CN112512515A - 用于抑制炎症的化合物 - Google Patents

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吴皓
J·利伯曼
胡俊
刘星
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Abstract

本申请提供了可用于例如执行以下的化合物：抑制细胞中的消皮素孔隙形成；抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；抑制来自细胞的细胞因子分泌；抑制细胞中的炎性半胱天冬酶和/或与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应。这些化合物还可用于治疗或预防炎症小体激活与发病机制有关的疾病或病状。此类疾病或病状的一个实例为脓毒症。

Description

用于抑制炎症的化合物
优先权要求
本申请要求于2018年6月27日提交的美国临时专利申请序列号62/690,788的优先权，所述美国临时专利申请的完整内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及化合物，具体地涉及抑制炎症并且可用于治疗与炎症相关的病状的化合物。
背景技术
炎症小体是多蛋白信号传导支架，所述多蛋白信号传导支架响应于侵袭性病原体和无菌危险信号进行组装，以激活炎性半胱天冬酶(1/4/5/11)，所述炎性半胱天冬酶触发炎性死亡(细胞焦亡)和促炎性细胞因子的加工和释放。炎症小体激活导致许多人类疾病，包含炎性肠病、痛风、II型糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)和脓毒症(通常是对全身性感染的致命应答)。
发明内容
在第一总体方面，本公开提供了一种执行以下的方法：
·抑制细胞中的消皮素(gasdermin)孔隙形成；和/或
·抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
·抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
·抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
·与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
·与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子；
所述方法包括使所述细胞与有效量的本文所述的化合物中的任一种化合物或其药学上可接受的盐接触。
在第二总体方面，本公开提供了一种治疗或预防其中炎症小体激活和/或消皮素炎性细胞死亡与发病机制有关的疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的化合物中的任一种化合物或其药学上可接受的盐。
在第三总体方面，本公开提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物：
·抑制细胞中的消皮素孔隙形成；和/或
·抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
·抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
·抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
·与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
·与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子；
所述方法包括：
a)提供包括脂质体的样品，所述脂质体包括能够与螯合配体、所述螯合配体、测试化合物和消皮素蛋白或其片段形成复合物的金属阳离子；
b)使所述样品中的所述消皮素蛋白与蛋白酶接触；以及
c)确定所述测试化合物是否抑制所述金属阳离子从所述脂质体中渗漏，其中对所述金属阳离子从所述脂质体中的所述渗漏的所述抑制指示所述测试化合物：
·抑制细胞中的消皮素孔隙形成；和/或
·抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
·抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
·抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
·与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
·与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子。
在第四总体方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所述的化合物中的任一种化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
本文描述了所述第一总体方面、所述第二总体方面、所述第三总体方面和所述第四总体方面的某些实施方式。
在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括用于治疗或预防本文所述的疾病或病状中的任一种的本文所述的化合物中的任一种化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，本公开提供了本文所述的化合物中的任一种化合物或其药学上可接受的盐，其用作用于治疗或预防本文所述的疾病或病状中的任一种的药物。
在一些实施例中，本公开提供了一种本文所述的化合物中的任一种化合物或其药学上可接受的盐的用途，其用于制造用于治疗或预防本文所述的疾病或病状中的任一种的药物。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述的方法和材料用于在本申请中使用；也可以使用本领域中已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用以其全文并入。在冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。
根据以下详细描述和附图以及权利要求，本申请的其它特征和优点将显而易见。
附图说明
图1含有铽(Tb3+)/吡啶二羧酸(DPA)荧光脂质体渗漏测定的图形表示。
图2含有示出脂质体渗漏测定中的双硫仑(disulfiram)的剂量应答曲线的线图。
图3含有示出Alexa 488标记的His-MBP-GSDMD(80nM)与C-22、C-23或C-24结合的MST测量结果的线图。
图4含有示出在存在尼日利亚菌素(nigericin)或介质的情况下用化合物C-22、C-23和C-24处理之后的细胞活力的条形图。
图5含有示出在用每种测试化合物预处理之后(在用PBS或LPS进行电穿孔之前)的细胞活力的条形图。
图6含有示出通过化合物C-23抑制典型炎症小体激活的IC50的线图。
图7含有示出通过化合物C-23抑制非典型炎症小体激活的IC50的线图。
图8含有示出通过ELISA评估的通过化合物C-23处理的培养上清液(用LPS或LPS和尼日利亚菌素处理的细胞)中IL-1β的水平的条形图。
图9含有示出通过ELISA评估的通过化合物C-23处理的培养上清液(用PBS或LPS转染处理的细胞)中IL-1β的水平的条形图。
图10含有示出在用PBS或poly(dA:dT)转染之前用C-23预处理之后细胞活力的条形图。
图11含有化合物C-5、C-7、C-8、C-22、C-23、C-24和C-25的化学结构。
图12含有在存在或不存在Cu(II)的情况下双硫仑(C-23)或其代谢物DTC抑制脂质体渗漏的剂量应答曲线。
图13含有示出LPS致敏的THP-1在存在或不存在Cu(II)的情况下用C-23或DTC预处理1小时，之后加入尼日利亚菌素或介质持续2小时的线图。
图14含有示出用15mg/kg的LPS激发并且用C-23处理之后的小鼠存活百分比的线图。
图15含有示出在用C-23预处理并且用15mg/kg LPS激发的小鼠体内通过ELISA测量的血清IL-1β的条形图。
图16含有示出用25mg/kg的LPS激发并且用C-23处理之后的小鼠存活百分比的线图。
图17含有示出用50mg/kg的LPS激发并且用C-23处理之后的小鼠存活百分比的线图。
图18含有示出腹膜内LPS激发(25mg/kg)后通过腹膜内注射0和12小时用C-23(50mg/kg)、C-23(50mg/kg)加葡萄糖酸铜(0.15mg/kg)或媒剂(对照)处理小鼠之后的小鼠存活百分比的线图。
图19含有示出DTC与Cu2+之间的化学反应的化学方案。
图20含有含Cys191的人GSDMD肽的MS/MS谱。
图21含有在与C-23一起温育之后GSDMD肽的MS/MS谱，所述C-23具有通过C-23的二乙基二硫代氨基甲酸酯部分对Cys191进行的共价修饰。
图22含有示出呈自抑制形式的全长人GSDMD和基于GSDMA3的对应结构的GSDMD N端片段(GSDMD-NT)的孔隙形式的模型的图像。
图23含有C-23抑制由野生型、C38A或C191A GSDMD(0.3μM)加半胱天冬酶-11(0.15μM)诱导的脂质体渗漏的剂量应答曲线。
图24含有示出在C-23与N-乙酰半胱氨酸(NAC，500μM)或介质一起预温育1小时后C-23抑制LPS+尼日利亚菌素处理的THP-1细胞的细胞焦亡的条形图。
图25含有由人GSDMD-3C(0.3μM)加3C蛋白酶(0.15μM)诱导的脂质体渗漏中化合物C-23的剂量应答曲线。
图26含有由人GSDMD-3C(0.3μM)加3C蛋白酶(0.15μM)诱导的脂质体渗漏中化合物C-23的剂量应答曲线。
图27含有通过脲甲基半胱氨酸(carbamidomethyl)对半胱氨酸191进行修饰的肽FSLPGATCLQGEGQGHLSQK的MS/MS谱。
图28含有通过C-23对半胱氨酸191进行修饰的肽FSLPGATCLQGEGQGHLSQK的MS/MS谱。
图29含有示出Cys残基的GSDMA3、hGSDMA、mGSDMD和hGSDMD的序列比对。
图30含有示出在加入含半胱天冬酶-11(0.15μM)的脂质体(50μM)之前与指示浓度的C-23(0-50μM)一起预温育持续不同持续时间(2-90分钟)的GSDMD(0.3μM)的Tb3+/DPA荧光的线图。
图31含有示出在存在指示浓度的化合物C-23的情况下半胱天冬酶-1活性的时间进程的线图。
图32含有示出在存在指示浓度的化合物C-23的情况下半胱天冬酶-11活性的时间进程的线图。
图33含有半胱天冬酶-1活性测定中的化合物C-23的剂量应答曲线。
图34含有半胱天冬酶-11活性测定中的化合物C-23的剂量应答曲线。
图35含有示出在存在指示浓度的化合物C-23+Cu(II)的情况下半胱天冬酶-1活性的时间进程的线图。
图36含有示出在存在指示浓度的化合物C-23+Cu(II)的情况下半胱天冬酶-11活性的时间进程的线图。
图37含有半胱天冬酶-1活性测定中的化合物C-23+Cu(II)的剂量应答曲线。
图38含有半胱天冬酶-11活性测定中的化合物C-23+Cu(II)的剂量应答曲线。
图39含有表2中所呈现的测试化合物的化学结构。
图40含有示出表2和图39中所呈现的化合物的细胞活力测定的结果的条形图。
图41含有示出在使用或不使用尼日利亚菌素的情况下表2和图39中的化合物的细胞活力测定的结果的条形图。
图42含有在加入尼日利亚菌素之后化合物C-23A1、C-23A2 C-23A9和C-23A10的细胞活力测定的结果的条形图。
图43含有化合物C-23、Bay 11-7082和C-23+Bay 11-7082的细胞活力测定的结果的条形图。
图44含有示出化合物C-23和Bay 11-7082在LPS转染之后的细胞活力测定的结果的条形图。
图45含有用C-23和Bay 11-7082预处理的THP-1细胞的免疫印迹图像。
图46含有用C-23、Bay 11-7082或z-VADfmk预处理的LPS致敏的THP-1细胞的图像。
图47含有示出在用C-23、Bay 11-7082或z-VADfmk处理之后具有APS聚集体的细胞百分比的条形图。
图48含有用单独地C-23或C-23与Cu(II)预处理的LPS致敏的THP-1细胞的图像。
图49含有示出用单独地C-23或C-23与Cu(II)处理之后具有APS聚集体的细胞百分比的条形图。
图50含有示出用C-23、Bay 11-7082或z-VADfmk预处理并且用指示的抗体可视化的细胞的裂解物的免疫印迹图像。
图51含有示出用单独地C-23或C-23与Cu(II)预处理并且用指示的抗体可视化的细胞的裂解物的免疫印迹图像。
图52含有示出C-23、Bay 11-7082和z-VADfmk的半胱天冬酶-1活性的条形图。
图53含有用C-23、Bay 11-7082或z-VAD-fmk预处理并且用小鼠抗GSDMD单克隆抗体染色的LPS致敏的THP-1细胞的图像。
图54含有示出用GSDMD膜染色和焦亡性气泡定量的细胞比例的条形图。
图55含有通过野生型、C38A或C191A人GSDMD进行的Bay 11-7082对脂质体渗漏的抑制的应答曲线。
图56含有示出Alexa 488标记的His-MBP-GSDMD与Bay 11-7082直接结合的热泳测量结果的线图。
图57含有Bay 11-7082对半胱天冬酶-1活性的作用的剂量应答曲线。
图58含有Bay 11-7082对半胱天冬酶-11活性的作用的剂量应答曲线。
图59含有通过脲甲基半胱氨酸对Cys191进行修饰的GSDMD肽的MS谱。
图60含有在GSDMD与在Cys191处修饰的Bay 11-7082一起温育之后的GSDMD肽的MS谱。
图61含有Bay 11-7082对由人GSDMD-3C诱导的脂质体渗漏的作用的剂量应答曲线。
图62含有Bay 11-7082对由小鼠GSDMD-3C诱导的脂质体渗漏的作用的剂量应答曲线。
图63含有示出Bay 11-7082与N-乙酰半胱氨酸(NAC)一起温育对细胞焦亡的抑制的作用的条形图。
图64含有用指示质粒转染的HEK293T细胞的免疫印迹图像，凝胶用指示的抗体探测。
图65含有用指示质粒转染的HCT116、293T和THP-1细胞的免疫印迹图像，凝胶用指示的抗体探测。
图66含有用抗GSDMD单克隆抗体进行免疫染色并且用DAPI进行共染色的293T和THP-1细胞的图像。
图67含有示出引起消皮素D孔隙的形成和炎性介体随后释放的生化过程的方案。
图68含有与或不与GSDMD-3C加3C蛋白酶一起温育的含PS的纳米盘的负染色EM图像。在左起第3张图像中，在将C-23加入纳米盘之前，将C-23加入GSDMD-3C加3C蛋白酶混合物中；在第4张图像中，在已经形成孔隙时，在将混合物与纳米盘一起温育之后加入C-23。比例尺，100nm。箭头指向空纳米盘和孔隙。
图69含有示出在加入20ng/ml TNFα(T)、100nM SMAC模拟物(S)和20μM z-VAD-fmk(Z)之前用或不用双硫仑(C-23)或2μM坏死性磺酰胺(NSA)或10μM坏死性凋亡抑制素(Necrostatin)-1(Nec)预处理(10μM和50μM)1小时并且在24小时之后通过CellTiter-Glo测定分析细胞活力的HT-29细胞的实验结果的条形图。图示出了平均值±s.d；数据表示三个独立实验。**P<0.01。
图70含有示出在不存在抑制剂或存在30μM C-23或z-VAD-fmk的情况下如通过SYTOX Green摄取测量的细胞焦亡的结果的线图。
图71含有示出当HEK293T细胞中的全长(FL)人GSDMD和GSDMD C191S与半胱天冬酶-11共表达时的实验结果的条形图。细胞死亡在转染后20小时通过CytoTox96细胞毒性测定确定。
图72含有示出当HEK293T细胞中的FL人WT或C191S GSDMD与半胱天冬酶-11共表达时的实验结果的条形图。转染8小时后，加入指示量的双硫仑，并且12小时后，通过LDH释放确定细胞死亡。条形图示出了所执行的三个独立实验的1个代表性实验的平均值±s.d.。*P<0.05，**P<0.01，n.s.，不显著。
图73含有示出由预切割的人GSDMD(0.3μM)诱导的脂质体渗漏中双硫仑的剂量应答曲线的线图。
图74含有示出由预切割的小鼠GSDMA3-3C(0.3μM)诱导的脂质体渗漏中双硫仑的剂量应答曲线的线图。
图75含有示出用或不用30μM双硫仑或z-VAD-fmk预处理1小时并且用尼日利亚菌素或介质刺激的LPS致敏的THP-1细胞的图像。
图76含有示出LPS致敏的THP-1细胞的ASC斑点的分析结果的条形图。
图77含有示出LPS致敏的THP-1细胞的NLRP3的分析结果的条形图。
图78含有示出通过全细胞裂解物(WCL)或培养上清液的免疫印迹分析的LPS致敏的THP-1细胞的半胱天冬酶-1、GSDMD和促IL-1β切割以及IL-1释放的结果的图像。
图79含有示出GSDMD向质膜再分配的图像和条形图。在加入尼日利亚菌素并且使用内部产生的先前未曾报告的单克隆抗体进行GSDMD染色之后30分钟固定细胞。所示为具有GSDMD膜染色和焦亡性气泡的细胞的代表性共聚焦显微镜图像和细胞比例的定量。箭头指示对焦亡性气泡的GSDMD染色。图示出了平均值±s.d；数据表示三个独立实验。*P<0.05，**P<0.01。
图80含有示出炎症小体通路步骤的模型和主要作用于GSDMD的双硫仑对其的抑制的图像。
图81含有示出实验结果的图，其中在用15mg/kg LPS进行腹膜内激发并进行存活率随访之前24小时和4小时，通过腹膜内注射用双硫仑(50mg/kg)或媒剂(对照)对小鼠进行预处理。在LPS激发后12小时通过ELISA(n＝5个/组)测量TNFa。所示为平均值±s.d.。
图82含有示出实验结果的图，其中在用15mg/kg LPS进行腹膜内激发并进行存活率随访之前24小时和4小时，通过腹膜内注射用双硫仑(50mg/kg)或媒剂(对照)对小鼠进行预处理。在LPS激发后12小时通过ELISA(n＝5个/组)测量血清IL-6。所示为平均值±s.d.。
图83含有示出实验结果的线图，其中在腹膜内LPS激发(25mg/kg)并进行存活率随访之前4小时和之后每天一次通过腹膜内注射用双硫仑(50mg/kg)或媒剂(对照)对小鼠进行预处理。
图84含有示出实验结果的图像，其中通过免疫印迹分析来自四个指示组的小鼠的腹膜巨噬细胞的NLRP3、GSDMD和HMGB1。
图85含有示出脂质体渗漏测定的结果的线图。在20mM HEPES缓冲液(150mM NaCl)中，在不同浓度下在脂质体溶液中温育GSDMD(2.5μM)和半胱天冬酶-11(2.5μM)持续1小时。用于筛选的脂质体脂质的浓度设定为50μM。
图86含有示出脂质体渗漏测定的结果的线图。将不同浓度的GSDMD和半胱天冬酶-11(比率为1:1)在脂质体(50μM)溶液中温育持续1小时。筛选中所用的GSDMD的浓度设定为0.3μM。
图87含有示出脂质体渗漏测定的结果的线图。将不同浓度的半胱天冬酶-11和GSDMD(0.3μM)在脂质体(50μM)溶液中温育持续1小时。筛选中所用的半胱天冬酶-11的浓度设定为0.15μM。测量在276nm处激发之后在545nm处的荧光强度。
图88含有示出实验结果的条形图，其中用或不用范围为5-40μM的双硫仑(C-23)预处理小鼠iBMDM持续1小时，之后用PBS或poly(dA:dT)转染，并且在4小时后通过CellTiter-Glo分析细胞活力。**P<0.01。
图89含有示出Cys残基的GSDMA3、hGSDMA、mGSDMD和hGSDMD的序列比对图像。
图90含有示出实验结果的条形图，其中在HEK293T细胞中瞬时表达FL小鼠GSDMD或WT、C192S或C39A GSDMD-NT。细胞死亡在转染后20小时通过CytoTox96细胞毒性测定确定。c示出了所执行的三个独立实验的1个代表性实验的平均值±s.d.。*P<0.05。
图91含有示出由化合物坏死性磺酰胺的0.3μM GSDMD加0.15μM半胱天冬酶-11诱导的GSDMD介导的脂质体渗漏测定的结果的线图(剂量应答曲线)。
图92含有示出由化合物富马酸二甲酯的0.3μM GSDMD加0.15μM半胱天冬酶-11诱导的GSDMD介导的脂质体渗漏测定的结果的线图(剂量应答曲线)。
图93含有示出由化合物阿法替尼(afatinib)的0.3μM GSDMD加0.15μM半胱天冬酶-11诱导的GSDMD介导的脂质体渗漏测定的结果的线图(剂量应答曲线)。
图94含有示出由化合物依鲁替尼(ibrutinib)的0.3μM GSDMD加0.15μM半胱天冬酶-11诱导的GSDMD介导的脂质体渗漏测定的结果的线图(剂量应答曲线)。
图95含有由示出化合物LDC7559的0.3μM GSDMD加0.15μM半胱天冬酶-11诱导的GSDMD介导的脂质体渗漏测定的结果的线图(剂量应答曲线)。
图96含有示出实验结果的条形图，其中在0.5小时后通过可渗透细胞的荧光半胱天冬酶活性探针FAM-YVAD-FMK分析用或不用30μM双硫仑或z-VAD-fmk预处理1小时并且用尼日利亚菌素或介质刺激的LPS致敏的THP-1细胞的半胱天冬酶-1活性。
图97含有示出实验结果的条形图，其中在进行荧光读取之前，将去除介质后的LPS致敏的THP-1细胞与含探针FAM-YVAD-FMK的FLICA测定缓冲液一起温育另外0.5小时。在用或不用尼日利亚菌素处理0.5小时之前，用双硫仑、Bay 11-7082、坏死性磺酰胺(NSA)或z-VAD-fmk预处理iBMDM持续1小时。用指示的抗体对全细胞裂解物和培养上清液进行免疫印迹。
图98含有示出实验结果的条形图，其中在进行荧光读取之前，将去除介质后的LPS致敏的THP-1细胞与含探针FAM-YVAD-FMK的FLICA测定缓冲液一起温育另外0.5小时。在用或不用尼日利亚菌素处理1小时之前，用双硫仑、Bay 11-7082、坏死性磺酰胺(NSA)或z-VAD-fmk预处理iBMDM持续1小时。用指示的抗体对全细胞裂解物和培养上清液进行免疫印迹。
具体实施方式
如以下更全面地论述的，孔隙形成蛋白消皮素(如消皮素D)是炎症小体激活下游的最终细胞焦亡执行者。本申请的化合物有效地抑制炎性介体(如IL-1β)的消皮素孔隙形成和随后的分泌。如此，本申请的化合物可用于例如治疗由如脓毒症等炎症介导的疾病和病状。以下描述了含本公开的化合物的药物组合物以及使用和制备这些化合物的各种方法。
治疗性化合物
在一个总体方面，本公开提供一种式(I)化合物：
Figure BDA0002927659400000101
或其药学上可接受的盐，其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、Cy1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代；
或者R1和R2连同R1和R2所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy2的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
或者R3和R4连同R3和R4所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy3的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
每个Cy1独立地选自C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自RCy1的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
每个RCy1、RCy2和RCy3独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、卤基、CN、NO2、ORa2、C(O)Rb2、C(O)NRc2Rd2、C(O)ORa2、NRc2Rd2、NRc2C(O)Rb2、NRc2C(O)ORa2、NRc2C(O)NRc2Rd2、S(O)2Rb2和S(O)2NRc2Rd2；
Ra1、Ra2、Rc1、Rc2、Rd1和Rd2各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-4卤代烷基、Cy1、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa3、SRa3、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3、NRc3C(O)NRc3Rd3、NRc3S(O)2Rb3、NRc3S(O)2NRc3Rd3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
Rb1和Rb2各自独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-4卤代烷基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa3、SRa3、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3、NRc3C(O)NRc3Rd3、NRc3S(O)2Rb3、NRc3S(O)2NRc3Rd3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
Ra3、Rc3和Rd3各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基、(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基、C(O)Rb4、C(O)NRc4Rd4、C(O)ORa4、NRc4Rd4、S(O)2Rb4和S(O)2NRc4Rd4；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基各自任选地被独立地选自氧基、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、SRa4、C(O)Rb4、C(O)NRc4Rd4、C(O)ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4、NRc4C(O)NRc4Rd4、NRc4S(O)2Rb4、NRc4S(O)2NRc4Rd4、S(O)2Rb4和S(O)2NRc4Rd4的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
每个Rb3独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基各自任选地被独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、SRa4、C(O)Rb4、C(O)NRc4Rd4、C(O)ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4、NRc4C(O)NRc4Rd4、NRc4S(O)2Rb4、NRc4S(O)2NRc4Rd4、S(O)2Rb4和S(O)2NRc4Rd4的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
Ra4、Rc4和Rd4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基、(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基和Rg，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基各自任选地被独立地选自Rg的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
每个Rb4独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基、(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基和Rg，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基任选地被独立地选自Rg的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；并且
每个Rg独立地选自OH、NO2、CN、卤基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-4卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、氰基-C1-3亚烷基、HO-C1-3亚烷基、C6-10芳基、C6-10芳氧基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基、(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、硫基、C1-6烷基硫代、C1-6烷基亚磺酰基、C1-6烷基磺酰基、氨基甲酰基、C1-6烷基氨基甲酰基、二(C1-6烷基)氨基甲酰基、羧基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰基氨基、氨基磺酰基、C1-6烷基氨基磺酰基、二(C1-6烷基)氨基磺酰基、氨基磺酰基氨基、C1-6烷基氨基磺酰基氨基、二(C1-6烷基)氨基磺酰基氨基、氨基羰基氨基、C1-6烷基氨基羰基氨基和二(C1-6烷基)氨基羰基氨基。
在一些实施例中，R1选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，R1选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和Cy1；其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1S(O)2Rb1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，R1为任选地被Cy1取代的C1-6烷基。在这些实施例的一些方面，R1选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基和叔丁基，其中的每一个任选地被Cy1取代。在这些实施例的其它方面，R1为被Cy1取代的甲基。在一些实施例中，R1为Cy1。在一些实施例中，R1选自任选地被Cy1取代的Cy1和C1-6烷基。
在一些实施例中，R2选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，R2选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和Cy1；其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1S(O)2Rb1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，R2为任选地被Cy1取代的C1-6烷基。在这些实施例的一些方面，R2选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基和叔丁基，其中的每一个任选地被Cy1取代。在这些实施例的其它方面，R2为被Cy1取代的甲基。在一些实施例中，R2为Cy1。在一些实施例中，R2选自任选地被Cy1取代的Cy1和C1-6烷基。
在一些实施例中，R3选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，R3选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和Cy1；其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1S(O)2Rb1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，R3为任选地被Cy1取代的C1-6烷基。在这些实施例的一些方面，R3选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基和叔丁基，其中的每一个任选地被Cy1取代。在这些实施例的其它方面，R3为被Cy1取代的甲基。在一些实施例中，R3为Cy1。在一些实施例中，R3选自任选地被Cy1取代的Cy1和C1-6烷基。
在一些实施例中，R4选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，R4选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和Cy1；其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1S(O)2Rb1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，R4为任选地被Cy1取代的C1-6烷基。在这些实施例的一些方面，R4选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基和叔丁基，其中的每一个任选地被Cy1取代。在这些实施例的其它方面，R4为被Cy1取代的甲基。在一些实施例中，R4为Cy1。在一些实施例中，R4选自任选地被Cy1取代的Cy1和C1-6烷基。
在一些实施例中，R1和R2各自为任选地被Cy1取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R1和R2各自为Cy1。在一些实施例中，R1为任选地被Cy1取代的C1-6烷基，并且R2为Cy1。在一些实施例中，R1为Cy1；并且R2为任选地被Cy1取代的C1-6烷基。
在一些实施例中，R3和R4各自为任选地被Cy1取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R3和R4各自为Cy1。在一些实施例中，R3为任选地被Cy1取代的C1-6烷基，并且R4为Cy1。在一些实施例中，R3为Cy1；并且R4为任选地被Cy1取代的C1-6烷基。
在一些实施例中，R1和R2连同R1和R2所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy2的1个、2个或3个取代基取代。在前述实施例的一些方面，4-12元杂环烷基选自以下基团中的任一个基团：
Figure BDA0002927659400000141
以及
Figure BDA0002927659400000142
在一些实施例中，R3和R4连同R3和R4所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy3的1个、2个或3个取代基取代。在前述实施例的一些方面，4-12元杂环烷基选自以下基团中的任一个基团：
Figure BDA0002927659400000143
以及
Figure BDA0002927659400000144
在一些实施例中，Cy1为任选地被独立地选自RCy1的1个、2个或3个取代基取代的C6-10芳基。在这些实施例的一些方面，C6-10芳基为苯基或萘基。
在一些实施例中，每个Cy1独立地选自C6-10芳基和5-10元杂芳基，其中的每一个任选地被独立地选自RCy1的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，Cy1为任选地被独立地选自RCy1的1个、2个或3个取代基取代的C3-10环烷基。在这些实施例的一些方面，C3-10环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
在一些实施例中，Cy1为任选地被独立地选自RCy1的1个、2个或3个取代基取代的5-10元杂芳基。在这些实施例的一些方面，5-10元杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、1,2,3-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-三唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-三唑基、1,3,4-噻二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基和哒嗪基。在这些实施例的其它方面，5-10元杂芳基选自吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基。
在一些实施例中，Cy1为任选地被独立地选自RCy1的1个、2个或3个取代基取代的4-12元杂环烷基。在这些实施例的一些方面，4-12元杂环烷基选自四氢吡喃基、氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、吡咯烷基、异噁唑烷基、异噻唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、咪唑烷基、氮杂环庚烷基和苯并氮杂卓(benzazapenyl)。
在一些实施例中，每个RCy1独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、卤基、CN、NO2、ORa2、C(O)Rb2、C(O)NRc2Rd2、C(O)ORa2、NRc2Rd2、NRc2C(O)Rb2和NRc2C(O)ORa2。在一些实施例中，每个RCy1为C1-6烷基。
在一些实施例中，每个RCy2独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、卤基、CN、NO2、ORa2、C(O)Rb2、C(O)NRc2Rd2、C(O)ORa2、NRc2Rd2、NRc2C(O)Rb2和NRc2C(O)ORa2。在一些实施例中，每个RCy2为C1-6烷基。
在一些实施例中，每个RCy3独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、卤基、CN、NO2、ORa2、C(O)Rb2、C(O)NRc2Rd2、C(O)ORa2、NRc2Rd2、NRc2C(O)Rb2和NRc2C(O)ORa2。在一些实施例中，每个RCy3为C1-6烷基。
在一些实施例中，Ra1、Ra2、Rc1、Rc2、Rd1和Rd2各自独立地选自H、C1-6烷基、Cy1、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3；其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3和NRc3S(O)2Rb3的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，Rb1和Rb2各自独立地选自C1-6烷基和Cy1，其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自卤基、Cy1、CN、NO2、ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3和NRc3S(O)2Rb3的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，Ra3、Rc3和Rd3各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4和NRc4S(O)2Rb4的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，每个Rb3独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4和NRc4S(O)2Rb4的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，Ra4、Rc4和Rd4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自Rg的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，每个Rb4独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自Rg的1个、2个或3个取代基取代。
在一些实施例中，每个Rg独立地选自OH、NO2、CN、卤基、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、氰基-C1-3亚烷基和HO-C1-3亚烷基。
在一些实施例中：
每个R1、R2、R3和R4独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代；
或者R1和R2连同R1和R2所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy2的1个、2个或3个取代基取代；
或者R3和R4连同R3和R4所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy3的1个、2个或3个取代基取代；
每个Cy1独立地选自C6-10芳基和5-10元杂芳基，其中的每一个任选地被独立地选自RCy1的1个、2个或3个取代基取代；
每个RCy1、RCy2和RCy3独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、卤基、CN、NO2、ORa2、C(O)Rb2、C(O)NRc2Rd2、C(O)ORa2、NRc2Rd2、NRc2C(O)Rb2和NRc2C(O)ORa2；
Ra1、Ra2、Rc1、Rc2、Rd1和Rd2各自独立地选自H、C1-6烷基、Cy1、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3；其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3和NRc3S(O)2Rb3的1个、2个或3个取代基取代；
Rb1和Rb2各自独立地选自C1-6烷基和Cy1，其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自卤基、Cy1、CN、NO2、ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3和NRc3S(O)2Rb3的1个、2个或3个取代基取代；
Ra3、Rc3和Rd3各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4和NRc4S(O)2Rb4的1个、2个或3个取代基取代；
每个Rb3独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4和NRc4S(O)2Rb4的1个、2个或3个取代基取代；
Ra4、Rc4和Rd4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自Rg的1个、2个或3个取代基取代；
每个Rb4独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自Rg的1个、2个或3个取代基取代；并且
每个Rg独立地选自OH、NO2、CN、卤基、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、氰基-C1-3亚烷基和HO-C1-3亚烷基。
在前述实施例的一些方面：
R1、R2、R3和R4各自独立地选自Cy1和任选地被Cy1取代的C1-6烷基。
在一些实施例中，所述式(I)化合物选自以下：表A中所列的化合物中的任一种化合物
表A
Figure BDA0002927659400000171
Figure BDA0002927659400000181
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述式(I)化合物不是表(A)中所列的化合物中的任一种化合物：
在一些实施例中，本申请提供了以下化合物中的任一种化合物：
Figure BDA0002927659400000191
Figure BDA0002927659400000201
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，本申请的化合物不是C-5、C-7、C-8、C-22、C-24、C-25、Bay 11-7082、ASN-08966899、LDC7559、依鲁替尼、阿法替尼、富马酸二甲酯或坏死性磺酰胺。
在一些实施例中，本申请提供了以下化合物中的任一种化合物：
Figure BDA0002927659400000202
Figure BDA0002927659400000211
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，本申请的化合物不是C-5、C-7、C-8、C-22、C-24、C-25、Bay 11-7082或ASN-08966899。
药学上可接受的盐
在一些实施例中，本文所公开的化合物的盐在所述化合物的酸性基团与碱性基团(如氨基官能团)之间或者在所述化合物的碱性基团与酸性基团(如羧基官能团)之间形成。根据另一个实施例，所述化合物为药学上可接受的酸加成盐。
在一些实施例中，常用于形成本公开的化合物的药学上可接受的盐的酸包含：无机酸，如二硫化氢、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸；以及有机酸，如对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、二酒石酸、抗坏血酸、马来酸、苯磺酸(besylic acid)、富马酸、葡糖酸、葡糖醛酸、甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸(benzenesulfonic acid)、乳酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸；以及相关的无机酸和有机酸。此类药学上可接受的盐因此包含葡糖酸盐、硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-l,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、β-羟基丁酸盐、羟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐和其它盐。在一个实施例中，药学上可接受的酸加成盐包含与如盐酸和氢溴酸等矿物酸形成的盐以及尤其是与如马来酸等有机酸形成的盐。
在一些实施例中，常用于形成本公开的化合物的药学上可接受的盐的碱包含：碱金属的氢氧化物，所述碱金属包含钠、钾和锂；如钙和镁等碱土金属的氢氧化物；如铝和锌等其它金属的氢氧化物；氨、如未取代或羟基取代的单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺、二环己基胺等有机胺；三丁胺；吡啶；N-甲基；N-乙胺；二乙胺；三乙胺；单、双或三-(2-OH-(C1-C6)-烷基胺)，如N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；吗啉；硫代吗啉；哌啶；吡咯烷；以及氨基酸，如精氨酸、赖氨酸等。
在一些实施例中，本文公开的化合物或其药学上可接受的盐是基本上分离的。
制备方法
本文公开的化合物(包含其盐)可以使用已知的有机合成技术制备并且可以根据多种可能的合成途径中的任一种途径合成。本领域技术人员知道如何选择和实施适当的合成方案，并且了解大量的有机合成反应可用于潜在地合成本文提供的化合物。
起始材料、中间体和产物的合适的合成方法可以通过参考文献决定，所述文献包含以下参考来源，如：《杂环化学进展(Advances in Heterocyclic Chemistry)》,第1-107卷(爱思唯尔(Elsevier),1963-2012)；《杂环化学杂志(Journal of HeterocyclicChemistry)》第1-49卷(《杂环化学杂志》,1964-2012)；Carreira等人(编辑)《合成科学(Science of Synthesis)》,第1-48卷(2001-2010)和《知识更新(Knowledge Updates)》KU2010/1-4；2011/1-4；2012/1-2(蒂姆(Thieme),2001-2012)；Katritzky等人(编辑)《综合有机官能团转化(Comprehensive Organic Functional Group Transformations)》,(培格曼出版社(Pergamon Press),1996)；Katritzky等人(编辑)；《综合有机官能团转化II(Comprehensive Organic Functional Group Transformations II)》(爱思唯尔,第2版,2004)；Katritzky等人(编辑),《综合杂环化学(Comprehensive HeterocyclicChemistry)》(培格曼出版社,1984)；Katritzky等人,《综合杂环化学II(ComprehensiveHeterocyclic Chemistry II)》,(培格曼出版社,1996)；Smith等人,《马奇高等有机化学：反应、机制和结构(March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,andStructure)》,第6版(威利(Wiley),2007)；Trost等人(编辑),《综合有机合成(Comprehensive Organic Synthesis)》(培格曼出版社,1991)。
用于制备本文提供的化合物的反应可以在合适的溶剂中进行，所述合适的溶剂可以由有机合成领域中的技术人员容易地选择。合适的溶剂可以在进行反应的温度(例如，范围可以为从溶剂的冻结温度到溶剂的沸腾温度的温度)下与起始材料(反应物)、中间体或产物基本上无反应性。给定的反应可以在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。取决于特定的反应步骤，特定反应步骤的合适溶剂可以由技术人员选择。
本文提供的化合物的制备可以涉及各种化学基团的保护和脱保护。保护和脱保护的需要以及适当的保护基团的选择可以由本领域技术人员容易地确定。保护基团的化学性质可以例如在P.G.M.Wuts和T.W.Greene,《有机合成中的保护基团(Protective Groups inOrganic Synthesis)》,第4版,约翰·威利父子出版公司(Wiley&Sons,Inc.),纽约(2006)中找到。
使用方法
参考图67，当病原体相关的分子模式(PAMP)或损害相关的分子模式(DAMP)(又称为警报素)被细胞表面和如Toll样受体(TLR)和C型凝集素受体(CLR)等内体模式识别受体(PRR)以及胞质传感器感测到时，炎性级联开始。PAMP和DAMP的实例包含LPS、细菌毒素、细菌蛋白和核酸、微粒(如尿酸、胆固醇结晶和淀粉样蛋白β原纤维)、透明质酸和细胞外ATP。作为响应，细胞机制激活促半胱天冬酶典型或非典型炎症小体，从而引起活性炎性半胱天冬酶释放。炎性半胱天冬酶的实例包含半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-11以及半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-5。炎症小体中的半胱天冬酶的激活引起半胱天冬酶切割胞质蛋白消皮素，这产生消皮素N端片段(消皮素-NT)。在一些情况下，半胱天冬酶可切割的消皮素蛋白选自以下消皮素家族成员：GSDMA、GSMDB、GSDMC、GSDMD、DFNA5和DFNB59。消皮素-NT然后与来自胞质侧的细胞膜结合以形成孔隙，所述孔隙使细胞膜具有渗透性，从而引起细胞因子分泌和细胞焦亡。在经典的细胞凋亡期间，半胱天冬酶-3激活DFNA5。激活其它消皮素的蛋白酶目前还未知，但不是半胱天冬酶并且可以独立于炎症小体激活。通常，消皮素与酸性脂质结合，所述酸性脂质局限于哺乳动物膜的内叶，如磷脂酰肌醇磷酸(PIP)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酸(PA)以及细菌和线粒体脂质心磷脂。通常，消皮素基因在各种组织的上皮细胞和免疫细胞中表达，并且当被炎性半胱天冬酶切割时都能形成孔隙。在一个实例中，典型炎症小体激活使半胱天冬酶-1激活，所述半胱天冬酶-1切割促IL-1β、促IL-18和消皮素D，从而形成释放经过加工的炎性细胞因子IL-1β所需的孔隙。
本公开的化合物有效地阻断消皮素孔隙形成，并且因此阻断单独下游介体中的任一种介体。因此，与抑制单独的上游或下游炎性通路的抗炎剂(如已经过临床测试的抗炎剂(IL-1受体拮抗剂、TNFα抗体))相比，这些化合物在抑制炎症方面更有效。所述化合物在介导多种难以控制的使病人死亡的失调事件(如弥散性血管内凝血(通过激活蛋白C输注抑制))方面也更有效。通过本申请的化合物抑制消皮素(例如，消皮素D)可预防细胞因子风暴。这比常规的抗炎治疗更有效，一旦发生细胞因子风暴，所述常规的抗炎治疗试图减少细胞因子风暴的并发症。类似地，本申请的化合物也比中和LPS或其细胞外受体(TLR4，CD14)的药剂更有效。由于革兰氏菌会产生许多PAMP(毒素、鞭毛、杆状蛋白)，所有这些物质并不都是已知的，因此，如果LPS抑制不完全，则中和LPS可能不能预防革兰氏脓毒症，特别是对LPS超敏的人。与非典型炎症小体相比，TLR4可能是不那么重要的LPS传感器，所述非典型炎症小体不仅在人体免疫抗原呈递细胞中组成性地表达，而且在粘膜上皮处也有表达。LPS是非常重要的触发物，并且如果抑制其或其首次检测不成功，那么例如在人体内的多效性触发的脓毒症方面抑制其它PAMPPAMP或DAMP传感器中的一个传感器也将有效，其中在需要治疗时通常不知道触发PAMP。另外，本申请的化合物也比炎性半胱天冬酶的单独的抑制剂更有效。这是因为这些抑制剂对凋亡半胱天冬酶和其它半胱氨酸蛋白酶的潜在交叉反应性可能导致不必要的毒性(例如，肝纤维化)。半胱天冬酶-8的不必要的抑制还可能触发坏死性凋亡。在一些实施例中，对消皮素孔隙形成的抑制由于本申请的化合物与消皮素蛋白中的半胱氨酸反应而发生。在一些实施例中，所述半胱氨酸为Cys191。在一些实施例中，化合物还与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子。在一些实施例中，化合物与蛋白半胱氨酸残基的混杂反应性不会导致任何不期望的毒性，并且不会对化合物的疗效产生负面影响。
在一些情况下，本申请的化合物可用于治疗或预防炎性病症或缓解与这些病症相关的症状。此类病症通常导致免疫系统攻击身体自身的细胞或组织，并且包含脓毒症(例如，急性脓毒症)、秃头症、失聪症状、痛风、关节炎、类风湿性关节炎、硬化症、炎性肠病、强直性脊柱炎(AS)、抗磷脂抗体综合征(APS)、肌炎、硬皮病、干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)、全身性红斑狼疮、血管炎、家族性地中海热、新生儿发病多系统炎性疾病、贝赛特氏症(
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disease)、皮肤病、1型糖尿病、自体免疫疾病、银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化症、艾迪生氏病(Addison's disease)、格里夫氏病(Graves'disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌无力、恶性贫血、乳糜泻、慢性炎症、风湿病、脑脊髓炎、传染后小脑炎、视神经脊髓炎(例如，德维克病(Devic disease))、脑炎、代谢性脑病变、哮喘、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)、鼻窦炎、动脉粥样硬化、高胆固醇血症和消化性溃疡。在一些情况下，炎性疾病包含如青光眼、干眼症和视网膜缺血-再灌注等眼病。在一些情况下，炎性疾病包含慢性肺部疾病和损伤以及NASH和其它炎性肝脏疾病。在一些情况下，炎性疾病为遗传性自身炎性病状。
与炎性病症相关的症状通常包含慢性疼痛、泛红、关节和其它组织肿胀、僵硬、发烧、器官中血蛋白积聚、脱发、疲劳和对正常组织的损害。本申请的化合物可用于缓解这些症状。
在一些情况下，本申请的化合物可用于治疗脓毒症或缓解与此病状相关的症状。与脓毒症相关的症状的实例包含血管渗漏、循环性虚脱、凝血激活和多器官衰竭。在没有适当治疗的情况下，脓毒症在约三分之一的病例中都是致命的。脓毒症是世界上新生儿和幼儿死亡的主要原因，并且在美国，每2或3名住院的成人死亡中就有1人死于该病。目前对脓毒症的治疗仅限于抗生素和支持性护理，并且超过100项被设计成静默对感染的免疫应答的临床试验均未能产生单个新的有效疗法。有利地，本申请的化合物减少对弥散性和难以控制的感染的固有免疫应答，并且成功地治疗脓毒症。
在一些情况下，本申请的化合物可以用于例如预防有患脓毒症高风险的患者的脓毒症。此类患者的合适实例包含经受骨髓移植的中性粒细胞减少症患者。
在一些情况下，本公开的化合物可用于治疗或预防心血管疾病。此类疾病的实例包含中风、心力衰竭、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律不齐、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病、冠状动脉疾病、心肌梗塞和静脉血栓形成。
在一些情况下，本公开的化合物可用于治疗或预防代谢病症。此类病症的实例包含代谢综合征、II型糖尿病、胱氨酸病、胱氨酸尿、法布里病(Fabry disease)、半乳糖血症、戈谢病(Gaucher disease)(I型)、哈特纳普病(Hartnup disease)、高胱氨酸尿症、亨特氏综合征(Hunter syndrome)、胡勒尔综合征(Hurler syndrome)、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)、枫糖尿病、马-拉综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)、莫基奥综合征(Morquio syndrome)、尼曼匹克病(Niemann-Pick disease)(A型)、苯丙酮尿症、庞贝病(Pompe disease)、卟啉症、施艾氏综合征(Scheie syndrome)、戴萨克斯病(Tay-Sachsdisease)、酪氨酸血症(肝肾)和冯基尔克病(von Gierke disease)。
在一些情况下，本公开的化合物可用于治疗或预防神经退行性疾病。此类疾病的实例包含阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、多发性硬化症、痴呆、额颞叶痴呆、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、运动神经元疾病和精神分裂症。
任何疾病都可能有炎性组分，特别是当疾病涉及感染或细胞死亡时。所以，本申请的化合物可用于治疗或预防此类疾病。此类疾病的合适的实例包含革兰氏阳性菌引起的感染、多种微生物感染、寄生虫引起的感染(例如，疟疾、弓形虫病、锥虫病、利什曼虫)、移植排斥、眼内炎症(例如，视网膜炎、葡萄膜炎)和癌症。
组合治疗
在一些情况下，使用本文所描述的化合物或其药学上可接受的盐的方法包含向受试者施用所述化合物与至少一种另外的治疗剂的组合。在此方法中，化合物和另外的治疗剂可以(例如以相同的剂型或以不同的剂型)同时施用于受试者，或连续地施用于受试者(例如，另外的治疗剂可以在本公开的化合物或其药学上可接受的盐之前或之后施用)。
在一些情况下，另外的治疗剂包含抗炎剂。合适实例包含非类固醇性抗炎剂，如塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、阿司匹林(aspirin)、双氯芬酸(diclofenac)、舒林酸(sulindac)、奥沙普嗪(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、吲哚美辛(indomethacin)、美洛昔康(meloxicam)、非诺洛芬(fenoprofen)、二氟尼柳(diflunisal)、BAY 11-7082，或其药学上可接受的盐。类固醇(例如，皮质类固醇)抗炎剂的合适实例包含皮质醇、皮质酮、氢化可的松、醛固酮、脱氧皮质酮、去炎松、巴多索隆(bardoxolone)、甲基巴多索隆、去炎松、可的松、强的松和甲基强的松龙或其药学上可接受的盐。抗炎剂的其它合适实例包含如抗炎抗体(例如，抗IL-1、抗TNF)和整合素等蛋白质。
在一些情况下，另外的治疗剂为抗生素。此类抗生素可以选自：喹诺酮类、β-内酰胺、头孢菌素类、青霉素、碳青霉烯类、脂肽类、氨基糖苷类、糖肽类、大环内酯类、袢霉素类、氨磺胺类、单菌霉素、噁唑烷酮类、脂肽类、大环内酯类和阳离子抗菌肽(CAMP)。
阳离子抗菌肽的合适实例包含防御素肽(例如，防御素1，如β-防御素1或α-防御素1)、或天蚕素、果蝇抗菌肽基因(andropin)、小菜蛾抗菌肽基因(moricin)、角毒素(ceratotoxin)、蜂毒肽、蛙皮素、皮抑菌肽(dermaseptin)、铃蟾抗菌肽、灯盏花素(brevinin)(例如，灯盏花素-1)、秦皮乙素(esculentin)、布弗林(buforin)II(例如，来自两栖动物)、CAP18(例如，来自家兔)、LL37(例如，来自人)、蜂毒素(abaecin)、蜜蜂素(apidaecins)(例如，来自蜜蜂)、猪抗菌肽(prophenin)(例如，来自猪)、吲多立新(indolicidin)(例如，来自牛)、brevinins、溶菌素(protegrin)(例如，来自猪)、鲎肽素(tachyplesins)(例如，来自鲎)和果蝇素(例如，来自果蝇)。
喹啉抗生素的合适实例包含左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、氟罗沙星、司帕沙星、格雷沙星、曲伐沙星、克林沙星、吉米沙星、依诺沙星、西他沙星、那氟沙星、妥舒沙星、西诺沙星、罗索沙星、米洛沙星、莫西沙星、加替沙星、西诺沙星、依诺沙星、氟罗沙星、洛美沙星、洛美沙星、米洛沙星、萘啶酸、那氟沙星、噁喹酸、培氟沙星、吡咯米酸、吡哌酸、罗索沙星、芦氟沙星、替马沙星、托氟沙星、曲伐沙星和贝西沙星。
头孢菌素类抗生素的合适实例包含头孢唑林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢羟唑、头孢磺啶、头孢尼西、头孢哌酮、头孢丙烯和头孢曲松。
青霉素类抗生素的合适实例包含青霉素G、青霉素V、普鲁卡因青霉素和苄星青霉素、氨苄青霉素和阿莫西林、苄青霉素、苯氧甲基青霉素、苯唑西林、甲氧西林、双氯西林、氟氯西林、替莫西林、阿洛西林、羧苄西林、替卡西林(ricarcillin)、美洛西林、哌拉西林、阿帕西林、海他西林、巴氨西林、磺苄西林、mecicilam、匹美西林、环己西林、酞氨西林(talapicillin)、阿扑西林(aspoxicillin)、氯唑西林、萘夫西林和匹氨西林。
碳青霉烯类抗生素的合适实例包含噻烯霉素、头茂培南(tomopenem)、来那培南(lenapenem)、泰比培南(tebipenem)、阿祖培南(razupenem)、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南(倍他米隆)和比阿培南。
脂肽类抗生素的合适实例包含多粘菌素B、粘菌素(多粘菌素E)和达托霉素。
氨基糖苷类抗生素的合适实例包含庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、地贝卡星(debekacin)、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、紫苏霉素、大观霉素和链霉素。
糖肽类抗生素的合适实例包含万古霉素、替考拉宁、特拉万星(telavancin)、雷莫拉宁、达托霉素、迪卡皮宁(decaplanin)和博来霉素。
大环内酯类抗生素的合适实例包含阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素(fidaxomicin)、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素(solithromycin)、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素(tylosin/tylocine)、罗红霉素、地红霉素、醋竹桃霉素、大观霉素、酒霉素、新酒霉素、红霉内酯(erythronolid)、巨大霉素、苦霉素、那波霉素、竹桃霉素、三乙酰竹桃霉素、兰卡霉素(laukamycin)、久慈霉素A、白环霉素(albocyclin)和烬灰霉素(cineromycin)B。
袢霉素类抗生素的合适实例包含曲张链菌素、格尔德霉素、除莠霉素、利福霉素、利福平、利福布丁、利福喷丁和利福昔明。
氨磺胺类抗生素的合适实例包含磺胺、磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺索嘧啶(sulfasomidine)、柳氮磺胺吡啶、磺胺米隆、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧吡嗪、磺胺地索辛、磺胺均三嗪、磺胺多辛、磺胺林、磺胺胍、琥珀酰磺胺噻唑和酞磺胺噻唑。
药物组合物
本申请还提供了药物组合物，所述药物组合物包括有效量的本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。药物组合物还可以包括本文所描述的另外的治疗剂中的任何一种。在某些实施例中，本申请还提供了包括本文所描述的另外的治疗剂中的任何一种的药物组合物和剂型。在与调配物的其它成分兼容的意义上，一种或多种载体是“可接受的”，并且在药学上可接受的载体的情况下，所述一种或多种载体在药物中以对其接受者无害的量使用。
可以在本申请的药物组合物中使用的药学上可接受的载体、佐剂和媒剂包含但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。
组合物或剂型可以含有本文所述的化合物和治疗剂中的任何一种，其范围为0.005％到100％，其中余量由合适的药学上可接受的赋形剂构成。预期的组合物可以含有0.001％-100％的本文提供的化合物和治疗剂中的任何一种，在一个实施例中为0.1-95％，在另一个实施例中为75-85％，在另外的实施例中为20-80％，其中余量可以由本文所述的任何药学上可接受的赋形剂或这些赋形剂的任何组合构成。
施用路径和剂型
本申请的药物组合物包含适合于任何可接受的施用路径的那些组合物。可接受的施用路径包含但不限于口腔、皮肤、子宫颈内、窦内、气管内、肠内、硬膜外、间质、腹内、动脉内、支气管内、颊内、颅内、脑池内、冠状动脉内、皮内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、齿龈内、回肠内、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌内、鼻内、卵巢内、腹腔内、前列腺内、肺内、窦内、椎管内、滑膜内、睾丸内、鞘内、小管内、瘤内、子宫内、血管内、静脉内、鼻、鼻饲、口服、肠胃外、经皮(percutaneous)、硬膜外、直肠、呼吸系统(吸入)、皮下、舌下、黏膜下、局部、经皮(transdermal)、转化粘液质、经气管、输尿管、尿道和阴道。
本文所描述的组合物和调配物可以方便地以单位剂型呈现，例如片剂、缓释胶囊和脂质体，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。参见，例如《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,利平科特·威廉姆斯和威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins),巴尔的摩,MD(第20版2000)。此类制备方法包含将待施用的分子与成分(如构成一种或多种辅助成分的载体)缔合。通常，通过使活性成分与液体载体、脂质体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地缔合并且然后如果需要的话使产品成形来制备组合物。
在一些实施例中，本文所公开的化合物和治疗剂中的任何一种都是口服施用的。适合于口服施用的本申请的组合物可以以离散单位呈现，如各自含有预定量(例如，有效量)的活性成分的胶囊、小药囊、颗粒剂或片剂；粉末或颗粒剂；水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；水包油液体乳剂；油包水液体乳剂；填充于脂质体中；或作为大丸剂等存在。软明胶胶囊可以用于含有这种悬浮液，其可以有利地提高化合物吸收率。在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包含乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、硅酸和淀粉。其它可接受的赋形剂可以包含：a)填充剂或增充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，如甘油；d)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂，如石蜡；f)吸收促进剂，如季铵化合物；g)润湿剂，如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂，如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和其混合物。对于呈胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包含乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服施用水性悬浮液时，活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要的话，可以加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。适用于口服施用的组合物包含：在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包括这些成分的锭剂；以及在惰性基质(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中包括活性成分的软锭剂。
适合于肠胃外施用的组合物包含：水性和非水性无菌注射液或输注液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和增稠剂。所述调配物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以储存在仅需要在即将使用之前添加无菌液体载体(例如，注射用水、盐水(例如，0.9％盐水溶液))或5％右旋糖溶液的冷冻干燥(冻干)条件下。临时注射液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。注射液可以呈例如无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。此悬浮液可以根据本领域中已知的技术、使用合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂来调配。无菌可注射制剂还可以是非毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒剂和溶剂有甘露醇、水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常规被用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的非挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。如油酸等脂肪酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射物，天然的药学上可接受的油类(如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化的形式)也是如此。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂。
本申请的药物组合物可以以直肠施用的栓剂形式来施用。这些组合物可以通过将本申请的化合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下是固体而在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放活性组分。此类材料包含但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本申请的药物组合物可以通过鼻腔气雾剂或吸入来施用。此类组合物是根据药物调配领域熟知的技术制备的，并且可以使用苯甲醇或其它合适的防腐剂、用于提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂制备为盐水中的溶液。例如，参见美国专利第6,803,031号。在Ilium,L.,《药学与药理学杂志(J PharmPharmacol)》,56:3-17,2004和Ilium,L.,《欧洲药物科学杂志(Eur J Pharm Sci)》11:1-18,2000中发现了用于鼻内施用的另外调配物和方法。
本公开的局部组合物可以以下形式制备和使用：气溶胶喷雾剂、霜剂、乳剂、固体、液体、分散剂、泡沫剂、油、凝胶、水凝胶、洗剂、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发剂、溶液、泵式喷雾剂、棒、小毛巾、肥皂或局部施用和/或化妆品和皮肤护理制剂领域常用的其它形式。局部组合物可以呈乳剂形式。当所期望的治疗涉及通过局部应用容易接近的区域或器官时，本申请的药物组合物的局部施用尤其有用。在一些实施例中，局部组合物包括本文所公开的化合物和治疗剂中的任一种与一种或多种另外的成分、载体、赋形剂或稀释剂的组合，包括但不限于吸收剂、抗刺激剂、抗痤疮剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂/颜料、润肤剂(保湿剂)、乳化剂、成膜/保持剂、芳香剂、免洗型去角质剂、处方药、防腐剂、擦洗剂、有机硅、皮肤相同/修复剂、增滑剂、防晒活性成分、表面活性剂/洗涤清洁剂、渗透促进剂和增稠剂。
本申请的化合物和治疗剂可以并入用于涂覆植入式医学装置(如假体、人造瓣膜、血管移植物、支架或导管)的组合物中。合适的涂层和涂覆的植入式装置的一般制备是本领域中已知的，并且例示于美国专利第6,099,562号；第5,886,026号；以及第5,304,121号中。涂层通常为生物相容性聚合材料，如水凝胶聚合物、聚甲基二硅氧烷、聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸、乙烯醋酸乙烯酯以及其混合物。涂层可以任选地进一步被氟硅酮、多糖、聚乙二醇、磷脂或其组合的合适面层涂覆，以赋予组合物控释特性。用于侵入性装置的涂层将包含在药学上可接受的载体、佐剂或媒剂的定义内，如本文所使用的术语一样。
根据另一个实施例，本申请提供一种植入式药物释放装置，所述植入式药物释放装置浸染或含有化合物或治疗剂或包括本申请的化合物或治疗剂的组合物，使得所述化合物或治疗剂从所述装置释放并且具有治疗活性。
剂量和方案
在本申请的药物组合物中，本文所描述的化合物以有效量(例如，治疗有效量)呈现。
根据所治疗的疾病、疾病的严重程度、施用途径、受试者的性别、年龄和一般健康状况、赋形剂使用、与其它治疗剂治疗共同使用的可能性(如使用其它药剂)以及治疗医师的判断，有效剂量可以变化。
在一些实施例中，本申请的化合物以在人血液和组织中容易且安全地实现的浓度使用。
在一些实施例中，本文所描述的化合物的有效量的范围可以为例如约0.001mg/kg到约500mg/kg(例如，约0.001mg/kg到约200mg/kg；约0.01mg/kg到约200mg/kg；约0.01mg/kg到约150mg/kg；约0.01mg/kg到约100mg/kg；约0.01mg/kg到约50mg/kg；约0.01mg/kg到约10mg/kg；约0.01mg/kg到约5mg/kg；约0.01mg/kg到约1mg/kg；约0.01mg/kg到约0.5mg/kg；约0.01mg/kg到约0.1mg/kg；约0.1mg/kg到约200mg/kg；约0.1mg/kg到约150mg/kg；约0.1mg/kg到约100mg/kg；约0.1mg/kg到约50mg/kg；约0.1mg/kg到约10mg/kg；约0.1mg/kg到约5mg/kg；约0.1mg/kg到约2mg/kg；约0.1mg/kg到约1mg/kg；或约0.1mg/kg到约0.5mg/kg)。
在一些实施例中，本文所描述的化合物的有效量为约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg或约150mg/kg。
前述剂量可以按天(例如，以单剂量或以两次或更多次分开的剂量，例如一天一次、一天两次、一天三次)或不按天(例如每隔一天、每两天、每三天、一周一次、一周两次、每两周一次、每月一次)施用。
试剂盒
本公开还提供了例如可用于治疗本文所引述的病症、疾病和病状的药物试剂盒，所述药物试剂盒包含一个或多个含有药物组合物的容器，所述药物组合物包括治疗有效量的本公开的化合物。如果需要的话，此类试剂盒可以进一步包含各种常规药物试剂盒组分中的一种或多种，例如具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、另外的容器等。试剂盒中还可以包含指示待施用组分的量的说明书(呈嵌件或标签的形式)、施用指南和/或用于混合组分的指南。试剂盒可以任选地包含本文所描述的另外的治疗剂或其药学上可接受的盐中的任何一种的本文所描述的量和剂型中的任何一种。
筛选测定
在一些情况下，本申请提供了一种筛选测定，以鉴定例如消皮素孔隙形成、炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)、细胞因子分泌和/或炎性半胱天冬酶的抑制剂。参考图1，在此类测定中，样品可以包含脂质体，所述脂质体形成为使得金属阳离子俘获在脂质体内部。样品还可以包含全长消皮素蛋白，所述全长消皮素蛋白含有蛋白酶切割位点、测试化合物以及能够与俘获在脂质体内部的金属阳离子形成复合物的配体。为了确定化合物对孔隙形成的抑制，向样品中加入蛋白酶。所述蛋白酶切割来自全长消皮素蛋白的N端消皮素片段。在不存在测试化合物的情况下或者如果测试化合物在测定中无活性，这些NT片段然后会与脂质体的脂质结合并且在脂质体中形成孔隙，借此金属阳离子从脂质体渗漏到外部缓冲液中。在外部缓冲液中，金属阳离子与螯合配体结合以形成复合物。当阳离子和配体彼此不结合时，此复合物比金属阳离子或螯合配体的荧光更高。使用适当的仪器，可以检测到样品的增大的荧光，从而指示金属阳离子从脂质体的渗漏。在存在例如与消皮素发生化学反应的活性测试化合物的情况下，被测试化合物化学修饰的NT消皮素片段不在脂质体中形成孔隙。所以，金属阳离子仍包封在脂质体中，并且不与外部缓冲液中的螯合配体结合。如此，无脂质体渗漏，并且在样品中检测不到荧光增大。通过将含有测试化合物的样品的荧光与不含任何测试化合物的对照样品的荧光进行比较，可以鉴定测定中的活性化合物。当化合物被认为在测定中有活性时，样品的荧光低于对照的荧光。在一些实施例中，当化合物被认为有活性时，样品的荧光比对照的荧光低至少约10％、20％、30％、40％、50％或60％。
在一些情况下，金属阳离子选自Ce3+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+、Mg2+和Tb3+。在一些实施例中，金属阳离子为Tb3+。在一些情况下，螯合配体选自乙二胺四乙酸(EDTA)、吡啶二羧酸(DPA)、乙二胺、卟啉和二巯基丙醇。在一些实施例中，螯合配体为吡啶二羧酸(DPA)。
在一些情况下，样品中的消皮素蛋白选自GSDMA、GSMDB、GSDMC、GSDMD、DFNA5和DFNB59。在一些情况下，消皮素蛋白含有鼻病毒3C蛋白酶切割位点(GSDM-3C)。例如，样品中的消皮素蛋白为带有3C蛋白酶切割位点(GSDMD-3C)的消皮素D蛋白。
在一些情况下，蛋白酶选自：炎性半胱天冬酶和鼻病毒3C蛋白酶。炎性半胱天冬酶可以为半胱天冬酶1或半胱天冬酶11。在一些实施例中，消皮素蛋白为GSDM-3C，并且蛋白酶为3C蛋白酶。在其它实施例中，消皮素蛋白为GSDMD-3C，并且蛋白酶为3C蛋白酶。
在又另一总体方面，本申请提供了一种鉴定化合物的方法，所述化合物：
·抑制细胞中的消皮素孔隙形成；和/或
·抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
·抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
·抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
·与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
·与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子；
所述方法包括：
d)提供包括脂质体的样品，所述脂质体包括能够与螯合配体、螯合配体和测试化合物形成复合物的金属阳离子；
e)使测试化合物与N端消皮素蛋白片段接触；以及
f)确定所述测试化合物是否抑制所述金属阳离子从所述脂质体中渗漏，其中对所述金属阳离子从所述脂质体中的所述渗漏的所述抑制指示所述测试化合物：
·抑制细胞中的消皮素孔隙形成；和/或
·抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
·抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
·抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
·与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
·与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子。
定义
如本文所使用的，术语“约”意指“大约”(例如，指示值的+/-大约10％)。
在本说明书的各个地方，本发明的化合物的取代基以组或范围公开。其具体意图是，本发明包含此类组和范围的成员的每一个单独的子组合。例如，术语“C1-6烷基”具体旨在单独地公开甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
在本说明书的各个地方描述了各种芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基环。除非另外说明，否则这些环可以在化合价允许的任何环成员处连接到分子的其余部分。例如，术语“吡啶环”或“吡啶基”可以指吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基环。
应进一步理解的是，为清晰起见，在单独实施例的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。
术语“芳香族”是指具有一个或多个具有芳香族特征的多不饱和环(即，具有(4n+2)个离域π(pi)电子，其中n是整数)的碳环或杂环。
术语“n元”中的n为通常描述一个部分中的成环原子的数目的整数，其中成环原子的数目为n。例如，哌啶基为6元杂环烷基环的实例，吡唑基为5元杂芳基环的实例，吡啶基为6元杂芳基环的实例，并且1,2,3,4-四氢-萘为10元环烷基的实例。
如本文所使用的，短语“任选地被取代”意指未经取代或经过取代。取代基被独立地选择，并且取代可以在任何化学上可及的位置处。如本文所使用的，术语“经过取代”意指氢原子被去除并且被取代基替换。单个二价取代基(例如，氧基)可以替换两个氢原子。应理解的是，在给定原子处的取代受化合价的限制。
在整个定义中，术语“Cn-m”指示包含端点的范围，其中n和m是整数并且指示碳的数目。实例包含C1-4、C1-6等。
如本文所使用的，单独或与其它术语组合使用的术语“Cn-m烷基”是指可以为直链或支链的具有n到m个碳的饱和烃基。烷基部分的实例包含但不限于化学基团，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；高级同系物，如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。在一些实施例中，烷基含有1到6个碳原子、1到4个碳原子、1到3个碳原子、或1到2个碳原子。
如本文所使用的，单独或与其它术语组合使用的术语“Cn-m卤代烷基”是指具有一个卤原子到可以相同或不同的2s+1个卤原子的烷基，其中“s”为烷基中的碳原子的数目，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，卤代烷基是仅氟化的。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，“Cn-m烯基”是指具有一个或多个双碳-碳键并且具有n到m个碳的烷基。示例烯基包含但不限于乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、仲丁烯基等。在一些实施例中，烯基部分含有2到6个、2到4个、或2到3个碳原子。
如本文所使用的，“Cn-m炔基”是指具有一个或多个三碳-碳键并且具有n到m个碳的烷基。示例炔基包含但不限于乙炔基、丙-1-基、丙-2-基等。在一些实施例中，炔基部分含有2到6个、2到4个、或2到3个碳原子。
如本文所使用的，单独或与其它术语组合使用的术语“Cn-m亚烷基”是指具有n到m个碳的二价烷基连接基团。亚烷基的实例包含但不限于乙-1,1-二基、乙-1,2-二基、丙-1,1,-二基、丙-1,3-二基、丙-1,2-二基、丁-1,4-二基、丁-1,3-二基、丁-1,2-二基、2-甲基-丙-1,3-二基等。在一些实施例中，亚烷基部分含有2到6个、2到4个、2到3个、1到6个、1到4个、或1到2个碳原子。
如本文所使用的，单独或与其它术语组合使用的术语“Cn-m烷氧基”是指式-O-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳。示例烷氧基包含但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如，正丙氧基和异丙氧基)、丁氧基(例如，正丁氧基和叔丁氧基)等。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，“Cn-m卤代烷氧基”是指具有n到m个碳原子的式-O-卤代烷基的基团。示例卤代烷氧基为OCF3。在一些实施例中，卤代烷氧基是仅氟化的。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“氨基”是指式-NH2的基团。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基氨基”是指式-NH(烷基)的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。烷基氨基的实例包含但不限于N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-丙基氨基(例如，N-(n-丙基)氨基和N-异丙基氨基)、N-丁基氨基(例如，N-(n-丁基)氨基和N-(叔丁基)氨基)等。
如本文所使用的，术语“二(Cn-m烷基)氨基”是指式-N(烷基)2的基团，其中两个烷基各自独立地具有n到m个碳原子。在一些实施例中，每个烷基独立地具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷氧基羰基”是指式-C(O)O-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。烷氧基羰基的实例包含但不限于甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基(例如，正丙氧基羰基和异丙氧基羰基)、丁氧基羰基(例如，正丁氧基羰基和叔丁氧基羰基)等。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基羰基”指式-C(O)-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。烷基羰基的实例包含但不限于甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基(例如，正丙基羰基和异丙基羰基)、丁基羰基(例如，正丁基羰基和叔丁基羰基)等。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基羰基氨基”是指式-NHC(O)-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基磺酰基氨基”是指式-NHS(O)2-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“氨基磺酰基”是指-S(O)2NH2的基团。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基氨基磺酰基”是指式-S(O)2NH(烷基)的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“二(Cn-m烷基)氨基磺酰基”是指式-S(O)2N(烷基)2的基团，其中每个烷基独立地具有n到m个碳原子。在一些实施例中，每个烷基独立地具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“氨基磺酰基氨基”是指式-NHS(O)2NH2的基团。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基氨基磺酰基氨基”是指式-NHS(O)2NH(烷基)的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“二(Cn-m烷基)氨基磺酰基氨基”是指式-NHS(O)2N(烷基)2的基团，其中每个烷基独立地具有n到m个碳原子。在一些实施例中，每个烷基独立地具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，单独或与其它术语组合使用的术语“氨基羰基氨基”是指式-NHC(O)NH2的基团。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基氨基羰基氨基”是指式-NHC(O)NH(烷基)的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“二(Cn-m烷基)氨基羰基氨基”是指式-NHC(O)N(烷基)2的基团，其中每个烷基独立地具有n到m个碳原子。在一些实施例中，每个烷基独立地具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“氨基甲酰基”是指式-C(O)NH2的基团。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基氨基甲酰基”是指式-C(O)-NH(烷基)的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“二(Cn-m烷基)氨基甲酰基”是指式-C(O)N(烷基)2的基团，其中两个烷基各自独立地具有n到m个碳原子。在一些实施例中，每个烷基独立地具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“硫代”是指式-SH的基团。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基硫代”是指式-S-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基亚磺酰基”是指式-S(O)-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，术语“Cn-m烷基磺酰基”是指式-S(O)2-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施例中，烷基具有1到6个、1到4个、或1到3个碳原子。
如本文所使用的，单独或与其它术语组合使用的术语“羰基”是指-C(＝O)-基团，其也可以写作C(O)。
如本文所使用的，术语“羧基”是指-C(O)OH基团。
如本文所使用的，术语“氰基-C1-3烷基”是指式-(C1-3亚烷基)-CN的基团。
如本文所使用的，术语“HO-C1-3烷基”是指式-(C1-3亚烷基)-OH的基团。
如本文所使用的，“卤基”是指F、Cl、Br或I。在一些实施例中，卤基为F、Cl或Br。
如本文所使用的，单独或与其它术语组合使用的术语“芳基”是指芳香族烃基，所述芳香族烃基可以为单环或多环的(例如具有2、3或4个稠环)。术语“Cn-m芳基”指具有n到m个环碳原子的芳基。芳基包含例如苯基、萘基、蒽基、菲基、茚满基、茚基等。在一些实施例中，芳基具有6到10个碳原子。在一些实施例中，芳基为苯基或萘基。
如本文所使用的，“环烷基”是指包含环化烷基和/或烯基的非芳香族环烃。环烷基可以包含单环或多环(例如具有2、3或4个稠环)基团和螺环。环烷基的成环碳原子可以任选地被1或2个独立地选择的氧基或硫化物基团(例如，C(O)或C(S))取代。环烷基的定义中还包含具有与环烷基环(例如，环戊烷、环己烷等的苯并或噻吩基衍生物)稠合(即，与其具有共用键)的一个或多个芳香族环的部分。含有稠合芳香族环的环烷基可以通过包含稠合芳香族环的成环原子在内的任何成环原子连接。环烷基可以具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个成环碳(C3-10)。在一些实施例中，环烷基为C3-10单环或双环环烷基。在一些实施例中，环烷基为C3-7单环环烷基。示例环烷基包含环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚三烯基、降冰片基、降蒎基、降蒈基、金刚烷基等。在一些实施例中，环烷基为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
如本文所使用的，“杂芳基”是指具有至少一个选自硫、氧和氮的杂原子环成员的单环或多环芳香族杂环基。在一些实施例中，杂芳环具有1个、2个、3个或4个独立地选自氮、硫和氧的杂原子环成员。在一些实施例中，杂芳基部分中的任何成环N都可以为N-氧化物。在一些实施例中，杂芳基为具有1个、2个、3个或4个独立地选自氮、硫和氧的杂原子环成员的5-10元单环或双环杂芳基。在一些实施例中，杂芳基为具有1或2个独立地选自氮、硫和氧的杂原子环成员的5-6单环杂芳基。在一些实施例中，杂芳基为五元或六元杂芳基环。五元杂芳基环为环具有五个环原子的杂芳基，其中一个或多个(例如，1个、2个或3个)环原子独立地选自N、O和S。示例性五元环杂芳基为噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、1,2,3-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-三唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-三唑基、1,3,4-噻二唑基和1,3,4-噁二唑基。六元杂芳基环为环具有六个环原子的杂芳基，其中一个或多个(例如，1个、2个或3个)环原子独立地选自N、O和S。示例性六元环杂芳基为吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基和哒嗪基。
如本文所使用的，“杂环烷基”是指具有一个或多个选自O、N或S的成环杂原子的非芳香族单环或多环杂环。杂环烷基包含单环4、5、6、7、8、9或10元杂环烷基。杂环烷基还可以包含螺环。示例杂环烷基包含吡咯烷-2-酮、1,3-异噁唑烷-2-酮、吡喃基、四氢吡喃、氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基、吗啉代基、硫代吗啉代基、哌嗪基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、吡咯烷基、异噁唑烷基、异噻唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、咪唑烷基、氮杂环庚烷基、苯并氮杂卓等。杂环烷基的成环碳原子和杂原子可以任选地被1或2个独立地选择的氧基或硫离子基(例如，C(O)、S(O)、C(S)或S(O)2等)取代。杂环烷基可以通过成环碳原子或成环杂原子连接。在一些实施例中，杂环烷基含有0到3个双键。在一些实施例中，杂环烷基含有0到2个双键。杂环烷基的定义中还包含具有与环烷基环(例如，哌啶、吗啉、吖庚因等的苯并或噻吩基衍生物)稠合(即，与其具有共用键)的一个或多个芳香族环的部分。含有稠合芳香族环的杂环烷基可以通过包含稠合芳香族环的成环原子在内的任何成环原子连接。在一些实施例中，杂环烷基为具有1或2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环4-6元杂环烷基。在一些实施例中，杂环烷基为具有1、2、3或4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环或双环4-10元杂环烷基。
在某些地方，定义或实施例是指具体的环(例如，氮杂环丁烷环、吡啶环等)。除非另外指示，否则这些环可以连接到任何环成员，条件是不超出原子的化合价。例如，氮杂环丁烷环可以在环的任何位置处连接，而吡啶-3-基环在3-位置处连接。
如本文所使用的，术语“氧基”是指作为二价取代基的氧原子，当与碳连接时形成羰基(例如，C＝O)，或者当与杂原子连接时形成亚砜或砜基。
如本文所使用的，术语“化合物”旨在包含所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和所描绘的结构的同位素。除非另外说明，否则本文按名称或结构确定为一种特定互变异构形式的化合物旨在包含其它互变异构形式。
本文所描述的化合物可以是不对称的(例如，具有一个或多个立体中心)。除非另外指示，否则意指所有立体异构体(如对映异构体和非对映异构体)。含有不对称取代的碳原子的本发明的化合物可以以光学活性形式或外消旋形式被分离。关于如何由无光学活性起始材料制备光学活性形式的方法在本领域是已知的，如通过外消旋混合物拆分或通过立体选择性合成。本文所描述的化合物中还可以存在烯烃的许多几何异构体、C＝N双键、N＝N双键等，并且本发明中设想了所有此类稳定的异构体。描述了本发明的化合物的顺式和反式几何异构体，并且可以将其分离为异构体的混合物或单独的异构体形式。在一些实施例中，所述化合物具有(R)-构型。在一些实施例中，所述化合物具有(S)-构型。
本文提供的化合物还包含互变异构形式。互变异构形式是由于单键与相邻双键的交换以及质子的伴随迁移而产生的。互变异构形式包含质子异变互变异构体，所述质子异变互变异构体是具有相同经验式和总电荷的同分异构质子化状态。示例质子异变互变异构体包含酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对和环状形式，其中质子可以占据杂环体系的两个或更多个位置，例如1H-咪唑和3H-咪唑、1H-1,2,4-三唑、2H-1,2,4-三唑和4H-1,2,4-三唑、1H-异吲哚和2H-异吲哚以及1H-吡唑和2H-吡唑。互变异构形式可以处于平衡状态，或通过适当的取代在空间上锁定为一种形式。
如本文所使用的，术语“细胞”旨在指体外、离体或体内细胞。在一些实施例中，体外细胞可以是从有机体(如哺乳动物)切除的组织样品的一部分。在一些实施例中，离体细胞可以是细胞培养物中的细胞。在一些实施例中，体内细胞可以是生活在有机体(如哺乳动物)中的细胞。
如本文所使用的，术语“接触”是指使体外体系或体内体系中的指示部分在一起。例如，消皮素与本发明的化合物的“接触”包含向具有消皮素的个体或患者(如人)施用本发明的化合物，以及例如将本发明的化合物引入到包含含有消皮素的细胞制剂或纯化制剂的样品中。
如本文所使用的，可互换使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”是指任何动物，包含哺乳动物，优选地小鼠、大鼠、其它啮齿动物、家兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长目，并且最优选地人。
如本文所使用的，短语“有效量”或“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医生或其它临床医生正寻找的在组织、系统、动物、个体或人中引发生物学或药物学应答的活性化合物或药物制剂的量。
如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指1)抑制疾病；例如，抑制正在经历或表现出疾病、病状或病症的病理学或症状学的个体的疾病、病状或病症(即阻止病理学和/或症状学上的进一步发展)，或2)缓解疾病；例如，缓解正在经历或表现出疾病、病状或病症的病理学或症状学的个体的疾病、病状或病症(即逆转病理学和/或症状学)。
如本文所使用的，术语疾病、病状或病症的“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指降低一名受试者或一组受试者(例如，倾向于或易患疾病、病状或病症的一名受试者或一组受试者)患有疾病、病状或病症的风险。在一些实施例中，预防疾病、病状或病症是指降低获得疾病、病状或病症和/或其相关症状的可能性。在一些实施例中，预防疾病、病状或病症是指完全或几乎完全阻止疾病、病状或病症的发生。
实例
骨髓细胞和屏障上皮细胞对病原体和危险的胞质感知可组装名为炎症小体的较大复合物，所述炎症小体激活炎性半胱天冬酶，以触发细胞因子成熟和炎性细胞死亡(细胞焦亡)。炎症募集免疫细胞来协调保护性免疫应答，但也可能引起病理学。通过消皮素D(GSDMD)——即炎性半胱天冬酶底物进行的孔隙形成最近被鉴定为负责炎性介体的细胞焦亡和释放的机制。抑制GSDMD是抑制炎症的有吸引力的策略。以下描述的实验结果示出，双硫仑——用于治疗慢性酒精成瘾的药物可以作为通过GSDMD进行的孔隙形成的抑制剂，而GSDM家族的其它成员则不能。双硫仑阻断细胞中的炎症小体介导的细胞焦亡和细胞因子释放并且抑制小鼠的LPS诱导的脓毒性死亡。在纳摩尔浓度下，双硫仑对GSDMD中的人Cys191(小鼠Cys192)进行共价修饰以阻断孔隙形成和细胞焦亡。
一般方法
小鼠.从杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)购得8周龄雌性C57BL/6野生型小鼠并且将其饲养在哈佛医学院(Harvard Medical School)的SPF设施中。所有的小鼠实验均使用经波士顿儿童医院(Boston Children's Hospital)和哈佛医学院的动物护理和使用委员会批准的方案进行。
药物施用和LPS诱导的小鼠脓毒症.通过在指示的时间腹膜内注射在芝麻油或媒剂(对照)中调配的双硫仑(C-23，DSF，50mg/kg)对小鼠进行处理。在图5h中的指示的小鼠组中，在第一次注射DSF前6小时腹膜内施用葡萄糖酸铜(0.15mg/kg)。通过腹膜内注射指示浓度下的LPS(大肠杆菌O111:B4)在C57BL/6小鼠(8-10周龄)中诱导脓毒症。在一些实验中，通过在LPS激发前5小时进行腹膜内注射并且然后在LPS激发(腹膜内15mg/kg)前和恰好前4小时将给定DSF(50mg/kg)腹膜内溶解于芝麻油或媒剂中，用葡萄糖酸铜(0.15mg/kg)或媒剂处理小鼠。在LPS激发之后6小时，通过用含有3％FBS的冰冷PBS冲洗腹膜腔来收集腹膜细胞。为了测量细胞因子，LPS激发后12小时通过尾静脉放血来收集血液样品并且允许血液样品在室温下凝结。通过ELISA对在2,000x g下离心10分钟获得的血清的炎性细胞因子进行分析。
试剂.β-硫基乙醇(2ME)、二硫苏糖醇(DTT)、(三)氯化铽(TbCl3)、吡啶二羧酸(DPA)和葡萄糖酸铜来自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。化合物C-23和其类似物：二硫化四乙基秋兰姆(C-23)、二硫化四甲基秋兰姆(C-23A1)、二硫化四丁基秋兰姆(C-23A3)、4-甲基哌嗪-1-硫代羧二硫代过氧化酸酐(C-23A4)、二硫化四苯基秋兰姆(C-23A5)、N,N'-二甲基-N,N'-(4,4'-二甲基二苯基)二硫化秋兰姆(C-23A6)、二(4-吗啉基)二硫代过氧化酸酐(C-23A7)、N,N'-二甲基-N,N'-二(4-吡啶基)二硫化秋兰姆(C-23A8)、吡咯烷-1-硫代羧二硫代过氧化酸酐(C-23A10)和二硫化二甲基二苯基秋兰姆(C-23A11)来自西格玛奥德里奇公司。二硫化四异丙基秋兰姆(C-23A2)和二硫化二环环亚甲基秋兰姆(C-23A9)来自奥克伍德化学品公司(Oakwood Chemicals)。二硫化四苄基秋兰姆(C-23A12)来自AK科学公司(AK Scientific)。佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸盐(PMA)和DMSO来自西格玛奥德里奇公司。超LPS和尼日利亚菌素来自英维克公司(InvivoGen)。泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk来自BD生物科学公司(BD Bioscience)。全蛋白酶抑制剂混合物和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物来自罗氏公司(Roche)。坏死性磺酰胺、坏死性凋亡抑制素-1、富马酸二甲酯、依鲁替尼和阿法替尼来自西格玛奥德里奇公司。LDC7559由语音研究实验室(Intonation ResearchLabs)合成。
生物分子：根据标准方案，通过用重组人GSDMD对6周龄BALB/c小鼠进行免疫并且用重组人GSDMD-NT增强来在内部产生针对GSDMD的单克隆抗体。收集血清样品以评估反应性抗体的效价，并且使脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。选择杂交瘤，并且通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹法和免疫荧光显微镜检查对来自所产生的克隆的上清液进行筛选。微管蛋白抗体来自西格玛奥德里奇公司。磷酸-IκBα抗体、IκBα抗体、磷酸-NF-κB p65抗体、切割的人半胱天冬酶-1(Asp297)抗体和NLRP3抗体来自细胞信号传导科技公司(CellSignaling Technology)。ASC抗体(AL177)和小鼠半胱天冬酶-1p20抗体来自艾迪珀国际公司(AdipoGen)。人和小鼠IL-1β抗体来自R&D系统公司(R&D Systems)。HMGB1和小鼠GSDMD抗体来自艾博抗(Abcam)。
脂质体渗漏测定：荧光脂质体渗漏测定检测Tb3+从与GSDMD和半胱天冬酶-11一起温育的Tb3+加载脂质体中的渗漏(参见参考文献7和9)。参见图1。当Tb3+与含吡啶二羧酸(DPA)的缓冲液C结合时，通过荧光增大检测到脂质体渗漏。将人GSDMD(0.3μM)分散到含有PC/PE/CL脂质体(50μM脂质体脂质)的孔(康宁公司(Corning)3820)中，并且在向每孔中加入半胱天冬酶-11(0.15μM)之前，将其与测试化合物一起温育1小时。在加入半胱天冬酶-111小时后，在276nm处激发下，使用Perkin Elmer EnVision读板仪测量545nm处孔的荧光强度。最终的抑制百分比计算为[(荧光测试化合物-荧光阴性对照)/(荧光阳性对照-荧光阴性对照)]×100，其中无测试化合物的具有GSDMD的孔被用作阳性对照，并且无半胱天冬酶-11的孔被用作阴性对照。在0.008-50μM的剂量范围内，通过浓度-应答实验确定测试化合物的IC50。
蛋白质表达与纯化：使用NdeI和XhoI限制性位点，用烟草蚀纹病毒(TEV)可切割N端His6-MBP标记将全长人GSDMD序列克隆到pDB.His.MBP载体中。由QuikChangeMutagenesis(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))构建人GSDMD-3C和小鼠GSDMA3-3C突变体。为了表达全长GSDMD、GSDMD-3C、GSDMA3和GSDMA3-3C，当OD600达到0.8时，在用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使携带指示质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在18℃下在补充有50μg ml-1卡那霉素的LB介质中生长过夜。在含25mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM咪唑和5mM 2ME的裂解缓冲液对细胞进行超声处理。通过在4℃下以40,000xg离心1小时澄清裂解物。将含有靶蛋白的上清液与Ni-NTA树脂(凯杰公司(Qiagen))在4℃下一起温育30分钟。温育之后，将树脂-上清液混合物倒入柱中，并且用裂解缓冲液洗涤树脂。使用补充有100mM咪唑的裂解缓冲液对蛋白质进行洗脱。在16℃下，通过TEV蛋白酶消化过夜去除His6-MBP标记。使用HiTrap Q离子交换和Superdex 200凝胶过滤柱(通用医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences))对经过切割的蛋白质进行纯化。
使用EcoRI和XhoI限制性位点，用TEV可切割N端His6标记将半胱天冬酶-11序列克隆到pFastBac-HTa载体中。使用Bac-to-Bac系统(英杰公司(Invitrogen))制备杆状病毒，并且按照制造商的说明，将所述蛋白质在Sf9细胞中表达。His-半胱天冬酶-11杆状病毒(10ml)用于感染1L的Sf9细胞。感染后48小时收集细胞，并且按照与His6-MBP-GSDMD相同的方案对His6-半胱天冬酶-11进行纯化。收集来自Ni-NTA树脂的洗脱液以便进行随后的测定。
脂质体制备：将PC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，含25mg/mL的氯仿；80μL)、PE(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，含25mg/mL的氯仿；128μL)和CL(1',3'-双[1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸]-sn-甘油(钠盐)，含25mg/mL的氯仿；64μL)混合，并且将溶剂在N2气流下蒸发。将脂质混合物悬浮于1mL缓冲液A(20mM HEPES，150mMNaCl，50mM柠檬酸钠和15mM TbCl3)中持续3分钟。使悬浮液推进通过100nm
Figure BDA0002927659400000431
NucleporeTM径迹蚀刻膜30次，以获得均质的脂质体。将过滤后的悬浮液在缓冲液B(20mMHEPES，150mM NaCl)中用尺寸排阻柱(Superose 6，10/300GL)进行纯化，以去除脂质体外的TbCl3。使空隙级分汇集，以产生PC/PE/CL脂质体储备液(1.6mM)。将脂质体用缓冲液C(20mMHEPES，150mM NaCl和50μM DPA)稀释到50μM，以便用于高通量筛选。
荧光蛋白标记和微量热泳结合测定：使用分子探针蛋白标记试剂盒，用AlexaFluor-488标记His6-MBP-GSDMD。使用微量热泳(MST)对抑制剂与GSDMD的结合进行评价。将配体(49nM-150μM)与经过纯化的AlexaFluor-488标记蛋白(80nM)在测定缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，0.05％Tween 20)中一起温育30分钟。将样品加载到NanoTemperMonolith NT.115玻璃毛细管中，并且使用20％LED功率和40％MST功率进行MST。使用质量作用方程和NanoTemper软件计算Kd值。
半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11抑制测定：半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11活性的荧光测定基于7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)从半胱天冬酶底物Ac-YVAD-AMC中的释放。在加入Ac-YVAD-AMC(40μM)以启动反应之前，在384孔板(康宁公司3820)中将化合物(8nM-50μM)与含0.5U的半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-11的测定缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl)一起温育30分钟。在激发/发射波长为350/460nm的情况下，在SpectraMax M5读板仪(美国加利福尼亚州森尼韦尔分子装置公司(Molecular Devices))中监测反应。每2分钟记录每个反应的荧光强度，持续2小时。
细胞活力测定.以每孔4000个细胞的密度接种于96孔板(康宁公司3610)中的THP-1细胞在用100ng/mL LPS致敏之前通过暴露于50nM PMA持续36小时进行分化。在加入20μM尼日利亚菌素或介质作为对照之前，用每种测试化合物预处理致敏的THP-1细胞持续1小时。1.5小时后通过CellTiter-Glo测定确定存活细胞的数目。最终的细胞活力百分比使用式[(发光测试化合物-发光阴性对照)/(发光阳性对照-发光阴性对照)]×100计算，其中仅用LPS处理的孔用作阳性对照，并且用LPS和尼日利亚菌素处理的孔用作阴性对照。在0.39-50μM的剂量范围内，通过浓度-应答实验确定细胞活力测定中的每种测试化合物的IC50。
质谱分析和样品制备.将凝胶带切成1mm大小的片，并且置于单独的1.5mL聚丙烯管中。向每个管中加入含100μl 50％乙腈的50mM碳酸氢铵缓冲液，并且然后将样品在室温下温育20分钟。必要时重复此步骤以使凝胶脱色。然后，在用50mM碳酸氢铵、水和乙腈顺序洗涤凝胶之前，在室温下将凝胶切片与55mM碘乙酰胺(在50mM碳酸氢铵中)在黑暗中一起温育45分钟。然后将样品在Speedvac中干燥20分钟。向每个样品管中加入胰蛋白酶(普洛麦格公司(Promega Corp.))(含10ng/μL的25mM碳酸氢铵，pH 8.0)以恰好覆盖凝胶，并且然后将样品在37℃下温育6小时或过夜。
消化之后，用0.1％甲酸(FA)酸化样品，并且注射3μl胰蛋白酶肽溶液。在赛默科技轨道阱融合系统(Thermo Scientific Orbitrap Fusion system)上执行纳米LC/MS/MS，所述赛默科技轨道阱融合系统与Dionex Ultimat 3000纳米HPLC和具有40孔标准托盘的自动取样器联接。。将样品注射到阱柱(300μm i.d.×5mm，C18 PepMap 100)上，并且然后注射到C18反相纳米LC柱(Acclaim PepMap 100 75μm×25cm)上，加热到50℃。使用流动相A(99.9％水，0.1％FA)和流动相B(99.9％乙腈，0.1％FA)将流速设置为400标准升/分钟，其中LC梯度为60分钟。通过带电荷的发射器尖端(PicoTip发射器，新目标公司(NewObjective)，10+/-1μm)将洗脱肽喷射到质谱仪中。参数为：尖端电压，+2.2kV；MS获取前体离子的傅里叶变换质谱(FTMS)模式(分辨率120,000)；3秒内以最高速度通过高能碰撞离解(HCD)进行随后MS/MS的离子阱质谱(ITMS)模式。
Proteome Discoverer软件1.4用于蛋白质鉴定和修饰分析。UniPort人数据库用于分析原始数据。其它参数包含以下：选择酶作为胰蛋白酶；最大漏切率＝2；动态修饰为半胱氨酸上的脲甲基半胱氨酸(对照)、二乙基二硫代氨基甲酸酯(来自C-23)和Bay11-7082；氧化甲硫氨酸、脱氨基天冬酰胺和谷氨酰胺；前体耐受性设置为10ppm；MS/MS片段耐受性设置为0.6Da；以及考虑到+2到+4带电荷的肽。对于显著匹配，肽错误发现率(FDR)设置为小于1％。
细胞系和处理：使THP-1细胞和HEK293T细胞(从ATCC获得)在具有10％热灭活胎牛血清、补充有100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、6mM HEPES、1.6mM谷氨酰胺和50μM2ME的RPMI中生长。C57BL/6小鼠iBMDM细胞由J.Kagan(波士顿儿童医院(Boston Children's Hospital))提供，并且在具有相同补充剂的DMEM中培养。细胞被证实没有支原体污染。根据制造商说明，使用Lipofectamine 2000(英杰公司)执行HEK293T细胞的瞬时转染。使用Amaxa Nucleofector试剂盒(VPA-1009)通过核转染来转染iBMDM细胞。通常，THP-1细胞首先通过与50nM PMA一起温育36小时进行分化，并且然后在用尼日利亚菌素(20μM)处理之前，用LPS(1μg/ml)致敏持续4小时。为了检查IκBα磷酸化和降解以及IL-1β诱导，用LPS(1μg/ml)对PMA分化的THP-1细胞进行刺激分别持续0.5小时、1小时和4小时。对于非典型炎症小体激活，用1μg超LPS对100万个iBMDM细胞进行电穿孔。
细胞毒性和细胞活力测定：根据制造商的说明，分别通过使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(普洛麦格公司)进行的乳酸脱氢酶释放测定和通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(普洛麦格公司)测量ATP水平来确定细胞死亡和细胞活力。在BioTek Synergy 2读板仪上测量发光和吸光度。
纳米盘上的孔隙重构和阴性染色电子显微镜检查：将膜支架蛋白NW50的编码序列克隆到pET-28a载体中，并且所述蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，通过重折叠程序纯化并且根据先前描述的方案与分选酶共价环化。将含有磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰胆碱(PC)(摩尔比3:7)的脂质混合物溶解于60mM胆酸钠中，并且与环化的NW50在冰上一起温育1小时，以组装纳米盘。然后，胆酸钠通过在4℃下与Bio-beads SM-2(伯乐公司(Bio-Rad))一起温育过夜来被去除。然后，使用0.22μm过滤器去除Bio-beads，并且使用通过缓冲液D(pH为8.0的50mM Tris-HCl，150mM NaCl)平衡的Superose 6 10/300凝胶过滤柱(通用医疗生命科学公司)进一步纯化经过组装的纳米盘，以去除多余脂质。为了在纳米盘上形成GSDMD孔隙，在存在纳米盘的情况下，将经过纯化的人GSDMD-3C与3C蛋白酶在冰上一起温育6小时。通过用缓冲液D平衡的Superose 6柱进一步纯化孔隙。为了评估C-23的作用，在加入纳米盘(预处理)之前，将人GSDMD-3C加3C蛋白酶与C-23(摩尔比1:1)在冰上一起温育30分钟，或者在冰上将C-23加入已经组装的孔隙(处理后)持续30分钟。对于阴性染色电子显微镜检查，将5μl样品放置到辉光放电的碳包覆铜载网上(电子显微镜科学公司(ElectronMicroscopy Sciences))，用缓冲液A洗涤两次，用1％甲酸铀酰染色1分钟，并且风干。所述网在Tecnai G2 Spirit BioTWIN电子显微镜上成像，并且用AMT 2k CCD相机(哈佛医学院电子显微镜设施(Harvard Medical School Electron Microscopy Facility))记录。
免疫印迹分析：使用补充有全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(罗氏公司)的RIPA缓冲液(pH为7.4的50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mMEDTA，1％Triton X-100，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸盐)制备细胞提取物。使样品经受SDS-PAGE，并且然后将经过解析的蛋白质转移到PVDF膜(密理博(Millipore))。用指示的抗体探测免疫印迹，并且使用SuperSignal West Pico化学发光ECL试剂盒(皮尔斯(Pierce))进行可视化。
细胞中的半胱天冬酶-1活性测定：为了测量半胱天冬酶-1激活，将THP-1细胞接种到96孔板中并且用PMA分化。在指示的处理之后，将细胞与荧光活性半胱天冬酶-1底物FAM-YVAD-FMK(免疫化学技术公司(Immunochemistry Technologies))一起温育。在BioTekSynergy 2读板仪上对样品进行读取。
细胞因子的测量：根据制造商的说明，通过ELISA试剂盒(R&D系统公司)测量培养上清液或小鼠血清中的IL-1β的浓度。
免疫染色和共聚焦显微镜：将生长在盖玻片上的细胞用含4％多聚甲醛的PBS固定15分钟，使其在含0.1％Triton X-100的PBS中透化5分钟并且使用5％BSA阻断持续1小时。然后，将细胞用指示的初级抗体染色，随后将其与荧光缀合的次级抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司(Jackson ImmunoResearch))一起温育。用DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)(西格玛奥德里奇公司)对细胞核进行复染。使用Aqua-Poly/Mount(达科公司(Dako))封固载玻片。使用带有63倍水浸物镜和奥林巴斯(Olympus)Fluoview软件(奥林巴斯)的激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯Fluoview FV1000共聚焦系统)捕获图像。所有共聚焦图像表示三个独立实验。
统计：斯图登氏t检验用于两个独立处理的统计分析。使用Mantel-Cox对数秩检验分析小鼠存活曲线和统计。
实例1-通过测试化合物抑制GSDMD孔隙形成
C-23是被称为双硫仑——用于治疗酒精成瘾的药物(参见参考文献12)的对称分子：
Figure BDA0002927659400000471
表1中呈现了测试化合物的IC50值和GSDMD结合结果(通过微量热泳(MST)进行评估)。图11中示出了被测化合物的化学结构。
表1
化合物 体外IC<sub>50</sub>(μM) 通过MST的结合K<sub>D</sub>(μM)
C-5 1.1±0.4
C-7 1.9±0.1
C-8 2.4±0.3
C-22 1.6±0.3 27.9±5.5
C-23 0.3±0.0 12.8±1.9
C-24 0.6±0.1 8.6±0.6
C-25 1.8±0.6
通过微量热泳(MST)评估测试化合物的GSDMD结合。图3示出了Alexa 488标记的His-MBP-GSDMD(80nM)与C-22、C-23或C-24结合的MST测量结果。
为了评价测试化合物是否抑制细胞焦亡，将测试化合物加入PMA分化的且LPS致敏的人THP-1细胞或小鼠永生化的骨髓源性巨噬细胞(iBMDM)中，之后用尼日利亚菌素激活典型炎症小体或通过LPS电穿孔激活非典型炎症小体。如以下段落中论述的，C-23阻断细胞中的细胞焦亡，其中针对典型和非典型炎症小体依赖性细胞焦亡的IC50值分别为7.67±0.29μM和10.33±0.50μM，并且减少由用poly(dA:dT)转染的小鼠iBMDM中的AIM2炎症小体触发的细胞死亡(参见图10)。双硫仑抑制尼日利亚菌素或LPS转染诱导的IL-1β分泌的潜能也与泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk相当。
实验结果：图2中示出了脂质体渗漏测定中的化合物双硫仑(C-23)的应答曲线。在图4、6和8中，用指示浓度的每种化合物预处理PMA分化的、LPS致敏的人THP-1持续1小时，之后加入尼日利亚菌素或介质。通过CellTiter-Glo测定(图4和6)确定存活细胞的数目，并且在2小时之后通过ELISA(图8)对培养上清液中的IL-1β进行评估。在图5、7和9中，用每种测试化合物预处理小鼠iBMDM持续1小时，之后用PBS或LPS进行电穿孔。通过CellTiter-Glo测定(图5和7)确定存活细胞的数目，并且在2.5小时之后通过ELISA(图9)对培养上清液中的IL-1β进行评估。在图8和9中，加入40μM浓度的测试化合物。在图10中，不对小鼠iBMDM进行预处理或用30μM的C-23预处理小鼠iBMDM持续1小时，之后用PBS或poly(dA:dT)转染，并且在4小时后通过CellTiter-Glo测定分析其细胞活力。图示出了平均值±s.d，并且所示数据表示三个独立实验。**P<0.01。
为了证实C-23抑制孔隙形成，在用磷脂酰丝氨酸(PS)、酸性脂质和磷脂酰胆碱构建的共价环化脂质纳米盘上重构人GSDMD-NT孔隙。如前所述，全长GSDMD被工程化为用鼻病毒3C蛋白酶切割位点替换半胱天冬酶切割位点(GSDMD-3C)。工程化的GSDMD-3C的3C蛋白酶切割使活性NT片段释放。将GSDMD-3C加3C蛋白酶加入经过组装的纳米盘重构了孔隙，所述孔隙通过阴性染色电子显微镜检查(EM)可见。在加入纳米盘之前用C-23预处理时，通过GSDMD-3C加3C蛋白酶进行的孔隙形成被完全阻断。然而，在孔隙形成之后加入C-23不会破坏已经组装的孔隙。因此，双硫仑抑制孔隙形成，但不会分解已经形成的孔隙。
为了评价C-22、C-23和C-24是否抑制细胞焦亡，在用尼日利亚菌素激活典型NLRP3炎症小体之前，将这些化合物加入PMA分化的且LPS致敏的人THP-1细胞，或者在通过LPS电穿孔(参见附图)激活非典型炎症小体之前，将这些化合物加入小鼠永生化的骨髓源性巨噬细胞(iBMDM)。仅C-23阻断细胞焦亡，其中针对典型人和非典型小鼠炎症小体依赖性细胞焦亡的IC50值类似，分别为7.7±0.3μM和10.3±0.5μM。其还以剂量依赖性方式减少由用poly(dA:dT)转染的小鼠iBMDM中的AIM2炎症小体触发的细胞死亡，从而支持其对炎症小体通路的常见下游部分的抑制。抑制通过细胞存活率和膜透化示出，所述细胞存活率通过CellTiter-Glo ATP发光进行评估，所述膜透化通过不透膜的染料SYTOX Green的摄取进行评估。另外，双硫仑抑制THP-1中的尼日利亚菌素诱导的IL-1β分泌和iBMDM细胞中的LPS转染诱导的IL-1β分泌的潜能也与泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk相当。相比之下，双硫仑对在通过用TNFα、SMAC模拟物和z-VAD-fmk处理的HT-29细胞中诱导的坏死性凋亡没有影响，所述坏死性凋亡通过坏死性磺酰胺(NSA)或坏死性凋亡抑制素-1(Nec)阻断。这些数据示出，双硫仑抑制由典型和非典型炎症小体触发的人和小鼠细胞两者中的细胞焦亡，但对坏死性凋亡没有抑制作用。
实例2-双硫仑防止LPS诱导的脓毒症
双硫仑正在作为抗癌药物进行研究，因为流行病学研究示出因酒精成瘾服用双硫仑的个体死于癌症的可能性更小(参见参考文献24)。在细胞中，双硫仑会迅速代谢成二乙基二硫代氨基甲酸酯(DTC)(参见参考文献25和26)：
Figure BDA0002927659400000481
通过与铜的复合(参见参考文献24)很大程度上增强体内DTC的抗癌活性，可能是由于DTC硫醇的增强的亲电性。在脂质体渗漏测定中，发现葡萄糖酸铜(Cu2+)仅微弱地增加双硫仑或DTC抑制。这可能是由于所涉及的GSDMD Cys残基的高反应性(参见以下实例)。然而，Cu2+强有力地提升了双硫仑或DTC保护LPS致敏的THP-1细胞免于细胞焦亡的能力(图13)。在存在Cu2+的情况下，用于抑制细胞焦亡的C-23的IC50减小24倍到0.41±0.02μM，这与其预防脂质体渗漏的潜能类似。在存在Cu2+的情况下，DTC在细胞中的活性几乎与C-23一样。
因为C-23抑制细胞中的细胞焦亡和IL-1β释放，所以还对其保护C57BL/6小鼠免于LPS诱导的脓毒症的能力进行了测试。在用LPS激发之前，用媒剂或双硫仑腹膜内处理小鼠。而最低浓度的LPS(15mg/kg)在96小时后杀死8只对照小鼠中的3只，所有双硫仑处理的小鼠均存活(P<0.05)(图14)。当所有小鼠均存活时，在LPS激发后12小时，血清IL-1β浓度显著降低(在双硫仑预处理的小鼠中为281±149ng/mL，在对照小鼠中为910±140ng/mL(P<0.0001)(图15)。在中间浓度(25mg/kg)下进行LPS激发之后，所有对照小鼠在72小时内死亡，但双硫仑处理的8只小鼠中的5只存活(P<0.01)(图16)。在最高LPS激发(50mg/kg)时，尽管所有对照小鼠在一天内死亡，但是通过双硫仑处理显著延迟了死亡，并且8只小鼠中的1只存活(P<0.0001)(图17)。为了确定处理是否可以延迟到LPS激发之后并且加入铜是否可以改进保护，通过腹腔内25mg/kg LPS对小鼠进行激发，并且在存在或不存在葡萄糖酸铜的情况下立即和24小时之后施用C-23。LPS后的处理仍提高存活率(在不存在铜的情况下，P＝0.041，并且在存在铜的情况下，P＝0.024)。所有的对照小鼠和在不存在铜的情况下处理的小鼠死亡，但给予铜复合的双硫仑的8只小鼠中有2只存活(图18)。因此，在LPS之前或之后给予双硫仑部分地保护小鼠免于脓毒性死亡并且减少IL-1β分泌。
实验结果：图12示出了在存在或不存在Cu(II)的情况下通过C-23或其代谢物DTC抑制脂质体渗漏的剂量应答曲线。在图13中，在存在或不存在Cu(II)的情况下，用C-23或DTC预处理LPS致敏的THP-1持续1小时，之后加入尼日利亚菌素或介质持续2小时。通过CytoTox96测定确定细胞死亡。在图14-17中，在腹膜内LPS激发(图14和15：15mg/kg；图16：25mg/kg；图17：50mg/kg)之前24小时和4小时通过腹膜内注射用C-23(50mg/kg)或媒剂(对照)对小鼠进行预处理，并且进行存活率随访。使用对数秩检验执行统计分析(在图14、16、17中，小鼠/组)。在图15中，如上所述在用C-23预处理并且用15mg/kg LPS激发的小鼠(n＝5/组)中通过ELISA测量血清IL-1β。获得了LPS激发后12小时的血清。所示为平均值±s.d.。在图18中，在腹膜内LPS激发(25mg/kg)后0小时和12小时通过腹膜内注射用C-23(50mg/kg)、C-23(50mg/kg)加葡萄糖酸铜(0.15mg/kg)或媒剂(对照)对小鼠进行处理。使用对数秩检验执行统计分析(8只小鼠/组)。
在细胞中，Cu(II)有力地提升了双硫仑或DTC保护LPS致敏的THP-1细胞免于细胞焦亡的能力，推测是因为Cu(II)提升了主要细胞代谢物DTC的活性。在存在Cu(II)的情况下，用于抑制细胞焦亡的双硫仑的IC50减小24倍到0.41±0.02μM，这与其预防脂质体渗漏的潜能类似。在存在Cu(II)的情况下，DTC在细胞中的活性几乎与双硫仑一样。双硫仑(当其主要细胞代谢物稳定时)抑制脂质体中的GSDMD孔隙形成和细胞中的细胞焦亡的类似潜能支持GSDMD作为双硫仑作用机制的主要靶标。
实例3-双硫仑共价修饰GSDMD Cys191
已示出，双硫仑通过共价修饰使反应性Cys残基失活(参见参考文献27)。为了探测通过双硫仑对GSDMD抑制的机制，使用纳米液相色谱-串联质谱(纳米-LC-MS/MS)对双硫仑处理的人GSDMD进行分析。胰蛋白酶片段指示Cys191的二硫代二乙基氨基甲酰加合物，其中一半的对称性双硫仑分子连接到硫醇(图20、21、27和28)。事实上，细胞中的GSDMD孔隙形成需要Cys191，因为小鼠GSDMD中的对应Cys192的Ala突变阻断了低聚化(参见参考文献8)。在GSDMD中保守但在其它GSDM家族成员中不保守的此Cys残基可在基于小鼠GSDMA3结构产生的全长自抑制结构模型和N端孔隙形成模型两者中获得(参考文献7和14)(图22和29)。与GSDMA3的Leu183相对应的是，Cys191位于β7-β8发夹内的β8链起始处的跨膜区域的远端处，其是形成孔隙的β桶内的关键元素(参考文献14)。使用PROPKA(参考文献28)进行的对Cys反应性的分析表明，Cys191在GSDMD中的所有Cys残基中反应性最高。与其高反应性一致的是，时间进程分析示出双硫仑在2分钟的温育内抑制脂质体渗漏(图30)。为了证实双硫仑作用于Cys191，产生了Cys191和作为对照的Cys38的Ala突变。而在脂质体渗漏测定中，WT和C38A的双硫仑IC50值都为约0.3μM，C191A的IC50高出约8倍(图23)。在评估双硫仑是否保护THP-1细胞免于尼日利亚菌素介导的细胞焦亡之前，还将双硫仑与N-乙酰半胱氨酸(NAC)一起温育，所述NAC含有可以使Cys反应性药物失活的反应性Cys。正如预期的，NAC消除了双硫仑的活性(图24)。这些数据一起表明，双硫仑通过选择性地且共价地修饰Cys191来抑制GSDMD孔隙形成。
实验结果：图20和21示出了通过脲甲基半胱氨酸对Cys191进行修饰(增加57.0214Da)的含有Cys191的人GSDMD肽FSLPGATCLQGEGQGHLSQK(aa 184-103；2057.00Da)的MS/MS谱[LC保留时间，22.85分钟；观察到三重峰带电荷的前体离子m/z 705.6827(质量：2114.0481Da；δM 2.27ppm)](a)或在GSDMD与C-23(双硫仑)一起温育之后通过C-23的二乙基二硫代氨基甲酸酯部分对Cys191进行修饰(增加147.0255Da)的对应GSDMD肽的MS/MS谱。[LC保留时间。28.93分钟；观察到三重峰带电荷的前体离子m/z 735.6802(质量：2204.0406Da；δM 0.53ppm)。](b)。图22示出了呈其自抑制形式的全长人GSDMD和基于GSDMA3(参考文献7和14)的对应结构的GSDMD N端片段(GSDMD-NT)的孔隙形式的模型，其示出了由化合物C-23修饰的Cys191的位置。青色为GSDMD-NT；灰色为GSDMD-CT。图23示出了C-23抑制由野生型、C38A或C191A GSDMD(0.3μM)加半胱天冬酶-11(0.15μM)诱导的脂质体渗漏的剂量应答曲线。图24示出了在C-23与N-乙酰半胱氨酸(NAC，500μM)或介质一起预温育1小时后C-23抑制LPS+尼日利亚菌素处理的THP-1细胞的细胞焦亡。使用范围为5到40μM的C-23的2倍稀释液。图示出了平均值±s.d，并且所示数据表示三个独立实验。**P<0.01。图25和26示出了化合物C-23在由人GSDMD-3C(0.3μM)加3C蛋白酶(0.15μM)(图25)或小鼠GSDMA3-3C(0.3μM)加3C蛋白酶(0.15μM)(图26)诱导的脂质体渗漏中的剂量应答曲线。
图27和28示出了人GSDMD中的含有Cys191的肽的MS/MS谱。图27示出了通过脲甲基半胱氨酸对半胱氨酸进行修饰的肽FSLPGATCLQGEGQGHLSQK的MS/MS谱。蛋白质覆盖率为73％。图28示出了通过C-23对半胱氨酸进行修饰的肽FSLPGATCLQGEGQGHLSQK的MS/MS谱。蛋白质覆盖率为72％。
图29和30示出双硫仑对GSDMD Cys191进行共价修饰。在图29中，小鼠GSDMA3、人GSDMA(hGSDMA)、小鼠GSDMD(mGSDMD)和人GSDMD(hGSDMD)的序列比对示出了Cys残基。在图30中，在加入含半胱天冬酶-11(0.15μM)的脂质体(50μM)之前，将GSDMD(0.3μM)与指示浓度的C-23(0-50μM)一起预温育持续不同持续时间(2-90分钟)。
为了证实双硫仑作用于Cys191，对于用WT、C38A对照或C191A人GSDMD加半胱天冬酶-11处理的脂质体中的孔隙形成，对双硫仑IC50值进行比较。作用于C191A GSDMD的双硫仑的IC50高于作用于WT GSDMD的IC50的约8倍，而对C38A的活性类似于WT GSDMD，从而证实Cys191对双硫仑活性的重要性。Cys191突变体的残基抑制可能是由于突变体GSDMD中的其它Cys残基的双硫仑修饰引起的。为了证实Cys191在孔隙形成中的重要性，通过HEK293T细胞中的LDH释放测量细胞死亡，所述HEK293T细胞在存在或不存在半胱天冬酶-11的情况下异位表达全长人WT或C191S突变体GSDMD。虽然单独WT或C191S GSDMD不会损害细胞存活率，但WT GSDMD和半胱天冬酶-11一起会导致大量细胞死亡，而C191S GSDMD和半胱天冬酶-11的细胞死亡降低。类似地，由小鼠GSDMD-NT(mGSDMD-NT)的异位表达引起的细胞死亡在表达类似C192S突变体的HEK293T细胞中显著减少，但在表达C39A mGSDMD-NT的细胞中仅适度减少。与先前的结果一致，这些结果证实了Cys191和Cys192分别在人和小鼠中的GSDMD-NT孔隙形成中的作用。
为了进一步证实双硫仑作用于Cys191，对表达半胱天冬酶-11和WT或C191S GSDMD的HEK293T细胞中的LDH释放的双硫仑抑制进行评估。正如预期的，从被测的最低浓度(10μM)开始，双硫仑以剂量依赖性方式强烈抑制WT GSDMD诱导的细胞死亡，但当加入4倍的双硫仑时，仅由半胱天冬酶-11和C191S GSDMD的表达引起的减少的细胞死亡受到抑制。这些数据一起指示，双硫仑通过共价修饰Cys191来抑制GSDMD孔隙形成。另外，数据表明，双硫仑主要通过其对GSDMD-NT孔隙形成的作用抑制细胞死亡，因为如果双硫仑对半胱天冬酶-11有强烈的抑制作用，那么其将更好地防止表达半胱天冬酶-11和C191S GSDMD的细胞死亡。
实例4-双硫仑(C-23)抑制半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11
已报告，双硫仑通过与负责蛋白水解的催化Cys结合来抑制半胱天冬酶(参见参考文献29)。因此，双硫仑可能抑制半胱天冬酶和GSDMD两者。使用测量来自底物Ac-YVAD-AMC的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的释放的荧光半胱天冬酶活性测定，发现双硫仑事实上抑制半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11，其中IC50分别为0.15±0.04μM和0.73±0.07μM(图31-38)。加入Cu(II)并不在体外强烈改变双硫仑半胱天冬酶抑制。为了确定通过双硫仑进行的半胱天冬酶-11抑制相对于GSDMD抑制在孔隙形成方面的相对贡献，用鼻病毒3C蛋白酶位点(GSDMD-3C)替换GSDMD中的半胱天冬酶切割位点，并且在脂质体渗漏测定中，使用3C蛋白酶代替半胱天冬酶-11。所产生的IC50为0.52±0.03μM，其与半胱天冬酶-11触发的脂质体渗漏的0.30±0.01μM相当(图2和25)。相比之下，由于小鼠GSDMA3缺乏保守Cys191，双硫仑抑制由含有3C蛋白酶位点(GSDMA3-3C)的3C切割的GSDMA3触发的脂质体渗漏的IC50较弱，为12.14±2.10μM(图26)。因此，脂质体渗漏测定中的双硫仑的抑制作用由GSDMD的直接抑制介导。
实验结果：图31和32示出了在存在指示浓度的化合物C-23的情况下半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11活性的时间进程。将半胱天冬酶(0.5U)与化合物C-23一起温育(在加入Ac-YVAD-AMC(40μM)之前在指示浓度下持续1小时)。图33和34示出了半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11活性测定中的化合物C-23的剂量应答曲线。图35和36示出了在存在指示浓度的化合物C-23+Cu(II)的情况下半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11活性的时间进程。将半胱天冬酶(0.5U)与化合物C-23+Cu(II)一起温育(在加入Ac-YVAD-AMC(40μM)之前在指示浓度下持续1小时)。图37和38示出了半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11活性测定中的化合物C-23+Cu(II)的剂量应答曲线。测量在350nm处激发之后在460nm处的荧光强度。
实例5-测试化合物抑制GSDMD孔隙形成
图40-42中示出了在脂质体渗漏测定中图39所示的测试化合物的IC50值。数据示出，测试化合物防止THP-1中的尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡。表2中示出了渗漏测定的结果。图39中示出了表2所列的化合物的化学结构。
表2
化合物 IC<sub>50</sub>(μM)
C-23 0.30±0.01
C-23A1 0.22±0.01
C-23A2 0.37±0.01
C-23A3 0.46±0.08
C-23A4 0.26±0.01
C-23A5 3.74±1.06
C-23A6 0.35±0.03
C-23A7 0.25±0.01
C-23A8 1.25±0.01
C-23A9 0.26±0.003
C-23A10 0.26±0.02
C-23A11 0.37±0.01
C-23A12 2.93±1.07
实验结果：在图40中，用指示的化合物(40μM)处理PMA分化的、LPS致敏的THP-1细胞持续3小时，并且通过CellTiter-Glo测定测试其活力。在图41中，在用或不用尼日利亚菌素处理之前，用40μM双硫仑或指示的测试化合物或z-VAD-fmk预处理PMA分化的、LPS致敏的THP-1细胞持续1小时，并且在加入尼日利亚菌素之后2小时通过CellTiter-Glo测定来评估细胞的细胞活力。在图42中，在加入尼日利亚菌素之前，用40μM双硫仑或z-VAD-fmk或用指示测试化合物的2倍连续稀释液(浓度范围，0.39-50μM)预处理PMA分化的、LPS致敏的THP-1细胞持续1小时，并且在加入尼日利亚菌素之后2小时通过CellTiter-Glo来评估细胞的细胞活力。图示出了平均值±s.d，并且所示数据表示三个独立实验。**P<0.01。被测化合物对THP-1细胞均没有毒性(参见附图)。被测化合物还显著防止THP-1细胞中的尼日利亚菌素诱导的细胞焦亡。
实例6a-双硫仑和Bay 11-7082抑制炎症小体激活级联中的多个步骤
发现泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk(CAS注册号：187389-52-2)：
Figure BDA0002927659400000541
抑制THP-1细胞中的典型炎症小体通路。
还发现Bay 11-7082(CAS注册号：19542-67-7)：
Figure BDA0002927659400000542
NF-κB激活的先前已知的抑制剂(参考文献13)和NLRP3通路(参考文献30)(图43)也抑制THP-1细胞中的典型炎症小体通路。如以下论述的，Bay 11-7082抑制例如GSDMD、半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11。
根据MST，Bay 11-7082与GSDMD结合(参见图55和56以及图2)。Bay 11-7082抑制半胱天冬酶-1，并且在较小程度上扩展半胱天冬酶-11(参见图55-58)。令人惊讶的是，与双硫仑一样，Bay 11-7082通过使反应性Cys残基失活发挥作用(参见参考文献31和32)，并且GSDMD中的Cys191被Bay 11-7082共价修饰(参见图59和60)。通过在脂质体渗漏测定中用C191A GSDMD取代WT GSDMD，Bay 11-7082对脂质体渗漏的抑制降低了2倍(图55)。Bay 11-7082对脂质体渗漏的大量抑制可以归因于半胱天冬酶-11抑制，因为Bay 11-7082对由GSDMD-3C加3C蛋白酶引起的渗漏的抑制比由GSDMD加半胱天冬酶-11及其对小鼠GSDMA3-3C的活性引起的渗漏的抑制少，前者缺乏相当的反应性半胱氨酸，加之3C蛋白酶类似于其对GSDMD-3C的活性(参见图61和62)。
Bay 11-7082抑制由THP-1细胞中的典型和非典型炎症小体两者触发的细胞焦亡，但在尼日利亚菌素处理的细胞中比在LPS转染的细胞中的活性强(图43和44)。在抑制典型炎症小体依赖性细胞焦亡方面，Bay 11-7082比在不存在铜的情况下的双硫仑更有效，并且这两种药物一起具有附加保护作用，即使在被测的最高浓度下具有细胞毒性(图43)。在抑制由非典型炎症小体激活诱导的细胞焦亡方面，Bay 11-7082的活性不如双硫仑(图44)。
因为双硫仑和Bay 11-7082两者都非特异性地修饰反应性Cys，所以接下来分析两者对导致细胞焦亡和炎性半胱天冬酶激活的步骤的作用。参与典型炎症小体通路的基因中的一些基因未在未经刺激的细胞中表达，并且其表达需要诱导，诱导方法通常是在被称为致敏的过程中通过与病原体和危险相关的分子模式的细胞表面传感器(如Toll样受体(TLR))结合。已知Bay 11-7082抑制NF-κB激活——致敏中的关键转录因子。首先检查双硫仑和Bay 11-7082对致敏的作用(图45)。通过检查IκBα磷酸化和降解以及RelA(p65)磷酸化来评估NF-κB激活。通过促IL1β蛋白的免疫印迹来评估促IL-1β的诱导。在不存在双硫仑或Bay 11-7082的情况下，首先在加入LPS之后30分钟检测p65的磷酸化，并且所述磷酸化持续4小时，在加入LPS之后1小时检测磷酸化和减少的IκBα，并且在加入LPS之后4小时检测增加的促IL-1β。以30μM浓度加入的两种被测化合物均抑制NF-κB激活，但Bay 11-7082具有更强作用；两者均阻断促IL-1β诱导。因此，双硫仑和Bay 11-7082两者均抑制致敏。
尼日利亚菌素使用被称为细胞凋亡相关的斑点样蛋白(含有半胱天冬酶募集结构域(ASC))的适配体激活NLRP3典型炎症小体的组装，所述适配体可以在免疫荧光显微镜检查中可视化为斑点。当在不存在抑制剂的情况下用尼日利亚菌素处理LPS致敏的THP-1细胞时，在30％的细胞中检测到ASC斑点(图36)。正如预期的，z-VAD-fmk不抑制斑点形成，因为半胱天冬酶激活发生在炎症小体组装的下游。然而，在致敏之后但在尼日利亚菌素之前一小时加入的两种测试化合物抑制ASC斑点形成，但不完全抑制，并且在以相同浓度使用时，Bay 11-7082比双硫仑更有效。1μM双硫仑在阻断由尼日利亚菌素或转染的LPS(图6和7)触发的细胞焦亡方面完全无活性，但与葡萄糖酸铜组合的相同浓度的双硫仑完全阻断细胞焦亡并且还减少ASC点纹(图48和49)。
为了评估NLRP3介导的炎症中的哪些步骤在ASC斑点形成后被抑制，在加入尼日利亚菌素之前1小时用媒剂或30μM z-VAD-fmk、双硫仑或Bay 11-7082处理LPS致敏的THP-1细胞，并且在30分钟后通过全细胞裂解物的免疫印迹对半胱天冬酶-1、GSDMD和促IL-1β的切割和激活进行分析(图50)。还通过培养上清液的免疫印迹对加工后的IL-1β的分泌进行评估。在不存在抑制剂的情况下清晰地检测到半胱天冬酶-1、GSDMD和促IL-1β对其活性形式的切割，但在通过3种抑制剂中的任一种处理的细胞中极大地降低；此外，在不存在任何抑制剂的情况下，仅在培养上清液中检测到加工后的IL-1β。当通过用含仅1μM双硫仑的PBS或葡萄糖酸铜处理细胞来重复相同的实验时，与铜复合的双硫仑完全阻断半胱天冬酶-1、GSDMD和促IL-1β加工和IL-1β分泌，但不具有铜的双硫仑没有作用(图51)。由于免疫印迹不是定量的，还使用含荧光底物的完整细胞评估在加入尼日利亚菌素后30分钟的半胱天冬酶-1活性。虽然半胱天冬酶-1活性完全被z-VAD-fmk抑制，但双硫仑和Bay 11-7082仅部分地降低了其活性，Bay 11-7082的作用再一次强于双硫仑(图52)。接下来，使用产生的识别未切割的GSDMD和其孔隙形式两者的单克隆抗体，通过免疫荧光显微镜检查评估z-VAD-fmk、双硫仑和Bay 11-7082对LPS+尼日利亚菌素诱导的GSDMD孔隙形成的作用(图53、54和64-66)。在不存在任何抑制剂的情况下，GSDMD抗体对LPS加尼日利亚菌素处理的细胞的细胞质和质膜两者进行染色，这形成了特性焦亡性气泡(参见参考文献10)。所有3种抑制剂完全阻断GSDMD膜染色和焦亡性气泡的出现。因此，双硫仑和Bay 11-7082抑制引起典型炎症小体诱导的细胞焦亡和炎性细胞因子释放的多个步骤，包含致敏、炎症小体组装、炎性半胱天冬酶激活、促炎性细胞因子加工和GSDMD孔隙形成。
实验结果：在图43中，在用尼日利亚菌素处理之前，用C-23和/或Bay 11-7082的2倍连续稀释液(范围为0.3125到40μM)预处理PMA分化的、LPS致敏的THP-1细胞持续1小时。通过CytoTox96测定确定细胞死亡。在图44中，用C-23或Bay 11-7082(范围为0.3125到40μM)的2倍连续稀释液预处理小鼠iBMDM持续1小时，之后用PBS或LPS进行电穿孔之。通过CytoTox96测定确定细胞死亡。在图45中，在加入LPS之前，用30μM C-23或Bay 11-7082预处理THP-1细胞持续1小时。所示为0.5小时后采集的全细胞裂解物的免疫印迹。在图46、47、50和52中，在加入尼日利亚菌素或介质之前，用30μM C-23、Bay 11-7082或z-VAD-fmk预处理LPS致敏的THP-1持续1小时。20分钟后分析ASC斑点(箭头)的代表性图像和带有ASC斑点的细胞的平均值±s.d.百分比(图47)。在加入尼日利亚菌素后30分钟采集全细胞裂解物(WCL)和培养上清液(Sup)，并且用指示的抗体进行免疫印迹(图50)。在加入尼日利亚菌素之后30分钟使用可渗透细胞的荧光染料FAM-YVAD-FMK测定半胱天冬酶-1活性(图52)。在图48、49和51中，在加入尼日利亚菌素或介质之前，在存在或不存在Cu(II)的情况下，用1μMC-23预处理LPS致敏的THP-1持续1小时。20分钟后分析ASC斑点(箭头)的代表性图像和带有ASC斑点的细胞的平均值±s.d.百分比(图48和49)。通过免疫印迹分析在加入尼日利亚菌素之后30分钟采集的全细胞裂解物(WCL)和培养上清液(Sup)(图51)。在图53和54中，在加入尼日利亚菌素或介质之前，用30μM C-23、Bay 11-7082或z-VAD-fmk预处理LPS致敏的THP-1持续1小时，并且在30分钟后用小鼠抗GSDMD单克隆抗体(参见图55-63)进行染色。附图示出了具有GSDMD膜染色和焦亡性气泡的细胞的代表性共聚焦显微镜图像和其比例的定量。箭头指示对焦亡性气泡的GSDMD染色。图55示出了通过野生型、C38A或C191A GSDMD(0.3μM)加半胱天冬酶-11(0.15μM)抑制脂质体渗漏的Bay 11-7082剂量应答曲线。图56示出了Alexa 488标记的His-MBP-GSDMD(80nM)与Bay 11-7082通过NanoTemper直接结合的MST测量结果。图57和58示出了Bay 11-7082对针对荧光肽底物的半胱天冬酶-1(图57)和半胱天冬酶-11(图58)活性的作用的剂量应答曲线。图59和60示出了通过脲甲基半胱氨酸对Cys191进行修饰(增加57.0214Da)的含有Cys191的GSDMD肽FSLPGATCLQGEGQGHLSQK(aa184-103；2057.00Da)的MS/MS谱[LC保留时间，22.85分钟；观察到三重峰带电荷的前体离子m/z 705.6827(质量：2114.0481Da；δM 2.27ppm)](图59)或在GSDMD与Bay 11-7082一起温育之后对Cys191进行修饰(增加207.0354Da)的对应GSDMD肽的MS/MS谱。[LC保留时间，17.20分钟；观察到三重峰带电荷的前体离子m/z 756.0229(质量：2264.0688Da；δM11.7ppm)。](图60)。图61和62示出了Bay 11-7082对由0.3μM人GSDMD-3C(图61)或小鼠GSDMA3-3C(图62)加0.15μM 3C蛋白酶诱导的脂质体渗漏的作用的剂量应答曲线。图63示出了Bay 11-7082与N-乙酰半胱氨酸(NAC，500μM)一起预温育持续1小时对LPS+尼日利亚菌素处理的THP-1细胞的细胞焦亡的抑制的作用。使用5-40μM的Bay 11-7082的2倍稀释液。图示出了平均值±s.d；数据表示三个独立实验。*P<0.05，**P<0.01。
与双硫仑相比较，Bay 11-7082以较低亲和力与GSDMD结合，并且在抑制脂质体渗漏的活性方面比双硫仑低23倍(IC50 6.81±0.10μM相对于0.30±0.01μM)。Bay 11-7082还抑制半胱天冬酶-1，但针对半胱天冬酶-11的活性比双硫仑低约3倍。与双硫仑一样，Bay11-7082通过使反应性Cys残基29、30失活而发挥作用。通过纳米LC-MS/MS，发现Bay 11-7082共价修饰GSDMD中的Cys191。然而，通过在测定中用C191A GSDMD取代WT GSDMD，Bay11-7082对脂质体渗漏的抑制仅降低了2倍。所以，Bay 11-7082对脂质体渗漏的大量抑制可以归因于半胱天冬酶-11抑制，因为Bay11-7082对由GSDMD-3C加3C蛋白酶引起的渗漏的抑制大体上比由GSDMD加半胱天冬酶-11及其对小鼠GSDMA3-3C活性引起的渗漏的抑制少，前者缺乏相当的反应性半胱氨酸，加之3C蛋白酶类似于其对GSDMD-3C的活性。因此，与双硫仑不同，在脂质体渗漏测定中，Bay 11-7082更多地是半胱天冬酶抑制剂，而不是GSDMD抑制剂。
实例6b-炎症小体激活级联的抑制剂
最近，Cys反应性坏死抑制剂NSA被示出也可抑制GSDMD介导的细胞焦亡。将双硫仑与NSA和其它Cys反应性化合物抑制GSDMD和半胱天冬酶-11介导的脂质体渗漏的潜能进行比较，所述反应性化合物包含富马酸二甲酯(DMF，针对牛皮癣和多发性硬化症的药物)、阿法替尼(抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶的药物)、依鲁替尼(抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase)的药物)和LDC7559。NSA适度地抑制脂质体渗漏，但其潜能比双硫仑(IC50为9.50±0.43μM)低约30倍。
实例7-小鼠单克隆抗体通过免疫印迹和免疫荧光显微镜检查识别全长人GSDMD和GSDMD-NT孔隙形式
通过用重组人GSDMD对小鼠进行免疫并且用重组人GSDMD-NT增强来产生针对GSDMD的单克隆抗体，如方法中所述。在图64中，用指示的质粒转染HEK293T细胞，并且通过用指示的抗体探测的减少的凝胶的免疫印迹对细胞裂解物进行分析。在图65中，用指示的抗体对用或不用尼日利亚菌素处理的HCT116、293T和THP-1细胞的细胞裂解物进行免疫印迹。293T细胞不表达内源性GSDMD。在图66中，用抗GSDMD单克隆抗体对293T和THP-1细胞进行免疫染色并且用DAPI(蓝色)对其进行共染色。不表达GSDMD的293T细胞未示出背景染色。
实例8-机制研究
为了阐明通过双硫仑进行的细胞焦亡抑制的细胞机制，对其对完整的炎症小体激活通路的作用进行分析。参与典型炎症小体通路的基因中的一些基因未在未经刺激的细胞中表达，并且其表达需要诱导，诱导方法通常是在被称为致敏的过程中通过与病原体和危险相关的分子模式的细胞表面传感器(如Toll样受体(TLR))结合。在先前的实验中，在LPS致敏之后4小时以及用尼日利亚菌素刺激之前1小时加入双硫仑，并且因此未研究双硫仑在炎症小体致敏中的作用。为了明确地观察致敏，在加入LPS持续长达4小时之前用双硫仑预处理THP-1细胞持续1小时。通过检查IκBα磷酸化和降解以及RelA(p65)磷酸化来评估NF-κB激活——致敏中的关键转录因子。通过免疫印迹评估对NLRP3和促IL-1β表达的诱导。Bay11-7082因其对NF-κB激活的已知抑制作用而被用作阳性对照。在不存在双硫仑或Bay 11-7082的情况下，首先在加入LPS之后30分钟检测p65的磷酸化，并且所述磷酸化持续4小时，在加入LPS之后1小时检测磷酸化和减少的IκBα，并且在加入LPS之后4小时检测增加的NLRP3和促IL-1β蛋白。两种药物均抑制NF-κB激活，但Bay 11-7082具有更强作用；两者均阻断NLRP3和促IL-1β诱导。
尼日利亚菌素使用被称为细胞凋亡相关的斑点样蛋白(含有半胱天冬酶募集结构域(ASC))的适配体激活NLRP3典型炎症小体的组装，所述适配体可以在免疫荧光显微镜检查中可视化为斑点。当在不存在抑制剂的情况下用尼日利亚菌素处理LPS致敏的THP-1细胞时，在约30％的细胞中检测到ASC斑点。正如预期的，z-VAD-fmk不抑制斑点形成，因为半胱天冬酶激活发生在炎症小体组装的下游。致敏之后但在用尼日利亚菌素之前一小时加入的双硫仑适度地抑制ASC斑点形成到约20％的细胞。虽然在LPS致敏4小时之后才加入双硫仑，但斑点形成的适度减少归因于对通过双硫仑进行的致敏的细微抑制。事实上，免疫印迹示出，与在介质中温育的细胞相比，通过在致敏之后加入双硫仑来降低NLRP3水平。
典型炎症小体组装可激活半胱天冬酶-1，所述半胱天冬酶-1切割促IL-1β和GSDMD，并且释放加工后的IL-1β和诱导细胞焦亡需要后者。为了评估NLRP3介导的炎症中的哪些步骤在ASC斑点形成后被抑制，在加入尼日利亚菌素之前1小时用媒剂、30μM z-VAD-fmk或双硫仑1处理LPS致敏的THP-1细胞，并且在30分钟后和1小时后通过全细胞裂解物的免疫印迹对半胱天冬酶-1、GSDMD和促IL-1β的切割和激活进行分析。还通过培养上清液的免疫印迹对加工后的IL-1β的分泌进行评估。在不存在抑制剂的情况下清晰地检测到半胱天冬酶-1、GSDMD和促IL-1β对其活性形式的切割，并且其加工在尼日利亚菌素之后30分钟在通过双硫仑或z-VAD-fmk处理的细胞中减少。然而，与双硫仑对半胱天冬酶较弱的作用一致，到60分钟，双硫仑处理的样品中的半胱天冬酶-1、GSDMD和促IL-1β的加工追上在不存在抑制剂的情况下检测到的水平，而用z-VAD-fmk处理的样品仍然示出对这些蛋白质的极少切割。1小时的时间点是相关的，因为细胞死亡和IL-1β释放测量使用通过尼日利亚菌素分别刺激1小时和2小时的细胞。这些数据表明，双硫仑可延迟半胱天冬酶-1激活，但不抑制所述激活。然而，在不存在任一种抑制剂的情况下仅在培养上清液中检测到加工后的IL-1β，这表明尽管半胱天冬酶-1抑制受限，但双硫仑通过阻断GSDMD孔隙形成完全抑制了细胞因子释放。在小鼠iBMDM中也发现了双硫仑对IL-1β释放(但不是加工)的类似优选作用，而在1小时的时间点，NSA、Bay 11-7082和z-VAD-fmk仍然抑制半胱天冬酶-1、GSDMD和IL-1β的加工。
接下来，使用在先前实例中产生的识别未切割的GSDMD和其孔隙形式两者的单克隆抗体，通过免疫荧光显微镜检查评估z-VAD-fmk和双硫仑对LPS加尼日利亚菌素诱导的GSDMD孔隙形成的作用。在不存在任何抑制剂的情况下，GSDMD抗体对LPS加尼日利亚菌素处理的细胞的细胞质和质膜两者进行染色，这形成了特性焦亡性气泡。两种抑制剂完全阻断GSDMD膜染色和焦亡性气泡的出现。因此，虽然双硫仑抑制致敏并延迟半胱天冬酶-1激活，但是其作用在GSDMD孔隙形成的瓶颈步骤处达到顶峰，以减少THP-1和iBMDM细胞两者中的细胞焦亡和炎性细胞因子释放两者。相比之下，对照抑制剂z-VAD-fmk仅阻断半胱天冬酶-1活性。
为了研究双硫仑的体内作用，检查C57BL/6小鼠中的LPS诱导的脓毒症。在用LPS激发之前，使用在考虑体表面积的异速比例之后相当于人的284毫克/天的药物剂量(50mg/kg)腹膜内用媒剂或双硫仑处理小鼠，所述药物剂量在临床上认可的治疗酒精依赖32的125-500毫克/天的剂量范围内。而最低浓度的LPS(15mg/kg)在96小时后杀死8只对照小鼠中的3只，所有双硫仑处理的小鼠均存活(p＝0.045)。当所有小鼠均存活(p≤0.0003)时，血清IL-1β、TNFα和IL-6浓度在LPS激发之后12小时显著降低。在中间浓度(25mg/kg)下进行LPS激发之后，所有对照小鼠在72小时内死亡，但双硫仑处理的8只小鼠中的5只存活(p＝0.008)。在最高LPS激发(50mg/kg)时，尽管所有对照小鼠在一天内死亡，但是通过双硫仑处理显著延迟了死亡，并且8只小鼠中的1只存活(p＝0.007)。LPS诱导的小鼠脓毒症依赖于通过非典型炎症小体中的半胱天冬酶-11进行的GSDMD切割。与先前的研究一致，Casp11-/-和Gsdmd-/-小鼠而非Casp1-/-小鼠对由LPS诱导的脓毒症引发的死亡具有抗性。正如预期的，双硫仑保护Casp1-/-小鼠免受致命LPS激发的影响，但不显著影响Casp11-/-和Gsdmd-/-小鼠的存活率，因为未给药的对照组中除1只小鼠外均存活。
为了确定与Cu(II)复合是否在体内改进对脓毒症的防护，将双硫仑与或不与Cu(II)一起施用的有效性和腹膜内用25mg/kg LPS激发的小鼠的存活率进行比较。为了更好地模拟通常在炎性级联开始后才诊断出脓毒症的临床情况，双硫仑施用推迟到LPS刚注射之后和12小时之后。LPS后的双硫仑处理可显著延迟死亡(在不存在Cu(II)的情况下，p＝0.041)；在存在铜的情况下，p＝0.024)。尽管所有对照小鼠和单独用双硫仑处理的小鼠均死亡，但给予Cu(II)复合的双硫仑的8只小鼠中有2只存活。然而，在存在和不存在Cu(II)的情况下，双硫仑处理之间的存活率差异未达到显著性(p＝0.064)。因此，LPS之后给予的双硫仑部分地保护小鼠，并且在存在Cu(II)的情况下进行的施用可以改进其活性。
LPS不仅引起不需要致敏的细胞内非典型炎症小体激活，而且还对加剧脓毒性休克的NLRP3炎症小体激活进行致敏。NLRP3、ASC、半胱天冬酶-1或IL-1受体的遗传缺陷不提供在先前研究中用LPS激发的小鼠的实质存活率优点，而半胱天冬酶-11或GSDMD的缺陷可保护小鼠免于脓毒性死亡。因此，推断对LPS诱导的脓毒症的防护可能依赖于抑制GSDMD切割或孔隙形成，而非NLRP3炎症小体致敏。发现双硫仑类似地防护Casp1-/-和WT小鼠对此推理提供了支持。
为了确定双硫仑是否主要通过半胱天冬酶-11或孔隙形成抑制GSDMD加工，在腹膜内通过LPS或媒剂激发之前或紧接着之前4小时用双硫仑或媒剂预处理四组小鼠。6小时后采集腹膜巨噬细胞并通过免疫印迹分析其NLRP3、GSDMD和HMGB1。GSDMD在用或不用双硫仑处理的LPS激发的小组中同等加工，表明对死亡的抑制是由于对GSDMD孔隙形成的抑制，而非对GSDMD切割的抑制。令人惊讶的是，NLRP3水平在用或不用双硫仑处理的LPS激发的小组中也类似，表明虽然双硫仑损害细胞中的NLRP3致敏，但其不抑制在小鼠中的NLRP3致敏。这些结果有力地表明，在模型中，抑制GSDMD孔隙形成以阻止LPS诱导的细胞焦亡和炎性介体的释放是双硫仑的主要靶标。
双硫仑对小鼠和人细胞中的GSDMD孔隙形成的抑制补充其在阻断炎症小体致敏和半胱天冬酶活性方面的活性，以抑制由典型通路和非典型通路两者触发的细胞焦亡和炎性细胞因子释放。炎症小体通路中三个步骤的同时靶向意味着双硫仑(特别是当与Cu(II)一起给予以使其中间体稳定时)是特别有效的炎症抑制剂。本文中呈现的结果表明，对孔隙形成(通常是细胞焦亡和炎性介体释放两者中必经的最后一步)的抑制在双硫仑抗炎活性中占主要地位。其在抑制致敏和半胱天冬酶方面较弱的活性可以允许双硫仑对人无毒性，而如Bay 11-7082和半胱天冬酶抑制剂等更有效的NF-κB抑制剂均与毒性相关。另外，非典型炎症小体不需要致敏，并且在疾病情况中，相关免疫和上皮细胞的致敏可能已经通过临床上识别的炎症的时间体征和症状发生，表明抑制GSDMD以阻止细胞焦亡和炎性介体释放中的大多数下游步骤将特别有用。最后，双硫仑的相对选择性通过缺乏针对许多其它共价Cys反应性化合物(包含高反应性DMF)的GSDMD的活性提供了支持。
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其它实施例
应当理解，虽然已经结合详细描述对本申请进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本申请的范围，本申请的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (44)

1.一种执行以下的方法：
●抑制细胞中的消皮素(gasdermin)孔隙形成；和/或
●抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
●抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
●抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
●与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
●与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子；
所述方法包括使所述细胞与以下接触：有效量的式(I)化合物：
Figure FDA0002927659390000011
或其药学上可接受的盐，其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、Cy1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代；
或者R1和R2连同R1和R2所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy2的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
或者R3和R4连同R3和R4所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy3的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
每个Cy1独立地选自C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自RCy1的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
每个RCy1、RCy2和RCy3独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、卤基、CN、NO2、ORa2、C(O)Rb2、C(O)NRc2Rd2、C(O)ORa2、NRc2Rd2、NRc2C(O)Rb2、NRc2C(O)ORa2、NRc2C(O)NRc2Rd2、S(O)2Rb2和S(O)2NRc2Rd2；
Ra1、Ra2、Rc1、Rc2、Rd1和Rd2各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-4卤代烷基、Cy1、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa3、SRa3、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3、NRc3C(O)NRc3Rd3、NRc3S(O)2Rb3、NRc3S(O)2NRc3Rd3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
Rb1和Rb2各自独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-4卤代烷基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa3、SRa3、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3、NRc3C(O)NRc3Rd3、NRc3S(O)2Rb3、NRc3S(O)2NRc3Rd3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
Ra3、Rc3和Rd3各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基、(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基、C(O)Rb4、C(O)NRc4Rd4、C(O)ORa4、NRc4Rd4、S(O)2Rb4和S(O)2NRc4Rd4；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基各自任选地被独立地选自氧基、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、SRa4、C(O)Rb4、C(O)NRc4Rd4、C(O)ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4、NRc4C(O)NRc4Rd4、NRc4S(O)2Rb4、NRc4S(O)2NRc4Rd4、S(O)2Rb4和S(O)2NRc4Rd4的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
每个Rb3独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基各自任选地被独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、SRa4、C(O)Rb4、C(O)NRc4Rd4、C(O)ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4、NRc4C(O)NRc4Rd4、NRc4S(O)2Rb4、NRc4S(O)2NRc4Rd4、S(O)2Rb4和S(O)2NRc4Rd4的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
Ra4、Rc4和Rd4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基、(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基和Rg，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基各自任选地被独立地选自Rg的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；
每个Rb4独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基、(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基和Rg，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基和(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基任选地被独立地选自Rg的1个、2个、3个、4个或5个取代基取代；并且
每个Rg独立地选自OH、NO2、CN、卤基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-4卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、氰基-C1-3亚烷基、HO-C1-3亚烷基、C6-10芳基、C6-10芳氧基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基、C6-10芳基-C1-4亚烷基、C3-10环烷基-C1-4亚烷基、(5-10元杂芳基)-C1-4亚烷基、(4-12元杂环烷基)-C1-4亚烷基、氨基、C1-6烷基氨基、二(C1-6烷基)氨基、硫基、C1-6烷基硫代、C1-6烷基亚磺酰基、C1-6烷基磺酰基、氨基甲酰基、C1-6烷基氨基甲酰基、二(C1-6烷基)氨基甲酰基、羧基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰基氨基、氨基磺酰基、C1-6烷基氨基磺酰基、二(C1-6烷基)氨基磺酰基、氨基磺酰基氨基、C1-6烷基氨基磺酰基氨基、二(C1-6烷基)氨基磺酰基氨基、氨基羰基氨基、C1-6烷基氨基羰基氨基和二(C1-6烷基)氨基羰基氨基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代。
3.根据权利要求1所述的方法，其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自Cy1和任选地被Cy1取代的C1-6烷基。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中R1和R2连同R1和R2所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy2的1个、2个或3个取代基取代。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中R3和R4连同R3和R4所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy3的1个、2个或3个取代基取代。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述4-12元杂环烷基选自以下基团中的任一个基团：
Figure FDA0002927659390000041
以及
Figure FDA0002927659390000042
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中每个Cy1独立地选自C6-10芳基和5-10元杂芳基，其中的每一个任选地被独立地选自RCy1的1个、2个或3个取代基取代。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中RCy1、RCy2和RCy3各自独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、卤基、CN、NO2、ORa2、C(O)Rb2、C(O)NRc2Rd2、C(O)ORa2、NRc2Rd2、NRc2C(O)Rb2和NRc2C(O)ORa2。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中Ra1、Ra2、Rc1、Rc2、Rd1和Rd2各自独立地选自H、C1-6烷基、Cy1、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、S(O)2Rb3、S(O)2NRc3Rd3；其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3和NRc3S(O)2Rb3的1个、2个或3个取代基取代。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中Rb1和Rb2各自独立地选自C1-6烷基和Cy1，其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自卤基、Cy1、CN、NO2、ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3和NRc3S(O)2Rb3的1个、2个或3个取代基取代。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中Ra3、Rc3和Rd3各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4和NRc4S(O)2Rb4的1个、2个或3个取代基取代。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中每个Rb3独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4和NRc4S(O)2Rb4的1个、2个或3个取代基取代。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中Ra4、Rc4和Rd4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自Rg的1个、2个或3个取代基取代。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法，其中每个Rb4独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自Rg的1个、2个或3个取代基取代。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中每个Rg独立地选自OH、NO2、CN、卤基、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、氰基-C1-3亚烷基和HO-C1-3亚烷基。
16.根据权利要求1所述的方法，其中：
每个R1、R2、R3和R4独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和Cy1；其中所述C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基各自任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1、NRc1C(O)NRc1Rd1、NRc1S(O)2Rb1、NRc1S(O)2NRc1Rd1、S(O)2Rb1和S(O)2NRc1Rd1的1个、2个或3个取代基取代；
或者R1和R2连同R1和R2所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy2的1个、2个或3个取代基取代；
或者R3和R4连同R3和R4所连接的N原子一起形成4-12元杂环烷基，所述4-12元杂环烷基任选地被独立地选自RCy3的1个、2个或3个取代基取代；
每个Cy1独立地选自C6-10芳基和5-10元杂芳基，其中的每一个任选地被独立地选自RCy1的1个、2个或3个取代基取代；
每个RCy1、RCy2和RCy3独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、卤基、CN、NO2、ORa2、C(O)Rb2、C(O)NRc2Rd2、C(O)ORa2、NRc2Rd2、NRc2C(O)Rb2和NRc2C(O)ORa2；
Ra1、Ra2、Rc1、Rc2、Rd1和Rd2各自独立地选自H、C1-6烷基、Cy1、C(O)Rb3、C(O)NRc3Rd3、C(O)ORa3、S(O)2Rb3和S(O)2NRc3Rd3；其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自Cy1、卤基、CN、NO2、ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3和NRc3S(O)2Rb3的1个、2个或3个取代基取代；
Rb1和Rb2各自独立地选自C1-6烷基和Cy1，其中所述C1-6烷基任选地被独立地选自卤基、Cy1、CN、NO2、ORa3、NRc3Rd3、NRc3C(O)Rb3、NRc3C(O)ORa3和NRc3S(O)2Rb3的1个、2个或3个取代基取代；
Ra3、Rc3和Rd3各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4和NRc4S(O)2Rb4的1个、2个或3个取代基取代；
每个Rb3独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-6氰基烷基、卤基、CN、NO2、ORa4、NRc4Rd4、NRc4C(O)Rb4、NRc4C(O)ORa4和NRc4S(O)2Rb4的1个、2个或3个取代基取代；
Ra4、Rc4和Rd4各自独立地选自H、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自Rg的1个、2个或3个取代基取代；
每个Rb4独立地选自C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氰基烷基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-12元杂环烷基，其中的每一个任选地被独立地选自Rg的1个、2个或3个取代基取代；并且
每个Rg独立地选自OH、NO2、CN、卤基、C1-6烷基、C1-4卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、氰基-C1-3亚烷基和HO-C1-3亚烷基。
17.根据权利要求16所述的方法，其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地选自Cy1和任选地被Cy1取代的C1-6烷基。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述式(I)化合物选自以下：表A中所列的化合物中的任一种化合物：
Figure FDA0002927659390000061
Figure FDA0002927659390000071
Figure FDA0002927659390000081
或其药学上可接受的盐。
19.一种执行以下的方法：
●抑制细胞中的消皮素孔隙形成；和/或
●抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
●抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
●抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
●与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
●与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子；
所述方法包括使所述细胞与以下接触：有效量的以下化合物中的任一种化合物：
Figure FDA0002927659390000082
Figure FDA0002927659390000091
或其药学上可接受的盐。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述化合物选自：
Figure FDA0002927659390000101
或其药学上可接受的盐。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的方法，其中消皮素蛋白为消皮素D(GSDMD)。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的方法，其中所述炎性半胱天冬酶为半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-11。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的方法，其中所述化合物不抑制凋亡半胱天冬酶。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的方法，其中所述炎性细胞因子为IL-1β。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的方法，其中消皮素蛋白的所述半胱氨酸为Cys191。
26.一种治疗或预防其中炎症小体激活和/或消皮素炎性细胞死亡与发病机制有关的疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的：
●如权利要求1到18中任一项所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐；或
●权利要求19或20所述的化合物中的任一种化合物或其药学上可接受的盐。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病或病状选自：炎性疾病、心血管疾病、代谢疾病和神经退行性疾病。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述炎性疾病选自：脓毒症、痛风、关节炎、动脉粥样硬化、高胆固醇血症和炎性肠病。
29.根据权利要求26到28中任一项所述的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐与至少一种另外的治疗剂或其药学上可接受的盐组合施用于所述受试者。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述另外的治疗剂为抗炎剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗炎剂选自：抗IL1抗体、抗TNF抗体、NSAID以及类固醇抗炎剂。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述另外的治疗剂为抗生素。
33.一种鉴定化合物的方法，所述化合物：
●抑制细胞中的消皮素孔隙形成；和/或
●抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
●抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
●抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
●与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
●与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子；
所述方法包括：
g)提供包括脂质体的样品，所述脂质体包括能够与螯合配体、所述螯合配体、测试化合物和消皮素蛋白或其片段形成复合物的金属阳离子；
h)使所述样品中的所述消皮素蛋白与蛋白酶接触；以及
i)确定所述测试化合物是否抑制所述金属阳离子从所述脂质体中渗漏，其中对所述金属阳离子从所述脂质体中的所述渗漏的所述抑制指示所述测试化合物：
●抑制细胞中的消皮素孔隙形成；和/或
●抑制炎症小体介导的细胞死亡(细胞焦亡)；和/或
●抑制来自细胞的细胞因子分泌；和/或
●抑制细胞中的炎性半胱天冬酶；和/或
●与细胞中的消皮素蛋白的半胱氨酸共价反应；和/或
●与选自以下的炎性信号传导分子的半胱氨酸共价反应：传感器、适配体和转录因子或其调节因子。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述金属阳离子为Tb3+。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述螯合配体为吡啶二羧酸(DPA)。
36.根据权利要求33到35中任一项所述的方法，其中所述金属阳离子与所述螯合配体的所述复合物的荧光大于当所述阳离子与所述配体未彼此结合时所述金属阳离子或所述螯合配体的荧光。
37.根据权利要求33到36中任一项所述的方法，其中消皮素蛋白为消皮素D(GSDMD)。
38.根据权利要求33到37中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶为炎性半胱天冬酶。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述炎性半胱天冬酶为半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-11。
40.根据权利要求33到39中任一项所述的方法，其中所述消皮素蛋白包括鼻病毒3C蛋白酶切割位点(GSDM-3C)。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述蛋白酶为鼻病毒3C蛋白酶。
42.根据权利要求33到41中任一项所述的方法，其中所述炎性细胞因子为IL-1β。
43.根据权利要求33到42中任一项所述的方法，其中所述确定所述测试化合物是否抑制所述金属阳离子从所述脂质体中渗漏包括检测所述样品的荧光是否低于不含所述测试化合物的对照样品的荧光。
44.一种药物组合物，其包括：
●如权利要求1到18中任一项所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐；或
●权利要求19或20所述的化合物中的任一种化合物或其药学上可接受的盐；
以及药学上可接受的载体。
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