CN105732560B - 金雀异黄酮衍生物及其制备方法和在制药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，公开了式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐。本发明还公开了金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用、在制备治疗炎症相关的肿瘤药物中的应用、在制备抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的药物中的应用。本发明金雀异黄酮衍生物通过对肿瘤细胞产生生长抑制及杀伤作用从而起到抗肿瘤作用，具有广谱抗肿瘤活性，具有较好的效果；对AOM/DSS诱导炎症相关的肿瘤有很好的治疗效果；具有较好的抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的能力，可用于制备抗肿瘤转移的药物，可制备成各种剂型的抗肿瘤转移的药物，为肿瘤病人提供了更好的选择。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及金雀异黄酮衍生物及其制备方法和在制药中的应用，特别是涉及金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
抗肿瘤药物通过不同的机制发挥抗肿瘤的作用，如有文献将化疗药物按传统分类分为烷化剂、抗代谢物、抗癌抗生素、植物药、激素等。也可按作用机制分为直接破坏DNA的药物，插入DNA模板的药物、干扰核酸合成的药物、抑制微管装配的药物、影响蛋白质合成的药物，以及其他作用机制类药物等等。了解抗肿瘤药物的作用机制更有利于在临床治疗时根据肿瘤与药物的特征正确选择相应药物。
金雀异黄酮是大豆的活性组分之一，具有明显的抗肿瘤作用，是一个具有广阔应用前景的天然抗肿瘤药物。然而，金雀异黄酮药理作用广泛，其抗肿瘤作用的机制目前尚未完全阐明。金雀异黄酮的抗肿瘤作用已有报导，为了进一步提高其疗效，人们致力于对其结构进行改造以寻求疗效更高、毒副作用更小的衍生物。
发明内容
发明人的目的是通过对金雀异黄酮的一系列衍生物的研究和筛选，提供一种具有良好的抗肿瘤活性的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，及其制备方法和在制药中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，
式I结构所示的金雀异黄酮衍生物的化学名称：7,4’-二[2-羟基-3-(哌啶-1-基)丙氧基]-5-羟基异黄酮。
式I结构所示的金雀异黄酮衍生物可与下列酸形成药学上可接受的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、乙酸、马来酸或苯磺酸。
本发明的另一个目的是提供式I结构所示的金雀异黄酮衍生物的制备方法。
式I结构所示的金雀异黄酮衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)、金雀异黄酮(Genistein，简称GEN)与氯代环氧丙烷在无水溶剂中，在催化剂催化下反应得到7,4’-二(2,3-环氧丙氧基)-5-羟基异黄酮；
(2)、7,4’-二(2,3-环氧丙氧基)-5-羟基异黄酮在无水溶剂中与哌啶反应生成式I结构所示的金雀异黄酮衍生物，
步骤(1)中，所述的金雀异黄酮与氯代环氧丙烷在无水溶剂中加热回流反应生7,4’-二[2,3-环氧丙氧基]-5-羟基异黄酮；所述的无水溶剂为无水乙醇或无水甲醇。
所述的金雀异黄酮和环氧氯丙烷的摩尔比为1：2～12。
所述的催化剂为碳酸钾和碘化钾；所述的碳酸钾和金雀异黄酮的摩尔比为1.0～1.2：1，所述的碘化钾的量为催化量。
步骤(1)中得到的为7,4’-二(2,3-环氧丙氧基)-5-羟基异黄酮和副产物，混合物可不经分离，直接用于下步反应。
步骤(2)中，所述的7,4’-二(2,3-环氧丙氧基)]-5-羟基异黄酮和哌啶的摩尔比为1：2～4。
所述的7,4’-二(2,3-环氧丙氧基)-5-羟基异黄酮在无水溶剂中与哌啶加热回流反应生成式I结构所示的金雀异黄酮衍生物。所述的无水溶剂为无水乙醇或无水甲醇。
反应结束后，反应产物采用柱层析分离，洗脱液为氯仿∶甲醇＝100∶3(V：V)或二氯甲烷∶甲醇＝100∶3(V：V)。
本发明式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐通过对肿瘤细胞产生生长抑制及杀伤作用从而起到抗肿瘤作用，对人结肠癌HCT-116细胞株、HT-29细胞株、SW620细胞株的体外生长具有显著的抑制作用，对其他肿瘤细胞如人肝癌BEL-7402细胞株、单核巨噬细胞株THP-1等的体外生长也具有显著的抑制作用，表现出广谱抗癌性。本发明的另一个目的是提供式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤为结肠癌、肝癌、白血病、胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌。
本发明式I结构所示的金雀异黄酮衍生物对AOM/DSS诱导炎症相关的肿瘤有很好的治疗效果。本发明的另一个目的是提供式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗炎症相关的肿瘤药物中的应用。所述的炎症相关的肿瘤为对氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌。
本发明式I结构所示的金雀异黄酮衍生物具有较好的抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的能力，能够抑制LPS诱导的HCT116细胞侵袭和迁移、能够抑制低氧诱导的BxPc-3、MIA-PaCa2和PANC-1细胞侵袭和迁移。本发明的另一个目的是提供式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的药物中的应用。尤其是在制备抑制LPS诱导的结肠癌细胞、低氧诱导的人胰腺癌细胞侵袭和迁移的药物中的应用。
本发明式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的辅料制成药物组合物。本发明式I结构所示的金雀异黄酮衍生物还可以与一种或多种其它具有类似功效的活性成分(比如其它抗结肠癌药物)与一种或多种药学上可接受的辅料制成药物组合物。制成的药物组合物可以药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂、膜剂、胶囊剂、脂质体、缓释剂。在药物组合物中，有效成分式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐的纯度大99％。
本发明的有益效果：
本发明金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐具有广谱抗肿瘤活性，通过对肿瘤细胞产生生长抑制及杀伤作用从而起到抗肿瘤作用，具有较好的效果，可制备成各种剂型的抗肿瘤的药物，为肿瘤病人提供了更好的选择。具体表现为：
1、金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐对人结肠癌HCT-116细胞株、HT-29细胞株、SW620细胞株等肿瘤细胞株的体外生长具有显著的抑制作用。
2、金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐对AOM/DSS诱导炎症相关的肿瘤有很好的治疗效果。
3、金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐具有较好的抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的能力，可用于制备抗肿瘤转移的药物，可制备成各种剂型的抗肿瘤转移的药物，为肿瘤病人提供了更好的选择。
附图说明
图1为金雀异黄酮衍生物GEN-27对人结肠癌细胞的增殖抑制作用(***表示p<0.001)。
图2为金雀异黄酮衍生物GEN-27对AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型中腺瘤个数的影响(与AOM/DSS组相比，***表示p<0.001；###表示p<0.001)。
图3金雀异黄酮衍生物GEN-27对AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型中肠道肿瘤总面积数的影响。(与AOM/DSS组相比，***表示p<0.001；n.s表示p>0.05)
图4为金雀异黄酮衍生物GEN-27对AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型中小鼠大肠长度的影响(与AOM/DSS组相比，***表示p<0.001；###表示p<0.001；n.s表示p>0.05)。
图5为金雀异黄酮衍生物GEN-27对AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型中小鼠疾病模型临床评分的影响(与AOM/DSS组相比，**p表示<0.01,***p表示<0.001；##p表示<0.01)。
图6为采用划痕实验检测金雀异黄酮衍生物GEN-27对人结肠癌HCT116细胞迁移能力的影响(图中，Genistein表示金雀异黄酮，下同)。
图7为Transwell实验检测金雀异黄酮衍生物GEN-27对人结肠癌HCT116细胞侵袭能力的影响。
图8为采用划痕实验检测金雀异黄酮衍生物GEN-27对低氧诱导的人胰腺癌细胞迁移能力的影响。
图9为采用侵袭实验检测金雀异黄酮衍生物GEN-27对低氧诱导的人胰腺癌细胞侵袭能力的影响。
图10为采用细胞骨架染色实验检测金雀异黄酮衍生物GEN-27对低氧诱导的人胰腺癌细胞伪足生成的影响。
图11为金雀异黄酮衍生物GEN-27对低氧诱导人胰腺癌细胞BxPc-3的EMT相关蛋白的影响。
图12为金雀异黄酮衍生物GEN-27对低氧诱导人胰腺癌细胞MIA-PaCa 2的EMT相关蛋白的影响。
图13为金雀异黄酮衍生物GEN-27对低氧诱导人胰腺癌细胞PANC-1的EMT相关蛋白的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
金雀异黄酮衍生物的制备方法：金雀异黄酮2.7g(10.0mmol)，无水乙醇150mL，加热溶解，加入碳酸钾1.5g(11.0mmol)，碘化钾催化量，环氧氯丙烷9.3g(0.10mol)，回流10h，趁热过滤，冷却，析出结晶，抽滤，得浅黄色固体1.64g，收率42.9％，即为7,4’-二(2,3-环氧丙氧基)-5-羟基异黄酮，7,4’-二(2,3-环氧丙氧基)-5-羟基异黄酮直接投入下一步反应；7,4’-二(2,3-环氧丙氧基)-5-羟基异黄酮500mg(1.3mmol)，无水乙醇30mL，加热溶解，加入哌啶340mg(4.0mmol)，回流5h，产物柱层析分离(氯仿∶甲醇＝100∶3)，得浅白色固体135mg(化合物GEN-27)，收率18.7％。
化合物GEN-27的理化性质：M.p.140～143℃；ESI-MS m/z:553[M+H]+，提示分子量为552，分子式为C31H40N2O7；IR(KBr)υ:3384,2932,1657,1613,1512,1248,1182,1043,831cm-1。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:1.41(m,4H,2CH2),1.54(m,8H,4CH2),2.50(m,12H,2N(CH2)3),3.93～4.13(m,6H,2OCHCH2O),4.96(d,2H,2OH),6.43(d,J＝2.0Hz,1H,6-H),6.67(d,J＝2.0Hz,1H,8-H),7.02(d,J＝8.3Hz,2H,3’,5’-H),7.51(d,J＝8.3Hz,2H,2’,6’-H),8.45(s,1H,2-H),12.91(s,1H,5-OH)。
化合物GEN27的结构鉴定为：7,4’-二[2-羟基-3-(哌啶-1-基)丙氧基]-5-羟基异黄酮。
实施例2
1、实验材料
(1)药物
金雀异黄酮衍生物(GEN-27)，纯度>99.5％；金雀异黄酮(GEN)，纯度>99.5％。
用DMSO分别将GEN-27和GEN配成浓度为100mM母液，置于-20℃保存，使用前用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基配成所需浓度的样品溶液。
(2)细胞株
人结肠癌HCT116细胞株、HT29细胞株、SW620细胞株、人正常结肠黏膜上皮细胞FHC细胞株来自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库，用10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养(下同)。
(3)试剂
1)RPMI-1640培养基：取RPMI-1640粉末(美国GIBCO公司产品)10.4g溶于1000mL灭菌三蒸水中，用NaHCO3调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。
2)胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存-20℃低温冰箱中。
3)PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na2HPO4·H2O 1.56g、KH2PO42.0g，溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
4)0.02％EDTA溶液：称取EDTA 20mg，溶于100mL PBS缓冲液中，低速搅拌，调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。
5)0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mL PBS缓冲液中，高压灭菌。
6)DMSO溶液：美国Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo)公司产品。
2、实验仪器
1)YJ-875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。
2)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo electron公司产品。
3)OlympusIX51型倒置荧光显微镜：日本Olympus公司产品。
4)电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
5)ZW-A型微量振荡器：金坛市精达仪器制造厂。
6)ELx800型酶联免疫检测仪，购于美国BioTeK公司。
3、药效试验
采用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验考察化合物GEN-27、GEN对不同肿瘤细胞的抑制作用和IC50值。
将处于对数生长期的人结肠癌HCT116细胞用0.02％EDTA消化、离心、重悬和计数，制成细胞悬液，以5×104/mL细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100μL，设4复孔，置37℃，5％CO2培养箱培养12h左右待细胞完全贴壁。接着按如下方法加药：每孔中分别加入终浓度为1、10、50、100、200μM的化合物GEN-27，以人正常结肠黏膜上皮细胞FHC细胞作为对照组，孵育24h或48h后，每孔加入5mg/kgMTT溶液20μL，37℃下继续培养4h，弃去全部上清，每孔加入100μl的DMSO后微型振荡器上振荡2～3min，待结晶完全溶解后用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定吸光度值A。A值越大，代表活细胞数越多。实验重复3次，根据A值计算药物对细胞的生长抑制率。
根据孙氏综合法(改进寇氏法)来计算半数抑制浓度IC50(即抑制50％细胞生长所需药物浓度)。
采用MTT实验考察化合物GEN-27和GEN-27对人结肠癌HT29细胞、SW620细胞、人肝癌BEL-7402细胞、单核巨噬细胞THP-1、恶性胶质瘤细胞U87MG、胶质瘤细胞U251、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人胰腺腺癌细胞BxPc-3、人胰腺癌细胞panc-1等不同肿瘤细胞的生长抑制作用，操作方法同人结肠癌HCT-116细胞。结果见图1和表1，可知，化合物GEN-27对人结直肠癌细胞系HCT116、HT29及SW620都有明显的增殖抑制作用，且与人正常结直肠黏膜细胞FHC相比，GEN-27能够选择性的明显的抑制肿瘤细胞的增殖(p<0.001)，化合物GEN-27对HCT-116细胞的IC50约为22μM，HT-29细胞的IC50约为26μM，SW620细胞IC50约为30μM，同时呈现出明显的浓度依赖关系；且化合物GEN-27对其他肿瘤细胞也表现出生长抑制作用，表现出广谱抗癌活性；而金雀异黄酮对上述肿瘤细胞的IC50均大于200μM；说明金雀异黄酮衍生物对肿瘤细胞的抑制作用明显优于金雀异黄酮。同时化合物GEN-27对正常人体FHC细胞损伤小，说明对肿瘤的杀伤作用具有选择性。
表1化合物GEN-27对不同肿瘤细胞的IC50值
注：本实施例中，各种不同的肿瘤细胞仅是为了举例说明化合物GEN-27对不同肿瘤细胞具有生长抑制作用，上述肿瘤细胞株均是常规细胞株，能够通过常规市售获得。
实施例3
考察化合物GEN-27对氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextransodium sulfate,DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎相关性结直肠癌模型的预防作用。
给药方式：将受试化合物按对应剂量浓度混入小鼠食料中，以填喂法给药。
AOM/DSS小鼠结直肠炎癌模型建立：C57BL/6小鼠(购自南京大学南京生物医药研究院)，取健康、生命力旺盛、体重18-20g的雄性小鼠70只，随机分为7组，每组10只。小鼠适应性正常饮食7天后，记为实验开始日，将正常食料换为含有对应浓度化合物的食料。实验开始后第14天，每只小鼠腹腔注射(i.p.)10.0mg/kg的氧化偶氮甲烷，7天后，再给予含有2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水，7天后正常饮水14天；给予DSS7天，正常饮水14天为一个循环。制模过程中每天观察各组小鼠的体重变化、大便性状、便血情况，参照Cooper的经典的评分系统方法，每日将体重下降、大便性状和隐血或便血情况的评分相加，作为疾病活动指数(disease activity index，DAI)。共进行3个循环后处死小鼠，解剖结肠，进行组织病理学炎症损伤评分，并统计瘤体数量。取部分肠段置于10％福尔马林液内固定、包埋、切片、HE染色，进行一般组织病理学观察；免疫组化检测相关蛋白水平；部分正常组织、炎症组织和瘤组织分别提取蛋白和RNA。
7组的具体操作：
空白对照组：未进行任何处理正常饮食
AOM/DSS组：腹腔单次注AOM后给予三个循环的2.5％的DSS饮水；
GEN-27低剂量组：在AOM/DSS造模的基础上，填喂给予5mg/kg GEN27；
GEN-27中剂量组：在AOM/DSS造模的基础上，填喂给以15mg/kg的GEN27；
GEN-27高剂量组：在AOM/DSS造模的基础上，填喂给予45mg/kg的GEN27；
GEN对照组：在AOM/DSS造模的基础上，填喂给予45mg/kg的金雀异黄酮。
阿司匹林(ASP)阳性对照组：在AOM/DSS造模的基础上，填喂给予45mg/kg的阿司匹林。
注：mg/kg中mg为受试化合物质量，kg为小鼠体重。
表2各分组对AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的小鼠生存率及体重参数的影响
注：与空白对照组相比，###p<0.001；与模型组相比，*p<0.05.
由表2可知，GEN-27能够剂量依赖性的改善AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的疾病指标，主要包括提高小鼠生存率、提升小鼠体重，且效果显著性好于GEN对照及阿斯匹林；由图2可以看出，AOM/DSS模型组的腺瘤数平均值为12.0个，而GEN-27能够剂量依赖性的抑制小鼠结肠腺瘤数目，其中GEN-27低剂量组腺瘤数平均值为9.5个，GEN-27中剂量组腺瘤数平均值为5.3个，GEN-2745mg/kg高剂量组腺瘤数平均值为3.2个；且GEN-27疗效优于GEN对照组(p<0.001)。由图3可以看出，AOM/DSS模型组的肿瘤总面积平均值为9.83mm2，而GEN-27能够明显抑制小鼠结肠腺瘤面积，其中GEN-27低剂量组肿瘤总面积平均值为4.82mm2，GEN-27中剂量组腺肿瘤总面积平均值为4.13mm2，GEN-27高剂量组腺瘤数平均值为3.24mm2；GEN-27疗效与GEN对照组相比无显著性差异。由图4可以看出，AOM/DSS模型组的大肠长度平均值为6.26cm，而GEN-27高剂量组的大肠长度平均值为7.42cm，与空白对照组相比没有显著性差异，与AOM/DSS模型组相比能够明显提升小鼠大肠长度；且GEN-27的疗效明显好于GEN对照组(p<0.001)。由图5可以看出，AOM/DSS模型组的临床学评分平均值为3.25，而GEN-27能够剂量依赖性的抑制小鼠临床学评分(评分越高，小鼠疾病严重程度越高)，其中GEN-27低剂量组临床学评分平均值为2.42，GEN-27中剂量组腺肿瘤总面积平均值为1.74，GEN-27高剂量组腺瘤数平均值为1.27；GEN-27的疗效显著好于GEN对照组(p<0.01)。综上所述，GEN-27能够剂量依赖性的改善AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的疾病指标，主要包括提高小鼠生存率、提升小鼠体重；降低小鼠结肠腺瘤数目及大小；提高小鼠大肠总长度；改善小鼠便血，自发活动等小鼠状态及提升临床学评分。且GEN-27效果显著性好于母核GEN对照组及阿斯匹林对照组。
实施例4
考察化合物GEN-27抑制LPS诱导的人结肠癌HCT116细胞的侵袭转移能力。
1、实验材料
(1)药物
样品溶液配制同实施例2，利用DMSO配制成浓度为100mM的母液，-20℃保存。使用前用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释成所需浓度。
(2)细胞株
人结肠癌HCT116细胞株(同实施例2)，人结肠癌HCT116细胞株用含有100mg/L的链霉素、100U/mL的青霉素、10％的胎牛血清和3.5g碳酸氢钠(NaHCO3,2.2％,w/v)的RPMI-1640培养基培养，置于5％CO2、37℃培养箱孵育。
(3)试剂
细胞培养所需试剂：
①HCT116细胞培养液：RPMI-1640培养基，购于维森特生物技术(南京)有限公司。取RPMI-1640粉末10.4g，NaHCO3固体3.5g溶于1000mL三蒸水中，用高压灭菌后的筒式过滤器过滤除菌并分装，于4℃冰箱保存。使用前再加入10％的胎牛血清、100mg/L的链霉素、100U/mL的青霉素。
②胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：购于美国Thermo Scientific公司。56℃水浴灭活30min后，分装并保存于-20℃冰箱中。
③磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS缓冲液)：KCl 0.20g；Na2HPO4·H2O1.56g；NaCl 8.0g；KH2PO42.0g溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，分装并保存于4℃冰箱。
④LPS溶液：吸取10mL灭菌后的PBS缓冲液加入到10mg LPS粉末(LPS粉末购于美国SIGMA公司)中，涡旋混匀，配成浓度为1.0mg/mL母液，分装并保存于-20℃低温冰箱中。
⑤0.25％的胰酶：称取0.25g胰酶(购于中国BIOSHARP公司)，溶于100mL的PBS缓冲液中，配成浓度为0.25％胰酶，用高温灭菌后的筒式过滤器过滤除菌并分装保存在冰箱中，短期保存于4℃冰箱，长期则保存于-20℃。
划痕实验所需试剂：同细胞培养所需试剂；
Trans-well实验所需试剂：
①正常细胞培养试剂：同细胞培养所需试剂；
②Matrigel人工基质胶：中国翊圣生物科技公司；
③4％的多聚甲醛：4g的甲醛粉末溶于60℃的三蒸水中，同时通过HCl调pH至7.0左右。
④0.1％结晶紫，购于中国BIOSHARP公司。
2、实验方法
(1)、体外细胞培养
人结肠癌HCT116细胞株以适宜浓度接种于100μM玻璃培养瓶中，加入新鲜的培养液，37℃恒温、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞贴壁生长。每2～3天传代一次，传代时先用PBS缓冲液清洗2次，再用加入0.25％胰酶覆盖瓶底面，弃去胰酶，37℃培养箱中消化1～2min左右，加入新鲜培养液吹打均匀，以一定细胞数量移入新培养瓶中，并添加适量的新鲜培养液。
(2)、细胞划痕实验
(1)准备：无菌的6孔细胞培养板、直尺和marker笔，同时直尺和marker笔需要在紫外线照射30min以达到灭菌作用；
分组：空白组、LPS组、LPS+GEN27(2.5μM、5μM、10μM)、LPS+GEN(20μM)(48h)；
(2)首先，用直尺比着用marker笔在6孔板的背面均匀地划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿每一个孔，每孔至少要穿过5条线；
(3)取对数生长期的HCT116细胞，正常消化、离心并计数，在每孔中加入5×105个细胞，重新将6孔板放置37℃恒温、5％CO2培养箱中继续培养；
(4)12h～24h后，待到细胞融合度达到70％～80％时，用枪头比着直尺，垂直于背面的横线划痕，枪头尽量垂直，划线时力道尽量均衡不能倾斜，以使所得到的横线均匀；
(5)划痕结束后，用无菌的PBS缓冲液清洗细胞3次以上，使因为划痕造成的碎片或者漂浮的细胞去除干净，接着按照实验前设计的剂量组别分别加入不同的培养液。同时注意培养基中的血清不超过1％，需注意，对于特别脆弱的细胞血清可以适当的提高以保证在整个实验过程中细胞不会因为缺少营养而死亡；
(6)通过倒置显微镜(40×)对初始的各个组别进行拍照取样，24h和/或48h后继续拍照取样。注意：每次拍照尽量在同一位置进行；
(7)数据处理和结果分析。
(3)、Transwell实验
(1)将Matrigel人工基质胶与4℃预冷的无血清RPMI-1640培养基按1：1比例混合，每个8.0μm孔径的transwell小室上室均匀铺50μL稀释过的Matrigel基质胶，置于37℃恒温、5％CO2培养箱中使胶固化。
(2)取对数生长的HCT-116细胞经过正常消化、离心并计数，最后以每孔5×104个细胞数的量将50μL的细胞悬液点至transwell小室上室，下室加入含药的10％血清的RPMI-1640培养基(如图7所示)。
(3)固定时间后，将上下室培养基都移去同时用PBS缓冲液清洗两次。
(4)室温下用4％的多聚甲醛固定10min，除去多聚甲醛并用PBS缓冲液清洗两次。
(5)0.1％的结晶紫染色15～20min，甩去染色液并用PBS缓冲液清洗两次。
(6)倒置吸干水分并用棉签擦除上室内侧贴壁细胞，最后通过倒置显微镜进行拍照取样。
(4)、数据统计和分析
实验平行操作，重复三次。所有数据都采用mean±SD(n＝5)来表示，通过ImageJ对划痕宽度进行量化和通过显微镜对穿过Transwell小室的细胞进行计数，随后通过GraphPad Prism 5软件的One-way ANOVA分析检验各组间的差异。*P<0.05，说明LPS组和空白对照组相比有着显著性差异，**P<0.01，说明该LPS组与空白对照组相比有极显著差异。#P<0.05，说明该给药组与LPS组相比有显著差异，##P<0.01，说明该给药组与LPS组相比有极显著差异。
采用划痕实验检测GEN-27对人结肠癌HCT116细胞迁移能力的影响。划痕实验是检测肿瘤细胞迁移运动性的方法，是基于正常细胞的“接触抑制”原理上设计的，它能很好的反应出肿瘤细胞迁移运动能力。由图6可知，LPS和GEN-27共同作用时，LPS能够促进HCT116细胞的迁移，而GEN-27能够抑制LPS诱导的HCT116细胞迁移作用。当作用时间为48h，GEN-27对LPS诱导的肿瘤细胞迁移的抑制作用具有明显的剂量依赖性，GEN-27剂量越高作用效果越明显。
通过Transwell实验进一步检测GEN-27对人结肠癌HCT116细胞侵袭能力的影响。Transwell实验是检测肿瘤细胞的侵袭能力的方法，是基于肿瘤细胞能够穿过一定孔径的transwell小室的原理上设计的，它能反应肿瘤细胞的侵袭转移能力。图7的结果显示，48h时LPS能够增强HCT116细胞的侵袭转移能力，而GEN-27能够削弱LPS诱导的HCT116的侵袭转移能力的增强，且具有一定的剂量依赖性。
实施例5
化合物GEN-27抑制低氧诱导胰腺癌细胞侵袭转移的研究
1、实验材料
(1)药物
样品溶液配制同实施例2，使用前用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(同实施例2)稀释成所需浓度。
(2)细胞
人胰腺癌细胞(BxPc-3)用含10％胎牛血清RPMI1640培养基培养；
人胰腺癌细胞(MIA-PaCa 2和PANC-1)用含10％胎牛血清DMEM培养基培养。
(3)试剂
DMEM培养基：DMEM培养基购自美国GIBCO公司。取DMEM粉末10.4g溶于1000ml灭菌三蒸水中，加入3.7g NaHCO3调pH值至7.2～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前再加入10％的胎牛血清、100U/mL的青霉素和100mg/L的链霉素。
胎牛血清：美国HyClone公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于44℃低温冰箱中。
PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na2HPO4·H2O 1.56g、KH2PO42.0g，溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
0.02％EDTA溶液：称取EDTA 20mg，溶于100mL PBS缓冲液中，低速搅拌，调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。
0.25％胰酶：0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mL PBS缓冲液中，高压灭菌。
人工合成纤维连接蛋白(fibronectin，FN)：美国BD公司产品，4℃冰箱保存。临用前分装，按照说明书方法使用。
牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)：Sigma公司产品，按质量比用PBS缓冲液配制1％的蛋白溶液，4℃冰箱保存。
二甲基亚砜(DMSO)：上海化工有限公司。
细胞骨架染色实验相关试剂FITC标记鬼笔环肽(Phalloidin)：美国Sigma公司产品。
30％聚丙稀酰胺溶液：Bio-Rad公司产品。
细胞裂解液：美国Thermo公司产品。使用前加入0.2mM PMSF、0.1mM NaF、0.1mMNa3VO4和1mM DTT。
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM Tris，250mM甘氨酸(pH8.3)，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS，美国Biotech公司)。
SDS凝胶加样缓冲液：Bio-Rad公司产品。
转膜缓冲液：39mM甘氨酸，48mM Tris，0.037％SDS，20％甲醇。
丽春红S染液：丽春红S 2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g加水至100mL。
PBST：1％Tween-20(Tween 20：南京化学试剂一厂)溶于PBS中。
Triton X-100：美国Amresco公司。
蛋白质预染Marker：美国PIRECE公司。
抗体HIF1α，E-cadherin，MMP-9和Vimentin为美国Cell Signaling Technology公司产品。(4)仪器
YJ-875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。
荧光倒置显微镜：日本奥林巴斯公司产品。
702型超低温冰箱：美国Thermo electron公司产品。
YXQ-LS-50SII全自动立式电热压力蒸气灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品。
DGX-9003型鼓风干燥箱：上海福玛实验设备有限公司产品。
THZ-312型台式恒温振荡器：上海精宏试验设备有限公司产品。
3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo Forma公司生产。
电光分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。
LD4-2普通离心机：北京医用离心机厂产品。
Research型单道可调移液器：德国Eppendorf公司产品。
Varioskan全波长酶标仪：美国Thermo公司。
417R型台式冷冻高速离心机：德国Eppendorf公司产品。
半干式转膜仪：美国Bio-rad公司产品。
Mini-Protein 3电泳槽：美国Bio-rad公司产品。
Power PacTM Basic基础电源：美国Bio-rad公司产品。
Odyssey近红外荧光扫描成像系统：美国LI-COR公司产品。
激光共聚焦显微镜：日本Olympus公司产品。
96孔平底细胞培养板，Millipore公司。
2、实验方法
为了排除化合物GEN-27抑制低氧诱导的人胰腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭的作用不是因为抑制了细胞本身的活力而产生的，采用MTT法研究5、10μM的GEN-27和30μM的GEN对这三种胰腺癌细胞活力的影响。实验方法：黑色素瘤细胞接种至96孔板，贴壁生长后，加入不同浓度的样品液。24h后，每孔加入20μL 5mg/ml MTT溶液，避光放置于37℃、1％O2、培养箱4h。弃去上清溶液，板底甲瓒加100μL DMSO溶解，板式摇床震荡，沉淀溶解均匀。酶免疫检测仪在570nm波长(490nm为参比)下，测量吸光度(OD值)。实验重复3次，根据A值计算药物对细胞的生长抑制率。
根据孙氏综合法(改进寇氏法)来计算半数抑制浓度IC50(即抑制50％细胞生长所需药物浓度)。由实验结果可知：在低氧条件下5、10μM的GEN-27和30μM的GEN对BxPc-3、MIA-PaCa 2和PANC-1细胞的细胞活力无明显抑制作用，抑制率均小于15％。
(1)、划痕修复实验
单层贴壁培养的细胞，划一痕迹，通过观察和测量细胞在支持物上迁移距离判断细胞的迁移能力，可用于初步评价肿瘤细胞运动能力的变化。
分组：空白组(21％O2)、Hypoxia组(1％O2)、Hypoxia+GEN-27(5μM、10μM)、Hypoxia+GEN(30μM)；
实验方法：取对数生长期的人胰腺癌细胞接种至6孔细胞培养板中，细胞完全贴壁后细胞密度约80％后进行实验。弃去培养基，PBS洗3遍，用10μL塑料枪头在单层细胞表面划一条直线。PBS洗下脱离的细胞及细胞碎片，在显微镜下拍照。将含有不同浓度GEN-27和GEN的培养基加入六孔板内，放入细胞培养箱48h后在显微镜下观察细胞修复痕迹的变化，并拍照记录。实验重复3次，随机取各组别图片，计算细胞迁移的距离。
(2)、侵袭实验
具有侵袭能力的肿瘤细胞在培养基的趋化诱导下通过分泌蛋白水解酶水解细胞外基质穿过滤膜。通过统计穿过滤膜的细胞数可在体外观察药物对肿瘤细胞侵袭能力的影响，用于抗侵袭药物的筛选及研究。
实验方法：取对数生长的人胰腺癌细胞接种于6孔细胞培养板中，细胞密度达到70～80％后加入不同的浓度GEN-27和GEN。组别分为空白组(21％O2)、Hypoxia组(1％O2)、Hypoxia+GEN-27(5μM、10μM)、Hypoxia+GEN(30μM)；低氧条件下药物处理48h后，收集实验各组细胞，计数板计数。将Matrigel人工基质胶(同实施例3)与4℃预冷的无血清培养基按1：1比例混合加入Transwell上室，37℃培养箱活化1h。收集的细胞用无血清培养基稀释成相同浓度的细胞悬液(5×105个/ml)。将400μL细胞悬液加入上室中，下室加入600μL含10％胎牛血清的培养基，然后放入培养箱。48h后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，100％甲醇固定2min，苏木精染色3min，伊红染色30s，最后用水冲洗。取下滤膜，甘油封片，于显微镜下观察随机视野，计算细胞平均数，用以表示细胞的侵袭能力。实验重复3次。所得数据使用SPSS分析软件进行one-way ANOVA分析。
(3)、细胞骨架染色实验
鬼笔环肽能特异性与细胞微丝结合，检测侵袭细胞的骨架重排。
实验方法：将细胞接种于6孔细胞培养板的盖玻片上，待细胞密度50％后加入GEN-27处理48h。组别分为Normoxia(常氧，21％O2)、Hypoxia组(低氧，1％O2)、Hypoxia+GEN-27(低氧条件下给10μM的GEN-27)；吸出培养基，预冷PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5min。加入4％多聚甲醛2mL4℃固定20min，预冷PBS清洗3遍，每遍5min。0.1％Triton X-100 1ml 4℃透化20min，预冷PBS清洗3遍，每遍5min。1％BSA 2mL4℃封闭2h。预冷PBS清洗3遍，每遍5min。使用细胞骨架(F-actin)特异性染料FITC标记的鬼笔环肽染色，FITC-鬼笔环肽用预冷PBS稀释至工作液浓度，4℃过夜孵育。第二天预冷PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5min。取出盖玻片，用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)的抗荧光淬灭剂(Mounting Medium,Santa Cruz)封片，其中DAPI特异性染细胞核，激光共聚焦显微镜分别拍摄细胞骨架(F-actin)，细胞核(DAPI)，拍摄后将图片贴合(Merge)。
(4)、Western Blots实验
免疫印迹是将蛋白质转移到膜上，利用抗体进行检测。对已知的表达蛋白，可用相应抗体作一抗检测，对新基因的表达产物，可用融合部分的抗体检测。
实验方法如下：蛋白提取：人胰腺癌细胞接种于培养瓶中，常氧和低氧(1％O2)条件下待细胞密度达到70％时给予GEN-27(5、10μM)和GEN(30μM)处理48h，1000rpm离心收集细胞。预冷PBS洗3次，倒掉残余的PBS。用适量体积细胞裂解液重悬细胞，冰上放置1h，待细胞充分裂解。4℃13000rpm离心30min，上清液为总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度。按1:3的体积与4×loading buffer混匀，沸水变性8min后，冰上1h后再放入-20℃冰箱保存。制胶、电泳和转膜：制备10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，跑浓缩胶70V电压，分离胶120V，电泳时间2.5～3h。根据目的蛋白切取分离胶并选择合适大小的厚滤纸及硝酸纤维素膜，上下各一层滤纸，中间为胶和膜，胶在负极，膜在正极，用玻璃棒赶除气泡，恒压20V半干式转膜。丽染、封闭和抗体孵育：将膜浸入丽春红溶液中，染色2min，蒸馏水冲洗，剪取目的蛋白处的膜，PBS脱色。用1％BSA，37℃封闭1h。倒去封闭液，PBS漂洗3遍，10min/次。用一抗封膜，4℃孵育过夜；隔天PBST清洗3次，10min/次。避光操作用二抗封膜，37℃恒温摇床反应1h。倒去二抗，PBST清洗3次，10min/次，检测结果。
3、实验结果
(1)、GEN-27对低氧诱导的人胰腺癌细胞迁移能力的影响
通过划痕实验研究GEN-27对低氧诱导的人胰腺癌细胞迁移能力的影响。低氧条件下GEN-27作用3种人胰腺癌细胞细胞48h后，GEN-27可以抑制低氧诱导的BxPc-3、MIA-PaCa2和PANC-1细胞的运动迁移能力。如图8所示，低氧48h后能够增强人胰腺癌细胞的迁移能力，而GEN-27抑制在低氧条件下的细胞迁移，且呈浓度依赖性。5μMGEN-27组、10μMGEN-27组及30μM GEN组对BxPc-3细胞的抑制率分别为32.05％，77.47％和47.29％，对MIA-PaCa 2细胞的抑制率分别为14.65％，61％和45.75％，对PANC-1细胞的抑制率分别为28.68％，60.36％和38.26％。结果表明与GEN相比GEN-27在低氧条件下抑制人胰腺癌细胞迁移的作用更强。
(2)、GEN-27对低氧诱导的人胰腺癌细胞侵袭能力的影响
低氧诱导从而引发上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促进肿瘤细胞侵袭。采用Transwell侵袭实验研究GEN-27对对低氧诱导的人胰腺癌细胞侵袭能力的影响。BxPc-3、MIA-PaCa 2和PANC-1细胞在低氧条件下给予GEN-27和GEN48h后，如图9所示，低氧条件下能够促进人胰腺癌细胞穿过Matrigel人工基质胶，从而促进细胞侵袭，GEN-27和GEN抑制低氧诱导的人胰腺癌细胞穿过Matrigel，且呈浓度依赖性，5μMGEN-27组对BxPc-3、MIA-PaCa 2和PANC-1细胞的抑制率分别为29.25％，53.75％和9.375％；10μMGEN-27组对BxPc-3、MIA-PaCa 2和PANC-1细胞的抑制率分别为33.6％，71.87％和42％，30μM GEN组对BxPc-3、MIA-PaCa 2和PANC-1细胞的抑制率分别为62％，75.27％和65.27％。
(3)、GEN-27对低氧诱导的人胰腺癌细胞伪足生成的影响
细胞伪足是肿瘤细胞迁移的重要结构，它介导着肿瘤侵袭起始阶段的迁移运动，也能帮助肿瘤细胞突破基底膜和血管壁。因此，利用FITC标记的鬼笔环肽染色细胞肌动蛋白(F-actin)结合细胞核染色定位(DAPI)研究GEN-27对BxPc-3细胞伪足生成的影响。如图10所示，重叠图(Merge)结果显示GEN-27(10μM)可以明显抑制BxPc-3细胞的伪足生成，从另一方面说明了GEN-27抑制BxPc-3细胞迁移运动的作用。
(4)、GEN-27对低氧诱导的人胰腺癌细胞EMT相关蛋白的影响
上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)在器官发育和组织重塑中发挥重要作用，而在病理情况下，EMT现象与器官纤维化，肿瘤的侵袭转移密切相关。在EMT过程中，上皮细胞失去其典型的胞间连接，细胞之间的粘附降低，与周围基质细胞的接触减少，细胞迁移和运动能力增强。同时细胞表型发生改变，上皮表面标志如E-钙粘素(E-cadherin)减少，获得了某些间质细胞或纤维原细胞的特性，如波形蛋白(Vimentin)及细胞外基质(ECM)中基质金属蛋白酶(MMP-9)表达的上调。此外，缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是缺氧条件下存在于哺乳动物或人体内介导细胞适应于缺氧微环境的转导调控因子。研究证明过表达HIF1α能够诱导EMT的发生。本实验中：在低氧条件下，人胰腺癌细胞表现出明显的上皮型向间质型改变。因此，通过Western Blots实验研究GEN-27对BxPc-3、MIA-PaCa 2和PANC-1细胞EMT相关蛋白的影响。如图11-13所示，在BxPc-3和PANC-1细胞中，随着GEN-27剂量的增加上皮表型E-cadherin表达明显增高，MIA-PaCa 2细胞本底并不表达E-cadherin。另外，随着GEN-27剂量的增加间质表型Vimentin、HIF1α和MMP-9表达表现出不同程度的降低，说明GEN-27可以通过下调Vimentin，MMP-9，HIF1α上调E-Cadherin实现EMT的逆转。
Claims (5)
1.式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用；所述的肿瘤为结肠癌、肝癌、白血病、胶质瘤、胰腺癌；
2.式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗炎症相关的肿瘤药物中的应用；
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的炎症相关的肿瘤为AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎相关性结直肠癌。
4.式I结构所示的金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的药物中的应用；
5.根据权利要求4的应用，所述的应用为金雀异黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制LPS诱导的结肠癌细胞、低氧诱导的人胰腺癌细胞侵袭和迁移的药物中的应用。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |