CN113234116B

CN113234116B - 一种雷公藤红素衍生物及其制备方法和医用用途

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Publication number: CN113234116B
Application number: CN202110102947.3A
Authority: CN
Inventors: 沈庆坤; 全哲山; 尚凡凡; 金学军
Original assignee: Yanbian University
Current assignee: Yanbian University
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN113234116A

Abstract

本发明公开一种雷公藤红素衍生物及其制备方法和医用用途，提供了一种新的化合物‑‑雷公藤红素衍生物，可抑制细胞水平HIF‑1α表达，其IC50值仅为0.05μM，活性较雷公藤红素相比提高约5倍，且毒性降低22倍；异种移植小鼠研究结果表明，本发明化合物能显著抑制裸鼠的肿瘤生长，且无明显毒副作用；本发明化合物的制备方法具有原料来源丰富，反应条件温和，反应过程操作简单，所用试剂便宜易得的优点。

Description

一种雷公藤红素衍生物及其制备方法和医用用途

技术领域

本发明公开一种雷公藤红素衍生物，为一种新的化合物；本发明同时还提供了雷公藤红素衍生物在治疗癌症中的医用用途，属于医学医药技术领域。

背景技术

近年来，随着癌症发病率的逐年升高，全世界每年死于恶性肿瘤的病人已上升为各种死因的第二名，严重威胁到人类的健康。与人体健康细胞相比，肿瘤细胞具有无限增殖、快速分裂的特点，而肿瘤细胞的无限增殖往往需要大量的氧气与营养物质。因此，缺氧成为肿瘤组织与肿瘤细胞的一种常态。这种局部的缺氧环境会促进肿瘤组织周围新血管的生成，肿瘤组织因获得更充足的氧气和养料而能够继续无限快速的生长。在缺氧环境诱导肿瘤血管生成的过程中，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）是其反应过程中的关键性转录调控因子。肿瘤组织细胞中的HIF-1α在缺氧环境的诱导下持续高表达，从而使肿瘤组织中缺氧与饥饿状态得到缓解。因此，基于HIF-1α靶点的低氧信号通路阻断剂能高效低毒的特异性抑制肿瘤的发生和发展，现已成为抗肿瘤药物研发的热点。

发明内容

本发明公开一种雷公藤红素衍生物，为一种新的化合物，该化合物表现出较强的HIF-1α抑制活性，能够应用于抗肿瘤领域。

本发明公开一种雷公藤红素衍生物的制备方法，具有反应条件温和，反应过程操作简单，所用试剂便宜易得的优点。

本发明所述的一种雷公藤红素衍生物，其化学结构式为:

上述雷公藤红素衍生物的命名为：

2-(quinolin-3-yloxy)ethyl(2R,4aS,6aS,12bR,14aS,14bR)-10-hydroxy-2,4a,6a,9,12b,14a-hexamethyl-11-oxo-1,2,3,4,4a,5,6,6a,11,12b,13,14,14a,14b-tetradecahydropicene-2-carboxylae；

简称：C6；分子式为：C₄₀H₄₇NO₅；分子量为：621.34。

本发明公开一种雷公藤红素衍生物及其制备方法，具体制备步骤如下：

1）将3-羟基喹啉10 mmol、二溴乙烷30 mmol加入5 mL甲基异丁基甲酮溶液中，碳酸铯20 mmol作为催化剂，110℃下反应5 h；

2）反应完成后，用二氯甲烷以及饱和食盐水洗涤，干燥，柱层析得卤代物；

3）取雷公藤红素1mmol与步骤2）所得卤代物1.2 mmol及NaHCO₃3 mmol混合， N,N-二甲基甲酰胺5 mL作为溶剂，于60℃下搅拌4-6 h，TLC监测反应完全后，倒入15 mL水中，加入15 mL乙酸乙酯，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤三次，用无水硫酸钠除去水分，减压旋蒸除去乙酸乙酯，得到红色油状物用硅胶色谱法进行纯化，二氯甲烷甲醇（100:1-30:1）为展开剂洗脱后即得目标产物C6。

本发明所述的C6核磁共振数据如下：

Red powder; yield 56%; m.p. 156-158℃. ¹H-NMR (CDCl₃, 300MHz, ppm): δ8.68 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 7.2 Hz, 1H),7.63-7.51 (m, 3H), 7.40 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.31(d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.52-4.46 (m, 1H), 4.31-4.29 (m, 2H), 4.25-4.22 (m, 1H),2.46 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.22-2.02 (m, 2H), 1.90-1.58 (m,10H), 1.45 (s, 3H), 1.26 (s, 3H), 1.23 (s, 3H), 1.11 (s, 3H), 0.95-0.85 (m,2H), 0.59 (s, 3H). ¹³C-NMR (75MHz, CDCl₃, ppm): δ178.31 (2C), 169.71, 164.67,151.98, 146.00, 144.43, 133.98, 129.16, 128.59, 127.38, 127.27 (2C), 126.99,126.73, 119.52, 118.13, 117.09, 113.40, 66.11, 62.57,44.99, 44.25, 42.89,40.57, 39.40, 38.23, 36.35, 34.74, 33.56, 32.81, 31.59, 30.87, 30.52, 29.77,29.66, 28.62, 21.59, 18.69, 10.28. ESI-HRMS (m/z) calcd for C₄₀H₄₈NO₅ ⁺ [M+H]⁺:622.3527, found: 622.3524。

本发明所述的雷公藤红素衍生物可以作为HIF-1α抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明的积极效果在于：

提供了一种新的化合物--雷公藤红素衍生物，可抑制细胞水平HIF-1α表达，其IC50值仅为0.05 μM，活性较雷公藤红素相比提高约5倍，且毒性降低22倍；异种移植小鼠研究结果表明，本发明化合物能显著抑制裸鼠的肿瘤生长，且无明显毒副作用；本发明化合物的制备方法具有原料来源丰富，反应条件温和，反应过程操作简单，所用试剂便宜易得的优点。

附图说明

图1为本发明Hep3B细胞中雷公藤红素衍生物C6的HIF-1α抑制活性；

图2为本发明雷公藤红素治疗组效果图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

1）将3-OH喹啉10 mmol、二溴乙烷30 mmol加入5 mL甲基异丁基甲酮溶液中，碳酸铯20 mmol作为催化剂，110℃下反应4-6 h；

3）取雷公藤红素1 mmol及上述所得卤代物1.2 mmol以及NaHCO₃3 mmol置于25 mL圆底烧瓶中，5mL N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，于60℃下搅拌4-6 h，TLC监测反应完全后，倒入15 mL水中，加入15 mL乙酸乙酯，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤三次，用无水硫酸钠除去水分，减压旋蒸除去乙酸乙酯，得到红色油状物用硅胶色谱法进行纯化，二氯甲烷甲醇（100:1-30:1）为展开剂洗脱后即得目标产物C6：

C6核磁共振数据如下：

Red powder; yield 56%; m.p. 156-158℃. ¹H-NMR (CDCl₃, 300MHz, ppm): δ8.68 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 7.2 Hz, 1H),7.63-7.51 (m, 3H), 7.40 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.31(d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.52-4.46 (m, 1H), 4.31-4.29 (m, 2H), 4.25-4.22 (m, 1H),2.46 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.22-2.02 (m, 2H), 1.90-1.58 (m,10H), 1.45 (s, 3H), 1.26 (s, 3H), 1.23 (s, 3H), 1.11 (s, 3H), 0.95-0.85 (m,2H), 0.59 (s, 3H). ¹³C-NMR (75MHz, CDCl₃, ppm): δ178.31 (2C), 169.71, 164.67,151.98, 146.00, 144.43, 133.98, 129.16, 128.59, 127.38, 127.27 (2C), 126.99,126.73, 119.52, 118.13, 117.09, 113.40, 66.11, 62.57,44.99, 44.25, 42.89,40.57, 39.40, 38.23, 36.35, 34.74, 33.56, 32.81, 31.59, 30.87, 30.52, 29.77,29.66, 28.62, 21.59, 18.69, 10.28. ESI-HRMS (m/z) calcd for C₄₀H₄₈NO₅ ⁺ [M+H]⁺:622.3527, found: 622.3524；

分子式为：C₄₀H₄₇NO₅；分子量为：621.34。

试验例1

MTT法检测雷公藤红素衍生物C6对Hep3B细胞的毒性，采用荧光素酶报告基因法评估雷公藤红素衍生物C6缺氧条件下对HIF-1α表达活性的抑制作用。

实验材料：缺氧诱导培养箱（美国Thermo公司）、人肝癌（Hep3B）细胞株（美国ATCC公司）、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco BRL公司）、青霉素、链霉素、MTT（美国Sigma公司）。

实验方法：取对数生长期的Hep3B细胞用胰酶消化后，用10％DMEM培养基稀释，均匀的接种在96孔板中，每孔1×10⁴个细胞。将接种好的96孔板放在37℃，5％CO₂的培养箱中培养4h，待细胞贴壁后，用泵抽去培养基，实验组每孔加入200µL加药培养基（1％DMEM培养基），药物终浓度为0.01 µM、0.03 µM、0.10 µM、0.30 µM、1.00 µM，对照组加入等体积的溶媒，每个浓度设置三个复孔。放入培养箱中，继续培养24 h,之后避光加入MTT试剂，继续孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 µLDMSO，避光震荡10 min使甲瓒充分溶解。用酶标仪设置程序于492 nm处测定吸光值，结果与对照组比较，计算抑制率与半数抑制浓度即IC₅₀。结果显示，所有衍生物在不高于1.00 µM的浓度下不影响Hep3B细胞的正常存活。抑制率（％）=（1-给药孔OD值/对照孔OD值），根据抑制率与给药浓度绘制对数曲线图得半数抑制浓度。

将Hep3B细胞提前一天接种在6cm培养皿中，待其长到60％~80％的时候，用转染试剂Lipofectamine2000将pRL-CMV与pGL3-HRE-Lucifercse两种质粒转染到细胞中，继续培养24h。之后均匀的分布到96孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的待测化合物，终浓度分别为0 µM、0.01 µM、0.03 µM、0.10 µM、0.30 µM、1.00 µM，每个浓度设置三个复孔。放入1％O₂培养箱中继续孵育12h,最后弃去培养基，加入裂解液，在振荡器上震荡30分钟左右，使细胞完全打碎并充分溶解，加入荧光素酶底物，进行测量。

实验结果：常氧状态下HIF-1α几乎不表达，缺氧状态下可大量表达。HIF-1α与肿瘤组织中新生血管的生成密切相关。而雷公藤红素衍生物C6可以显著抑制HIF-1α的表达，且无明显细胞毒性。

试验例2

采用异种移植的方法检测雷公藤红素衍生物C6的体内抗肿瘤活性。

实验材料：无胸腺裸鼠（中国，北京）。

实验方法：从北京获得雄性无胸腺BALB / C裸鼠（体重22〜24 g），并在没有特定病原体的条件下饲养。将悬浮于100 µL生理盐水中的HCT116细胞（5×10⁶）注射到小鼠的右后方。随后，将小鼠随机分为5组，每组5只。当每组的肿瘤体积增加到40-100mm ³时，将给药组以1％DMSO / 1％Tween / 5％乙醇/ 93％盐水作为媒介物注入腹腔。阴性对照组用相同的媒介物治疗。每两天以腹膜内注射的频率进行治疗，总共连续20天，每次测量体重和肿瘤体积。在第21天，处死小鼠，切除肿瘤并称重。使用游标卡尺确定肿瘤大小，并使用标准公式计算肿瘤体积（mm³）：肿瘤体积=（L×W ²）/ 2，（L为长度，W为宽度）。

肿瘤抑制率（％）＝（1-治疗组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量）×100％。

实验结果：如图2所示，雷公藤红素治疗组在给药四天后，小鼠全部死亡(图2A)。而5-氟尿嘧啶，雷公藤红素衍生物C6低剂量治疗组和雷公藤红素衍生物C6高剂量治疗组对小鼠肿瘤生长的抑制率分别为59.58％，60.38％和74.03％，且与阴性对照组比具有显著性差异(图2B)。另外，在相同剂量下，雷公藤红素衍生物C6的体内抗肿瘤活性明显优于阳性对照5-氟尿嘧啶，而低剂量治疗组的治疗效果几乎与5-氟尿嘧啶相同。这些结果表明雷公藤红素衍生物C6具有显著的抗肿瘤活性，并且毒性显着降低。值得一提的是，雷公藤红素衍生物C6治疗的小鼠在治疗期间体重没有明显变化。

结论：

试验例1~2的实验结果充分说明，雷公藤红素衍生物C6具有显著的抗肿瘤活性，是一个有前途的HIF-1α抑制剂。

Claims

1.一种雷公藤红素衍生物，其特征在于具有如下结构式：

分子式为：C₄₀H₄₇NO₅；分子量为：621.34。

2.如权利要求1所述的雷公藤红素衍生物的制备方法，包括以下步骤：

1）将3-OH喹啉10 mmol、二溴乙烷30 mmol加入5 mL甲基异丁基甲酮溶液中，碳酸铯20mmol作为催化剂，110℃下反应5 h；

3）取雷公藤红素1mmol与步骤2）所得卤代物1.2 mmol及NaHCO₃3 mmol混合， N,N-二甲基甲酰胺5mL作为溶剂，于60℃下搅拌4-6 h，TLC监测反应完全后，倒入15 mL水中，加入15mL乙酸乙酯，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤三次，用无水硫酸钠除去水分，减压旋蒸除去乙酸乙酯，得到红色油状物用硅胶色谱法进行纯化，以100:1-30:1的二氯甲烷甲醇为展开剂洗脱后即得目标产物C6。

3.如权利要求1所述的雷公藤红素衍生物作为HIF-1α抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途。