CN114573459B - β-榄香烯双胺基取代衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开β‑榄香烯双胺基取代衍生物及其制备方法和应用。β‑榄香烯双胺基取代衍生物结构式如式(Ⅰ)，分子实体保留了榄香烯原有的三个碳‑碳双键部分，同时又引入了两个杂原子，且整体分力量较小，使穿透血脑屏障成为可能，有望开发出新型的抗脑胶质瘤药物。

Description

β-榄香烯双胺基取代衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于β-榄香烯衍生物的制备技术领域，具体涉及β-榄香烯双胺基取代衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

榄香烯(Ele)是一类小分子挥发油类化合物，主要从温郁金的块根中提取获得。目前文献中所报道的榄香烯主要包括α-榄香烯、(±)-β-榄香烯、γ-榄香烯和δ-榄香烯，其中(-)-β-榄香烯是其发挥抗肿瘤作用的主要活性成分，具有广谱抗肿瘤活性，对多种癌症均有一定的疗效，如肝癌、乳腺癌、肺癌等。目前，以榄香烯为主要成分的多种制剂在临床上均取得了一定的抗癌疗效。

但是由于榄香烯极性小、水溶性差，生物口服利用度低，限制了其临床应用。因此，需要对榄香烯进行结构改造以获得水溶性好、生物口服利用度更高，生物活性优于榄香烯，且毒副作用小的榄香烯衍生物。

在过去的20～30年里，科研人员对β-榄香烯进行了大量的结构改造及活性研究工作。在不破坏榄香烯基本骨架及其双键的前提下，大部分的研究主要集中在β-榄香烯13-位点上的修饰，也有部分研究报道了在13和14位点上以相同取代基修饰，相对较少的报道涉及到13和14位β-榄香烯进行独特双胺化结构修饰。

脑胶质瘤是一种神经上皮来源的原发性颅内中枢神经系统的恶性肿瘤，是人类最难治疗的恶性肿瘤。大量抗肿瘤药物对治疗脑胶质瘤效果不明显，主要是因中枢神经系统与外周血循环之间存在血脑屏障(Blood–Brain Barrier,BBB)，使得许多药物无法穿过这一屏障，而不能发挥其抗脑胶质瘤活性。BBB是由彼此重叠覆盖连接紧密的内皮细胞，连续不断的基膜，以及星形细胞(星形胶质细胞，astrocyte，AS)等层层包围组成。这种多层膜性结构，构成了脑组织的防护性屏障，严格限制了血液与脑组织之间物质的交换，充分地保护了大脑免受外来化学物质的伤害。但对于存在病的大脑而言，BBB同样阻止了药物进入脑组织，进而严重影响了药物对脑部疾病的治疗。研究表明接近100％的大分子和98％的小分子药物不能够通过BBB，这就直接导致了帕唑帕尼、紫杉醇和多柔比星等常用抗肿瘤药物对脑胶质瘤疗效较差。而能够有效的穿过BBB的抗肿瘤药物在脑胶质瘤的治疗中可发挥更好的疗效，如替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)，尽管其体外抑制脑胶质瘤细胞增殖活性并不强，但在临床上已经作为抗脑胶质瘤药物广泛应用。

在研究和开发靶向药物治疗脑胶质瘤的过程中，如何提升药物穿透血脑屏障的能力仍然是亟待科学家们去解决的攻关难题。相比而言，提高药物的体外生物活性(抑制脑胶质瘤的增殖)则容易得多。因此，通过合适的方法修饰药物以提升药物穿透血脑屏障能力是药物学家多年来的研究热点。

榄香烯是从温郁金中提取出来的倍半萜化合物。它的分子量很小(MW 204)，具有广谱的抗肿瘤细胞活性。有文献表明，榄香烯本身具有穿透血脑屏障的能力，但是穿透程度仍然有限。另外有文献表明，榄香烯对脑胶质瘤有一定的抑制作用。

通过在小分子的榄香烯上连接极性的胺基取代基团，可以显著改善分子整体的类药物特性(如良好的溶解性、亲脂性、膜穿透性以及代谢稳定性和理想的药代动力学和药效学特性等)。因此，在β-榄香烯的13-位和14-位连接分子量较小的含氮胺基取代基团，形成一类结构新颖的榄香烯双胺基取代化合物。这一类全新的分子实体保留了榄香烯原有的三个碳-碳双键部分(这三个碳-碳双键是榄香烯抗肿瘤活性的主要贡献元素)，同时又引入了两个杂原子，且整体分力量较小，使穿透血脑屏障成为可能，有望开发出新型的抗脑胶质瘤药物。

发明内容

本发明的第一目的是针对现有技术的不足，提供一类β-榄香烯双胺基取代衍生物。

β-榄香烯双胺基取代衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物，所述β-榄香烯双胺基取代衍生物的结构如式(I)所示：

本发明的第二个目的是提供一种β-榄香烯双胺基取代衍生物的制备方法，具体包括步骤：

(1)将β-榄香烯A-1进行13-位与14-位的烯丙位双氯代反应得中间体β-榄香烯双氯化合物A-2；

(2)将中间体β-榄香烯双氯化合物A-2加入(Boc)₂NH A-3通过亲核取代反应连接到β-榄香烯的13-位与14-位上，得化合物A-4；

(3)将化合物A-4进行保护基去保护，得式(I)所示的β-榄香烯双胺基取代衍生物。

本发明式(I)所示化合物可通过如上的方法制得，然而该方法的条件，如反应物、溶剂、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于上面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。

本发明各合成路线的步骤(1)均可采用现有技术，如公开号为CN110683932A中公开的方法。

本发明的第三个目的是提供了所述的β-榄香烯双胺基取代衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物的用途，包括：

(a)用于制备抗肿瘤药物；或

(b)用于体外非治疗性地抑制各种肿瘤细胞株增殖。

本发明的第四个目的是提供了一种抗肿瘤药物，含有安全有效量的所述的β-榄香烯双胺基取代衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物。

作为优选，所述抗肿瘤药物还可以包括药学上可以接受的载体。

作为优选，所述肿瘤包括结肠癌、肺癌、前列腺癌、脑胶质瘤。

本发明的第五个目的是提供一种用于治疗、预防以及缓解各种癌症的药物组合物，包括安全有效量范围内的所述的β-榄香烯双胺基取代衍生物，或其各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物为主要活性成分。

作为优选，药物组合物还包括药理上可接受的盐及药理上可接受的赋形剂或载体。

“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-1000mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，如甘油；(d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠；(e)缓溶剂，如石蜡；(f)吸收加速剂，如季胺化合物；(g)润湿剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土；(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型，如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部位中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型，包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂，包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～5000mg，优选5～2000mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明提供了式(I)所示结构的β-榄香烯双胺基取代衍生物、含有式(I)化合物的药物组合物及水合物，以及这些化合物的同位素衍生物、手性异构体、变构体、不同的盐、前药和制剂等。本发明还提供了所述β-榄香烯胺基取代衍生物的制备方法、用途，以及这类化合物对各种脑胶质瘤细胞株的增殖的活性。本发明中的β-榄香烯双胺基取代衍生物有望成为抗肿瘤候选药物，治疗脑胶质瘤等。

附图说明

图1.Compound 1抑制胶质母细胞瘤细胞活力和迁移的效果。其中A为CCK-8实验检测不同浓度compound 1对C6细胞活力的抑制效果；B为CCK-8实验检测compound 1在接近IC₅₀浓度即25μM时分别作用24h和48h对C6细胞活力的抑制效果；C为细胞迁移实验检测榄香烯乳液与对照组对C6细胞迁移的抑制效果；D为榄香烯乳液与对照组对C6细胞迁移抑制效果的统计分析；E为细胞划痕实验检测compound 1对C6细胞迁移抑制效果；F为compound 1对C6细胞迁移抑制效果的统计分析；G为compound 1和榄香烯乳液对C6细胞相对抑制率的统计分析比较。

图2.Compound 1抑制胶质瘤母细胞瘤增殖。其中A为ki67(细胞增殖标志物)染色显示compound 1对胶质母细胞瘤细胞C6、U87增殖抑制效果；B、C分别为A图中compound 1和对照组细胞的ki67阳性率和细胞密度统计差异分析；D为compound 1对C6、U87细胞集落形成的抑制效果；E为细胞集落数目的统计差异分析。

图3.Compound 1阻滞胶质母细胞瘤细胞周期。其中A为Western bolt检测compound 1对细胞周期蛋白CylinB1,CylinD1表达水平的影响；B、C分别为compound 1对细胞周期蛋白CylinB1,CylinD1的表达水平差异的统计分析；D为流式细胞术检测compound 1对细胞周期的影响；E为流式细胞术检测compound 1对细胞周期影响的统计分析。

图4.Compound 1诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡。其中A为Western bolt检测compound 1对细胞凋亡蛋白Cleaved-caspase3,Bcl2,Bax表达水平的影响；B、C分别为compound 1对细胞凋亡蛋白Cleaved-caspase3,Bcl2/Bax表达水平差异的统计分析；D为免疫荧光检测compound 1对Cleaved-caspase3表达水平的影响；E、F分别为compound 1对细胞凋亡率及细胞密度影响的统计分析；G为流式细胞术检测compound 1促进细胞凋亡；H为流式细胞术检测compound 1对细胞凋亡率的统计分析。

图5.Compound 1抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移。其中A为细胞划痕实验检测compound 1对胶质母细胞瘤细胞系C6,U87细胞迁移抑制效果；B为胞划痕实验检测compound 1对胶质母细胞瘤细胞系C6,U87细胞迁移率的统计分析；C为Transwell实验检测compound 1对胶质母细胞瘤细胞系C6,U87细胞迁移抑制效果；D为Transwell实验检测compound 1对胶质母细胞瘤细胞系C6,U87迁移细胞量的统计分析；E为基质胶迁移实验检测compound 1对C6细胞迁移抑制效果；F为基质胶迁移实验检测compound 1对C6细胞迁移距离的统计分析。

图6.Compound 1抑制胶质母细胞瘤在动物体内的肿瘤生长。其中A为compound 1和对照组裸鼠荷瘤图；B为compound 1和对照组裸鼠荷瘤组织大小的统计分析；C为compound 1和对照组裸鼠荷瘤组织重量的统计分析；D为compound 1和对照组给药期间肿瘤体积变化差异的统计分析；E为compound 1和对照组给药期间裸鼠体重变化差异的统计分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：化合物1(compound 1)的制备

将β-榄香烯1-a(3.8g,18.6mmoL)溶于二氯甲烷(25mL)与冰乙酸(22mL)的混合溶液中，加入催化量的TBAF，冰浴下缓慢滴入NaClO(M＝3.0，28mL,84mmoL)水溶液，耗时5小时，滴完继续保持0℃搅拌1小时；然后再加入10％亚硫酸钠水溶液(30mL)及饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)淬灭反应。上述的反应液用乙酸乙酯萃取(3x50mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗(30mL)，并用无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，滤液在减压条件下浓缩，所得粗品经硅胶柱层析(100％石油醚)得到无色液体化合物(1-b)(1.84g,收率37％)。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.80(dd,J＝17.1,11.1Hz,1H),5.29(d,J＝1.0Hz,1H),5.18(d,J＝1.0Hz,1H),5.05(s,1H),4.98–4.90(m,3H),4.14–4.08(dd,J＝11.6,0.8Hz,1H),4.11(s,2H),3.98(dd,J＝11.6,0.8Hz,1H),2.37–2.22(m,2H),1.79–1.63(m,2H),1.59–1.43(m,4H),0.99(s,3H)。

将化合物1-b(783mg,2.88mmoL)溶于干燥DMF(10mL)，于室温下加入真空干燥的碳酸铯(2.82g,8.65mmoL)和双(叔丁氧羰基)胺1-c(2.5g,11.52mmoL),55℃搅拌10小时。减压除去DMF，剩余物用乙酸乙酯稀释(40mL)，并用水洗(20mL)，水相用乙酸乙酯反萃(20mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗(20mL)，并用无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，滤液在减压条件下浓缩后所得粗品经硅胶柱层析(13％＝乙酸乙酯：石油醚)得到无色液体化合物1-d(1.02g,收率56％)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.83(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),4.98–4.90(m,2H),4.87(d,J＝2.1Hz,2H),4.75(d,J＝2.2Hz,2H),4.18–4.16(m,2H),4.08(dd,J＝133.5,17.1Hz,2H),2.01–1.67(m,2H),1.64–1.58(m,4H),1.51–1.45(m,36H),1.29(dd,J＝21.8,3.0Hz,1H),1.02(s,3H),0.91–0.76(m,1H).

将化合物1-d(48mg,0.08mmoL)溶于干燥二氯甲烷(2mL)。于0℃下加入三氟乙酸(0.5mL,6.7mmoL),逐渐升至室温搅拌3小时。减压除去N,N-二甲基甲酰胺，再用乙酸乙酯稀释后萃取(10mL)，用饱和碳酸钾溶液(2mL)洗涤，水层反萃一次(5mL)，合并有机相，饱和食盐水洗(2mL)，分出有机相，无水硫酸钠干燥。过滤浓缩后抽干后得黄色液体化合物1(18mg,收率100％)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ5.81(dd,J＝17.5,10.9Hz,1H),5.08(d,J＝1.8Hz,1H),4.94–4.89(m,4H),,4.85(s,1H),3.28(d,J＝1.3Hz,2H),3.27–3.11(dd,J＝43.2,15.8Hz,2H),2.08–2.06(m,2H),1.76–1.39(m,4H),1.29(s,2H),1.03(s,3H).

体外抗肿瘤活性评价

1.实验设备与试剂

1.1仪器

生物安全柜(上海百基生物科技有限公司)、恒温二氧化碳培养箱(THERMO)、酶联免疫分析仪(Spark)、倒置显微镜(Nikon)、移液枪一套(eppendorf)和离心机(beckmancoulter)。

1.2试剂

DMEM(浙江森瑞生物科技有限公司)、RPMI 1640(浙江森瑞生物科技有限公司)、McCoy’S 5A(浙江森瑞生物科技有限公司)、Fatal Bovine Serum(BI)、PBS(浙江森瑞生物科技有限公司)、Trypsin(浙江森瑞生物科技有限公司)、DMSO(Coolaber)和CCK-8(Coolaber)。

1.3细胞株

大鼠胶质瘤细胞(C6)、人脑胶质瘤细胞(U87)。

2.肿瘤细胞增殖抑制实验

2.1实验准备

①实验细胞株的培养

将冻存的细胞从-80℃低温冰箱取出，迅速融化弃除冻存液中的DMSO，再用10％FBS的DMEM细胞培养基重悬，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

②药物母液的配制

取榄香烯衍生物原料药，用DMSO溶解配制成一定浓度的母液，再取适量体积用培养基稀释成相应的工作液。

2.2实验方法

实施例2：

(1)CCK-8实验

①将C6、U87细胞消化、计数，配制细胞悬液，在96孔板中加入细胞悬液，使细胞浓度为每孔5000个/100μL。

②将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，弃去细胞培养液，用含1％FBS的培养液稀释药物至所需工作浓度，每孔加入100μL相应的含不同药物浓度的细胞培养液，并设置阴性对照组，加药后继续培养24h或48h。

③将细胞进行CCK8染色，步骤如下：每孔加入10μL的CCK8溶液，在培养箱中孵育1-4h，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。按下列公式计算细胞存活率：

细胞存活率(100％)＝[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]x100％。

按照上述方法，得出compound 1(即上面的化合物1)的IC₅₀值。由于β-榄香烯乳剂组对照孔吸光度值较大，无法通过CCK8实验比较其与榄香烯衍生物的存活率差异。因此使用细胞划痕实验比较β-榄香烯和compound 1的作用效果，结果表明compound 1在更低IC₅₀值时，抑制胶质瘤细胞迁移的效果更好。

(2)细胞划痕实验

①将细胞消化，配制细胞悬液，在6孔板中加入细胞悬液。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养使细胞贴壁生长。

②待细胞密度为90％-100％时，在6孔板中划十字，并用PBS洗去漂浮细胞，拍照记录0h的划痕面积。

③用细胞培养基稀释药物，加入划痕细胞中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，拍照记录24h的划痕面积。

④统计细胞迁移率(或伤口愈合百分比)＝24h迁移面积(0h划痕面积-24h划痕面积)/0h划痕面积。

实施例3：

(1)ki67染色实验

①将细胞消化、计数，配制细胞悬液，在铺有玻片的12孔板中加入细胞悬液，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，吸取培养基，加入含1％FBS的细胞培养基及用培养基稀释的药物，继续培养24h。

②用4％多聚甲醛固定细胞10min，PBS漂洗后，用0.3％的Triton-X100破膜，5％BSA封闭，加入兔抗ki67一抗，孵育过夜。

③PBS漂洗后，加入荧光标记二抗，避光孵育2h。

④用DAPI染细胞核。

⑤用封片剂封片。

⑥统计分析ki67阳性率和细胞密度。

(2)细胞克隆实验

①将细胞消化、计数，配制成细胞悬液，以1000个细胞/孔加入到6孔板中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，吸取培养基，加入含1％FBS的细胞培养基及用培养基稀释的药物，继续培养一周。

②用4％多聚甲醛固定30min。

③加入0.1％结晶紫染色30min，用0.01M PBS漂洗后晾干。

④拍照计数并统计分析。

实施例4：

(1)Western bolt实验

①使用预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞30min。

②用BCA定量试剂盒对蛋白浓度进行定量，加入加载缓冲液，煮沸10min。

③用8-12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质样品并转移到硝酸纤维素膜。

④5％脱脂牛奶封闭1h，加入一抗，4℃孵育过夜。

⑤用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育1h。TBST漂洗后，用ECL检测试剂盒检测蛋白质信号。

⑥统计分析。

(2)流式细胞周期实验：

①将细胞消化、计数，配制成细胞悬液，将细胞悬液分为1×106个/管。

②200g离心5min，弃上清，用l mL 0.01M PBS重悬细胞，离心，弃上清液。

③沉淀细胞用500μL solutionA和5μL solution B重悬，37℃孵育30min。

④流式细胞仪检测记录数据，并统计分析。

实施例5：

Western bolt实验过程如实施例3中的步骤(1)。

免疫荧光实验过程如实施例2中的步骤(1)。

流式细胞凋亡实验过程如下：

①将细胞消化、计数，配制成细胞悬液，将细胞悬液分为1×10⁶个/管。

②200g离心5min，弃上清，用l mL 0.01M PBS重悬细胞，离心，弃上清液。

③沉淀细胞用500μl Binding Buffer重悬细胞，加3.5μL FITC和5μLPI染液染色，室温避光孵育5min。

④流式细胞仪检测记录数据，并统计分析。

实施例6：

细胞划痕实验过程同实施例2(2)。

Transwell实验过程如下：

①将细胞消化、计数，配制成细胞悬液，在Transwell小室上室中加入2000个细胞，无血清培养基培养，下室为含10％FBS的DMEM培养基。

②分别在上室中加入一定量的compound 1和对照溶剂，培养24h后

③4％多聚甲醛固定30min，0.1％的结晶紫染色30min，用并用棉签擦拭未迁移的细胞。

④拍照计数并统计分析。

基质胶迁移实验

①将细胞消化后配制成密度较高的细胞悬液，取20μL细胞悬液滴于细胞培养皿中立即倒扣，使细胞集聚，在37℃、5％CO₂培养箱中培养6h。

②吸取集聚的细胞悬液加入到铺有matrigel基质胶涂布的载玻片的细胞培养皿中，对照组和实验组分别加入对照溶剂和compound 1，继续培养48h。

③拍照，统计分析。

实施例7：体内抗肿瘤活性评价

(1)裸鼠荷瘤动物模型建立

①将C6细胞消化、计数，配制成细胞悬液，并用0.01M PBS洗涤去除培养基残留的血清。

②约6周的雄性BALB/c裸鼠随机分为两组，100x10⁴个细胞/只接种于皮下。

(2)裸鼠体内实验

①待瘤组织长至约100mm³时，隔天腹腔注射25mg/kg compound 1及对照品，并于给药前称重。

②待瘤组织长至约1000mm³时，停止给药。

③将裸鼠麻醉后，断颈处死。

④取出瘤组织，拍照并统计分析。

实验结果

(1)化合物1(compound 1)抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移效果最好，且具有更低的IC₅₀值。

多个β-榄香烯衍生物的CCK-8实验结果显示compound 1具有更低的IC₅₀值，进一步运用细胞划痕实验验证了compound 1抑制细胞迁移的效果最佳，因次，选取compound 1作为本发明的研究对象。

图1可知compound 1抑制胶质母细胞瘤细胞迁移的效果最好且具有更低的IC₅₀值。

(2)Compound 1抑制胶质母细胞瘤的增殖

按上述免疫荧光技术、细胞集落形成实验证明了化合物1(compound 1)明显抑制胶质母细胞瘤的增殖。图2是compound 1对肿瘤细胞抑制剂率的影响，A图为ki67(细胞增殖的标志物)染色，B、C图分别统计了A图中实验组和对照组ki67的阳性率和细胞密度差异，D图为细胞集落形成实验，E图为细胞克隆数目的统计差异分析。

(3)化合物1(compound 1)使胶质母细胞瘤细胞周期阻滞于S期

运用Western blot(图A)和流式细胞术(图D)进行验证，图3结果表明，Compound 1抑制周期蛋白CyclinD1、CyclinB1的表达，并使细胞周期阻滞在S期。

(4)化合物1(compound 1)诱导细胞周期凋亡

图4 Compound 1诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡结果，用Westernblot(图A)、免疫荧光染色(图D)、流式细胞术(图G)进行验证。实验结果显示与对照组相比，compound 1处理组的凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达量显著升高，Bcl-2/Bax比值降低；细胞凋亡率显著升高，以上结果表明compound 1可诱导细胞凋亡。

(5)化合物1(compound 1)抑制胶质母细胞瘤的迁移

图5 Compound 1抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移结果，以细胞划痕实验(图A)，transwell实验(图C)和基质胶迁移实验(图E)，证实了compound 1显著抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移。

(6)化合物1(compound 1)抑制胶质母细胞瘤在裸鼠体内的生长

图6 Compound 1抑制胶质母细胞瘤在动物体内的肿瘤生长结果，为了验证compound 1是否抑制胶质瘤在体内的生长，构建了裸鼠皮下成瘤模型，结果显示与对照组相比，compound 1治疗组的肿瘤组织体积和重量均显著降低，表明compound 1可抑制胶质母细胞瘤在动物体内的生长。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.β-榄香烯双胺基取代衍生物或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于：

用于制备抗脑胶质瘤药物；

所述β-榄香烯双胺基取代衍生物的结构如式（I）所示：

（I）。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述β-榄香烯双胺基取代衍生物的制备方法包括以下步骤：

。

3.一种抗脑胶质瘤药物，其特征在于，含有安全有效量的β-榄香烯双胺基取代衍生物或其药学上可接受的盐；所述β-榄香烯双胺基取代衍生物的结构如式（I）所示：

（I）。

4.根据权利要求3所述的抗脑胶质瘤药物，其特征在于，还包括药学上可以接受的载体。

5.一种用于治疗、预防以及缓解脑胶质瘤的药物组合物，其特征在于，β-榄香烯双胺基取代衍生物或其药学上可接受的无机盐或有机盐为主要活性成分；所述β-榄香烯双胺基取代衍生物的结构如式（I）所示：

（I）。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，还包括药理上可接受的盐及药理上可接受的赋形剂或载体。