CN105228628A - 与用于使肿瘤靶向成像的化合物缀合的氨基酸连接基的合成和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作近红外荧光探针的化合物，其中该化合物包括：i)结合靶受体蛋白的蝶酰基配体；ii)染料分子；和iii)含有氨基酸或其衍生物的连接分子。本发明还描述了制备和使用所述化合物的方法和组合物、掺入所述化合物的方法和掺入所述化合物的试剂盒。

Description

与用于使肿瘤靶向成像的化合物缀合的氨基酸连接基的合成和组合物
相关申请
本专利申请涉及并要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请顺序号US61/791,921的优先权利益，将该文献内容完整地引入本申请作参考。
技术领域
本申请属于诊断领域。本申请提供合成和使用氨基酸连接基的方法，所述氨基酸连接基与用于使肿瘤靶向成像的化合物缀合。缀合氨基酸连接基增加了所述化合物的特异性和检测性。关注在诊断成像中应用的方法和组合物。
背景技术
手术除去恶性肿瘤疾病构成了用于癌症初步治疗的最常用和有效的治疗手段之一。所有可检测到的恶性肿瘤损害的切除导致所有癌症患者的约50％中未可检测到该病复发1，且可能延长预期寿命或减少观察到癌症复发的患者的发病率。并不两人惊奇地，用于实现更定量的缩减细胞的手术方法是目前正在接受的更多的考察。
所有可检测到的恶性肿瘤损害的切除导致所有癌症患者的约50％中未可检测到该病复发，且可能延长预期寿命或减少观察到癌症复发的患者的发病率。由于完全切除恶性肿瘤损害的重要性，所以有益的是确保精确和完全地鉴定恶性肿瘤损害。在手术过程中鉴定恶性肿瘤损害目前通过三种方法进行。首先，可以基于异常颜色、质地和/或形态通过视觉检测许多肿瘤块和根瘤。因此，肿瘤块可以显示出斑驳的颜色，出现具有不规则边界的不对称性或从健康器官的轮廓中突出。恶性肿瘤块还可以因柔软性、弹性或坚硬度而通过触觉与相邻的健康组织识别。最终，可以使用荧光染料在手术过程中定位几种癌症病灶，所述荧光染料从原发性肿瘤被动地流入引流的淋巴结。在这种后面的方法中，可以通过视觉鉴定荧光(标记)淋巴结，切除并且检查癌细胞是否转移至这些淋巴结。
尽管认识到除去肿瘤的重要性和一些鉴定技术在使肿瘤块显影的可利用性，但是许多恶性肿瘤根瘤仍然逃过了检测，导致疾病复发且通常导致死亡。因此，对改进的肿瘤鉴定存在需求。这种动机已经导致引入了用于手术中使恶性肿瘤疾病显影的两种新方法。在第一种方法中，将猝灭的荧光染料通过全身注入具有肿瘤的动物，且通过肿瘤特异性酶、pH改变或氧化还原电位改变释放猝灭部分被利用于选择性地活化恶性肿瘤块内的荧光。在第二种方法中，使荧光染料于肿瘤特异性靶向配体缀合，所述肿瘤特异性靶向配体导致结合的染料蓄积在超表达所述配体的受体的癌症中。用于这种后面的目的的肿瘤靶向配体的实例包括叶酸，其显示对卵巢、肾、肺、子宫内膜、乳腺和结肠和DUPA的叶酸受体(FR)阳性癌症的特异性，其可以将连接的荧光染料选择性地递送至表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)的细胞，即前列腺癌和其它实体瘤的新血管系统。有益地，近期已经在人卵巢癌患者中测试了一种叶酸靶向的荧光染料(叶酸-荧光素或EC17)。在该研究中，借助于肿瘤靶向荧光染料除去了超过不使用它的恶性肿瘤损害～5X以上，且所有切除的荧光损害均通过药理学方法被证实为恶性肿瘤。
常规的荧光技术使用在可见光光谱(～400-600nm)内的探针，它对于手术过程中影像指导外科手术而言并非最佳，因为它与因组织中胶原蛋白导致的相对高水平的非特异性背景光相关。因此，来自这些常规化合物的信躁比低。此外，由生物发色团、特别是血红蛋白吸收可见光将透入深度限于几个毫米。因此，埋藏组织中深于几个毫米的肿瘤可能仍然无法检测到。此外，荧光素的电离平衡(pKa＝6.4)导致在5-9范围的pH-依赖性吸收和发射。因此，基于荧光素的染料的荧光在低pH(低于pH5)下被猝灭。
例如，EC17染料在更广泛用于光学成像以表征和测定临床环境中的患病组织中的潜在应用因连接的染料(荧光素)在可见光范围发射荧光的主要缺陷而受阻。这使得EC17和相关染料难以在应用于体内组织，因为组织典型地在可见光范围强烈地发出自体荧光且光难以透入组织。此外，EC17(叶酸-乙二胺-异硫氰酸荧光素)构成了硫脲连接基。众所周知硫脲化合物因硫脲键的不稳定性而具有低贮存期限。因此，化合物例如EC17对于应用于光学成像而言并非最佳，这归因于这种不稳定性和硫脲桥分解的相关分解。
可见光谱(<600nm)中血红蛋白与IR范围(>900nm)内的水和脂质的光吸收的组合提供了约650-900nm的光学成像窗，其中组织的吸收系数最小。在可见范围发射光的染料的适合的可替代选择可以用于研发可以用于近红外(NIR)范围的染料，因为近红外区内的光几乎不诱导自体荧光并且非常有效地透入组织。近-IR荧光技术的另一个有益性在于来自从激发源的散射光的背景明显减少，因为散射强度与波长的四次方的倒数成正比。低背景荧光是高灵敏度检测所必需的。此外，生物组织中近-IR区(650nm至900nm)内的光学透明观察孔线(opticallytransparentwindow)使得NIR荧光成为用于体内成像和亚细胞检测应用的有价值的技术，所述的体内成像和亚细胞检测应用需要光通过生物成分传送。
尽管光在用于较深组织成像的NIR范围中的应用优先针对可见光谱中的光，但是目前本领域中使用的NIR成像染料存在大量挑战和缺陷，例如对于光漂白敏感、化学稳定性差、落入与许多生理学分子相同范围的吸收和发射光谱(导致高背景信号和自体荧光)。此外，大部分NIR染料在合成过程不稳定，尤其是与胺连接基缀合，产生多种不需要的副产物。因此，采用配体-靶向的NIR成像剂对于临床而言可能是昂贵的。所以，目前使用NIR荧光探针的成像方法在深度组织(距离表面>5mm)成像、哺乳动物组织中的荧光信号定量或在增加临床前期至临床转换时间的生产成本方面无效。
两种富有希望的荧光引导手术的方法目前处于用于临床的紧张研究中。在一种方法中，可活化的NIR荧光探针因其接近连接的猝灭剂而在稳态中发出最少的荧光，其在恶性肿瘤组织中释放猝灭剂时变成明显的荧光。最常用的释放机制之一牵涉在染料与猝灭剂之间并入态序列，其可以特异性地被肿瘤富含的蛋白酶(即组织蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶)裂解。这种策略的主要优点在于在缺乏活化酶的组织中不存在荧光，使得组织沿排泄途径(例如肾、膀胱、肝)保留非荧光，除非它们意外地表达所述裂解酶。这种肿瘤活化的NIR染料还可以在肿瘤块中生成大量荧光，只要恶性肿瘤损害中富含所述裂解酶且释放的染料保留在肿瘤中。这种方法的主要缺点归因于许多相关水解酶的肿瘤特异性差(其大部分还在进行天然重建或经历炎症的健康组织中表达)。此外，期望的蛋白酶的丰度在肿瘤块中可变，导致在一些恶性肿瘤损害中荧光迟缓或无活化，而在其它损害中荧光快速出现。
因此，仍然需要可以特异性地用于靶向患病组织且在体内用于组织成像的应用中具有增加的稳定性和量度的染料物质。
发明内容
本申请提供用于合成氨基酸连接基的方法，所述氨基酸连接基与用于使肿瘤和淋巴结靶向成像的化合物缀合。在一些实施方案中，本申请涉及包含叶酸或蝶酰基配体、连接基和荧光染料的化合物或其盐衍生物。在一些实施方案中，所述连接基可以是氨基酸、其异构体、衍生物或外消旋混合物。在其它方面，所述荧光染料选自LS288、IR800、SP054、S0121、KODAK、S2076和S0456。
在一些方面，本申请提供使氨基酸连接基与荧光染料缀合的方法，其中所述氨基酸可以为酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、其异构体和衍生物。在一些实施方案中，所述氨基酸、其异构体或衍生物包含-OH、-NH2或-SH官能团，其在以稍摩尔过量添加到荧光染料中时使荧光基团与氨基酸、其异构体或衍生物缀合。在其它实施方案中，所述氨基酸、其异构体或衍生物包含-OH官能团，其在合成时与增加化合物量度和检测性的荧光染料生成醚键。在一些实施方案中，本申请涉及氨基酸连接基与荧光染料的缀合，其中所述氨基酸、其异构体或衍生物包含-SH、-SeH、-PoH或–TeH官能团，其在合成时与荧光染料生成C-S、C-Se、C-Po或C-Te键。在一些方面，本申请涉及氨基酸连接基与荧光染料的缀合，所述荧光染料具有约500nm至约900nm的最大吸收和发射光谱。在其它方面，所述氨基酸连接基与具有约600nm至约800nm最大吸收和发射光谱的荧光染料缀合。
在另外的实施方案中，本申请提供用于使氨基酸连接基与叶酸配体缀合的方法，其中所述氨基酸连接基为酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、其异构体或衍生物，且与叶酸通过二肽键缀合。在另外的方面中，本申请提供连接基与叶酸配体的缀合方法，其中所述连接基为酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺,谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、其异构体或衍生物，且与叶酸通过高-寡肽键缀合。在其它实施方案中，本申请涉及蝶酰基配体与氨基酸连接基缀合的方法，其中所述连接基为酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、其异构体或衍生物。在一些方面，连接基的羧酸与任意氨基酸的α碳结合，由此增加化合物对于靶向受体的特异性。在一些实施方案中，所述氨基酸连接基赋予化合物特异性，其中所观察到的化合物对靶向受体的结合亲和力是指叶酸受体。
在另外的方面，所述化合物对于靶向表达靶受体的肿瘤细胞具有高度选择性。
在其它实施方案中，本申请涉及命名为Pte-Tyr-S0456(OTL-0038)的化合物在影像定向外科、肿瘤造影、淋巴结显像、炎性疾病、动脉粥样硬化、感染性疾病、法医应用、矿物应用、眼科、凝胶染色、DNA测序、神经染色或整形外科中的用途。在其它方面，Pte-Tyr-S0456衍生物可以为Pte-D-Tyr-S0456、Pte-高Tyr-S0456、Pte-β-高-Tyr-S0456、Pte-(NMe)-Tyr-S0456、Pte-Tyr(OMe)-S0456、Pte-Tyr(OBn)-S0456、Pte-NHNH-Tyr-OAc-S0456、其盐或衍生物。
在其它方面，本申请提供合成化合物的方法，其中保护基用于避免与非氨基的可能生成不需要的化合物的基团的不期望的反应性。本申请提供的方法产生具有超过98％纯度的收率的最终化合物。
在一些方面，本申请涉及用于使肿瘤靶向成像的化合物，其中该化合物可以用于研究、诊断或治疗目的。在其它实施方案中，本申请提供包含成像化合物和药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或盐的组合物。
在其它方面，本申请涉及具有选自下式的化合物：
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中酪氨酸是β高酪氨酸，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
及其药学上可接受的盐。
附图说明
图1以叶酸受体为靶的第一代叶酸-NIR染料缀合物。
图2第一代叶酸-NIR缀合物的结合等温线。叶酸-NIR染料缀合物与表达叶酸受体的KB细胞的结合曲线。靶向的缀合物是DyLight680(三角形)、AlexaFluor750(菱形)和IR800CW(圆形)。
图3：静脉内注射第一代叶酸-NIR染料缀合物后4小时具有转移性疾病的小鼠(实验模型)的荧光图像。完整(A-D)和手术打开的(a-d)带有肿瘤的小鼠的荧光和白色光图像覆盖。给具有表达FR的转移性L1210A肿瘤的无胸腺裸鼠通过静脉内注射10nmol叶酸-DyLight680(A/a)或叶酸-DyLight750(B/b)并且在4小时后成像。
图4：连续肿瘤削体外科手术期间切除的组织的H&E分析。A-D：尾静脉注射10nmol叶酸-IR800CW后4小时带有L1210A转移性肿瘤的小鼠的荧光和白色光图像覆盖。A：全身图像。B：打开的胸腔。C：除去原发性肿瘤后。D：除去所有次级淋巴小结后。a-d：a的H&E染色：健康对照肺；b：原发性肿瘤；c：次级淋巴小结。d：残留组织。
图5以叶酸受体为靶的第二代叶酸-NIR染料缀合物。
图6是叶酸-连接基和第二代叶酸-NIR染料缀合物与培养的癌细胞的结合等温线(使用放射性标记的叶酸的竞争性研究。本试验同时提供对叶酸受体的结合亲和力和特异性)。A：叶酸-EDA-和B：叶酸-Lys-NIR染料缀合物与表达叶酸受体的KB细胞的结合曲线。
图7第二代叶酸-NIR缀合物的荧光图像和离体组织生物分布。A：静脉内注射10nmol叶酸-NIR缀合物后2小时具有KB肿瘤异种移植物的裸鼠的荧光图像。(a)使施用叶酸-EDA-NIR缀合物的小鼠组各自成像；(b)施用叶酸-EDA-NIR缀合物的小鼠的对头比较；和(c)使施用叶酸-Lys-NIR缀合物的小鼠组各自成像。B：施用叶酸-NIR缀合物的动物的离体组织生物分布。
图8以叶酸受体为靶的第三代NIR染料缀合物。
图9Pte-L-Tyr-S0456NIR染料缀合物的示构。具有4个有益官能团的蝶酰基-Tyr-S0456(OTL-0038)的化学结构。a＝作为靶分子的蝶酸；b＝来自酪氨酸的用于肿瘤特异性并且改善对叶酸受体的结合亲和力的α-羧酸；c＝来自酪氨酸的增强(加亮)荧光强度的酚部分；d＝近-IR荧光探针。因此，酪氨酸作为配体、连接基和近–IR染料的部分起作用。换句话说，酪氨酸是改善配体(蝶酸)结合亲和力和特异性的连接基。它还增强NIR染料的亮度。
图10通过LC/MS监测(A)Pte-Tyr-S0456(OTL-0038)和(B)叶酸-EDA-IR800CW的反应进程。Pte-Tyr-S0456得到99％纯的具有超过98％收率的期望的产物，而叶酸-EDA-IR800CW得到具有30-40％期望的产物多种副产物。
图11注射10nmolPte-Tyr-S0456的小鼠的全身荧光图像和离体组织生物分布。(1)静脉内注射10nmol以叶酸受体为靶的-NIR缀合物后2小时具有KB肿瘤异种移植物的裸鼠的荧光图像(荧光和白色光图像覆盖)。(2)采集预先成像的小鼠组织后缀合物的离体组织生物分布。
图12给裸鼠施用Pte-Tyr-S0456和第二代叶酸-NIR缀合物(10nmol)后2h的Pte-L-Try-S0456(OTL-0038)与第二代叶酸-NIR缀合物的头对头比较(A)全身荧光图像；(B)离体组织生物分布；和(C)肿瘤和肾图像。切除的(切片的)肿瘤显示靶向成像剂在肿瘤中均匀吸收。
图13在具有对叶酸受体阳性肿瘤异种移植物的小鼠施用10nmol每种缀合物后Pte-Tyr-S0456与其它蝶酰基-NIR染料缀合物的肿瘤蓄积和肿瘤特异性比较。
图14描述与氨基酸连接基缀合的4种化合物包括Pte-Lys-S0456、蝶酰基-Cys-S0456、Pte-Ser-S0456和Pte-4-氨基-L-Pro-S0456的结构。
图15描述OTL-0038、OTL-0039(OTL-0038的D-异构体)和叶酸对叶酸受体的相对结合亲和力。图15A是描述每种化合物对叶酸受体的结合曲线的示意图，图15B是示例所有3种化合物的结合亲和力和相对结合亲和力的表。
图16A描述注射OTL-0039的具有KB肿瘤异种移植物的裸鼠的全身荧光图像。给小鼠静脉内注射10nmol在磷酸缓冲盐水(100μL)中的OTL-0039。2.5小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation进行全身成像实验。
图16B示例在注射化合物后2.5小时，注射图5A中的OTL-0039的小鼠的组织生物分布。在全身成像后，切开动物并且使用如上的IVIS成像器对选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤和肿瘤)分析荧光活性。
图17描述概括OTL-0038的肿瘤吸收的表。在注射递增量的0.3-90nmol的OTL-0038的小鼠中分析组织生物分布。在注射后2.5小时检查生物分布的数据分析。
图18示例注射递增量的OTL-0038的小鼠的组织生物分布。通过静脉内给小鼠施用0.3-90nmol的化合物浓度范围。在注射后2.5小时检查生物分布的数据分析。
图19示例注射1nmolOTL-0038的具有KB肿瘤异种移植物的裸鼠的全身荧光图像。其显示我们需要极低浓度的OTL-0038来使肿瘤成像，这是因为其对FR的高亲和力和染料的更高亮度。2.5小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation进行全身成像实验。
图20A描述具有对叶酸受体为肿瘤异种移植物阴性的小鼠的全身荧光图像。在施用10nmolOTL-0038后的2.5小时进行全身成像。
图20B使用叶酸受体-阴性肿瘤异种移植物和叶酸受体-阳性肾来示例侵害性肿瘤和OTL-0038的肾吸收。注射后2.5小时进行数据分析。
图21描述用于溶液相合成成像化合物的三步反应路线。
图22描述用于固相合成成像化合物的的两步反应路线。
图23A呈现注射10nmolPte-酪氨酸类似物-S-456的小鼠的全身荧光图像(注射后2小时)。
图23B呈现Pte-酪氨酸类似物-S0456的组织生物分布(注射后2小时)。
图24显示注射10nmolOTL-0038(Pte-Tyr-S0456)、OTL-0053(蝶酰基-Lys-S0456)和OTL-0054(蝶酰基-Cys-S0456)的小鼠的全身荧光图像(注射后2小时)。激发：745nm。发射：830nm。
图25显示OTL-0038(Pte-Tyr-S0456)、OTL-0053(蝶酰基-Lys-S0456)和OTL-0054(蝶酰基-Cys-S0456)的组织生物分布(注射后2小时)。激发：745nm。发射：830nm。
图26描述注射10nmolOTL-0051(蝶酰基-Tyr-IRD28)和OTL-0052(蝶酰基-Tyr-Kodak)的小鼠的全身和半身荧光图像(注射后2小时)。
图27描述OTL-0051(蝶酰基-Tyr-IRD28)和OTL-0052(蝶酰基-Tyr-Kodak)的组织生物分布(注射后2小时)。
具体实施方式
手术是用于所有实体瘤的最佳疗法之一，例如前列腺癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌。在美国，尽管手术在50％的具有实体瘤的患者中有效，但是单独的化疗和放疗在全部癌症中的有效率低于5％。在美国每年有超过700,000患者进行癌症手术，且40％的手术患者在5年内具有局部疾病复发。尽管在过去十年内在肿瘤学方面取得了重大进展，但是在本领域中仍然存在明显的障癌需要克服。例如，仍然难以完全切除无边缘原发性肿瘤、除去隐藏转移性癌细胞的淋巴结和鉴定卫星疾病(satellitedisease)。实现这三种情况的改善不仅改善疾病清除率，而且指导有关术后化疗和放射的决定。尽管已经证实非靶向荧光染料被动地蓄积在实体瘤中，但是得到的肿瘤育背景比通常较差且在恶性肿瘤与健康组织之间的边界可能难以确定。尽管配体靶向的荧光染料(例如EC17：叶酸-EDA-FITC)已经用于使组织成像，但是那些染料无效，因为它们不能透入深部组织且由此仅鉴定非组织样品内较深部的组织表面上的特定细胞。此外，已经证实这些在先的荧光染料的激发和发射光谱使得它产生显著的背景噪声，使得靶向组织不易于被检测到。此外，正如上述背景部分中所讨论的，基于荧光的染料存在低贮存期限稳定性缺点。EC17作为该化合物中的硫脲桥的不稳定性的结果而易于分解。此外，归因于EC17，使用具有来自成像部位周围组织中的胶原蛋白的相对高水平非特异性背景噪声的缺陷荧光素。此外，生物发色团、特别是血红蛋白吸收可见光进一步限制了掺入荧光素的染料的有用性。这意味着常规的染料不易于检测埋藏在组织中深度超过几个毫米的肿瘤。此外，来自荧光素的荧光在低pH(低于pH5)下被猝灭。
为了使染料物质用于检测和指导手术或提供其它组织成像，重要的是克服这些缺陷。
在制备包括近红外染料的缀合物中考虑了几种标准。易于合成和化学稳定性是主要的化学属性。考虑了光谱特性，例如吸收和发射光谱和量子收率。评价了几种生物特性，例如在细胞研究中的结合亲和力、使用具有肿瘤的小鼠的全身动物成像和生物分布。特别地考虑了生物分布的几个方面，包括每次口服分布2小时后小鼠死亡、存活小鼠成像和剂量递增。最终，采取了安全性考量，包括最大耐受剂量(MTD)、免疫组织化学(IHC)分析和一般临床病理学分析。
本申请提供近红外染料的蝶酰基缀合物，其是稳定的、在红外范围发出荧光并且透入靶向组织内的深部以便对表达叶酸受体的组织区域进行特异性和亮度鉴定。更具体地，所述蝶酰基缀合物通过氨基酸连接基连接至近红外染料。甚至更具体地，已经发现如果氨基酸连接基是酪氨酸或酪氨酸衍生物，则染料的荧光强度得以维持乃至得到增强。
将氨基酸定义为包括连接至羧酸官能团的胺官能团和对于每种氨基酸具有特异性的侧链。α氨基酸是通式R5CH(NH2)COOH(α-氨基酸)的任意化合物，其中R5选自H或任意已知的氨基酸侧链。
将β氨基酸定义为包括连接在β碳上的胺官能团和连接在α碳上的羧 酸官能团。将β高氨基酸定义为包括连接在β碳上的胺官能团、连接在α碳上的羧酸官能团和从α或β碳上起始的侧链，其中所述侧链与另一种氨基酸结合。
可以将天然存在的氨基酸分成如下4类：(1)酸性氨基酸、(2)碱性氨基酸、(3)中心极性氨基酸和(4)中性非极性氨基酸。在这些不同类别内的有代表性的氨基酸包括、但不限于：(1)酸性(带负电荷的)氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(代正电荷的)氨基酸，例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
天然存在的氨基酸序列内的氨基酸的保守取代可以选自天然存在的氨基酸所属类别的其它成员。例如，氨基酸的脂族侧链是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。天然存在的氨基酸缬氨酸的保守取代包括使用甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
氨基酸的脂族-羟基侧链基是丝氨酸和苏氨酸。氨基酸的包含酰胺的侧链基是天冬酰胺和谷氨酰胺。氨基酸的芳族侧链基是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。氨基酸的碱性侧链基是赖氨酸、精氨酸和组氨酸。氨基酸的包含硫侧链基是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守氨基酸取代的实例是：缬氨酸取代亮氨酸、丝氨酸取代苏氨酸、苯丙氨酸取代酪氨酸、赖氨酸取代精氨酸、半胱氨酸取代甲硫氨酸和天冬酰胺取代谷氨酰胺，
在优选的实施方案中，本文证实这种蝶酰基缀合物特异性地靶向组织内的肿瘤细胞。此外，荧光强度大于使用其它用于叶酸受体阳性肿瘤的叶酸靶向的聚合物染料预先观察到的强度。这种增加的强度允许靶向和清楚地鉴定来自所监测组织的生物样品的小区域(例如较小肿瘤)。此外，本申请的化合物的增加的强度提供附加的优点，即可以施用较低剂量/用量的燃料且仍然产生有意义的结果。因此，本申请的化合物产生更经济的成像技术。此外，存在附加的优点，即本申请的化合物与常规成像化合物相比剂量较低，仍然能够将对身体施用外部物质附带的毒性和其它副作用减少到最低限度。
此外，鉴定小肿瘤导致对不产生边缘的原发性肿瘤的切除更精确和更有效并且能够准确地鉴定和除去隐藏转移性癌细胞的淋巴结和鉴定卫星疾病。这些优点各自对所治疗患者的更好的临床结果积极相关。
在具体的实施方案中，发现非酪氨酸的氨基酸作为连接基的应用导致聚合物荧光缺失。例如，参见反应路线I的讨论。特别注意到，合成途径产生不期望的副产物4作为主要产物，其不具有NIR特性。
然而，关注除酪氨酸和酪氨酸衍生物哇外，具有半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的近红外染料的蝶酰基缀合物可能是有用的。此外，关注蝶酰基或叶酸部分与染料直接连接或染料与蝶酸或叶酸通过胺连接基连接也产生了来自化合物的荧光强度缺失，而在蝶酰基(靶向部分)与近红外染料(荧光部分)之间存在酪氨酸或酪氨酸衍生物作为连接部分对于维持或增强缀合化合物的荧光是有益的。本申请的基于酪氨酸的化合物无需额外的胺连接基连接至化合物S0456且还因为缀合通过酪氨酸的酚部分缀合导致荧光增强。
所述化合物可以与荧光介导的分子体层造影成像系统一起使用，例如为在深部组织中检测近红外荧光活化设计的那些。所述化合物提供分子和组织特异性、产生高荧光对比、更明亮的荧光信号和减少背景自体荧光，从而使得体内患病组织(例如癌症)的早期检测和分子靶标评价改善。所述化合物可以用于深部组织三维成像、靶向手术和用于对生物样品中的靶细胞类型的量定量。
化合物
在一个方面，本申请涉及包含式(I)的化合物：
其中：
X是氨基酸或其衍生物，且
Y是在近红外范围具有荧光激发和发射光谱的染料，且所述化合物维持或增强Y的荧光。
在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸衍生物诱导电子发射光谱、电子吸收光谱或电子发射光谱和电子吸收光谱中相对于未修饰染料分子的电子光谱的位移。适合地，电子光谱中的位移是红移(即向较长波长/较低频率位移)，这有助于改善化合物在近红外(NIR)光谱窗宽中的检测和/或减少背景信号的量、自体荧光、来自所显影的区域周围组织的干扰。更具体地，特别使用包含并入6-元环的负电性原子的NIR染料观察到电子光谱中的位移。因此，在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸(X)衍生物包含富含电子的部分，例如氧、硫或氮。这种氨基酸的实例可以包括半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺或其衍生物。
在该方面的实施方案中，本申请提供式(I)a、(I)b、(I)c和(I)d的化合物：
其中Tyr、Cys、Ser和Lys基团分别表示酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和赖氨酸氨基酸残基或且衍生物，且L优选是蝶酰基或叶酸，且Rx各自包含独立选择的任选地不存在的增溶基团
其中Tyr、Cys、Ser和Lys基团分别表示酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和赖氨酸氨基酸残基或且衍生物，且L优选是蝶酰基或叶酸。优选L是蝶酰基。
在特别优选的实施方案中，本申请提供式I(a)的化合物，其中Tyr选自：
适合地，本文公开的化合物在约650nm-1000nm、例如且优选地在约800nm的近红外区具有最大光吸收波长。
在特别优选的实施方案中，本文公开的化合物包括配体(L)，其有效地使所述化合物靶向至特定细胞或组织类型且允许对该靶向的细胞或组织成像。优选L是蝶酰基部分或叶酸部分且更优选L是蝶酰基部分。然而，关注本领域技术人员可以使用一些另外的配体L使所述化合物靶向至所关注的特定细胞表面蛋白或受体蛋白。在具体和优选的实施方案中，所述配体包含蝶酰基：
化合物的合成
本文公开的化合物可以使用文献中已知的常规方法制备，参见，例如，如上述报道的合成所述染料化合物。
然而，在特别优选的实施方案中，本申请提供用于生成本文所述化合物(即式I的化合物)的更有效的合成方法。例如，可以根据如下反应路线I、II和III中概括的通用反应路线，制备具有式I(a)-I(d)的化合物。
反应路线I示例预先用于生成式I的化合物的合成反应路线，其中目标配体包含通过氨基酸(赖氨酸)连接至染料分子的叶酸。简言之，通过连接至氨基酸的氨基修饰的叶酸配体与染料的桥连的醚衍生物在产生产物(3)和(4)的条件下反应。然而，值得注意的是，化合物3是优选期望的化合物，而合成路径导致存在不期望的副产物4作为主要产物，其不具有NIR特性。此外，其光谱特性是pH依赖性的。因此，该反应路线显示醚桥连的染料的主要缺陷。在这些染料的常规生产过程中，30-60％的收率是期望的产物的收率，而40-70％的收率是不期望的副产物的收率。
反应路线II提供合成途经，其包括仅3个反应步骤且提供高收率的产物化合物(5)(高于98％)。简言之，将靶向配体(1)(示例在反应路线II中，带有蝶酰基)和任选地包括保护基以避免不期望的与非氨基酸的氨基的基团的反应的氨基酸或氨基酸衍生物(2)在HATU[(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐)]/DIPEA(二异丙基乙胺)/DMF(二甲基甲酰胺)溶剂系统中混合，在室温反应足够时间(5分钟)，以使(2)通过氨基官能团与配体(1)偶合，得到(3)。可以通过将稀酸添加到该反应混合物中有利地沉淀化合物(3)。更具体地，用1NHCl(盐酸)沉淀化合物3，得到最终化合物，纯度超过98％，在这些实施方案中，避免了使用昂贵的HPLC或柱色谱步骤。通过使化合物在室温下在TFA(三氟乙酸)：水：TIPS(三异丙基硅烷)溶剂系统中反应使化合物(3)反应以除去化合物的氨基酸部分上的保护基，得到化合物(4)。通过用乙醚或甲基叔丁基醚沉淀纯化化合物4，在不进行HPLC(高效液相色谱法)或柱色谱法的情况下得到超过98％的纯度。使化合物(4)在碱水系统(例如NaOH，氢氧化钠)中反应，以便除去保护基官能团，随后在稍摩尔过量的情况下与染料(S0456)在水中在80-100℃温度下反应15分钟时间，以允许染料与(4)偶合，得到最终化合物(5)。用丙酮沉淀化合物5，得到超过98％纯的Pte-Tyr-S0456。当使用NaOH时，产生Pte-Tyr-S0456的钠盐。
反应路线II：
反应路线III提供生产本文公开的化合物的可选固相合成途经且提供与如反应路线II中所述类似的收率。简言之，使与底物(1)结合的氨基酸(如下反应路线III中示例为被保护的连接至树脂珠的酪氨酸)在20％哌啶的DMF溶液中反应以除去Fmoc(芴基甲氧基羰基)保护基，随后与靶向配体(另外示例为下文的蝶酰基)在HATU/DIPEA/DMF中反应，其反应时间和温度足以使该配体与氨基酸的胺官能团偶合，得到(2)。使化合物(2)反应以便在一系列反应中在TFA：水：TIPS溶剂系统中除去底物和氨基酸上的任意保护基，得到(3)。在如反应路线II中所述的类似最终步骤后，使化合物(3)在碱水系统中反应，以便除去保护基官能团，随后在稍摩尔过量的情况下与染料(S0456)在水中反应，其反应时间和温度允许染料与(3)偶合，得到最终化合物(4)。
反应路线III：
上述反应路线仅示例几种非限制性合成方法，通过这些方法可以制备本文公开的化合物。本领域技术人员可以理解，能够对上述反应路线鉴定和并入变型，这些变型可以提供具有本申请范围的物理特性的另外的化合物。例如，尽管上述反应路线示例叶酸和蝶酰基作为本文公开的化合物的靶向配体，但是本领域技术人员可以理解，易于将其它靶向配体并入合成反应路线并且生成式I的可选化合物。作为另一个实例，本领域技术人员可以理解，可以通过调整聚甲炔链的长度并且选择适合的芳基或杂芳基(例如吲哚与苯并吲哚)以及连接氨基酸基团来调节化合物的染料部分的吸收/发射波长。在另一个实例中，本领域技术人员认可，可以通过如本领域一般公知的调整聚甲炔链的刚性(例如通过将环系引入聚甲炔链，例如环己烯、环丁烯酮等)改变染料的消光系数和荧光强度。因此，本领域技术人员能够通过选择适合的试剂改变合成以制备本文公开的任意化合物且能够改变该化合物的特定物理特性。
使用方法
正如上文注意到的，对于特异性地靶向至组织内的区域的近红外染料化合物存在需求。即所述化合物可以用于成像技术并且辅助疾病的诊断和治疗干预。正如上文详细讨论的，本文提供的化合物用作染料和NIR光谱区的中的成像剂。照此，所述化合物广泛适用于众多成像、诊断和靶向治疗方法。
在具体的实施方案中，本申请涉及并入本文公开的化合物的至少一种(例如式I、I(a)、I(b)、I(c)和/或I(d)的化合物)的方法，这些化合物可以用于特异性地和灵敏地鉴定组织内的肿瘤。更具体地，随即可以通过手术方法治疗性地切除所鉴定的肿瘤。按照这种方式，本申请的化合物可以用肿瘤、淋巴结等的于荧光引导的手术切除。或者，本申请的化合物易于用于全身成像，其中将所述化合物施用于受试者并且荧光定位有利于鉴定肿瘤部位。
按照这种方式，本申请的化合物可以用于有此需要的受试者的患病组织的体内鉴定。本申请的方法包括用在约600nm-约1000nm近红外范围具有至少一种激发波长的光照射包含患病组织的受试者的体内身体部位。使来源于施用于受试者且特异性地结合身体部分内的患病组织和/或被其吸收作为对至少一种激发波长的响应的本申请的化合物的荧光荧光直接显现以确定受试者的患病组织的位置和/或表面积。
具有600nm-850nm波长范围的光属于光谱的近红外范围，与可见光相对比，可见光属于约401nm-约500nm的范围。因此，用于实施本申请的诊断方法的激发光包含至少一种波长的光以便在红外波长处照射组织，从而激发化合物以便得自吸收本申请的化合物的区域的荧光清楚地显现且不同于周围组织的自体荧光。激发光可以是单色的或多色的。按照这种方式，本申请的化合物是有利的，因为它们消除了对于使用过滤机制的需求，所述过滤机制可以用于得到期望的诊断图像，只要荧光探针是在低于约600nm的波长处发出荧光。按照这种方式，本申请的化合物避免了模糊的诊断图像，这些模糊的诊断图像是作为可以从健康组织反射出的并且导致荧光图像分辨率缺失的波长的激发光的结果产生的。
可以给外科手术用手术室配备高架光，这些高架光产生在用于实施本申请的诊断方法的光学发射光谱中的光波长，例如产生适合的波长的光的灯。这种光仅可以用于通过在手术室中切换成其它光(以消除可能在研究中从身体部分的组织中反射出的可见的外部光)并且将近红外波长的激发光照入体腔或实施开放式手术来实施本申请的诊断方法，使得观察者(例如外科医师)的眼直接接收的荧光图像主要是来源于视野中的荧光团的荧光图像。来源于600nm-850nm范围、优选750nm-850nm范围的来源的光可以用于由观察者直接达到显影的目标，使得从身体部分反射出的而非来自发射荧光的部分的光被减至最少或被消除。
因此，在本工具文本的诊断方法中，使患病组织(和结合的或吸收的靶向构建体)"暴露"于激发光(例如通过手术生成的开放区或光的内窥镜递送至内部位置。本申请的公开的方法公开特别适合于位于受试者的体内部位上的患病组织的体内检测，例如天然体腔内或手术生成的开放区域内，其中患病组织是"平坦的视图"形式(即暴露于人眼)以有利于活组织检查操作或手术切除因吸收本申请的化合物而突出显示的区域。因为肿瘤组织的精确位置和/或表面积易于通过本申请的化合物的吸收确定，所以使用本申请的化合物的方法为外科医师提供了有价值的指引，该外科医师需要实时"观察"到肿块的确切外形、大小等，以便在手术进行中将其切除。
因此，在具体的实施方案中，本申请要求通过使所述组织接触包含本申请的化合物(例如式I的化合物)的组合物并且允许组合物中的化合物在组织内分布并且与叶酸受体部位发生相互作用的时间对表达叶酸受体的生物组织进行光学成像。在这种相互作用经过足够的时间后，用激发光照射组织以导致组合物中的化合物发出荧光。然后如果且其中观察到这种荧光，则将该荧光检测为包含叶酸受体的区域。
按照类似方式，本申请的化合物用于鉴定生物样品中的靶细胞类型，通过使生物样品接触这种化合物来进行，其接触时间和条件允许该化合物结合所述靶细胞类型的至少一种细胞。然后对于结合的化合物进行光学检测，使得存在的来源于本申请的结合的靶向化合物的近红外波长的荧光表示靶细胞类型存在于生物样品中。该方法由此提供所评价的组织内靶向的靶向细胞类型的图像。最优选地，所述靶向细胞类型是肿瘤细胞或肿瘤细胞已经扩散至的淋巴结。
这些方法有利地提供对受试者进行影像指导的手术的改进方法，因为以足以使化合物蓄积在指定手术部位的条件和时间施用包含本申请的化合物的组合物将有助于外科医生对待除去的组织显影。优选地，所述组织是肿瘤组织，且使所述组织吸收的化合物发出亮光有利于通过化合物的近红外荧光、使用红外光使肿瘤显影。借助于本申请的化合物靶向至肿瘤部位促进的显影，手术切除在被红外光激发时发出荧光的区域能够改善和精确地出去甚至小的肿瘤。
应当理解，在本申请的手术方法的任意种中，可以在进行手术切除之前乃至在上述暴露出手术腔和肿瘤部位之后施用它们。
如果推定的患病部位是天然体腔或手术产生的体内部位，则可以任选内窥镜装置用于将激发光递送至该部位，接收来源于体腔内该部位的荧光并且辅助来自患病组织的荧光的直接图像形成。例如，内窥镜装置中的镜头可以聚焦于检测的荧光，因为有助于图像形成。认为本文所用的这种内窥镜递送的荧光是由医师"直接观察的"，且靶向寡聚体结合或其中吸收它的组织对于内窥镜必需是"平坦的视野"形式，因为用于本申请的诊断方法的光不含透入组织的光波长，例如近红外范围的波长。或者，可以通过任意便利的方式将激发光导入体腔或包含如本文所述施用的靶向构建体的手术开放区域，且由此产生的荧光图像可以无来自内窥镜的辅助下由观察者的眼直接观察到。使用或不使用来自任意类型的内窥镜装置的辅助，通过本申请方法产生的荧光图像使得可以在没有图像加工装置的辅助下观察到该荧光图像，所述图像加工装置例如CCD照相机、TV检测器、光子采集装置等。
关注本申请的诊断或成像方法能够使得外科医师/医师通过开放式手术同时观察/观测/显示患病或异常组织，以有利于活组织检查操作或手术切除。因为患病组织的部位和/表面区域易于通过本申请的使用本文所述的化合物的诊断方法测定，所以本申请的方法对于外科医师而言是有价值的引导，所述外科医师需要知晓肿块的确切外形、大小等，以便在手术进行时切除。特别地，注意到本申请的化合物在近红外范围发出强度大于预先所述的荧光。照此，有利地，关注需要较少的该化合物实现诊断成像。此外，本申请的化合物可以透入肿瘤且由此本申请能够有利地提供除去肿瘤的更大的精确度。
本申请提供在手术过程中对需要的受试者使用诊断操作的方法，通过对该受试者施用包含本申请的化合物的组合物并且用光照射包含患病组织的受试者的体内身体部分来进行，所使用的光具有约600nm至约850nm范围的至少一种波长，从而能够直接显示来源于施用于受试者的特异性结合所述身体部分中的患病组织和/或被其吸收的靶向构建体的荧光，其中所述靶向构建体发出荧光作为对至少一种激发波长的响应，从而能够测定受试者的患病组织的位置和/表面积并且除去至少部分肿瘤组织。
在另一个实施方案中，本申请提供用于对需要的受试者的肿瘤组织进行体内诊断的方法。在该实施方案中，本申请的方法包含使得自所述受试者的肿瘤细胞样品在体外接触多种可检测到的标记的化合物，它们各自结合不同肿瘤类型或选择性地被其吸收；确定化合物与之结合或被样品肿瘤细胞吸收；施用诊断有效量的至少一种生物相容性靶向构建体，其包含已经确定与样品肿瘤细胞结合和/或被其吸收的本申请的化合物和对于约600nm至约850nm范围的至少一种光波长有响应的荧光团；和诊断体内身体部分中肿瘤组织的位置和/或表面积，通过在用提供荧光靶向构建体的至少一种激发波长的光照射时使来源于肿瘤组织内结合或被其吸收的靶向构建体的荧光直接显示来进行。
在一些实施方案中，单一类型的荧光部分依赖于从照射的身体部分生成的荧光(即来自结合患病组织或被其吸收的荧光靶向构建体)和是所述靶向构建体接触来自近红外光谱的光源。
在其它实施方案中，关注多种(即两种、三种、四种或多种)靶向构建体用于得到诊断图像。这种另外的靶向构建体可以是不同于第一种这样的本申请的另外的化合物。或者，所述另外的靶向构建体可以包含本文所述的染料，但蝶酰基部分被非叶酸受体的另一种受体的配体替代。在其它实施方案中，所述另外的靶向部分可以是其它的发出荧光的靶向构建体(例如抗体或其生物活性片段，其连接荧光团)，它们结合所成像的肿瘤或组织上的其它受体或抗原(例如动脉粥样硬化、感染、心血管疾病、神经变性疾病、免疫性疾病、自身免疫疾病、呼吸系统疾病、代谢疾病、遗传疾病、感染性疾病、骨疾病和环境性疾病等的部位)。可以使用特异性靶向肿瘤或组织上的特定部位的任意另外的靶向部分，只要它对于所监测的部位具有特异性。另外的发出荧光的靶向构建体的目的在于增加荧光在所监测部位上的强度，由此有助于检测身体部位中的患病或异常组织。例如，指定肿瘤可以具有大量标记，且除本申请的化合物外，还提供荧光部分的混合物，其对指定肿瘤具有特异性，使得来源于该肿瘤的信号由一种以上的靶向所关注的组织部位且定位于该部位的化合物或荧光部分生成。
实际上，本领域技术人员可以单独地或作为靶向可检测部分的混合物施用本申请的化合物并且能够使得这些化合物和靶向部分结合可以存在于研究部位上的任意靶向组织和/或被其吸收，且然后提供光源供给。典型地，本申请的化合物和任意另外的靶向部分可以在手术前施用一定时间，并且可以在允许本申请的荧光化合物以及任意另外的荧光构建体被靶组织吸收的组合物形式施用一定时间。
本领域技术人员能够设计依次施用的发出荧光的靶向构建体的组合，它们各自可以特异性地结合靶部位。优选用于这种混合物的发出荧光的用于鉴定靶组织的所有靶向构建体包含与本申请化合物相同波长带内或相同波长处的荧光团(例如对于本申请的化合物中的近红外光波长敏感性地发出荧光)，以便将需要用于同时激发来自用于实施本申请方法的所有不同靶向构建体的荧光的不同光源数量减至最少。然而，关注非本申请的化合物的另外的靶向部分可以发出荧光作为对与本申请的荧光化合物不同的颜色的照射光(即具有不同波长)的响应。来源于本申请的化合物和另外的靶向化合物的荧光的颜色差异可以有助于观察者确定患病组织的位置和大小。在一些实例中，期望在靶向至靶正常组织的靶向构建体中包括荧光团和靶向患病组织的本申请的化合物，使得患病组织与正常组织之间的对比进一步得到增强以便有助于观察者确定靶组织的位置和大小。除本公开为文本的化合物外这种另外的荧光团和靶向剂的应用提供如下优点：来源于正常组织的任意天然荧光被来源于靶向至身体部分内靶组织的补充靶向构建体中的荧光团的荧光掩蔽。来源于正常与靶组织的荧光之间的颜色差异越大，则对于观察者而言使靶组织的外形和大小的显影越方便。例如，包含对靶组织(即异常组织)产生来自本申请的化合物的红外光的荧光团和对健康组织产生绿色光的荧光团的发出荧光的靶向构建体有助于观察者区分靶组织与正常组织。本领域技术人员易于选择提供不同可见颜色对比的荧光团的组合。
选择用于实施本申请方法的光的光谱以包含至少一种相当于靶向构建体或靶向构建体内包含的生物相容性发出荧光的部分的主要激发波长。一般地，用于实施本申请方法的激发光包含约600nm-约850nm范围的近红外波长光的至少一种波长。
然而，当在不同波长处发出荧光的靶向配体的组合用于在本申请中实施时，激发光的光谱必须宽至足以提供用于所用荧光团各自的至少一种激发波长。例如，当选择不同颜色的荧光团以区分正常与患病组织时，特别有益的是光的是激发光谱包括靶向至正常和靶组织的荧光团的激发波长。
正如本文注意到的，本申请的化合物通过作为本申请的化合物的部分的蝶酰基或叶酸配体特异性地靶向至叶酸受体。在其中使用另外的靶向部分的实施方案中，选择这种另外的靶向部分的靶向构建体以结合所关注靶组织和/或特异性地被其吸收，例如结合特征在于靶组织内的疾病或异常状态的细胞上或其内的抗原或其它表面特征。正如在其它诊断试验中，期望靶向构建体选择性地结合靶组织或被其吸收或结合与疾病或异常状态相关的抗原；然而，包含也结合健康组织或细胞结构或被其吸收的配体部分的靶向构建体可以用于实施本申请的方法，只要在视野中靶组织中的抗原浓度或靶向构建体对靶组织的亲和力足够大于对健康组织，使得代表靶组织的荧光图像可以清楚地在视野中显示为不同于来源于健康组织或结构的任意荧光。
例如，结肠癌的特征通常在于存在癌胚抗原(CEA)，而这种抗原也结合健康个体中的一些组织。然而，CEA在癌性结肠组织中的浓度通常大于在健康中发现的浓度，因此，抗-CEA抗体可以用作本申请实施中的配体部分。在另一个实例中，脱氧葡萄糖被健康组织吸收和利用至不同程度，而其在健康组织(除外一些已知的器官)例如心脏中的代谢基本上低于在肿瘤中的代谢。脱氧葡萄糖在体内消耗的已知模式由此可以用于辅助确定那些其中脱氧葡萄糖令人意外的高吸收发出存在肿瘤细胞的信号的区域。
本申请方法检测的疾病或异常状态可以是任意类型，其特征在于对于已知特异性结合配体存在已知的靶组织。例如，不同心脏病的特征在于对于已知特异性结合配体产生坏死或缺血性组织或产生动脉粥样硬化组织。作为另一个示例性实例，乳腺癌的特征在于产生由针对CA15-3、CA19-9,CEA或HER2/neu的单克隆抗体鉴定的癌组织。关注靶组织的特征可以在于产生已知结合配体所针对的表面抗原或胞内标记(即抗原)的细胞，因为许多靶向构建体透入细胞膜。可以使用本申请方法鉴定的有代表性的疾病状态包括例如不同类型的肿瘤、细菌、真菌和病毒感染等这样的不同病症。本文所用的"异常"组织包括癌前状态、坏死或缺血性组织和与结缔组织疾病和自身免疫疾病相关的组织等。此外，适合于使用本申请方法诊断或检查的靶组织的类型的实例包括心脏、乳腺、卵巢、子宫、肺、内皮、血管、胃肠道、结肠直肠、前列腺组织、内分泌组织等及其任意两种或多种的组合。
单纯地作为实例，一些常见恶性肿瘤的抗原和通常发现它们的身体部位是本领域技术人员已知的，且靶向配体例如抗体或用于这些抗原的抗体或实际上其中抗原是受体的配体是本领域已知的。例如，CEA(癌胚可以)通常在来自结肠、乳腺和肺的肿瘤中发现；PSA(前列腺特异性抗原或有时称作前列腺特异性膜抗原(PSMA))对前列腺癌具有特异性；CA-125通常在卵巢癌来源的肿瘤中发现；CA15-3、CA19-9、MUC-1、雌激素受体、孕酮受体和HER2/neu通常在乳腺癌中发现；甲胎蛋白在睾丸和肝癌肿瘤中发现；β-人绒毛膜促性腺素在睾丸癌和绒毛膜癌中发现；雌激素受体和孕酮受体也在子宫癌肿瘤发现；且表皮生长因子受体通常在来自膀胱癌的肿瘤中发现。其它肿瘤特异性配体和标记是本领域技术人员众所周知的。在优选的实施方案中，本申请使用用于靶向叶酸受体的叶酸或蝶酰基部分和用于靶向使染料靶向至癌细胞的PMSA靶向部分。
关注可以使用本文所述的染料靶向任意这些通常已知的肿瘤标记(通过将蝶酰基部分变换成特异性靶向这些标记的部分)，或者，还和与使用本申请的化合物靶向的叶酸受体组合靶向这些标记。正如上文讨论的，特别有利的是在指定肿瘤上具有针对几种个不同标记的靶向部分以用作诊断混合物，其中靶向几种标记至更明亮和更清楚地使肿瘤显影的程度。
除化学化合物外，这种混合物中的靶向部分还可以包括蛋白质或多肽，例如抗体或其生物活性片段，优选单克隆抗体。用于实施本申请方法的补充靶向构建体还可以是或包含用荧光团标记的多克隆或单克隆抗体。本申请中所用的术语"抗体"包括完整的分子及其功能性片段，例如能够结合表位决定簇的Fab,F(ab')2和Fv。制备这些片段的方法是本领域公知的(参见，例如Harlow&Lane,Antibodies：ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1988，引入本文参考)。作为在本申请中使用的，术语"表位"是指抗体互补位结合的抗原上的任意抗原决定簇。表位决定簇通常由分子例如氨基酸或糖侧链的化学活性表面定群组成且通常具有特定的三维结构特征以及特定电荷特征。
除抗体外，所述混合物还可以包含这样的化合物，其中连接至荧光靶向构建体的配体部分选自许多生物相容性化合物，其可以特异性地结合受体和/或优先被肿瘤细胞吸收且可以用作本申请的靶向构建体中的配体部分。优先被肿瘤细胞"吸收"的化合物可以通过表面或核受体(例如激素受体)、孔、细胞脂双层中的亲水性"窗"等进入细胞。
靶向肿瘤的这种类型的化合物的示例是促生长素抑制素、促生长素抑制素受体-结合肽类、脱氧葡萄糖、甲硫氨酸等。特别有用的促生长素抑制素受体-结合肽类是促生长素抑制素的长效八肽类似物，称作抑生长肽(D-苯丙氨酰基-L-半胱氨酰基-L-苯丙氨酰基-D-色氨酰基-L-赖氨酰基-L-苏氨酰基-N-[2-羟基-1-(羟甲基)丙基]--L-半胱酰胺环(2→7)-二硫化物)；兰瑞肽，即抑生长肽的口服制剂；P829；P587等。促生长素抑制素-结合肽类公开在美国专利US5,871,711中，且使这种肽通过其羧基末端氨基酸在还原条件下共价连接至放射性同位素的方法公开在美国专利US5,843,401中，将这两篇文献完整地引入本文参考。本领域技术人员用于采用这种教导通过在放射性同位素处用本申请的发出荧光的部分取代制备荧光敏感性促生长素抑制素受体-结合肽类。
当疾病状态是神经内分泌或内分泌肿瘤时，促生长素抑制素和促生长素抑制素受体-结合肽类特别有效地用作靶向构建体中的靶向肿瘤的配体部分。可以使用本申请方法诊断的神经内分泌肿瘤的实例包括腺瘤(产生GH和产生TSH)、胰岛细胞瘤、类癌、分化不良型神经内分泌癌、小细胞和非小细胞肺癌、神经内分泌癌和/或中间细胞癌、卵巢、宫颈、子宫内膜、乳腺、肾、鼻旁窦和唾液腺的神经内分泌瘤、脑膜瘤、分化良好型胶质衍生的肿瘤、嗜铬细胞瘤、神经细胞瘤、神经节成神经细胞瘤、副神经节瘤、甲状腺细胞中的乳头状癌、乳头状癌和髓样癌、Merkel细胞癌和黑素瘤以及肉芽肿和淋巴瘤。已知这些肿瘤具有促生长素抑制素受体且可以使用促生长素抑制素或促生长素抑制素身体结合肽类作为本申请荧光靶向构建体中的靶向肿瘤的配体靶向。
用于VIP受体闪烁造影术的血管活性肠肽(Vasointestinalpeptide)(VIP)(I.Virgolini,EurJ.Clin.Invest.27(10):793-800,1997也用于本申请的方法，以便诊断小型原发性腺癌、肝转移和胃肠道的一些内分泌肿瘤。
可以被肿瘤优先吸收的靶向肿瘤的配体的另一个分子示例是脱氧葡萄糖，已知其优先在各种不同类型的中被吸收。可以使用脱氧葡萄糖作为靶向肿瘤的配体检测的肿瘤类型包括黑素瘤、结肠直肠和胰腺肿瘤、淋巴瘤(HD和NHL)、头颈肿瘤、卵巢癌、乳腺癌和脑癌(高级和垂体腺瘤)、肉瘤(等级依赖性)、肝细胞瘤、睾丸癌、甲状腺(等级依赖性)小细胞肺癌、膀胱癌和子宫癌等。
可以用于本申请的混合物中的其它靶向肿瘤的化合物包括1-氨基-环丁烷-1-羧酸和L-甲硫氨酸。L-甲硫氨酸是蛋白质合成所必需的必需氨基酸。已知恶性肿瘤细胞改变甲硫氨酸代谢并且需要外部来源的甲硫氨酸。
特异性结合肿瘤受体和/或优先被肿瘤细胞吸收的生物相容性靶向肿瘤的化合物的另外的实例包括哺乳动物激素，特别是性激素、神经递质和由肿瘤细胞表达以便彼此沟通被肿瘤细胞优先吸收的化合物，例如来源于染色体改变例如克隆内的转移或翻转的新的分泌蛋白构建体。
激素包括性激素。细胞生长激素、细胞因子、内分泌激素、红细胞生成素等也充分地用作肿瘤靶向部分。正如本领域公知的，许多肿瘤类型表达激素例如雌激素、孕酮、雄激素例如睾酮等的受体。这种激素优先被肿瘤细胞吸收，例如通过特异性受体。
用于实施本申请方法的靶向构建体和补充靶向构建体可以通过本领域技术人员公知的任意途经施用，例如通过局部、关节内、池内、眼内、心室内、向鞘内、静脉内、肌内、腹膜内、皮内、气管内、腔内等以及通过它们的任意两种或多种的任意组合。
最适合的施用途经根据所治疗的疾病状态或所诊断的疑似病症或肿瘤的位置的不同而改变。例如，为了治疗炎性病症和不同肿瘤，局部施用包括通过直接注入激发光照射的身体部位施用(例如通过腔内)提供如下优点：可以以高浓度施用靶向构建体(例如荧光标记的抗体)，没有可能随其全身施用附带的并发症风险。
可以以"有效量"施用本申请的化合物和包含本申请的化合物的诊断混合物中使用的任意另外的靶向构建体用于诊断。有效量是有助于使位于受试者的研究中的身体部分内的任意靶组织直接显影必不可少的靶向构建体用量。关注作为本文所用的术语"受试者"包括任意的哺乳动物，例如家养宠物、农场动物或动物园动物，但优选是人。有效地用于诊断应用的量当然根据所研究的身体部分的大小和位置、靶向构建体对于靶组织的亲和力、靶组织的类型以及施用途经的不同而不同。靶向构建体的局部施用典型地需要小于任意全身施用模式的剂量，不过，在一些情况中，靶向构建体的局部浓度在局部施用后高于全身施用时安全达到的浓度。
由于个体受试者可能呈现症状严重性的广泛变化且每种靶向构建体具有其独特的诊断酮特征，包括靶向构建体对靶标的亲和力、靶向构建体被身体过程的清除速率、其中包含的荧光团的特性等，所以本领域技术人员将加权所述因素并且由此改变剂量。
可以根据公知方法、使用适合的分散剂或湿润剂和助悬剂将本申请的化合物和包含这些化合物的混合物配制成无菌可注射混悬液。无菌可注射制剂还可以是在无毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如为在1-4,丁二醇中的溶液。无菌固定油常用作溶剂或助悬介质。对于该目的，可以使用任意温和的固定油，包括合成单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类、脂肪酸(包括油酸)、天然存在的植物油如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等或合成脂肪媒介物如油酸乙酯等。可以根据需要掺入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等，或它们可以包含在制剂中。
本领域技术人员显而易见，可以在不脱离其范围的情况下在本申请中进行各种改变，且由此本申请除本说明书中具体地公开的那些外海包括如待批权利要求中显示的那些。
提供下文的实施例仅用于示例本申请的具体实施方案的目的，而不预以限定待批权利要求的范围。正如本文所讨论的，可以按照不同方式改变所公开的化合物和方法的具体特征，这些不同方式所提供的不一定具有可操作性或优点。例如，化合物可以并入各种氨基酸和氨基酸衍生物以及靶向配体，这取决于所用化合物的具体用途。本领域技术人员可以理解，这种变型包括在待批权利要求范围。
实施例
实施例1：以肿瘤为靶的近红外染料在荧光指导的手术中的开发
完全手术切除恶性肿瘤疾病是癌症中唯一可靠的干预方法。令人遗憾地，定量肿瘤切除通常受限于外科医师定位所有的恶性肿瘤疾病和将其与健康组织区分开的能力。荧光指导的手术已经显示为辅助外科医师鉴定和除去恶性肿瘤损害的工具。尽管已经证实非靶向荧光染料被动地蓄积在一些肿瘤中，但是得到的肿瘤与背景之比通常较差且难以确定恶性肿瘤与健康组织之间的边界。为了防止这些问题，本申请显示开发该亲和力靶向配体，其结合在癌细胞上超表达的受体并且将连接的分子选择性地递送入这些细胞。
在本实施例中，应用两种肿瘤特异性靶向配体(即叶酸，其靶向叶酸受体(FR)以便将近红外(NIR)荧光染料特异性地递送至表达FR的癌症，由此仅赋予恶性肿瘤细胞明显的荧光。本实施例显示检查的所有FR-靶向的NIR染料以低纳摩尔范围结合培养的癌细胞。此外，当静脉内注入具有肿瘤的带有转移性疾病的小鼠时，这些相同的配体-NIR染料缀合物给表达受体的肿瘤组织传递荧光，从而能够便利地切除，而对健康组织的污染减少到最低限度。
1A：材料和方法
本实施例中显示的结果使用本文上述的特定材料和方法得到。关注本领域技术人员能够改变这些方法、反应条件和测试条件，且仍然产生显示本申请FR-靶向的NIR染料的效能的结果。
a.叶酸-NIR缀合物的合成和表征.如上述文献中报道的合成所有配体和连接基。纯化后，如图1、5和8中所示使靶向叶酸的配体育选择的NIR染料缀合。使用反相制备型HPLC[Waters,xTerraC1810μm；19x250mm；λ＝280nm；溶剂梯度：0-30％或80％B，30min运行，A＝10mMNH4OAc的水缓冲液(pH＝7.0)，,B＝乙腈(ACN)]纯化染料缀合物。使用LC-MS(ESI)质谱法(Waters,X-BridgeC185μm；3.0x15mm)分析纯化的化合物。
b.表达叶酸受体的细胞系的培养.L1210A细胞得自ManoharRatnam博士且KB细胞得自美国模式培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC；Rockville,MD)。在补充了10％热灭活胎牛血清(HIFBS)、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的叶酸缺乏1640RPMI培养基中培养细胞。在37℃在5％二氧化碳、95％空气加湿气氛中培养全部细胞系。
c.通过荧光测定法分析叶酸-NIR染料缀合物的几何亲和力和特异性.将KB(200,000细胞/孔，500μL)接种入24-孔培养板，使其在48h内形成单层。用包含递增浓度的叶酸-NIR染料缀合物的新鲜培养基(0.5mL)在100-倍过量的竞争性配体即叶酸的存在下或在其不存在下替代每个孔中的消耗的培养基。在37℃下温育1小时后，用溶于1％SDS水溶液(0.600mL)的新鲜培养基(3×0.5mL)冲洗细胞，通过转移至石英比色池测定荧光，使用AgilentTechnologiesCaryEclipse荧光发光光度计分析在每种染料最大激发和发射除的荧光发射强度。通过使用GraphPadPrism4.03绘制荧光发射单位与添加的靶向近红外染料浓度关系的示意图计算缀合物的解离常数(Kd)。
d.体内小鼠转移模型.经普度动物护理和应用委员会(PurdueAnimalCareandUseCommittee)批准进行全部动物操作。为了进行牵涉表达FR的肿瘤的研究，5-6周龄雌性DBA/2小鼠购自HarlanLaboratories(Indianapolis,IN)，将在进行每次研究前和过程中其置于叶酸缺乏膳食上2周。通过使用30号针头将1x106L1210A(表达FR)细胞注入心脏的左心室诱发瘤转移。使肿瘤发育4周，此后，通过静脉内给动物注射10nmols的溶于100μl盐水的期望的FR-靶向的NIR染料。4小时后，通过CO2窒息处死动物，如下所述成像。
e.具有转移性疾病的小鼠的荧光成像.使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIvisLuminaIIImagingStation进行动物成像实验。用于成像AlexaFluor647和DyLight680缀合物的设置：灯的等级：高；激发：605；发射：Cy5.5；epi照明；框并法：(M)4；FOV＝7.5；f-终止＝4；获取时间＝1s。用于成像DyLight750和IR800CW缀合物的设置：灯的等级：高；激发：745；发射：ICG；epi照明；框并法：(M)4,FOV＝12.5；f-终止＝4；获取时间＝1s.
f.正常和患病组织的H&E染色.成像后，解剖器官，储存在5ml福尔马林中，送入PurdueHistology&PhenotyingLaboratory进行H&E染色。简言之，使用SakuraTissue-TekVIP6处理组织样品，使用ThermoFinesseME切片机切片，用H&E试剂、使用ShandonVari-Stain24-2自动染色器染色。然后使用带有OlympusDP70照相机的OlympusBH-2研究显微镜使H&E染色的载玻片显像。
B.结果
a.以肿瘤为靶的NIR染料的合成.为了选择性肿瘤靶向，发明人使商购的NIR与叶酸缀合。合成了高收率的大部分叶酸-NIR染料缀合物，随后使用HPLCs将其纯化至均匀。
b.靶向NIR染料的结合亲和力和特异性.因为连接至配体的负荷通常可以干扰配体结合，所以有益的是测试叶酸-NIR染料缀合物与表达FR的癌细胞的结合亲和力。发现所有缀合物的结合亲和力在低纳摩尔范围(图2)，其中根据连接的染料的不同有一些变化，这启示连接的负荷仅适度地影响配体结合。还通过添加过量叶酸在体外测定了叶酸-NIR染料缀合物对其受体的特异性。正如在图2中观察到的，通过与100-倍摩尔过量的叶酸一起温育接近定量地抑制了结合。
c.以肿瘤为靶的NIR染料的体内成像.在体内肿瘤靶向染料的肿瘤特异性评价之前，有益的是比较在通过组织激发时选择的染料的强度。为了该目的，将包含100nM每种染料(AlexaFluor647、DyLight680、DyLight750、IR800CW)的1mL磷酸缓冲盐水放入埃彭道夫管，然后将其放置在1cm厚度新鲜猪肌肉切片下，在相同条件下在KodakImageStation和IVISLuminaImager中使得到的组织显像，对于每种染料在每种仪器中始终仅选择最佳激发和发射波长。IR800CW产生最亮荧光信号，而DyLight750产生中间强度的信号，AlexaFluor647和DyLight680展示出最弱的荧光。
为了比较上述叶酸-NIR染料缀合物检测体内转移瘤根瘤的能力，研发了肿瘤转移鼠模型，其牵涉心内注射106L1210A细胞(表达FR的细胞)，然后正常饲养小鼠4周，以使初生肿瘤生长。然后用10nmol选择的叶酸-NIR染料缀合物通过尾静脉注射治疗具有肿瘤的小鼠，4小时后对小鼠实施安乐死，用于荧光成像。正如图3中观察到的，肿瘤部位易于区分，在荧光癌症根瘤与相邻健康组织之间产生强烈对比。在一些情况中，甚至可以在完整小鼠的图像中观察到荧光肿瘤(图3，上部组)，然而，由于肿瘤大小、位置和深度的差异，所以不能明确地确立NIR染料在完整动物中产生最佳图像。
最终，为了模拟有活力的外科手术环境，分阶段进行荧光肿瘤组织切除，其中首先除去最大的肿块，在清除更明显的荧光肿块之后切除较小的恶性肿瘤部位(图4)。有益地，除去原发性肿块通常暴露出继发性转移灶，其在初始手术循环之前不显示，在没有肿瘤特异性荧光的辅助下可能无法观察到。在这些多循环切除后，当除去所有可见荧光时，对切除的组织进行组织学分析，这些研究揭示出所有荧光根瘤实际上是恶性的。有益地，其余组织的随机采样显示非荧光区域是非恶性的(图4d)，这启示借助于以肿瘤为靶的荧光染料显而易见定量地除去了癌症损害。
C.讨论
用于荧光指导的外科手术的第二种方法牵涉使NIR染料与肿瘤特异性靶向配体缀合，所述配体积极地结合癌细胞并且从大部分健康组织中定量地清除。这种方法的优点包括：i)肿瘤显影的快速速率，这归因于染料的吸收和正常组织清除可以在静脉内注射的数分钟内发射这一事实；ii)肿瘤造影的稳定性，这归因于配体-染料缀合物通常由癌细胞通过受体介导的胞吞摄入这一事实；iii)无论靶向受体是不存在、弱表达还是无法达到正常组织都具有荧光特异性；和iv)不存在来自恶性肿瘤的荧光“流”入非恶性肿瘤组织，这归因于配体-染料缀合物对其受体的高亲和力，产生清楚地区分癌症的高度确定的边界。该策略的缺点来源于如下事实：配体-靶向的染料始终有荧光，甚至在排泄过程中，从而阻碍了肾和膀胱肿瘤的成像，直到染料的排泄完全为止。
从这些研究产生的一个两人惊奇的结果是易于在体内检测到较小尺寸的恶性肿瘤损害。因此，对具有穿刺的转移性疾病的几个部位的更详细分析揭示出，可以使用较高分辨率的光学仪器使小至50μm的癌细胞簇显影。因为甚至几个细胞的团簇最终可以导致癌症复发，所以检测和除去甚至最小转移病灶的能力最终可能导致患者的死亡率降低，从而推断可以设计适合的照相机。
在发现荧光指导的外科手术的大部分应用可持续地被发现的同时，该项技术的一些应用已被关注。首先，因使肿瘤块更好地显影而能够鉴定和切除更多的恶性肿瘤损害。第二，在其中最大限度地保护正常组织是必需的情况中(即脑癌、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌等)，谨慎地消刮荧光损害，直到无荧光保留为止，这能够更有效地保护健康组织。第三，通过腹腔镜检查查找荧光损害的近端淋巴结最终能够对癌症患者进行术前分期，从而在清楚地观察到明显的转移灶时排除对于手术的需求并且随后在仅检测到单一肿瘤块时消除对于前哨淋巴结手术采样的需求。
总之，本实施例显示以肿瘤为靶的NIR染料通过改善恶性肿瘤组织的显影具有改造标准外科手术操作的潜能，从而导致更完全和精确地除去患病组织并且改善患者预后。
实施例2：具有高度靶向亲和力并且对于荧光指导的癌症手术具有灵敏度的最佳叶酸缀合的近红外荧光探针物的设计和合成
尽管使用复杂的工具一样肿瘤鉴定，但是许多恶性肿瘤根瘤仍然逃过检测，导致疾病复发且通常导致死亡。根据对改善的肿瘤鉴定的需求，已经引入了用于手术中使恶性肿瘤疾病显影的新方法。在第一种方法中，将猝灭的荧光染料经全身注入带有肿瘤的动物，利用因肿瘤特异性酶、pH改变或氧化还原电位改变释放的猝灭部分选择性地活化恶性肿瘤块内的荧光。在第二种方法中，使荧光染料与肿瘤特异性靶向配体缀合，导致连接的染料蓄积在超表达配体受体的癌症中。用于这种后面的目的的肿瘤靶向配体的实例包括叶酸，其显示对卵巢、肾、肺、子宫内膜、乳腺和结肠的叶酸受体(FR)阳性癌症的特异性。有益地，近期已经在人卵巢癌患者的手术进行中测试了叶酸-靶向的荧光染料(叶酸-荧光素或EC17)。在该研究中，借助于以肿瘤为靶的荧光染料除去了高于不使用它～5X以上的恶性肿瘤损害，通过病理学证实所有切除的荧光损害均为恶性的。
令人遗憾地，使用上述临床研究的主要缺陷来源于如下事实：连接的染料(荧光素)发射在可见范围的荧光，即其中自体荧光强且光难以透入组织。因为近红外(NIR)区内的光几乎不诱导自体荧光且非常更有效地透入组织，所以发明人推定，如果NIR染料用于指导外科手术，则更完全地切除肿瘤是可能的。不过，存在的商购NIR荧光团数量有限且主要基于通过每个制造商特别修饰的花菁化学结构(图6)。幸运地，荧光团系列各自作为反应性荧光团产生，其易于与所关注的蛋白质或配体缀合，特异性地用于通过共轭化学体内靶向。大部分商购实验用NIR荧光团作为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯类得到，其可以用于在N-末端胺上的荧光团缀合。为了评价和坚定用于影像指导的癌症外科手术的最佳叶酸缀合的NIR探针，发明人已经使耐光稳性NHS酯NIR染料(如下的化合物a-c)与N-末端胺官能化的叶酸缀合(Fol-EDA和Fol-Lys)，得到预计的NIR探针(1a-c和2a-c)与主要的消除副产物(1e-g和2e-g)。为了得到提高的收率，使用更稳定的NIR染料LS288NHS酯(d)，分离具有良好收率的叶酸缀合的NIR染料1d和2d。表征合成的叶酸-NIR探针1a-d和2a-d的光线性能和耐光性。
相同浓度的所有叶酸-NIR探针1a-d和2a-d(500L；5M，在PBS中)的荧光激发和发射光谱显示几乎类似的强度。通过体外细胞实验研究所述探针的细胞毒性和叶酸受体亲和力，在5组带有FR+KB肿瘤异种移植物的裸鼠中研究体内肿瘤靶向能力，还使用LuminaII近红外荧光成像系统检查生物分布。令人遗憾地，以合成有利的图6化合物1d和图7化合物2d的探针叶酸-NIR的高收率方式显示的生物分布在肿瘤上的荧光强度亮度低于图6化合物1a-c和图7化合物2a-c的其它叶酸-NIR探针2倍。
根据所述结构，有益的变化在于在中心插烯环己烯碳(C(sp2))上被NIR染料a-c上的酚部分取代(SNR1)，而NIR染料d上的苯基部分也带有其相应的最终叶酸-NIR探针。上述这些原因归因于发明人研发了新的修饰的叶酸-NIR探针，其在生理pH下具有耐光性、选择性、灵敏性和高度荧光强度。
为了解决所述问题，总体策略在于选择作为商购前体NIR荧光团的S0456应包含用于溶解性的4个SO3H基团和在荧光团中间用于耐光性的刚性环己烯环和连接酚氧的插烯环己烯氯化物(C(sp2)Cl)，这有益于在体内肿瘤成像方面的高灵敏性和明亮荧光。此外，已经研究了对于叶酸结合袋的叶酸受体配体的结构需求来改善配体与受体的结合亲和力和选择性。尚未建立叶酸受体的晶体结构，蝶酸即缺乏远端谷氨酰基残基的叶酸碎片对于结合高亲和力叶酸受体足够良好这一事实存在争议。为了确定谷氨酰基残基上的-羧酸对于结合叶酸受体是否有益，发明人合成了不同氨基酸和非氨基酸蝶酰基缀合物及其NIR探针。接下来，发明人比较了所有这些新修饰的叶酸-NIR探针的与野生受体阳性癌(cancel)细胞的体外结合亲和力和使用叶酸受体阳性KB肿瘤的体内成像(imaing)。有意义地，发明人未观察到结合亲和力的显著改变，而在肿瘤特异性和荧光强度方面存在显著改变。本研究与所有叶酸-NIR缀合物一致且启示谷氨酰基残基上的-羧酸有益于肿瘤特异性靶向、吸收，且NIR染料中的中心插烯环己烯碳(C(sp2))上的酚氧取代有益于肿瘤组织的高荧光强度。因此，迫切地需要研发更简单和更直接的策略以得到用于影像指导的癌症外科手术的最佳的新修饰的叶酸-NIR荧光探针。发明人设计并且合成了灵敏的、耐光的和肿瘤选择性的新修饰的叶酸-NIR荧光探针(蝶酰基-Tyr-S0456；图6)，其具有用于临床应用的高荧光强度。
在本实施例中，发明人设计具有增强的荧光强度和耐光性的以叶酸受体为靶的近红外荧光探针(蝶酰基_Tyr_S0456)。显示具有明亮荧光强度的叶酸受体-超表达的肿瘤的高靶向能力。这种新蝶酰基_Tyr_S0456缀合物改善了所述探针在小鼠受试者中的动力学并且增强了对FR超表达的肿瘤的靶向能力和灵敏性。本实施例中的结果显示这种新的NIR探针在诊断早期阶段肿瘤中具有巨大的潜能。
实施例3
OTL-0001(FA-EDA-LS288)、OTL-0002(FA-EDA-IR800)、OTL-0003(FA-EDA-ZW800)和OTL-0004(FA-EDA-Kodak2)的对比分析
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸鼠(5周龄,18-20g)购自Harlan(IN)并且将其维持在γ-照射的叶酸-缺乏特定膳食(Teklad,WI)上至少2周，然后开始本研究。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水。使动物寄居在标准12h光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
全身成像：
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在无叶酸的RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(2只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的测试制品(FA-EDA-LS288、FA-EDA-IR800、FA-EDA-ZW800和FA-EDA-Kodak2)。2h后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件(PerkinElmerInc,MA)的CaliperIVISLuminaIIImagingStation进行全身成像(完整肿瘤)实验。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：830nm；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
组织生物分布：
全身成像后，解剖动物，如上所述使用IVIS成像器分析选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤、肿瘤)的荧光活性。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：830nm；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
结果：
全身成像：正如图7a中观察到的，FA-EDA-LS288、FA-EDA-IR800和FA-EDA-ZW800主要蓄积在叶酸受体阳性肿瘤中，在其它组织中基本上无荧光活性。然而，FA-EDA-Kodak2未蓄积在肿瘤中。此外，直接比较显示FA-EDA-IR800注射的小鼠的肿瘤荧光强度比用其它叶酸-缀合的近红外IR染料治疗的小鼠的荧光强度明亮(更高的荧光强度)(图7b)。
结论：
从最佳到最弱列出的缀合物的亮度和特异性如下：FA-EDA-IR800、FA-EDA-ZW800、FA-EDA-LS288、FA-EDA-Kodak2。包含IR800和ZW800的缀合物显示最高的肿瘤蓄积荧光，而包含Kodak的缀合物显示对肿瘤的极低特异性。在Kodak缀合物中观察到的低荧光可能归因于染料在800nm激发这一事实。IVIS图像系统不具有在800nm激发的过滤器，由此在肿瘤中的低荧光可以归因于使用弱的激发波长。
实施例4：以叶酸受体为靶的近红外染料的全身成像和生物分布
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸鼠(5周龄,18-20g)购自Harlan(Indianapolis,IN)并且将其维持在γ-照射的叶酸-缺乏特定膳食(Teklad,WI)上至少2周，然后开始本研究。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水和食物。使动物寄居在标准12h光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
全身成像：
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在无叶酸的RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(2-3只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的测试制品。2h后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件(PerkinElmerInc,MA)的CaliperIVISLuminaIIImagingStation进行全身成像(完整肿瘤)实验。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG830nm；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
组织生物分布：
全身成像后，解剖动物，如上所述使用IVIS成像器分析选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤和肿瘤)的荧光活性。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(830nm)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
结果：
全身成像：
正如图1中观察到的，FA-EDA-LS288、FA-EDA-IR800和FA-EDA-ZW800主要蓄积在叶酸受体阳性肿瘤中，在其它组织中基本上无荧光活性。此外，直接比较显示FA-EDA-IR800注射的小鼠的肿瘤荧光强度比用其它叶酸-缀合的近红外IR染料治疗的小鼠的荧光强度明亮(更高)(图2)。
组织生物分布：
在相同条件下通过对每只小鼠实施安乐死、取出其器官并且使用IVIS成像器对其成像对动物进行组织生物分布分析。正如在图2中观察到的，在FR-阳性肿瘤和肾中观察到最高荧光强度。肾吸收是预期的，因为已知肾的近端小管的顶端膜表达高水平的叶酸受体。此外，可能的情况是，探针通过肾排泄，这归因于其低分子量和半衰期(大部分叶酸缀合物具有<30min的半衰期)。
结论：
从最佳到最弱列出的缀合物的亮度和特异性如下：FA-EDA-IR800、FA-EDA-ZW800、FA-EDA-LS288、FA-EDA-Kodak2。包含IR800和ZW800的缀合物显示最高的肿瘤蓄积荧光，而包含Kodak的缀合物显示对肿瘤的极低特异性其与其它相比的低荧光。
A.材料和方法
使用本文所述的材料和方法得到本实施例中所示的结果。关注本领域技术人员能够改变这些方法、反应条件和测试条件，且仍然产生显示本申请的FR-靶向的NIR染料的效能的结果。
a.叶酸-NIR缀合物的合成和表征.基本上如实施例1中所述合成和表征叶酸NIR缀合物。
b.叶酸-NIR缀合物(4)对FR的相对结合亲和力.将超表达FR-α的KB细胞接种在24-孔(100,000细胞/孔)的Falcon培养板上，使其在24h期限内形成单层。在递增浓度(0.1nM-1μM)的测试制品或叶酸的存在下在新鲜培养基(0.5mL)中用10nM[3H]-叶酸替代每个孔中消耗的培养基。在37℃温育1小时后，用PBS(2x0.5mL)和1M三氯乙酸(1x0.5mL)冲洗细胞以除去任何未结合的放射性材料。在添加在PBS中1％的十二烷基硫酸钠(0.5mL)后，将细胞转入各自包含Ecolume闪烁混合物(3.0mL)的闪烁小瓶,中，用a.液体闪烁分析仪计数。使用细胞结合的放射性与测试制品浓度关系的示意图、应用GraphPadPrism4计算相对结合亲和力。
c.体内皮下肿瘤异种移植物的小鼠模型.给5周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在RPMI培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在两个垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L为最长轴，W轴垂直于L，单位为毫米)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则用在磷酸缓冲盐水(100μL)中的以叶酸受体为靶的NIR染料缀合物(10nmol)治疗动物。2h后，通过CO2窒息对动物处死动物，如下所述成像。
d.具有FR+KB肿瘤的小鼠的荧光成像.使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation进行动物成像实验。用于使AlexaFluor647和DyLight680缀合物成像的设置：灯的等级：高；激发：605；发射：Cy5.5；epi照明；框并法：(M)4,FOV＝7.5；f-终止＝4；获取时间＝1s。用于使DyLight750和IR800CW缀合物成像的设置：灯的等级：高；激发：745；发射：ICG；epi照明；框并法：(M)4,FOV＝12.5；f-终止＝4；获取时间＝1s。
B.结果
a.以肿瘤为靶的NIR染料的合成.为了选择性肿瘤靶向，发明人使用NHS活化的染料或Williamson醚合成反应、使用NIR染料的氯-衍生物使商购NIR染料与叶酸或蝶酸盐通过酰胺键缀合。以极高收率(>98％)合成了Pte-氨基酸-NIR、尤其是酪氨酸，不使用任何HPLC或专用纯化技术(通过沉淀)，且纯度极高(>98％)。本文鉴定的氨基酸是酪氨酸及其类似物、胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸等。所用的NIR染料是S0456、Kodak、S0121和S2076(不限于此)。然而，叶酸的醚桥连的NIR缀合物例如叶酸-IR800CW(3)和叶酸-ZW800(5)的合成导致产生大量副产物(图10B)，其需要专用的纯化技术，例如HPLC，由此导致生产成本较高且增加了前期临床到临床转化的时间期限。这不仅影响肿瘤外科手术的进步，而且影响等待新治疗剂的患者。此外，较高的生产成本可能间接地影响患者及其保险提供者，这归因于药物的成本增加。重要地，Pte-Tyr-S0456反应不产生任何不期望的副产物，且反压在15min内完成，收率高且纯度高(图10A)。
b.以叶酸受体为靶的NIR染料的结合亲和力和特异性.首先使用超表达叶酸受体的癌(KB)细胞评价叶酸-和蝶酸盐-NIR缀合物的亲和力和特异性。使用氚代叶酸(放射性标记的叶酸)的竞争性研究显示叶酸-或蝶酸盐-NIR缀合物不仅以高亲和力(低纳摩尔值)、而且以高特异性(图6)结合叶酸受体。使用氚代叶酸(放射性标记的叶酸)的竞争性研究显示Pte-Tyr-S0456以高亲和力和特异性结合叶酸受体，这启示大S0456部分通过酚氧缀合不含损害Pte-Tyr与叶酸(flote)受体结合。
c.体内以肿瘤为靶的NIR染料的成像.为了比较上述叶酸-NIR染料缀合物检测肿瘤的能力，研发异种移植物模型，这牵涉皮下植入KB细胞(表达FR的细胞)，随后正常控制小鼠4周，以使新生肿瘤生长。然后用10nmol的选择的叶酸-NIR染料缀合物通过尾静脉注射治疗带有肿瘤的小鼠，2小时后对小鼠实施安乐死，用于荧光成像。正如图7A中观察到的，易于区分肿瘤位置，在荧光癌症根瘤与相邻健康组织之间产生强对比。最重要地，甚至在未打开或采集肿瘤的完整小鼠的图像中也观察到完整荧光的肿瘤(图7A)。第二代以叶酸受体为靶的NIR试剂的头对头全身荧光成像研究显示叶酸-IR800CW(3)与所有其它染料竞争(在荧光亮度方面)(图7A,第二代粗品)。然而，令人遗憾地，叶酸-IR800CW(3)在合成过程中不温度，导致形成超过60％的不期望的副产物。如上所述，这将导致找到特定的纯化技术，其显示较高生产成本的路径、对于临床转化的更长等待期限，且外科医师和患者无法得到该药物。
为了建立体内特异性，在带有叶酸受体阳性肿瘤异种移植物的小鼠肩上施用Pte-Tyr-S0456。体内全身成像研究显示Pte-Tyr-S0456主要蓄积在叶酸受体阳性肿瘤中且在其它组织中未观察到荧光(图11A)。离体组织生物分布研究显示Pte-Tyr-S0456主要蓄积在叶酸受体阳性肿瘤中，在其它器官中基本上无荧光活性，除外肾(图11B和12B)。预期在肾中吸收明显，这是因为已知肾的近小管顶端膜表达高水平的FR。Pte-Tyr-S0456与叶酸-IR800CW、叶酸-LS288和叶酸-ZW800的头对头比较研究显示Pte-Tyr-S0456在荧光亮度方面与所有叶酸-NIR缀合物竞争(图12A&B)。除外，切片(解剖的)肿瘤的荧光图像启示Pte-Tyr-S0456和所有叶酸-NIR缀合物均匀地蓄积在甚至埋藏在肿瘤内部的所有肿瘤细胞中(图12C)。
实施例5叶酸-和蝶酰基-NIR染料的体外药理学研究
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
将超表达FR-α的KB细胞接种入24-孔(100,000细胞/孔)Falcon培养板(BDBiosciences,CA)，使其在12h期限内形成单层。将每个孔中消耗的培养基与10nM[3H]-叶酸(氚代叶酸)在递增浓度的(0.1nM-1μM)测试制品或叶酸(Sigma-Aldrich,MO)的存在下在新鲜培养基(0.5mL)中合并。在37℃下温育1h后，用PBS(3x0.5mL,Gibco,NY)冲洗细胞，以除去任何未结合的放射性材料。在添加0.25M氢氧化钠(0.5mL)和在4℃温育12h后，将细胞转入包含Ecolite闪烁混合物(3.0mL,MPBiomedicals,OH)的各闪烁小瓶中，用液体闪烁分析仪(Packard)计数。使用％细胞结合放射性与测试制品的log浓度关系的示意图、应用GraphPadPrism4计算相对结合亲和力。
结果：
对于化合物OTL-001-OTL-0010和叶酸将来源于本研究的解离常数(KD)分别计算为30.7nM、19.3Nm、23.3nM、30.6nM、50.1nM、22.8nM、30.5nM、39.7nM、49.6nM、30.5nM和8nM。对于OTL-0001-OTL-0010和叶酸将相对结合亲和力分别计算为0.270、0.430、0.356、0.271、0.166、0.364、0.272、0.209、0.167、0.272和1。全部测试制品定量地与[3H]-叶酸竞争。将相对结合亲和力定义为替代细胞上结合叶酸受体的50％[3H]-叶酸所需的化合物的摩尔比；叶酸的相对亲和力＝1；相对亲和力<1表四对于叶酸受体的亲和力较弱；相对亲和力>1表示与叶酸受体结合较强。
结论：
所有化合物均对于叶酸受体具有亲和力且将它们可适度良好地与叶酸的结合亲和力比拟好。所有化合物均与[3H]-叶酸充分地竞争，表明叶酸受体构成了癌细胞上唯一的结合位点且它们对于叶酸受体具有高度特异性。
实施例6：OTL-0038和OTL-0039(OTL-0038的D-异构体)的体外药理学研究
研发两种配体-NIR缀合物并且命名为OTL-0038和OTL-0039。OTL-0038化合物是指PTE-L-Tyr-S0456，如果蝶酰基连接至S0456，则配体与L-酪氨酸缀合物。OTL-0039是OTL-0038的D-异构体。检查了与叶酸受体的缀合配体叶酸比较两种化合物对于叶酸受体的结合亲和力和结合特异性。
A.材料和方法
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
将超表达FR-α的KB细胞接种入24-孔(100,000细胞/孔)Falcon培养板(BDBiosciences,CA)，使其在12小时期限内形成单层。将每个孔中消耗的培养基与10nM[3H]-叶酸(氚代叶酸)在递增浓度(0.1nM-1μM)的OTL-0039(D-异构体)和OTL-0038(L-异构体)或叶酸(Sigma-Aldrich,MO)的存在下在新鲜培养基(0.5mL)中合并。在37℃下温育1小时后，用PBS(3x0.5mL,Gibco,NY)冲洗细胞，以除去任何未结合的放射性材料。在添加0.25M氢氧化钠(0.5mL)和在4℃温育12小时后，将细胞转入包含Ecolite闪烁混合物(3.0mL,MPBiomedicals,OH)的各闪烁小瓶中，用液体闪烁分析仪(Packard)计数。使用％细胞结合放射性与测试制品的log浓度关系的示意图、应用GraphPadPrism4计算相对结合亲和力。
B.结果
对于OTL-0039、OTL-0038或叶酸将来源于本研究的解离常数(KD)分别计算为81.8nM、10.4nM和7.4nM。对于OTL-0039、OTL-0038和叶酸将相对结合亲和力分别计算为0.09、0.71和1。全部3种测试制品定量地与[3H]-叶酸竞争。
将相对结合亲和力定义为替代细胞上结合叶酸受体的50％[3H]-叶酸所需的化合物的摩尔比；叶酸的相对亲和力＝1；相对亲和力<1表四对于叶酸受体的亲和力较弱；相对亲和力>1表示与叶酸受体结合较强。
C.结论
OTL-0038对于叶酸受体具有亲和力且它可与叶酸的结合亲和力充分比拟(10.4nM与7.4nM)。另一方面，当与叶酸和OTL-0038比较时，OTL-0039对于叶酸受体具有较低亲和力。OTL-0038与[3H]-叶酸充分竞争，表明叶酸受体构成癌细胞上的唯一OTL-0038结合位点且其对叶酸受体具有高度特异性。
实施例7：OTL-0038和OTL-0039(OTL-0038的D-异构体)在具有叶酸受体-阳性肿瘤异种移植物的小鼠中的全身成像和生物分布
检查OTL-0038(PTE-L-Tyr-S0456)和OTL-0039(PTE-D-Tyr-S0456)的叶酸受体阳性肿瘤吸收以确定两种化合物如何充分地被肿瘤上的靶受体吸收。还检查了所述化合物的组织生物分布。静脉内施用所述化合物后半小时，检查小鼠的两种特性。
A.材料和方法
细胞培养和动物准备
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸(nu/nu)鼠(5周龄,18-20g)购自HarlanLaboratories(Indianapolis,IN)并且将其维持在γ-照射的叶酸-缺乏特定膳食(Teklad,WI)上至少2周，然后开始本研究。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水和食物。使动物寄居在标准12h光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
全身成像
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在无叶酸的RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(5只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的OTL-0038或OTL-0039。2.5小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation(PerkinElmerInc,MA)进行全身成像(完整肿瘤)实验。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(吲哚花菁绿(indocyaninegreen))；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
组织生物分布
全身成像后，解剖动物，如上所述使用IVIS成像器分析选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤和肿瘤)的荧光活性。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
B.结果
全身成像
正如图14中所观察到的，OTL-0038主要蓄积在叶酸受体阳性肿瘤中，在其它组织中基本上无荧光活性。
组织生物分布
对通过对每只小鼠实施安乐死、取出其器官和使用IVIS成像器成像进行全身成像的相同动物进行组织生物分布分析。正如图15中所观察到的，在FR-阳性肿瘤中观察到最高荧光强度，在其它组织中无蓄积，除外肾。预期OTL-0038在肾中吸收，这归因于已知肾的近端小管的顶端膜表达高水平的叶酸受体。除外，可能的情况是，所述探针因其低分子量和半衰期(大部分叶酸缀合物具有<30min的半衰期)而通过肾排泄。
C.结论
OTL-0038主要蓄积在叶酸受体阳性肿瘤异种移植物和肾中。所有其它正常组织均展示出最低水平的吸收或无吸收，导致肿瘤与正常组织的荧光比极佳。
实施例8：OTL-0038(L-异构体)与叶酸衍生的近IR试剂的对比分析
将OTL-0038的全身成像和组织生物分布与叶酸-LS288、叶酸-IR800和叶酸-ZW800比较。使这些化合物与叶酸和商购近红外染料LS288、IR800和ZW800缀合。
A.材料和方法
细胞培养和小鼠准备
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸鼠(5周龄,18-20g)购自HarlanLaboratories(Indianapolis,IN)并且将其维持在γ-照射的叶酸-缺乏特定膳食(Teklad,WI)上至少2周，然后开始本研究。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水和食物。使动物寄居在标准12小时光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
全身成像
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在无叶酸的RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(2只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的测试制品(OTL-0038、叶酸-LS288、叶酸-IR800、叶酸-ZW800)。2.5h后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation(PerkinElmerInc,MA)进行全身成像(完整肿瘤)实验。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(吲哚花菁绿)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
组织生物分布
全身成像后，解剖动物，如上所述使用IVIS成像器分析选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤和肿瘤)的荧光活性。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
B.结果
全身成像
正如图14中所观察到的，OTL-0038(L-异构体)、叶酸-LS288、叶酸-IR800、叶酸-ZW800主要蓄积在叶酸受体阳性肿瘤中，在其它组织中基本上无荧光活性。此外，直接比较显示注射OTL-0038的小鼠的肿瘤荧光强度比用其它叶酸-缀合的近IR染料治疗的小鼠明亮(更高)(图15)。
组织生物分布
对通过对每只小鼠实施安乐死、取出其器官和使用IVIS成像器成像进行全身成像的相同动物进行组织生物分布分析。正如图16中所观察到的，在FR-阳性肿瘤和肾中观察到最高荧光强度。肾吸收是预期的，这归因于已知肾的近端小管的顶端膜表达高水平的叶酸受体。此外，可能的情况是，所述探针因其低分子量和半衰期(大部分叶酸缀合物具有<30min的半衰期)而通过肾排泄。
C.结论
OTL-0038相对于叶酸-LS288、叶酸-IR800和叶酸-ZW800想肿瘤蓄积的荧光强度方面具有有益特征。OTL-0038比其它商购近IR染料例如LS288、IR800和ZW800明亮。
实施例9：OTL-0038在具有叶酸受体阳性肿瘤异种移植物的小鼠中的剂量递增研究
进行剂量范围实验以测定可以施用得到最佳肿瘤与背景比的OTL-0038的最低剂量。此外，进行实验以测定可以施用以得到最佳肿瘤(靶向)与非靶向组织比的OTL-0038的最高剂量。
A.材料和方法
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸鼠(nu/nu)(5周龄,18-20g)购自HarlanLaboratories(Indianapolis,IN)并且将其维持在γ-照射的叶酸-缺乏特定膳食(Teklad,WI)上至少2周，然后开始本研究。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水和食物。使动物寄居在标准12小时光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在无叶酸的RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(3只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的OTL-0038(0.3nmol、1nmol、3nmol、10nmol、30nmol、60nmol、90nmol)。2.5h后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation(PerkinElmerInc,MA)进行组织生物分布研究。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(吲哚花菁绿)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
在注射1nmolOTL-0038后2.5小时，使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation(PerkinElmerInc,MA)取得全身图像(完整肿瘤)。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
B.结果
正如表1和图14中所示，所有剂量在叶酸受体阳性肿瘤中均具有较高肿瘤吸收，除外0.3nmol剂量。另一方面，对于0.3-10nmol范围观察到较高的肾吸收，而对30-90nmol范围观察到较少的肾吸收(相对于肿瘤吸收)。此外，在60和90nmol剂量下观察到较高的非特异性吸收。
C.结论
在0.3nmol剂量下观察到的在叶酸受体-阳性肿瘤中的较低吸收(弱荧光强度)可以归因于叶酸受体在肿瘤细胞上的不完全饱和。另一方面，在肾中观察到的较高荧光强度可以归因于所述探针通过肾清除。此外，已知肾的近端小管的顶端膜表达高水平的叶酸受体。1.0-30.0nmol的剂量范围显示肿瘤吸收和极佳的肿瘤与正常组织比(信号与背景比)。较高的肾吸收可以归因于所述探针通过肾清除(除外30nmol剂量)和叶酸受体在肾上表达。剂量水平60.0nmol和低于该值显示较高的非特异性吸收。然而。它们仍然具有高肿瘤吸收和低肾吸收(包括30nmol剂量)。较低的肾吸收可以归因于所述探针可选地通过肝和肠清除。因此，OTL-0038可以以这种较高浓度形成聚集物。我们可以得出结论，1.0nmol是得到良好肿瘤与背景比所施用的最低剂量，其同时维持用于肿瘤成像(图22)的非侵害性方面，且30nmol为得到最佳肿瘤与背景比所施用的最高剂量。
实施例10：OTL-0038在具有叶酸受体-阴性肿瘤异种移植物的小鼠中的全身成像和生物分布
完成全身成像和组织生物分布以便测定OTL-0038对于叶酸受体的体内特异性。实验使用隐藏对于叶酸受体阴性的肿瘤的小鼠以表征OTL-038化合物对于叶酸受体的特异性。
A.材料和方法
细胞培养和小鼠准备
A549细胞(肺泡基底上皮癌细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸(nu/nu)鼠(6周龄,18-20g)购自HarlanLaboratories(Indianapolis,IN)并且将其维持在正常膳食(Teklad,WI)上。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水和食物。使动物寄居在标准12小时光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
全身成像
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种A549细胞(在RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(6只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的OTL-0038。2.5h后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation(PerkinElmerInc,MA)进行全身成像(完整肿瘤)实验。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(吲哚花菁绿)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
组织生物分布
全身成像后，解剖动物，如上所述使用IVIS成像器分析选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤和肿瘤)的荧光活性。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
B.结果
全身成像
正如图14中所观察到的，OTL-0038不会蓄积在叶酸受体阴性肿瘤中，在其它组织中基本上无荧光活性，除外肾。
侵害性肿瘤和肾吸收
对通过对每只小鼠实施安乐死、取出其器官和使用IVIS成像器成像进行全身成像的相同动物进行肿瘤和肾蓄积分析。正如我们预期的，在叶酸受体阴性肿瘤中未观察到荧光，在肾中高度吸收。因为已知肾的近端小管的顶端膜表达高水平的FR，所以预计肾吸收。此外，可能的情况是，所述探针因其低分子量和半衰期(大部分叶酸缀合物具有<30min的半衰期)而通过肾排泄。
C.结论
OTL-0038对于叶酸受体具有高度特异性。
实施例11：OTL-0038和OTL-0039(OTL-0038的D-异构体)在健康裸鼠中的毒性评价
在健康小鼠中表征OTL-0038和OTL-0039的体内毒性。给小鼠施用1nmol或1000x的临床剂量的每种化合物以检查所述化合物的毒性。
A.材料和方法
无胸腺雌性裸(nu/nu)鼠(6周龄,18-20g)购自HarlanLaboratories(Indianapolis,IN)并且将其维持在正常膳食(Teklad,WI)上。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水和食物。使动物寄居在标准12小时光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
在第0天时给7周龄健康雌性裸鼠(5只小鼠/组)通过尾静脉注射施用1μmol新鲜制备的溶于100μL磷酸缓冲盐水的OTL-0038或OTL-0039。在给药前、此后从第0天开始到第7天每日监测体重和临床观察结果。可以对体重在连续2天内缺失20％或以上的任何动物实施安乐死，但并非必需的。在第7天时通过CO2窒息对动物实施安乐死，将选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤)采集入包含4％福尔马林的小瓶。将福尔马林固定的组织切成10μm厚度的切片并且固定在SuperfrostPlusTM载玻片(FisherScientific,PittsburghPA)上。用H&E染色载玻片后，对组织进行免疫组织化学(IHC)分析以测定OTL-0038和OTL-0039的毒性。
B.结果
注射OTL-0038或OTL-0039后，动物皮肤即刻变成绿色。然而，绿色在24小时内消失。在施用测试制品后动物变活跃，在本研究至始至终行为正常。正如在图14中观察到的，在本研究期间的体重保持稳定。根据IHC数据(图15)，在任何组织中均不存在鉴定的损害。
C.结论
1μmol(1000x临床剂量)的OTL-0038或OTL-0039对于动物无毒性，这启示OTL-0038(1nmol)和OTL-0039(1nmol)在临床上对于人无毒性。
实施例12:
Pte-酪氨酸类似物-S0456(修饰的OTL-0038类似物)的体外药理学研究
测试制品：OTL-0040(Pte-Tyr-13C-S0456)、OTL-0042(Pte-Tyr-2H(氘代)-S0456)、OTL-0043[Pte-Tyr-(OBn)-S0456]、OTL-0044[Pte-N(Me)-Tyr-S0456]、OTL-0045[Pte-NHNH-Tyr-(OAc)-S0456]、OTL-0046(Pte-高-Tyr-S0456)、OTL-0047(Pte-β-高-Tyr-S0456)、OTL-0049(Pte-Tyr胺-S0456)
材料和方法：KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
将超表达FR-α的KB细胞接种入24-孔(100,000细胞/孔)Falcon培养板(BDBiosciences,CA)，使其在12小时期限内形成单层。将每个孔中消耗的培养基与10nM[3H]-叶酸(氚代叶酸)在递增浓度(0.1nM-1μM)的测试制品或叶酸(Sigma-Aldrich,MO)的存在下在新鲜培养基(0.5mL)中合并。在37℃下温育1小时后，用PBS(3x0.5mL,Gibco,NY)冲洗细胞，以除去任何未结合的放射性材料。在添加0.25M氢氧化钠(0.5mL)和在4℃温育12h后，将细胞转入包含Ecolite闪烁混合物(3.0mL,MPBiomedicals,OH)的各闪烁小瓶中，用液体闪烁分析仪(Packard)计数。使用％细胞结合放射性与测试制品的log浓度关系的示意图、应用GraphPadPrism4计算相对结合亲和力。
结果：
对于化合物OTL-0040、OTL-0042-OTL-0047、OTL-0049和叶酸将来源于本研究的解离常数(KD)分别计算为27.6nM、61.7nM、14.8nM、13.8nM、12.8nM、30.2和8nM。对于OTL-0040、OTL-0042-OTL-0047、OTL-0049和叶酸将相对结合亲和力分别计算为0.290、0.130、0.177、0.580、0.625、0.265和1。全部测试制品定量地与[3H]-叶酸竞争。
结论：
所有化合物均对叶酸受体具有亲和力，除外OTL-0044和OTL-0045，且它们可适度良好地与叶酸的结合亲和力比拟。所有化合物均充分地与[3H]-叶酸竞争，表明叶酸受体构成癌细胞上唯一的结合位点且它们对于叶酸受体具有高度特异性。
实施例13:
Pte-酪氨酸类似物-S0456的全身成像和生物分布
测试制品：OTL-0043[Pte-Tyr-(OBn)-S0456]、OTL-0044[Pte-N(Me)-Tyr-S0456]、OTL-0045[Pte-NHNH-Tyr-(OAc)-S0456]、OTL-0046(Pte-homo-Tyr-S0456)、OTL-0047(Pte-β-homo-Tyr-S0456)、OTL-0049(Pte-Tyr胺-S0456)
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸鼠(5周龄,18-20g)购自Harlan(IN)并且将其维持在γ-照射的叶酸-缺乏特定膳食(Teklad,WI)上至少2周，然后开始本研究。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水。使动物寄居在标准12h光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
全身成像：
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在无叶酸的RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(2-3只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的测试制品。2小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation(PerkinElmerInc,MA)进行全身成像(完整肿瘤)实验。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(830nm)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
组织生物分布：
全身成像后，解剖动物，如上所述使用IVIS成像器分析选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤和肿瘤)的荧光活性。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(830nm)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
结果：
全身成像：
正如在图28A中所观察到的，OTL-0044、OTL-0046和OTL-0047主要蓄积在叶酸受体-阳性肿瘤中，在其它组织中基本上无荧光活性。
组织生物分布：
在相同条件下对通过对每只小鼠实施安乐死、取出其器官和使用IVIS成像器对其成像进行组织生物分布分析。正如在图28B中所观察到的，在FR-阳性肿瘤中观察到最高荧光强度。肾吸收是预期的，因为已知肾的近端小管的顶端膜表达高水平的叶酸受体。此外，可能的情况是，所述探针因其低分子量和半衰期(大部分叶酸缀合物具有<30min的半衰期)而通过肾排泄。
结论：
尽管体内生物分布显示所有化合物均蓄积在肿瘤和肾中，但是全身分布显示OTL-0044、OTL-0046和OTL-0047主要蓄积在肿瘤中，表明α羧酸对于特异性和亲和力的需求。
实施例14：OTL-0050(蝶酰基-Tyr-S0122)、OTL-0051(蝶酰基-Tyr-IRD28)和OTL-0052(蝶酰基-Tyr-Kodak)的体外药理学研究
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
将超表达FR-α的KB细胞接种入24-孔(100,000细胞/孔)Falcon培养板(BDBiosciences,CA)，使其在12h期限内形成单层。将每个孔中消耗的培养基与10nM[3H]-叶酸(氚代叶酸)在递增浓度(0.1nM-1μM)的测试制品或叶酸(Sigma-Aldrich,MO)的存在下在新鲜培养基(0.5mL)中合并。在37℃下温育1h后，用PBS(3x0.5mL,Gibco,NY)冲洗细胞，以除去任何未结合的放射性材料。在添加0.25M氢氧化钠(0.5mL)和在4℃温育12h后，将细胞转入包含Ecolite闪烁混合物(3.0mL,MPBiomedicals,OH)的各闪烁小瓶中，用液体闪烁分析仪(Packard)计数。使用％细胞结合放射性与测试制品的log浓度关系的示意图、应用GraphPadPrism4计算相对结合亲和力。
结果：
对于化合物OTL-050-OTL-0052和叶酸将来源于本研究的解离常数(KD)分别计算为29.3nM、13.8nM、15.3nM和7.4nM。对于OTL-0050-OTL-0052叶酸将相对结合亲和力分别计算为0.25、0.54、0.48和1。全部测试制品定量地与[3H]-叶酸竞争。
结论：
OTL-0050、OTL-0051和OTL-0052各自对于叶酸受体具有亲和力且这些化合物可适度良好地与叶酸的结合亲和力比拟。所有化合物均充分地与[3H]-叶酸竞争，表明叶酸受体构成癌细胞上的唯一结合位点且它们对于叶酸受体具有高度特异性。
实施例15：蝶酰基-非氨基酸-NIR染料缀合物的体外药理学研究
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
将超表达FR-α的KB细胞接种入24-孔(100,000细胞/孔)Falcon培养板(BDBiosciences,CA)，使其在12h期限内形成单层。将每个孔中消耗的培养基与10nM[3H]-叶酸(氚代叶酸)在递增浓度(0.1nM-1μM)的测试制品或叶酸(Sigma-Aldrich,MO)的存在下在新鲜培养基(0.5mL)中合并。在37℃下温育1h后，用PBS(3x0.5mL,Gibco,NY)冲洗细胞，以除去任何未结合的放射性材料。在添加0.25M氢氧化钠(0.5mL)和在4℃温育12h后，将细胞转入包含Ecolite闪烁混合物(3.0mL,MPBiomedicals,OH)的各闪烁小瓶中，用液体闪烁分析仪(Packard)计数。使用％细胞结合放射性与测试制品的log浓度关系的示意图、应用GraphPadPrism4计算相对结合亲和力。
结果：
对于化合物OTL-0056(蝶酰基-DAP-S0456)、OTL-0057(蝶酰基-BAMB-S0456)、OTL-0058(蝶酰基-AMHMB-S0456)、OTL-0059(蝶酰基-DHDADS-S0456)、OTL-0060(蝶酰基-DADS-S0456)、OTL-0061(蝶酰基-4APEP-S0456)和叶酸将来源于本研究的解离常数(KD)分别计算为95.2nM、121.3nM、90.2nM、250.5nM、225.8nM、41.7nM。对于OTL-0056-OTL-0061和叶酸将相对结合亲和力分别计算为0.078、0.061、0.082、0.029、0.033、0.171和1。全部测试制品定量地与[3H]-叶酸竞争。
结论：
化合物OTL-0056-OTL-0061各自对于叶酸受体具有亲和力且它们可适度良好地与叶酸的结合亲和力比拟。所有化合物均充分地与[3H]-叶酸竞争，表明叶酸受体构成癌细胞上的唯一结合位点且它们对于叶酸受体具有高度特异性。
实施例16:
蝶酰基-非氨基酸-NIR染料缀合物的体外药理学研究
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
将超表达FR-α的KB细胞接种入24-孔(100,000细胞/孔)Falcon培养板(BDBiosciences,CA)，使其在12h期限内形成单层。将每个孔中消耗的培养基与10nM[3H]-叶酸(氚代叶酸)在递增浓度(0.1nM-1μM)的测试制品或叶酸(Sigma-Aldrich,MO)的存在下在新鲜培养基(0.5mL)中合并。在37℃下温育1h后，用PBS(3x0.5mL,Gibco,NY)冲洗细胞，以除去任何未结合的放射性材料。在添加0.25M氢氧化钠(0.5mL)和在4℃温育12h后，将细胞转入包含Ecolite闪烁混合物(3.0mL,MPBiomedicals,OH)的各闪烁小瓶中，用液体闪烁分析仪(Packard)计数。使用％细胞结合放射性与测试制品的log浓度关系的示意图、应用GraphPadPrism4计算相对结合亲和力。
结果：
对于化合物OTL-0056-OTL-0061和叶酸计算来源于本研究的解离常数(KD)并且分别测定为95.2nM、121.3nM、90.2nM、250.5nM、225.8nM、41.7nM和7.4nM。对于OTL-0056(Pte-DAP-S0456)、OTL-0057(Pte-BAMB-S0456)、OTL-0058(蝶酰基-AMHMB-S0456)、OTL-0059(Pte-DHDADS-S0456)、OTL-0060(Pte-DADS-S0456)、OTL-0061(Pte-4APEP-S0456)和叶酸计算相对结合亲和力并且分别测定为0.078、0.061、0.082、0.029、0.033、0.171和1。全部测试制品定量地与[3H]-叶酸竞争。
结论：所有化合物对于叶酸受体均具有弱亲和力。所有化合物与[3H]-叶酸竞争，表明叶酸受体构成癌细胞上的唯一结合位点且它们对于叶酸受体具有高度特异性。
实施例17:
蝶酰基-氨基酸-NIR染料缀合物的全身成像和生物分布
测试制品：OTL-0038(Pte-Tyr-S0456)、OTL-0053(蝶酰基-Lys-S0456)和OTL-0054(蝶酰基-Cys-S0456)
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸鼠(5周龄,18-20g)购自Harlan(IN)并且将其维持在γ-照射的叶酸-缺乏特定膳食(Teklad,WI)上至少2周，然后开始本研究。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水。使动物寄居在标准12h光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
全身成像：
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在无叶酸的RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(2-3只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的测试制品。2小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation(PerkinElmerInc,MA)进行全身成像(完整肿瘤)实验。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(830nm)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。在Pte-Lys-S0456的情况中，激发：745nm、710nm、675nm、640nm、605nm；发射：ICG，其余参数相同。
组织生物分布：
全身成像后，解剖动物，如上所述使用IVIS成像器分析选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤和肿瘤)的荧光活性。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(830nm)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
结果：
全身成像：
正如在图29中观察到的，OTL-0038(Pte-Tyr-S0456)和OTL-0054(Pte-Cys-S0456)主要蓄积在叶酸受体-阳性肿瘤中，在其它组织中基本上无荧光活性。此外，直接比较显示OTL-0038注射小鼠的肿瘤荧光强度比用其它缀合物治疗的小鼠明亮。另一方面，当在605-675nm波长激发并且在ICG(830nm)发射时，Pte-Lys-S0456具有明亮的肿瘤荧光，而当在710-745nm激发并且在ICG发射时，仅具有适度的亮度，正如在图30中观察到的(与其它缀合物使用相同的参数)。
组织生物分布：
在相同条件下对通过对每只小鼠实施安乐死、取出其器官和使用IVIS成像器对其成像进行组织生物分布分析。正如在图31中所观察到的，在FR-阳性肿瘤中观察到最高荧光强度。肾吸收是预期的，因为已知肾的近端小管的顶端膜表达高水平的叶酸受体。此外，可能的情况是，所述探针因其低分子量和半衰期(大部分叶酸缀合物具有<30min的半衰期)而通过肾排泄。
结论：
从最佳到最弱列出的缀合物在Ex＝745nm和Em＝ICG的亮度和特异性如下：Pte-Tyr-S0456、Pte-Cys-S0456和Pte-Lys-S0456。Pte-Lys-S0456均显示较长的Stoke’sshift，表明我们可以在605nm激发并且在ICG(830nm)发射以观察到明亮肿瘤荧光。
实施例18：
Pte-Tyr-Kodak衍生物[OTL-0051(蝶酰基-Tyr-IRD28)和OTL-0052(蝶酰基-Tyr-Kodak)]的全身成像和生物分布
测试制品：OTL-0051(蝶酰基-Tyr-IRD28)和OTL-0052(蝶酰基-Tyr-Kodak)
材料和方法：
KB细胞(人鼻咽细胞系)得自美国模式培养物保藏中心(Rockville,MD)并且使用不含叶酸的包含10％热灭活胎牛血清(AtlantaBiological,GA)和1％青霉素链霉素(Gibco,NY)的1640RPMI培养基(Gibco,NY)在37℃在5％二氧化碳：95％空气加湿气氛中使其作为单层生长至少6代，然后将它们用于测定。
无胸腺雌性裸鼠(5周龄,18-20g)购自Harlan(IN)并且将其维持在γ-照射的叶酸-缺乏特定膳食(Teklad,WI)上至少2周，然后开始本研究。使动物以5只/笼寄居在有屏障的无病原体的寄居框架中。如果需要给予高压灭菌的自来水。使动物寄居在标准12h光照-黑暗周期的无菌环境中持续本研究的期限。通过耳打孔各自鉴别小鼠。普度动物护理和应用委员会批准了所有动物操作。根据用于慈善动物处理的国家和国际指南进行动物护理和研究。
全身成像：
给7周龄雌性nu/nu小鼠肩上经皮下接种KB细胞(在无叶酸的RPMI1640培养基中1.0×106/小鼠)。每隔2天使用卡钳测量肿瘤在垂直方向上的生长(使用同一方案监测体重)，将肿瘤体积计算为0.5×L×W2(L＝最长轴，且W＝与L垂直的轴，以毫米计)。一旦肿瘤达到400至500mm3体积，则经静脉内给动物(2-3只小鼠/组)注射10nmol的在磷酸缓冲盐水(100μL)中的测试制品。2小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死。然后使用带有LivingImage4.0软件的CaliperIVISLuminaIIImagingStation(PerkinElmerInc,MA)进行全身成像(完整肿瘤)实验。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(830nm)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。在Pte-Lys-S0456的情况中，激发：745nm、710nm、675nm、640nm、605nm；发射：ICG(830nm)，其余参数相同。
组织生物分布：
全身成像后，解剖动物，如上所述使用IVIS成像器分析选择的组织(心脏、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、肌肉、皮肤和肿瘤)的荧光活性。成像设置：-灯的等级：中；激发：745nm；发射：ICG(830nm)；epi照明；框并法：4(M),FOV＝12.5；f-终止＝2；获取时间＝1s。
结果：
全身成像：
正如在图32中观察到的，OTL-0051(蝶酰基-Tyr-IRD28)和OTL-0052(蝶酰基-Tyr-Kodak)主要蓄积在叶酸受体-阳性肿瘤中，在其它组织中基本上无荧光活性。尽管Kodak染料在800nM激发，但是IVIS影像系统不具有在800nM激发的过滤器。旖旎从，在肿瘤中观察到的低荧光吸收可以归因于应用了弱的激发波长。
组织生物分布：
在相同条件下对通过对每只小鼠实施安乐死、取出其器官和使用IVIS成像器对其成像进行组织生物分布分析。正如在图33中所观察到的，在FR-阳性肿瘤中观察到最高荧光强度。我们还观察到在肺中的吸收。尽管我们预期存在肾吸收(因为已知肾的近端小管的顶端膜表达高水平的叶酸受体)，但是肾吸收程度低。
结论：
组织生物分布研究显示OTL-0051(蝶酰基-Tyr-IRD28)和OTL-0052(蝶酰基-Tyr-Kodak)缀合物在叶酸受体阳性肿瘤中吸收。

Claims (69)

1.具有下式的化合物：
或其药学上可接受的盐，
或其同位素，
其中：
X是氨基酸或其衍生物，且
Y是在近红外范围具有荧光激发和发射光谱的染料，且该化合物维持或增强所述染料的荧光。
2.权利要求1的化合物，其中所述氨基酸选自酪氨酸、半胱氨酸或者酪氨酸或半胱氨酸的衍生物。
3.权利要求1的化合物，其中所述氨基酸是酪氨酸。
4.权利要求3的化合物，其中碳的同位素位于酪氨酸的芳族环上。
5.权利要求4的化合物，其中氢的同位素是酪氨酸的芳族环的取代基。
6.权利要求1的化合物，其中所述氨基酸衍生物是酪氨酸衍生物，其选自：
或其外消旋混合物。
7.权利要求1的化合物，其中Y具有下式：
其中
X独立地选自O、S、N和C，且
R独立地选自CH2和CH2CH2。
8.权利要求1的化合物，其中所述氨基酸包括含硫侧链基。
9.权利要求8的化合物，其中包括含硫侧链基的氨基酸是半胱氨酸。
10.权利要求8的化合物，其中包括含硫侧链基的氨基酸是甲硫氨酸。
11.权利要求1的化合物，其中包括含硫属元素侧链基的氨基酸是硒代半胱氨酸。
12.权利要求1的化合物，其中该化合物具有下式：
或其钾、钠或铵盐。
13.权利要求1的化合物，其中该化合物具有下式：
或其药学上可接受的盐。
14.权利要求1的化合物，其中该化合物具有下式：
或其药学上可接受的盐。
15.权利要求1的化合物，其中该化合物具有约500nm至约900nm的最大吸收和发射。
16.权利要求15的化合物，其中该化合物具有约600nm至800nm的最大吸收和发射。
17.权利要求1的化合物，其中使该化合物在组织细胞中分布后发出荧光。
18.权利要求1的化合物，其中通过使该化合物接触近红外波长的激发光而发出荧光。
19.权利要求1的化合物，其中该化合物具有对叶酸受体靶标的结合亲和力，与对叶酸受体的叶酸的结合亲和力类似。
20.权利要求1的化合物，其中该化合物具有大于化合物的叶酸缀合物的近红外亮度，所述化合物选自：
21.权利要求1的化合物，其中所述化合物高度选择性地靶向肿瘤细胞。
22.组合物，包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
23.使表达叶酸受体的生物组织光学成像的方法，该方法包含：
(a)使所述生物组织接触权利要求22的组合物；
(b)允许组合物中的化合物在生物靶标内分布的时间；
(c)用该化合物可吸收的波长的激发光照射所述组织；和
(d)检测该化合物发射的光学信号。
24.权利要求23的方法，其中所述化合物发射的信号用于构建图像。
25.权利要求23的方法，其中所述组织在受试者中，且所述受试者是动物或人。
26.权利要求23的方法，其中在步骤(a)中，使其信号特性可区分的两种或多种荧光化合物接触所述组织，任选地所述组织在受试者中。
27.权利要求25的方法，其中照射和检测步骤使用内窥镜、导管、X射线断层扫描系统、手提式光学成像系统、外科手术护目镜或手术中显微镜来进行。
28.权利要求23的方法，其中表达叶酸受体的生物组织具有超表达该受体的疾病。
29.权利要求28的方法，其中所述疾病选自癌症、心血管疾病、神经变性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病、呼吸系统疾病、代谢疾病、遗传疾病、感染性疾病、骨疾病和环境性疾病。
30.鉴定生物样品中靶细胞类型的方法，包括：
a)使所述生物样品接触权利要求1的化合物，接触时间和条件允许该化合物结合靶细胞类型的至少一种细胞；和
b)任选地检测所述生物样品中存在或不存在所述化合物，
其中在检测步骤b)中存在所述化合物表示所述靶细胞类型存在于所述生物样品中。
31.权利要求30的方法，其中所述靶细胞类型是待成像以用于诊断目的的组织。
32.权利要求31的方法，其中所述组织是肿瘤或淋巴结。
33.权利要求30的方法，其中所述任选地检测包括使所述化合物接触激发光源并且检测来自该化合物的荧光。
34.权利要求33的方法，其中所述激发光是近红外波长的光。
35.权利要求33的方法，其中所述激发光波长在约600至1000纳米范围。
36.权利要求33的方法，其中所述激发光波长在约670至850纳米范围。
37.对受试者实施影像指导的手术的方法，包括：
a)施用包含权利要求1的化合物的组合物，施用条件和时间足以使所述化合物蓄积在指定手术部位上；
b)照射所述化合物以便使用红外光使该化合物显影；和
c)对于由红外光激发时发出荧光的区域实施手术切除。
38.权利要求37的方法，其中红外光是近红外波长的光。
39.权利要求37的方法，其中红外光的波长在约600至1000纳米范围。
40.权利要求37的方法，其中红外光的波长在约670至850纳米范围。
41.诊断受试者的疾病的方法，包括：
a)对需要诊断的受试者施用一定量的权利要求1的化合物，施用时间和条件允许该化合物结合靶细胞类型的至少一种细胞；
b)测定来自存在于生物样品中的权利要求1的化合物的信号；
c)将b)中测定的信号与至少一个对照数据组比较，其中所述至少一个对照数据组包含来自权利要求1的化合物的信号，该化合物接触了不含靶细胞类型的生物样品；和
d)提供疾病的诊断，其中步骤c)中的比较指示所述疾病的存在。
42.试剂盒，包含权利要求1的化合物。
43.权利要求42的试剂盒，其中权利要求1的化合物产生荧光信号，该荧光信号的亮度大于包含化合物的叶酸缀合物的化合物的荧光信号的亮度，所述化合物选自：
44.权利要求43的试剂盒，还包含权利要求1的化合物的衍生物。
45.权利要求44的化合物，其中Y是具有下式的化合物：
其中Rx各自独立地选自硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、膦酸盐、铵和羟基、糖、氨基酸、磺酰胺或羧基。
46.权利要求43的化合物，其中Y具有下式：
其中
X独立地选自O、S、N或C，且
R独立地选自CH2或CH2CH2。
47.权利要求1的化合物，其中该化合物具有选自如下的式：
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
其中酪氨酸是β高酪氨酸，
其中W、X、Y或Z是H、Na或NH4 +，
及其药学上可接受的盐。
48.化合物，具有下式：
或其药学上可接受的盐，
或其同位素，
其中：
X是氨基酸或其衍生物，且
Y是具有在可见光谱中的荧光激发和在近红外范围中的发射光谱的染料，X连接至Y，生成直接连接至Y的仲胺，且所述化合物维持或增强所述染料的荧光。
49.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸是天然存在的氨基酸。
50.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸是α氨基酸。
51.权利要求50的化合物，其中所述氨基酸是高氨基酸。
52.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸是β氨基酸。
53.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸包括含羟基的侧链基。
54.权利要求53的化合物，其中所述氨基酸选自丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、其异构体及其衍生物。
55.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸包括含氧侧链基。
56.权利要求55的化合物，其中所述氨基酸选自谷氨酰胺、谷氨酸、谷氨酸盐、天冬酰胺、其异构体及其衍生物。
57.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸包括芳族侧链基。
58.权利要求57的化合物，其中包括芳族侧链基的氨基酸选自苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
59.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸包括含硫侧链基。
60.权利要求59的化合物，其中包括含硫侧链基的氨基酸是半胱氨酸。
61.权利要求48的化合物，其中包括含硫属元素侧链基的氨基酸是硒代半胱氨酸。
62.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸是中性极性氨基酸。
63.权利要求62的化合物，其中所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
64.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸包括含胺的侧链基。
65.权利要求64的化合物，其中所述氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、及其异构体和衍生物。
66.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸衍生物包括碱性侧链基。
67.权利要求66的化合物，其中所述氨基酸选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
68.权利要求48的化合物，其中所述氨基酸衍生物包括含硫属元素侧链基。
69.权利要求68的化合物，其中硫属元素选自氧、硫和硒。
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