CN115944621B - 金雀异黄酮在制备预防或治疗白细胞减少症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了金雀异黄酮在制备预防或治疗白细胞减少症药物中的应用，白细胞减少症为药物、辐射、感染、自身免疫等因素均引起的白细胞减少以及化疗所致的白细胞减少症。本发明的金雀异黄酮能够升高白细胞减少症模型大鼠的白细胞数目和淋巴细胞数目。本发明的金雀异黄酮通过刺激骨髓有核细胞的增殖来治疗白细胞减少症；本发明的金雀异黄酮通过刺激淋巴细胞的分化和成熟来治疗白细胞减少症；本发明的金雀异黄酮通过调控IL‑1β、IL‑4、IL‑6、TNF‑α、IFN‑γ的含量来促进白细胞的活化来治疗白细胞减少症；本发明的金雀异黄酮通过PI3K‑AKT‑MTOR/FOXO3A通路促进和维持造血系统的稳态平衡来治疗白细胞减少症。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及金雀异黄酮在制备预防或治疗白细胞减少症药物中的应用。
背景技术
白细胞减少症是指各种病因导致外周血白细胞数低于4×109/L，而产生的一类临床综合征，最常见于放化疗所致的骨髓抑制，治疗上主要使用粒细胞刺激因子、利血生等，但这些药物在使用过程中可能会导致骨痛、脾脏破裂、过敏等不良反应；近年来，国家大力发扬传统医学，传统复方制剂在治疗白细胞减少症上具有独特的优势，其因疗效明确、毒副作用小等特点而越来越广泛应用于临床，但复方制剂成分构成繁杂，药理机制不明确，药代动力学研究较复杂，因此，从传统复方中寻找有明确疗效的单体成分至关重要。
金雀异黄酮又叫金雀异黄素，主要来源于豆科植物金雀花的根，可以抑制酪氨酸激酶(PTK)，破坏信号转导并诱导细胞分化；抑制topoisomerase-II，导致DNA片段化和凋亡，并诱导G2/M细胞周期停滞；对多种肿瘤细胞株具有抑制作用，在抗肿瘤作用上具有广泛的应用前景，中国医学科学院以金雀异黄酮为原料研制的金转停胶囊可以抑制多种肿瘤细胞的生长和转移，适合各种肿瘤患者和人群。
目前为止，金雀异黄酮的文献报道主要集中在抗肿瘤方面，关于其治疗白细胞减少症的作用和机制并没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供金雀异黄酮在制备预防或治疗白细胞减少症药物中的应用，金雀异黄酮可以治疗化疗所致的白细胞减少症，作为中药的活性成分可以成为治疗白细胞减少症的候选药物。
本发明采用的具体技术方案为：
根据本发明的一方面，提供了式I所示的金雀异黄酮5,7-二羟基-3-(4-羟苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮在制备预防或治疗白细胞减少症药物中的应用，
可选地，在上述应用中，金雀异黄酮通过调控血清细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、INF-γ，从而通过免疫调节来治疗白细胞减少症。
可选地，在上述应用中，金雀异黄酮通过PI3K-AKT-MTOR/FOXO3A通路促进和维持造血系统的稳态来治疗白细胞减少症。
可选地，在上述应用中，金雀异黄酮通过抑制PI3K-AKT-MTOR的过度表达来阻止造血干细胞因过度增殖而导致的造血衰竭，以及金雀异黄酮促进FOXO3A的表达来调控造血干细胞中ROS水平和线粒体功能，从而维持造血干细胞的功能，促进白细胞的增殖和分化。
可选地，在上述应用中，金雀异黄酮通过刺激骨髓有核细胞的增殖来治疗白细胞减少症。
可选地，在上述应用中，金雀异黄酮通过刺激淋巴细胞的分化和成熟来治疗白细胞减少症。
可选地，在上述应用中，白细胞减少症是药物、辐射、感染、自身免疫引起的白细胞减少症，或由于放化疗导致骨髓抑制而引起的白细胞减少症。
根据本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗白细胞减少症的药物，药物包括金雀异黄酮，以及金雀异黄酮为药物的活性成分。
可选地，在上述药物中，药物包括金雀异黄酮和医学上可接受的辅料。
本发明的有益效果：
白细胞减少症是临床上比较常见的一类综合症，药物、辐射、感染、自身免疫等因素均可引起白细胞减少，最常见于放化疗导致骨髓抑制而引起的白细胞减少症。患者可出现畏寒、高热、头痛、乏力、反复感染等症状，严重感染者可出现败血症、脓毒血症等可致患者死亡。
本发明发现金雀异黄酮可以治疗药物、辐射、感染、自身免疫等因素均引起的白细胞减少以及化疗所致的白细胞减少症。金雀异黄酮通过调控血清细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、INF-γ从而通过调节免疫来治疗白细胞减少症以及金雀异黄酮通过PI3K-AKT-MTOR/FOXO3A的机制来治疗白细胞减少症，这方面目前还未见报道。化合物金雀异黄酮可以作为药物(例如，中药)的活性成分成为治疗白细胞减少症的候选药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是展示不同浓度的金雀异黄酮作用于白细胞减少症模型大鼠的血常规变化；
图2是展示不同浓度的金雀异黄酮作用于白细胞减少症模型大鼠的骨髓有核细胞计数；
图3是展示不同浓度的金雀异黄酮作用于白细胞减少症模型大鼠的脏器指数变化；
图4是展示不同浓度的金雀异黄酮作用于白细胞减少症模型大鼠的血清因子表达的情况；
图5是展示不同浓度的金雀异黄酮作用于白细胞减少症模型大鼠的PI3K/AKT/MTOR/FOXO3A的mRNA的表达。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明并不受限于此，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何变化都应落入本发明权利要求书所限定的范围内。
以下实施例所用的生物材料、药品和实验方法如下：
动物：无特定病原体(SPF)级SD大鼠，购于中国人民解放军总医院实验动物中心并经实验动物伦理委员会批准，批准书编号：SQ2022498。
药品：注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号H32020857)，用0.9％的生理盐水配置成4mg/ml注射液；金雀异黄酮(阿拉丁，货号G106673-25g)。
白细胞减少症模型的构建及分组给药：SD大鼠饲养于SPF级恒温空调设施动物房，饲养条件为12h/12h光暗循环，自由进食水，适应性饲养1周后用于实验。对SD大鼠进行编号，用随机数字表法进行分组，分为空白对照组和造模组，造模组予以腹腔注射环磷酰胺30mg/kg/d，空白对照组予以等量的生理盐水注射，连续注射5天，检测外周血象，造模组白细胞数有明显的降低，且与空白对照组有统计学差异，则造模成功，将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、金雀异黄酮低剂量组、金雀异黄酮高剂量组和咖啡酸阳性对照组。空白对照组和模型对照组予以纯水灌胃；金雀异黄酮低剂量组、金雀异黄酮高剂量组分别采用金雀异黄酮50mg/kg/d、200mg/kg/d灌胃(金雀异黄酮通过纯水超声溶解)；咖啡酸阳性对照组采用咖啡酸100mg/kg/d灌胃，连续灌胃2周。
白细胞计数：于造模前、造模后和给药结束后第二天，用0.3％的戊巴比妥钠40mg/kg对实验大鼠进行麻醉后眼眶采血，用五分类血液分析仪检测各组大鼠的白细胞数目。
酶联免疫吸附剂测定(Elisa)检测血清因子变化：麻醉后，心脏采血法采集实验大鼠的血液，静置30min后，3000r/min离心10min后取上清液，使用ELISA试剂盒检测上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和INF-γ含量，上样量100μL。按照说明书步骤，依次加入待检样本、抗体、HRP显色底物、终止液进行孵育、洗涤，最后用酶标仪读取指定波长下的OD值，按说明书中的计算公式，计算细胞因子含量。
脏器指数的检测：麻醉解剖出大鼠的胸腺和脾脏，称重后计算脏器指数，计算公式：脏器指数(％)＝脏器湿重(g)/动物末次体质量(g)*100。
骨髓有核细胞的计数：脊椎脱臼法处死大鼠后，分离出大鼠一侧股骨，剪断股骨两端，以1×PBS溶液反复冲洗骨髓腔，1500r/min离心10min后，去上清液，加入1ml的红细胞裂解液，静置3min，PBS定量离心后，重新悬浮为1ml，取0.1ml显微镜下计数有细胞核的细胞数量，计数所得的10倍即为单侧股骨总有核细胞数。
RT-qPCR检测mRNA的变化：收集大鼠股骨骨髓组织，溶解稀释引物，Trizol法提取RNA，使用Servicebio公司的逆转录试剂盒合成cDNA，再用qRT-PCR扩增目的片段，扩增程序：95℃，3min预变性→95℃，15s；60℃，30s(40个循环)→65℃—95℃，每升温0.5℃采集一次荧光信号。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参对照，取PCR产物进行凝胶成像分析，每个样本的相对mRNA表达水平＝2-△△Ct，每组进行3次重复。
实施例1
(1)不同浓度的金雀异黄酮作用于白细胞减少症模型的大鼠(即，实验大鼠)2周后，血常规的变化见图1及表1。
表1.金雀异黄酮在不同给药剂量下作用于实验大鼠的血常规变化
由此可见，不同浓度的金雀异黄酮均对白细胞减少症模型的大鼠有效，可以明显升高白细胞和淋巴细胞数目，其中，金雀异黄酮高剂量组疗效优于咖啡酸阳性对照组。
(2)不同浓度的金雀异黄酮作用于白细胞减少症模型的大鼠2周后，单侧股骨骨髓有核细胞的计数，见图2及表2。
表2.金雀异黄酮在不同给药剂量下作用于实验大鼠的骨髓有核细胞计数变化
| 分组 | 骨髓有核细胞计数(*105/股骨) |
| 空白对照组 | 9.08±0.61 |
| 模型对照组 | 1.69±0.21 |
| 金雀异黄酮低剂量组 | 2.73±0.49 |
| 金雀异黄酮高剂量组 | 5.27±0.53 |
| 咖啡酸阳性对照组 | 4.50±0.88 |
由此可见，不同浓度的金雀异黄酮均能提高白细胞减少症模型大鼠的骨髓有核细胞的数目，刺激骨髓造血，从而发挥升高白细胞的作用。
(3)不同浓度的金雀异黄酮作用于白细胞减少症模型的大鼠2周后，解剖出实验大鼠的胸腺和脾脏，计算脏器指数，如图3及表3所示。
表3.金雀异黄酮在不同给药剂量下作用于实验大鼠的胸腺指数和脾脏指数的变化
| 分组 | 胸腺指数(mg/g) | 脾脏指数(mg/g) |
| 空白对照组 | 1.96±0.18 | 2.91±0.31 |
| 模型对照组 | 1.49±0.07 | 2.08±0.15 |
| 金雀异黄酮低剂量组 | 1.69±0.03 | 2.43±0.18 |
| 金雀异黄酮高剂量组 | 2.18±0.18 | 3.02±0.09 |
| 咖啡酸阳性对照组 | 1.92±0.13 | 3.22±0.26 |
由此可见，不同浓度的金雀异黄酮能明显提高白细胞减少症模型大鼠的胸腺指数和脾脏指数，促进淋巴细胞的分化和成熟，从而治疗白细胞减少症。
(4)不同浓度的金雀异黄酮作用于实验大鼠2周后，血清细胞因子的表达情况如图4和表4所示。
表4.金雀异黄酮在不同给药剂量下作用于实验大鼠的血清细胞因子含量变化
由此可见，不同剂量的金雀异黄酮能够提高白细胞减少症模型大鼠的血清细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ因子的含量，这些细胞因子都是由免疫细胞分泌的，可以促进白细胞的活化，一定程度上反应了机体的免疫水平，如IFN-γ可由TH1细胞分泌，介导细胞免疫，激活巨噬细胞、细胞毒性T细胞等；IL-4、IL-6可由TH2细胞分泌，介导体液免疫，激活B细胞和嗜酸性粒细胞等。其中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ在造血调控和造血平衡过程中也发挥一定作用。可知，金雀异黄酮能通过调控血清细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、INF-γ，从而通过免疫调节来治疗白细胞减少症。
(5)不同浓度的金雀异黄酮作用于实验大鼠2周后，检测PI3K、AKT及其下游因子MTOR和FOXO3A的mRNA表达的情况，PI3K-AKT-MTOR/FOXO3A的引物序列见表5，具体mRNA表达情况如图5所示。
表5.PI3K-AKT-MTOR/FOXO3A的引物序列
由此可见，不同剂量的金雀异黄酮可以抑制PI3K-AKT-MTOR的过度表达，促进FOXO3A的表达。抑制PI3K-AKT-MTOR的过度表达，可以阻止造血干细胞因过度增殖而导致的造血衰竭，促进FOXO3A的表达可以调控造血干细胞中ROS水平和线粒体功能，从而维持造血干细胞的功能，促进白细胞的增殖和分化。金雀异黄酮通过PI3K-AKT-MTOR/FOXO3A通路促进和维持造血系统的稳态来治疗白细胞减少症。
本发明的预防或治疗白细胞减少症的药物，对于实验大鼠，金雀异黄酮的安全有效浓度为50～200mg/ml。
以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或改进，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (2)
1.如式I所示的金雀异黄酮在制备预防或治疗白细胞减少症药物中的应用，
2.根据权利要求1所述的金雀异黄酮在制备预防或治疗白细胞减少症药物中的应用，其特征在于，所述白细胞减少症是药物、辐射、感染、自身免疫引起的白细胞减少症，或由于放化疗导致骨髓抑制而引起的白细胞减少症。
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| 《不同剂量金雀异黄酮对骨关节炎模型大鼠关节疼痛、炎症的抑制作用》;曾小云;《中国组织工程研究》;第35卷(第24期);5607-5612 * |
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