CN115429794B - 3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备防治牙周炎药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及3‑甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备防治牙周炎药物的用途，属于生物制药技术领域，本发明通过实验验证了3‑甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯通过恢复线粒体功能和阻断MAPK信号通路有效抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症和RANKL诱导的破骨细胞分化，并减少小鼠牙周炎炎症反应和骨吸收，进而防治牙周炎的发生发展，有望成为临床上防治牙周炎的新型药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备防治牙周炎药物的用途。
背景技术
牙周炎是细菌感染引起，累及牙周组织慢性炎症性、破坏性疾病。以牙周软组织损伤和牙槽骨吸收为关键特征。牙周炎是成年人牙齿丧失的首要原因，影响全世界超过50％的成年人。牙周炎不仅影响口腔健康，同时作为动脉粥样硬化、癌症等系统疾病的风险因素，严重危害全身健康。鉴于牙周炎的严重性和危险性，对牙周炎进行防治研究具有重要意义。
牙周炎发病机理复杂，炎症反应和破骨细胞过度分化均是牙周炎的重要病理机制。靶向抑制炎症反应及破骨细胞分化的药物已成为牙周炎防治研究的重点。临床上牙周炎的辅助药物治疗包括抗骨质疏松药物，抗菌药和非甾体抗炎药等。尽管其中非甾体抗炎药物作为常规方法的辅助手段具有潜力，但在牙周病学的临床应用中，具体的非甾体抗炎药物的生物利用度需要更进一步的研究。
3-甲基-1H-吲哚-1-基二甲基氨基二硫代酸酯(3o)是一种吲哚-二硫代氨基甲酸酯类似物，在先研究发现其具有治疗急性肺损伤的潜力；然而，3o是否能抑制炎症从而防治牙周炎未见报道。与此同时，3o作为吲哚化合物(具有抑制破骨细胞分化功能)的类似物，其能否缓解牙周炎的牙槽骨吸收也尚不可知。
本发明旨在提供一种新的能够对牙周炎有防治效果的药物。
发明内容
针对目前治疗牙周炎药物种类有限性，本发明的目的在于提供3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备防治牙周炎药物的用途，其结构式如下所示：
进一步的，所述牙周炎由牙龈卟啉单胞菌的脂多糖诱导产生。
进一步的，3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备通过抑制巨噬细胞炎症和破骨细胞分化防治牙周炎药物的用途。
进一步的，3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备减少牙周炎炎症反应药物的用途。
进一步的，3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备减少牙槽骨吸收药物的用途。
进一步的，3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备通过恢复线粒体功能和抑制MAPK通路从而抑制牙周炎的发生发展药物的用途。
进一步的，所述药物由作为活性成分的3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯和药学上可接受的载体和/或添加剂组成。
进一步的，所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型、敷料剂型或者注射剂型。
进一步的，所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体剂。
进一步的，所述药物的有效剂量为20mg/kg体重。
与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：
本公开内容提供的3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯的新用途，即3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备预防或治疗牙周炎的药物中的用途，为牙周炎的预防或治疗提供新的思路。发明人研究发现，3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯防治牙周炎主要是通过以下两个方面来实现：一是3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯恢复线粒体功能和抑制MAPK信号通路来抑制对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症，抑制IL-6，IL-1β和TNF-α的表达，减缓牙周炎的炎症反应；二是3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯能够通过抑制MAPK通路以及抑制线粒体功能异常活跃来抑制破骨细胞分化，并且通过体外实验验证了3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯抑制牙周炎炎症和牙槽骨吸收进而防治牙周炎的发生发展。
本公开内容提供3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯为药效成分能够有效预防和治疗牙周炎。
附图说明
图1.3o对细胞活性影响结果统计。
图2A.3o预培养2h对脂多糖(LPS)引起IL-6炎性细胞因子释放的检测结果及统计分析，***P<0.001，****P<0.0001；
图2B.3o预培养2h对脂多糖(LPS)引起TNF-α炎性细胞因子释放的检测结果及统计分析，****P<0.0001。
图3A.3o抑制的RANKL诱导的破骨细胞分化的MAPK蛋白表达情况；
图3B.其统计分析结果，****P<0.0001。
图4A.3o抑制RANKL诱导的破骨细胞分化的酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)染色结果；
图4B.其统计分析结果(细胞核≥3个为破骨细胞)，****P<0.0001。
图5A.在含有RANKL(50ng/mL)的培养基中加入1μM的3o并诱导5天后的线粒体活性氧(mtROS)荧光染色结果；
图5B.其统计分析结果，*P<0.1，**P<0.01。
图6A.在含有RANKL(50ng/mL)的培养基中加入1μM的3o并诱导5天后的线粒体膜电位(MMP)荧光染色结果；
图6B.其统计分析结果，***P<0.001，****P<0.0001。
图7.在含有RANKL(50ng/mL)的培养基中加入1μM的3o并诱导3天后细胞内ATP水平，****P<0.0001。
图8A.牙周组织石蜡切片免疫组织化学染色检测TNF-α；
图8B.TNF-α蛋白表达量统计分析，**P<0.01；
图8C.牙周组织石蜡切片免疫组织化学染色检测IL-1β；
图8D.IL-1β蛋白表达量统计分析，**P<0.01，***P<0.001；
图8E.牙周组织石蜡切片免疫组织化学染色检测IL-6；
图8F.IL-6蛋白表达量统计分析，**P<0.01。
图9A.牙槽骨组织切片的TRAP染色结果；
图9B.其破骨细胞统计结果，****P<0.0001。
图10A.体式显微镜下拍摄的釉牙骨质界至牙槽骨嵴顶的距离(ACJ-AC)，
图10B.其统计分析结果，****P<0.0001。
图11A.牙槽骨的Micro-CT三维重建图和矢状面图；
图11B.牙槽骨骨量与总体积比值(BV/TV)，*P<0.1，**P<0.01。
具体实施方式
下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
药物3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯的制备方法如下：
3-甲基吲哚(0.2mmol)、N,N,N’,N’-四甲基秋兰姆(0.22mmol)、叔丁醇钾(0.4mmol)和甲苯(2.0mL)，室温下反应2小时后，停止反应。反应体系中加入水和乙酸乙酯，分离有机层，用乙酸乙酯将水层洗三次。结合所有有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(乙酸乙酯石油醚溶液)，得到产物3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯，在下文中记作3o。
实施例1：3o不具有细胞毒性
用MTT检测法测试了不同浓度3o对RAW264.7细胞的增殖影响。如图1所示，在72h，3o浓度在0-1μM时对RAW264.7细胞活性均无抑制作用，ns无统计学意义。说明3o不具有细胞毒性。
实施例2：3o抑制巨噬细胞炎症反应
实验分组
1)对照组：RAW264.7细胞培养于正常培养基中。
2)LPS组：RAW264.7细胞用LPS(100ng/mL)处理30min。
3)LPS+3o组：RAW264.7细胞用7.5、10、12.5μM浓度3o预培养2h后，加入100ng/mL的LPS处理30min。
通过Elisa检测炎性细胞因子的释放。结果如图2显示，在LPS刺激下，IL-6和TNF-α炎性细胞因子释放高达100倍(P<0.0001)，3o降低IL-6的炎性细胞因子释放(P<0.001)和TNF-α炎症性细胞因子释放(P<0.01)。LPS引起的巨噬细胞炎症反应的上调，具体表现为炎症相关基因和促炎细胞因子的显著增加，表示炎症模型造模成功。此外，3o减轻LPS诱导的巨噬细胞炎症，表明了3o的抗炎作用。
实施例3：3o抑制RANKL介导的MAPK信号通路的激活而减少破骨分化
实验分组
1)对照组：将RAW264.7细胞培养于正常培养基中。
2)3o组：将RAW264.7细胞培养于含1μM3o的培养基中。
3)RANKL组：RAW264.7细胞用50ng/mLRANKL诱导5、15、30、60min。
4)RANKL+3o组：用1μM浓度3o预培养RAW264.7细胞2h后，加入50ng/mLRANKL诱导30min。
通过蛋白印迹法检测MAPK通路相关蛋白，即ERK、JNK和P38，如图3显示1μM浓度3o处理，MAPK中ERK，JNK和P38蛋白磷酸化被抑制(P<0.0001)，JNK的蛋白磷酸化抑制最为显著(P<0.0001)。表明3o通过抑制MAPK信号通路激活起到抑制破骨作用。
实施例4：3o通过缓解线粒体功能障碍而减少破骨分化
RAW264.7细胞经RANKL和不同浓度的3o培养5天后进行TRAP染色。如图4所示，单纯RANKL组分化出大量体积巨大的多核破骨细胞。在3o干预后呈浓度依赖性减少了破骨细胞的数量及体积(P<0.01)。在1μM浓度处理时观察到最大抑制效果，此时破骨细胞数量最少(P<0.0001)。
RAW264.7细胞分别在空白对照组、RANKL(50ng/mL)、3o(1μM)、RANKL(50ng/mL)+3o(1μM)一起培养5天后收样。
采用Mitosox荧光染色方法检测mtROS如图5所示，我们发现单纯RANKL组出Mitosox荧光水平增加(P<0.0001)，并且在形态上呈巨大的多核细胞。这说明RANKL刺激引起mtROS的增加。与单纯RANKL组相比，3o处理后，mtROS明显降低(P<0.0001)，并在形态上体积变小。以上说明3o通过减少RANKL引起的的mtROS的增加，进而抑制破骨细胞分化。
采用TMRM荧光染色方法检测线粒体膜电位(MMP)。如图6所示，单纯RANKL组比较C组的MMP高(P<0.0001)。3o处理后的MMP较RANKL组的下降(P<0.001)。以上说明3o通过减少RANKL引起的的线粒体内MMP的增加，进而抑制破骨细胞分化。
检测三磷酸腺苷(ATP)含量，如图7所示，RANKL组与C组相比ATP水平明显增高(P<0.0001)，3o处理组明显降低了RANKL引起的细胞内ATP水平的增高(P<0.001)。以上说明3o通过减少RANKL引起的的线粒体内ATP水平的增加，进而抑制破骨细胞分化。
3o抑制RANKL诱导的破骨细胞线粒体功能的异常活跃，具体表现为mtROS，MMP和ATP的降低，而减少破骨分化。
实施例5：牙周炎动物模型的制备
6-8周龄的SPF级雄性C57BL/6J实验小鼠购买于北京维通利华实验动物中心，之后饲养于温州医科大学SPF级动物房屏障内。牙周炎动物模型建立已通过该温州医科大学动物中心的伦理委员会。
6-8周龄的雄性小鼠先适应性喂养一周，第8天进行牙周炎造模。配制7％质量体积的水合氯醛，按0.5mL/100g的剂量腹腔注射麻醉小鼠。置小鼠于固定器，悬吊下颌，暴露口腔，显露上颌后牙，显微外科镊将5-0的慕斯线结扎于小鼠双侧上颌第二磨牙颈部，舌侧打结。丝线保持14天，第22天处死并收集牙槽骨样本。
将24只C57BL/6J小鼠随机分为4组，每组6只。分组如下：
C：正常对照组。
P：结扎诱导牙周炎组。
P+(低浓度)3o：结扎诱导牙周炎+3o(10mg/kg)药物干预组。
P+(高浓度)3o：结扎诱导牙周炎+3o(20mg/kg)药物干预组。
对牙周炎小鼠模型造模第8天开始，对3o药物干预组，接下来每日一次进行给药干预直至处死。
实施例6：3o缓解牙周炎炎症反应
对所有小鼠采用过量麻醉安乐死。将左侧上颌骨用10％EDTA脱钙液进行脱钙4周，然后进行切片处理。免疫组织化学染色，如图8结果显示，P组炎症蛋白相较于C组，IL-6(P<0.001)，IL-1β(P<0.001)和TNF-α(P<0.0001)在牙周膜内表达均升高，3o治疗后能显著减少牙周膜组织内IL-6(P<0.001)，IL-1β(P<0.01)和TNF-α(P<0.0001)炎症蛋白的表达。
实施例7：3o缓解牙周炎小鼠的破骨细胞生成
组织切片的TRAP染色，结果如图9显示，P组牙槽骨的破骨细胞生成增加(P<0.0001)，3o干预可以明显降低破骨细胞的生成(P<0.001)。由此知3o可以减少牙周炎小鼠牙槽骨的破骨细胞数量。
实施例8：3o缓解牙周炎牙槽骨吸收
迅速获取小鼠上颌骨，从腭中缝进行分离大部分的肌肉组织。上颌骨放入多于样本10倍体积的4％多聚甲醛中，固定48h后流水冲洗过夜。右侧上颌骨去净牙槽骨上附着的软组织后于体式显微镜及Micro-CT检测测牙槽骨吸收。
用体视显微镜拍摄小鼠的釉牙骨质界至牙槽嵴顶之间的距离，图10A-B显示：与C组相比，P组小鼠的ACJ-AC增加(P<0.0001)。而与P组相比，P+3o组的小鼠ACJ-AC减少(P<0.0001)。Mirco-CT结果显示，P组骨密度明显减少。而与P组相比，P+3o组小鼠骨密度增加(图11A-B)。结果显示3o治疗能缓解牙周炎小鼠的牙槽骨吸收。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯在制备防治牙周炎的药物中的用途，所述3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物由作为活性成分的3-甲基吲哚二甲基氨基二硫代酸酯和药学上可接受的载体组成。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型、敷料剂型或者注射剂型。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述药学上可接受的口服剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体剂。
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