CN109734692B - 一种具有egfr激酶抑制活性的白杨素亮氨酸衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有EGFR激酶抑制活性的白杨素亮氨酸衍生物，其能够特异性地阻断癌细胞分裂从而使癌细胞死亡的白杨素亮氨酸衍生物，在杀死癌细胞的同时，对人体正常细胞无灭杀活性，可以有效避免因对人体正常细胞的灭杀带来的副作用。因而可以用做抗肿瘤药物的活性成分，具有良好的开发应用前景。

Description

一种具有EGFR激酶抑制活性的白杨素亮氨酸衍生物

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体地涉及一种具有EGFR激酶抑制活性的白杨素亮氨酸衍生物、其制备方法及其用途。

背景技术

癌症发病率高，死亡率高，是严重威胁人类健康的疾病之一，据世界卫生组织统计，2012年全世界新增癌症患者超过1400万，因癌症死亡人数超过820万。化疗是目前治疗癌症最有效的方法之一。传统的化疗药物非特异性地阻断细胞分裂从而使细胞死亡，它们在杀死癌细胞的同时，也破坏了人体正常细胞的生长，带来许多毒副作用。近年来，随着全球生命科学领域的发展，癌症发生侵润和转移的过程正在逐步被阐明。如今愈多抗肿瘤药物，研发趋势转向以肿瘤细胞分化增殖相关的分子及信号通路中的某些环节为作用靶点，使肿瘤细胞发生特异性死亡，而不波及肿瘤细胞周围的正常细胞。

EGFR酪氨酸激酶是一种重要的跨膜受体，对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用，并在多种癌细胞中过度表达。目前，通过对表皮生长因子结构的分析，选择特定部位作为靶点，干扰其信号传导，已经成为开发抗癌和抗肿瘤药物的新思路(BehavBrain Funct, 2007, 3(1):31.)。

黄酮类化合物是从低毒或无毒的植物中提取，且具有多种生物活性。根据文献报道，黄酮类化合物通过介导细胞凋亡通路中的相关活性分子或蛋白，诱导肿瘤细胞凋亡（Med Res Rev, 2010, 23(4):519-534）。同时也有研究表明，黄酮类化合物具有二苯基色原酮结构，属于天然EGFR抑制剂（Eur J Med Chem, 2009, 44(5):1982-1988）。同时其结合EGFR模式与ATP类似，能够和EGFR蛋白主链活性位点以氢键的形式相结合(J Med Chem,1999, 42(6):1018-1026)。白杨素（5,7-二羟基黄酮）是一种在自然界广泛存在的黄酮化合物，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等广泛的生物活性。最近的研究表明其还可以预防顺铂引起的器官毒性和改善间歇性缺氧引起的认知缺陷和脑损伤。然而，由于其水溶性较差，肠道吸收邵，在体内容易代谢失活。为了提高其药理活性，对其进行结构修饰与改造，对于获得高效低毒的新型候选药物具有重要意义。已有文献报道合成具有优异的EGFR抑制活性的白杨素衍生物。

氨基酸是构成蛋白质的基本单元，作为人体内的重要的活性分子，参与多种生命活动。由于其自身具有一定的生物活性、低毒性及较好的生物相容性等特点被视为制备前体药物的理想载体。已有研究结果证明，一些氨基酸自身具备一定的生物活性，如精氨酸、谷酰胺酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸在分子水平参与并调控基因的表达、蛋白质的合成及信号通路的传导( Amino Acids, 2015, 47(10):2037-2063.)。且与正常细胞相比，肿瘤细胞的的代谢活动更加旺盛和频繁，对氨基酸是的需求量也更大。有研究表明，L-型氨基酸转运蛋白家族(LAT1、LAT2、LAT3、LAT4)，在细胞营养物质供给上起到重要作用，主要负责一些大分子中性氨基酸如支链氨基酸和芳香族氨基酸包括一些必须氨基酸的跨膜转运。其中LAT1在肿瘤的发展和扩散过程中扮演着重要的角色，它除了为肿瘤细胞的增殖提供了源源不断养料和能量外，还对肿瘤细胞特有的一些代谢通路起到了一定的调节作用。

史兰香等（CN108101892A）通过将白杨素与非天然氨基酸结合，并在分子中引入三氮唑，得到了一系列白杨素衍生物

，活性测试结果显示其对于人肝癌细胞HepG2和人胃癌细胞MGC-803具有良好的抑制活性；胡昆等（CN101774993A）将白杨素与含氨基的基团通过分子拼合的方法，得到了一系列白杨素含氮衍生物

，活性测试结果显示部分化合物对于HCT-116、Hela、DU-145、K562和SGC-7901细胞株具有一定的抑制活性；本发明的发明人刘运美等（CN106632193A）公开了一系列白杨素氨基酸衍生物

，部分化合物对于HepG2和MGC-803具有良好的抑制活性。

综上所述，虽然目前利用氨基酸结构修饰的白杨素已有文献报道，然而这些化合物仅提供了对部分癌细胞的抑制活性，然而并未公开其对EGFR酪氨酸激酶的靶向抑制作用，也未公开修饰后的化合物能够特异性阻断癌细胞分裂从而使癌细胞死亡，使得其在杀死癌细胞的同时，对人体正常细胞无灭杀活性。因此，开发和研究具备特异性抗癌活性的化合物仍然具备重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供了一种白杨素亮氨酸衍生物，其能够对EGFR酪氨酸激酶的靶向抑制作用；并且能够特异性地抑制癌细胞，对人体正常细胞无灭杀活性。

本发明的发明人在前期工作的基础上，为了得到具有靶向抑制的白杨素氨基酸衍生物，进行了大量的工作，设计并合成了一系列白杨素氨基酸衍生物，筛选出了与EGFR激酶能够较好地结合的化合物，并考量了化合物对细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移和人正常血管内皮细胞的毒性等因素，最终筛选得到了本发明的化合物。

本发明的第一个方面，是提供一种式I所示化合物及其药学上可接受的盐，其具有如下结构：

式I；

优选地，所述药学上可接受的盐选自：盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、对甲苯磺酸盐或水杨酸盐；

本发明的另一方面提供一种制备式I化合物的方法，其合成路线如下：

；

具体反应步骤如下：

步骤一：向白杨素（1）的丙酮溶液中加入无水碳酸钾，60℃下搅拌30 min，滴加2-溴辛酸乙酯（2）以及催化剂碘化钾，在60℃条件下继续搅拌回流，TLC检测反应完成后，经后处理得到化合物3a；

步骤二：将化合物3，氢氧化钾和甲醇依次加入到反应瓶中，60℃搅拌回流，TLC检测反应结束后，反应液过滤，调节滤液pH在2-3，置于冰水中2小时，待完全析晶后抽滤，滤饼分别用3.8 % 盐酸溶液、饱和氯化钠溶液和蒸馏水各洗涤三次，真空干燥，得到化合物4；

步骤三：在冰浴条件下将化合物4，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCl），1-羟基苯并三唑（HOBt）以及溶剂DMF加入到三颈烧瓶中，搅拌1h，加入亮氨酸甲酯盐酸盐的DMF溶液，滴加含缚酸剂N，N’-二异丙基乙胺（DIPEA）、4-二甲氨基吡咯（DMAP）的DMF溶液，冰浴下反应30 min后逐渐升至室温反应12 h，TLC检测反应结束后，将反应液投入到装有冰水的烧杯中，将烧杯放入冰水中静置，抽滤，滤饼分别用饱和氯化钠溶液、蒸馏水各洗涤三次，用硅胶色谱柱分离纯化，得到淡黄色固体I。

优选地，步骤一中白杨素与2-溴辛酸乙酯的摩尔比为：（0.5-2）:（1-2）；

步骤三中化合物4与亮氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为：（1-1.5）:（1-2）。

本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂。

本发明另一方面涉及一种式I化合物及其药学上可接受的盐或包含其药物组合物在制备抗癌药物中的用途；

优选地，所述癌症以EGFR激酶为作用靶点；更优选地，所述癌症为人乳腺癌；尤其是，人乳腺癌细胞MCF-7。

定义：

在某些实施方案中，药学上可接受的形式是药学上可接受的盐,药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。药学上可接受的盐的实例是诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、高氯酸、乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、乳酸、三氟乙酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等与化合物形成盐的形式。

“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或赋形剂不破坏公开的化合物的药理学活性，并且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时是无毒的。药物活性物质的所述介质和试剂的使用在本领域中是熟知的。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明提供了一类新的具有抗癌活性的白杨素亮氨酸衍生物，拓宽了现有抗癌化合物的范围，可作为先导化合物继续优化；

（2）本发明化合物能够与EGFR酪氨酸激酶分子结合，可以作为靶向治疗药物用于癌症的治疗；

（3）本发明化合物可以特异性地抑制癌细胞的增殖和迁移，而对人体正常细胞无灭杀活性，可以减少化疗药物对于人体的毒副作用。通过对比试验的方法，表明了本发明的化合物能够特异性地抑制癌细胞，而对人正常细胞无生理毒性，减少了成药副作用。

附图说明

图1是化合物I对MCF-7细胞集落的形成和迁移的影响。（A）不同浓度的I处理MCF-7细胞集落10天。（B）给予MCF-7细胞浓度分别为0，20，40 μM的化合物I药液处理48 h。对照组的划痕随着时间的推移而愈合，宽度减小；给药组的划痕由于药物的作用，划痕愈合的宽度宽于对照组。

图2是化合物I对MCF-7细胞的周期和凋亡的影响。（A）MCF-7细胞经过化合物I处理48 h后,MCF-7细胞周期分布发生明显变化。（B）周期结果统计柱状图。（C） I处理MCF-7细胞48h 后，I对细胞凋亡的影响。Q1:坏死细胞；Q2: 早期凋亡；Q3:晚期凋亡；Q4：正常细胞。(D)凋亡结果统计柱状图；与对照组48 h处理结果相比，“*” p＜0.05, “**” p＜0.01。

图3是采用ELISA双抗体夹心法原理。（A）利用CurveExpert 1.4软件绘制以吸光度OD值为纵坐标，相应的EGFR标准品浓度为横坐标，生成相应的标准曲线，样品的EGFR含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。样品线性回归与预期浓度相关系数R＞0.99。（B）不同浓度的化合物I处理MCF-7细胞48 h后根据试剂盒说明书进行样品收集、处理和检测。所得样品中EGFR含量统计图。与对照组48 h处理结果相比，“*” p＜0.05。

图4是利用Sybyl-XL 2.0软件将化合物I与EGFR分子(PDB ID:1M17)进行对接。并由Pymol软件生成图片。

具体实施方式

下面通过实施例来具体说明本发明的内容。在本发明中，以下实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

N-[2-(5-羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-O)辛酰基]-L-亮氨酸甲酯（化合物I）

步骤一：在搅拌条件下向白杨素（2524.4 mg）的丙酮（100 mL）溶液中加入无水碳酸钾（2073.2 mg）。60℃下搅拌30 min。用恒压滴液漏斗缓慢滴加2-溴辛酸乙酯（2724 μL）以及催化剂碘化钾（166.0 mg），在60℃条件下继续搅拌回流。TLC检测反应结束后，冷却，过滤，滤渣用少量丙酮洗涤，将得到的滤液在旋转蒸发仪上除去有机溶剂。再经过硅胶层析柱层析分离纯化（二氯甲烷/丙酮=50：1），得到化合物3。产率: 60%。m.p.100-103 ℃。¹H NMR(500 MHz, CDCl₃) δ 12.69 (d, J = 22.9 Hz, 1H), 7.85 (t, J = 10.7 Hz, 2H),7.62 – 7.41 (m, 3H), 6.66 (s, 1H), 6.47 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.32 (d, J = 1.7Hz, 1H), 4.72 (dd, J = 14.1, 8.7 Hz, 1H), 3.88 (d, J = 39.1 Hz, 1H), 3.78 (s,3H), 3.63 (s, 1H), 2.10 – 1.92 (m, 2H), 1.60 – 1.44 (m, 2H), 1.40 – 1.20 (m,6H), 0.88 (t, J = 6.5 Hz, 3H)。

步骤二：将化合物3（2075 mg），1 mol/L 氢氧化钾（12.5 mL）和甲醇50 mL依次加入到100 mL三口烧瓶中，60℃搅拌回流。TLC检测反应结束后，反应液过滤，向滤液中滴加0.5 mol/L硫酸，随着酸的加入逐渐析出淡黄色固体，调节滤液pH在2-3，置于冰水中2小时，待完全析晶后抽滤，滤饼分别用3.8 % 盐酸溶液、饱和氯化钠溶液和蒸馏水各洗三次，真空干燥，得到化合物4。产率: 90%。m.p. 100-102 ℃。¹H NMR (500 MHz, DMSO): δ 12.76(s, 1H), 8.06 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 7.64 – 7.48 (m,3H), 7.01 (s, 1H), 6.71 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.96 –4.82 (m, 1H), 2.86 (s, 1H), 2.70 (s, 1H), 1.92 – 1.77 (m, 2H), 1.47 – 1.35(m, 2H), 1.33 – 1.20 (m, 5H), 0.83 (t, J = 6.8 Hz, 2H)。

步骤三：在冰浴条件下将化合物4（396.0 mg），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDCl）（766.8 mg），1-羟基苯并三唑（HOBt）（540.6 mg）以及溶剂N, N-二甲基甲酰胺（DMF）（20 mL）加入到 50 mL三颈烧瓶中，搅拌1h，加入亮氨酸甲酯盐酸盐（363.2mg）的DMF溶液4 mL, 用恒压滴液漏斗逐滴加入含缚酸剂N，N’-二异丙基乙胺（DIPEA）（700μL）、4-二甲氨基吡咯（DMAP）（146.4 mg）的DMF溶液2 mL, 冰浴下反应30 min后逐渐升至室温反应12 h。TLC检测反应结束后，将反应液投入到装有50 mL冰水的烧杯中，将烧杯放入冰水中静置2 h，抽滤，滤饼分别用饱和氯化钠溶液、蒸馏水各洗涤三次，用硅胶色谱柱分离纯化（二氯甲烷/丙酮=50：1），得到淡黄色固体I。产率：59%。m.p. 107.0-109.5 ℃。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 7.96 – 7.87 (m, 2H), 7.64 – 7.51 (m, 3H), 6.73 (s, 1H),6.55 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 2.2 Hz, 1H),4.74 – 4.60 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 2.08 – 1.95 (m, 2H), 1.62 – 1.46 (m, 4H),1.41 – 1.25 (m, 10H), 0.84 – 0.76 (m, 6H)。

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 182.42 (s), 172.87 (s), 170.59 (s), 164.25(s), 163.13 (s), 162.39 (s), 157.80 (s), 132.05 (s), 131.03 (s), 129.17 (s),126.30 (s), 106.46 (s), 105.96 (s), 99.64 (s), 93.42 (s), 79.37 (s), 77.29(d, J = 11.6 Hz), 77.03 (s), 76.71 (s), 52.41 (s), 50.23 (s), 41.15 (s),32.78 (s), 31.57 (s), 28.85 (s), 24.83 (d, J = 12.4 Hz), 22.62 (d, J = 16.3Hz), 21.49 (s), 14.04 (s)。

对比实施例1

参照实施例1的方法，在步骤三中以丙氨酸甲酯盐酸盐代替亮氨酸甲酯盐酸盐作为反应原料，制备得到对比实施例化合物II，其结构如下：

。

实施例2 体外活性测试

细胞株选用MCF-7（人乳腺癌细胞）和HVECs（人正常血管内皮细胞）。

培养液为DMEM+10％ FBS+ 5 mL双抗

样品液配制：用DMSO（Merck）溶解后，浓度为33333.33 μmol/L

1.种板 将细胞悬液加入96孔板，每孔100 μL（每孔的细胞含量约为8000个/孔），置于37℃、5％ CO₂培养箱培育24 h；

2.加药 用培养基配制样品液梯度浓度（256，128，64，32，16，8，4，2 μmol/L），再弃去96孔板上原有培养基，加入药物不同浓度的培养基，每孔100 μL，每个浓度做5个副孔。其余孔用含有3‰的DMSO的培养基做对照，置37℃、5％培养箱培育48 h；

3.MTT法测试 取出96孔板，避光条件下每孔加入10 μL MTT (3-(4，5- 二甲基噻唑-2- 基)-2，5- 二苯基四唑翁溴化物，5 mg/mL）溶液，再放入培养箱内放置4 h；4 h后弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO溶解震荡，用MK-2全自动酶标仪测490 nm OD 值，计算半数抑制浓度IC₅₀。

由上表可以看，化合物I抗乳腺癌MCF-7活性显著，且IC₅₀优于对比实施例化合物II、阳性对照药五氟尿嘧啶5-FU和吉非替尼Gefitinib。细胞毒性实验表明，化合物I对人正常血管内皮细胞HVECs无明显毒性。尤其是本发明化合物与对比化合物II相比，二者的区别仅在于与羧酸甲酯相连的亚甲基上取代基的碳原子数不同（式I化合物为异丙基取代，对比化合物II为甲基取代），然而二者对于MCF-7的抑制活性相差很大，且式I化合物表现出对正常细胞的低毒性，取得了预料不到的技术效果。

实施例3 化合物对癌细胞集落形成和迁移影响细胞株选用MCF-7（人乳腺癌细胞）

1.培养板划线用马克笔在6孔板背后，用直尺沿着孔直径划线将每孔等分2部分。

2.铺细胞在孔中加入一定量细胞，因为不同的细胞生长快慢不同，所取的细胞量也不同。接种原则为过夜后孔内细胞基本长满无明显空隙。

3.细胞划线用200 μL的无菌Tip头垂直于细胞平面，沿着直尺在细胞层上进行划痕。

4. PBS洗涤细胞、拍照观察划痕完成后，用PBS洗细胞3次，洗去不贴壁细胞，即划线时划线的细胞。使划线后留下的间隙清晰可见。每个孔加入500 μL培养基，盖上六孔板盖，用封口膜封好间隙。而后利用可拍照的显微镜对每个孔的划痕进行拍照观察。

5.细胞培养、观察拍照完毕后，吸出培养基，加入含药培养基，放入培养箱。48 h后取出，继续利用可拍照的显微镜对每个孔的划痕进行拍照观察。

实验结果表明化合物I能够有效抑制MCF-7细胞集落的形成，从侧面证实了I能够有效抑制MCF-7细胞的增殖。同时，划痕实验表明化合物I能够有效抑制MCF-7细胞的迁移。

实施例4 通过流式细胞术研究化合物对癌细胞的周期的影响细胞株选用MCF-7（人乳腺癌细胞）

1.种板：以六孔板为单位，每孔计数五十万个细胞，放置于培养箱培养24 h

2.加药：每种细胞系设置空白对照孔一个，以0，10，20，40 μM/L的药物浓度，每个浓度设置2个副孔，药物处理时间：48 h。

3.细胞固定：处理48 h后，吸出含药培养基，冷PBS洗涤细胞表面，胰酶消化每孔细胞，将细胞悬液转至一次性15 mL离心管中，并做好每孔的对应标记。进行第一次离心，完毕后小心吸出上清液，而后加入PBS重悬细胞，进行第二次离心。离心完毕后，小心吸除上清液，加入1 mL PBS重悬细胞，并将细胞悬液转移至1.5 mL EP管中，进行第三次离心（转速1500，时间：10 min）。小心吸出上清液后，每个样品加入1 mL 70% 的4℃乙醇，重悬细胞后，盖好盖子，放入4℃环境12h。

4.细胞染色：12h后，进行第四次离心，小心吸出上清液后，加入1 mL PBS重悬细胞而后进行第五次离心，小心吸出上清液，每个样品加入0.5 mL染色剂溶液（缓冲液+PI染色液+RNase A）重悬细胞。放置于37℃环境下避光孵育30分钟后进行流式检测。

实验结果表明化合物I通过阻滞MCF-7细胞于G2/M期来抑制细胞增殖。

实施例5 通过流式细胞术研究化合物对癌细胞的凋亡的影响细胞株选用MCF-7（人乳腺癌细胞）

1.仪器参数调节：将未加药的细胞(0.5~1×106)用预冷的PBS离心洗涤2次，弃上清。加入250 mL Apoptosis positive control solution重悬，置冰上孵育30min；孵育完成后，离心，弃上清。用预冷PBS转移至1.5mL EP管中再次离心洗涤，弃上清。加入1*BindingBuffer 750mL重悬，分为三份，一份不加任何染色剂同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2.样本检测：将加药处理48 h的细胞(0.5~1×106)用预冷的PBS离心洗涤2次，弃上清。用预冷PBS转移至1.5mL EP管中再次离心洗涤，弃上清液。加入1﹡Binding Buffer250 mL 重悬，每管加入2.5 mL AnnexinV-FITC及5 mL PI。轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5 Min。1 h内FCM检测。

实验结果表明随着化合物I剂量的增加，对应的细胞凋亡比例增加（1.12%-83.36%），且呈剂量依赖性。

实施例6 通过酶联免疫吸附测定ELISA研究化合物对EGFR的抑制活性

ELISA试剂盒购于武汉博士德生物有限公司（EK0327）；细胞株选用MCF-7（人乳腺癌细胞）

1.样品处理：将计数完的细胞制成6 mL细胞悬液，用移液枪移取1 mL至6孔板中每孔，培养24h后，进行加药处理。化合物I以0，2.5，5，10，20，40 mM/L的浓度梯度分别处理对应的细胞系列。培养24h后，吸出含药培养基，PBS洗涤每孔细胞，胰酶消化每孔细胞至一次性离心管中并做好标记。离心后，倒上清，用PBS重悬底部沉淀，再次离心洗涤。洗涤后，用1mL PBS将细胞转移至1.5 mL EP管中。将样品放入-20℃冰箱中，反复冻融三次，以使细胞破坏并放出细胞内成分。离心20 min（3000转/分），仔细收集上清并做好标记。

2.标准品稀释与加样：在酶标板上设标准孔10孔，在第一孔中加入标准品100mL和标准品稀释液50 mL，混匀；从第一孔中移取100 mL至第二孔，再向第二孔中加入50 mL标准品稀释液，混匀；第二孔中取50 mL弃去，再取50 mL加入第三孔中，再向第三孔中加入50 mL标准品稀释液，混匀；从第三孔中取50 mL加入至第四孔中，再向第四孔中加入50 mL标准品稀释液，混匀；从第四孔中取50 mL加入至第五孔中，再向第五孔中加入50 mL标准品稀释液，混匀，第五孔中取50 mL弃去。（稀释后各个孔加样量都为50 mL，浓度分别为6 mg/L，4mg/L，2 mg/L，1 mg/L，0.5 mg/L）；同方法进行另外五个标准品对照孔操作。以吸光度OD值为纵坐标，相应的EGFR标准品浓度为横坐标，生成相应的标准曲线，样品的EGFR含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。样品线性回归与预期浓度相关系数R＞0.99。（附图3-A）

3.加样：分别设空白孔（不加样品及酶标试剂，其余操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 mL，再加入待测样品10 mL（样品最终稀释为5倍），加完后轻晃均匀。

4.加酶：每孔加入HRP酶标试剂50 mL，空白孔除外。

5.孵育：用封板膜封板后置于37℃温育30 min。

6.洗涤：取浓缩洗涤液1 mL+30 mL蒸馏水配制成洗涤液备用。温育完成后小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加300 mL洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色、终止和测定:每孔先加入显色剂A 50 mL，再加入显色剂B 50 mL，轻震荡混匀，37℃避光显色10 min。显色完成后，每孔加终止液50 mL，孔内颜色立即由蓝色转为黄色。以空白孔调0，450 nm波长依序测量各孔的吸光度。测定应在加终止液15分钟内进行。

根据结果可得相应化合物浓度下，对应处理细胞胞内EGFR含量 (mg/L)。

如附图3-B，统计结果表明随着化合物I的剂量增加，对应细胞内的EGFR含量减少。通过计算抑制率 (%)= [1-(A490/A490control)]×100%，可得在化合物I剂量为40 mM时候，EGFR的抑制率为67.4% 。由此可分别计算出化合物对EGFR的IC₅₀。与对照组相比，化合物I作用于MCF-7细胞内EGFR含量减少具有显著性差异。

a. 抑制率 (%)= [1-(A490/A490control)]×100%。

b. 由GraphPad Prism 6.0 软件计算得到IC₅₀。

实施例7 通过分子对接研究化合物与EGFR的连接方式

1.从PDB库或者PubMed中下载EGFR分子(PDB ID:1M17)，蛋白下载后一定确保为.pdb文件。然后在Sybyl或Chemdraw中画好所需要对接的化合物，若用Chemdraw画结构，需另存为.mol2格式文件。

2.打开Surflex-Dock准备蛋白：设置目标文件夹（默认文件夹）后，打开Surflex-Dock界面，文件夹中找到所下载的蛋白受体（PDB文件），然后将其导入Sybyl-X 2.0程序中，对EGFR蛋白删除对接不需要的水分子，为蛋白加氢和电荷，完成蛋白的准备后，生成蛋白的对接位点。

3.准备配体文件：从文件中（mol2 File）找到画好的配体结构。

4.对接：将配体结构导入到程序中后，对其进行对接。

5.利用Pymol软件（https://pymol.org/2/）进行蛋白和配体的修饰。

如附图4，对接结果表明化合物与化合物能够以氢键的形式与EGFR分子的氨基酸残基结合。化合物I能够以氢键的形式与EGFR分子的4个氨基酸残基结合。进一步证实了，化合物I较好的抑制EGFR的活性。

Claims (8)

1.一种式I所示化合物及其药学上可接受的盐，其具有如下结构：

2.根据权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐选自：盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、对甲苯磺酸盐或水杨酸盐。

3.一种制备如权利要求1所述的式I化合物的方法，其反应路线如下：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一：向白杨素(1)的丙酮溶液中加入无水碳酸钾，60℃下搅拌30min，滴加2-溴辛酸乙酯(2)以及催化剂碘化钾，在60℃条件下继续搅拌回流，TLC检测反应完成后，经后处理得到化合物3；

步骤二：将化合物3，氢氧化钾和甲醇依次加入到反应瓶中，60℃搅拌回流，TLC检测反应结束后，反应液过滤，调节滤液pH在2-3，置于冰水中2小时，待完全析晶后抽滤，滤饼分别用3.8％盐酸溶液、饱和氯化钠溶液和蒸馏水各洗涤三次，真空干燥，得到化合物4；

步骤三：在冰浴条件下将化合物4，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCl)，1-羟基苯并三唑(HOBt)以及溶剂DMF加入到三颈烧瓶中，搅拌1h，加入亮氨酸甲酯盐酸盐的DMF溶液，滴加含缚酸剂N，N’-二异丙基乙胺(DIPEA)、4-二甲氨基吡咯(DMAP)的DMF溶液，冰浴下反应30min后逐渐升至室温反应12h，TLC检测反应结束后，将反应液投入到装有冰水的烧杯中，将烧杯放入冰水中静置，抽滤，滤饼分别用饱和氯化钠溶液、蒸馏水各洗涤三次，用硅胶色谱柱分离纯化，得到淡黄色固体I。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：

步骤一中白杨素与2-溴辛酸乙酯的摩尔比为：(0.5-2):(1-2)；

步骤三中化合物4与亮氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为：(1-1.5):(1-2)。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述式I化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

7.权利要求1-2中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求6所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症以EGFR激酶为作用靶点。

8.如权利要求7所述的用途，所述癌症为人乳腺癌。

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