ES2765896T3 - Métodos de obtención de imágenes de enfermedades inflamatorias mediante ligandos conjugados con compuestos fluorescentes - Google Patents

Métodos de obtención de imágenes de enfermedades inflamatorias mediante ligandos conjugados con compuestos fluorescentes Download PDF

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Abstract

Un compuesto capaz de unirse a una célula inflamatoria que tiene la Fórmula **(Ver fórmula)** en donde W, X, Y, Z, cada uno, son H, Na, K o NH4.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de obtención de imágenes de enfermedades inflamatorias mediante ligandos conjugados con compuestos fluorescentes
SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud de patente reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/791.921, presentada el 15 de marzo de 2013; la solicitud de patente estadounidense n.° 14/010.098, presentada el 26 de agosto de 2013; la solicitud de patente internacional PCT n.° PCT/US13/56629, presentada el 26 de agosto de 2013, y la solicitud de patente estadounidense n.° 14/046.916, presentada el 4 de octubre de 2013.
Sector de la técnica
La presente invención proporciona métodos de utilización de ligandos derivados de pterina conjugados con colorantes para la obtención de imágenes dirigida de enfermedades inflamatorias. La conjugación de ligandos derivados de pterina con colorantes usando grupos de enlace de aminoácidos aumenta la especificidad y la detección del compuesto.
Estado de la técnica
Las enfermedades inflamatorias crónicas afectan a millones de personas diariamente. Los pacientes se someten a tratamientos de enfermedades inflamatorias con resultados variados y muchos tienen una recidiva de enfermedad locorregional o sistémica a lo largo de su vida. A pesar de los grandes avances en el campo de la inmunología durante la última década, existen obstáculos que superar en el campo, incluyendo, por ejemplo, una calidad de vida del paciente mejorada mediante formas eficaces y preferentemente no quirúrgicas de identificación específica de una diana de la/s enfermedad/es.
Aunque el sistema inmunitario normalmente proporciona una línea de defensa contra los patógenos extraños, existen muchos casos en los que la respuesta inmunitaria en sí está implicada en la evolución de la enfermedad. Las enfermedades causadas o empeoradas por la propia respuesta inmunitaria de una persona son las enfermedades autoinmunitarias, tales como la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso, la psoriasis, la fibrosis pulmonar y la artritis reumatoide, y las enfermedades en las que la respuesta inmunitaria contribuye a la patogénesis, tales como la ateroesclerosis, las enfermedades inflamatorias, la osteomielitis, la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn y la enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH), que a menudo da como resultado el rechazo de trasplante de órganos. Las enfermedades de ejemplo adicionales incluyen fibromialgia, artrosis, sarcoidosis, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, inflamaciones de la piel (por ejemplo, psoriasis), glomerulonefritis, retinopatía proliferativa, reestenosis e inflamaciones crónicas.
Las células inflamatorias activadas, tales como los macrófagos, pueden contribuir a la fisiopatología de la enfermedad en algunos casos. Las células inflamatorias activadas pueden sumir de manera no específica y destruir patógenos extraños dentro de las células mediante un ataque hidrolítico y oxidativo que dé como resultado la degradación del patógeno. Los péptidos de las proteínas degradadas se pueden presentar sobre la superficie celular inflamatoria donde estos se pueden reconocer mediante los linfocitos T y estos pueden interactuar directamente con los anticuerpos sobre la superficie de los linfocitos B, lo que da como resultado la activación de los linfocitos T y B y una mayor estimulación de la respuesta inmunitaria. Los tipos de células inflamatorias que se pueden asociar a las enfermedades inflamatorias incluyen macrófagos, monocitos y células progenitoras, incluyendo células progenitoras endoteliales.
El receptor de folato (FR en inglés) es una proteína anclada a GPI de 38 KDa que se une al ácido fólico vitamínico con alta afinidad (<1 nM). Después de la unión al receptor, la endocitosis rápida proporciona la vitamina a la célula, donde esta se descarga en un compartimento endosómico a pH bajo. De manera importante, la conjugación covalente de moléculas pequeñas, proteínas e incluso liposomas con ácido fólico no altera la capacidad de la vitamina para unirse al receptor de folato y, por lo tanto, los conjugados de folato-fármaco pueden entrar fácilmente en las células mediante endocitosis mediada por receptores.
Debido a que la mayoría de las células usan un transportador de folato reducido (RFC en inglés) no relacionado para adquirir el ácido fólico necesario, la expresión del receptor de folato se restringe a unos pocos tipos de células. Con la excepción del riñón y la placenta, los tejidos normales expresan niveles bajos o no detectables de FR. El folato se une a su receptor análogo (isoformas principales: FR-a, FR-p, FR-y y FR-5) con alta afinidad (Kd <0,5 nM) y especificidad. El FR-a, sobreexpresado en el 80 % de todos los tipos de células malignas (por ejemplo, ovario, pulmón, mama, riñón), y el FR-p, expresado en subconjuntos únicos de macrófagos activados y determinadas neoplasias hemáticas, constituyen las dos isoformas de FR primarias explotadas para la provisión de cargas útiles terapéuticas y de obtención de imágenes dirigidas. También se ha indicado que el FR-p, la isoforma no epitelial del receptor de folato, se expresa en macrófagos sinoviales activados (pero no en reposo).
Mary Jo Turk y col. han evaluado recientemente un agente de obtención de imágenes (EC20) por tomografía computarizada por emisión de fotón simple (TCEFS) dirigido a folato (Arthritis & Rheumatism, Vol. 46, n.° 7, julio de 2002, páginas 1947-1955) para determinar si la sobreexpresión de un receptor beta de folato (Fr-p) de alta afinidad en macrófagos activados se puede explotar para dirigir, de manera selectiva, los agentes de obtención de imágenes a sitios de inflamación en ratas con artritis inducida por adyuvante (AIA). Los estudios preclínicos con tales agentes de obtención de radioimágenes enfatizaron el valor de la obtención de imágenes de los tejidos artríticos in vivo. Los resultados sugieren que esto también puede resultar útil para el análisis de la participación de los macrófagos activados en procesos inflamatorios, tales como la artritis reumatoide. El mismo agente de obtención de radioimágenes (EC20) se usó más recientemente para obtener imágenes de la ateroesclerosis mediante audioradiografía en ratones con genes inactivados de la apoliproteína E en Wilfredo Ayalo Lopez y col. (The Journal of Nuclear Medicine, Vol. 51, n.° 5, mayo de 2010, páginas 768-774) para la detección temprana de cardiopatías. Sin embargo, algunos de los agentes actuales de obtención de radioimágenes no están disponibles y son caros, son difíciles de modelar, pueden carecer de la sensibilidad para la obtención de imágenes basada en receptores o pueden tener semividas no deseables o tiempos de relajación relativamente cortos.
Los estudios adicionales (Chrystal M Paulos y col., Arthritis Research & Therapy, 2006, 8: R77) han mostrado que los productos radiofarmacéuticos unidos a folato se concentran en las articulaciones artríticas, lo que permite la visualización de tales tejidos mediante gammagrafía. La retirada selectiva de macrófagos activados con fármacos unidos a folato se podría explotar para someter a tratamiento la artritis reumatoide con poca toxicidad para otros tejidos.
Los estudios de tratamiento de inmunoterapia de otra enfermedad inflamatoria, lupus eritematoso sistémico (LES), también se han realizado previamente en los casos en los que los macrófagos activados se han dirigido con conjugados de hapteno unido a folato conocidos (Bindu Varghese y col., Molecular Pharmaceutics, 4(5):679-852007).
El EC-20 también se ha usado para detectar macrófagos FR+ acumulados en sitios de enfermedades infecciosas mediante la obtención de imágenes por gammagrafía de focos de infección bacteriana después de infectar ratones BALB/c con Staphylococcus aureus.
El EC20 también se ha usado en la sesión clínica para evaluar las articulaciones de RA en pacientes con RA (Assessment of disease activity in rheumatoid arthritis using a novel folate targeted radiopharmaceutical Folatescan. Matteson EL, Lowe VJ, Prendergast FG, Crowson CS, Moder KG, Morgenstern DE, Messmann RA, Low PS. Clin Exp Rheumatol. marzo-abril de 2009;27(2):253-9).
Aunque las exploraciones por TCEFS son caras, las exploraciones por TCEFS proporcionan imágenes de baja resolución en comparación con las exploraciones por PET. Por lo tanto, múltiples agentes de obtención de imágenes por PET dirigidos a folato se evalúan en la fase preclínica, incluyendo varios agentes marcados con flúor-18. Sin embargo, los radionúclidos usados en la obtención de imágenes por PET podrían tener cualquier posible problema de dosimetría debido a sus largas semividas [por ejemplo, 86Y (t1/2 ~ 14,7 h), 64Cu (t1/2 ~ 12,7 h) y 66Ga (t1/2 ~ 9,49 h)] o su necesidad de producción in situ debido a sus cortas semividas [por ejemplo, 11C (t1/2 ~ 22 minutos), 13N (t1/2 -10 min) y 15O (t1/2 ~2 min)]. Por tanto, existen deficiencias importantes en la obtención de radioimágenes.
Dado que los agentes de obtención de radioimágenes pueden dañar el ADN que puede conducir al cáncer, el uso de múltiples dosis de agentes de obtención de radioimágenes no es deseable cuando se controla la respuesta a la terapia. Otra desventaja de los agentes de obtención de radioimágenes es que el paciente ha de permanecer en el hospital hasta que el agente de obtención de radioimágenes se elimine en todo el cuerpo. Por otra parte, los agentes de obtención de radioimágenes pueden ser caros, pueden requerir una producción in situ y puede que no se puedan almacenar debido a las semividas de los radionúclidos. Por lo tanto, existe una alta demanda médica de desarrollo de modalidades de detección mejores y más seguras. En este sentido, la obtención de imágenes ópticas ofrece muchas ventajas sobre la obtención de radioimágenes, por ejemplo, facilidad de síntesis, alta pureza, estabilidad a largo plazo durante el almacenamiento, estabilidad durante la preparación y un procedimiento razonable para su síntesis y purificación. Por otra parte, los agentes de obtención de imágenes ópticas son seguros en el uso clínico.
Las técnicas fluorescentes convencionales usan sondas en el espectro de luz visible (~400-600 nm). Tal longitud de onda no es óptima para obtener imágenes de enfermedades inflamatorias, ya que esta se asocia a un nivel relativamente alto de intervención de fondo no específica debido al colágeno en los tejidos. Por tanto, la relación de señal respecto a interferencia de estos compuestos convencionales es baja. Por otra parte, la absorción de luz visible mediante cromóforos biológicos, en particular, hemoglobina, limita la profundidad de penetración de la penetración de la imagen fluorescente a unos pocos milímetros. Por tanto, los sitios de enfermedad que están ocultos a más de unos pocos milímetros en el tejido a menudo permanecen sin ser detectados.
La combinación de absorción de luz mediante hemoglobina en el espectro de luz visible (<600 nm) y agua y lípidos en el rango del IR (>900 nm) ofrece una ventana de obtención de imágenes ópticas de aproximadamente 650-900 nm en la que el coeficiente de absorción del tejido está al mínimo. Una alternativa adecuada a los colorantes que emiten luz en el rango visible sería desarrollar colorantes que se puedan usar en el rango del infrarrojo cercano (IRC) porque la luz en la región del infrarrojo cercano induce muy poca autofluorescencia y permea el tejido de manera mucho más eficaz. Otro beneficio de la tecnología fluorescente del IR cercano es que el fondo de la luz dispersada de la fuente de excitación se reduce en gran medida dado que la intensidad de dispersión es proporcional a la cuarta potencia inversa de la longitud de onda. La fluorescencia de fondo baja es necesaria para la detección altamente sensible. Además, la ventana ópticamente transparente en la región del IR cercano (de 650 nm a 900 nm) en el tejido biológico hace que la fluorescencia del IRC sea una tecnología valiosa en aplicaciones de obtención de imágenes y detección subcelular in vivo que requieren la transmisión de luz a través de componentes biológicos.
Aunque el uso de la luz en el rango del IRC para la obtención de imágenes de tejido más profundo resulta preferible a la luz en el espectro visible, los colorantes de obtención de imágenes del IRC usados actualmente en la técnica experimentan una serie de desafíos y desventajas. Estos incluyen una susceptibilidad al fotoblanqueo, una estabilidad química deficiente, espectros de absorbancia y emisión que se encuentran dentro del mismo rango que muchas moléculas fisiológicas (lo que da como resultado una alta señal de fondo y autofluorescencia). Por otra parte, la mayoría de los colorantes del RC no son estables durante la síntesis, no al menos debido al hecho de que la conjugación de un ligando con un enlazador de amina conduce a múltiples productos secundarios no deseados. Por lo tanto, la ingesta de un agente de obtención de imágenes del IRC dirigido a ligando para la sesión clínica puede ser cara. Por tanto, los métodos de obtención de imágenes actuales que utilizan sondas fluorescentes del IRC para el tratamiento de enfermedades inflamatorias experimentan varios inconvenientes, entre los que se incluyen la ineficacia para la obtención de imágenes de tejido profundo (>5 mm de la superficie); la ineficacia en cuanto a la cuantificación de la señal de fluorescencia en tejidos de mamíferos y en cuanto al coste de producción, que aumentan el tiempo de traducción preclínico a clínico.
Se ha realizado una evolución en el uso de agentes de obtención de imágenes ópticas que fluorescen en el rango espectral del infrarrojo cercano. Los avances anteriores también han incluido el uso de colorantes no dirigidos como agentes de contraste óptimos en el rango espectral de fluorescencia del IRC de aproximadamente 650 a aproximadamente 1.000 nm para identificar enfermedades inflamatorias, incluyendo artritis reumatoide. Esto incluyó el uso de colorantes de cianina de la clase de los indotricarbocianuros, tales como el verde de indocianina (ICG en inglés) conocido por su eficacia en diagnósticos cardiovasculares y ensayos funcionales hepáticos. Aunque se ha mostrado que los colorantes fluorescentes no dirigidos se acumulan de manera pasiva en algunos tejidos, las relaciones de tejido a fondo resultantes a menudo son deficientes y los límites entre el sitio inflamatorio y los tejidos sanos pueden ser difíciles de definir.
La investigación actual en fluorescencia del IRC ha conducido a nuevos enfoques para la obtención de imágenes dirigida de enfermedades inflamatorias. Se han estudiado las sondas de IRCF activadas por proteasa in vivo por su capacidad de obtener imágenes de la presencia de artritis inducida por colágeno en las articulaciones al dirigirse a un sitio de escisión particular y dar como resultado la activación de fluorescencia (Andreas Wunder y col., Arthritis & Rheumatism, 50(8):2459-2465 (2004)). De manera adicional, se sometió a ensayo un conjugado de IRC2-folato desarrollado recientemente para la obtención de imágenes in vivo de artritis mediante el direccionamiento a una abundancia de receptores de folato en macrófagos activados en células inflamadas (Wei-Tsung Chen y col., Arthritis Research & Therapy, 7(2):R310-R317 (2005)).
Sin embargo, no se ha investigado el conjugado de colorante-enlazador-ligando fluorescente del IRC que comprende derivados de ácido fólico alternativos como ligandos con enlazadores para producir colorantes mejores y más brillantes para el direccionamiento a un tejido enfermo inflamatorio.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad del uso de sustancias de colorante a base de derivado de ácido fólico alternativas que se puedan usar para dirigirse de manera específica a las enfermedades inflamatorias y que tengan una estabilidad y brillo aumentados para su uso in vivo para la obtención de imágenes.
Objeto de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines de información.
La presente divulgación se refiere a un método de obtención de imágenes de una enfermedad inflamatoria que comprende las etapas de: a) administrar a un paciente que necesita tal proceso una cantidad eficaz de un compuesto capaz de unirse a una célula inflamatoria que tiene la Fórmula:
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o una sal o un isótopo del mismo farmacéuticamente aceptables, en donde X es un aminoácido o un derivado del mismo e Y es un colorante que tiene un espectro de excitación y emisión de fluorescencia en el rango del infrarrojo cercano (IRC) y el compuesto mantiene o potencia la fluorescencia del colorante; y b) obtener imágenes fluorescentes de un área de la enfermedad inflamatoria en el cuerpo del paciente donde se ha absorbido el compuesto. El aminoácido del compuesto se puede seleccionar del grupo que consiste en tirosina, cisteína, lisina, un derivado de la tirosina, un derivado de cisteína y un derivado de lisina. En una realización particular, el compuesto de aminoácido es tirosina y, en una realización más particular, el compuesto de aminoácido es un derivado de tirosina seleccionado del grupo que consiste en:
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y mezclas racémicas de los mismos.
De manera adicional, el colorante Y del compuesto puede tener la Fórmula:
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en donde X’ se selecciona de manera independiente del grupo que consiste en O, S, N y C y R’ se selecciona de manera independiente del grupo que consiste en CH2 y CH2CH2. En realizaciones particulares, el colorante Y se selecciona del grupo que consiste en LS288, IR800, SP054, S0121, KODAK, IRD28, S2076, S0456 y derivados de los mismos. En una realización más particular, el colorante Y es S0456.
La enfermedad inflamatoria a obtener imágenes se puede seleccionar del grupo que comprende colitis ulcerosa, artritis reumatoide, fibrosis pulmonar y ateroesclerosis.
La administración del compuesto puede ser mediante cualquier vía empleada de manera convencional. Por ejemplo, esta puede ser mediante inyección intravenosa (IV), inyección intraperitoneal (IP), administración oral, etc. en una parte del cuerpo afectada por una enfermedad inflamatoria. Se prevé que la vía de administración puede ser tópica, entérica o parenteral. La invención proporciona un método de obtención de imágenes de una enfermedad inflamatoria que comprende administrar a un paciente que necesita tal proceso una cantidad eficaz de un compuesto que tiene la Fórmula:
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en donde W, X, Y, Z, cada uno, son H, Na, K o NH4 , y
obtener imágenes fluorescentes de un área de la enfermedad inflamatoria en el cuerpo del paciente donde el compuesto se ha unido a una célula inflamatoria.
La enfermedad inflamatoria a obtener imágenes mediante este método puede ser, por ejemplo, colitis ulcerosa, artritis reumatoide, fibrosis pulmonar y ateroesclerosis.
En realizaciones de ejemplo, la administración del compuesto puede ser mediante inyección intravenosa (IV), inyección intraperitoneal (IP), administración oral, en una parte del cuerpo afectada por una enfermedad inflamatoria. En realizaciones particulares, la cantidad eficaz del compuesto puede estar entre aproximadamente 1 ng/kg y aproximadamente 1 mg/kg y, en realizaciones más particulares, entre 1 pg/kg y aproximadamente 500 pg/kg y, en una realización particular, la cantidad eficaz del compuesto está entre aproximadamente 100 pg/kg y aproximadamente 400 pg/kg.
Descripción de las figuras
La Figura 1A ilustra una comparación de la acumulación de enfermedad y la acumulación de especificidad de enfermedad y la especificidad de enfermedad después de la inyección de 10 nmol de Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) en un ratón sano (izquierda) y un ratón que tiene colitis ulcerosa.
La Figura 1B ilustra una comparación de la acumulación de enfermedad y la especificidad de enfermedad en todo el tubo gastrointestinal, incluyendo el intestino delgado y grueso, después de la inyección de 10 nmol de Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) en un ratón sano (izquierda) y un ratón que tiene colitis ulcerosa.
La Figura 1C ilustra una comparación de la acumulación de enfermedad y la especificidad de enfermedad en el intestino grueso después de la inyección de 10 nmol de Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) en un ratón sano (izquierda) y un ratón que tiene colitis ulcerosa.
La Figura 2A ilustra una comparación de la acumulación de enfermedad y la especificidad de enfermedad después de la inyección de 10 nmol de Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) en un ratón sano (derecha) y un ratón enfermo que tiene artritis inducida por colágeno (AIC) (izquierda).
La Figura 2B ilustra una comparación de la acumulación de enfermedad y la especificidad de enfermedad después de la inyección de 10 nmol de Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) en un ratón sano y un ratón que tiene artritis inducida por colágeno (AIC).
La Figura 3 ilustra una comparación de la acumulación de enfermedad y la especificidad de enfermedad después de la inyección de 10 nmol de Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) en un ratón sano (derecha) y un ratón que tiene ateroesclerosis (izquierda).
La Figura 3B ilustra una comparación de la acumulación de enfermedad y la especificidad de enfermedad después de la inyección de 10 nmol de Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) en un ratón sano (derecha) y un ratón que tiene ateroesclerosis (izquierda).
La Figura 4 ilustra una comparación de la acumulación de enfermedad y la especificidad de enfermedad después de la inyección de 10 nmol de Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) en un ratón sano (izquierda) y un ratón que tiene fibrosis pulmonar (derecha).
Descripción detallada de la invención
Por tanto, los solicitantes han utilizado compuestos unidos a folato potencialmente capaces de alterar la función de las células inflamatorias, a fin de someter a tratamiento enfermedades mediadas por células inflamatorias.
En otra realización, el paciente puede padecer una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple, lupus eritematoso, psoriasis y otras inflamaciones de la piel, fibrosis pulmonar, artritis reumatoide, ateroesclerosis, lesiones inflamatorias, osteomielitis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, rechazo de trasplante de órganos, fibromialgia, artrosis, sarcoidosis, esclerosis sistémica, síndrome de Sjógren, glomerulonefritis, retinopatía proliferativa, reestenosis e inflamación crónica.
en donde W, X, Y, Z, cada uno, son H, Na o NH4.
La presente divulgación proporciona métodos de obtención de imágenes de enfermedades inflamatorias, incluyendo esclerosis múltiple, lupus eritematoso, psoriasis, fibrosis pulmonar y artritis reumatoide/inducida por colágeno (AIC), y enfermedades en las que la respuesta inmunitaria contribuye a la patogénesis, tales como ateroesclerosis, enfermedades inflamatorias, osteomielitis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH), fibromialgia, artrosis, sarcoidosis, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, inflamaciones de la piel (por ejemplo, psoriasis), glomerulonefritis, retinopatía proliferativa, reestenosis e inflamaciones crónicas, mediante compuestos de pteroílo de colorantes del infrarrojo cercano que son estables, fluorescen en el rango del infrarrojo y penetran profundamente en el tejido dirigido para producir una identificación específica y brillante de las áreas de tejido que expresan el receptor de folato. De manera más específica, los compuestos de pteroílo se pueden unir a los colorantes del infrarrojo cercano a través de un enlazador de aminoácidos. De manera incluso más específica, se ha hallado que en los casos en los que el enlazador de aminoácidos es tirosina o un derivado de tirosina, la intensidad de la fluorescencia del colorante se mantiene o incluso se potencia.
En las realizaciones preferidas, se muestra en el presente documento que tales compuestos de pteroílo se unen de manera específica a receptores de folato en, por ejemplo, macrófagos activados. Los macrófagos activados pueden contribuir a la fisiopatología de la enfermedad en algunos casos. Los macrófagos activados pueden sumir de manera no específica y destruir patógenos extraños dentro de las células mediante un ataque hidrolítico y oxidativo que dé como resultado la degradación del patógeno. Los péptidos de las proteínas degradadas se pueden presentar sobre la superficie celular inflamatoria donde estos se pueden reconocer mediante los linfocitos T y estos pueden interactuar directamente con los anticuerpos sobre la superficie de los linfocitos B, lo que da como resultado la activación de los linfocitos T y B y una mayor estimulación de la respuesta inmunitaria. Otros tipos de células inflamatorias que se pueden asociar a enfermedades inflamatorias incluyen monocitos y células progenitoras, incluyendo células progenitoras endoteliales. Se pueden obtener imágenes de tales enfermedades mediante la administración a un paciente que padece tal enfermedad de una cantidad eficaz de una composición que comprende un conjugado de la Fórmula general
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o una sal o un isótopo del mismo farmacéuticamente aceptables, en donde X es un aminoácido o un derivado del mismo e Y es un colorante que tiene un espectro de excitación y emisión de fluorescencia en el rango del infrarrojo cercano (IRC) y el compuesto mantiene o potencia la fluorescencia del colorante. Tales conjugados, cuando se administran a un paciente que padece inflamación, funcionan para concentrar y asociar el colorante conjugado a la población de células inflamatorias. La eliminación o desactivación de la población de células inflamatorias funciona para detener o reducir los síntomas característicos de la enfermedad que se está sometiendo a tratamiento. La obtención de imágenes de afecciones inflamatorias se lleva a cabo mediante la administración local de una cantidad eficaz del compuesto, incluyendo la administración mediante inyección directamente en la parte del cuerpo a irradiar mediante la luz de excitación (por ejemplo, por vía intracavitaria). La administración del conjugado, de manera típica, continúa hasta que los síntomas de la enfermedad se reducen o eliminan.
Por otra parte, la intensidad de la fluorescencia es mayor que la intensidad observada previamente con otros colorantes del infrarrojo cercano que se dirigen con folato para las isoformas de FR. Este aumento de la intensidad permite el direccionamiento y la identificación evidente de áreas más pequeñas de muestras biológicas (por ejemplo, áreas afectadas de inflamación más pequeñas) de un tejido que se está controlando. Además, el aumento de la intensidad de los compuestos y los métodos de obtención de imágenes de la presente divulgación proporciona la ventaja añadida de que se pueden administrar dosis/cantidades más bajas del colorante y todavía produce resultados significativos. Por tanto, los métodos de obtención de imágenes de enfermedades inflamatorias con los compuestos de la presente divulgación conducen a técnicas de obtención de imágenes más económicas. Por otra parte, existe la ventaja añadida de que una dosis más baja de los compuestos de la divulgación en comparación con los compuestos de obtención de imágenes convencionales minimiza la toxicidad y otros efectos secundarios que acompañan a la administración de materiales extraños a un cuerpo.
Además, la identificación de los tejidos afectados por la inflamación conducirá a un diagnóstico, una obtención de imágenes y una identificación más rápidos, más precisos y más eficaces de una enfermedad satelital. Cada una de estas ventajas se correlaciona de manera positiva con un mejor resultado clínico en el paciente que se está sometiendo a tratamiento.
En experimentos específicos, se halló que el uso de lisina como enlazador daba como resultado la pérdida de fluorescencia del infrarrojo cercano. Sin embargo, se contempla que, además de tirosina y derivados de tirosina, también puede resultar útil un compuesto de pteroílo de un colorante del infrarrojo cercano con cisteína o derivados de cisteína. Además, se contempla que un enlace directo del resto pteroílo o folato con el colorante o enlace del colorante con ácido pteroico o ácido fólico a través de un enlazador de amina también produce una pérdida de intensidad de la fluorescencia del compuesto, mientras que la presencia de la tirosina o derivados de tirosina como resto de enlace entre el pteroílo (resto de direccionamiento) y el colorante del infrarrojo cercano (el resto fluorescente) resulta beneficiosa para mantener o potenciar la fluorescencia del compuesto conjugado. Los compuestos basados en tirosina de la divulgación no requieren un enlazador de amina adicional para componer el S0456 y, además, porque la conjugación a través del resto fenol de la tirosina conduce a una fluorescencia potenciada.
Los compuestos se pueden usar con sistemas de obtención de imágenes tomográficas moleculares mediados por fluorescencia, tales como aquellos diseñados para detectar la activación de fluorescencia del infrarrojo cercano en tejidos profundos. Los compuestos proporcionan especificidad molecular y tisular, producen un contraste de fluorescencia alto, una señal de fluorescencia más brillante y reducen la autofluorescencia de fondo, lo que permite una detección temprana y un análisis de diana molecular mejorados in vivo (por ejemplo, cánceres o enfermedades inflamatorias). Los compuestos se pueden usar para la obtención de imágenes tridimensionales de tejido profundo, la cirugía dirigida y los métodos para la cuantificación de la cantidad de un tipo de célula diana en una muestra biológica.
Compuestos de conjugado
En un aspecto, la divulgación se refiere a compuestos que comprenden la Fórmula;, Fórmula (I):
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en donde:
X es un aminoácido o un derivado del mismo, e
Y es un colorante que tiene un espectro de excitación y emisión de fluorescencia en el rango del infrarrojo cercano y dicho compuesto mantiene o potencia la fluorescencia de Y.
En algunas realizaciones, el aminoácido o derivado de aminoácido induce un desplazamiento en el espectro de emisión electrónica, el espectro de absorción electrónica o el espectro tanto de emisión como de absorción electrónica, con respecto a los espectros electrónicos de la molécula de colorante sin modificar. De manera adecuada, el desplazamiento en el espectro electrónico es un desplazamiento batocromático (es decir, desplazamiento a una longitud de onda más larga/frecuencia más baja) que ayuda a mejorar la detección del compuesto en la ventana espectral del infrarrojo cercano (IRC) y/o reduce la cantidad de señal de fondo, autofluorescencia, interferencias del tejido que rodea el área que se visualiza. De manera más específica, este desplazamiento en el espectro electrónico se observa, en particular, con colorantes del IRC que comprenden átomos electronegativos que se incorporan al anillo de 6 elementos. Por tanto, en determinadas realizaciones, el aminoácido o el derivado de aminoácido (X) comprende un resto rico en electrones, tal como, por ejemplo, oxígeno, azufre o nitrógeno. Los ejemplos no limitantes de tales aminoácidos pueden incluir cisteína, metionina, treonina, serina, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina, lisina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina y glutamina o derivados de los mismos.
La divulgación proporciona un compuesto de Fórmula I, en donde Tyr se selecciona entre el grupo que consiste en:
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De manera adecuada, los compuestos desvelados en el presente documento tienen una longitud de onda de absorción de luz máxima en la región del infrarrojo cercano de entre aproximadamente 650 nm y 1.000 nm, por ejemplo y preferentemente, a aproximadamente 800 nm.
En realizaciones preferidas específicas, los compuestos desvelados en el presente documento incluyen un ligando (L) que es eficaz para dirigir el compuesto a un tipo de célula o tejido particular y permitir la obtención de imágenes de esa célula o tejido dirigido. Resulta preferible que L sea un resto pteroílo o resto folato y más preferible que L sea un resto pteroílo. Sin embargo, se contempla que la persona experta pueda usar algún otro ligando L para dirigir los compuestos a una proteína de superficie celular particular o proteína receptora de interés. En realizaciones específicas y preferidas, el ligando comprende pteroílo:
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Síntesis de compuestos
Los compuestos desvelados en el presente documento se pueden preparar usando métodos convencionales conocidos en la literatura. Véase, por ejemplo, que los compuestos de colorante se sintetizaron tal como se ha indicado anteriormente.
Sin embargo, en realizaciones preferidas específicas, la presente divulgación proporciona métodos sintéticos más eficaces para la generación de los compuestos descritos en el presente documento (es decir, los compuestos de Fórmula I), incluyendo el compuesto que tiene la Fórmula
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en donde W, X, Y, Z, cada uno, son H, Na o NH4 , que se pueden preparar de acuerdo con los esquemas generales representados en cada uno de los Esquemas I, II y III, a continuación.
El Esquema I ilustra un esquema sintético usado previamente para generar compuestos de Fórmula I donde el ligando diana comprende un resto pterina aromático, tal como folato o ácido pteroico. El Esquema I ilustra, en particular, los compuestos de Fórmula I donde el ligando diana comprende folato unido a través de un aminoácido (lisina) a la molécula de colorante. En resumen, el ligando de folato modificado mediante la unión al grupo amino del aminoácido se hace reaccionar con un derivado de éter puenteado del colorante en condiciones para producir los productos (3) y (4). Sin embargo, resulta notable que el compuesto 3 es el compuesto deseable preferido, pero la ruta sintética conduce a la presencia de un subproducto 4 no deseado como producto principal que no tiene propiedades del IRC. Por otra parte, sus propiedades espectrales dependen del pH. Por tanto, este esquema demuestra el principal inconveniente de los colorantes con puente de éter. En la producción convencional de estos colorantes, el 30 - 60 % del rendimiento es del producto deseado, mientras que el 40 - 70 % del rendimiento es del subproducto no deseado.
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El Esquema II proporciona una ruta sintética que incluye solo tres etapas de reacción y proporciona el compuesto del producto (5) con altos rendimientos (por encima del 98 %). En resumen, el ligando de direccionamiento (1) (ilustrado en el Esquema II con un grupo pteroílo) y un aminoácido o derivado de aminoácido (2) que opcionalmente incluye grupos protectores para evitar una reactividad no deseada con grupos distintos del grupo amino del aminoácido se mezclan en un sistema de disolvente de HATU[hexafluorofosfato de (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio)]/DIPEA (diisopropiletilamina)/DMF (dimetilformamida) y se hacen reaccionar a temperatura ambiente y durante un tiempo suficiente (5 minutos) para permitir el acoplamiento de (2) a través de la funcionalidad amino al ligando (1) para proporcionar (3). El compuesto (3) se puede precipitar de manera ventajosa mediante la adición de ácido diluido a la mezcla de reacción, incluyendo otros disolventes, tales como dimetilsulfóxido (DMSO). De manera más específica, el compuesto 3 se precipitó en HCl 1 N (ácido clorhídrico) para obtener el compuesto final con más del 98 % de pureza, en estas realizaciones, se evitan las costosas etapas de HPLC o cromatografía en columna. El compuesto (3) se hace reaccionar para retirar los grupos protectores en la parte de aminoácidos del compuesto mediante la reacción del compuesto a temperatura ambiente en un sistema de disolvente de TFA (ácido trifluoroacético):agua:TIPS (triisopropilsilano) para proporcionar el compuesto (4). El compuesto 4 se purificó mediante precipitación con éter de dietilo o éter de metil-t-butilo para proporcionar una pureza superior al 98 % sin HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) o cromatografía en columna. El compuesto (4) se hace reaccionar en un sistema acuoso básico (por ejemplo, NaOH, hidróxido de sodio) con el fin de retirar las funcionalidades de grupo protector y, posteriormente, se hace reaccionar, en ligero exceso molar, con el colorante (S0456) en agua durante un tiempo de 15 minutos y a una temperatura de 70-100 0C que permite el acoplamiento entre el colorante y (4), para producir el compuesto final (5). El compuesto 5 se precipitó con acetona para dar más del 98 % de Pte-Tyr-S0456 puro. Cuando se usa NaOH, se produce la sal de sodio de Pte-Tyr-S0456.
Esquema II
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El Esquema III proporciona una ruta sintética en fase sólida alternativa para producir los compuestos desvelados en el presente documento y proporciona rendimientos similares a los descritos en el Esquema II. En resumen, un aminoácido unido a un sustrato (1) (ilustrado en el Esquema III a continuación como tirosina protegida unida a una perla de resina) se hace reaccionar para retirar el grupo protector Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) en piperidina al 20 % en DMF y, posteriormente, se hace reaccionar con el ligando de direccionamiento (de nuevo ilustrado mediante pteroílo a continuación) en HATU/DIPEA/DMF durante un tiempo y a una temperatura suficiente para permitir el acoplamiento del ligando al grupo funcional amina del aminoácido para proporcionar (2). El compuesto (2) se hace reaccionar para retirar el sustrato y cualquier grupo protector en el aminoácido en una serie de reacciones en un sistema de disolvente de TFA:Agua:TIPS para proporcionar (3). Después de una etapa final similar a la descrita en el Esquema II, el compuesto (3) se hace reaccionar en un sistema acuoso básico para retirar las funcionalidades de grupo protector y, posteriormente, se hace reaccionar, en ligero exceso molar, con el colorante (S0456) en agua durante un tiempo y a una temperatura que permite el acoplamiento entre el colorante y (3), para producir el compuesto final (4).
Esquema III:
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Los esquemas anteriores simplemente ilustran varios enfoques sintéticos no limitantes mediante los que se pueden preparar los compuestos desvelados en el presente documento. Se apreciará que un experto en la materia será capaz de identificar e incorporar modificaciones a los esquemas anteriores que proporcionarían otros compuestos que tuvieran las propiedades físicas que se encuentran dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, aunque los Esquemas anteriores ilustran grupos folato y pteroílo como ligandos de direccionamiento de los compuestos desvelados en el presente documento, un experto apreciará que otros ligandos de direccionamiento se pueden incorporar fácilmente en el esquema sintético y generan compuestos alternativos de la Fórmula I, tales como Pte-L-Tyr-S0456 (OTL-0038), tal como se muestra en la Figura 1. Como otro ejemplo, un experto apreciará que las longitudes de onda de absorción/emisión de la parte de colorante de los compuestos se pueden modular mediante el ajuste de la longitud de la cadena de polimetina y la selección de los grupos arilo o heteroarilo apropiados (por ejemplo, indol frente a benzindol), así como la unión de grupos aminoácidos. En un ejemplo adicional, un experto en la materia reconocerá que el coeficiente de extinción y la intensidad de fluorescencia del colorante se pueden variar mediante el ajuste de la rigidez de la cadena de polimetina (por ejemplo, mediante la introducción de un sistema de anillo en la cadena de polimetina, tal como ciclohexeno, ciclobutenona, entre otros), tal como se conoce, en general, en la técnica. Por consiguiente, un experto en la materia será capaz de modificar la síntesis mediante la selección de los reactivos apropiados para preparar cualquiera de los compuestos desvelados en el presente documento y, opcionalmente, será capaz de variar las propiedades físicas particulares de los compuestos.
Métodos de obtención de imágenes
Tal como se ha señalado anteriormente en el presente documento, existe la necesidad de compuestos de colorante del infrarrojo cercano que se dirijan de manera específica a regiones dentro de un tejido. Esto es para que los compuestos se puedan usar en técnicas de obtención de imágenes y para ayudar en el diagnóstico y la intervención terapéutica de la enfermedad inflamatoria. Tal como se ha analizado con detalle anteriormente, los compuestos proporcionados en el presente documento son útiles como colorantes y agentes de obtención de imágenes en la región del IRC del espectro de luz. Como tales, los compuestos tienen una amplia aplicabilidad a cualquier cantidad de métodos de obtención de imágenes, diagnósticos y terapéuticos dirigidos.
En realizaciones específicas, la presente divulgación se refiere a métodos, un método para someter a tratamiento una enfermedad inflamatoria que comprende administrar a un paciente que necesita tal proceso una cantidad eficaz de un compuesto que incorpora al menos uno de los compuestos desvelados en el presente documento (por ejemplo, la Fórmula I se puede usar para identificar de manera específica y sensible la enfermedad inflamatoria dentro de un tejido). En otras realizaciones, la presente divulgación se refiere al uso de un compuesto denominado Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) para diagnósticos y la obtención de imágenes relacionados con 1) la obtención de imágenes de ganglios linfáticos, 2) enfermedades inflamatorias, 3) ateroesclerosis, 4) enfermedades infecciosas y/o 5) cirugía guiados por imágenes, así como otros usos. En otros aspectos, el derivado de Pte-Tyr-S0456 puede ser Pte-D-Tyr-S0456, Ptehomo-Tyr-S0456, Pte-p-homo-Tyr-S0456, Pte-(NMe)-Tyr-S0456, Pte-Tyr(OMe)-S0456, Pte-Tyr(OBn)-S0456, Pte-NHNH-Tyr-OAc-S0456, sales o derivados de los mismos. De esta manera, los compuestos de la presente divulgación pueden ser útiles en la obtención de imágenes guiada por fluorescencia de la inflamación sistémica y, si es necesario, la resección quirúrgica de enfermedades, ganglios linfáticos y similares. Como alternativa, los compuestos de la presente divulgación se pueden usar fácilmente en la obtención de imágenes de cuerpo entero en la que el compuesto se administra a un sujeto y la localización de la fluorescencia facilita la identificación de un tejido inflamado o sitio de cáncer.
De esta manera, los compuestos de la presente divulgación se pueden usar para la identificación in vivo de tejido enfermo en un sujeto que lo necesita. El método de divulgación incluye irradiar una parte del cuerpo in vivo del sujeto que contiene tejido enfermo con luz que tiene al menos una longitud de onda de excitación en el rango del infrarrojo cercano de aproximadamente 600 nm a aproximadamente 1.000 nm. La fluorescencia que emana de un compuesto de la presente divulgación administrado al sujeto y que se ha unido de manera específica a y/o se ha absorbido por el tejido enfermo en la parte del cuerpo, en respuesta a la al menos una longitud de onda de excitación, se observa directamente para determinar la localización y/o el área de superficie del tejido enfermo en el sujeto.
La luz que tiene un rango de longitud de onda de 600 nm y 850 nm se encuentra dentro del rango del infrarrojo cercano del espectro, en contraste con la luz visible, que se encuentra dentro del rango de aproximadamente 400 nm a aproximadamente 500 nm. Por lo tanto, la luz de excitación usada en la práctica de los métodos de diagnóstico de la divulgación contendrá al menos una longitud de onda de luz que ilumina el tejido en la longitud de onda infrarroja para excitar los compuestos con el fin de que la fluorescencia obtenida del área que tiene la absorción de los compuestos de la presente divulgación sea claramente visible y distinta de la autofluorescencia del tejido circundante. La luz de excitación puede ser monocromática o policromática. De esta manera, los compuestos de la presente divulgación son ventajosos ya que eliminan la necesidad de uso de los mecanismos de filtrado que se usarían para obtener una imagen de diagnóstico deseada si la sonda fluorescente es una que fluoresce a longitudes de onda inferiores a aproximadamente 600 nm. De esta manera, los compuestos de la presente divulgación evitan las imágenes de diagnóstico oscurecidas que se producen como resultado de la luz de excitación de las longitudes de onda que se reflejarían del tejido sano y causan la pérdida de resolución de la imagen fluorescente.
Los laboratorios de diagnóstico, los consultorios médicos y los quirófanos para procedimientos quirúrgicos se pueden equipar con una lámpara de quirófano que produce longitudes de onda de luz en el espectro de emisión óptica útil en la práctica de los métodos de diagnóstico de la divulgación, tal como las lámparas que producen luz en la longitud de onda adecuada. Tal luz se puede utilizar en la práctica de los métodos de diagnóstico de la divulgación simplemente apagando las otras luces del quirófano (para eliminar la luz extraña que se reflejaría visiblemente del tejido en la parte del cuerpo sometida a investigación) y brillando la luz de excitación de longitud de onda del infrarrojo cercano dentro de la cavidad del cuerpo o abertura creada quirúrgicamente para que la imagen fluorescente recibida directamente por el ojo del observador (por ejemplo, el cirujano) sea predominantemente la imagen fluorescente que emana del/de los fluoróforos en el campo de visión. La luz que emana de una fuente en el rango de 600 nm y 850 nm, preferentemente en el rango de 750 nm-850 nm, se usaría para lograr el objetivo de la visualización directa por parte del observador, de tal manera que la luz que se refleja de la parte del cuerpo, aparte de la del/de los resto/s fluorescente/s, se minimice o elimine.
Por consiguiente, el tejido enfermo (y la construcción de direccionamiento unida o absorbida) se "expone" a la luz de excitación (por ejemplo, mediante la abertura creada quirúrgicamente o la provisión endoscópica de la luz a una localización interior). La divulgación de estos métodos de obtención de imágenes es, en particular, apta para la detección in vivo de tejido enfermo localizado en un sitio interior del sujeto, tal como dentro de una cavidad natural del cuerpo o una abertura creada quirúrgicamente, donde el tejido enfermo está "a la vista" (es decir, expuesto al ojo humano) para facilitar un procedimiento de biopsia o escisión quirúrgica del área que se ha resaltado mediante la absorción de los compuestos de la presente divulgación. Como la localización y/o área de superficie precisa del tejido enfermo o inflamado se determinan fácilmente mediante la absorción de los compuestos de la presente divulgación, los métodos que emplean los compuestos de la presente divulgación proporcionan una valiosa guía para los patólogos, inmunólogos, técnicos y cirujanos por igual, que necesitan "observar" en tiempo real los contornos exactos, el tamaño, etc. de la masa de las áreas inflamadas para el diagnóstico y la obtención de imágenes y, si es necesario, la cirugía.
Por tanto, en realizaciones específicas, la presente divulgación implica la obtención de imágenes ópticas de un tejido biológico que expresa un receptor de folato mediante la administración a un paciente que tiene una enfermedad inflamatoria poniendo en contacto el tejido con una composición que comprende una cantidad eficaz de los compuestos de la presente divulgación (por ejemplo, los compuestos de Fórmula I) y permitiendo tiempo para que el compuesto en la composición se distribuya dentro del tejido e interactúe con el sitio del receptor de folato. Después de que haya transcurrido un tiempo suficiente para tal interacción, el tejido se ilumina con una luz de excitación para provocar la fluorescencia del compuesto en la composición. A continuación, se detecta la fluorescencia siempre y cuando se observe que tal fluorescencia es un área que contiene el receptor de folato.
De la misma manera, los compuestos de la presente divulgación se usan para identificar un tipo de célula diana en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con tales compuestos durante un tiempo y en condiciones que permitan la unión del compuesto a al menos una célula del tipo de célula diana. A continuación, el compuesto unido se detecta ópticamente, de tal manera que la presencia de fluorescencia de la longitud de onda del infrarrojo cercano que emana del compuesto unido y dirigido de la presente divulgación indica que el tipo de célula diana está presente en la muestra biológica. Por tanto, este método proporciona una imagen del tipo de célula diana en el tejido que se analiza. Lo más preferentemente, el tipo de célula diana es una célula inflamatoria activada, incluyendo, pero sin limitación, macrófagos, monocitos y células progenitoras, incluyendo células progenitoras endoteliales.
La vía más adecuada para la administración de una cantidad eficaz de los compuestos conjugados desvelados en el presente documento variará dependiendo de la enfermedad a someter a tratamiento o la localización de la afección sospechada a diagnosticar. Esta incluye, pero sin limitación, vía parenteral, por ejemplo, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. En otras realizaciones, el conjugado se puede administrar al paciente mediante otros procesos médicamente útiles y se puede usar cualquier dosis y forma de dosificación terapéutica adecuada eficaz, incluyendo formas de dosificación de liberación prolongada. De manera ilustrativa, el método descrito en el presente documento se puede usar en combinación con terapias biológicas, tales como otras inmunoterapias, incluyendo, pero sin limitación, terapia con anticuerpos monoclonales, tratamiento con agentes inmunomoduladores y vacunación. Por ejemplo, en el tratamiento de afecciones inflamatorias, la administración local, incluyendo la administración mediante inyección directamente en la parte del cuerpo a irradiar mediante la luz de excitación (por ejemplo, por vía intracavitaria), proporciona la ventaja de que la construcción de direccionamiento (por ejemplo, los anticuerpos marcados con fluorescencia) se puede administrar en una alta concentración sin riesgo de complicaciones que puedan acompañar a la administración sistémica de la misma. Sin embargo, también se pueden prever aplicaciones orales, tópicas y parenterales.
Estos métodos proporcionan, de manera ventajosa, un método mejorado para realizar un diagnóstico guiado por imágenes y un tratamiento de la enfermedad inflamatoria en un sujeto como la administración de una composición que comprende el compuesto de la divulgación en condiciones y durante un tiempo suficiente para que dicho compuesto se acumule en un sitio de tejido dado ayudará a un médico a visualizar el tejido a someter a tratamiento.
Si el supuesto sitio enfermo es una cavidad del cuerpo natural o un sitio interior producido quirúrgicamente, opcionalmente, se puede usar un dispositivo endoscópico para proporcionar la luz de excitación al sitio, para recibir la fluorescencia que emana del sitio dentro de una cavidad del cuerpo y para ayudar en la formación de una imagen directa de la fluorescencia del tejido enfermo. Por ejemplo, se puede usar una lente en el dispositivo endoscópico para enfocar la fluorescencia detectada como ayuda en la formación de la imagen. Tal como se usa en el presente documento, se dice que tal fluorescencia administrada por endoscopio se "observa directamente" por parte del especialista y el tejido al que se une la construcción de direccionamiento o en el que se absorbe debe estar "a la vista" del endoscopio, dado que la luz usada en el procedimiento de diagnóstico de la divulgación no contendrá longitudes de onda de luz que penetren en el tejido, tales como longitudes de onda en el rango del infrarrojo cercano. Como alternativa, la luz de excitación se puede dirigir mediante cualquier medio conveniente a una cavidad del cuerpo o abertura quirúrgica que contenga una construcción de direccionamiento administrada tal como se describe en el presente documento y la imagen fluorescente así producida se puede visualizar directamente mediante el ojo del observador sin ayuda de un endoscopio. Con o sin ayuda de cualquier tipo de dispositivo endoscópico, la imagen fluorescente producida mediante el método de la divulgación es tal que se puede observar sin la ayuda de un dispositivo de procesamiento de imágenes, tal como una cámara CCD, un monitor de TV, un dispositivo colector de fotones y similares.
Se contempla que los métodos de diagnóstico u obtención de imágenes de la presente divulgación permiten al cirujano/especialista observar/ver/visualizar el tejido enfermo o anómalo a través de una abertura quirúrgica para facilitar un procedimiento de biopsia o escisión quirúrgica. Como la localización y/o el área de superficie del tejido enfermo se determina fácilmente mediante el procedimiento de diagnóstico de la divulgación que emplea los compuestos descritos en el presente documento, el método de la divulgación es una guía valiosa para el cirujano, que necesita conocer los contornos exactos, el tamaño, etc. de la masa, por ejemplo, para la resección a medida que avanza la cirugía. En particular, se observa que los compuestos de la divulgación fluorescen en el rango del infrarrojo cercano a una intensidad mayor que aquellos descritos anteriormente. Como tal, de manera ventajosa, se contempla que se necesitará menos del compuesto para lograr la obtención de imágenes de diagnóstico. Además, los compuestos de la presente divulgación penetran profundamente en el tejido y, por tanto, la divulgación permite, de manera ventajosa, una mayor precisión de que se tome el transcurso adecuado de tratamiento de la enfermedad inflamatoria.
En algunas realizaciones, se depende de un solo tipo de resto fluorescente para la generación de la fluorescencia que emana de la parte del cuerpo irradiada (es decir, de la construcción de direccionamiento fluorescente que se une a o se absorbe mediante el tejido enfermo) y el sometimiento de la construcción de direccionamiento con una fuente de luz del espectro del infrarrojo cercano.
En otras realizaciones, se contempla que se usa una pluralidad (es decir, dos, tres, cuatro o más) de construcciones de direccionamiento para obtener una imagen de diagnóstico. Tales construcciones de direccionamiento adicionales pueden ser compuestos adicionales de la presente divulgación distintos del primer compuesto de este tipo. Como alternativa, las construcciones de direccionamiento adicionales pueden comprender los colorantes descritos en el presente documento, pero con el resto pteroílo estando reemplazado por un ligando para otro receptor distinto del receptor de folato. En otras realizaciones más, los restos de direccionamiento adicionales pueden ser otras construcciones de direccionamiento fluorescentes (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos biológicamente activos de los mismos, que tienen fluoróforos unidos) que se unen a otros receptores o antígenos en el tumor o el tejido (por ejemplo, un sitio de ateroesclerosis, infección, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades inmunológicas, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades respiratorias, enfermedades metabólicas, enfermedades hereditarias, enfermedades infecciosas, enfermedades óseas y enfermedades medioambientales o similares) a obtener imágenes. Se puede usar cualquier resto de direccionamiento adicional que se dirija de manera específica al tumor o sitio específico en el tejido, siempre que este sea específico para el sitio a controlar. El fin de la construcción de direccionamiento fluorescente adicional es aumentar la intensidad de la fluorescencia en el sitio a controlar, ayudando de este modo en la detección de tejido enfermo o anómalo en la parte del cuerpo. Por ejemplo, un tejido enfermo dado puede tener numerosos marcadores y, además de los compuestos de la presente divulgación, se proporciona una mezcla de restos fluorescentes que son específicos para ese sitio dado, de tal manera que la señal que emana del tejido se genera mediante más de un compuesto o resto fluorescente que se ha dirigido y se ha localizado en el sitio de tejido de interés.
En la práctica, la persona experta administraría un compuesto de la presente divulgación, ya sea solo o como parte de una mezcla de restos detectables de direccionamiento, y permitiría que estos compuestos y restos de direccionamiento se unieran y/o absorbieran mediante cualquier tejido de direccionamiento que pudiera estar presente en el sitio sometido a investigación y, a continuación, proporcionaría un suministro de la fuente de luz. De manera típica, los compuestos de la presente divulgación y cualquier resto de direccionamiento adicional se administrarán antes de la cirugía durante un tiempo y en composiciones que permiten que los compuestos fluorescentes de la presente divulgación, así como cualquier construcción fluorescente adicional, se absorban mediante el tejido diana.
Aquellos expertos en la materia serán capaces de idear combinaciones de construcciones de direccionamiento fluorescentes administradas sucesivamente, cada una de las cuales se une de manera específica al sitio diana. Resulta preferible que todas las construcciones de direccionamiento fluorescentes usadas en tales mezclas para identificar el tejido diana comprendan fluoróforos que fluorescen dentro de la misma banda de longitud de onda o en la misma longitud de onda que el compuesto de la presente divulgación (por ejemplo, un fluorescente sensible a la longitud de onda del infrarrojo cercano de la luz en los compuestos de la presente divulgación) para minimizar el número de diferentes fuentes de luz que deben emplearse para excitar la fluorescencia simultánea de todas las diferentes construcciones de direccionamiento usadas en la práctica del método de la divulgación. Sin embargo, se contempla que los restos de direccionamiento adicionales distintos de los compuestos de la presente divulgación pueden fluorescer en respuesta a la luz de irradiación en un color diferente (es decir, tiene una longitud de onda diferente) al de los compuestos fluorescentes de la presente divulgación. La diferencia en los colores de la fluorescencia que emana de los compuestos de la presente divulgación y aquellos de los compuestos de direccionamiento adicionales puede ayudar al observador a determinar la localización y el tamaño del tejido enfermo. En algunos ejemplos, puede resultar deseable incluir fluoróforos en las construcciones de direccionamiento dirigidas al tejido normal diana y los compuestos de la presente divulgación para dirigirse al tejido enfermo de tal manera que el contraste entre el tejido enfermo y el tejido normal se potencie aún más para ayudar adicionalmente al observador a determinar la localización y el tamaño del tejido diana. El uso de tales fluoróforos y agentes de direccionamiento adicionales, además de los compuestos de la presente divulgación, proporciona la ventaja de que cualquier fluorescencia natural que emana del tejido normal está ocultada por la fluorescencia que emana del/de los fluoróforo/s en construcciones de direccionamiento complementarias dirigidas al tejido normal en la parte del cuerpo. Cuanto mayor es la diferencia de color entre la fluorescencia que emana del tejido normal y diana, más fácil resulta para el observador visualizar los contornos y el tamaño del tejido diana. Por ejemplo, el direccionamiento de una construcción de direccionamiento fluorescente que comprende un fluoróforo que produce luz infrarroja a partir de los compuestos de la presente divulgación al tejido diana (es decir, el tejido anómalo) y un fluoróforo que produce luz verde al tejido sano ayuda al observador a distinguir el tejido diana del tejido normal. Aquellos expertos en la materia pueden seleccionar fácilmente una combinación de fluoróforos que presenten un contraste de color visual distinto.
El espectro de luz usado en la práctica del método de la divulgación se selecciona para contener al menos una longitud de onda que corresponda a la longitud de onda de excitación predominante de la construcción de direccionamiento o de un resto fluorescente biológicamente compatible contenido dentro de la construcción de direccionamiento. En general, la luz de excitación usada en la práctica del método de la divulgación comprende al menos una longitud de onda de excitación de luz en el rango de longitud de onda del infrarrojo cercano de aproximadamente 600 nm a aproximadamente 850 nm.
Sin embargo, cuando se usa una combinación de ligandos de direccionamiento que fluorescen a diferentes longitudes de onda en la práctica de la divulgación, el espectro de la luz de excitación debe ser lo suficientemente amplio como para proporcionar al menos una longitud de onda de excitación para cada uno de los fluoróforos usados. Por ejemplo, resulta particularmente beneficioso, cuando se seleccionan fluoróforos de diferentes colores para distinguir el tejido normal del tejido enfermo, que el espectro de excitación de la/s luz/luces incluya longitudes de onda de excitación para los fluoróforos dirigidos al tejido normal y diana.
Tal como se observa en el presente documento, los compuestos de la presente divulgación se dirigen de manera específica al receptor de folato por medio de pteroílo o ligando de folato, que forma parte de los compuestos de la presente divulgación. En las realizaciones en las que se usa un resto de direccionamiento adicional, la construcción de direccionamiento de tal resto de direccionamiento adicional se selecciona para unirse y/o absorberse de manera específica mediante el tejido diana de interés, por ejemplo, a un antígeno u otra característica de superficie contenida sobre o dentro de una célula que caracteriza una enfermedad o estado anómalo en el tejido diana. Como en otros análisis de diagnóstico, resulta deseable que la construcción de direccionamiento se una a o se absorba mediante el tejido diana de manera selectiva o a un antígeno asociado a la enfermedad o estado anómalo; sin embargo, las construcciones de direccionamiento que contienen restos de ligando que también se unen a o se absorben mediante el tejido sano o las estructuras celulares se pueden usar en la práctica del método de la divulgación siempre que la concentración del antígeno en el tejido diana o la afinidad de la construcción de direccionamiento para el tejido diana sea suficientemente mayor que para el tejido sano en el campo de visión, de tal manera que una imagen fluorescente que representa el tejido diana se pueda visualizar claramente como distinta de cualquier fluorescencia que provenga del tejido sano o las estructuras en el campo de visión.
La enfermedad o el estado anómalo detectado mediante el método de la divulgación puede ser de cualquier tipo caracterizado por la presencia de un tejido diana conocido para el que se conoce un ligando de unión específico. Por ejemplo, diversas afecciones cardíacas se caracterizan por la producción de tejido necrótico o isquémico o la producción de tejido arterioesclerótico para el que se conocen ligandos de unión específicos. Se contempla que el tejido diana se puede caracterizar por células que producen un antígeno de superficie para el que se conoce un ligando de unión o un marcador intracelular (es decir, antígeno), dado que muchas construcciones de direccionamiento penetran en la membrana celular. Las enfermedades representativas que se pueden identificar usando el método de la divulgación incluyen diversas afecciones, tales como diferentes tipos de tumores, infecciones bacterianas, fúngicas y víricas y similares. Tal como se usa en el presente documento, el tejido "anómalo" incluye afecciones precancerosas, tejido necrótico o isquémico y tejido asociado a enfermedades del tejido conectivo y trastornos autoinmunitarios y similares. Además, los ejemplos de los tipos de tejido diana adecuados para el diagnóstico o examen usando el método de la divulgación incluyen tejido cardíaco, de mama, de ovario, uterino, de pulmón, endotelial, vascular, gastrointestinal, colorrectal, tejido prostático, tejido endocrino y similares, así como combinaciones de dos o más cualesquiera de los mismos.
Simplemente a modo de ejemplo, los antígenos de algunas neoplasias malignas frecuentes y las localizaciones del cuerpo en las que se hallan frecuentemente son conocidos por parte de los expertos en la materia y los ligandos de direccionamiento, tales como los anticuerpos, o para estos antígenos o incluso los ligandos donde los antígenos son receptores se conocen en la técnica.
Las construcciones de direccionamiento y las construcciones de direccionamiento complementarias usadas en la práctica del método de la divulgación se pueden administrar mediante cualquier vía conocida por parte de aquellos expertos en la materia, tal como por vía tópica, intraarticular, intracisternal, intraocular, intraventricular, intratecal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, intratraqueal, intracavitaria y similares, así como mediante cualquier combinación de dos o más cualesquiera de las mismas.
La vía más adecuada para la administración variará según la enfermedad a someter a tratamiento o la localización de la afección o tumor sospechado a diagnosticar. Por ejemplo, para la obtención de imágenes de afecciones inflamatorias y diversos tumores, la administración local, incluyendo la administración mediante inyección directamente en la parte del cuerpo a irradiar mediante la luz de excitación (por ejemplo, por vía intracavitaria), proporciona la ventaja de que la construcción de direccionamiento (por ejemplo, los anticuerpos marcados con fluorescencia) se puede administrar en una alta concentración sin riesgo de complicaciones que puedan acompañar a la administración sistémica de la misma.
Los compuestos de la presente divulgación, así como cualquier construcción de direccionamiento adicional usada en mezclas de diagnóstico que comprenden los compuestos de la presente divulgación, se administran en una "cantidad eficaz" para el diagnóstico. Una cantidad eficaz es la cantidad de una construcción de direccionamiento necesaria para ayudar en la visualización directa de cualquier tejido diana localizado en la parte del cuerpo sometida a investigación en un sujeto. Se considera que un "sujeto", tal como se usa el término en el presente documento, incluye cualquier mamífero, tal como una mascota domesticada, un animal de granja o un animal de zoo, pero preferentemente es un ser humano. Las cantidades eficaces para el uso de diagnóstico dependerán, por supuesto, del tamaño y la localización de la parte del cuerpo a investigar, la afinidad de la construcción de direccionamiento para el tejido diana, el tipo de tejido diana, así como la vía de administración. La administración local de la construcción de direccionamiento requerirá, de manera típica, una dosificación menor que cualquier modo de administración sistémica, aunque la concentración local de la construcción de direccionamiento, en algunos casos, puede ser más alta después de la administración local de lo que se puede lograr con seguridad con la administración sistémica.
Una cantidad eficaz del compuesto de conjugado a administrar dependerá de la afección del paciente, la enfermedad que se está sometiendo a tratamiento, el peso molecular del conjugado, su vía de administración y distribución de tejidos y la posibilidad de uso conjunto con tratamientos terapéuticos, tales como la radioterapia. La cantidad eficaz que se administrará a un paciente se basa en el área de superficie del cuerpo, el peso del paciente y el análisis médico de la afección del paciente. En diversas realizaciones de ejemplo, se puede elaborar cantidad de dosis eficaz con o sin un excipiente/vehículo, incluyendo, pero sin limitación, solución salina. Dado que los sujetos individuales pueden presentar una amplia variedad en cuanto a la gravedad de los síntomas y cada construcción de direccionamiento tiene sus características de diagnóstico únicas, incluyendo, la afinidad de la construcción de direccionamiento para la diana, la velocidad de depuración de la construcción de direccionamiento mediante los procesos corporales, las propiedades del fluoróforo contenido en la misma y similares, el especialista experto sopesará los factores y variará las dosificaciones en consecuencia.
Los compuestos de la presente divulgación, así como las mezclas que comprenden estos compuestos, se pueden formular como una suspensión inyectable estéril de acuerdo con métodos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente atóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1-4, butanodiol. Los aceites no volátiles estériles se emplean, de manera convencional, como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos, ácidos grasos (incluyendo ácido oleico), aceites vegetales naturales, como el aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, etc., o vehículos grasos sintéticos, como el oleato de etilo, o similares. Los tampones, conservantes, antioxidantes, y similares, se pueden incorporar según sea necesario o, como alternativa, pueden comprender la formulación.
Los ejemplos que siguen se proporcionan simplemente con el fin de ilustrar realizaciones particulares de la divulgación y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Tal como se analiza en el presente documento, las características particulares de los compuestos y métodos desvelados se pueden modificar de diversas maneras que no son necesarias para la capacidad de funcionamiento o las ventajas que proporcionan. Por ejemplo, los compuestos pueden incorporar una diversidad de aminoácidos y derivados de aminoácidos, así como ligandos de direccionamiento, dependiendo del uso particular para el que se empleará el compuesto.
Ejemplos
EJEMPLO 1: Estudios in vivo de la colitis ulcerosa con Pte_L_Tyr_S0456 (OTL-0038):
A los ratones Balb/c de siete semanas (Harlan Laboratories) mantenidos con una dieta deficiente en folato se les administró sulfato sódico de dextrano al 5 % (DSS en inglés) en su agua potable para inducir la colitis ulcerosa. Los ratones de control sanos recibieron agua potable normal.
Después de 8 días, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 10 nmol de OTL-0038. Después de 4 horas, los ratones se sacrificaron y se obtuvieron imágenes usando luces IVIS II (tal como se muestra en las Figuras 1A-C).
EJEMPLO 2: Estudios in vivo de la artritis inducida por colágeno (AIC) (como modelo para la artritis reumatoide) con Pte_L_Tyr_S0456 (OTL-0038):
Se mantuvieron ratones hembra DBA/1 de 6-7 semanas (Jackson Laboratories) con una dieta deficiente en folato (Harlan-Teklad). Los ratones se inmunizaron en la base de la cola con 100 pg de colágeno bovino tipo II emulsionado en adyuvante de Freund completo (Chondrex, Inc., Redmond, WA, EE. UU.). Los ratones se reforzaron 21 días después con una inyección similar de 100 pg de colágeno bovino tipo II emulsionado en adyuvante de Freund incompleto. Después de cuatro días (Día 25), el inicio de la artritis se sincronizó en todos los ratones con una inyección intraperitoneal de 25 pg de lipopolisacárido (LPS) disuelto en solución salina. Los ratones de control sanos no se sometieron a la inducción de artritis.
El Día 39, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 10 nmol de OTL-0038. Después de 4 horas, los ratones se sacrificaron y se obtuvieron imágenes con unas luces IVIS II (tal como se muestra en las Figuras 2A-2B).
EJEMPLO 3: Estudios in vivo de la ateroesclerosis con Pte_L_Tyr_S0456 (OTL-0038):
Los ratones ApoE-l- macho de cinco semanas se adquirieron a través de Jackson Laboratories y se les puso en una dieta ajustada en calorías (42 % de grasa, Harlan Laboratories). Los ratones de control sanos se mantuvieron con una alimentación normal.
Después de 20 semanas, los ratones recibieron una inyección por vía intraperitoneal de 10 nmol de OTL38. Después de 4 horas, los ratones se sacrificaron y se obtuvieron imágenes con unas luces IVIS II (tal como se muestra en las Figuras 3A - 3B).
EJEMPLO 4: Estudios in vivo de la fibrosis pulmonar con Pte_L_Tyr_S0456 (OTL-0038):
Los ratones C57BL/6 hembra de 6 semanas (Harían Laboratories), mantenidos con una dieta deficiente en folato, se anestesiaron con isoflurano y se instilaron por vía intratraqueal 50 pl de bleomicina (2 U/kg de peso corporal) disuelta en solución salina a cada ratón. A los ratones de control sanos se les instiló de manera similar por vía intratraqueal con 50 pl de solución salina.
El Día 15, los ratones recibieron una inyección por vía intraperitoneal de 10 nmol de OTL38. Después de 4 horas, los ratones se sacrificaron y se obtuvieron imágenes con unas luces IVIS II (tal como se muestra en la Figura 4).
Resulta evidente para aquellos expertos en la materia que se pueden realizar diversos cambios en la divulgación sin apartarse del espíritu y el alcance de la misma y, por lo tanto, la divulgación abarca realizaciones, además de aquellas desveladas de manera específica en la memoria descriptiva, pero solo tal como se indica en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto capaz de unirse a una célula inflamatoria que tiene la Fórmula
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en donde W, X, Y, Z, cada uno, son H, Na, K o NH4.
2. Un método de obtención de imágenes de una enfermedad inflamatoria en donde se ha administrado una cantidad eficaz del compuesto capaz de unirse a una célula inflamatoria de acuerdo con la reivindicación 1 a un paciente que lo necesita y en donde dicho método comprende una etapa de obtención de imágenes fluorescentes de un área de la enfermedad inflamatoria en el cuerpo del paciente donde el compuesto se ha unido a una célula inflamatoria.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la célula inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en macrófagos activados, monocitos y células progenitoras, preferentemente macrófagos activados.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los macrófagos activados se localizan en las articulaciones, las arterias, los pulmones o el tubo gastrointestinal del paciente, preferentemente una articulación interfalángica, una articulación metatarsofalángica, una muñeca, un codo, un hombro, una rodilla, un tobillo o los dedos de las manos, un pulgar.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que comprende colitis ulcerosa, artritis reumatoide, fibrosis pulmonar, ateroesclerosis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso, psoriasis, osteomielitis, enfermedad de Crohn, enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH), fibromialgia, artrosis, sarcoidosis, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, inflamaciones de la piel (por ejemplo, psoriasis), glomerulonefritis, retinopatía proliferativa, reestenosis e inflamaciones crónicas, rizartrosis, artrosis, gota o lupus, preferentemente colitis ulcerosa, artritis reumatoide, ateroesclerosis o fibrosis pulmonar.
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