CN114195779A - 9-0-乙基乙醚小檗红碱的合成方法及其在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的化合物及其制备方法和用途，本发明所述的化合物为9‑0‑乙基乙醚小檗红碱，具有式Ⅰ所示的结构(其中，n为1‑50)，优选的n＝1，实验证明，本发明的9‑0‑乙基乙醚小檗红碱具有抗肿瘤作用显著，且效果优于小檗碱、安全性好、用药简单方便、原料价格低廉易得、便于运输与保存的优点，此外，本发明还公开了一种制备所述化合物的方法，该方法路线简单，可有效的节省合成时间及降低成本，操作简单，易于实施，适用于工业生产，本发明的9‑0‑乙基乙醚小檗红碱作为抗肿瘤药物具有广阔的应用前景。

Description

9-0-乙基乙醚小檗红碱的合成方法及其在制备抗肿瘤药物中 的用途

技术领域

本发明涉及一种新的抗肿瘤化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱的制备方法和用途，属于药物合成和医药卫生领域。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，据《2020-2026年中国肿瘤治疗精准医疗行业市场分析预测及投资价值咨询报告》发布的数据显示：2018年全球新增癌症患者达1810万人，因为癌症死亡人数为960万人。我国是人口大国，也是癌症高发国家，2018年我国新发病例数380.4 万例，占全球癌症新发病人数的20％以上，其中恶性肿瘤发病率为278.07/10万，死亡率为167.89/10万；恶性肿瘤在我国的高发病率和高死亡率的现状，使得中国肿瘤医疗服务市场容量不断扩大。

目前，临床上对于恶性肿瘤的治疗主要包括手术、化学和放射等方法，但手术治疗仅对少部分的癌症早期患者能够实现根治，而大多数癌症患者确诊时往往是中晚期，大部分没有手术机会。化疗副作用大，患者的生存质量较差。放射治疗是一种局部治疗方法，但对远处转移的肿瘤效果欠佳，副作用同样很大。基于上述治疗手段存在的局限性，寻找新的有效的抗恶性肿瘤的药物变得尤为关键。近年来，从天然植物中提取具有抗肿瘤活性的物质已经成为新的趋势。小檗碱，又称为黄连素，是一种异喹啉类生物碱，是从小檗属、黄连属植物的根茎中提取出的一种天然物质。近几年来，多项研究已表明，小檗碱具有抗菌抗炎、调血脂、降压、抗心律失常等多种药理学作用。但小檗碱溶解性差和吸收困难等不足等缺点，导致其生物利用度低，造成本身成药性较差。因此，对小檗碱进行结构修饰, 制备新型小檗碱衍生物,寻找生物利用度及疗效更好的小檗碱衍生物尤为重要。本发明公开的9-0-乙基乙醚小檗红碱是对小檗碱进行了结构改造，通过对裸鼠体侧髋关节皮下种植SW620结肠癌细胞、Hep3B肝癌细胞和裸鼠颈背部皮下注射肺腺癌A459细胞、143B人骨肉瘤细胞，建立结肠癌和肺癌和肝癌及骨肉瘤皮下移植瘤模型，旨在观察9-0-乙基乙醚小檗红碱抗肿瘤的作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供具有抗肿瘤作用的化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱及其制备方法和用途，本发明所提供的化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱抗肿瘤作用显著、安全性好、用药简单方便、价格低廉、便于运输与保存。其制备方法路线简单，可有效的节省合成时间及降低成本，操作简单，易于实施，适用于工业生产。

为达上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明提出的一种新的抗肿瘤化合物，其具有式Ⅰ所示的结构，

其中，n＝1-50，

优选的，所述化合物，其中n＝1-10

更优选的，所述化合物，其中n＝1-2。

最优选的，所述化合物，其中n＝1

式I中，n＝1，时，所述化合物为9-0-乙基乙醚小檗红碱。

化学命名：5,6-二氢-9-[(2-乙氧基-2-乙氧基]-1-甲氧基苯并[g]-1,3-苯并二氧戊环[5,6-α]喹啉盐酸盐

分子式：C23H24BrNO5

分子量：474.34

本发明进一步包括所述化合物的药用盐，如本发明化合物和碱形成的盐或和酸形成的盐。

本发明进一步包括所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

首先盐酸小檗碱高温条件下合成小檗红碱；

然后2-溴乙基乙醚类化合物直接与小檗红碱反应得到所述的化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱类化合物。

当n＝1时，所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)小檗红碱的合成：称取2g小檗碱置于250mL圆底烧瓶中，抽真空后于 180-210摄氏度沙浴并转动烧瓶至黄色完全消失得到深红色产物；

(2)9-0-乙基乙醚小檗红碱的合成：小檗红碱溶于适量DMF中，滴加2-溴乙基乙醚，氮气保护条件下进行反应，溶液由深红色转变为黄褐色，薄层色谱监测反应进程，反应完毕后，旋干，柱层析，二氯：甲醇＝12：1，得化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱。

其中，

步骤(1)中所述的时间为3-10个小时，优选3个小时；

步骤(2)中按照摩尔比计算，小檗红碱与2-溴乙基乙醚的比为＝1:10，优选为1:4；反应温度40-80摄氏度，优选55摄氏度；反应溶剂DMF，乙腈，乙醇，二甲基亚砜，甲苯，二甲苯等，优选DMF，柱层析中二氯甲烷与甲醇的体积比为100： 1-100：9优选12：1。

本发明进一步包括所述化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。如本发明所述的药物能够抑制裸鼠结肠癌、裸鼠肝癌、裸鼠肺癌皮下移植瘤以及裸鼠骨肉瘤细胞皮下移植瘤的生长，抑制体外肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，诱导细胞焦亡。

本发明进一步包括，含有本发明所述的化合物或药用盐的药物组合物。

所述的药物组合物，其特征在于，选自胶囊剂、片剂、口服粉剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂、乳膏剂、贴剂、喷雾剂。

本发明所述的新的抗肿瘤化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱利于生物体吸收。通过对实验人SW620结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型、A549肺癌裸鼠皮下移植瘤模型、 Hep3B肝癌裸鼠皮下移植瘤模型和143B人骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤模型以及体外对结肠癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞系进行药理实验，证实本发明的抗肿瘤化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱具有显著的抗肿瘤作用。

本发明实验路线可行且合理，得到9-0-乙基乙醚小檗红碱类总收率最高可达80％，纯度最高可达98％以上。本发明的方法工艺设计合理，切实可行，成本较低，有毒有害试剂使用较少，不对环境造成污染，适用于大量工业生产。

相对于现有技术，本发明的有益技术效果在于：

(1)抗肿瘤作用显著：9-0-乙基乙醚小檗红碱具有较好的安全性，此外所述的药物能够抑制SW620结肠癌细胞、A549肺腺癌细胞、Hep3B肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤以及143B人骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的生长，也可体外抑制结肠癌细胞系、肝癌细胞系和A549肺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和诱导细胞死亡。可以作为安全有效的预防和治疗恶性肿瘤的药物。9-0-乙基乙醚小檗红碱抗结肠癌、肺癌和骨肉瘤作用显著，且抗骨肉瘤作用优于小檗碱：9-0-乙基乙醚小檗红碱具有显著的抗结肠癌、抗肺癌和抗骨肉瘤作用，可显著抑制结肠癌SW620细胞、肺腺癌 A459细胞和143B人骨肉瘤细胞皮下移植瘤生长，并同时可体外抑制结肠癌细胞系活力和肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，诱导肺癌细胞焦亡；毒副作用低于化疗药物。9-0-乙基乙醚小檗红碱抗结肠癌和骨肉瘤效果分别接近顺铂和5-Fu。

(2)用药简单方便，人或动物口服易吸收。

(3)本发明的原料为小檗碱，成品成药性强，与其他抗肿瘤药物相比，价格便宜，性价比高，易于患者接受。

(4)便于运输与保存，密封，置阴凉处干燥即可。

附图说明

图1为9-0-乙基乙醚小檗红碱合成路线图；

图2为9-0-乙基乙醚小檗红碱核磁共振波谱图；

图3为9-0-乙基乙醚小檗红碱对人骨肉瘤细胞143B皮下移植瘤生长的影响；人骨肉瘤细胞143B皮下移植瘤模型构建成功的裸鼠分别灌胃给予剂量 5mg/kg·d-1、50mg/kg·d-1的小檗碱及0.1mg/kg·d-1、0.5mg/kg·d-1、 1mg/kg·d-1、和10mg/kg·d-1的9-0-乙基乙醚小檗红碱，腹腔注射剂量为 1mg/kg·d-1的盐酸阿霉素(DOX,1mg/kg·d-1)作为阳性对照，Control:模型对照组，接种肿瘤+给予盐水。图(A)为对上述各组裸鼠连续给药18天，期间每两天测量一次肿瘤大小，观察肿瘤体积的变化统计图。图(B)为给药第18天结束后，各组裸鼠肿瘤体积变化统计图。图(C)为给药第18天结束后，各组裸鼠肿瘤质量变化统计图。数据以均值±标准误表示，*P＜0.05,**P＜0.01,***P ＜0.001vs.Control，#P＜0.05vs.小檗碱(50mg/kg·d-1)。N＝6/组。

图4为9-0-乙基乙醚小檗红碱抑制人骨肉瘤细胞增殖

应用cck8细胞活力检测实验，9-0-乙基乙醚小檗红碱加药后143B和LM8骨肉瘤细胞分别分为五组：对照组(9-0-乙基乙醚小檗红碱0μM)，9-0-乙基乙醚小檗红碱加药组(20μM、100μM、200μM)和阳性药物Dox组(Dox 2μM)，72h 后检测(A)143B和(B)LM细胞活力值；应用细胞EdU染色实验，9-0-乙基乙醚小檗红碱加药后143B和LM8骨肉瘤细胞分别分为五组：对照组(9-0-乙基乙醚小檗红碱0μM)，9-0-乙基乙醚小檗红碱加药组(20μM、100μM、200μM)和阳性药物Dox组(Dox 2μM),N＝3/组；在给药24h后进行EdU染色镜下观察并拍照检测细胞的增殖能力，(C-D)143B和LM8细胞的EdU染色阳性的统计图， N＝4/组；(E)在给药24h后进行细胞克隆形成实验，14天后进行结晶紫染色肉眼观察并拍照检测9-0-乙基乙醚小檗对单个细胞的增殖能力的影响，N＝3。数据以均值±标准误表示，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001vs.对照。

图5 9-0-乙基乙醚小檗红碱抑制人骨肉瘤细胞侵袭和迁移应用划痕实验，9-0-乙基乙醚小檗红碱加药后143B和LM8骨肉瘤细胞分别分为五组：对照组(9-0-乙基乙醚小檗红碱0μM)，9-0-乙基乙醚小檗红碱加药组(20 μM、100μM、200μM)和阳性药物Dox组(Dox，2μM)；分别在给药0h和24h 镜下观察并拍照检测细胞的迁移能力。(A-B)143B和LM8细胞迁移距离的统计图，N＝4；细胞给予9-0-乙基乙醚小檗红碱24h后镜下观察并拍照检测细胞的侵袭能力。(C-D)143B和LM8骨肉瘤细胞侵袭能力的统计图,N＝3。数据以均值±标准误表示，***P＜0.001vs.对照。

图6为9-0-乙基乙醚小檗红碱对Hep3B肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长和细胞活力的影响；

模型对照组(Model)、阳性对照5-氟尿嘧啶组(10mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱低剂量组(1.5mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱高剂量组 (3mg/kg·d-1)，每组6只。图(A)Hep3B肝癌细胞皮下移植瘤模型构建成功的裸鼠分别灌胃给予剂量为1.5mg/kg·d-1和3.0mg/kg·d-1的9-0-乙基乙醚小檗红碱，腹腔注射剂量为10mg/kg·d-1的5-氟尿嘧啶作为阳性对照，分别观察其对Hep3B肝癌皮下移植瘤生长的影响。数据以均值±标准误表示，*P＜0.05 vs.Model，N＝6/组。(B-C)CCK8法检测50μM，100μM，200μM、400μM和800μM 的9-0-乙基乙醚小檗红碱对Hep3B细胞系和PLC5肝癌细胞系的活力的影响。数据以均值±标准差表示，*P＜0.05vs.对照，N＝3/组。

图7为9-0-乙基乙醚小檗红碱对肺腺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响图(A)为给药第28天结束后，各组裸鼠肿瘤体积变化统计图。图(B)为给药第28天结束后，各组裸鼠肿瘤质量变化统计图。肿瘤模型对照组、阳性对照药物顺铂组(DDP,2mg/kg·2d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱低剂量组(1mg/kg·d-1)、 9-0-乙基乙醚小檗红碱中剂量组(3mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱高剂量组(10mg/kg·d-1)，N＝6/组。数据以均值±标准误表示，**P＜0.01,***P＜0.001 vs.模型。

图8为9-0-乙基乙醚小檗红碱对A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响 (A)给药处理48h后采用CCK8检测细胞活力。N＝3(B)A549细胞接种于24孔板，经药物处理24h后，进行Ki-67染色，与Control组比较，9-0-乙基乙醚小檗红碱可抑制A549细胞的过度增殖(n＝3)；(C)1×104个细胞接种于Transwell 小室，给药24h后检测A549细胞的侵袭率(n＝4)；(D)细胞接种待汇合度达到 80％后，加入不同剂量药物，分别于12、24h拍照检测细胞迁移距离，9-0-乙基乙醚小檗红碱在不同时间点均能抑制A549细胞迁移(n＝4)。数据以均值±标准误表示，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001vs.对照。

图9为9-0-乙基乙醚小檗红碱对A549细胞焦亡的影响；

(A)Heochst33342/PI双染各组药物的PI阳性细胞比例；(B)Annexin V/FITC 结合流式细胞仪检测各组药物的焦亡细胞比例(Q2区)N＝4。数据以均值±标准误表示，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001vs.对照。

图10为9-0-乙基乙醚小檗红碱对裸鼠SW620结肠癌细胞皮下移植瘤生长的影响SW620结肠癌细胞皮下移植瘤模型构建成功的裸鼠分别灌胃、腹腔注射给予9-0- 乙基乙醚小檗红碱(100mg/kg/d)，紫杉醇(TAX,15mg/kg/d),观察其对结肠癌皮下移植瘤生长的影响。(A)不同时间点肿瘤的体积；(B)肿瘤质量。数据以均值±标准误表示，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001vs.模型,N＝6。

图11为9-0-乙基乙醚小檗红碱对多种结肠癌细胞增殖的影响；

结肠癌细胞系HCT-116、SW620、Lovo分别用25μM，50μM，100μM，200μM， 400μM和800μM的9-0-乙基乙醚小檗红碱处理。图(A-C)MTT法检测48h后 9-0-乙基乙醚小檗红碱对结肠癌细胞系活力的影响。数据以均值±标准误表示， *P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001vs.对照，N＝3。

具体实施方式

下面结合附图(表)及具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 9-0-乙基乙醚小檗红碱的制备

称取盐酸小檗碱2g置于100mL圆底烧瓶中，向内加入搅拌子、50Ml DMF和沸石若干，240W条件下微波反应20分钟。反应结束冷却后，减压蒸馏除去溶剂DMF。干法硅胶柱层析纯化，洗脱剂为V(二氯甲烷):V(甲醇)＝10:1进行洗脱，减压蒸去溶剂，得到深红色固体小檗红碱。

取小檗红碱(12g,37mmol)置于250mL圆底烧瓶中，以DMF(3mL)为溶剂，在50℃下缓慢滴加2-溴乙基乙醚(24mL,100mmol)，50摄氏度反应24小时。用碳酸氢钠水溶液萃取(20mL×3)，合并有机相，饱和食盐水萃取有机相 (30mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，得到粗产物为紫黄色固体。硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(v/v 20:1)洗脱，得黄色产物纯品9.6g。收率65％，纯度98％以上。

9-0-乙基乙醚小檗红碱的合成路线如图1所示，其中n＝1。

实施例2

目标化合物(实施例1)结构鉴定

1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),8.97(s,1H),8.21(d,J＝9.1 Hz,1H),8.02(d,J＝9.1Hz,1H),7.81(s,1H),7.10(s,1H),6.18(s, 2H),4.94(t,J＝6.2Hz,2H),4.42(t,J＝4.5Hz,2H),3.78(t,J＝4.4 Hz,2H),3.47(dq,J＝27.4,6.7Hz,2H),3.33(s,2H),3.22(t,J＝6.3 Hz,2H),1.07(dt,J＝18.0,7.0Hz,4H)。

13C NMR(151MHz,DMSO)δ150.85,150.19,148.07,145.76,143.42,143.00,137.79,133.31,130.97,126.97,123.92,122.24,120.83,120.62,115.67, 108.82,105.82,102.48,98.80,73.43,69.24,65.86,57.41,56.39,55.85, 40.44,40.33,40.19,40.05,39.91,39.77,39.63,39.49,29.37,26.76, 18.94,15.51。

综合上述信息确定该化合物结构如式Ⅰ所示，其中n＝1，9-0-乙基乙醚小檗红碱核磁共振波谱图如图2所示。

实施例3本发明产品的功效性试验1

9-0-乙基乙醚小檗红碱对143B人骨肉瘤细胞皮下移植瘤生长影响的研究 1、实验材料实验动物：BALB/c-nu裸鼠，雄性，体重18±2g，48只。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

主要药品：盐酸阿霉素、小檗碱、9-0-乙基乙醚小檗红碱(实施例1制备)

2、实验方法

(1)骨肉瘤动物模型的构建：采用裸鼠颈背部皮下注射143B人骨肉瘤细胞建立异位骨肉瘤动物模型。143B人骨肉瘤细胞收集后，制成5×105个/mL的细胞悬液，每只裸鼠颈背部皮下注射100μL细胞悬液。

(2)实验分组：雄性裸鼠48只，随机分成8组：模型对照组、阳性对照盐酸阿霉素组(1mg/kg·d-1)、小檗碱低剂量组(5mg/kg·d-1)、小檗碱高剂量组 (50mg/kg·d-1)9-0-乙基乙醚小檗红碱极低剂量组(0.1mg/kg·d-1)、9-0- 乙基乙醚小檗红碱低剂量组(0.5mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱中剂量组(1mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱高剂量组(5mg/kg·d-1)，每组6只。

(3)给药方式：阳性对照组裸鼠腹腔注射盐酸阿霉素，其余各组灌胃给药。

(4)检测指标：评价肿瘤在临床分期和预后效果的重要指标就是肿瘤的生长速度，因此，选择用药前后，连续观察检测肿瘤体积的变化和给药18天后，取材，拍照并记录肿瘤重量、长和宽，能够客观评价9-0-乙基乙醚小檗红碱的抗骨肉瘤作用。

(5)检测方法：异位骨肉瘤模型建立后，各组裸鼠连续给药。给药后，观察肿瘤生长情况。隔两天记录肿瘤体积变化，给药18天后取材、拍照，观察成瘤情况和裸鼠生存情况，直到实验结束。

3、实验数据与实验结果

3.1数据处理

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，36F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性差异；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.2实验结果

给药结束后，取各组裸鼠肿瘤组织，比较各组裸鼠肿瘤组织大小。结果显示(如图3A-C所示):与模型对照组相比，阳性药物对照组肿瘤体积显著降低，生长速度显著减慢，并且具有统计学意义，说明本研究的实验方法和技术稳定、可靠。小檗碱高剂量组(50mg/kg·d-1)，9-0-乙基乙醚小檗红碱中剂量组 (1mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱高剂量组(5mg/kg·d-1)均能明显降低肿瘤体积以及肿瘤重量。这说明本发明的9-0-乙基乙醚小檗红碱能够有效抑制143B人骨肉瘤细胞皮下移植瘤的生长。小檗碱低剂量组(5mg/kg·d-1)对骨肉瘤无抑制效果，而同剂量的9-0-乙基乙醚小檗红碱可以显著抑制骨肉瘤生长； 9-0-乙基乙醚小檗红碱高剂量组(5mg/kg·d-1)的肿瘤质量要显著低于小檗碱高剂量组(50mg/kg·d-1)(#P＜0.05)，说明其抗骨肉瘤效果显著优于小檗碱。

实施例4本发明产品的功效性试验2

9-0-乙基乙醚小檗红碱对骨肉瘤细胞增殖的影响

1实验方法

1.1实验分组设计：

实验按照9-0-乙基乙醚小檗红碱加药后分为以下五组:对照组(9-0-乙基乙醚小檗红碱0μM)，9-0-乙基乙醚小檗红碱加药组(20μM、100μM、200μM) 和阳性药物Dox组(Dox 2μM)。分别加药至同等细胞数量的143B骨肉瘤细胞以及LM8骨肉瘤细胞。

1.2 CCK8实验检测骨肉瘤细胞活力值

在给药72h后分别对143B和LM8进行cck8检测(450nm)实验。

1.3 EdU染色实验检测骨肉瘤细胞增殖能力

将各组加药24h后的143B骨肉瘤细胞以及LM8骨肉瘤细胞固定并进行EdU染色，共聚焦显微镜下观察并拍照记录细胞增殖情况，计算EdU阳性细胞数目(细胞核数目)占所有细胞的百分比。

1.4克隆形成实验检测骨肉瘤单个细胞增殖能力

将各组加药24h后的143B骨肉瘤细胞消化后计数，重新铺板6孔板中5000个细胞/孔，第7天更换培养液一次，14天后收样固定，结晶紫染色观察并拍照记录细胞克隆形成情况。

3、实验数据与实验结果

3.1数据处理

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，36F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性差异；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.2实验结果

如图4A-B所示，与9-0-乙基乙醚小檗红碱0μM对照组比(Ctl)，给予9-0-乙基乙醚小檗红碱的143B和LM8骨肉瘤细胞的细胞活力明显降低，且呈剂量依赖性。EdU染色实验结果如图4C-D所示，与对照组比，143B和LM8骨肉瘤细胞在给予9-0-乙基乙醚小檗红碱24h后细胞增殖能力受到显著抑制，并且抑制程度随药物浓度增加而增强。克隆形成实验结果如图4D所示，与对照组比，143B骨肉瘤细胞在给予9-0-乙基乙醚小檗红碱24h后细胞克隆形成能力受到显著抑制，并且抑制程度随9-0-乙基乙醚小檗红碱浓度增加而增强。

实施例5本发明产品的功效性试验3

9-0-乙基乙醚小檗红碱对骨肉瘤细胞增殖侵袭和迁移的影响

1、实验材料

实验对象：143B、LM8贴壁肝癌细胞

受试物：9-0-乙基乙醚小檗红碱(实施例1-2制备)

主要试剂及仪器：CCK8、EDU试剂盒、酶标仪和荧光显微镜

2实验方法

2.1实验分组设计：

实验按照9-0-乙基乙醚小檗红碱加药后分为以下五组:对照组(9-0-乙基乙醚小檗红碱0μM)，9-0-乙基乙醚小檗红碱加药组(20μM、100μM、200μM) 和阳性药物Dox组(Dox 2μM)。分别加药至同等细胞数量的143B骨肉瘤细胞以及LM8骨肉瘤细胞。在加药24h后镜下观察并拍照记录细胞的迁移和侵袭情况。

2.2划痕实验检测骨肉瘤细胞迁移能力

利用200μl枪头在143B骨肉瘤细胞以及LM8骨肉瘤细胞表面进行痕，使划痕宽度尽量保持一致，分别在加药24h后显微镜下观察并拍照记录两侧细胞迁移情况。

2.3细胞侵袭实验检测骨肉瘤细胞侵袭能力将各组加药24h后143B骨肉瘤细胞以及LM8骨肉瘤细胞消化后用空培重悬至小室上方，小室下方放置完全培养基，24h后固定并进行结晶紫染色，显微镜下观察并拍照记录细胞侵袭情况。

3、实验数据与实验结果

3.1数据处理

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，36F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性差异；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.2实验结果

划痕实验结果如图5A-B所示，与加药0h对照组比，143B和LM8骨肉瘤细胞在给予9-0-乙基乙醚小檗红碱24h后细胞迁移能力受到显著抑制，并且抑制程度随9-0-乙基乙醚小檗红碱浓度增加而增强。侵袭实验结果如图5C-D所示，与空白对照组比，143B和LM8骨肉瘤细胞在给予9-0-乙基乙醚小檗红碱24h后细胞侵袭能力受到显著抑制，并且抑制程度随药物浓度增加而增强。

实施例6本发明产品的功效性试验4

9-0-乙基乙醚小檗红碱对Hep3B肝癌裸鼠皮下移植瘤生长影响的研究

1、实验材料

实验动物：BALB/c-nu裸鼠，雄性，体重18±2g，24只。由上海斯莱克实验动物公司提供。

主要药品：5-氟尿嘧啶、9-0-乙基乙醚小檗红碱(实施例1-2制备)

2、实验方法

(1)肝癌动物模型的构建：采用裸鼠体侧髋关节皮下注射Hep3B肝癌细胞建立异位肝癌动物模型。Hep3B肝癌细胞收集后，制成3×107个/mL的细胞悬液，每只裸鼠体侧髋关节皮下注射100μL细胞悬液。

(2)实验分组：雄性裸鼠24只，随机分成4组：模型对照组、阳性对照5-氟尿嘧啶组(10mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱低剂量组(1.5mg/kg·d-1)、 9-0-乙基乙醚小檗红碱高剂量组(3mg/kg·d-1)，每组6只。

(3)给药方式：阳性对照组裸鼠腹腔注射5-氟尿嘧啶，其余各组灌胃给药。

(4)检测指标：评价肿瘤在临床分期和预后效果的重要指标就是肿瘤的生长速度，因此，选择用药前后，连续观察检测肿瘤体积的变化，能够客观评价9-0- 乙基乙醚小檗红碱的抗肝癌作用。

(5)检测方法：异位肝癌模型建立后，各组裸鼠连续给药。给药后，观察肿瘤生长情况。隔两天记录肿瘤体积变化，给药四周后，观察并且测量肿瘤的体积，直到实验结束。

3、实验数据与结果

3.1数据处理

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，36F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性差异；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.2实验结果

给药结束后，取各组裸鼠肿瘤组织，比较各组裸鼠肿瘤组织大小。结果显示(如图6A所示):与模型对照组相比，阳性药物对照组肿瘤体积显著降低，生长速度显著减慢，并且具有统计学意义，说明本研究的实验方法和技术稳定、可靠。9-0- 乙基乙醚小檗红碱组肿瘤体积与模型对照组比都显著降低，肿瘤体积减小，生长速度显著减慢，具有统计学意义，且对肝癌生长的抑制效果接近5-Fu。这说明本发明的9-0-乙基乙醚小檗红碱能够有效抑制肝癌Hep3B细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。

实施例7本发明产品的功效性试验5

9-0-乙基乙醚小檗红碱对Hep3B、PLC5肝癌细胞增殖影响的研究

1、实验材料

实验对象：Hep3B、PLC5贴壁肝癌细胞

受试物：9-0-乙基乙醚小檗红碱(实施例1-2制备)

主要试剂及仪器：CCK8试剂盒和酶标仪

2、实验方法

2.1细胞传代培养

将复苏的细胞加入含有10％胎牛血清、1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养液中，置于37℃、5％CO2含量的培养箱中培养。细胞覆盖率达到80％时，使用0.25％胰酶消化，磷酸缓冲液清洗细胞，重新加入新鲜的培养液，继续扩增培养细胞，直到数量达到实验要求。

2.2 CCK8实验

(1)铺板

T-25细胞培养瓶或者10cm细胞培养皿中的细胞处于对数生长期，细胞覆盖率达到80％以上，细胞数量达到实验需要。收集细胞，制成浓度为1×104个/mL的细胞悬液。混合均匀后，加入到96孔板中，200μL/孔，震荡摇匀，放置在37℃、 5％CO2含量的培养箱中培养。

(2)加药

细胞铺板24小时后，根据试验设计，各孔中分别加入浓度为50μM，100μM， 200μM,400μM和800μM的药物工作液。

(3)检测

培养48小时后，去除药物工作液，加入110μL的CCK-8反应液，避光孵育90 分钟。在波长450nm的吸收光条件下，测定各孔中的吸光度值。

3、实验结果

CCK8实验结果显示：(如图6B-C所示)与空白对照相比，不同浓度的的9-0-乙基乙醚小檗红碱均能降低Hep3B和PLC5肝癌细胞的活力，且抑制率随浓度升高而增加。综上：9-0-乙基乙醚小檗红碱对Hep3B和PLC5肝癌细胞的增殖均有抑制作用。

实施例8本发明产品的功效性试验6

9-0-乙基乙醚小檗红碱对A549肺腺癌裸鼠皮下移植瘤生长影响的研究

1、实验材料

实验动物：BALB/c-nu裸鼠，6-7周，雄性30只/雌性30只。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

主要药品：顺铂、9-0-乙基乙醚小檗红碱(实施例1-2制备)

2、实验方法

(1)肺癌动物模型的构建：采用右背部皮下注射肺腺癌A549细胞建立异位肺癌动物模型。肺腺癌A549细胞收集后，制成5×107个/mL的细胞悬液，每只裸鼠右背部皮下注射200μL细胞悬液。

(2)实验分组：肿瘤造模1天后，将裸鼠随机分为5组。其中包括肿瘤模型对照组、阳性对照药物顺铂组(2mg/kg·2d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱低剂量组 (1mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱中剂量组(3mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱高剂量组(10mg/kg·d-1)，每组6只。

(3)给药方式：阳性药组每两天腹腔注射顺铂1次，受试药物组每天灌胃给药，共给药28天。

(4)检测指标：每3天监测1次体重并测量肿瘤大小；给药28天后，取材，拍照并记录肿瘤重量、长和宽。

(5)检测方法：异位肺癌模型建立后，各组裸鼠连续给药。每3天监测一次体重并测量肿瘤大小，给药28天后取材，测量肿瘤体积及称取肿瘤质量，并拍照。

3.1数据处理

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，36F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性差异；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.2实验结果

给药结束后，取各组裸鼠肿瘤组织，比较各组裸鼠肿瘤组织大小。结果显示(如图5A-C所示):与模型对照组相比，阳性药物顺铂给药组肿瘤体积显著降低，生长速度显著减慢，并且具有统计学意义，说明本研究的实验方法和技术稳定、可靠。与肿瘤模型组相比，9-0-乙基乙醚小檗红碱低剂量(1mg/kg·d-1)、9-0- 乙基乙醚小檗红碱中剂量(3mg/kg·d-1)、9-0-乙基乙醚小檗红碱高剂量(10mg/kg·d-1)能够降低荷瘤小鼠的肿瘤体积(p<0.001)和重量(p<0.01)。这说明本发明的9-0-乙基乙醚小檗红碱能够有效抑制肺腺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。

实施例9本发明产品的功效性试验7

9-0-乙基乙醚小檗红碱对A549肺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和焦亡影响的研究

1、实验材料

实验动物：人源肺癌细胞系A549(哈尔滨医科大学药理实验室)

主要药品：顺铂、9-0-乙基乙醚小檗红碱(实施例1-2制备)

主要试剂配制：

1)9-0-乙基乙醚小檗红碱的配制：称取0.0474g 9-0-乙基乙醚小檗红碱分别溶于1mL DMSO中，用0.2μm微孔滤膜过滤后配成浓度为100mmol/L，用无FBS 的1640培养液稀释至10μM、30μM和100μM。

2)顺铂溶液的配制：将10mg的注射用粉末用10mL的双蒸水溶解成1mg/mL药物原液，吸取5μL原液于0.995mL无FBS的1640培养液，稀释成5μg/ml。

2、实验方法

2.1 CCK8实验

(1)铺板T-25细胞培养瓶或者10cm细胞培养皿中的细胞处于对数生长期，细胞覆盖率达到80％以上，细胞数量达到实验需要。收集细胞，制成浓度为1×104 个/mL的细胞悬液。混合均匀后，加入到96孔板中，200μL/孔，震荡摇匀，放置在37℃、5％CO2含量的培养箱中培养。

(2)加药细胞铺板24小时后，根据试验设计，各孔中分别加入浓度为50μM， 100μM，200μM,400μM和800μM的药物工作液。

(3)检测培养48小时后，去除药物工作液，加入110μL的CCK-8反应液，避光孵育90分钟。在波长450nm的吸收光条件下，测定各孔中的吸光度值。

2.2 Ki67检测A549细胞增殖实验

(1)细胞铺板，待细胞生长至70％-80％时，将实验分为空白对照组、顺铂组、 10μM、30μM和100μM 9-0-乙基乙醚小檗红碱组，分别加入无血清培养液、顺铂、不同剂量的9-0-乙基乙醚小檗红碱后继续培养24h。

(2)弃细胞培养液，用PBS清洗三次，吸干PBS，加入1mL的4％多聚甲醛室温固定30min。吸出多聚甲醛，PBS清洗两遍，吸干，加入500μL的免疫荧光染色通透液，20min后吸干液体，PBS清洗一次。按照Anti-ki67：一抗稀释液＝1： 500配制一抗，每孔加入90μL的一抗，4℃湿盒中孵育过夜。按照二抗：二抗稀释液＝1：100配制二抗，每孔加入90μL的二抗，避光孵育1h。(12)避光拍照。(13)用KI67阳性细胞数目除以细胞总数目(细胞核数目)作为细胞增殖的指标

2.3 Transwell实验

(1)将基质胶、200μL枪头、1.5mL EP管、EP管架和小室4℃预冷过夜。

(2)用预冷的无血清培养液按8:1将基质胶稀释，每孔加入50μL，37℃培养箱中放置1h。(3)取对数生长期的A549细胞，用胰酶消化。终止消化后取1μL 细胞液于1mLPBS中，并使用流式细胞仪计数。(4)将2ml的细胞混悬液于1500 rpm，5min离心，PBS洗2次，用含10g/LBSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度为5×105个/mL。(5)取细胞悬液200μL加入到小室上孔中，下孔分别加入500μL的无血清培养液、DDP、10μmol/L、30μmol/L和100μmol/L的9-0-乙基乙醚小檗红碱，去除上、下室之间的气泡，37℃，5％CO2孵育24h。(6) 24h后，取出小室，用棉签将小室上层的基质胶和细胞擦去，PBS洗两次，晾干。 (7)加入2mL固定液固定15min。(8)弃去固定液，PBS清洗三次，每次5min。 (9)加入1mL染色液，染色10min。(10)弃去染色液，加入1mL调色液A+1滴调色液B，快速混匀，染色5min。(11)弃去调色液，PBS清洗，显微镜下拍照。

2.3划痕实验

(1)取对数生长期的A549细胞用胰酶消化，并加入4mL有血清培养液终止消化，用吸管反复吹打混匀。(2)六孔板中每孔先加入1mL有血清培养液，再加入1mL 细胞悬液，十字轻晃混匀。(3)当细胞生长至90％以上，使用10μL小枪头在六孔板孔中央轻轻呈直线划过，并用PBS清洗两次。(4)吸干PBS，将实验分为空白对照组、顺铂组、10μmol/L、30μmol/L和100μmol/L 9-0-乙基乙醚小檗红碱组，分别加入无血清培养液、顺铂、不同剂量的9-0-乙基乙醚小檗红碱后继续培养24h。(5)在0h、12h、24h在显微镜下拍照，记录同一划痕区域细胞迁移生长情况。(6)用Image Pro Plus软件分析照片。

2.4 AnnexinV-FITC/PI结合流式细胞仪(1)细胞在六孔板中铺板加药，实验分为空白对照组、顺铂组、10μmol/L、30μmol/L和100μmol/L 9-0-乙基乙醚小檗红碱组。(2)每孔加入500μL的不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心15min，沉淀细胞。加入1ml预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸出上清(3)用去离子水：结合缓冲液＝1：3比例稀释缓冲液。(4)用1x结合液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1-5x106/ml。(5)取100μL的细胞悬液于1.5mLEP管中，加入5μLAnnexin V/FITC 混匀后于室温避光孵育5min。(6)加入10μL的PI，并加入400μL的PBS混匀后，立即进行检测。

2.5 Hoechst 33342/PI双染实验

(1)细胞在六孔板中铺板加药，实验分为空白对照组、顺铂组、10μmol/L、 30μmol/L和100μmol/L 9-0-乙基乙醚小檗红碱组。(2)固定培养的细胞消化收集后，将105-106个细胞悬浮于1mL培养基中(3)加入10lμLHeochst 33342 染液，混匀，37℃孵育5-15min。(4)细胞于4℃，1000r/min离心5min后弃去上清液。(5)用双蒸水将10xBuffer A稀释10倍后，加入1mLBuffer A工作液悬浮细胞，加入5μLPI染液，室温避光孵育10min。(6)吸取100μL细胞悬液，滴在载玻片上，盖上盖玻片，吸干周围液体，荧光显微镜下拍照观察。

3.1数据处理

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，36F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性差异；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.2实验结果

CCK8结果显示，与空白对照相比，9-0-乙基乙醚小檗红碱浓度依赖性的降低A549细胞活力(图8A)。Ki67免疫荧光染色结果显示(图8B)：与空白对照组相比， 9-0-乙基乙醚小檗红碱组Ki67的荧光强度显著降低，且具有浓度依赖性(P< 0.05)。以上结果说明，9-0-乙基乙醚小檗红碱能够抑制A549细胞的增殖。迁移实验结果显示(图8C)，与空白对照组比较，给予不同浓度的9-0-乙基乙醚小檗红碱作用12h和24h后，A549细胞的迁移受到显著抑制(P<0.05)，且呈浓度依赖性。Transwell实验结果显示(图8D)，与空白对照组相比，不同浓度9-0-乙基乙醚小檗红碱均能极显著地降低A549细胞的侵袭率(P<0.001)。焦亡是一种炎症依赖性的细胞死亡方式，表现出凋亡和坏死的共同特征。通过 hoechst33342/PI对A549细胞进行双重染色，结果显示(图9A),与空白对照组比9-0-乙基乙醚小檗红碱9-0-乙基乙醚小檗红碱诱导的PI阳性细胞比例呈剂量增加趋势。此外，所有具有核浓缩的细胞在细胞膜上均可被annexin V染色，所以细胞焦亡与凋亡一样均被annexin V染色呈阳性，但焦亡染色较弱，且染色过程不同。结果如图9B显示，使用annexin V-FITC/PI结合流式细胞仪分析了9-0- 乙基乙醚小檗红碱作用24h后A549细胞的焦亡率。结果表明9-0-乙基乙醚小檗红碱显著且剂量依赖性地增加了焦亡细胞的比率，并相应地降低了A549细胞的细胞活力。综上所述，9-0-乙基乙醚小檗红碱能显著诱导A549细胞的细胞焦亡。

实施例10本发明产品的功效性试验8

9-0-乙基乙醚小檗红碱对裸鼠SW620结肠癌细胞皮下移植瘤生长影响的研究 1、实验材料实验动物：BALB/c-nu裸鼠，雄性，体重18±2g，18只。由上海斯莱克实验动物公司提供。

主要药品：紫杉醇、9-0-乙基乙醚小檗红碱(实施例1-2制备)

2、实验方法

(1)结肠癌动物模型的构建：采用SW620结肠癌细胞建立异位结肠癌动物模型。SW620结肠癌细胞收集后，制成5×107个/mL的细胞悬液，每只裸鼠体侧髋关节皮下注射100μL细胞悬液。

(2)实验分组：雄性裸鼠24只，随机分成3组：模型对照组、阳性对照药物紫杉醇组、9-0-乙基乙醚小檗红碱组，每组8只。

(3)给药方式：阳性对照组裸鼠腹腔注射紫杉醇(15mg/kg·d-1)；裸鼠灌胃给予9-0-乙基乙醚小檗红碱(20mg/kg·d-1)。每组8只，裸鼠皮下注射SW620结肠癌细胞悬液5天后给药，连续给药12天。

(4)检测指标：评价结肠癌在临床分期和预后效果的重要指标就是肿瘤的生长速度，因此，选择用药前后，连续观察检测肿瘤体积的变化，能够客观评价9-0- 乙基乙醚小檗红碱的抗结肠癌作用。

(5)检测方法：异位结肠癌模型建立后，各组裸鼠连续给药12天。观察并且测量肿瘤的体积，每两天一次，直到实验结束，最终检测各组小鼠肿瘤质量。

3.1数据处理

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，36F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性差异；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.2实验结果

给药结束后，取各组小鼠肿瘤组织，比较各组小鼠肿瘤组织大小和重量。结果显示(如图11A-B所示):与模型对照组相比，阳性药物对照组肿瘤体积显著降低，生长速度显著减慢，并且具有统计学意义，说明本研究的实验方法和技术稳定、可靠。9-0-乙基乙醚小檗红碱组肿瘤体积与模型对照组比都显著降低，肿瘤质量减小，生长速度显著减慢，具有统计学意义。这说明本发明的9-0-乙基乙醚小檗红碱能够有效抑制结肠癌SW620细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。

实施例11本发明产品的功效性试验9

9-0-乙基乙醚小檗红碱对结肠癌细胞增殖影响的研究

1、实验材料

实验对象：HCT-116、SW620、Lovo结肠癌细胞系

受试物：9-0-乙基乙醚小檗红碱(实施例1-2制备)

主要试剂及仪器：MTT噻唑蓝(Solarbio公司)、二甲基亚砜(天津市致远化学试剂有限公司)、CO2培养箱(Thermo公司)、光学显微镜(Olympus公司)、超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)、细胞计数板(OIUJNG)、往复式脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、酶联免疫检测仪(美国伯爵仪器有限公司)

2、实验方法

2.1细胞培养

分别将HCT-116、SW620和Lovo结肠癌细胞复苏后培养在含10％FBS的1640中，同时加入100U/mL的青链霉素，在5％CO2，37℃培养箱中培养。每天换液，每隔两天传代一次，按需要分瓶。

2.2 MTT实验

(1)铺板收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度至5-10×104/mL，分于96 孔板，每孔加入200μL。置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时。

(2)加药将配置好的9-0-乙基乙醚小檗红碱母液用无FBS的培养液分别稀释成12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL和400μg/mL的溶液，吸去96孔板中的培养液，加入不同浓度的药物，每孔200μL。置37℃、5％CO2 细胞培养箱中培养24小时。

(3)检测小心吸去上清，每孔加入200μL现配好的0.5％MTT噻唑蓝，继续培养4小时。终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的OD值。

3.1数据处理

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，36F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性差异；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.2实验结果

MTT实验结果显示：(如图4A-C所示)与空白对照相比不同的9-0-乙基乙醚小檗红碱均能降低HCT-116、SW620、Lovo结肠癌细胞的活力，且抑制率随浓度升高而增加。综上：9-0-乙基乙醚小檗红碱对HCT-116、SW620、Lovo结肠癌细胞增殖均有抑制作用。

Claims (10)

1.具有式Ⅰ结构的化合物：

其中，n＝1-50。

2.根据权利要求1所述化合物，其中n＝1。

3.权利要求1或2所述化合物的药用盐。

4.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

首先盐酸小檗碱高温条件下合成小檗红碱；

然后2-溴乙基乙醚类化合物直接与小檗红碱反应得到所述的化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱类化合物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，当n＝1时，包括以下步骤：

(1)小檗红碱的合成：称取2g小檗碱置于250mL圆底烧瓶中，抽真空后于180-210摄氏度沙浴并转动烧瓶至黄色完全消失得到深红色产物；

(2)9-0-乙基乙醚小檗红碱的合成：小檗红碱溶于适量DMF中，滴加2-溴乙基乙醚，氮气保护条件下进行反应，溶液由深红色转变为黄褐色，薄层色谱监测反应进程，反应完毕后，旋干，柱层析，二氯：甲醇＝12：1，得化合物9-0-乙基乙醚小檗红碱。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中，

步骤(1)中所述的时间为3-10个小时，优选3个小时；

步骤(2)中按照摩尔比计算，小檗红碱与2-溴乙基乙醚的比为＝1:10，优选为1:4；反应温度40-80摄氏度，优选55摄氏度；反应溶剂DMF，乙腈，乙醇，二甲基亚砜，甲苯，二甲苯等，优选DMF，柱层析中二氯甲烷与甲醇的体积比为100：1-100：9优选12：1。

7.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的药物能够抑制裸鼠结肠癌、裸鼠肝癌、裸鼠肺癌皮下移植瘤以及裸鼠骨肉瘤细胞皮下移植瘤的生长，抑制体外肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，诱导细胞焦亡。

9.含有权利要求1-3任意一项权利要求所述的化合物或药用盐的药物组合物。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，选自胶囊剂、片剂、口服粉剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂。

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