CN115160277A - 芹菜素衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类新颖的芹菜素衍生物以及包含该类化合物的药物组合物及其抗肾癌应用。其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药，

Description

芹菜素衍生物及其应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种新的芹菜素衍生物,及其在制备抗肿瘤药 物中的应用。
背景技术
芹菜素(Apigenin,APG)主要存在于卷柏科、瑞香科、马鞭草科植物中，如卷柏， 芫花中含量较大，是一种天然黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、防治心血管 疾病和骨质疏松、抗菌等多种生物活性。近年来通过药理研究发现，芹菜素抗肿瘤作用 明显，可抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，并可抑制肿瘤血管形成、侵袭和转移， 此外，还能干扰肿瘤细胞的信号传导途径。芹菜素在抗肿瘤方面的应用备受关注。随着 肿瘤发病率的上升和耐药性的产生，人们需要开发新型的抗肿瘤药物。与其他黄酮类物 质(槲皮素、山奈黄酮)相比，芹菜素来源广、价格低廉、低毒、无诱变性以及具有广 泛的活性的优势吸引了药物化学家们，对芹菜素修饰和改性，以期筛选出效果好、生物 利用度高的抗肿瘤药物。
恶性肿瘤(通称癌症)的发病率和死亡率均呈上升趋势，是当前危害人类生命健康的重要疾病之一，已成为继冠心病之后，人类致死率第二高的病症，也是全球性的热点 健康问题。据世界卫生组织(WHO)统计，2020年世界癌症报告显示，2020年全球新 发癌症病例1929万例，死亡病例996万例。2020年中国新发癌症病例457万例，死亡 病例300万例。据WHO估计，在未来20年中，全球癌症例数可能会增加60％，形势 非常严峻。预计到2040年，全球癌症新发例数将超过2700万。
目前已上市的抗肿瘤药物较多，如抗代谢药物、烷化剂药物、免疫调节剂、抗肿瘤抗生素等，但是大多药物的毒性较大，病人不耐受。运用现代医学手段，发现一些活性 天然产物如芹菜素能有效抑制肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡。目前使用的众多抗肿瘤 药物或直接来源于天然产物，或经其结构改造而得。因此，安全性高的改构的活性天然 产物用于治疗癌症将具有广阔的前景，也是目前肿瘤治疗领域发展的新方向。
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)简称肝癌，是泌尿系统最常见的恶性肿 瘤之一，占成人肝脏恶性肿瘤的85-90％，目前，在所有癌症中，肝癌是发病率和死亡 率居高的四大恶性肿瘤之一，在我国，男性肝癌发病率占所有癌症中第3位，女性肝癌 发病率占第7位。目前该病多采用手术、放疗、化疗和免疫等措施综合治疗，尽管在研 究、诊断和治疗方面已经取得了很大进步，但大多数肝癌患者确诊时，往往已处于病情 的中晚期，伴随全身广泛的转移，整体预后并未得到明显改善，5年生存率仅为11％， 肝癌仍然是一个非常致命的疾病，严重威胁着人民的生命和健康。
发明内容
以下仅概括说明本发明的一些方面，并不局限于此。这些方面和其他部分在后面有 更完整的说明。本说明书中的所有参考文献通过整体引用于此。当本说明书的公开内容与引用文献有差异时，以本说明书的公开内容为准。
本发明提供了一种新的芹菜素衍生物，及其在制备抗癌症药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种芹菜素衍生物，其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的 盐或它的前药，
Figure BDA0003659577770000021
其中，R1、R3、R4分别独立的H、D或C1-C4烷基；
R2为H、D、卤素、OH、CN、NO2、NH2、NHCO-R5、CH2-R7、CHR8R9、-SO2-R10、 CONH-R14、N(CH2)2、COCH2、COH、COOCH3、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、 C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、取代的C3-C8环烷基、C3-C8杂环基、取代的C3-C8杂 环基，其中，取代的C1-C6烷基、取代的C3-C8环烷基、取代的C3-C8杂环基中的取 代基可独立任选地被1个或多个选自氢、D、F、Cl、Br、I、-OH、-NH2、-NO2、-CN、 C1-C6烷基取代；
R5为H、D、卤素、CN、NO2、OH、NH2、C1-C6烷基、NH-R6；
R6为H、D、卤素、C3-C8杂环基；
R7为H、D、卤素、OH或C1-C6烷基；
R8和R9分别独立的选自H、D、OH或C1-C6烷基；
R10为H、D、卤素、C1-C6烷基；
R14为H、D、卤素、OH或C1-C6烷基、C3-C8环烷基。
优选的，R1、R3、R4分别独立的H、D、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、 异丁基或叔丁基。
优选的，R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、丙烯基、炔丙基、丙炔基、 -CHF2、-CF3、-CHFCH2F、-CF2CHF2、-CH2CF3、-CH2CF2CHF2、甲氧基、乙氧基、正 丙基氧基、异丙基氧基、-OCHF2、-OCF3、-OCHFCH2F、-OCF2CHF2、-OCH2CF3、 -OCH2CF2CHF2、甲硫基、乙硫基、甲氨基、二甲氨基、乙氨基、羟甲基、2-羟基乙基、 环丁基、环戊基、环己基、氮杂环丁基、吡咯烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、哌啶基、 哌嗪基、吗啉基、苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三氮唑基、四氮唑基、呋喃基、噻 吩基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基或取代的环丁基、环戊基、 环己基、氮杂环丁基、吡咯烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、 苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三氮唑基、四氮唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁 唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基；其中，所述取代的环丁基、环戊基、环己基、 氮杂环丁基、吡咯烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、苯基、 吡咯基、吡唑基、咪唑基、三氮唑基、四氮唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、 吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基可独立任选地被1、2、3、4或5个选自D、F、Cl、 Br、I、-OH、-NH2、-NO2、-CN、甲基、乙基、正丙基、异丙基所取代。
优选的，R5为C1-C4烷基、NH-R6。
优选的，R6为CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH(CH3)2、吡咯烷基、氧杂环丁基、 四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三氮唑基、 四氮唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基。
优选的，R6为C3-C5环氧基。
优选的，R8和R9分别独立的选自OH、NH2或C1-C4烷基。
优选的，R10为C1-C4烷基。
优选的，R14为C1-C4烷基。
优选的，所述芹菜素衍生物，其为具有下列之一结构的化合物或具有下列之一结构 的化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代 谢产物、药学上可接受的盐或它的前药：
Figure BDA0003659577770000031
Figure BDA0003659577770000041
本发明还要求保护一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述公开的化合物。
优选的，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂或它们的任意组合。
如上所述的药物的剂型为：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、散剂、溶液、混 悬液、膏剂、脂质体、冲剂、口服剂、注射液、注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、贴剂、 喷雾剂、洗剂、滴剂或擦剂。
本发明还要求保护上述公开的化合物或药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
优选的，所述肝癌为肝细胞癌。
优选的，所述肝细胞癌为肝细胞癌、肝内胆管癌、混合细胞癌。
下面对本发明做进一步的解释：
本发明合成了一系列芹菜素衍生物，并研究了其抗癌活性，其中评估了它们对HepG2人肝癌细胞系的活性，发现本发明化合物具有意料不到的优异的抗肿瘤活性，尤 其具有很好的抗HepG2细胞增殖活性。因此本发明提供的化合物可作为较好的抗肿瘤 药物，特别是抗肝细胞癌药物。
本发明的有益效果为：
实验结果表明：本发明化合物能有效抑制肝癌细胞的生长，尤其具有很好的体外抑 制HepG2细胞生长的作用。本发明化合物对HepG2细胞有明显的周期阻滞作用；能够 大幅诱导HepG2细胞凋亡；对HepG2细胞克隆有强烈的抑制作用；同时对HepG2细胞 迁移的抑制作用，且这些作用均明显优于芹菜素。因此，本发明化合物可用于预防或治 疗肝细胞癌。
本发明化合物性质稳定，安全性良好，毒副作用少，具有药效学和药代动力学优势， 例如良好的脑/血浆比(brain plasma ratio)、良好的生物利用度或良好的代谢稳定性等， 因此具备较好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1合成的化合物1的1H-NMR图；
图2为实施例2合成的化合物2的1H-NMR图；
图3为实施例3合成的化合物3的1H-NMR图；
图4为实施例4合成的化合物4的1H-NMR图；
图5为实施例5合成的化合物5的1H-NMR图；
图6为实施例6合成的化合物6的1H-NMR图；
图7为实施例7合成的化合物7的1H-NMR图；
图8为实施例8合成的化合物8的1H-NMR图；
图9为实施例9合成的化合物9的1H-NMR图；
图10为实施例10合成的化合物10的1H-NMR图；
图11为实施例11合成的化合物11的1H-NMR图；
图12为实施例12合成的化合物12的1H-NMR图；
图13为实施例13合成的化合物13的1H-NMR图；
图14为实施例14合成的化合物14的1H-NMR图；
图15为实施例15合成的化合物15的1H-NMR图；
图16为实施例16合成的化合物16的1H-NMR图；
图17为实施例17合成的化合物17的1H-NMR图；
图18为本发明化合物9在BALB/c-nude老鼠体内的抗肿瘤作用；
图19为受试化合物9对HepG2细胞周期阻滞作用；其中(a)表示数量，(b)表示数 量比率；
图20为受试化合物9诱导HepG2细胞凋亡的作用；
图21为受试化合物9对HepG2细胞克隆形成的抑制作用；
图22为受试化合物9对HepG2细胞迁移的抑制作用。
具体实施方式
定义和一般术语
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发 明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本发明所述类似或等同的方法和材料能够用 于实践本发明。本发明绝不限于本发明所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类 似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术 语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁 起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外说明，应当应用本发明所使用的下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学 一般原理可参考“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和“March's Advanced Organic Chemistry”by Michael B.Smith and JerryMarch, John Wiley&Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本发明。
下面所描述的实施例，除非其他方面表明所有的温度定为摄氏度。试剂购买于商品 供应商如Aldrich Chemical Company,Arco Chemical Company and Alfa ChemicalCompany，使用时都没有经过进一步纯化，除非其他方面表明。一般的试剂从汕头西陇 化工厂，广东光华化学试剂厂，广州化学试剂厂，天津好寓宇化学品有限公司，天津市 福晨化学试剂厂，武汉鑫华远科技发展有限公司，青岛腾龙化学试剂有限公司，和青岛 海洋化工厂购买得到。
无水四氢呋喃，二氧六环，甲苯，乙醚是经过金属钠回流干燥得到。无水二氯甲烷和氯仿是经过氢化钙回流干燥得到。乙酸乙酯，石油醚，正己烷，N,N-二甲基乙酰胺和 N,N-二甲基甲酰胺是经无水硫酸钠事先干燥使用。
以下反应一般是在氮气或氩气正压下或在无水溶剂上套一干燥管(除非其他方面表 明)，反应瓶都塞上合适的橡皮塞，底物通过注射器打入。玻璃器皿都是干燥过的。
色谱柱是使用硅胶柱。硅胶(300-400目)购于青岛海洋化工厂。
1H NMR谱使用Bruker 400MHz或600MHz核磁共振谱仪记录。1H NMR谱以 CDC13、DMSO-d6、CD3OD或丙酮-d6为溶剂(以ppm为单位)，用TMS(0ppm)或 氯仿(7.26ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet， 单峰)，d(doublet，双峰)，t(triplet，三重峰)，q(quartet，四重峰)，m(multiplet，多重 峰)，br(broadened，宽峰)，brs(broadened singlet，宽的单峰)，dd(doublet of doublets， 双二重峰)，ddd(doubletof doublet of doublets，双双二重峰)，ddt(doublet of doublet of triplets，双双三重峰)，dt(doublet of triplets，双三重峰)，dq(doublet of quartets，双四重 峰)，td(triplet of doublets，三双重峰)，tt(triplet of triplets，三三重峰)，qd(quartet ofdoublets， 四双重峰)。偶合常数J，用赫兹(Hz)表示。
低分辨率质谱(MS)数据的测定条件是：Agilent 6120四级杆HPLC-M(柱子型号：Zorbax SB-C18,2.1×30mm,3.5微米,6min,流速为0.6mL/min。流动相：5％-95％(含 0.1％甲酸的CH3CN)在(含0.1％甲酸的H2O)中的比例，采用电喷雾电离(ESI)， 在210nm/254nm下，用UV检测。
纯的化合物使用Agilent 1260pre-HPLC或Calesep pump 250pre-HPLC(柱子型号： NOVASEP 50/80mm DAC)，在210nm/254nm用UV检测。
下面简写词的使用贯穿本发明：
Figure BDA0003659577770000061
Figure BDA0003659577770000073
下列合成方案描述了制备本发明公开化合物的步骤，除非另外说明，其中，R2具有本发明所述的定义。
以下结合具体实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围并不局限于这 些实施例。
中间体合成方案
中间体合成方案1
式3a所示的化合物可以通过下列过程制备得到：式1a所示的化合物与式2a所 示的化合物或式2a’所示的化合物通过Suzuki-Miyaura偶联反应得到式3a所示的中 间体化合物。
Figure BDA0003659577770000071
合成方案1-1
式7a所示的化合物可以通过下列过程制备得到：式3a所示的化合物发生脱苄基反应得到式4a所示的化合物。
Figure BDA0003659577770000072
实施例1：8-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的 合成
Figure BDA0003659577770000081
步骤一：8-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的 合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-甲基氨基甲酰 基苯硼酸(167.5mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反 应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次， 有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶 柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲 氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(350mg,86.2％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:522.2[M+H]+
步骤二：8-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮 (250mg,0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg, 3.36mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶 液1mL，继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过 滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-(甲基氨基甲酰 基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(176mg,85％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:432.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.56(s,1H,NH),7.96(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),7.64(dd,J＝11.8,8.1Hz,4H,Ar-H),6.77(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.64(s,1H,C＝CH),6.56(s,1H,Ar-H),4.00(s,3H,OCH3),3.95(s,3H,OCH3),2.85(d,J＝4.3Hz,3H,NCH3).
实施例2 8-(4-(氨基甲酰基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000091
步骤一：8-(4-(氨基甲酰基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-氨基甲酰基苯 硼酸(155.1,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反应结束后停 止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次，有机层用 饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯 化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-(氨基甲酰基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯 -4-酮，为黄色固体(320mg,80％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:508.2[M+H]+
步骤二：8-(4-(氨基甲酰基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-(氨基甲酰基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(244 mg,0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg,3.36mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL， 继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集 滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-(氨基甲酰基)苯基)-2-(4- 羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(173mg,86％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:418.1[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.07(s,1H,NH),8.01(d,J＝8.4,2H,Ar-H),7.65(t,J＝8.6Hz,4H,Ar-H),7.43(s,1H,NH),6.77(d,J＝8.7,2H,Ar-H),6.65(s,1H,C＝CH),6.58(s,1H,Ar-H),4.02(s,3H,OCH3),3.96(s,3H,OCH3).
实施例3 8-(4-吗啉苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000092
步骤一：8-(4-吗啉苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-吗啉苯硼酸(194.6mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol) 置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反应结束后停 止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次，有机层用 饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯 化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-吗啉苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为 黄色固体(351mg,82％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:550.3[M+H]+
步骤二：8-(4-吗啉苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-吗啉苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(264mg,0.48 mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg,3.36mmol)， 在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL，继续 回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-吗啉苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(185mg,84％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:460.2[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.04(s,1H,OH),7.67(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H), 7.42(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),7.04(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),6.78(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H), 6.62(s,1H,C＝CH),6.51(s,1H,Ar-H),3.99(s,3H,OCH3),3.92(s,3H,OCH3),3.79(t,J＝ 4.8Hz,4H,OCH2),3.18(t,J＝4.8Hz,4H,NCH2).
实施例4 8-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合 成
Figure BDA0003659577770000101
步骤一：8-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的 合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯硼酸(206.9mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3 mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜， 反应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三 次，有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过 硅胶柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7- 二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(346mg,79％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:563.3[M+H]+
步骤二：8-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮 (270mg,0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg, 3.36mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶 液1mL，继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过 滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-(4-甲基-1-哌嗪 基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(186mg,82％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:473.2[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.06(s,1H,OH),7.67(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H), 7.42(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),7.05(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.77(d,J＝8.2Hz,Ar-H,2H), 6.62(s,1H,C＝CH),6.53(s,1H,Ar-H),3.99(s,3H,OCH3),3.94(s,3H,OCH3),3.24(t,J＝ 5.1Hz,4H,NCH2),2.53(d,J＝5.0Hz,4H,NCH2),2.27(s,3H,NCH3).
实施例5 8-(4-二甲基氨基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000111
步骤一：8-(4-二甲基氨基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-二甲氨基苯硼 酸(155.1mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反应结束后停 止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次，有机层用 饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯 化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-二甲基氨基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4- 酮，为黄色固体(336mg,85％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:507.3[M+H]+
步骤二：8-(4-二甲基氨基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-二甲基氨基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(244mg, 0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg,3.36mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL， 继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集 滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-二甲基氨基苯基)-2-(4- 羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(168mg,84％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:418.2[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.06(s,1H,OH),7.69(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H), 7.40(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),6.84(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),6.78(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H), 6.62(s,1H,C＝CH),6.53(s,1H,Ar-H),3.99(s,3H,OCH3),3.94(s,3H,OCH3),2.98(s,6H, NCH3).
实施例6 8-(4-(N-四氢吡咯基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000121
步骤一：8-(4-(N-四氢吡咯基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合 成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-(N-四氢吡咯基)苯硼酸(179.6mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反 应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次， 有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶 柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-(N-四氢吡咯基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧 基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(312mg,75％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:534.3[M+H]+
步骤二：8-(4-(N-四氢吡咯基)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-(N-四氢吡咯基)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(256 mg,0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg,3.36 mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL，继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集 滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-(N-四氢吡咯基)苯基)-2-(4- 羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(181mg,85％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:443.2[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.69(d,J＝8.7,2H,Ar-H),7.37(d,J＝8.5,2H,Ar-H),6.78(d,J＝8.6,2H,Ar-H),6.67–6.56(m,3H,Ar-H),6.51(s,1H,Ar-H),3.98(s,3H,OCH3),3.92(s,3H,OCH3),3.31–3.21(m,4H,NCH2),2.02–1.87(m,4H,CH2).
实施例7 8-(4-乙酰基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000122
步骤一：8-(4-乙酰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-乙酰基苯硼酸(154.2mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol) 置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反应结束后停 止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次，有机层用 饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯 化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-乙酰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮， 为黄色固体(335mg,85％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:507.2[M+H]+
步骤二：8-(4-乙酰基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-乙酰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(243mg,0.48 mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg,3.36mmol)， 在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL，继续 回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-乙酰基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7- 二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(169mg,85％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:417.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),7.70(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),7.62(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),6.76(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),6.64(s,1H,C＝CH),6.54(s,1H,Ar-H),4.01(s,3H,OCH3),3.93(s,3H,OCH3),2.65(s,3H,COCH3).
实施例8 8-(4-异丙基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000131
步骤一：8-(4-异丙基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-异丙基苯硼酸 (154.3mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol) 置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反应结束后停 止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次，有机层用 饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯 化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-异丙基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮， 为黄色固体(343mg,87％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:507.3[M+H]+
步骤二：8-(4-异丙基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-异丙基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(243mg,0.48 mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg,3.36mmol)， 在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL，继续 回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-异丙基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7- 二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(171mg,86％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:417.2[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.63(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),7.47(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),7.36 (d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),6.72(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.62(s,1H,C＝CH),6.55(s,1H,Ar-H),4.00 (s,3H,OCH3),3.94(s,3H,OCH3),2.07(s,1H,CH),1.29(d,J＝6.9Hz,6H,CH3).
实施例9 8-(3,4-苯并-1,4二氧六环苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4- 酮的合成
Figure BDA0003659577770000141
步骤一：8-(3,4-苯并-1,4二氧六环苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的 合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的苯并-1,4二氧六 环-6-硼酸(169.2mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反 应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次， 有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶 柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(3,4-苯并-1,4二氧六环苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二 甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(342mg,84％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:521.2[M+H]+
步骤二：8-(3,4-苯并-1,4二氧六环苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合 成
称取8-(3,4-苯并-1,4二氧六环苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮 (250mg,0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg, 3.36mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶 液1mL，继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过 滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(3,4-苯并-1,4二氧 六环苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(168mg,81％)。 MS(ESI,pos.ion)m/z:431.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.22(s,1H,OH),7.68(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),7.07(d,J＝2.0Hz,1H,Ar-H),7.03(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H,Ar-H),6.97(d,J＝8.3Hz,1H,Ar-H),6.78(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),6.62(s,1H,C＝CH),6.52(s,1H,Ar-H),4.32(s,4H,OCH2),3.99(s,3H,OCH3),3.94(s,3H,OCH3).
实施例10 8-(4-甲氧羰基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000151
步骤一：8-(4-甲氧羰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-甲氧羰基苯硼 酸(169.2mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反应结束后停 止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次，有机层用 饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯 化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-甲氧羰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4- 酮，为黄色固体(301mg,74％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:521.2[M+H]+
步骤二：8-(4-甲氧羰基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-甲氧羰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(251mg, 0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg,3.36mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL， 继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集 滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-甲氧羰基苯基)-2-(4-羟 基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(176mg,85％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:431.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),7.71(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),7.62(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.74(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),6.65(s,1H,C＝CH),6.55(s,1H,Ar-H),4.01(s,3H,OCH3),3.94(s,3H,OCH3),3.91(s,3H,OCH3).
实施例11 8-(4-乙酰氨基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000152
步骤一：8-(4-乙酰氨基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-乙酰氨基苯硼 酸(168.3mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反应结束后停 止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次，有机层用 饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯 化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-乙酰氨基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4- 酮，为黄色固体(345mg,85％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:522.2[M+H]+
步骤二：8-(4-乙酰氨基苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-乙酰氨基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(251mg, 0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg,3.36mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL， 继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集 滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-乙酰氨基苯基)-2-(4-羟 基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(165mg,80％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:432.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.08(s,1H,NH),10.06(s,1H,OH),7.70(d,2H,Ar-H),7.66(d,2H,Ar-H),7.49(d,J＝8.5,2H,Ar-H),6.75(d,2H,Ar-H),6.63(s,1H,C＝CH),6.54(s,1H,Ar-H),4.00(s,3H,OCH3),3.94(s,3H,OCH3),2.10(s,3H,NHCH3).
实施例12 8-(4-(环丙基氨基甲酰)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合 成
Figure BDA0003659577770000161
步骤一：8-(4-(环丙基氨基甲酰)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的 合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)(400mg,0.78mmol)，与购买的4-(环丙基氨基 甲酰)苯硼酸(192.7mg,0.94mmol)，Pd(PPh3)4(92.4mg,0.08mmol)，Cs2CO3(508.3mg,1.56mmol)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)，在110℃反应过夜，反 应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯(3×30mL)萃取三次， 有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶 柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-(环丙基氨基甲酰)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲 氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(350mg,85％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:548.3[M+H]+
步骤二：8-(4-(环丙基氨基甲酰)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
称取8-(4-(环丙基氨基甲酰)苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮 (263mg,0.48mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝(448mg, 3.36mmol)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶 液1mL，继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过 滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-(环丙基氨基甲 酰)苯基)-2-(4-羟基苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，为黄色固体(180mg,82％)。 MS(ESI,pos.ion)m/z:458.2[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.08(s,1H,OH),8.55(d,J＝4.3Hz,1H,NH),7.95(d,J＝8.1Hz,2H,Ar-H),7.64(dt,J＝8.3,3.9Hz,4H,Ar-H),6.77(,2H,Ar-H),6.65(s,1H, C＝CH),6.57(s,1H,Ar-H),4.01(s,3H,OCH3),3.95(s,3H,OCH3),2.91(tq,J＝8.0,4.1Hz, 1H,CH),0.74(dt,J＝7.0,3.3Hz,2H,CH2),0.63(p,J＝4.8,4.4Hz,2H,CH2).
实施例13 8-(4-6’喹啉)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000171
步骤一：8-(4-6’喹啉)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)400mg(0.78mmol，1eq)、4-乙基苯硼酸162.9mg(0.94mmol，1.2eq)、四三苯基膦钯92.4mg(0.08mmol，0.2eq)和无水碳 酸铯508.3mg(1.56mmol，2eq)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)， 在110℃反应过夜，反应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯 (3×30mL)萃取三次，有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后 减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-6’喹啉)-2-(4-(苄氧基)苯 基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，黄色固体350mg，产率86.2％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:516.2[M+H]+
步骤二：8-(4-6’喹啉)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成 称取8-(4-6’喹啉)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮247mg(0.48mmol，1 eq)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝448mg(3.36mmol,7eq)， 在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL，继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集滤饼， 通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-6’喹啉)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7- 二甲氧基-4H-色烯-4-酮黄色固体176mg，产率85％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:426.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.97(d,J＝4.1Hz,1H,Ar-H),8.44(d,J＝6.9Hz,1H,Ar-H),8.25(s,1H,Ar-H),8.11(d,J＝8.9,1H,Ar-H),7.95(d,J＝8.8Hz,1H,Ar-H),7.62(d,J＝8.2Hz,3H,Ar-H),6.66(s,1H,C＝CH),6.64(s,2H,Ar-H),6.61–6.60(m,1H,Ar-H), 4.05(s,3H,OCH3),4.00(s,3H,OCH3).
实施例14 8-(4-乙基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000181
步骤一：8-(4-乙基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)400mg(0.78mmol，1eq)、4-乙基苯硼酸140.9mg(0.94mmol，1.2eq)、四三苯基膦钯92.4mg(0.08mmol，0.2eq)和无水碳 酸铯508.3mg(1.56mmol，2eq)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)， 在110℃反应过夜，反应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯 (3×30mL)萃取三次，有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后 减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-乙基苯基)-2-(4-(苄氧基) 苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，黄色固体350mg，产率86.2％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:493.2[M+H]+
步骤二：8-(4-乙基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成 称取8-(4-乙基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮193mg(0.48mmol， 1eq)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝448mg(3.36mmol,7eq)， 在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL，继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集滤饼， 通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-乙基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯 基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮黄色固体176mg，产率85％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:403.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H,OH),7.64(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.45(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),7.32(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),6.77–6.72(m,2H,Ar-H),6.62(s,1H, C＝CH),6.53(s,1H,Ar-H),4.00(s,3H,OCH3),3.93(s,3H,OCH3),2.69(q,J＝7.6Hz,2H,CH2),1.26(t,J＝7.5Hz,3H,CH3).
实施例15 8-(4-戊基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000182
步骤一：8-(4-戊基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)400mg(0.78mmol，1eq)、4-戊基苯硼酸180.9mg(0.94mmol，1.2eq)、四三苯基膦钯92.4mg(0.08mmol，0.2eq)和无水碳 酸铯508.3mg(1.56mmol，2eq)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)， 在110℃反应过夜，反应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯 (3×30mL)萃取三次，有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后 减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-戊基苯基)-2-(4-(苄氧基) 苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，黄色固体350mg，产率86.2％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:535.1[M+H]+
步骤二：8-(4-戊基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成 称取8-(3，4-亚甲氧基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮244mg(0.48 mmol，1eq)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝448mg(3.36mmol, 7eq)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL， 继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-戊基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮黄色固体176mg，产率85％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:445.2[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.63(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),7.45(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H),7.29(d,J＝7.7Hz,2H,Ar-H),6.73(d,J＝8.1Hz,2H,Ar-H),6.61(d,J＝5.0Hz,1H, C＝CH),6.53(d,J＝5.0Hz,1H,Ar-H),4.00(d,J＝4.8Hz,3H,OCH3),3.93(d,J＝4.7Hz, 3H,OCH3),2.65(t,J＝7.6Hz,2H,ArCH2),1.64(q,J＝7.3Hz,2H,CH2),1.40–1.25(m, 4H,CH2),0.88(t,J＝6.9Hz,3H,CH3).
实施例16 8-(4-戊基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000191
步骤一：8-(3，4-亚甲氧基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)400mg(0.78mmol，1eq)、4-亚甲氧基苯 硼酸155.9mg(0.94mmol，1.2eq)、四三苯基膦钯92.4mg(0.08mmol，0.2eq)和无 水碳酸铯508.3mg(1.56mmol，2eq)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1， v/v)，在110℃反应过夜，反应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙 酸乙酯(3×30mL)萃取三次，有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠 干燥后减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(3，4-亚甲氧基苯 基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，黄色固体350mg，产率86.2％。 MS(ESI,pos.ion)m/z:509.1[M+H]+
步骤二：8-(4-亚甲氧基苯基)-5-羟基-2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮的合成 称取8-(3，4-亚甲氧基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮244mg(0.48 mmol，1eq)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝448mg(3.36mmol, 7eq)，在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL， 继续回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集滤饼，通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-亚甲氧基苯基)-5-羟基 -2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮黄色固体176mg，产率85％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:419.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.66(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),7.09(s,1H,Ar-H),7.06–6.99(m,2H,Ar-H),6.77(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.62(s,1H,C＝CH),6.51(s,1H,Ar-H),6.10(s,2H,OCH2O),3.99(s,3H,OCH3),3.93(s,3H,OCH3).
实施例17 8-(4-甲酰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
Figure BDA0003659577770000201
步骤一：8-(4-甲酰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮的合成
氮气保护下，将2-(4-(苄氧基)苯基)-8-碘-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮(化合物1a， 参考专利CN 108299365 A中化合物l合成)400mg(0.78mmol，1eq)、4-甲酰基苯硼 酸140.9mg(0.94mmol，1.2eq)、四三苯基膦钯92.4mg(0.08mmol，0.2eq)和无水 碳酸铯508.3mg(1.56mmol，2eq)置于圆底烧瓶中，加入DMF-H2O 5mL(9:1，v/v)， 在110℃反应过夜，反应结束后停止加热。将反应液冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯 (3×30mL)萃取三次，有机层用饱和氯化钠萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后 减压蒸发浓缩。通过硅胶柱色谱纯化(PE/EA＝2:1)得到8-(4-甲酰基苯基)-2-(4-(苄氧基) 苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮，黄色固体350mg，产率86.2％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:522.2[M+H]+
步骤二：8-(4-甲酰基苯基)-5-羟基-2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮的合成 称取8-(4-甲酰基苯基)-2-(4-(苄氧基)苯基)-5,7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮250mg(0.48mmol， 1eq)置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈4mL，加入无水三氯化铝448mg(3.36mmol,7eq)， 在氮气保护下回流反应过夜。反应结束后冷却至室温，加入30％盐酸溶液1mL，继续 回流反应2h。停止反应后，将反应液倒入冰水中，此时有沉淀析出，过滤，收集滤饼， 通过硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH＝50:1,v/v)得到8-(4-甲酰基苯基)-5-羟基-2-(4-羟基 苯基)-7-甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮黄色固体176mg，产率85％。
MS(ESI,pos.ion)m/z:432.1[M+H]+
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.08(s,1H,OH),8.01(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.80(d, J＝7.9Hz,2H,Ar-H),7.63(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.76(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),6.66(s, 1H,C＝CH),6.57(s,1H,Ar-H),4.02(s,3H,OCH3),3.95(s,3H,OCH3).
实施例18生物试验
评价本发明化合物对HepG2细胞增殖抑制作用
实验目的：
运用CCK-8实验测定化合物对HepG2细胞增殖的抑制IC50来评价本发明化合物对HepG2细胞增殖的抑制作用。
HepG2：来源于一位15岁的美国男性分化良好的肝癌组织。HepG2是上皮形态， 该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等 ，是一个合适的研究人类肝癌细胞的体外模型系统。
实验方法：
细胞活力测定试剂盒购自Dojindo Molecular Technologies(CK04)。将6×103个HepG2细胞(产品号
Figure BDA0003659577770000211
HTB-46TM，购于美国模式培养物集存库(American type culturecollection，ATCC))接种到96孔板内，并与空白对照(0.5％DMSO)、不同浓 度的APG(产品号HY-N1201，购自MCE(MedChemExpress)公司)或不同浓度的本发 明公开的各化合物孵育72小时。然后加入最终浓度为10％(v/v)的CCK-8工作液，放 于37℃、5％CO2培养箱继续培养1-2小时，然后使用酶标仪在450nm波长处检测吸 光度值。
数据处理：
根据所测吸光度值计算各化合物的细胞增殖抑制率(inhibition ratio,IR)，计算公式 如下：
IR％＝[AC–AD]/[AC–AB]×100％
AB：空白组，含0.5％DMSO、CCK-8和无细胞的培养基的孔的吸光度
AD：实验组，含0.5％DMSO、CCK-8、药物和有细胞的培养基的孔的吸光度
AC：对照组，含0.5％DMSO、CCK-8和有细胞的培养基的孔的吸光度
采用Graph Pad Prism5软件分析数据及作图，计算各化合物在72小时的半数抑制浓度(IC50)。实验结果见表1。
表1本发明化合物对HepG2细胞增殖的抑制作用结果
实施例编号 IC50(μM) 实施例编号 IC50(μM)
实施例1合成的化合物1 43.35 实施例10合成的化合物10 97.03
实施例2合成的化合物2 74.53 实施例11合成的化合物11 100.03
实施例3合成的化合物3 16.13 实施例12合成的化合物12 98.53
实施例4合成的化合物4 2.30 实施例13合成的化合物13 67.87
实施例5合成的化合物5 83.18 实施例14合成的化合物14 12.23
实施例6合成的化合物6 12.6 实施例15合成的化合物15 53.49
实施例7合成的化合物7 1.58 实施例16合成的化合物16 110.56
实施例8合成的化合物8 5.21 实施例17合成的化合物17 78.34
实施例9合成的化合物9 1.03 Apigenin(芹菜素) 74.27
实验结果表明：本发明的化合物具有很好的体外抑制HepG2细胞生长的作用，且抑制作用明显优于APG。
APG的结构式为
Figure BDA0003659577770000221
实施例19 HepG2细胞裸鼠移植瘤实验
本发明对本发明化合物在BALB/c-nude老鼠体内的抗肿瘤作用进行了评估，动物信息 详见表3。
表3动物信息
Figure BDA0003659577770000222
试验方法
小鼠在有水和食物的标准条件下饲养，并进行12小时的明/暗循环的光照。将HepG2 细胞(1x107重悬于50μL无血清RPMI+50μL基质胶)接种至裸鼠右背部皮下。待肿 瘤生长至约200mm3后，测量肿瘤的体积和肿瘤的重量，根据肿瘤的体积和重量随机 机分为三组，每组6只，保证三组的肿瘤体积和体重相差不大。将本发明化合物9以 含5％DMSO and15％PEG400的生理盐水，pH＝9溶液形式，以低剂量为10mg/kg、高 剂量为20mg/kg的剂量设计，对受试动物进行给药，每天采取腹腔注射的方法给予受 试化合物和对照组相应体积的溶剂(含5％DMSO and 15％PEG400的生理盐水，pH＝9)， 连续给药21天。每周检测肿瘤大小2次，以及称量老鼠体重2次，给药21天，然后处 死小鼠解剖取出肿瘤拍照和称重，结果见图18。
分析结果表明，本发明化合物在BALB/c-nude老鼠体内具有较好的抗肿瘤作用。
说明本发明化合物体内抗肿瘤活性好，具有良好的临床应用前景。
实施例20 HepG2细胞周期实验
评价本发明化合物9对HepG2细胞周期阻滞的作用
实验目的：
运用流式细胞术测定化合物对HepG2细胞的周期阻滞作用，评价本发明化合物9对HepG2细胞周期的作用。
实验方法：
细胞周期测定试剂盒购自Beyotime。将细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中， 于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h，细胞达到80％-90％融合度。更换为 无血清的DEME高糖/RPMI-1640培养基于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。更换培养基为含有梯度药物(5μl芹菜素，10μl芹菜素，5μl化合物9，10μl化合物9) 的完全培养基于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养72h。收集各孔中的培养基 于离心管中备用，向孔板中加入300μl的胰酶溶液，轻轻吹打并收集所有细胞至离心 管中，以1000rpm，5min条件离心。移除离心管内液体后用预冷的PBS溶液重悬洗涤 1次，并转移到1.5ml的离心管中。离心沉淀细胞后小心移除上清液，适当残留一些PBS 溶液避免吸走与细胞成团，轻弹1.5ml离心管底部。使用1ml预冷的70％乙醇溶液轻 轻吹打分散上一步骤中的1.5ml离心管，静置于4℃冰箱中固定过夜12h。以1000rpm， 5min条件离心昨夜的1.5ml离心管，小心移除上清，加入1ml预冷的PBS溶液重悬细 胞沉淀，离心沉淀细胞后小心移除上清液，适当残留一些PBS溶液避免吸走与细胞成团， 轻弹1.5ml离心管底部。配制细胞周期工作液：按一个样品500μl体积，将染色缓冲 液、碘化丙啶染色液(20×)、RNase A(50×)按照1：50：20的比例配制待用。向 每管细胞样品中加入500μl细胞周期工作液，小心吹打重悬后置于37℃避光温浴30min，之后低温存放至流式上机检测。对流式细胞仪执行清洗与指控，打开488nm波长 检测，打开多个散射光通道进样细胞，根据散射光点图调整至合适电压，调节分析速度， 待点图稳定后记录数据。
数据处理：
使用光散射点图圈出主要的细胞群，根据PE-W情况去除粘连多倍体，依照PE-A 分析细胞周期分部情况，打印输出数据。
采用Graph Pad Prism5软件分析数据及作图，计算各化合物在G0/G1,G2/M,S期的比例。实验结果见图19。
实验结果表明：本发明化合物9具有很好的将HepG2细胞周期阻滞在S期的作用，并且作用明显强于APG。
实施例21 HepG2细胞凋亡实验
评价本发明化合物9诱导HepG2细胞凋亡的作用。
实验目的：
运用流式细胞术测定化合物诱导HepG2细胞的凋亡作用，评价本发明化合物9对HepG2细胞凋亡的作用。
实验方法：细胞凋亡测定试剂盒购自Beyotime。分别取处于对数生长期形态良好的 肝癌细胞系消化并计数。将细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，于37℃、5％ CO2饱和湿度的培养箱中培养24h，细胞达到80％-90％融合度。更换为无血清的DEME 高糖培养基于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h。更换培养基为含有梯度药 物(2.5μl芹菜素，10μl芹菜素，2.5μl化合物9，10μl化合物9)的完全培养基于37℃、 5％CO2饱和湿度的培养箱中培养72h。收集各孔中的培养基于离心管中备用，使用PBS 溶液一次并转移到离心管中，向孔板中加入300μl的无EDTA胰酶溶液，轻轻吹打并 收集所有细胞至离心管中，以1000rpm，5min条件离心。用PBS溶液轻轻吹打重悬细 胞沉淀，计数，取5-10×104个细胞以以1000rpm，5min条件离心。加入约185μl AnnexinⅤ-FITC结合液轻轻重悬细胞沉淀。加入5μl AnnexinⅤ-FITC染色液轻轻吹 打均匀。加入10μl碘化丙啶染色液轻轻吹打均匀。在25℃环境下避光孵育10min， 染色完毕置于4℃冰箱中避光暂存等待流式上机。对流式细胞仪执行清洗与指控，散射 光通道、FITC、PI等通道进样细胞，根据散射光点图调整至合适电压，使用单染管调 节补偿，调节分析速度，待点图稳定后记录数据。
数据处理：
筛选圈出主要的细胞群，在横坐标FITC-A纵坐标PI-A的点图中设置十字门，对比不同实验组对细胞凋亡的影响，输出打印数据。
采用Graph Pad Prism5软件分析数据及作图，计算各化合物诱导细胞凋亡的比例。 实验结果见图20。
实验结果表明：本发明化合物具有诱导HepG2细胞凋亡的作用，并且作用强于APG。
实施例22 HepG2细胞克隆形成实验
评价本发明化合物9抑制HepG2细胞克隆形成的作用。
实验目的：
运用结晶紫染色测定化合物抑制HepG2细胞克隆形成的作用，评价本发明化合物9对HepG2细胞克隆形成的抑制作用。
实验方法：分别取处于对数生长期形态良好的肝癌细胞消化并计数。以2×103个/孔接种到12孔板中，将孔板静置于37℃、5％CO2培养箱培养48h。加入9μM、1μ M的P4、溶剂(DMSO)对照组处理，各设两个复孔。将孔板静置于37℃、5％CO2 饱和湿度的培养箱中培养7d。移除孔板培养基，用PBS溶液洗涤两次，加入4％多聚 甲醛孵育10min。移除孔板溶液，用PBS溶液洗涤两次，加入结晶紫溶液孵育10min。 移除孔板染色液，用PBS溶液洗涤两次，晾干后拍照。
数据处理：在显微镜下拍照，用imageJ软件分析细胞面积，Graph Pad Prism5软件分析数据及作图。实验结果见图21。实验结果表明：本发明化合物具有抑制HepG2细 胞克隆形成能力的作用。
实施例23抑制HepG2细胞迁移实验
评价本发明化合物9抑制HepG2细胞迁移的作用。
实验目的：
通过细胞划痕愈伤实验和trans-well实验测试化合物抑制HepG2细胞迁移的作用， 评价本发明化合物9对HepG2细胞迁移的抑制作用。
实验方法：分别取处于对数生长期形态良好的肝癌HepG2细胞消化并计数。以2×105 个/孔的密度接种于6孔板中，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h，细胞达 到80％-90％融合度。移除培养基，使用10μl的移液枪吸头于垂直方向在6孔板中划 出笔直且宽度均匀的划痕，使用PBS溶液润洗脱落下来的细胞，加入培养基后在倒置显 微镜的100×视野下观察划痕并拍照。更换孔板中的培养基为含梯度药物的培养基，将 6孔板静置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养箱培养24h。24h后使用光学显微 镜以100×视野下继续观察同一位置的划痕上细胞愈合情况，拍照记录。
Trans-well实验：分别取处于对数生长期形态良好的肝癌HepG2细胞消化并计数。将细胞用无血清培养基重悬，最终药液浓度分别为9μM、1μM与溶媒(DMSO)对照 组，下室加入含20％胎牛血清的完全培养基，在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培 养24h。将上室取出分别用PBS溶液润洗两次，浸泡于入500μL4％多聚甲醛溶液中固 定10min。将上室取出分别用PBS溶液润洗两次，浸泡于入500μL结晶紫染色液中染 色10min。将上室取出分别用PBS溶液润洗两次，用棉签清理Transwell小室内侧残留 细胞。在光学显微镜下以100×的视野观察并拍照记录实验结果。
数据处理：在显微镜下拍照，用imageJ软件分析细胞面积，Graph Pad Prism5软件分析数据及作图。实验结果见图22。
实验结果表明：本发明化合物具有抑制HepG2细胞迁移的作用，强于APG。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一实施方案”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例、实施方案或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例、实施方案或示例中。在本 说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例、实施方案或示例。 而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例、实施方案或 示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本 说明书中描述的不同实施例、实施方案或示例以及不同实施例、实施方案或示例的特征 进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性 的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种芹菜素衍生物，其特征在于，其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药，
Figure FDA0003659577760000011
其中，R1、R3、R4分别独立的H、D或C1-C4烷基；
R2为H、D、卤素、OH、CN、NO2、NH2、NHCO-R5、CH2-R7、CHR8R9、-SO2-R10、CONH-R14、N(CH2)2、COCH2、COH、COOCH3、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、取代的C3-C8环烷基、C3-C8杂环基、取代的C3-C8杂环基，其中，取代的C1-C6烷基、取代的C3-C8环烷基、取代的C3-C8杂环基中的取代基可独立任选地被1个或多个选自氢、D、F、Cl、Br、I、-OH、-NH2、-NO2、-CN、C1-C6烷基取代；
R5为H、D、卤素、CN、NO2、OH、NH2、C1-C6烷基、NH-R6；
R6为H、D、卤素、C3-C8杂环基；
R7为H、D、卤素、OH或C1-C6烷基；
R8和R9分别独立的选自H、D、OH或C1-C6烷基；
R10为H、D、卤素、C1-C6烷基；
R14为H、D、卤素、OH、C1-C6烷基或C3-C8环烷基。
2.根据权利要求1所述的芹菜素衍生物，其特征在于，R1、R3、R4分别独立的H、D、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
3.根据权利要求1所述的芹菜素衍生物，其特征在于，R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、烯丙基、丙烯基、炔丙基、丙炔基、-CHF2、-CF3、-CHFCH2F、-CF2CHF2、-CH2CF3、-CH2CF2CHF2、甲氧基、乙氧基、正丙基氧基、异丙基氧基、-OCHF2、-OCF3、-OCHFCH2F、-OCF2CHF2、-OCH2CF3、-OCH2CF2CHF2、甲硫基、乙硫基、甲氨基、二甲氨基、乙氨基、羟甲基、2-羟基乙基、环丁基、环戊基、环己基、氮杂环丁基、吡咯烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三氮唑基、四氮唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基或取代的环丁基、环戊基、环己基、氮杂环丁基、吡咯烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三氮唑基、四氮唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基；其中，所述取代的环丁基、环戊基、环己基、氮杂环丁基、吡咯烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三氮唑基、四氮唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基可独立任选地被1、2、3、4或5个选自D、F、Cl、Br、I、-OH、-NH2、-NO2、-CN、甲基、乙基、正丙基、异丙基所取代。
4.根据权利要求1所述的芹菜素衍生物，其特征在于，R5为C1-C4烷基、NH-R6；优选的，R6为CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH(CH3)2、吡咯烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三氮唑基、四氮唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基；进一步优选的，R6为C3-C5环氧基。
5.根据权利要求1所述的芹菜素衍生物，其特征在于，R8和R9分别独立的选自OH、NH2或C1-C4烷基；R10为C1-C4烷基；R14为C1-C4烷基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的芹菜素衍生物，其特征在于，其为具有下列之一结构的化合物或具有下列之一结构的化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药：
Figure FDA0003659577760000021
Figure FDA0003659577760000031
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-6任一项所述的芹菜素衍生物。
8.如权利要求1-7任一项所述的芹菜素衍生物或如权利要求14所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肝癌为肝细胞癌；优选的，所述肝细胞癌为肝细胞癌、胆管细胞癌、混合细胞癌。
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