状固体，将所得固体用8L甲醇溶解，开启搅拌，加入4L 25％的氨水，然后加入氯化铵固体(53g，1mol)。反应液升温至65℃，恒温搅拌反应18小时，此时停止反应，反应液降至室温，加入5L二氯甲烷萃取。有机相旋干，粗品用8L甲醇重结晶，过滤，得9-O-(6-氨基己基)小檗碱盐酸盐(388.3g，85％)。高分辨质谱(m/z)：理论值：C25H29N2O4 +,[M-Cl]+,421.2122；实测值：421.2128。
Figure BDA0002426882450000121
小檗碱亚油酸缀合物2的制备方法如下：称取9-O-(6-氨基己基)小檗碱盐酸盐(685g，1.5mol)和亚油酸(560g，2mol)，加入10LN,N-二甲基甲酰胺，搅拌溶解。在10℃温度条件下加入二环己基碳二亚胺(412g，2mol)和三乙胺(20.2g，0.2mol)。反应液在10℃温度条件下搅拌8小时，减压蒸馏除去有机溶剂，所得固体残渣经硅胶柱色谱纯化(洗脱液：二氯甲烷︰甲醇＝10体积︰3体积)得小檗碱亚油酸缀合物2884.4g，产率82％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.76(s,1H,CH＝N),8.95(s,1H,ArH),8.19(d,J＝9.2Hz,1H,ArH),7.98(d,J＝9.2Hz,1H,ArH),7.80-7.76(m,2H,ArH,NH),7.09(s,1H,ArH),6.18(s,2H,-OCH2O-),5.36-5.25(m,4H,-CH＝CH-),4.96(t,J＝7.0Hz,2H,CH2),4.28(t,J＝8.4Hz,2H,CH2),4.05(s,3H,OCH3),3.21(t,J＝6.0Hz,2H,CH2),3.07-3.02(m,2H,CH2),2.72(t,J＝6.8Hz,2H,CH2),2.04-1.97(m,4H,2×CH2),1.90-1.83(m,2H,CH2),1.74-1.70(m,1H),1.64-1.59(m,1H),1.49-1.13(m,20H),0.85(t,J＝7.2Hz,3H,CH3)；
高分辨质谱(m/z)：理论值：C43H59N2O5 +,[M-Cl]+,683.4418；实测值：683.4422。
实施例3
Figure BDA0002426882450000131
9-O-(氨基二聚乙二醇基)小檗碱盐酸盐的制备：称取小檗红碱(571g，1.6mol)，溶于6L乙腈和2LN,N-二甲基甲酰胺中。开启搅拌，在5～10℃下加入2,2'-二溴二乙醚(1856g，8mol)。反应液升温至75℃，恒温搅拌反应6小时，得黄色浑浊液。停止反应，反应液降至室温，抽滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得黄色粉末状固体，将所得固体用5L甲醇溶解，开启搅拌，加入3L 28％的氨水，然后加入氯化铵固体(80g，1.5mol)。反应液升温至50℃，恒温搅拌反应25小时，此时停止反应，反应液降至室温，加入10L二氯甲烷萃取，有机相旋干，粗品用10L甲醇重结晶，过滤，得9-O-(氨基二聚乙二醇基)小檗碱盐酸盐612.2g，产率86％。
高分辨质谱(m/z)：理论值：C23H25N2O5 +,[M-Cl]+,409.1758；实测值：409.1764。
Figure BDA0002426882450000132
小檗碱亚油酸缀合物3的制备方法如下：称取9-O-(氨基二聚乙二醇基)小檗碱盐酸盐(445g，1mol)和亚油酸(336g，1.2mol)，加入10LN,N-二甲基甲酰胺，搅拌溶解。在10～15℃条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(230g，1.2mol)，搅拌条件下加入三乙胺(10.1g，0.1mol)；反应液在25℃温度条件下搅拌10小时，减压蒸馏除去有机溶剂，所得固体残渣经硅胶柱色谱纯化(洗脱液：二氯甲烷︰甲醇＝10体积︰2体积)得小檗碱亚油酸缀合物3 579.9g，产率82％。
高分辨质谱(m/z)：理论值：C41H55N2O6 +,[M-Cl]+,671.4055；实测值：671.4050。
实施例4
Figure BDA0002426882450000141
9-O-(氨基四聚乙二醇基)小檗碱盐酸盐的制备：称取小檗红碱(714g，2mol)，溶于10L乙腈中。开启搅拌，在0～5℃下加入溴代-四聚乙二醇-溴代(3200g，10mol)。反应液升温至70℃，恒温搅拌反应6小时，得黄色浑浊液。停止反应，反应液降至室温，抽滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得黄色粉末状固体，将所得固体用5L甲醇和1L乙腈溶解，开启搅拌，加入5L 25％的氨水，然后加入氯化铵固体(80g，1.5mol)。反应液升温至60℃，恒温搅拌反应15小时，此时停止反应，反应液降至室温，加入8L二氯甲烷萃取。有机相旋干，粗品用9L甲醇重结晶，过滤，得9-O-(氨基四聚乙二醇基)小檗碱盐酸盐927.4g，产率87％。
高分辨质谱(m/z)：理论值：C27H33N2O7 +,[M-Cl]+,497.2282；实测值：497.2286。
Figure BDA0002426882450000151
小檗碱亚油酸缀合物4的制备方法如下：称取9-O-(氨基四聚乙二醇基)小檗碱盐酸盐(533g，1mol)和亚油酸(420g，1.5mol)，加入5L二氯甲烷和5LN,N-二甲基甲酰胺的混合液，搅拌溶解。在10～15℃下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(287g，1.5mol)和4-二甲氨基吡啶(12.3g，0.1mol)。反应液在60℃温度条件下搅拌10小时，减压蒸馏除去有机溶剂，所得固体残渣经硅胶柱色谱纯化(洗脱液：二氯甲烷︰甲醇＝10体积︰1体积)得小檗碱亚油酸缀合物4 723.8g，产率91％。
高分辨质谱(m/z)：理论值：C45H63N2O8 +,[M-Cl]+,759.4579；实测值：759.4575。
实施例5
Figure BDA0002426882450000152
9-O-(4-氨基丁基)小檗碱盐酸盐的制备：称取小檗红碱(571g，1.6mol)，溶于10LN,N-二甲基甲酰胺中，开启搅拌，在25～30℃下加入1,4-二溴丁烷(1382g，6.4mol)，反应液升温至50℃，恒温搅拌反应10小时，得黄色浑浊液，停止反应，反应液降至室温，抽滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得黄色粉末状固体，将所得固体用5L甲醇溶解，开启搅拌，加入3L28％的氨水，然后加入氯化铵固体(53g，1mol)，反应液升温至65℃，恒温搅拌反应10小时，停止反应，反应液降至室温，加入6L二氯甲烷萃取，有机相旋干，粗品用10L甲醇重结晶，过滤，得9-O-(4-氨基丁基)小檗碱盐酸盐603.9g，产率88％。
高分辨质谱(m/z)：理论值：C23H25N2O4 +,[M-Cl]+,393.1809；实测值：393.1812。
Figure BDA0002426882450000161
称取9-O-(4-氨基丁基)小檗碱盐酸盐(429g，1.0mol)和亚油酸(560g，2mol)，加入7LN,N-二甲基甲酰胺，2L二氯甲烷，搅拌溶解。在50℃温度条件下加入二环己基碳二亚胺(412g，2mol)和三乙胺(30.3g，0.3mol)。反应液在50℃温度条件下搅拌6小时，减压蒸馏除去有机溶剂，所得固体残渣经硅胶柱色谱纯化(洗脱液：二氯甲烷︰甲醇＝10体积︰2体积)得小檗碱亚油酸缀合物5 559.9g，产率81％。
高分辨质谱(m/z)：理论值：C41H55N2O5 +,[M-Cl]+,655.4105；实测值：655.4110。
一、体外抗肿瘤活性评价
对实施例1～5所得的小檗碱亚油酸缀合物1～5的体外抗肿瘤活性评价采用MTT法，选取的肿瘤细胞系包括：人肺癌细胞(A549)，人肝癌细胞(HepG2)，宫颈癌细胞(HeLa)，人乳腺癌细胞(MCF7)和大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)。
向96孔板内接种上述肿瘤细胞悬液，细胞浓度为105个细胞/孔，100μL/孔，置于细胞培养箱中培养24小时(37℃，5％二氧化碳)。弃去原培养基，加入新鲜的培养基，加入待测样品(包括：小檗碱，顺铂，他莫昔芬和小檗碱亚油酸缀合物1～5)，使加入后每个待测样品在培养液中的浓度包括如下7个浓度：40，20，10，5，2.5，1.25和0.625μM，每个浓度设置6个复孔。将上述96孔板置于培养箱中，继续培养12h(37℃，5％二氧化碳)，同时设置空白组，用于去除培养液本身的干扰。然后向每孔中加入20μL的MTT标准溶液(0.5mg/mL)，培养2小时，弃去原培养基，加入100μL的DMSO，振荡混匀，在酶标仪上于570nm(吸收波长)处测定每孔的吸光度OD值，并计算半数抑制浓度(IC50)。
小檗碱、顺铂、他莫昔芬和小檗碱亚油酸缀合物1～5的半数抑制浓度如表1所示。
表1.各个化合物的半数抑制浓度结果表
Figure BDA0002426882450000171
由表1的数据可以看出，小檗碱亚油酸缀合物1～5均表现出较好的肿瘤细胞抑制活性，且要好于阳性对照药顺铂和他莫昔芬，尤其是小檗碱亚油酸缀合物1～5对A549、HeLa和PC12的半数抑制浓度均未超过7μM，又如小檗碱亚油酸缀合物2和3对人肺癌细胞(A549)的半数抑制浓度均未超过4μM，远远低于比现有的药物顺铂和他莫昔芬等；小檗碱亚油酸缀合物2的活性尤其优异，对人肺癌细胞(A549)、宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF7)和大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)的半数抑制浓度仅为3μM多，对多个肿瘤细胞均具有较好的抑制活性。
二、小檗碱亚油酸缀合物2对A549肿瘤细胞增殖的影响
由于小檗碱亚油酸缀合物2表现出最好的肿瘤细胞抑制活性，我们采用细胞增殖成像分析试剂盒(EdU法，EdU试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司)测定小檗碱亚油酸缀合物2对A549肿瘤细胞增殖的影响。将A549细胞接种于96孔板，细胞浓度为105个细胞/孔，100μL/孔，孵育过夜，吸出原培养基，加入含有小檗碱亚油酸缀合物2的新鲜培养基，设置小檗碱亚油酸缀合物2的终浓度为0(CTL)，1，2.5，5，7.5和10μM，孵育24小时，吸出原培养基，加入浓度为50μM的EdU培养基，孵育2小时，细胞用4％的甲醛溶液固定20分钟，用0.5％Triton X-100处理10分钟，然后细胞用
Figure BDA0002426882450000181
染色反应液孵育30分钟，再用Hoechst33342处理30分钟，用荧光倒置显微镜拍照，用Image J软件处理图片，计算增值率，结果如图1和图2所示，小檗碱亚油酸缀合物2能够明显抑制A549肿瘤细胞增殖，由图2可以看出，在作用浓度为2.5μM时，小檗碱亚油酸缀合物2便可以高效的抑制肿瘤细胞的增殖，EdU阳性细胞比率约为14.36％±2.24，且随着小檗碱亚油酸缀合物2浓度的递增，阳性细胞比率越低。
三、小檗碱亚油酸缀合物2对MAPK信号通路相关蛋白表达的影响
通过Western Blot研究小檗碱亚油酸缀合物2对MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。将A549细胞接种于96孔板，细胞浓度为105个细胞/孔，100μL/孔，孵育过夜，吸出原培养基，加入含有小檗碱亚油酸缀合物2的新鲜培养基，设置小檗碱亚油酸缀合物2的终浓度为0(CTL)，1，5，和10μM，孵育24小时。收集细胞，用RIPA裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司)裂解30分钟，4℃下10000转离心10分钟，收集上清液，以BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度。将相同蛋白浓度的变性蛋白分散于12％的SDS凝胶电泳上，转移至硝酸纤维膜，用5％的BSA溶液封闭1小时，将硝酸纤维膜用如下一抗在4℃孵育过夜：anti-p-ERK(货号4370，Cell Signaling Technology(CST)公司)，anti-p38(货号4631S，Cell Signaling Technology(CST)公司),anti-p-JNK(货号4668S，CellSignaling Technology(CST)公司)，anti-GAPDH(货号BM3876,武汉博士德生物工程有限公司)。用TBST缓冲液洗涤三次，将硝酸纤维膜用二抗在37℃孵育1小时，采用ECL发光检测蛋白条带。
结果如图3和图4所示，小檗碱亚油酸缀合物2在浓度下(5μM)可降低p-ERK蛋白的表达量，增加p-p38和p-JNK蛋白的表达量，证明小檗碱亚油酸缀合物2通过MAPK信号通路抑制肿瘤细胞的增殖。
四、小檗碱亚油酸缀合物2对A549肿瘤细胞迁移的影响
采用伤痕愈合实验(Wound closure assay)研究小檗碱亚油酸缀合物2对A549肿瘤细胞迁移的影响。将A549细胞接种于24孔板，细胞浓度为3×105个细胞/孔，孵育24小时，用无菌吸管头将细胞水平刮掉，孔板用PBS洗涤两次，加入含10％FBS的新鲜的培养液，培养液含有不同浓度的小檗碱亚油酸缀合物2(0(CTL)，0.5，1，和2.5μM)。分别在0，24和48小时时拍摄照片，以Image-Pro Plus软件处理照片，计算细胞迁移率。结果如图5和图6所示，低浓度的小檗碱亚油酸缀合物2可以明显抑制肿瘤细胞的迁移，小檗碱亚油酸缀合物2浓度为2.5μM时，肿瘤细胞的迁移率约为8.25±3.22％。
五、体内抗肿瘤活性评价
BALB/c小鼠购自于凯学生物科技(上海)有限公司。将宫颈癌细胞(HeLa)培养、传代，于细胞浓度为105个细胞/孔时注射入小鼠右前肢(腋下)，注射量为0.2mL，室温下饲养2周，观察肿瘤生长状况，选取肿瘤直径4-5mm的小鼠，进行给药实验。各组小鼠分别给与口服小檗碱(5mg/kg)，顺铂(3mg/kg)，他莫昔芬(3mg/kg)，小檗碱亚油酸缀合物1～5(3mg/kg)，每组10只小鼠，每只小鼠每天给药一次，连续给药2周。同时设置模型组，其小鼠均为肿瘤模型小鼠，正常饲养，不给与任何药物干预。2周后，处死小鼠，取出肿瘤，并称重。肿瘤抑制率＝[(模型组平均瘤重-实验组平均瘤重)/模型组平均瘤重]×100％。结果如表2所示，小檗碱亚油酸缀合物1～5在小鼠体内均具有较好的肿瘤抑制率，且效果明显好于阳性对照药顺铂和他莫昔芬。
表2.对小鼠肿瘤的抑制情况表
Figure BDA0002426882450000201
六、口服吸收效率研究
以SD大鼠(南京君科生物工程有限公司)测定小檗碱衍生物的药代动力学数据。小鼠饲养温度23±2℃，湿度40～60％，将小鼠分为6组，设置对照组和药物组，每组6只小鼠。将小檗碱和小檗碱缀合物1～5分别悬浮于含0.7％羧甲基纤维素钠的水溶液中，给与每只老鼠口服，对照组口服小檗碱的悬浮液，药物组1～5依次分别口服小檗碱缀合物1～5的悬浮液，口服剂量均为100mg/kg，口服后分别在0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，12小时取血，取血量为每次每只老鼠0.1mL，以HPLC分析化合物的药代动力学数据。结果如表3所示。
表3.体内药代动力学数据结果表
Figure BDA0002426882450000211
由表3的结果可以看出，小檗碱亚油酸缀合物1～5的口服吸收率均远远高于小檗碱的口服吸收效率，其中AUC，Cmax等值明显优于小檗碱。

Claims (10)

1.一种小檗碱亚油酸缀合物，其特征在于，结构式如式（I）所示：
Figure 526943DEST_PATH_IMAGE001
式（I）；
式（I）中，Linker为
Figure 912925DEST_PATH_IMAGE002
或
Figure 489400DEST_PATH_IMAGE003
；
m为1、2、3、4或5；
n为0或2。
2.根据权利要求1所述的一种小檗碱亚油酸缀合物，其特征在于，Linker为
Figure 228817DEST_PATH_IMAGE004
。
3.根据权利要求1所述的一种小檗碱亚油酸缀合物，其特征在于，m为1或5。
4.权利要求1所述的小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，其特征在于，反应方程式为：
Figure 777610DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
制备方法包括以下步骤：
①第二小檗碱衍生物的制备：
将小檗红碱溶于第一溶剂中，开启搅拌，在0~30℃下加入二溴代化合物，反应升至50~90℃，搅拌反应3~10小时，得到黄色浑浊液，停止反应，反应液降温至0~30℃，抽滤，滤饼用乙腈洗涤，干燥得第一小檗碱衍生物；
将所得第一小檗碱衍生物溶于第二溶剂中，搅拌下依次加入氨水和氯化铵固体，升温至50~80℃，搅拌反应10~48小时，停止反应，降温至0~30℃，加入二氯甲烷萃取，有机相减压蒸馏除去溶剂，然后用甲醇重结晶，过滤，滤饼为第二小檗碱衍生物；
小檗红碱、第一溶剂、二溴代化合物、第二溶剂、氨水、氯化铵固体、二氯甲烷、甲醇的摩尔体积比为1~2mol：5~10L：5~10mol：5~10L：1~5L：1~2mol：5~10L：8~12L；其中二溴代化合物为二溴代烷烃或二溴代聚乙二醇；
第一溶剂为乙腈或/和N,N-二甲基甲酰胺；
第二溶剂为甲醇或/和乙腈；
二溴代烷烃为1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷、1,4-二溴丁烷、1,5-二溴戊烷或1,6-二溴己烷；
二溴代聚乙二醇为2,2'-二溴二乙醚或溴代-四聚乙二醇-溴代；
氨水的质量浓度为25~28%；
②小檗碱亚油酸缀合物的制备：
将亚油酸和步骤①所得第二小檗碱衍生物溶于第三溶剂，开启搅拌，在10~60℃下加入缩合剂和有机碱，搅拌反应5~10小时，减压蒸馏除去第三溶剂，所得固体残渣经硅胶柱色谱纯化，得到小檗碱亚油酸缀合物；
硅胶柱色谱纯化时的洗脱液为二氯甲烷和甲醇由体积比10：1~3组成；
亚油酸、步骤①中小檗红碱、第三溶剂、缩合剂和有机碱的摩尔体积比为1~3mol：1~2mol：5~10L：1~3 mol：0.1~0.5 mol；
第三溶剂为二氯甲烷或/和N,N-二甲基甲酰胺；
缩合剂为二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
有机碱为4-二甲基氨基吡啶、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。
5.根据权利要求4所述的小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，其特征在于，第一溶剂由乙腈和N,N-二甲基甲酰胺按照体积比1：2~5混合得到。
6.根据权利要求4所述的小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，其特征在于，第二溶剂为甲醇和乙腈按照体积比1：4混合得到。
7.根据权利要求4所述的小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，其特征在于，缩合剂为二环己基碳二亚胺。
8.根据权利要求4所述的小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，其特征在于，有机碱为N,N-二异丙基乙胺。
9.根据权利要求4所述的小檗碱亚油酸缀合物的制备方法，其特征在于，硅胶柱色谱纯化时的洗脱液为二氯甲烷和甲醇由体积比5：1组成。
10.权利要求1所述的小檗碱亚油酸缀合物的应用，其特征在于，在制备抗肿瘤药物中的应用。
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