BR112015022810A2 - síntese e composição de grupos de ligação de aminoácidos conjugados a compostos utilizados para a criação de imagens específicas de tumores - Google Patents

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Abstract

“síntese e composição de grupos de ligação de aminoácidos conjugados a compostos utilizados para a criação de imagens específicas de tumores” resumo a presente divulgação tem relação com compostos que são úteis como sondas de fluorescência nir, em que os compostos incluem i) um ligante de pteroíla que se prende a uma proteína receptora alvo, ii) uma molécula de corante e iii) uma molécula ligante que é compreendida por um aminoácido ou derivado disto. a divulgação descreve também métodos e composições para fazer e para usar os compostos, métodos incorporando os compostos e kits incorporando os compostos. 1/1

Description

“SÍNTESE E COMPOSIÇÃO DE GRUPOS DE LIGAÇÃO DE AMINOÁCIDOS CONJUGADOS A COMPOSTOS UTILIZADOS PARA A CRIAÇÃO DE IMAGENS ESPECÍFICAS DE TUMORES” RELATÓRIO DESCRITIVO [001] O presente pedido de patente está relacionado com e reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisória U.S. N° de Série 61 /791,921, depositado em 15 de março de 2013, o conteúdo da qual se encontra aqui incorporado por referência em sua totalidade nesta divulgação.
CAMPO DA DIVULGAÇÃO [002] A presente divulgação é na área de diagnósticos. Esta divulgação fornece métodos para sintetizar e para utilizar grupos de ligação de aminoácido que são conjugados a um composto usado para a criação de imagens específicas de tumores. Conjugação dos grupos de ligação de aminoácido aumentam a especificidade e a detecção do composto. Os métodos e as composições para o uso disto em imagens de diagnóstico são contempladas.
FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO [003] A remoção cirúrgica de doença maligna constitui um dos mais comuns e eficientes terapêuticos para o tratamento primário de câncer. A resseção de todas as lesões malignas detectáveis resulta em não retorno detectável da doença em aproximadamente 50% de todos os pacientes1 e pode estender a expectativa de vida ou reduzir a mortalidade para pacientes nos quais a recorrência do câncer é vista. Não é uma surpresa que métodos cirúrgicos para alcançar cito redução mais quantitativa agora estão recebendo exame mais detalhado.
2/109 [004] A resseção de todas as lesões malignas detectáveis resulta em não retorno detectável da doença em aproximadamente 50% de todos os pacientes com câncer e pode estender a expectativa de vida ou reduzir a mortalidade para pacientes nos quais a recorrência do câncer é vista. Dada a importância de resseção total das lesões malignas, é benéfico garantir que as lesões malignas sejam identificadas precisa e completamente. A identificação de tecido maligno durante a cirurgia é atualmente alcançada por três métodos. O primeiro, diversos nódulos e massas de tumores podem ser visualmente detectados com base em core anormal, textura e/ou morfologia. Portanto, uma massa de tumor pode exibir cor variada, parecer assimétrica com uma margem irregular, ou se estender a partir dos contornos de um órgão saudável. Uma massa maligna também pode ser reconhecida pelo tato devido a diferenças em plasticidade, elasticidade ou solidez de tecidos saudáveis adjacentes. Finalmente, uns poucos focos de câncer podem ser localizados intraoperatoriamente usando corantes fluorescentes que fluem passivamente do tumor primário para os nódulos linfáticos de drenagem. Nesta última metodologia, nódulos linfáticos fluorescentes (sentinela) podem ser visualmente identificados, operados e examinados para determinar se células de câncer se metastetizaram a esses nódulos linfáticos.
[005] Apesar do reconhecimento da importância da remoção de tumor e da disponibilidade de certas técnicas de identificação para visualizar massa de tumor, muitos nódulos malignos ainda escapam detecção, levando à recorrência da doença e geralmente morte. Portanto, existe uma necessidade de identificação de tumor melhorada. Esta motivação levou à introdução de duas novas abordagens para visualização durante a cirurgia de doença maligna. Na primeira, um corante fluorescente temperado é injetado de forma sistemática no animal portador do tumor e a liberação da parte resfriada bruscamente por uma enzima específica de tumor, mudança de pH ou mudança em potencial de redox é explorada para ativar fluorescência seletivamente
3/109 dentro da massa maligna. Em uma segunda abordagem, um corante fluorescente é conjugado a um ligante de alvo específico de tumor que faz com que o corante afixado se acumule em cânceres que sobre expressa o receptor do ligante. Exemplos de ligantes de alvo de tumor usados para este último propósito incluem o ácido fólico, o qual exibe especificidade para cânceres positivos de receptor de folato (RE) de ovário, rim, pulmão, endométrio, mama e intestino e DUPA, o qual exibe especificidade para cânceres positivos de receptor de folato (FR) de ovário, rim, pulmão, endométrio, mama e intestino e DUPA, o qual pode fornecer corantes fluorescentes afixados seletivamente a células demonstrando antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), isto é, cânceres de próstata e a neovasculatura de outros tumores sólidos. Beneficamente, um corante fluorescente específico de folato (fluoresceína de folato ou EC 17) foi recentemente testado durante a cirurgia em pacientes humanos com câncer de ovário. Neste estudo, lesões ~5X mais malignas foram removidas com o auxílio do corante fluorescente específico de tumor do que sem ele e todas as lesões fluorescentes operadas foram confirmadas por patologia como sendo malignas.
[006] Técnicas fluorescentes convencionais usam sondas no espectro de luz visível (-400-600 nm), o qual não é ideal para cirurgia guiada por imagem pois é associado com um nível relativamente alto de luz de segundo plano não específica devido a colágeno nos tecidos. Por causa disto, a relação de sinal para ruído destes compostos convencionais é baixa. Além disso, a absorção de luz visível por cromóforos biológicos, em particular hemoglobina, limita a profundidade de penetração a alguns milímetros. Portanto tumores que estão enterrados mais fundo do que alguns milímetros no tecido podem permanecer indetectados. Além disso, equilíbrio de ionização de fluoresceína (pKa = 6,4) leva a absorção e emissão dependente de pH sobre a faixa de 5 a 9. Portanto, a fluorescência de corantes com base em fluoresceína é temperada em pH baixo (abaixo de pH 5).
[007] Por exemplo, o uso potencial de corante EC 17 para um uso
4/109 mais amplo em imagens óticas para a caracterização e a medição de tecido com doença em um ambiente clínico foi prejudicado por uma grande desvantagem que é o fato de que o corante afixado (fluoresceína) emite fluorescência na faixa visível. Isto torna o EC 17 e corante relacionados indesejados para uso ao vivo em tecidos porque tecidos tipicamente autofluorescem fortemente na faixa visível e a luz penetra no tecido de forma fraca. Além disso, o EC 17 (folato- etelenodiaminafluoresceína isotiocinato) consiste de um ligante de tiourea. Sabe-se bem que compostos de tiourea possuem pouco tempo de uso devido à instabilidade da ligação de tiourea. Portanto, um composto tal como o EC 17 não é ideal para o uso em imagens óticas por causa desta instabilidade e da decomposição relacionada da decomposição de ponte de tiourea.
[008] A combinação de absorção de luz por hemoglobina no espectro de luz visível (<600 nm) e água e lipídios na faixa do infravermelho (>900 nm), oferece uma janela de imagens óticas de aproximadamente 650 nm a 900 nm na qual o coeficiente de absorção de tecido está em um mínimo. Uma alternativa adequada a corantes que emitem luz na faixa visível seria desenvolver corantes que podem ser usados na faixa NIR (NIR) porque a luz na região NIR induz muito pouca autofluorescência e permeia o tecido de forma muito mais eficiente. Outro benefício de tecnologia fluorescente NIR é que o fundo da luz dispersa pela fonte de excitação é amplamente reduzido já que a intensidade de dispersão é proporcional ao inverso da quarta potência do comprimento de onda. Baixa fluorescência de funda é necessária para detecção altamente sensível. Além do mais, a janela oticamente transparente na região NIR (650 nm a 900 nm) em tecido biológico torna a fluorescência NIR uma tecnologia valiosa para imagens ao vivo e para aplicações de detecção subcelular que requerem a transmissão de luz através de componentes biológicos.
[009] Embora o uso de luz na faixa NIR para imagens de tecido mais profundo seja preferível a luz no espectro visível, os corantes de imagens
5/109
NIR atualmente usados na técnica sofrem com um número de desafios e desvantagens tais como uma suscetibilidade a fotobranqueador, estabilidade química fraca, espectro de absorção e de emissão que cai dentro da mesma faixa que diversas moléculas fisiológicas (resultando em alto sinal de segundo plano e autofluorescência). Além disso, a maioria dos corantes NIR não são estáveis durante a síntese, especialmente conjugando a um ligante com um ligante de amina, levando a múltiplos produtos colaterais indesejados. Portanto, levar agente de imagem NIR específico de ligante pode ser caro. Deste modo, métodos de imagem atuais que utilizam sondas fluorescentes NIR não são eficientes em imagem de tecido profundo (>5 mm da superfície), na quantificação do sinal de fluorescência em tecidos mamários, ou em custo de produção que aumenta o tempo translacional de pré-clínico para clínico.
[010] Duas abordagens promissoras para cirurgia guiada por fluorescência estão atualmente sob intensa investigação para uso clínico. Em um método, uma sonda fluorescente NIR ativável, a qual é minimamente fluorescente no estado estável devido à sua proximidade a um resfriador afixado, se torna altamente fluorescente após a liberação do resfriador em tecido maligno. Um dos mecanismos mais comumente usado para a liberação envolve a incorporação de uma sequência peptídica entre o corante e o resfriador que pode ser especificamente clivado por uma protease enriquecida de um tumor (isto é, catepsinas, caspases e matriz de metaloproteinases). Uma grande vantagem desta estratégia está na ausência de fluorescência em tecidos que não possuem a enzima de ativação, permitindo que tecidos ao longo do caminho de excreção (por exemplo, rins, bexiga, fígado) permaneçam não fluorescentes a menos que eles fortuitamente expressem a enzima de clivagem. Tais corantes NIR ativados por tumor também podem gerar fluorescência substancial na massa de tumor desde que a lesão maligna seja enriquecida na protease de clivagem e que o corante liberado seja retido no tumor. A grande desvantagem desta metodologia surge das poucas especificidades de tumor de muitas das hidrolases relevantes (a
6/109 maioria das quais também são expressas em tecidos saudáveis passando por remodelagem natural ou sofrendo inflamação). Além disso, a abundância das proteases desejadas pode variar entre massas de tumor, levando a lenta ou não ativação da fluorescência em algumas lesões malignas e rápido desenvolvimento de fluorescência em outras.
[011] Deste modo, permanece uma necessidade para uma substância corante que pode ser usada para alvejar especificamente tecido doente e possui brilho e estabilidade aumentados para uso ao vivo para imagens de tecido.
BREVE SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO [012] Esta divulgação fornece um método para sintetizar grupos de ligação de aminoácido que estão conjugados a um composto usado para fazer imagens específicas de tumores e de nódulos linfáticos. Em certas modalidades, esta divulgação está relacionada a um composto ou a um derivado de sal disto, que compreende um folato ou um ligante de pteroíla, um grupo de ligação e um corante fluorescente. Em certas modalidades, o grupo de ligação pode ser um aminoácido, um isômero, um derivado, ou uma mistura racêmica disto. Em outros aspectos, o corante fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste de LS288, IR800, SP054, SO 121, KODAK, S2076 e S0456 [013] Em alguns aspectos, esta divulgação fornece um método de conjugar um grupo de ligação de aminoácido a um corante fluorescente, em que o aminoácido pode ser a tirosina, a serina, a teronina, a lisina, a arginina, a asparagina, a glutamina, a cistina, a selenocistina, os isômeros e os derivados disto. Em certas modalidades, o aminoácido, os isômeros, ou os derivados disto, contêm um grupo funcional de -OH, NH2, ou -SH que com a adição do corante fluorescente em leve excesso produz a conjugação do grupo fluorescente com o aminoácido, o isômero, ou os derivados disto. Em outras modalidades, o aminoácido, os isômeros, ou os derivados disto, contêm um grupo funcional de -OH que
7/109 após síntese gera uma ligação éter com o corante fluorescente que aumenta o brilho e a detecção do composto. Em algumas modalidades, esta divulgação está relacionada à conjugação do grupo de ligação de aminoácido com o corante fluorescente, em que o aminoácido, os isómeros, ou os derivados disto, contêm um grupo funcional de -SH, SeH, -PoH, ou -TeH que após síntese gera uma ligação C-S, C-Se, C-Po, ou C-Te com o corante fluorescente. Em alguns aspectos, esta divulgação está relacionada à conjugação do grupo de ligação de aminoácido a um corante fluorescente que possui uma absorção e emissão máxima entre cerca de 500 nm e cerca de 900 nm. Em outros aspectos, o grupo de ligação de aminoácido está conjugado a um corante fluorescente que possui uma absorção e emissão máxima entre cerca de 600 nm e cerca de 800 nm.
[014] Em modalidades adicionais, esta divulgação fornece um método para conjugar o grupo de ligação de aminoácido a um ligante folato, em que o grupo de ligação de aminoácido é a tirosina, a serina, a teronina, a lisina, a arginina, a asparagina, a glutamina, a cistina, a selenocistina, os isómeros ou os derivados disto e está conjugado ao folato através de uma ligação de dipeptídeo. Em aspectos adicionais, esta divulgação fornece um método para conjugar o grupo de ligação com um ligante folato, em que o grupo de ligação é a tirosina, a serina, a teronina, a lisina, a arginina, a asparagina, a glutamina, a cistina, a selenocistina, os isómeros, ou os derivados disto e está conjugado ao folato através de uma ligação de homo-oligopeptídeo. Em outras modalidades, esta divulgação está relacionada a um método para conjugar um ligante de pteroíla a um grupo de ligação de aminoácido, em que o grupo de ligação é a tirosina, a serina, a teronina, a lisina, a arginina, a asparagina, a glutamina, a cistina, a selenocistina, os isómeros ou os derivados disto. Em certos aspectos, o ácido carboxílico do grupo de ligação é preso ao carbono alfa de qualquer aminoácido, aumentando assim a especificidade do composto para receptores específicos. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de aminoácido contribui com
8/109 especificidade ao composto, em que afinidade de ligação do composto observada a receptores específicos é receptor de folato.
[015] Em aspectos adicionais, o composto é altamente seletivo para alvejar células de tumor mostrando o receptor alvo.
[016] Em outras modalidades, esta divulgação está relacionada ao uso de um composto designado, Pte-Tyr-S0456 (OTL-0038) para cirurgia guiada por imagem, formação de imagem de tumor, formação de imagem de nódulo linfático, doenças inflamatórias, artereosclerose, doenças infecciosas, aplicações forenses, aplicações minerais, dentárias, coloração de gel, formação de sequência de DNA, ou cirurgia plástica. Em outros aspectos, o derivado de Pte-Tyr-S0456 pode ser Pte-D-Tyr-S0456, Pte-homoTyr-S0456, Pte-beta-homo-Tyr-S0456, Pte-(NMe)-Tyr-S0456, Pte-Tyr(OMe)-S0456, Pte-Tyr(OBn)-S0456, Pte-NHNH-Tyr-OAc-S0456, sais, ou derivados disto.
[017] Em outros aspectos, esta divulgação fornece um método para sintetizar o composto, em que um grupo de proteção é usado para evitar reatividade indesejada com grupos além dos grupos amina que possam gerar compostos indesejados. Os métodos fornecidos nesta divulgação produzem um composto final com um rendimento de mais de 98% de pureza.
[018] Em certos aspectos, esta divulgação está relacionada a um composto usado para a formação de imagens de tumores específicos, em que o composto pode ser usado para pesquisa, diagnóstico ou propósitos terapêuticos. Em outras modalidades, esta divulgação fornece uma composição compreendendo um composto de formação de imagem e um excipiente, diluentes, sais ou transportador farmaceuticamente aceitáveis.
[019] Em outros aspectos, esta divulgação está relacionada a um composto o qual possui uma fórmula selecionada a partir do grupo que consiste de:
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so3|-í
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em que W, X, Y ou Z é H, Na, ou NH4+,
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em que W, X, Y ou Z é H, Na, ou NH4+,
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Figure BR112015022810A2_D0007
em que W, X, Y ou Z é H, Na, ou NH4+,
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em que W, X, Y ou Z é H, Na, ou NH4+,
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em que W, X, Y ou Z é H, Na, ou NH4+,
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em que tirosina é beta homo,
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ho3s
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em que W, X, Y ou Z é H, Na, ou NH4+,
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e um sal farmaceuticamente aceitável disto.
BREVE DESCRIÇÃO DE DIVERSAS VISÕES DOS DESENHOS [020] Figura 1: Conjugados de corante folato-NIR de Ia geração alvejados em receptor de folato.
[021] Figura 2: Isotermas de ligação de conjugados de folato-NIR de Ia geração. Curvas de ligação de conjugados de corante folato-NIR para receptor de folato expressando células KB. Os conjugados alvejados são
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DyLight 680 (triângulos), Alexa Fluor 750 (diamantes) e IR800CW (círculos).
[022] Figura 3: Imagens fluorescentes de ratos com doença metastática (modelo experimental) 4 horas após injeção intravenosa de conjugados de corante folato NIR de Ia geração. Sobreposições de imagem de luz fluorescente e branca de ratos portadores de tumor intactos (A-D) e cirurgicamente abertos (a-d). Ratos nus atímicos com FR expressando tumores metastáticos L1210A foram injetados intravenosamente com 10 nmol folato-DyLight 680 (A/a) ou folatoDyLight 750 (B/b) e imagem formada 4 horas depois.
[023] Figura 4: Análise H&E de tecido operado durante cirurgia para a remoção de excesso de volume de tumor sequencial. A-D: Sobreposições de imagem de luz fluorescente e branca de ratos portadores de tumor metastático L1210A 4 horas após a injeção na veia da cauda com 10 nmol folato-IR800CW. A: Imagem de corpo inteiro. B: Cavidade torácica aberta. C: Após a remoção de tumor principal. D: Após a remoção de todos os nódulos secundários, a-d: H&E coloração de um: Pulmão de controle saudável, b: Tumor principal, c: nódulo de tumor secundário, d: Tecido residual.
[024] Figura 5: Conjugados de corante folato-NIR de 2a geração alvejados em receptor de folato.
[025] Figura 6: Isotérmicos de ligação (estudos concorrentes com ácido fólico rádio-marcador. Esta análise fornecerá afinidade de ligação e especificidade para receptor de folato ao mesmo tempo) de ligantes de folato e conjugados de corante folato NIR de 2a geração para células de câncer cultivadas. Curvas de ligação de A: folato-EDA- e B: conjugados de corante folato-Lys-NIR para receptor de folato expressando células KB. [026] Figura 7: Imagens fluorescentes e Biodistribuição de Tecidos ao vivo de conjugados de folato NIR de 2a geração. A: Imagens fluorescentes de ratos nus com xenoenxertos de tumor KB 2 horas após injeção intravenosa de conjugado folato NIR de 10 nmol, (a) grupo de rato administrado com conjugados de folato-EDA-NIR tiveram imagem
22/109 formada individualmente, (b) comparação frente a frente de ratos administrados com conjugado de folato-EDA-NIR e (c) grupo de rato administrado com conjugados de folato-Lys-NIR tiveram imagem formada individualmente. B: Biodistribuição de Tecidos ao vivo de animais administrados com conjugados de folato NIR.
[027] Figura 8: Conjugados de corante NIR de 3a geração alvejados em receptor de folato.
[028] Figura 9: Racional de conjugado de corante NIR Pte-L-TyrS0456. Estrutura química de Pteroyl-Tyr-S0456 (OTL-0038) com quatro funcionalidades benéficas, a = ácido pteróico como uma molécula alvo; b = σ-ácido carboxílico da tirosina para especificidade de tumor e melhorar a afinidade de ligação para o receptor de folato; c = parte fenólica da tirosina para melhorar a intensidade de fluorescência (clara); d = sonda fluorescente NIR. Por tanto, a tirosina age como parte de ligante e de corante NIR. Em outras palavras, a tirosina é um ligante que melhora a afinidade de ligação e especificidade de ligante (ácido pteróico). Ela também melhora a luminosidade do corante NIR.
[029] Figura 10: Monitoramento de progresso de reação de (A) PteTyr-S0456 (OTL-0038) e (B) folato-EDA-IR800CW por LC/MS. Pte-TyrS0456 deu produto desejado 99% puro com mais de 98% de rendimento enquanto que folato- EDA- 1 R800CW produziu múltiplos derivados com 30 a 40% de produto desejado.
[030] Figura 11: Imagens fluorescentes de corpo inteiro e Biodistribuição de Tecidos ao vivo de ratos injetados com 10 nmol de PteTyr-S0456. (1) Imagens fluorescentes de ratos nus com xenoenxertos de tumor KB 2 horas após a injeção intravenosa de 10 nmol de conjugados NIR alvejados em receptor de folato (sobreposição de imagens de luz fluorescente e branca). (2) Biodistribuição de Tecidos ao vivo de conjugados seguindo de recolhimento de tecidos com imagem formada previamente de ratos.
[031] Figura 12: Comparação frente a frente de Pte-L-Try-S0456 (OTL-0038) com conjugados de folato NIR de 2a geração (A) Imagens
23/109 fluorescentes de corpo inteiro, (B) Biodistribuição de Tecidos ao vivo e (C) Imagens de tumor e de rim 2 horas após administrar Pte-Tyr-S0456 e conjugados de folato NIR de 2a geração (10 nmol) a ratos nus. Tumores dissecados (fatiados) mostraram absorção homogênea dos agentes de formação de imagem específicos nos tumores.
[032] Figura 13: Comparações de acúmulo de tumor e de especificidade de tumor de Pte-Tyr-S0456 com outro conjugado de corante de pteroíla-NIR após administrar 10 nmol de cada um dos conjugados a ratos portadores de xenoenxertos de tumor positivo de receptor de folato.
[033] Figura 14: Mostra a estrutura de quatro compostos conjugados com um grupo de ligação de aminoácido incluindo Pte-Lys-S0456, Pteroyl-Cys-S0456, Pte-Ser-S0456 e Pte-4-amino-L-Pro-S0456.
[034] Figura 15: Mostra a afinidade de ligação relativa de OTL-0038, OTL-0039 (D-Isômero de OTL-0038) e ácido fólico para receptores folato. A figura 15A é uma trama a qual mostra a curva de ligação de cada um dos compostos para receptores folato. A figure 15B é uma tabela ilustrando a afinidade de ligação e a afinidade de ligação relativa de todos os três compostos.
[035] Figura 16A: Mostra a imagem de fluorescência de corpo inteiro de ratos nus com xenoenxertos de tumor KB injetados com OTL-0039. Ratos foram injetados intravenosamente com 10 nmol de OTL-0039 em tampão salino de fosfato (100 pL). Após 2,5 horas, os animais foram eutanizados por asfixia de CO2. Experimentos de formação de imagem de corpo inteiro foram então realizados usando a Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0.
[036] Figura 16B: Ilustra Biodistribuição de Tecidos de ratos injetados com OTL-0039 na Figura 5A, 2,5 horas após injeção do composto. Após a formação de imagens de corpo inteiro, as horas seguindo injeção de composto. Após a formação de imagens de corpo inteiro, os animais foram dissecados e tecidos particulares (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso,
24/109 músculo, pele e tumor) foram analisados para atividade de fluorescência usando o formador de imagem IVIS assim como antes.
[037] Figura 17: Mostra uma tabela que resume absorção de OTL0038 pelo tumor. A biodistruibuição de tecido foi analisada em ratos injetados com quantidades maiores de OTL-0038, variando de 0,3 nmol a 90 nmol. A análise de dados de biodistribuição foi examinada 2,5 horas após a injeção.
[038] Figura 18: Ilustra a Biodistribuição de Tecidos de ratos injetados com quantidades maiores de OTL-0038. As concentrações de composto variando de 0,3 nmol a 90 nmol foram administradas em ratos de modo intravenoso. A análise de dados de biodistribuição foi examinada
2,5 horas após a injeção.
[039] Figura 19: Ilustra a formação de imagem de fluorescência de corpo inteiro de ratos nus com xenoenxertos de tumor KB injetados com 1 nmol de OTL-0038. Isto demonstra que nós precisamos de uma concentração muito baixa de OTL-0038 para formar imagem de tumor devido à sua alta afinidade para FR e luminosidade mais alta do corante. Após 2,5 horas, os animais foram eutanizados por asfixia de CO2. Experimentos de formação de imagem de corpo inteiro foram então realizados usando a Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0.
[040] Figura 20A: Mostra a imagem de fluorescência de corpo inteiro de ratos portadores de xenoenxertos de tumor negativo para receptores folato. A formação de imagem de corpo inteiro foi realizada 2,5 horas após a administração de 10 nmol de OTL-0038.
[041] Figura 20B: Ilustra absorção de OTL-0038 pelo rim e tumor invasivo, por xenoenxertos de tumor negativo por receptor de folato e rins positivos de receptor de folato. A análise de dados foi realizada 2,5 horas após a injeção.
[042] Figura 21: Mostra um esquemático de reação de três etapas para a síntese de fase de solução de compostos formadores de imagem.
[043] Figura 22: Mostra um esquemático de reação de duas etapas
25/109 para a síntese de fase sólida de compostos formadores de imagem.
[044] Figura 23A: Apresenta imagens de fluorescência de corpo inteiro de ratos injetados com 10 nmol de Pte - Analógicos de Tirosina S0456 2 horas após a injeção.
[045] Figura 23B: Apresenta Biodistribuição de Tecidos de Pte Analógicos de Tirosina - S0456 2 horas após a injeção.
[046] Figura 24: Demonstra imagens de fluorescência de corpo inteiro de ratos injetados com 10 nmol de OTL-0038 (Pte-Tyr-S0456), OTL-0053 (Pteroyl-Lys-S0456) e OTL-0054 (Pteroyl-Cys-S0456) 2 horas após a injeção. Excitação: 745 nm. Emissão: 830 nm.
[047] Figura 25: Demonstra Biodistribuição de Tecidos de OTL-0038 (Pte-Tyr-S0456), OTL-0053 (Pteroyl-Lys-S0456) e OTL-0054 (Pteroyl-CysS0456) 2 horas após a injeção. Excitação: 745 nm. Emissão: 830 nm.
[048] Figura 26: Mostra imagens de fluorescência de corpo inteiro e de meio corpo de ratos injetados com 10 nmol de OTL-0051 (Pteroyl-TyrIRD28) e OTL-0052 (Pteroyl-Tyr-Kodak) 2 horas após a injeção.
[049] Figura 27: Mostra a Biodistribuição de Tecidos de OTL-0051 (Pteroyl-Tyr-IRD28) e OTL-0052 (Pteroyl-Tyr-Kodak) 2 horas após a injeção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO [050] Cirurgia é uma das melhores terapias para todos os tumores sólidos, tais como de próstata, ovário, pulmão, mama, intestino e câncer pancreático. Embora a cirurgia seja eficiente em 50% de pacientes com tumores sólidos nos Estados Unidos, quimio e radioterapia sozinhos são eficientes em menos do que 5% de todos os pacientes com câncer. Mais de 700.000 pacientes passam por cirurgia de câncer todo ano nos Estados Unidos e 40% de pacientes cirúrgicos possuem uma recorrência de doença locorregional dentro de 5 anos. Apesar de grandes avanços no campo da oncologia durante a última década, obstáculos significativos a serem superados permanecem no campo. Por exemplo, continua difícil
26/109 de alcançar a resseção completa do tumor principal com margens negativas, a remoção dos nódulos linfáticos abrigando células cancerígenas metastáticas e identificação de doença satélite. Alcançar melhorias nestes três casos não só melhora eliminação da doença, mas também guia decisões com relação à quimio e rádio terapia pósoperatória. Embora tenha sido demonstrado que corantes fluorescentes não específicos se acumulam passivamente em alguns tumores, as relações de tumor para segundo plano resultante geralmente são fracas e os limites entre tecidos malignos e saudáveis podem ser difíceis de definir. Embora corantes de fluorescência específicos de ligantes (por exemplo, EC 17: Folato-EDA-FITC) tenham sido usados para a formação de imagem de tecido, estes corantes não têm sido eficientes pois eles não penetram a fundo no tecido e por isso apenas identificavam as células específicas na superfície de um tecido ao invés de a fundo na amostra de tecido. Além disto, foi mostrado que o espectro de excitação e de emissão destes corantes de fluorescência anteriores era tal que ele produzia ruído de segundo plano significativo tanto que o tecido alvejado não era facilmente detectado. Além disto, conforme discutido nos fundamentos acima, corantes a base de fluoresceína possuem as desvantagens tais de baixa estabilidade de tempo de uso. O EC 17 se decompõe facilmente como resultado da instabilidade da ponte de tiourea neste composto. Além disto, como o EC 17 usa fluoresceína a qual possui a desvantagem de um nível relativamente alto de ruído de segundo plano não específico de colágeno nos tecidos ao redor do local da formação de imagem. Além disso, a absorção de luz visível por cromóforos biológicos, em particular a hemoglobina, limita mais ainda a utilidade de corantes que incorporam a fluoresceína. Isto quer dizer que aqueles corantes convencionais não podem prontamente detectar tumores que podem estar enterrados mais fundo do que alguns milímetros no tecido. Além do mais, a fluorescência da fluoresceína é resfriada a um pH baixo (abaixo de pH 5).
[051] Para um material de corante ser útil na detecção e condução de cirurgia ou para fornecer outra formação de imagem, é importante
27/109 superar essas desvantagens.
[052] Vários critérios foram considerados em preparação de conjugados incluindo corantes NIR. A facilidade de síntese e de estabilidade química foram atributos químicos primários. As propriedades espectrais, tais como o espectro de absorção e de emissão e o rendimento quântico, foram considerados. Diversas propriedades biológicas foram avaliadas, tais como a afinidade de ligação em estudos de células, formação de imagem de animal de corpo inteiro usando ratos com tumores e biodistribuição. Especificamente para biodistribuição, diversos aspectos foram considerados incluindo ratos mortos após 2 horas por distribuição oral, formação de imagem de ratos vivos e escalada de dosagem. Finalmente, considerações de segurança foram tomadas incluindo Dosagem de Tolerância Máxima (MDT), análise ImunoHistoQuímica (IHC) e análise de patologia clínica geral.
[053] A presente divulgação fornece conjugados de pteroíla de corantes NIR que são estáveis, fluorescein na faixa do infravermelho e penetram fundo dentro do tecido alvejado para produzir uma identificação específica e luminosa das áreas de tecido que mostram receptor de folato. Mais especificamente, os conjugados de pteroíla estão ligados aos corantes NIR através de um ligante de aminoácido. Ainda mais especificamente, foi descoberto que onde o ligante de aminoácido é a tirosina ou um derivado de tirosina, a intensidade da fluorescência do corante é mantida ou até melhorada.
[054] Um aminoácido é definido como incluindo um grupo funcional amina ligado a um grupo funcional de ácido carboxílico e uma cadeia lateral específica a cada aminoácido. Um alfa aminoácido é qualquer composto da fórmula geral RsCH(NH2)COOH (α-aminoácido), em que R5 é selecionado a partir do grupo que consiste de H ou qualquer cadeia lateral de aminoácido conhecida.
[055] Um beta aminoácido é definido como incluindo um grupo funcional amina ligado a um carbono beta e um grupo funcional de ácido carboxílico ligado ao carbono alfa. Um aminoácido beta homo é definido
28/109 como incluindo um grupo funcional amina ligado a um carbono beta, um grupo funcional de ácido carboxílico ligado ao carbono alfa e uma cadeia lateral começando ou no carbono alfa ou no carbono beta em que a cadeia lateral está presa a outro aminoácido.
[056] Aminoácidos de ocorrência natural podem ser divididos entre os quatro grupos a seguir: (1) aminoácidos acídicos, (2) aminoácidos básicos, (3) aminoácidos polares neutros e (4) aminoácidos não polares neutros. Aminoácidos representativos dentro desses diversos grupos incluem, mas não são limitados a: (1 ) aminoácidos acídicos (de carga negativa) tais como o ácido aspártico e o ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (de carga positiva) tais como a arginina, a histidina e a lisina; (3) aminoácidos polares neutros tais como a glicina, a serina, a treonina, a cistina, a tirosina, a asparagina e a glutamina; e (4) aminoácidos não polares neutros (hidrofóbicos) tais como a alanina, a leucina, a isoleucina, a valina, a prolina, a fenilalanina, o triptofano e a metionina.
[057] A substituição conservada para um aminoácido dentro de uma sequência de aminoácido de ocorrência natural pode ser selecionada a partir de outros membros do grupo ao qual o aminoácido de ocorrência natural pertence. Por exemplo, o grupo de cadeias laterais alifáticas de aminoácidos é a glicina, a alanina, a valina, a leucina e a isoleucina. A substituição conservada do aminoácido de ocorrência natural valina inclui o uso da glicina, da alanina, da leucina ou da isoleucina.
[058] O grupo de cadeia lateral alifático hidroxil de aminoácidos é a serina e a treonina. O grupo de cadeia lateral contendo amida de aminoácidos é a asparagina e a glutamina. O grupo de cadeia lateral aromático de aminoácidos é a fenilalanina, a tirosina e o triptofano. O grupo de cadeia lateral básico de aminoácidos é a lisina, a arginina e a histidina. O grupo de cadeia lateral contendo enxofre de aminoácidos é a cistina e a metionina. Exemplos de substituições de aminoácidos de conservação natural são: a valina para a leucina, a serina para a treonina, a fenilalanina para a tirosina, a lisina para a arginina, a cistina para a metionina e a asparagina para a glutamina.
29/109 [059] Em modalidades preferidas, é mostrado aqui que tais conjugados de pteroíla alvejam especificamente células de tumores dentro de um tecido. Além disso, a intensidade da fluorescência é maior do que a intensidade previamente observada com outros corantes NIR que são alvejados com folato para tumores de receptor de folato positivo. Esta intensidade aumentada permite o alvejamento e a identificação clara de áreas menores de amostras biológicas (por exemplo, tumores menores) de um tecido sendo monitorado. Além disto, a intensidade aumentada dos compostos da presente divulgação fornece a vantagem adicional que menores doses/quantidades do corante podem ser administradas e ainda assim produzirem resultados significativos. Sendo assim, os compostos da presente divulgação levam a técnicas de formação de imagem mais econômicas. Além disso, existe uma vantagem adicional que uma dose menor dos compostos da presente divulgação conforme comparado a compostos de formação de imagem convencionais minimiza a toxicidade e outros efeitos colaterais que se fazem presentes com a administração de materiais estranhos a um corpo.
[060] Além disso, a identificação de pequenos tumores levará a uma recessão mais precisa e mais eficiente do tumor principal para produzir margens negativas, assim como identificação e remoção precisa dos nódulos linfáticos abrigando células cancerígenas metastáticas e identificação de doença satélite. Cada uma destas vantagens está correlacionada positivamente com um melhor resultado clínico para o paciente sendo tratado.
[061] Em experimentos específicos, foi descoberto que o uso de aminoácidos além da tirosina como o ligante resultou em perda de fluorescência NIR. Por exemplo, veja a discussão do Esquema I. Observe especificamente que o caminho sintético leva a derivado 4 indesejado como grande produto que não possui propriedades NIR.
[062] Porém, é tido em consideração que em adição à tirosina e aos derivados de tirosina, um conjugado de pteroíla de um corante NIR com cistina ou derivados de cistina também pode ser útil. Além disto, é tido
30/109 em consideração que uma ligação direta da pteroíla ou parte de folato para o corante ou ligação do corante a ácido pteróico ou ácido fólico através de um ligante de amina também produz uma perda de intensidade da fluorescência do conjugado enquanto que a presença da tirosina ou derivado de tirosina como a parte de ligação entre a pteroíla (parte alvo) e o corante NIR (a parte fluorescente) é benéfico para manter ou melhorar a fluorescência do composto conjugado. Os compostos com base em tirosina da presente divulgação não requerem um ligante de amina extra para conjugar o S0456 e ainda porque a conjugação através da parte de fenol da tirosina leva à fluorescência melhorada.
[063] Os compostos podem ser usados com sistemas de formação de imagem tomográfica molecular mediado por fluorescência, tais como aqueles designados para detectar ativação de fluorescência NIR em tecidos profundos. Os compostos fornecem especificidade molecular e de tecido, rendimento de alto contraste de fluorescência, sinal de fluorescência mais luminoso e reduz autofluorescência de segundo plano, permitindo melhor detecção cedo e análise de alvo molecular de tecido doente ao vivo (por exemplo, cânceres). Os compostos podem ser usados para a formação de imagem tridimensional de tecido profundo, cirurgia específica e métodos para quantificar a quantidade de um tipo de célula alvo em uma amostra biológica.
[064] Compostos [065] Em um aspecto, a divulgação está relacionada a compostos compreendendo a Fórmula (I):
Figure BR112015022810A2_D0019
[066] em que:
[067] X é um aminoácido ou um derivado disto, e
31/109 [068] Y é um corante que possui um espectro de excitação e de emissão de fluorescência na faixa NIR e tal composto mantém ou melhora a fluorescência de Y.
[069] Em algumas modalidades, o aminoácido ou derivado de aminoácido inclui uma mudança no espectro de emissão eletrônico, no espectro de absorção eletrônico ou em ambos os espectros de emissão e de absorção eletrônicos, em relação ao espectro eletrônico da molécula de corante não modificada. Adequadamente, a mudança no espectro eletrônico é uma mudança batocrômica (isto é, mudança para comprimento de onda mais longo/frequência mais baixa) que ajuda a melhorar a detecção do composto na janela espectral NIR e/ou reduzir a quantidade de sinal de segundo plano, autofluorescência, interferências do tecido ao redor da área sendo visualizada. Mais especificamente, esta mudança no espectro eletrônico é particularmente observada com corantes NIR que compreendem átomos eletronegativos que são incorporados no anel de 6 elementos. Desta forma, em certas modalidades, o aminoácido ou derivado de aminoácido (X) compreende uma parte rica em elétrons tal como, por exemplo, oxigênio, enxofre ou nitrogênio. Exemplos não limitadores de tais aminoácidos podem incluir a cistina, a metionina, a treonina, a serina, a tirosina, a fenilalanina, o triptofano, a histidina, a lisina, a arginina, o ácido aspártico, o ácido glutâmico, a asparagina e a glutamina, ou derivados disto.
[070] Em modalidades deste aspecto, a divulgação fornece compostos de Fórmulas (l)a, (l)b, (l)c e (l)d:
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Figure BR112015022810A2_D0020
[071] em que os grupos de Tyr, Cys, Ser e Lys indicam um resíduo de
33/109 aminoácido de tirosina, cistina, serina e lisina, respectivamente, ou derivados disto e L é preferencialmente um pteroíla ou folato e Rx cada compreende um grupo de solubilização independentemente selecionado que está opcionalmente ausente.
Figure BR112015022810A2_D0021
so3h (I)a1 (I)b1
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Figure BR112015022810A2_D0022
(I)c1;
(D di [072] Em que os grupos de Tyr, Cys, Ser e Lys indicam um resíduo de aminoácido de tirosina, cistina, serina e lisina, ou derivados disto e L é preferencialmente um pteroíla ou folato. Preferencialmente, L é pteroila. [073] Em modalidades preferidas específicas, a divulgação fornece um composto da Fórmula 1(a), em que Tyr é selecionado a partir do grupo que consiste de:
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Figure BR112015022810A2_D0023
divulgados possuem aqui [074] Adequadamente, os compostos comprimentos de onda de absorção de luz máxima na região NIR de entre cerca de 650 nm e 1000 nm, por exemplo e preferencialmente, a aproximadamente 800 nm.
[075] Em modalidades preferidas específicas, os compostos aqui divulgados incluem um ligante (L) que é eficiente para alvejar o composto a uma célula em particular ou tipo de tecido e permitir a formação de imagem daquela célula ou tecido específico. Ê preferível que L seja ou parte de pteroíla ou parte de folato e mais preferencialmente que L seja parte de pteroíla. Contudo, é tido em consideração que a pessoa versada possa usar outro ligante L para alvejar os compostos a uma proteína de superfície de célula ou proteína receptora de interesse. Em modalidades específicas e preferidas, o ligante compreende pteroíla:
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Figure BR112015022810A2_D0024
[076] Síntese de Compostos [077] Os compostos aqui divulgados podem ser feitos usando métodos convencionais conhecidos na literatura. Veja por exemplo, os compostos de corante foram sintetizados como anteriormente reportado. [078] Contudo, em modalidades preferidas específicas, a presente divulgação fornece métodos sintéticos mais eficientes para gerar os compostos aqui descritos (isto é, Compostos da Fórmula I). Por exemplo, os compostos possuindo fórmula 1(a)-1(d) podem ser preparados de acordo com os esquemas gerais definidos em cada um dos Esquemas I, II e III abaixo.
[079] Esquema I ilustra um esquema sintético previamente usado para gerar compostos de Fórmula I onde o ligante alvo compreende folato ligado através de um aminoácido (lisina) à molécula de corante. Brevemente, o ligante folato modificado por ligação ao grupo amina do aminoácido é reagido com um derivado de éter em ponte do corante sob condições para render produtos (3) e (4). Porém, é notável que aquele composto 3 é o composto desejavelmente preferido, mas o caminho sintético leva à presença de derivado 4 indesejado como um grande produto que não possui propriedades NIR. Além disso, suas propriedades espectrais são dependentes de pH. Desse modo, este esquema demonstra a grande desvantagem de corantes ligados a éter. Na produção convencional destes corantes, de 30 a 60% do rendimento é do produto desejado e enquanto que de 40 a 70% do rendimento é de derivado indesejado.
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NHS
Figure BR112015022810A2_D0025
Figure BR112015022810A2_D0026
HOsS [080] Esquema II fornece uma rota sintética que inclui apenas três etapas de ração e fornece o composto de produto (5) em altos rendimentos (acima de 98%). Brevemente, o ligante alvo (1) (ilustrado no Esquema II com um grupo pteroíla) e um aminoácido ou derivado de aminoácido (2) que opcionalmente inclui grupos protetores para evitar reatividade indesejada com grupos além do grupo amina do aminoácido são misturados em um sistema de solvente HATU[(O)-7-azabenzotriazol-l-il)Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametiluronia hexafluorofosfato)} /DIPEA (Diisopropiletilamina)/DMF (dimetilformamida) e reagidos em
38/109 temperatura ambiente e por um tempo suficiente (5 minutos) para permitir a acoplagem de (2) através da funcionalidade de amina a ligante (1) para fornecer (3). O composto (3) pode ser vantajosamente precipitado adicionando ácido diluído à mistura de reação. Mais especificamente, o Composto 3 foi precipitado em 1 N HCI (ácido clorídrico) para conseguir composto final com mais de 98% de pureza, nestas modalidades, o caro HPLC ou etapas de cromatografia de coluna são evitados. O Composto (3) é reagido para remover os grupos de proteção na parte de aminoácido do composto reagindo o composto em temperatura ambiente em TFA (ácido trifluoroacítico):água:sistema solvente TIPS (triisopropilsilana) para fornecer o composto (4). O composto 4 foi purificado por precipitação com dietil éter ou metil-t-butil éter para render mais de 98% de pureza sem HPLC (Cromatografia líquida de alto desempenho) ou cromatografia de coluna. O composto (4) é reagido em um sistema aquoso básico (por exemplo, NaOH, hidróxido de sódio) para remover as funcionalidades do grupo protetor e é subsequentemente reagido, em ligeiro excesso molar, com o corante (S0456) em água por um tempo de 15 minutos a uma temperatura de 80 a 100 °C que permite a acoplagem entre o corando e (4), para render o composto final (5). O composto 5 foi precipitado com acetona para dar Pte-Tyr-S0456 mais de 98% puro. Quando NaOH é usado, o sal de sódio de Pte-Tyr-S0456 é produzido.
Esquema II
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Figure BR112015022810A2_D0027
Figure BR112015022810A2_D0028
[081] Esquema III fornece uma rota sintética de fase sólida alternativa para produzir os compostos aqui divulgados e fornecer rendimentos semelhantes como descrito no Esquema II. Brevemente, um aminoácido preso a um substrato (1) (ilustrado no Esquema III abaixo como tirosina protegida ligada a uma gota de resina) é reagido para remover o grupo protetor Fmoc (Fluorenilmetiloxicarbonila) em 20% de piperidina em DMF e é subsequentemente reagido com o ligante alvo (ilustrado novamente por pteroíla abaixo) em HATU/DIPEA/DMF por um tempo e a uma temperatura suficiente para permitir a acoplagem do ligante ao grupo funcional amina do aminoácido para fornecer (2). O composto (2) é reagido para remover o substrato e quaisquer grupos de proteção no aminoácido em uma série de reações em TFA:Água:sistema solvente TIPS para fornecer (3). Seguindo uma etapa final semelhante conforme descrito no Esquema II, o composto (3) é reagido em um sistema
40/109 aquoso básico para remover as funcionalidades do grupo protetor e é subsequentemente reagido, em ligeiro excesso molar, com o corante (S0456) em água por um tempo e a uma temperatura que permite a acoplagem entre o corante e (3), para render o composto final (4).
Esquema III
Figure BR112015022810A2_D0029
Figure BR112015022810A2_D0030
2£f% jxfeaHÍhS W)
HATíMOTAWF. 2h $ ································►.
Figure BR112015022810A2_D0031
[082] Os esquemas acima meramente ilustram diversas abordagens sintéticas não limitadoras pelas quais os compostos aqui divulgados podem ser preparados. Será apreciado que uma pessoa versada na técnica será capaz de identificar e incorporar as modificações aos esquemas acima que forneceríam outros compostos possuindo as propriedades físicas que estão dentro do escopo da presente divulgação. Por exemplo, embora os Esquemas acima ilustrem grupos folato e pteroíla como os ligantes alvos dos compostos aqui divulgados, um pessoa versada irá apreciar que outros ligantes alvos podem ser pronta
41/109 mente incorporados ao esquema sintético e gerar compostos alternativos da Fórmula I. Como outro exemplo, uma pessoa versada na técnica irá apreciar que os comprimentos de onda de absorção/ emissão da parte de corante dos compostos pode ser modulada ajustando o comprimento da cadeia de polimetina e selecionando os grupos arila ou heteroarila apropriados (por exemplo, indol vs. benzindol) assim como ligando grupos de aminoácidos. Em outro exemplo ainda, uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que o coeficiente de extinção e a intensidade de fluorescência do corante podem ser variadas ajustando a rigidez da cadeia de polimetina (por exemplo, introduzindo um sistema de anel na cadeia de polimetina tal como ciclohexena, ciclobutenona, entre outros) assim como é geralmente conhecido na técnica. Assim sendo, uma pessoa versada na técnica será capaz de modificar a síntese selecionando os reagentes apropriados para fazer qualquer um dos compostos aqui divulgados e opcionalmente ser capaz de variar propriedades físicas particulares dos compostos.
[083] Métodos de Uso [084] Assim como notado aqui acima, existe uma necessidade de compostos de corante NIR que alvejem especificamente regiões em um tecido. Isso é feito para que os compostos possam ser usados em técnicas de formação de imagem e para auxiliar no diagnóstico e na intervenção terapêutica de doença. Assim como discutido em detalhes abaixo, os compostos aqui fornecidos são úteis como corantes e agentes formadores de imagem na região NIR do espectro de luz. De tal forma, os compostos possuem ampla aplicabilidade a qualquer número de métodos de formação de imagem, diagnóstico e terapêuticos específicos.
[085] Em modalidades específicas, a presente divulgação está relacionada a métodos que incorporam pelo menos um dos compostos aqui divulgados (por exemplo, da Fórmula I, 1(a), 1(b), 1(c), e/ou 1(d)) pode ser usado especificamente e com sensibilidade para identificar tumores dentro de um tecido. Mais especificamente, os tumores identificados podem então ser operados terapeuticamente através de
42/109 métodos cirúrgicos. Desta maneira, os compostos da presente divulgação podem ser úteis em resseção cirúrgica guiada por fluorescência de tumores, nódulos linfáticos e semelhantes. Alternativamente, os compostos da presente divulgação podem ser imediatamente usados em formação de imagem de corpo inteiro na qual o composto é administrado a um paciente e a localização da fluorescência facilita a identificação do local de um tumor.
[086] Desta maneira, os compostos da presente divulgação podem ser usados para a identificação ao vivo de tecido doente em um paciente com necessidade disto. O método da divulgação inclui irradiar uma parte do corpo ao vivo do paciente contendo tecido morto com luz possuindo pelo menos um comprimento de onda de excitação na faixa NIR de cerca de 600 nm a cerca de 1000 nm. Fluorescência emanando de um composto da presente divulgação administrado ao paciente e o qual foi especificamente preso a e/ou foi tomado pelo tecido doente na parte do corpo, em resposta ao pelo menos um comprimento de onda de excitação é diretamente visualizado para determinar o local e/ou a área de superfície do tecido doente no paciente.
[087] A luz possuindo um comprimento de onda na faixa de 600 nm e 850 nm está dentro da faixa NIR do espectro, em contraste à luz visível, a qual está dentro da faixa de cerca de 401 nm a 500 nm. Portanto, a luz de excitação usada na prática dos métodos de diagnóstico da presente divulgação irá conter pelo menos um comprimento de onda de luz para iluminar o tecido no comprimento de onda infravermelho para agitar os compostos para que a fluorescência obtida da área possuindo a absorção dos compostos da presente divulgação seja claramente visível e distinta da autofluorescência do tecido ao redor. A luz de excitação pode ser monocromática ou policromática. Desta maneira, os compostos da presente divulgação são vantajosos pois eles eliminam a necessidade para o uso de mecanismos de filtragem que seriam usados para obter uma imagem de diagnóstico desejada se a sonda fluorescente for uma que fluoresce a comprimentos de onda abaixo de 600 nm. Desta maneira,
43/109 os compostos da presente divulgação evitam imagens de diagnóstico escurecidas que são produzidas como um resultado de luz de excitação de comprimentos de onda que seriam refletidos a partir de tecido saudável e pode causar a perda de resolução da imagem fluorescente. [088] Salas de operação para procedimentos cirúrgicos podem ser equipadas com uma luz superior que produz comprimentos de onda de luz no espectro de emissão ótico útil na prática de métodos de diagnóstico da divulgação, tal como uma lâmpada que produza luz no comprimento de onda apropriado. Tal luz pode ser utilizada na prática de métodos de diagnóstico da presente divulgação meramente desligando as outras luzes na sala de operação (para eliminar luz externa que seria visivelmente refletida de tecido na parte do corpo sob investigação) e apontar a luz de excitação de comprimento de onda NIR na cavidade do corpo ou abertura criada cirurgicamente para que a imagem fluorescente recebida diretamente pelo olho do observador (por exemplo, o cirurgião) seja predominantemente a imagem fluorescente emanando do(s) fluoróforo(s) no campo de visão. A luz emanando a partir de uma fonte na faixa de 600 nm a 850 nm, preferencialmente na faixa de 750nm a 850nm seria usada para alcançar o objetivo de visualização direta pelo observador para que luz refletindo a partir da parte do corpo, além daquela da(s) parte(ões) fluorescendo, seja minimizada ou eliminada.
[089] Assim sendo, em métodos de diagnóstico da divulgação, o tecido doente (e construto alvo tomado ou ligado) é “exposto” à luz de excitação (por exemplo, criando cirurgicamente uma abertura ou entrega endoscópica da luz a um local no interior. O método divulgado é particularmente adequado para a detecção ao vivo de tecido doente localizado em um local no interior do paciente, tal como dentro de uma cavidade do corpo natural ou uma abertura criada cirurgicamente, onde o tecido doente esteja “em plena visão “ (isto é, exposto ao olho humano) para facilitar um procedimento de biopsia ou retirada cirúrgica da área que foi destacada por absorção dos compostos da presente divulgação. Conforme o local exato e/ou área da superfície do tecido com tumor é
44/109 imediatamente determinado pela absorção dos compostos da presente divulgação, os métodos empregando os compostos da presente divulgação fornecem um guia valioso ao cirurgião, que precisa “ver” em tempo real os contornos exatos, tamanho etc. da massa a ser operada conforme a cirurgia procede.
[090] Deste modo, em específicas modalidades, a presente divulgação envolve imagens óticas de um tecido biológico que expressa um receptor de folato entrando em contato com o tecido com uma composição compreendendo compostos da presente divulgação (por exemplo, compostos da Fórmula I) e dando tempo para o composto na composição para se distribuir dentro do tecido e interagir com o local do receptor de folato. Após um tempo suficiente para tal interação ter ocorrido, o tecido é iluminado com uma luz de excitação para fazer com que o composto na composição fluoresça. A fluorescência é então detectada e onde tal fluorescência é observada é uma área que contém o receptor de folato.
[091] De uma maneira semelhante, os compostos da presente divulgação são usados para identificar um tipo de célula alvo em uma amostra biológica entrando em contato com a amostra biológica com tais compostos por um tempo e sob condições que permitem a ligação do composto a pelo menos uma célula do tipo da célula alvo. O composto de ligação é então oticamente detectado tal que a presença de fluorescência do comprimento de onda NIR emanando da ligação, composto específico da presente divulgação indicou que o tipo de célula alvo está presente na amostra biológica. Este método fornece assim uma imagem do tipo de célula específico no tecido sendo avaliado. Mais preferencialmente, o tipo de célula específico é uma célula de tumor ou um nódulo linfático ao qual uma célula de tumor se espalhou.
[092] Estes métodos vantajosamente fornecem um método melhorado de realizar cirurgia guiada por imagem em um paciente pois a administração de uma composição compreendendo o composto da presente divulgação sob condições e por um tempo suficiente para tal composto se acumular em um dado local cirúrgico irá auxiliar um
45/109 cirurgião na visualização do tecido a ser removido. Preferencialmente o tecido é um tecido de tumor e iluminando o composto que foi tomado pelo tecido facilita a visualização do tumor pela fluorescência do composto NIR usando luz infravermelha. Com o auxílio da visualização facilitada pelo alvejamento do composto da presente divulgação ao local dos tumores, a resseção cirúrgica das áreas que fluorescein com excitação por luz infravermelha permite uma remoção melhorada e precisa até mesmo de tumores pequenos.
[093] Deve ser entendido que em quaisquer dos métodos cirúrgicos da presente divulgação, os compostos da presente divulgação podem ser administrados antes de a incisão cirúrgica ocorrer ou até mesmo após a cavidade cirúrgica e o local do tumor ter sido revelado pela cirurgia.
[094] Se o local supostamente doente é em uma cavidade natural do corpo ou local no interior produzido cirurgicamente, um dispositivo endoscópico pode ser opcionalmente usado para fornece a luz de excitação ao local, para receber a fluorescência emanando a partir do local dentro de uma cavidade do corpo e para auxiliar na formação de uma imagem direta da fluorescência do tecido doente. Por exemplo, uma lente no dispositivo endoscópico pode ser usada para focar a fluorescência detectada como um auxílio na formação da imagem. Assim como aqui usada, diz-se que tal fluorescência fornecida por endoscópio é “visualizada diretamente” pelo profissional e o tecido ao qual a construção específica se prende ou no qual é absorvido deve estar “em plena visão” do endoscópio já que a luz usada no procedimento de diagnóstico da presente divulgação não irá conter comprimentos de onda de luz que penetram no tecido, tais como os comprimentos de onda na faixa NIR. Alternativamente, a luz de excitação pode ser direcionada por qualquer meio conveniente dentro da cavidade do corpo ou abertura cirúrgica contendo um construto alvo administrada assim como aqui descrito e a imagem fluorescente produzida pode ser diretamente visualizada pelo olho do observador sem o auxílio de um endoscópio. Com ou sem o auxílio de qualquer tipo de dispositivo endoscópico, a imagem
46/109 fluorescente produzida por um método da presente divulgação é tal que ela pode ser visualizada sem o auxílio de um dispositivo de processamento de imagem, tal como uma câmera de CCD, monitor de TV, dispositivo de coleta de fóton e semelhantes.
[095] Ê tido em consideração que os métodos de formação de imagem e de diagnóstico da presente divulgação permitem que o cirurgião/profissional observe/veja/visualize ao mesmo tempo tecido doente ou anormal através de uma abertura cirúrgica para facilitar o procedimento de biopsia ou de retirada cirúrgica. Conforme o local e/ou área de superfície do tecido doente são imediatamente determinadas pelo procedimento de diagnóstico da presente divulgação empregando os compostos aqui descritos, o método da presente divulgação é um guia valioso para o cirurgião, que precisa saber os contornos exatos, tamanho etc. da massa, por exemplo, para resseção à medida em que a cirurgia procede. Em particular, é notado que os compostos da presente divulgação fíuorescem na faixa NIR a uma maior intensidade do que aqueles descritos previamente. De tal forma, vantajosamente, é tido em consideração que menos do composto será necessário para alcançar a formação de imagem de diagnóstico. Além disto, os compostos da presente divulgação penetram fundo no tumor e portando a presente divulgação vantajosamente permite uma maior precisão de que o tumor foi removido.
[096] A presente divulgação fornece métodos para a utilização de um procedimento de diagnóstico durante a cirurgia em um paciente em necessidade disto administrando ao paciente uma composição compreendendo um composto da presente divulgação e irradiando uma parte do corpo ao vivo do paciente contendo tecido doente com luz possuindo pelo menos um comprimento de onda de excitação na faixa de cerca de 600nm a cerca de 850nm, diretamente visualizando a fluorescência emanando de um construto alvo administrado ao paciente que se ligou especificamente a e/ou foi tomado pelo tecido doente na parte do corpo em que o construto alvo fluoresce em resposta a pelo
47/109 menos um comprimento de onda de excitação, determinando o local e/ou a área de superfície do tecido doente no paciente e removendo pelo menos uma parte do tecido de tumor.
[097] Em outra modalidade ainda, a presente divulgação fornece métodos para diagnóstico ao vivo de tecido de tumor em um paciente com necessidade disto. Nesta modalidade, o método da presente divulgação compreende entrar em contato com amostras de célula de tumores obtidas do paciente in vitro com uma pluralidade de compostos detectadamente rotulado, cada um dos quais se prende a ou é seletivamente tomado por um tipo de tumor distinto, determinando quais dos compostos é preso a ou tomado pela amostra de células de tumores, administrando uma quantidade diagnosticamente eficiente de pelo menos um construto alvo fluorescente biologicamente compatível contendo um composto da presente divulgação que foi determinado a se prender a e/ou ser tomado pela amostra de células de tumores e um fluoroforo responsivo a pelo menos um comprimento de onda de luz na faixa de cerca de 600nm a cerca de 850nm e diagnosticando o local e/ou área de superfície do tecido de tumor na parte do corpo ao vivo visualizando diretamente a fluorescência emanando do construto alvo ligado ou tomado no tecido de tumor após a irradiação disto com luz fornecendo pelo menos um comprimento de onda de excitação para o construto alvo fluorescente.
[098] Em algumas modalidades, um único tipo de parte fluorescente é responsável por gerar a fluorescência emanando da parte do corpo irradiada (isto é, a partir do construto alvo fluorescente que se liga a ou é tomado pelo tecido doente) e sujeitando o construto alvo com uma fonte de luz do espectro NIR.
[099] Em outras modalidades, é tido em consideração que uma pluralidade, (isto é, dois, três, quatro ou mais) construtos alvos são usados para obter uma imagem de diagnóstico. Tais construtos alvos adicionais podem ser compostos adicionais da presente divulgação distintos do primeiro composto. Alternativamente, os construtos alvos
48/109 adicionais podem compreender os corantes aqui descritos, mas com a parte de pteroíla sendo substituída por um ligante para outro receptor além do receptor de folato. Em outras modalidades ainda, as partes alvos adicionais podem ser outros construtos alvos fluorescentes (por exemplo, anticorpos, ou fragmentos biologicamente ativos disto, possuindo fluoroforos afixados) que se prendem a outros receptores ou antígenos no tumor ou tecido (por exemplo, um local de artereoesclerose, infecção, doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, doenças imunológicas, doenças autoimunes, doenças respiratórias, doenças metabólicas, doenças hereditárias, doenças infecciosas, doenças ósseas e doenças ambientais, ou semelhantes) a terem imagem formada. Qualquer parte alvo adicional que alveja especificamente o tumor ou local específico no tecido pode ser usada desde que seja específica para o local a ser monitorado. O propósito construto alvo fluorescente adicional é aumentar a intensidade da fluorescência no local a ser monitorado auxiliando assim na detecção de tecido doente ou anormal n parte do corpo. Por exemplo, um determinado tumor pode ter diversos marcadores e em adição aos compostos da presente divulgação, um coquetel de partes fluorescentes é fornecido que são específicas para aquele determinado tumor tal que o sinal emanando do tumor é gerado por mais do que um composto ou parte fluorescente que foi alvejada e se tornou localizada no local de interesse do tumor.
[100] Na prática, a pessoa versada na técnica administraria um composto da presente divulgação sozinho ou como parte de um coquetel de alvejamento de partes detectáveis e permite que estes compostos e partes alvos se liguem a e/ou sejam tomados por qualquer tecido alvo que pode estar presente no local sob investigação e depois fornecer um suprimento da fonte de luz. Tipicamente, os compostos da presente divulgação e quaisquer partes alvos adicionais serão administrados antes da cirurgia por um tempo e em composições que permitem que os compostos fluorescentes da presente divulgação assim como quaisquer construtos fluorescentes adicionais sejam tomados pelo tecido alvo.
49/109 [101] Aqueles versados na técnica serão capazes de desenvolver combinações de construtos alvos fluorescentes administrados sucessivamente, cada um dos quais se prende especificamente ao local alvo. Ê preferível que todos os construtos alvos fluorescentes usados em tais coquetéis para identificar o tecido alvo compreendam fluoroforos que fluorescein dentro da mesma faixa de comprimento de onda ou no mesmo comprimento de onda que o composto da presente divulgação (por exemplo uma fluorescência sensível a comprimento de onda NIR de luz nos compostos da presente divulgação) para minimizar o número de diferentes fontes de luz que precisam ser empregadas para agitar fluorescência simultânea de todos os diferentes construtos alvos usados na prática do método da presente divulgação. Porém, é tido em consideração que as partes alvos adicionais além dos compostos da presente divulgação podem fluorescer em resposta à luz irradiante em uma cor diferente (isto é, possui um comprimento de onda diferente) do que aquele de compostos florescentes da presente divulgação. A diferença nas cores da fluorescência emanando dos compostos da presente divulgação e daquelas dos compostos alvos adicionais podem auxiliar o observador em determinar o local e o tamanho do tecido doente. Em alguns exemplos, pode ser desejável incluir fluoroforos em construtos alvos específicos para alvejar tecido normal e os compostos da presente divulgação alvejar o tecido doente de tal forma que o contraste entre o tecido doente e o tecido normal seja ainda mais realçado para auxiliar ainda mais o observador em determinar o local e o tamanho do tecido alvo. O uso de tais fluoroforos adicionais e agentes alvos além dos compostos da presente divulgação fornece a vantagem de que qualquer fluorescência natural emanando de tecido normal é obscurecida pela fluorescência emanando de fluoroforo(s) em construtos alvos suplementais alvejados para o tecido normal na parte do corpo. Quanto maior a diferença em cor entre a fluorescência emanando de tecido normal e tecido alvo, mais fácil é para o observador visualizar os contornos e o tamanho do tecido alvo. Por exemplo, alvejar um construto
50/109 alvo fluorescente compreendendo um fluoroforo produzindo luz infravermelha a partir dos compostos da presente divulgação para o tecido alvo (isto é, tecido anormal) e um fluoroforo produzindo luz verde para o tecido normal. Aqueles versados na técnica podem imediatamente selecionar uma combinação de fluoroforos que apresentem um distinto contraste visual de cor.
[102] O espectro de luz usado na prática do método da presente divulgação é selecionado para conter pelo menos um comprimento de onda que corresponde ao comprimento de onda de excitação predominante do construto alvo, ou de uma partes fluorescente biologicamente compatível contida dentro do construto alvo. Geralmente, a luz de excitação usada na prática do método da presente divulgação compreende pelo menos um comprimento de onda de excitação de luz na faixa de comprimento de onda NIR de cerca de 600nm a cerca 850 nm.
[103] Contudo, quando uma combinação de ligantes alvos que fluorescein em comprimentos de onda diferentes é usada na prática da presente divulgação, o espectro da luz de excitação deve ser amplo o bastante para fornecer pelo menos um comprimento de onda de excitação para cada um dos fluoroforos usados. Por exemplo, é particularmente benéfico quando fluoroforos de diferentes cores são selecionados para distinguir tecido normal de tecido doente, que o espectro de excitação da(s) luz(es) inclui comprimentos de onda de excitação para os fluoroforos específicos para tecido normal e para tecido alvo.
[104] Assim como aqui notado, os compostos da presente divulgação são especificamente alvejados para o receptor de folato por meio de pteroíla ou ligante folato fazendo parte dos compostos da presente divulgação. Em modalidades onde parte alvo adicional é usada, o construto alvo de tal parte alvo adicional é selecionado para se prender a e/ou ser tomado especificamente pelo tecido alvo de interesse, por exemplo a um antígeno ou outra superfície contida sobre ou dentro de uma célula que caracteriza uma doença ou estado anormal no tecido alvo. Assim como em outras análises diagnosticas, é desejável para o
51/109 construto alvo para ligar a ou ser tomado pelo tecido alvo seletivamente ou a um antígeno associado com a doença ou estado anormal; contudo, construtos alvos contendo partes de ligante que também se prendem a ou são tomados por tecido saudável ou estruturas celulares podem ser usadas na prática do método da presente divulgação desde que a concentração do antígeno no tecido alvo ou a afinidade do construto alvo para p tecido alvo seja suficientemente maior do que para tecido saudável no campo de visão para que uma imagem fluorescente representando o tecido alvo possa ser claramente visualizada como distinta de qualquer outra fluorescência vindo de tecido saudável ou de estruturas no campo de visão.
[105] Por exemplo, câncer de intestino é geralmente caracterizado pela presença de antígeno carcinoembriônico (CEA), no entanto este antígeno também é associado com certos tecidos em indivíduos saudáveis. Porém, a concentração de CEA em tecido cancerígeno do intestino é geralmente maior do que é encontrado em tecido saudável, então um anticorpo anti-CEA poderia ser usado como uma parte de ligante na prática da presente divulgação. Em outro exemplo, deoxiglicose é tomada e utilizada por tecido saudável em diferentes graus, porém seu metabolismo em tecidos saudáveis, exceto para certos órgãos conhecidos, como o coração, é substancialmente menor do que em tumor. O padrão conhecido de consumo de deoxiglicose no corpo pode, portanto, ser usado para auxiliar na determinação destas áreas em que a tomada de deoxiglicose inesperadamente alta sinaliza a presença de células de tumor.
[106] A doença ou estado anormal detectado por um método da presente divulgação pode ser qualquer tipo caracterizado pela presença de um tecido alvo conhecido para o qual um específico ligante de ligação é conhecido. Por exemplo, diversas condições cardíacas são caracterizadas pela produção de tecido necrótico ou isquêmico ou pela produção de tecido artereosclerótico para o qual específicos ligantes de ligação são conhecidos. Como outro exemplo ilustrativo, câncer de mama
52/109 é caracterizado pela produção de tecido cancerígeno identificado por anticorpos monoclonais para CA15-3, CA19-9, CEA, ou HER2/neu. Ê tido em consideração que o tecido alvo pode ser caracterizado por células que produzem ou um antígeno de superfície para o qual um ligante de ligação é conhecido, ou um marcador intracelular (isto é, antígeno), já que diversos construtos alvos penetram na membrana da célula. Estados de doença representativos que podem ser identificados usando um método da presente divulgação incluem tais diversas condições como diferentes tipos de tumores, infecções por bactéria, fungo e vírus e semelhantes. Assim como aqui usado, tecido “anormal” inclui condições pré-cancerígenas, tecido necrótico ou isquêmico e tecido associado com doenças de tecido conjuntivo e desordens autoimunes e semelhantes. Além disto, exemplos dos tipos de tecido alvo adequados para diagnóstico ou exame usando um método da presente divulgação incluem cardíaco, mamário, ovariano, uterino, pulmonar, endotelial, vascular, gastrointestinal, colorretal, tecido prostático, tecido endócrino e semelhantes, assim como combinações de quaisquer dois ou mais disto.
[107] Simplesmente como exemplo, antígenos para algumas malignidades comuns e os locais do corpo nos quais elas são comumente encontradas são conhecidas por aqueles versados na técnica e ligantes alvos, tais como anticorpos ou para estes antígenos ou de fato ligantes onde os antígenos são receptores são conhecidos na técnica. Por exemplo, CEA (antígeno carcinoembriônico) é comumente achado em tumores do intestino, mama e pulmão; PSA (antígeno específico de próstata, ou às vezes referido como antígeno de membrana específico de próstata (PSMA)) é específico para câncer de próstata; CA-125 é comumente achado em tumores de origem de câncer de ovário, CA 15-3, CA19-9, MUC-1, receptor de estrogênio, receptor de progesterona e HER2/neu são comumente achados em tumores de câncer de mama, a proteína alfa feto é achada tanto em câncer testicular quanto coriocarcinoma, tanto o receptor de estrogênio quanto o receptor de progesterona também são achados em tumores de câncer uterino e receptor de fator de crescimento
53/109 epidérmico é comumente achado em tumores de câncer de bexiga. Outros marcadores e ligantes específicos de tumor são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Em modalidades preferidas, a presente divulgação emprega folato ou partes de pteroíla para alvejar o receptor de folato e partes alvos PMSA para alvejar os corantes para células cancerígenas de próstata.
[108] Ê tido em consideração que qualquer um desses marcadores comumente conhecidos de tumores pode ser alvejado usando os corantes aqui descritos (trocando a parte de pteroíla por uma parte que alveja especificamente estes marcadores) ou alternativamente, estes marcadores podem ser alvejados em adição e em combinação com o receptor de folato que está sendo alvejado usando os compostos da presente divulgação. Como discutido previamente, pode ser particularmente vantajoso ter partes alvos para diversos marcadores diferentes em um certo tumor para servir como um coquetel de diagnóstico no qual diversos marcadores são alvejados para visualizar mais luminosamente e mais claramente o tumor.
[109] Além de compostos químicos, as partes alvos em tais coquetéis podem incluir uma proteína ou polipeptídeo, tal como um anticorpo, ou fragmento biologicamente ativo disto, preferencialmente um anticorpo monoclonal. O(s) construto(s) alvo(s) fluorescente(s) suplementar(ais) usado(s) na prática do método da presente divulgação pode(m) também ser(em) ou compreender(em) anticorpos monoclonais marcados com um fluoroforo. O termo “anticorpo” conforme usado nesta divulgação inclui moléculas intactas assim como fragmentos funcionais disto, tal como Fab, F(ab')2 e Fv que são capazes de ligar o determinante epitópico. Os métodos para fazer estes fragmentos são conhecidos na técnica. (Veja por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, 1988, incorporado aqui por referência). Conforme usado nesta divulgação, o terme “epitópico” quer dizer qualquer determinante antigênico em um antígeno ao qual o paratopo de um anticorpo se liga. Determinantes epitópicos geralmente consistem de
54/109 grupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específica.
[110] Além de anticorpos, os coquetéis podem compreender compostos nos quais a parte de ligante afixada ao construto alvo fluorescente é selecionada a partir dos diversos compostos biologicamente compatíveis que se ligam com especificidade a receptores e/ou são preferencialmente tomados por células de tumor e podem ser usados como a parte de ligante dos construtos alvos da presente divulgação. Os compostos que são preferencialmente “tomados” por células de tumor podem entrar nas células através da superfície ou dos receptores nucleares (por exemplo, receptores de hormônio), poros, “ janelas” hidrofílicas na bicamada lipídica da célula e semelhantes.
[111] Ilustrativo desta classe de compostos para alvejar tumores são somatostatina, peptídeos de ligação receptor somatostatina, deoxiglicose, metionina e semelhantes. Peptídeos de ligação receptor somatostatina particularmente úteis são um analógico octapeptídeo de somatostatina de longa atuação, conhecido como octreotídeo (D-fenilalanil-L-cisteinil-Lfenilala-nil-D-triptofil-L-lisil-L-treonil-N-[2-hidróxi-l-(hidroximetil) propil]— L-cisteinamida cíclica (2^7)-dissulfeto), lanreotida, uma formulação oral de octreotídeo, P829, P587 e semelhantes. Peptídeos de ligação de somatostatina são divulgados na Patente U.S. N° 5.871,71 1 e métodos para ligação de tais peptídeos covalentemente a um radioisótopo através de seu aminoácido terminal de carboxila sob condições de redução estão divulgados na Patente U.S. N° 5.843.401, ambas as quais estão incorporadas aqui por referência em suas totalidades. Uma pessoa versada na técnica pode imediatamente adaptar tais ensinamentos para a preparação de peptídeos de ligação receptor somatostatina sensíveis a fluorescência substituindo as partes fluorescentes desta divulgação no lugar do radioisótopo.
[112] Somatostatina e peptídeos de ligação receptor somatostatina
55/109 são particularmente eficientes para o uso como a parte ligante de alvejamento de tumor no construto alvo quando o estado da doença é uma neuroendócrina ou tumor endócrino. Exemplos de tumores neuroendócrinos que podem ser diagnosticados usando um método da presente divulgação incluem adenomas (produtores de GH e produtores de TSH), tumores de célula ilhotas, carcinoides, carcinomas neuroendócrinos indiferenciados, câncer de pulmão de célula pequena e de célula não pequena, carcinomas de célula neuroendócrina e/ou intermediária, tumores neuroendócrinos de ovário, cervical, endométrio, mama, rim, laringe, seios paranasais e glândulas salivares, meningiomas, tumores glia-derivados bem diferenciados, feocromocitomas, neuroblastomas, ganglioneuro(blasto)mas, paragan-gliomas, papilário, folicular e carcinomas medulares em células tireóides, carcinomas de célula Merkel e melanomas, assim como granulomas e limfomas. Ê sabido que estas células de tumor possuem receptores somatostatina e podem ser alvejadas usando somatostatina ou peptídeos de ligação receptor somatostatina como o ligante alvo de tumor no construto alvo fluorescente da presente divulgação.
[113] Peptídeo vasointestinal (VIP), que é usado em cintilografia receptor VIP (I. Virgolini, Eur J. Clin. Invest. 27(10):793-800, 1997, também é útil em um método da presente divulgação para diagnóstico de adenocarcinomas primários pequenos, metástases de fígado e certos tumores endócrinos do trato gastrointestinal.
[114] Outra molécula ilustrativa dos ligantes alvos de tumor que são preferencialmente tomados por tumores é a deoxiglicose, a qual é conhecida por ser preferencialmente tomada em uma variedade de diferentes tipos de tumores. Ilustrativo dos tipos de tumores que podem ser detectados usando a deoxiglicose como o ligante alvo de tumor incluem melanoma, tumores colorretais e pancreáticos, linfoma (tanto HD e NHL), tumores de cabeça e pescoço, mieloma, cânceres de ovário, câncer, mama e cérebro (adenomas pituitáios e de alto nível), sarcomas (dependente de nível), hepatoma, câncer testicular, tireóide (dependente
56/109 de nível) câncer de pulmão de célula pequena, câncer de bexiga e uterino e semelhantes.
[115] Todavia, outros compostos alvos de tumor que podem ser usados em coquetéis da presente divulgação incluem 1 -aminociclobutano-1 -ácido carboxílico e L-metionina. L-metionina é um aminoácido essencial que é necessário para a síntese de proteína. Sabese que células malignas possuem metabolismo de metionina alterado e requerem uma fonte externa de metionina.
[116] Exemplos adicionais de compostos alvos de tumor biologicamente compatíveis que se ligam com especificidade a receptores de tumor e/ou são preferencialmente tomados por células de tumor incluem hormônios mamários, particularmente hormônios do sexo, neurotransmissores e compostos expressos por células de tumor para se comunicarem uns com os outros que são preferencialmente tomados por células de tumor, tais como novos construtos de proteína separados surgindo de aberrações cromossômicas, tais como transferências ou inversões dentro de um clone.
[117] Hormônios, incluindo hormônios do sexo, hormônios de crescimento de célula, citocinas, hormônios endócrinos, eritropoietina e semelhantes também servem como partes alvos de tumor. Conforme é conhecido na técnica, um número de tipos de tumores expressa receptores para hormônios, por exemplo, estrogênio, progesterona, andrógenos, tais como a testosterona e semelhantes. Tais hormônios são preferencialmente tomados por células de tumor, por exemplo, através de receptores específicos.
[118] Os construtos alvos e construtos alvos suplementais usados na prática do método da presente divulgação podem ser administrados por qualquer rota conhecida daqueles versados na técnica, tais como tópica, intraarticular, intracisterna, intraocular, intraventricular, intratecal, intravenosa, intramoscular, intraperitonea, intradermal, intratraqueal, intracavitariamente e semelhantes, assim como por qualquer combinação de dois ou mais destes.
57/109 [119] A rota mais adequada para a administração irá variar dependendo do estado da doença a ser tratada, ou do local da condição suspeitada ou tumor a ser diagnosticados. Por exemplo, para o tratamento de condições inflamatórias e diversos tumores, administração local, incluindo administração por injeção diretamente na parte do corpo a ser irradiada pela luz de excitação (por exemplo, intracavitariamente) fornece a vantagem de que o construto alvo (por exemplo, anticorpos marcados fluorescentemente) pode ser administrado e uma alta concentração sem risco de complicações que podem acompanhar a administração sistêmica disto.
[120] Os compostos da presente divulgação assim como quaisquer construtos alvos adicionais usados em coquetéis de diagnóstico compreendendo os compostos da presente divulgação são administrados em uma “quantidade eficaz” para diagnóstico. Uma quantidade eficaz é a quantidade de um construto alvo necessário para auxiliar em visualização direta de qualquer tecido alvo localizado na parte do corpo em um paciente sob investigação. Um “paciente” assim como o termo é aqui usado é tido em consideração a incluir qualquer mamífero, tal como um animal domesticado, animal de fazenda ou um animal de zoológico, mas preferencialmente é um humano. Quantidades eficazes para uso em diagnóstico irão, é claro, depender do tamanho e do local da parte do corpo a ser investigado, a finidade do construto alvo para o tecido alvo, o tipo de tecido alvo, assim como a rota de administração. Administração local do construto alvo irá tipicamente requerer uma dosagem menor do que qualquer outro modo de administração sistêmica, embora a concentração local do construto alvo possa, em alguns casos, ser mais alta após a administração local do que pode ser alcançado com segurança com administração sistêmica.
[121] Já que pacientes individuais podem apresentar uma ampla variação em gravidade de sintomas e cada construto alvo possui suas características de diagnóstico únicas, incluindo, a afinidade do construto alvo para o alvo, taxa de afastamento do construto alvo por processos
58/109 corporais, as propriedades do fluoroforo contido ali e semelhantes, a pessoa versada na técnica irá pesar os fatores e variar as dosagens de acordo.
[122] Os compostos da presente divulgação assim como coquetéis compreendendo esses compostos podem ser formulados como uma suspensão injetável estéril de acordo com métodos conhecidos usando agentes umedecidos ou dispersantes adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução injetável ou suspensão em um diluente ou solvente não tóxico que não passa pelo intestino, por exemplo, como uma solução em 1 -4, butanodiol. Óleos fixos, estéreis são convencionalmente empregados como um meio suspenso ou solvente. Para este propósito, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos, ácidos graxos (incluindo ácido oleico), naturalmente ocorrente em óleos vegetais como o óleo de gergelim, o óleo de coco, o óleo de amendoim, o óleo de semente de algodão etc., ou veículos graxos sintéticos como o oleato de etila, ou semelhantes. Tampões, conservantes, antioxidantes e semelhantes, podem ser incorporados conforme necessário, ou, alternativamente, pode compreender a formulação.
[123] Será aparente àqueles versados na técnica que diversas mudanças podem ser feitas na presente divulgação sem abandonar o espírito e o escopo disto e, portanto, a presente divulgação engloba modalidades além daquelas especificamente divulgadas na especificação, mas apenas conforme indicado nas reivindicações anexadas.
[124] Os exemplos a seguir são meramente fornecidos com o propósito de ilustrar modalidades em particular da presente divulgação e não é a intenção que sejam limitadores do escopo das reivindicações anexadas. Confirme aqui discutido, características particulares dos métodos e compostos divulgados podem ser modificadas de diversas formas que não são necessárias para a operabilidade ou vantagens que elas fornecem. Por exemplo, os compostos podem incorporar uma variedade de aminoácidos e derivados de aminoácido assim como ligantes
59/109 alvos dependendo do uso em particular para qual o composto será empregado. Uma pessoa versada na técnica irá apreciar que tais modificações estão englobadas dentro do escopo das reivindicações anexadas.
[125] EXEMPLOS [126] Exemplo 1: Desenvolvimento de Corantes Próximo a Infravermelho Alvejados em Tumor para Cirurgia Guiada por Fluorescência [127] Resseção cirúrgica completa de doença maligna é o único método confiável para intervenção em câncer. Infelizmente, resseção de tumor quantitativa é geralmente limitada pela capacidade de um cirurgião de localizar toda a doença maligna e de distingui-la de tecido saudável. Cirurgia guiada por fluorescência surgiu como uma ferramenta para auxiliar os cirurgiões na identificação e na remoção de lesões malignas. Embora corantes fluorescentes não alvejados tenham mostrado se acumularem passivamente em alguns tumores, as relações resultantes de tumor para segundo plano são geralmente fracas e as fronteiras entre tecidos malignos e tecidos saudáveis podem ser difíceis de definir. Para contornar estes problemas, a presente divulgação mostra o desenvolvimento de ligantes alvos de tumor de alta afinidade que se prendem a receptores que são sobre-expressos em células cancerígenas e entregam moléculas ligadas seletivamente nestas células.
[128] No presente exemplo, o uso de dois ligantes alvos específicos de tumor (isto é, ácido fólico que alveja o receptor de folato (FR) para entregar corantes fluorescentes NIR especificamente em cânceres expressando FR, deixando, portanto, apenas as células malignas altamente fluorescentes. O presente exemplo mostra que todos os corantes alvos NIR de FR examinaram células cancerígenas cultivadas de ligação na faixa nanomolar baixa. Além disso, com injeção intravenosa em ratos portadores de tumor com doença metastática, estes mesmos conjugados de corante ligante NIR deixam tecidos de tumor expressando receptor fluorescentes, permitindo sua resseção facilitada com contaminação
60/109 mínima de tecidos saudáveis.
[129] IA: Materiais e Métodos [130] Os resultados mostrados no presente exemplo foram obtidos usando métodos e materiais específicos aqui descritos. Ê tido em consideração que a pessoa versada na técnica pode ser capaz de modificar esses métodos, condições de reação e condições de teste e ainda assim produzir os resultados que demonstram a eficácia dos corantes alvos FR NIR da presente divulgação.
[131] a. Síntese e caracterização de conjugados de folato NIR. Todos os ligantes e conectores foram sintetizados assim como previamente relatado em literatura. Após a purificação, ligantes alvos folato foram conjugados a corantes NIR selecionados como mostrado nas Figuras 1, 5 e 8. Conjugados de corantes foram purificados usando HPLC preparativo de fase inversa [Águas, xTerra C18 lOpm; 19 mm x 250 mm; À=280 nm; gradiente de solvente: 0 a 30% ou 80%B em passagem de 30 min, A=10 mM ΝΗ4ΟΑε tampão em água (pH = 7,0), B=Acetonitrila (ACN)]. Os compostos purificados foram analisados usando espectrometria de massa LC-MS (ESI) (Águas, X-Ponte C18 5 pm; 3,0 mm x 15 mm).
[132] b. Cultura de receptor de folato expressando linhas de células. Células LI 21 OA foram obtidas do Dr. Manohar Ratnam e células KB foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). As células foram cultivadas em meio com deficiência de folato 1 640 RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal não ativado de calor (HI FBS), 1% de L-glutamina e 1% de penicilina estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todas as linhas de célula foram cultivadas em 5% de dióxido de carbono, 95% de ar atmosférico umidificado a 37° C.
[133] c. Análise de afinidade de ligação e especificidade de conjugados de corante NIR folato por fluorometeria. KB (200.000 células/cavidade em 500 pL) foram semeadas em 24 placas de cavidade e deixadas formarem monocamadas por mais de 48 horas. O meio gasto
61/109 em cada cavidade foi substituído por meio fresco (0,5 mL) contendo concentrações mais altas de conjugado de corante NIR folato na presença ou na ausência de ligante de competição em excesso de 100 vezes; isto é, ácido fólico. Após incubar por 1 hora a 37° C, as células foram enxaguadas com meio fresco (3x0,5 mL), dissolvido em 1% de SDS aquoso (0,600 mL) e analisados para fluorescência por transferência a uma cuveta de quartzo e análise de intensidade de emissão de fluorescência em cada uma da máxima emissão e excitação do corante usando um espectrofotômetro de fluorescência Agilent Technologies Cary Eclipse. A constante de dissociação do conjugado (Kd) foi calculada plotando unidades de emissão de fluorescência versus a concentração de corante NIR alvejado adicionado usando GraphPad Prism 4.03.
[134] d. Modelos de metastases de rato ao vivo. Todos os procedimentos animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Uso e Cuidado Animal de Purdue. Para os estudos envolvendo tumores com expressão de FR, ratos fêmeas DBA/2 com 5 a 6 semanas de vida foram comprados dos Laboratórios Harlan (Indianapolis, IN) e colocados em dieta deficiente de folato por duas semanas antes de e durante cada estudo. Metástases de tumor foram induzidas injetendo células 1 x 106 L1210A (com expressão de FR) no ventrílocu esquerdo do coração usando uma agulha de calibre 30. Permitiu-se que os tumores desenvolvessem por 4 semanas, após isto, os animais foram injetados intravenosamente com 10 nmols do corante NIR alvejado em FR desejado dissolvido em 100 pi de salina. Após 4 horas, os animais foram sacrificados por asfixia de CO2 e tiveram imagens formadas como descrito abaixo.
[135] e. Formação de imagem fluorescente de ratos com doença metastática. Os experimentos de formação de imagem de animal foram realizados usando Caliper Ivis Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0. Configurações para a formação de imagens de conjugados Alexa Fluor 647 e DyLight 680: nível de lâmpada: alto; excitação: 605; emissão: Cy5.5; iluminação epi; armazenamento: (M) 4; FOV = 7,5; abertura=4; tempo de aquisição=l s. Configurações para a
62/109 formação de imagens de conjugados DyLight 750 e IR800CW: nível de lâmpada: alto; excitação: 745; emissão: ICG; iluminação epi; armazenamento: (M) 4, FOV = 12,5; abertura=4; tempo de aquisição=l s.
[136] f. Coloração H&E de tecidos normais e tecidos doentes. Após a formação de imagem, os órgãos foram dissecados e armazenados em 5 ml de formalina e submetidos ao Laboratório de Histologia & Phenotying de Purdue para coloração H&E. Em resumo, amostras de tecido foram processadas usando um Sakura Tissue-Tek VIP 6, seccionado usando um micrótomo Thermo Finesse ME e coloridas com reagente H& usando um autocolorante Shandon Vari-Stain 24-2. Fatias coloridas com H&E tiveram então sua imagem formada usando um microscópio de pesquisa Olympus BH-2 com uma câmera Olympus DP70.
[137] B. Resultados [138] a. Síntese de corantes NIR alvejados em tumor. Para alvejar tumor seletivamente, os inventores conjugaram corantes NIR disponíveis comercialmente para folato. A maioria dos conjugados de corante NIR folato foram sintetizados com alto rendimento e subsequentemente purificados usando HPLC para homogeneidade.
[139] b. Afinidade de ligação e especificidade corantes NIR alvejados. Como a carga afixada a um ligante pode geralmente interferir com união de ligante, foi benéfico testar as afinidades de ligação dos conjugados de corante NIR folato para células cancerígenas expressando FR. Descobriu-se que as afinidades de ligação de todos os conjugados estão na faixa nanomolar baixa (Figura 2), com alguma variação dependendo do corante ligado, sugerindo que a carga ligada influencia apenas levemente influências de união de ligante. A especificidade de conjugados de corante NIR folato para os seus receptores também foi determinada in vitro adicionando ácido fólico em excesso. Assim como visto na Fig. 2, a ligação foi quase quantitativamente inibida por coincubação com 100 vezes de excesso molar de ácido fólico.
[140] c. Formação de imagem de corantes NIR alvejados em
63/109 tumor ao vivo. Antes de avaliação das especificidades de tumor dos corantes alvos de tumor, foi benéfico comprar as intensidades dos corantes selecionados após excitação através de tecido. Para este propósito, 1 ml de tampão salino de fosfato contendo 100 nm de cada corante (Alexa Fluor 647, DyLight 680, DyLight 750, IR800CW) foi colocado em um tubo Eppendorf, o qual por sua vez foi posicionado sob uma seção de 1 cm de espessura de músculo de porco fresco e os tecidos resultantes tiveram sua imagem formada sob as mesmas condições em Kodak Image Station e IVIS Lumina Imager, apenas a excitação e emissão ideais de comprimentos de onda foram sempre selecionadas para cada corante em cada instrumento. IR800CW produziu o sinal fluorescente mais luminoso, com DyLight 750 rendendo um sinal de intensidade intermediária e Alexa Fluor 647 e DyLight 680 exibindo a fluorescência mais fraca.
[141] Para comparar as capacidades dos conjugados de corante NIR folato acima para detectar nódulos de tumor metastáticos ao vivo, um modelo de rato de metástases de tumor foi desenvolvido que envolveu injeção intracardíaca de células 106 L1210A (células expressando FR) seguido criação normal de ratos por 4 semanas para permitir que tumores nascentes crescessem. Ratos portadores de tumor foram então tratados com 10 nmol de conjugado de corante NIR folato selecionado através de injeção na veia da cauda e os ratos foram eutanizados 4 horas depois para a formação de imagem de fluorescência. Assim como visto na Fig. 3, o local de tumor pôde ser imediatamente distinguido, proporcionando forte contraste entre nódulos cancerígenos fluorescentes e tecidos saudáveis adjacentes. Em alguns casos, tumores fluorescentes podiam até ser vistos em imagens de ratos intactos (Fig. 3, painéis superiores), porém, devido a diferenças em tamanho de tumor, local e profundidade, não foi possível para inequivocadamente estabelecer qual corante NIR rendeu as melhores imagens em animais intactos.
[142] Finalmente, para imitar um ambiente cirúrgico de verdade, resseção de tecido de tumor fluorescente foi realizada em estágios, com
64/109 as maiores massas sendo removidas primeiro e locais malignos menores sendo operados após massas fluorescentes mais proeminentes terem sido liberadas (Fig. 4). Beneficamente, a remoção das massas principais geralmente revelaram metástases secundárias que não eram visíveis antes das rodadas iniciais de cirurgia e provavelmente teriam sido ignoradas sem o auxílio de fluorescência específica de tumor. Seguindo estas múltiplas rodadas de resseção, quando toda a fluorescência visível foi removida, tecidos operados foram submetidos a análise histológica e estes estudos revelaram que todos os nódulos fluorescentes eram de fato malignos. Beneficamente, amostragem aleatória dos tecidos restantes demonstraram que regiões não fluorescentes eram não malignas (Fig. 4d), sugerindo uma remoção quantitativa aparente de lesões cancerígenas com o auxílio de corantes fluorescentes alvejados em tumor.
[143] C. Discussão [144] Uma segunda abordagem a cirurgia guiada por fluorescência envolve a conjugação de um corante NIR a um ligante alvo alvejado em tumor que se prende avidamente a células cancerígenas e se libera quantitativamente da maioria de tecidos saudáveis. As vantagens desta abordagem incluem: i) a rápida taxa de visualização de tumor, devido ao fato de que absorção de tumor e liberação do corante de tecido normal pode ocorrer dentro de minutos da injeção intravenosa, ii) a estabilidade de contraste de tumor, surgindo do fato de que conjugados de corante ligante são comumente internalizados pelas células cancerígenas através de endocitose mediada de receptor, iii) a especificidade da fluorescência sempre que o receptor alvo ou está ausente, expresso fracamente ou inacessível em tecidos normais e iv) a ausência de “vazamento” de fluorescência de tecidos malignos para tecidos não malignos, devido à alta retenção de afinidade do conjugado de corante ligante em seu receptor, criando margens altamente definidas que claramente demarcam o câncer. Uma desvantagem da estratégia deriva do fato de que corante alvejado em ligante é sempre fluorescente, mesmo durante
65/109 excreção, evitando a formação de imagem de tumores de rim e bexiga até a excreção do corante estar completa.
[145] Um resultado surpreendente destes estudos foi o tamanho menor de lesões malignas que puderam ser imediatamente detectadas ao vivo. Deste modo, uma análise mais detalhada de diversos locais com doença metastática pontuada revelou que grupos de células de câncer tão pequenas quanto 50 pm podiam ser visualizados com o uso de ótica de maior resolução. Como os grupos de até mesmo umas poucas células pode eventualmente levar à recorrência do câncer, a capacidade de detectar e de remover até mesmo as menores lesões metastáticas pode eventualmente levar a taxa de mortalidade de paciente reduzida, assumindo que uma câmera apropriada pode ser designada.
[146] Embora a maioria das aplicações de cirurgia guiada por fluorescência provavelmente permanecem a serem descobertas, alguns usos da tecnologia já podem ser previstos. Primeiro, mais lesões malignas serão potencialmente identificadas e operadas devido à melhor visualização de massas. Segundo, em casos onde a preservação máxima de tecidos normais é essencial (isto é, cânceres do cérebro, mama, pâncreas, cabeça e pescoço etc.), raspagem cuidadosa de lesões fluorescentes até que nenhuma fluorescência permaneça pode permitir uma conservação mais eficiente de tecido saudável. Terceiro, estágio préoperatório de pacientes com câncer pode eventualmente ser possível através de interrogatório laparoscópico de nódulos linfáticos proximais para lesões fluorescentes, obviando a necessidade de cirurgia quando metástases significativas são claramente observadas e eliminando o requisito de amostragem cirúrgica subsequente de nódulos linfáticos sentinelas quando apenas uma única massa de tumor é detectada.
[147] Em conclusão, o presente exemplo demonstra que corantes NIR alvejados em tumor possuem o potencial de reformular procedimentos cirúrgicos padrão melhorando a visualização de tecidos malignos, levando à remoção de tecido doente mais completa e precisa e resultado de paciente melhorado.
66/109 [148] EXEMPLO 2: Desenho e Síntese da Sonda Próximo a Infravermelho Conjugada de Folato Ideal com Afinidade Alvo Alta e Sensibilidade para Cirurgia de Câncer Guiada por Fluorescência [149] Até mesmo com as sofisticadas ferramentas de identificação de tumor, diversos nódulos malignos ainda escapam detecção, levando à recorrência de doença e geralmente à morte. Motivado pela necessidade de identificação de tumor melhorada, duas novas abordagens para visualização intraoperatória de doença maligna foram introduzidas. Na primeira, um corante fluorescente resfriado bruscamente é injetado de forma sistemática no animal portador de tumor e liberação da parte resfriada bruscamente por uma enzima específica de tumor, mudança de pH, ou mudança em potencial redox é explorado para ativar fluorescência seletivamente dentro da massa maligna. Na segunda, um corante fluorescente é conjugado a um ligante alvo específico de tumor o que faz com que o corante ligado se acumule em cânceres que sobre-expressam o receptor do ligante. Exemplos de ligantes alvos de tumor usados para este último propósito incluem o ácido fólico, o qual exibe especificidade para cânceres positivos de receptor de folato (RE) de ovário, rim, pulmão, endométrio, mama e intestino. Beneficamente, um corante fluorescente alvejado em folato (folato-fluoresceína ou EC 17) foi recentemente testado introperatoriamente em pacientes humanos com câncer de ovário. Naquele estudo, lesões ~5X mais malignas foram removidas com o auxílio do corante fluorescente específico de tumor do que sem ele e todas as lesões fluorescentes operadas foram confirmados por patologia como sendo malignas.
[150] Infelizmente, uma grande deficiência com o estudo clínico acima derivou do fato de que o corante ligado (fluoresceína) emite fluorescência na faixa visível, isto é, onde autofluorescência é forte e penetra no tecido fracamente. Como luz na região NIR induz pouco autofluorescência e permeia o tecido de forma muito mais eficiente, os inventores postularam que uma resseção de tumor mais completa seria possível se um corante NIR fosse usado para guiar a cirurgia. Embora
67/109 haja um número limitado de fluoroforos NIR disponíveis comercialmente e amplamente baseados na estrutura química da cianina com modificações específicas por cada fabricante (Figura 6). Felizmente, cada uma das séries de fluoroforo vem como fluoroforos reativos que podem ser imediatamente conjugados à proteína ou ligante de interesse para alvejamento ao vivo de interesse através de química de conjugação. A maioria dos fluoroforos NIR experimentais comercialmente disponíveis estão disponíveis como ésteres TV-hidroxisucinimido (NHS) o qual pode ser usado para conjugação de fluoroforo em N-terminal amina. Para avaliar e identificar a melhor sonda NIR de conjugado de folato para cirurgia de câncer guiada por imagem, os inventores conjugaram os corantes de éster NHS fotoestáveis NIR (compostos a - c abaixo) com folatos funcionalizados de N-terminal amina (Fol-EDA e Fol-Lys) renderam as sondas NIR esperadas (la-c e 2a-c) junto com uma grande eliminação de derivados (le-g e 2e-g). Para alcançar o rendimento melhorado, o corante NIR mais estável LS288 NHS éster (d) foi utilizado e isolou os corantes conjugados de folato NIR “Id e 2d com bons rendimentos. As propriedades óticas e fotoestabilidade das sondas NIR de folato sintetizado la-d e 2a-d foram caracterizadas.
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Figure BR112015022810A2_D0032
[151] O espectro de excitação e emissão de fluorescência de todos as sondas folato-NIR la-d e 2a-d (500 L; 5 M em PBS) na mesma concentração mostrou intensidade quase semelhante. A citotoxidade e afinidade de receptor de folato da sonda foram investigadas por experimentos de célula in vitro e a capacidade alvo de tumor foi investigada ao vivo em cinco grupos de ratos nus portadores de xenoenxertos de tumor FR+ KB, biodistribuição também foi examinada usando o sistema de formação de imagem de fluorescência próximo a infravermelho Lumina II. Infelizmente, a biodistribuição mostrou sondas de folato-NIR de alto rendimento sinteticamente favoráveis da Figura 6 composto ld e figura 7 composto 2d tinha duas vezes menos luminosidade do que a intensidade de fluorescência em tumor comparado com outras sondas de folato-NIR da Figura 6 compostos la-c e Figura 7 compostos 2a-c.
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Figure BR112015022810A2_D0033
[152] Em vista da estrutura, a variação benéfica foi a substituição (SNm) no carbono ciclohexeno análogo a vinil central (C(sp2)) por parte de fenol em corantes NIR a-c e parte fenila em corante NIR d também com suas correspondentes sondas de folato-NIR final. Esses motivos acima motivaram os inventores a desenvolver uma nova sonda de folato-NIR modificada com intensidade fotoestável, seletiva e de alta fluorescência em pH fisiológico.
70/109 [153] Para solucionar o problema, a estratégia geral foi escolher S0456 como um fluoroforo NIR precursor comercialmente disponível deveria conter quatro grupos S03H para solubilidade e anel ciclohexenila rígido no meio de fluoroforo para fotoestabilidade e cloro ciclohexeno analógico a vinil (C(sp2)CI) para conectar oxigênio fenólico o qual será benéfico para alta sensibilidade e fluorescência clara para formação de imagem de tumor ao vivo. Além disso, os requisitos estruturais para ligantes de receptor de folato com bolso de ligação de folato foram investigados para melhorar a afinidade de ligação e seletividade dos ligantes ao receptor. A estrutura de cristal de receptor de folato não foi estabelecida e existe um argumento de que ácido pteróico, um fragmento de ácido fólico sem o resíduo distai de glutamila é bom o bastante para ligação ao receptor de folato de alta afinidade. Para determinar se o ácido carboxílico em resíduo glutamila é benéfico para ligação com receptor de folato, os inventores sintetizaram diversos conjugados de aminoácido e não aminoácido de pteroíla e suas sondas NIR. Em seguir, os inventores compararam todas estas novas sondas folato-NIR modificadas para afinidade de ligação in vitro com células de câncer positivo de receptor de folato e formação de imagem ao vivo com tumor KB positivo de receptor de folato. De modo interessante, os inventores não observaram muita variação em afinidade de ligação, mas houve uma mudança incrível em especificidade de tumor e intensidade de fluorescência. O estudo foi consistente com todos os conjugados de folato NIR e ácido carboxílico em resíduo glutamila sugerido é benéfico para alvejamento de tumor específico, absorção e a substituição de oxigênio fenólico no carbono ciclohexeno analógico a vinil central (C(sp2)) em corante NIR será benéfico para alta intensidade de fluorescência do tecido de tumor. Portanto, é urgente desenvolver uma estratégia mais simples e mais direta para obter uma nova sonda fluorescente de folato-NIR modificada ideal para cirurgia de câncer guiada por imagem. Os inventores projetaram e sintetizaram uma nova sonda fluorescente de folato-NIR modificada sensível, fotoestável e seletiva de tumor (Pteroyl-Tyr-S0456;
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Figura 6) com alta intensidade de fluorescência para uma aplicação clínica.
[154] No presente exemplo, os inventores projetaram uma sonda de fluorescência próximo a infravermelho alvejada em receptor de folato (Pteroyl_Tyr_S0456) com intensidade de fluorescência fortificada e fotoestabilidade. A alta capacidade de alvejamento para tumores sobre expressados de receptor de folato com intensidade de fluorescência clara foi demonstrada. Esta nova conjugação Pteroyl_Tyr_S0456 melhorou a dinâmica da sonda em ratos cobaias e realçou a capacidade de alvejamento e sensibilidade a tumores sobre-expressos de FR. Os resultados neste exemplo demonstram que esta nova sonda NIR possui grande potencial no diagnóstico de tumores em estágio inicial.
[155] EXEMPLO 3 [156] Análise Comparativa de OTL-OOOl (FA-EDA- LS288), OTL0002 (FA-EDA-IR800), OTL-0003 (FA-EDA-ZW800) e OTL-0004 (FAED A-Kodak2) [157] Material e Métodos:
[158] Células KB (uma linha de célula nasofaringeal humana) foram obtidas da American type culture collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada usando meio 1640 RPMI livre de folato contendo (Gibco, NY) 10% de soro bovino fetal não ativado de calor (Atlanta Biological, GA) e 1 % de penicillina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de ar atmosférico umidificado a 37° C por pelo menos seis passagens antes de serem usadas para as análises.
[159] Ratos fêmeas nus atímicos (5 semanas de idade, 18 g a 20 g) foram comprados de Harlan (IN) e mantidos em dieta especial deficiente em folato irradiados por gama (Teklad, Wl) por pelo menos 2 semanas antes de começar o estudo. Os animais foram abrigados 5/jaula em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógeno. Água de torneira autoclivada e comida foram dadas conforme necessário. Os animais foram abrigados em um ambiente estéril em um ciclo de claro e escuro de 12 horas padrão pela duração do estudo. Os ratos foram identificados
72/109 individualmente por furo na orelha. Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal de Purdue. Cuidado animal e estudos foram realizados de acordo com guias nacionais e internacionais para o tratamento humano de animais.
[160] Formação de imagem de corpo todo:
[161] Ratos nu/nu fêmeas com sete semanas de vida foram inoculados subcutaneamente com células KB (1,0 x 106/rato em meio RPMI1640 livre de folato) no ombro. O crescimento de tumores foi medido em direções perpendiculares a cada 2 dias usando um compasso de calibre (os pesos corporais foram monitorados na mesma programação) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L = eixo mais longo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores alcançaram entre 400 mm3 e 500 mm3 em volume, os animais (2 ratos/grupo) foram injetados intravenosamente com 10 nmol de artigo de teste (FA-EDA-LS288, FA-EDA-IR800, FA-EDA-ZW800 e FA-EDAKodak2) em tampão salino de fosfato (100 μΙ_). Após 2 horas, os animais foram eutanizados por asfixia de CO2. Experimentos de formação de imagem (tumor intacto) de corpo inteiro foram então realizados usando Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Configurações para a formação de imagens de conjugados:-nível de lâmpada: médio; excitação: 745 nm; emissão: 830 nm; iluminação epi; armazenamento: 4 (M), FOV = 12,5; abertura = 2; tempo de aquisição = 1 s.
[162] Biodistribuição de Tecidos:
[163] Seguindo a formação de imagem de corpo inteiro, os animais foram dissecados e tecidos selecionados (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele, tumor) foram analisados para atividade de fluorescência usando formador de imagem IVIS assim como antes. Configurações para a formação de imagens de conjugados:- nível de lâmpada: médio; excitação: 745 nm; emissão: 830 nm; iluminação epi; armazenamento: 4 (M), FOV = 12,5; abertura = 2; tempo de aquisição = 1 s.
73/109 [164] Resultados:
[165] Formação de imagem de corpo inteiro: Assim como visto na Figura 7a, FA-EDA-LS288, FA-EDA-IR800 e FA-EDA-ZW800 acumularam predominantemente nos tumores positivos de receptor de folato, sem atividade de fluorescência substancial nos outros tecidos. Porém, FA-EDA-Kodak2 não acumulou nos tumores. Além disso, comparação direta demonstrou que intensidade de fluorescência de tumor de ratos injetados com FA-EDA-IR800 foi mais clara (maior intensidade de fluorescência) do que os ratos tratados com outros corantes NIR conjugado de folato (Fig. 7b).
[166] Conclusão:
[167] A luminosidade e a especificidade dos conjugados listados de melhor para pior são as seguintes: FA-EDA-IR800, FA-EDA-ZW800, FAEDA-LS288, FA-EDA-Kodak2. Os conjugados contendo IR800 e ZW800 mostraram a mais alta fluorescência acumulada em tumor enquanto que o conjugado contendo Kodak mostrou muito pouca especificidade para o tumor. A baixa fluorescência vista no conjugado Kodak pode ser devido ao fato de que o corante excita a 800 nm. O sistema de imagem IVIS não possui um filtro para excitar a 800 nm, então a baixa fluorescência nos tumores pode ser devido ao uso de um comprimento de onda de excitação fraco.
[168] EXEMPLO 4: Formação de imagem de corpo inteiro e Biodistribuição de corantes de infravermelho receptor alvo de folato [169] Materiais e métodos:
[170] Células KB (uma linha de célula nasofaringeal humana) foram obtidas da coleta de cultura tipo Americano (Rockville, MD) e crescimento como uma monocamada de um meio 1640 RPMI livre de folato contendo (Gibco, NY) 10% de soro bovino fetal inativado por calor (Atlanta Biological, GA) e 1% de penicilina-streptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera de ar umidificado a 37°C por pelo menos seis passagens antes de elas serem usadas para os ensaios.
[171] Ratos nus femininos atímicos (5 semanas de idade, 18 - 20 g)
74/109 foram comprados de Harlan (Indianápolis, IN) e mantidos em dieta especial deficiente de folato gama irradiado (Teklad, WI) por pelo menos 2 semanas antes do início do estudo. Animais foram alojados 5/gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógeno. Água da torneira autoclavada e comida foram dados conforme necessário. Os animais foram alojados em um ambiente estéril em um ciclo de claro-escuro padrão de 12h pela duração do estudo. Ratos foram identificados individualmente por furo na orelha. Todos procedimentos animais foram aprovados por Cuidado Animal Purdure e Comitê de Uso. Cuidado animal e estudos foram realizados de acordo com as linhas de guia internacional e nacional para o tratamento humano de animais.
[172] Formação de Imagem de corpo inteiro:
[173] Ratos nu/nu femininos de sete semanas de idade foram inoculados subcutaneamente com células KB (1,0 x 106/rato no meio RPMI1640 livre de folato) no ombro. Crescimento de tumores foi medido em direções perpendiculares cada 2 dias usando um compasso de calibre (pesos corporais foram monitorados no mesmo cronograma) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L= eixo mais longo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores alcançaram entre 400 e 500 mm3 de volume, animais (2-3 ratos/grupo) foram injetados intravenosamente com 10 nmol de artigo de teste em tampão de fosfato salino (lOOgL). Após 2 horas, animais foram eutanaziados por asfixia por CO2. Experimentos de formação de imagem de corpo inteiro (tumor intacto) foram então realizados usando um Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Conjuntos para formação de imagem - nível de lâmpada: médio; excitação: 745 nm, emissão: ICG (830 nm) iluminação epi; binning: 4 (M), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = ls.
[174] Biodistribuição de Tecidos:
[175] Seguindo formação de imagem de corpo inteiro, animais foram dissecados e tecidos selecionados (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele e tumor)
75/109 foram analisador para atividade de fluorescência usando formador de imagem IVIS como antes. Configurações para formação de imagem - nível de lâmpada: médio; excitação: 745 nm, emissão: ICG (830 nm) iluminação epi; binning: 4 (M), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = ls.
[176] Resultados:
[177] Formação de imagem de corpo inteiro [178] Como visto na Figura 1: FA-EDA-LS288, FA-EDA-IR800 e FAEDA-ZW800 acumularam predominantemente nos tumores positivos de receptor de folato, com nenhuma atividade de fluorescência substancial em outros tecidos. Mais adicionalmente, comparação direta demonstrou que intensidade de fluorescência do tumor FA-EDA-IR800 injetados nos ratos foram mais claros (maiores) que os ratos tratados com os outros corantes próximos a IR conjugados de folato (Fig. 2).
[179] Biodistribuição de Tecidos:
[180] Análise de Biodistribuição de Tecidos foi realizada em animais sob as mesmas condições por eutanásia de cada rato, removendo seus órgãos e formando imagem dos mesmos usando um formador de imagem IVIS. Como visto na Figura 2, a intensidade de fluorescência mais alta foi observada em tumores positivos de FR e os rins. A captação de rim foi antecipada desde que a membrana ápica do túbulo proximal do rim tem sido conhecido a expressar altos níveis de receptor de folato. Mais adicionalmente, é possível que sondas são excretadas através dos rins devido a seus baixos pesos moleculares e meia-vida (a maioria dos conjugados de folato tem meia-vida de < 30 min).
[181] Conclusão:
[182] O brilho e especificidade dos conjugados listados do melhor ao pior são como se segue: FA-EDA-IR800, FA-EDA-ZW800, FA-EDA-LS288, FA-EDA-Kodak2. Os conjugados contendo IR800 e ZQ800 mostraram a maior fluorescência acumulada de tumor enquanto o conjugado contendo Kodak mostrou muito pouca especificidade para o tumor e pouca fluorescência comparado aos outros.
76/109 [183] A. MATERIAIS E MÉTODOS [184] Os resultados mostrados no presente exemplo foram obtidos usando materiais específicos e métodos descritos aqui. Ê tido em consideração que a pessoa versada pode ser capaz de modificar estes métodos, condições de reação e condições de teste e ainda produz resultados que demonstram a eficácia dos corantes NIR alvo FR da presente divulgação.
[185] a. Síntese e caracterização dos conjugados de folato-NIR. Síntese e caracterização de conjugados de folato de NIR foram realizados substancialmente como descrito no Exemplo 1.
[186] b. Afinidade de Ligação Relativa dos conjugados de folatoNIR (4) a FR. Células KB que sobre expressam FR-α foram semeados em placas Falcon de 24-poços (100.000 células/poço) e deixadas a formar monocamadas por um período de 24h. Meio gasto em cada poço foi substituído com 10 nM[3H]- de folato na presença de concentração crescente (0,1 nM - ΙμΜ) do artigo de teste ou ácido fólico em meio fresco (0,5 mL). Após incubar por 1 hora a 37°C, células foram lavadas com PBS (2 x 0,5 mL) e ácido tricloroacético 1M (1 x 0,5 mL) para remover quaisquer materiais radioativos não ligados. Após adicionar dodecilsulfato de sódio 1% em PBS (0,5 mL), células foram transferidas em frascos de cintilação individual contendo coquetel de cintilação Ecolume (3,0 mL) e contados em um analisador de cintilação de líquido. As afinidades de ligação relativa foram calculadas usando uma plotagem de radioatividade de ligação de célula versus a concentração do artigo de teste usando Graph Pad Prism 4.
[187] c. Modelos de rato in vivo de xenoenxertos de tumor subcutâneo. Ratos nu/nu femininos de cinco sememas de idade foram inoculados subcutaneamente com células KB (1,0 x 106/rato em meio RPMI) em seus ombros. Crescimento dos tumores foi medido em duas direções perpendiculares a cada 2 dias usando um compasso de calibre (pesos dos corpos foram monitorados no mesmo cronograma) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L= eixo mais
77/109 longo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores alcançaram entre 400 e 500 mm3 de volume, animais foram tratados com conjugado de corante NIR alvo receptor (10 nmol) em tampão de fosfato salino (lOOpL). Após 2 horas, animais foram sacrificados por asfixia por CO2 e formados em imagem como descrito abaixo.
[188] d. Formação de imagem fluorescente de ratos com tumor FR + KB. Experimentos de formação de imagem animal foram realizados usando um Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Conjuntos para formação de imagem de conjugados Alexa Fluor 647 e DyLight 680 - nível de lâmpada:alto; excitação: 605, emissão: Cy5.5; iluminação epi; binning: 4 (M), FOV = 7,5; parada-f = 4; tempo de aquisição = ls. Configurações para formação de imagem de conjugados DyLight 750 e IR800CQ; nível de lâmpada:alto: excitação: 745, emissão: ICG; iluminação epi; binning: 4 (M), FOV = 12,5; parada-f = 4; tempo de aquisição = ls.
[189] B. Resultados [190] a. Sínteses de corantes NIR de tumor alvo. Para alvo de tumor seletivo, os inventores conjugaram corantes de NIR disponíveis comercialmente a tanto folato ou pteroato através de formação de ligação de amida usando corante NHS ativado ou reação de síntese de éter de Williamson usando derivado de cloro de corante NIR. Pte-aminoácidoNIR, especialmente tirosina, foi sintetizado em rendimento muito alto (> 98%) sem qualquer técnica de HPLC ou purificação especial (por precipitação) com pureza muito alta (> 98%). Os aminoácidos referidos aqui são tirosina e seus análogos, cistina, serina, lisina etc. Os corantes de NIR que usamos são S0456, Kodak, SO 121 e S2076 (não limitado a). Síntese de tanto conjugados NIR ligados de folatos tais como folato1R800CW (3) e folato- ZW800 (5), entretanto, resultaram em produção de subprodutos proeminentes (Figura 10B) que necessitam técnicas de purificação especial tais como HPLC, assim levando a custo alto de produção e aumento no tempo para pré-clínica para tradução clínica. Isto
78/109 não irá apenar afetar os avanços da cirurgia oncológica, mas também pacientes que estão esperando novos agentes terapêuticos. Mais adicionalmente, custo alto de produção pode afetar indiretamente pacientes e seus fornecedores de seguro devido a aumento no custo da droga. Importantemente, reação de Pt-Tyr-S0456 não rendeu qualquer subproduto indesejado e reação foi completada dentro de 15 minutos com rendimento alto e alta pureza (Figura 10A).
[191] b. Afinidade de ligação e especificidade dos corantes de NIR receptor alvo de folato. A afinidade e especificidade de conjugados de folato e pretoato NIR foi primeiro avaliada usando células de câncer (KB) que sobreexpressaram receptor de folato. Os estudos completos com ácido fólico tritiado (ácido fólico radiomarcado) demonstraram que conjugados de folato ou preroato não apenas ligaram a receptor de folato com alta afinidade (valores nanomolares baixos) mas também com alta especificidade (Figura 6). Os estudos completos com ácido tritiado fólico (ácido fólico radiomarcado) demonstraram que Pte-Tyr-S0456 liga receptor de folato com alta afinidade e especificidade sugerindo que conjugação de parte de S0456 em volume através de oxigênio fenólico não compromete a ligação de Pte-Tyr a receptor de folato.
[192] c. Formação de imagem de corantes NIR alvo de tumor in vivo. De modo a comparar as habilidades dos conjugados de corante acima folato-NIR para a detecção de tumores, em um modelo de xenoenxerto foi desenvolvido que a implantação de células KB envolvidas por via subcutânea (células que expressam FR) seguido de criação de ratos normais durante 4 semanas para permitir que os tumores incipientes cresçam. Ratos portadores de tumor foram então tratados com 10 nmol de corante selecionado de conjugado de folato-NIR através de injeção na veia da cauda e os ratos foram sacrificados 2 horas mais tarde para formação de imagem de fluorescência. Como pode ser visto na Figura 7A o local do tumor poderia ser facilmente distinguido, obtendose forte contraste entre os nódulos fluorescentes cancerosos e tecidos saudáveis adjacentes. Mais importante ainda, os tumores fluorescentes
79/109 intactos foram sequer vistos em imagens de ratos intactos, sem a abertura ou a colheita do tumor (Fig. 7A). Estudo de imagem de fluorescência de corpo inteiro cabeça-de-cabeça para o agente NIR receptor de folato direcionado de segunda geração indicou que folatoIR800CW (3) era competitivo (em termos de brilho fluorescente) a todos os outros corantes (Figura 7A, 2o bruto). No entanto, infelizmente, folato1 R800CW (3) não foi estável durante a síntese levando a formar mais de 60% de subprodutos indesejáveis. Como mencionado anteriormente, isso irá causar técnicas especiais de purificação indicando caminho para um maior custo de produção, maior período de espera para a tradução clínica e cirurgiões e pacientes não terão acesso à droga.
[193] Para estabelecer a especificidade in vivo, Pte-Tyr-S0456 foi administrado a ratos portadores de xenoenxertos de tumores do receptor de folato positivo sobre os seus ombros. Estudos in vivo imagem de corpo inteiro demonstrou que Pte-Tyr-S0456 é principalmente acumulado nos tumores positivos para o receptor de folato e ausência de fluorescência foi observada em outros tecidos (Figura 11 A). Estudos ex vivo de biodistribuição dos tecidos indicou que Pte-Tyr-S0456 acumulado predominantemente nos tumores positivos para o receptor de folato, sem atividade de fluorescência substancial em outros órgãos, exceto os rins (Figura 1 1 B e 12 B). Absorção significativa nos rins era esperada, uma vez que a membrana apical do túbulo proximal do rim tem sido conhecida por expressar níveis elevados de RE. Estudo de comparação cabeça-acabeça de Pte-Tyr-S0456 com folato-IR800CW, folato-LS288 e folatoZW800 demonstraram que Pte-Tyr-S0456 é competitivo, em termos de brilho fluorescente, para todos os conjugados de folato-NIR (Figura 12 A e B). Além disso, a fluorescência formada em imagem de fatias (tumores dissecados) sugeriu que tanto Pte-Tyr-S0456 como todos os conjugados folato-NIR foram acumulados homogeneamente em todas as células tumorais, mesmo que estejam enterrados no interior do tumor (Figura 12C).
[194] EXEMPLO 5 Estudos in vitro de Farmacologia de Corantes
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Folato- e Pteroila-NIR [195] Material e Métodos:
[196] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 livre de folato (Gibco, NY) contendo, 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida com ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[197] As células KB que sobreexpressam FR-A foram semeadas em placas de 24 poços (100.000 células / poço) placas Falcon (BD Biosciences, CA) e deixou-se formar monocamadas durante um período de 12 h. Meio gasto em cada poço foi combinado com 10 nM de [3H] ácido fólico (ácido fólico tritiado) na presença de concentrações crescentes de (0,1 nM - 1 μΜ) do artigo de teste ou do ácido fólico (Sigma-Aldrich, MO) em meio fresco (0,5 mL). Após incubação durante 1 h a 37 ° C, as células foram lavadas com PBS (3 x 0,5 mL, Gibco, NY) para remover qualquer material radioativo não ligado. Após a adição de hidróxido de sódio 0,25 M (0,5 ml) e incubação durante 12 h a 4 ° C, as células foram transferidas para frascos de cintilação individuais contendo coquetel Ecolite de cintilação (3,0 ml, MP Biomedicals, OH) e contadas em um analisador de cintilação líquida (Packard) . As afinidades de ligação relativas foram calculadas usando um gráfico da % de células radioatividade ligada versus o log da concentração do artigo de teste utilizando GraphPad Prism 4.
[198] Resultados:
[199] As constantes de dissociação (KD) derivadas dos estudos foi calculada como sendo de 30,7 nM, 19,3 Nm, 23,3 nM, 30,6 nM, 50,1 nM,
22,8 nM, 30,5 nM, 39,7 nM, 49,6 nM, 30,5 nM e 8 nM para compostos OTL-OOl - OTL-OOIO e ácido fólico, respectivamente. Afinidades de ligação relativas foram calculadas para ser 0,270, 0,430, 0,356, 0,271,
81/109
0,166, 0,364, 0,272, 0,209, 0,167, 0,272 e 1 para OTL-OOOl- OTL-OOIO e ácido fólico, respectivamente. Todos os artigos de teste competiram quantitativamente com [3H] ácido fólico. Afinidade de ligação relativa é definida como a razão molar do composto necessária para deslocar 50% de [3H] ácido fólico ligado ao receptor de folato nas células; afinidade relativa de ácido fólico = 1; afinidade relativa <1 indica afinidade mais fraca ao receptor de folato; afinidade relativa > 1 indica ligação mais forte ao receptor de folato.
[200] Conclusão:
[201] Todos os compostos têm uma afinidade ao receptor de folato e comparam moderadamente bem com a afinidade de ligação de ácido fólico. Todos os compostos competiram bem com [3H] ácido fólico indicando que o receptor de folato constitui o único local de ligação sobre as células cancerosas e são altamente específicos para o receptor de folato.
[202] EXEMPLO 6: estudos in vitro de Farmacologia de OTL-0038 e OTL-0039 (Isômero D do OTL-0038) [203] Dois conjugados de ligante NIR foram desenvolvidos e designados OTL-0038 e OTL-0039. Composto OTL-0038 refere-se àTEPL-Tir-S0456, onde pteroila, o ligante é conjugado a L-tirosina, o qual está ligado ao S0456. OTL-0039 é o isômero D de OTL-0038. A afinidade de ligação e especificidade de ligação de ambos os compostos para os receptores de folato foram examinadas em comparação com o ácido fólico, o conjugado de ligante para os receptores de folato.
A. Material e Métodos [204] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 livre de folato contendo (Gibco, NY), 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco,
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NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida com ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[205] As células KB que sobreexpressam FR-A foram semeadas em placas de 24 poços (100.000 células / poço) placas Falcon (BD Biosciences, CA) e deixou-se formar monocamadas durante um período de 12 horas. Meio usado em cada poço foi combinado com 10 nM de [3H] ácido fólico (ácido fólico tritiado) na presença de concentrações crescentes (0,1 nM - 1 μΜ) do OTL-0039 (isómero D) e OTL-0038 (isômero L), ou ácido fólico (Sigma-Aldrich, MO) em meio fresco (0,5 mL). Após incubação durante 1 hora a 37 ° C, as células foram lavadas com PBS (3 x 0,5 mL, Gibco, NY) para remover quaisquer materiais não ligados radioativos. Após a adição de hidróxido de sódio 0,25 M (0,5 mL) e incubadas durante 12 horas a 4 ° C, as células foram transferidas para frascos de cintilação individuais contendo coquetel Ecolite de cintilação (3,0 ml, MP Biomedicals, OH) e contadas em um analisador de cintilação líquida (Packard) . As afinidades de ligação relativas foram calculadas usando um gráfico da % de células radioatividade ligada versus o log da concentração do artigo de teste utilizando GraphPad Prism 4.
B. Resultados [206] As constantes de dissociação (KD) derivadas a partir dos estudos foram calculadas como sendo de 0,8 81 nM, 10,4 nM e 7,4 nM para OTL-0039, OTL-0038, ou o ácido fólico, respectivamente. Afinidades de ligação relativas foram calculadas para ser de 0,09, 0,71 e 1 para OTL0039, OTL-0038 e ácido fólico, respectivamente. Todos os três artigos teste competiu quantitativamente com [3 H] ácido fólico.
[207] Afinidade de ligação relativa é definida como a razão molar do composto necessário para deslocar 50% de [3H] ácido fólico ligado ao receptor de folato nas células; afinidade aparente de ácido fólico = 1; afinidade relativa < 1 indica afinidade mais fraca para o receptor de folato;
83/109 afinidade relativa > 1 indica ligação mais forte ao receptor de folato.
C. Conclusão [208] OTL-0038 tem afinidade ao receptor de folato e compara bem com a afinidade de ligação de ácido fólico (10,4 nM vs 7,4 nM). Por outro lado, OTL-0039 tem uma afinidade mais baixa ao receptor de folato, quando comparado com o ácido fólico e OTL-0038. OTL-0038 competiu bem com [3H] ácido fólico indicando que o receptor de folato constitui local único de OTL-0038 de ligação em células cancerosas e que é altamente específico para o receptor de folato.
[209] EXEMPLO 7: Total das imagens do corpo e Biodistribuição de OTL-0038 e OTL-0039 (isômero D do OTL-0038) em ratos portadores de receptor de folato - xenoenxertos de tumores positivos [210] O receptor captação tumoral positiva folato de OTL-0038 (PTEL-Tyr-S0456) e OTL-0039 (PTE-D-Tyr-S0456) foi examinado para determinar o quão bem ambos os compostos foram ocupados por receptores alvo nos tumores. A Biodistribuição de tecidos dos compostos também foi examinada. Ambas as propriedades foram examinadas em ratos duas horas e meia após a administração intravenosa dos compostos.
A. Material e Métodos
A Cultura de Células e Preparação de Animais [211] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 livre de folato contendo (Gibco, NY), 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida com ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os
84/109 ensaios.
[212] Ratos nus (nu / nu) fêmea atímicas (5 semanas de idade, em 18 - 20 g) foram adquiridos da Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) e mantidos sob irradiação com radiação gama com dieta especial deficiente de folato (Teklad, Wl) durante pelo menos 2 semanas antes do início do estudo. Os animais foram alojados 5 / gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógenos. Água da torneira autoclavada e comida foram dados conforme necessário. Os animais foram alojados em um ambiente estéril em um ciclo de luz-escuro de 12 hora padrão para a duração do estudo. Os ratos foram identificados individualmente por punção da orelha. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Purdue Animal Care e Uso do Comitê. Cuidados com animais e estudos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o tratamento humano dos animais. Imagem de corpo inteiro
Imageamento de Corpo Inteiro [213] Ratos do sexo femininos nu/ nu de sete semanas de idade foram inoculados subcutaneamente com células KB (10,0 x 106 / rato em meio RPMI1640 livre de folato) no ombro. O crescimento dos tumores foi medido em direções perpendiculares a cada 2 dias utilizando um compasso de calibre (pesos corporais foram monitorados no mesmo horário) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L = maior eixo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores atingiram entre 400 e 500 mm3 de volume, animais (5 ratos / grupo) foram injetados intravenosamente com 10 nmol de OTL-0038 ou OTL-0039 em tampão de fosfato salino (100 pL). Depois de 2,5 horas, os animais foram sacrificados por asfixia com CO2. Experimentos de formação de imagem de corpo inteiro (tumor intacto) foram então realizados usando uma estação de imagens Caliper IVIS Lumina II com software Vivendo Imagem 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Configurações de
85/109 formação de imagem: - nível de lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (indocianina verde); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
Biodistribuição de Tecidos [214] Em seguida da formação de imagem de corpo inteiro, os animais foram dissecados e tecidos selecionados (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele, tumor) foram analisados relativamente à atividade de fluorescência usando formador de imagem IVIS como antes. Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG; iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
B. Resultados
Imagem de corpo inteiro [215] Conforme visto na Figura 14, OTL-0038 acumulado predominantemente nos tumores positivos para o receptor de folato, sem atividade substancial de fluorescência nos outros tecidos.
Biodistribuição de Tecidos [216] A análise de Biodistribuição de tecidos foi realizada sobre os mesmos animais que foram submetidos a formação de imagem de corpo inteiro por eutanásia de cada rato, removendo os seus órgãos e formação de imagem IVIS usando Imager. Como pode ser visto na Figura 15, a maior intensidade de fluorescência foi observado em tumores FRpositivo, sem nenhuma acumulação nos outros tecidos exceto os rins. A absorção de OTL-0038 nos rins era esperada, uma vez que a membrana apical do túbulo proximal do rim tem sido conhecida para expressar níveis elevados de receptor de folato. Além disso, é possível que as sondas
86/109 sejam excretadas através dos rins, devido aos seus pesos moleculares baixos e meia-vida (a maioria dos conjugados de folato tem <meia-vida de 30 min).
C. Conclusão [217] OTL-0038 acumulou principalmente no xenoenxertos de tumor positivo receptor de folato e rins. Todos os outros tecidos normais apresentaram níveis mínimos ou nenhuma captação, resultando em excelentes índices de fluorescência no tecido tumoral-a-normal.
[218] EXEMPLO 8: Análise Comparativa de OTL-0038 (isômero L) com agentes derivados de folato próximos a IR [219] A imagem de corpo inteiro e tecido biodistribuição de OTL-0038 foi comparada com folato-LS288, folato-IR800 e folato-ZW800. Estes compostos foram conjugados com folato e corantes próximos de infravermelho, disponíveis comercialmente, LS288, IR800 e ZW800.
Material e Métodos
Cultura de células e Preparação dos Ratos [220] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 livre de folato contendo (Gibco, NY), 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida com ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[221] Ratos atimicos nus fêmeas (5 semanas de idade, em 18 - 20 g) foram adquiridos da Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) e mantidos sob irradiação com radiação gama e dieta especial deficiente de folato (Teklad, Wl) durante pelo menos 2 semanas antes do início do estudo. Os
87/109 animais foram alojados 5 / gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógenos. Água da torneira autoclavada e comida foram dadas conforme necessário. Os animais foram alojados em um ambiente estéril em um ciclo de luz-escuro de 12 hora padrão para a duração do estudo. Os ratos foram identificados individualmente por punção da orelha. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Purdue Animal Care e Comitê de Uso. Cuidados com animais e estudos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o tratamento humano dos animais.
Formação de Imagem de corpo inteiro [222] Ratos nu / nu femininos de sete semanas de idade foram inoculados subcutaneamente com células KB (10,0 χ 106 / rato em meio RPMI1640 livre de folato) no ombro. O crescimento dos tumores foi medido em direções perpendiculares a cada 2 dias utilizando um compasso de calibre (pesos corporais foram monitorizados no mesmo horário) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L = maior eixo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores atingiram entre 400 e 500 mm3 de volume, os animais (2 ratos / grupo) foram injetados por via intravenosa com 10 nmol de produto de teste (OTL-0038, folato-LS288, folato-IR800, folato-ZW800) em tampão de fosfato salino (100 pL). Após 2,5 h, os animais foram sacrificados por asfixia com CO2. Experimentos de formação de imagem de corpo inteiro (tumor intato) foram então realizadas usando um Caliper I VIS Lumina II Imaging Station com software Living Imagem 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (indocianina verde); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
Biodistribuição de Tecidos [223] A seguir da formação de imagem de corpo inteiro, os animais
88/109 foram dissecados e tecidos selecionados (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele, tumor) foram analisadas relativamente à atividade de fluorescência usando formador de imagem IVIS como antes. Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG; iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
B. Resultados
Formação de imagem de corpo inteiro [224] Conforme visto na Figura 14, OTL-0038 (isômero L), ácido fólico-LS288, folato-IR800, folato-ZW800 acumulado predominantemente nos tumores positivos para o receptor de folato, sem atividade substancial de fluorescência nos outros tecidos. Além disso, a comparação direta demonstrou que a intensidade de fluorescência do tumor OTL-0038 de ratos injetados era mais brilhantes (superior) do que os ratos tratados com o próximo corantes IR conjugados folato-outro (Fig. 15).
Biodistribuição de Tecidos [225] Análise de biodistribuição de tecidos foi realizada nos mesmos animais que foram submetidos a exames de corpo inteiro por eutanásia de cada rato, remoção dos seus órgãos e formação de imagem usando um gerador de imagens IVIS. Como pode ser visto na Figura 16, a maior intensidade de fluorescência foi observada em tumores FR-positivos e os rins. A absorção renal foi antecipada, uma vez a membrana apical do túbulo proximal do rim tem sido conhecida por expressar níveis elevados de receptor de folato. Além disso, é possível que as sondas sejam excretadas através dos rins, devido aos seus pesos moleculares baixos e meia-vida (a maioria dos conjugados de folato tem <meia-vida de 30 min).
89/109
C. Conclusão [226] OTL-0038 tem aspectos benéficos em relação ao folato-LS288, folato-IR800 e folato-ZW800 no tumor acumulada intensidade de fluorescência. OTL-0038 pode ser mais brilhante do que outros corantes próximos a IR disponíveis no mercado, tais como LS288, IR800 e ZW800.
[227] EXEMPLO 9: Dose Estudos crescente de OTL-0038 em ratos portadores de xenoenxertos de tumor positivo receptor de folato [228] Faixas de dosagem experimentais foram realizadas para determinar a menor dose de OTL-0038 que pode ser administrada para se obter melhor razão tumor-para-fundamento. Além disso, as experiências foram realizadas para determinar a dose mais elevada de OTL-0038 que pode ser administrada para se obter melhor da proporção tumor (alvo) -para- -tecido não alvo.
A. Material e Métodos [229] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 livre de folato contendo (Gibco, NY), 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida com ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[230] Ratos nus (nu / nu) fêmeas atímicos (5 semanas de idade, em 18 - 20 g) foram adquiridos da Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) e mantidos sob irradiação com radiação gama com dieta especial deficiente de folato (Teklad, Wl) durante pelo menos 2 semanas antes do início do estudo. Os animais foram alojados 5 / gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógenos. Água da torneira autoclavada e comida foram dados conforme necessário. Os animais foram alojados em um ambiente estéril em um ciclo de luz-escuro de 12 hora padrão para a
90/109 duração do estudo. Os ratos foram identificados individualmente por punção da orelha. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Purdue Animal Care e Uso do Comitê. Cuidados com animais e estudos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o tratamento humano dos animais.
[231] Ratos do sexo femininos nu/ nu de sete semanas de idade foram inoculados subcutaneamente com células KB (10,0 x 106 / rato em meio RPMI1640 livre de folato) no ombro. O crescimento dos tumores foi medido em direções perpendiculares a cada 2 dias utilizando um compasso de calibre (pesos corporais foram monitorados no mesmo horário) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L = maior eixo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores atingiram entre 400 e 500 mm3 de volume, animais (5 ratos / grupo) foram injetados intravenosamente com 10 nmol de OTL-0038 ou OTL-0039 em tampão de fosfato salino (100 pL). Depois de 2,5 horas, os animais foram sacrificados por asfixia com CO2. Experimentos de formação de imagem de corpo inteiro (tumor intacto) foram então realizados usando uma estação de imagens Caliper IVIS Lumina II com software Vivendo Imagem 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Configurações de formação de imagem: - nível de lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (indocianina verde); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
[232] Imagens de corpo inteiro (tumor intacto) foram tomadas 2,5 horas após a injeção de 1 nmol de OTL-0038 usando um Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Imagem 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (indocianina verde); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
B. Resultados [233] Conforme demonstrado na Tabela 1 e na Figura 14, todas as
91/109 doses tinham absorção tumoral mais elevada nos tumores positivos para o receptor de folato, exceto dose de 0,3 nmol. Por outro lado, a alta absorção renal também foi observada para faixa de doses 0,3 - 10 nmol e menos absorção renal (em relação à absorção do tumor) foi observada para a faixa de dose de 30 nmol -90. Além disso, a absorção nãoespecífica mais elevada foi observada nas doses 60 e 90 nmol.
C. Conclusão [234] Observada absorção menor em tumores positivos de receptor de folato (fraca intensidade de fluorescência) a dose 0,3 nmol pode ser devido à saturação dos receptores de folato incompleta sobre as células tumorais. Por outro lado, observou-se maior intensidade de fluorescência nos rins que pode ser devido à liberação da sonda através dos rins. Além disso, a membrana apical do túbulo proximal do rim tem sido conhecida por expressar níveis elevados de receptor de folato. Intervalo de doses entre 1,0 - 30,0 nmol mostrou absorção do tumor e tecido excelente de razão tumor-para-normal (relação sinal-para-fundo). Maior captação de rim pode ser devido à liberação da sonda através dos rins (com exceção da dose de 30 nmol) e expressão do receptor de folato nos rins. Nível de dose de 60,0 nmol e além mostra a absorção não específica mais elevada. No entanto, estes ainda têm elevada absorção de tumor e menor absorção renal (incluindo 30 doses nmol). Menos absorção renal pode ser devido à folga alternativa da sonda através do fígado e intestino. Portanto, OTL0038 pode formar agregados a esta concentração mais elevada. Podemos concluir que 1,0 nmol é a menor dose a administrar para se obter uma boa proporção de tumor-a-fundamento, mantendo o aspecto nãoinvasivo para a formação de imagem de tumores (Figura 22) e 30 nmol como a dose mais elevada para administrar a obter melhor tumoral proporção -para-fundamento.
[235] Exemplo 10: Formação de Imagem de corpo inteiro e Biodistribuição de OTL-0038 em ratos portadores de xenoenxertos
92/109 de tumor negativo receptor de folato [236] Formação de imagem de corpo inteiro e Biodistribuição de Tecidos foram realizados para determinar a especificidade in vivo de OTL0038 para os receptores de folato. As experiências utilizaram ratos com um tumor que é negativo para receptores de folato para caracterizar a especificidade do composto OTL-038 para os receptores de folato.
Material e Métodos
Cultura Celular e rato Preparação [237] As células A549 (uma linha alveolar de células de carcinoma epitelial basal) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640contendo (Gibco, NY), 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida com ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados nos ensaios.
[238] Ratos atímicos fêmeas nus (nu / nu) (6 semanas de idade, em 18 - 20 g) foram adquiridos da Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) e mantidos sob uma dieta normal (Teklad, Wl). Os animais foram alojados 5 / gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógenos. Água da torneira autoclavada e comida foram dadas conforme necessário. Os animais foram alojados em um ambiente estéril em um ciclo de luzescuro de 12 horas padrão para a duração do estudo. Os ratos foram identificados individualmente por punção da orelha. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Purdue Animal Care e do Comitê de Uso. Cuidados com animais e estudos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o tratamento humano dos animais.
Formação de Imagem de corpo inteiro
93/109 [239] Ratos nu/nu femininos de sete semanas de idade foram inoculados subcutaneamente com células A549 (1,0 x 106/rato no meio RPMI1640) no ombro. Crescimento de tumores foi medido em direções perpendiculares cada 2 dias usando um compasso de calibre (pesos corporais foram monitorados no mesmo cronograma) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L= eixo mais longo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores alcançaram entre 400 e 500 mm3 de volume, animais (6 ratos/grupo) foram injetados intravenosamente com 10 nmol de artigo de teste em tampão de fosfato salino (lOOpL). Após 2 horas, animais foram eutanatizdos por asfixia por CO2. Experimentos de formação de imagem de corpo inteiro (tumor intacto) foram então realizados usando um Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Conjuntos para formação de imagem - nível de lâmpada: médio; excitação: 745 nm, emissão: ICG (830 nm) iluminação epi; binning: 4 (M), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = ls.
Biodistribuição de Tecidos [240] Seguido da formação de imagem de corpo inteiro, os animais foram dissecados e tecidos selecionados (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele, tumor) foram analisados relativamente à atividade de fluorescência usando formador de imagem IVIS como antes. Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG; iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
B. Resultados
Formação de Imagem de corpo inteiro [241] Conforme visto na Figura 14, OTL-0038 não acumulou nos
94/109 tumores negativos receptores de folato e não havia nenhuma atividade de fluorescência substancial nos outros tecidos, exceto rins.
Tumor invasivo e captação renal [242] Análise de acumulação tumoral e rim foi realizada sobre os mesmos animais que foram submetidos a formação de imagem de corpo inteiro por eutanásia de cada rato, removendo os seus órgãos e formação de imagem IVIS usando formador de imagem. Como antecipamos, nenhuma fluorescência foi observada em tumores negativos receptores de folato e houve alta absorção renal. Desde que a membrana apical do túbulo proximal do rim foi conhecida por expressar níveis elevados de FR, absorção renal é esperada. Além disso, é possível que as sondas são excretadas através dos rins, devido aos seus pesos moleculares baixos e meia-vida (a maioria dos conjugados de folato tem <meia-vida de 30 min).
C. Conclusão [243] OTL-0038 é altamente específico para o receptor de folato.
[244] Exemplo 11: Avaliação da toxicidade OTL-0038 e OTL-0039 (Isômero D do OTL-0038) em Ratos nus saudáveis [245] A toxicidade in vivo de OTL-0038 e OTL-0039 foi caracterizada em ratos saudáveis. Os ratos foram administrados com 1 nmol ou lOOOx da dose clínica de cada composto para examinar a toxicidade dos compostos.
A. Material e Métodos [246] Ratos atímicos fêmeas nus (nu / nu) (6 semanas de idade, em 18 - 20 g) foram adquiridos da Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) e mantidos sob uma dieta normal (Teklad, Wl). Os animais foram alojados 5 / gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógenos. Água da torneira autoclavada e comida foram dadas conforme necessário. Os animais foram alojados em um ambiente estéril m um ciclo de luz-escuro
95/109 de 12 horas padrão para a duração do estudo. Os ratos foram identificados individualmente por punção da orelha. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Purdue Animal Care e Comitê de Uso. Cuidados com animais e estudos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o tratamento humano dos animais.
[247] Ratos saudáveis fêmea nus de sete semanas de idade (5 ratos / grupo) foram administrados com 1 pmol preparado de OTL-0038 ou OTL-0039 fresco dissolvido em 100 pL de tampão fosfato salino através de injeção na veia da cauda no dia zero. Os pesos corporais e as observações clínicas foram monitorados antes da dosagem e depois diariamente a partir do dia zero até 7. Qualquer animal com uma perda de peso corporal de 20% ou mais em dois dias consecutivos seriam sacrificados, mas esta medida não foi necessária. Os animais foram sacrificados por asfixia com CO2 no dia 7 e injeção de tecidos (cérebro, coração, pulmão, fígado, baço, rim, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele) foram recolhidas em frascos contendo 4% de formalina. Tecidos fixados em formalina foram seccionados em seções de 10 pm espessas e montadas em lâminas de Superfrost Plus ™ (Fisher Scientific, Pittsburgh PA). Após a coloração das lâminas com H 8s E, análise imuno-histoquímica (IHQ) dos tecidos foi realizada para determinar a toxicidade do OTL-0038 e OTL-0039.
B. Resultados [248] Imediatamente após a injeção de OTL-0038 ou OTL-0039, a pele dos animais tornou-se verde. No entanto, a cor verde desapareceu dentro de 24 horas. Os animais foram ativos após administração dos artigos de teste e comportou-se normalmente ao longo do estudo. Como pode ser visto na Figura 14, o peso do corpo no decorrer do estudo permaneceu estável. De acordo com os dados de IHC (Fig. 15), não se verificaram lesões identificadas em todos os tecidos.
96/109
C. Conclusão [249] 1 μπιοί (dose ΙΟΟΟχ clínica) de OTL-0038 ou OTL-0039 não é tóxico para os animais, sugerindo que OTL-0038 (1 nmol) e OTL-0039 (1 nmol) não são tóxicos para humanos na clínica.
[250] EXEMPLO 12:
[251] Os estudos in vitro farmacológicos de análogos de Ptetirosina - S0456 (Análogos de OTL-0038 Modificados) Os artigos de teste:
OTL-0040 (Pte-Tyr-13 C-S0456), OTL-0042 (Pte-Tyr-2H (Deuterados) S0456), OTL-0043 [Pte-Tyr- (OBn) -S0456], OTL-0044 [Pte- N (Me) -TyrS0456], OTL-0045 [Pte-NHNH-Tyr- (OAc) -S0456], OTL-0046 (Pte-homoTyr-S0456), OTL-0047 (Pte- -homo-Tyr -S0456), OTL-0049 (PteTyramine-S0456) [252] Material e Métodos: As células KB (uma linha de células da nasofaringe humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando-1640 isento de ácido fólico RPMI contendo (Gibco, NY), 10% de soro fetal bovino inativado por calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em dióxido de carbono a 5%: 95% atmosfera úmida de ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[253] As células KB que sobreexpressam FR-A foram semeadas em placas de 24 poços (100.000 células / poço) placas Falcon (BD Biosciences, CA) e deixou-se formar monocamadas durante um período de 12 h. Meio gasto em cada poço foi combinado com 10 nM de [3H] ácido fólico (ácido fólico tritiado) na presença de concentrações crescentes de (0,1 nM - 1 μΜ) do artigo de teste ou do ácido fólico (Sigma-Aldrich, MO) em meio fresco (0,5 mL). Após incubação durante 1 h a 37 ° C, as células foram lavadas com PBS (3 x 0,5 mL, Gibco, NY) para remover quaisquer materiais não ligados radioativos. Após a adição de hidróxido de sódio
97/109
0,25 Μ (0,5 ml) e incubou-se durante 12 h a 4 ° C, as células foram transferidas para frascos de cintilação individuais contendo Coquetel Ecolite de cintilação (3,0 ml, MP Biomedicals, OH) e contadas em um analisador de cintilação líquida (Packard) . As afinidades de ligação relativas foram calculadas usando um gráfico da % de células radioatividade ligada versus o log da concentração do artigo de teste utilizando GraphPad Prism 4.
[254] Resultados:
[255] As constantes de dissociação (KD) derivadas dos estudos foram calculadas como sendo de 27,6 nM, 61 nM 0,7, 14,8 nM, 13,8 nM, 12,8 nM, 30,2 nM e 8 para os compostos OTL-0040, OTL-0042 - OTL- 0047, OTL-0049 e ácido fólico, respectivamente. Afinidades de ligação relativas foram calculados para ser 0,290, 0,130, 0,177, 0,580, 0,625, 0,265 e 1 para OTL-0040, OTL-0042 - OTL-0047, OTL-0049 e ácido fólico, respectivamente. Todos os artigos de teste competiram quantitativamente com [3 H] ácido fólico.
[256] Conclusão:
[257] Todos os compostos têm uma afinidade para o receptor de folato exceto OTL-0044 e OTL-0045 e comparam moderadamente bem com a afinidade de ligação de ácido fólico. Todos os compostos competiram bem com [3H] ácido fólico indicando que o receptor de folato constitui o único local de ligação sobre as células cancerosas e são altamente específicos para o receptor de folato.
[258] EXEMPLO 13:
[259] Formação de Imagem Corporal Total e Biodistribuição de Pte - Análogos de tirosina - S0456 [260] Artigos de teste: OTL-0043 [Pte-Tyr- (OBn) -S0456], OTL-0044 [Pte-N (Me) -Tyr-S0456], OTL-0045 [Pte-NHNH-Tyr- (OAc) -S0456], OTL0046 (Pte-homo-Tyr-S0456), OTL-0047 (Pte-3-homo-Tyr-S0456), OTL0049 (Pte-Tyramine-S0456) [261] Material e Métodos:
[262] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana)
98/109 foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 isento de ácido fólico contendo (Gibco, NY) a 10% soro fetal bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera de ar umidificado a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[263] Ratos atímicos fêmea nu (5 semanas de idade, em 18 - 20 g) foram adquiridos de Harlan (IN) e mantidos sob dieta especial deficiente de folato irradiada gama (Teklad, Wl) durante pelo menos 2 semanas antes do início do estudo. Os animais foram alojados 5 / gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógenos. Água da torneira autoclavada e comida foram dadas conforme necessário. Os animais foram alojados num ambiente estéril em um 12 h ciclo claro-escuro normal para o período de duração do estudo. Os ratos foram identificados individualmente por punção da orelha. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Purdue Animal Care e Comitê de Uso. Cuidados com animais e estudos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o tratamento humano dos animais.
[264] Formação de Imagem de corpo inteiro:
[265] Ratos femininos de sete semanas de idade nu / nu foram inoculados subcutaneamente com células KB (1 0,0 χ 106 / rato em meio RPMI 1640 livre de ácido fólico) no ombro. O crescimento dos tumores foi medido em direções perpendiculares a cada 2 dias utilizando um compasso de calibre (pesos corporais foram monitorados no mesmo horário) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L = maior eixo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores atingiram entre 400 e 500 mm3 de volume, os animais (2-3 ratos / grupo) foram injetados por via intravenosa com 10 nmol de artigo de teste em tampão de fosfato salino (100 pL). Após 2 horas, os animais foram sacrificados por asfixia com CO2. Experiências de Formação de
99/109
Imagem (tumor intacto) de corpo inteiro foram então realizadas usando um Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (830nm); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
[266] Biodistribuição de tecidos:
[267] Seguindo a formação de imagem de todo o corpo, os animais foram dissecados e tecidos selecionados (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele e tumor) foram analisados relativamente à atividade de fluorescência usando Formador de Imagem IVIS como antes. Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (830nm); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
[268] Resultados:
[269] Formação de imagem de corpo:
[270] Como pode ser visto na Figura 28A, OTL-0044, OTL-0046 e OTL-0047 acumulado predominantemente nos tumores positivos de receptores de folato, sem atividade substancial de fluorescência nos outros tecidos.
[271] Biodistribuição de tecidos:
[272] Análise de biodistribuição tecido foi realizada em animais nas mesmas condições por eutanásia de cada rato, remoção dos seus órgãos e formação de imagem usando um gerador de imagens IVIS. Como pode ser visto na Figura 28B, a intensidade de fluorescência mais elevada foi observada em tumores FR-positivos e os rins. A absorção renal foi antecipada, uma vez a membrana apical do túbulo proximal do rim tem sido conhecida por expressar níveis elevados de receptor de folato. Além disso, é possível que as sondas são excretadas através dos rins, devido aos seus pesos moleculares baixos e meia-vida (a maioria dos conjugados de folato tem <meia-vida de 30 min).
[273] Conclusão:
100/109 [274] Enquanto biodistribuição in vivo demonstra todos os compostos acumulados nos tumores e nos rins, a distribuição de todo o organismo demonstrou que OTL-0044, OTL-0046 e OTL-0047 acumularam principalmente nos tumores, indicando um requisito de ácido carboxílico alfa para a especificidade e afinidade.
[275] EXEMPLO 14: Estudos in vitro de Farmacologia de OTL0050 (Pteroyl-Tyr-S0122), OTL-0051 (Pteroyl-Tyr-IRD28) e OTL0052 (Pteroyl-Tyr-Kodak) [276] Material e Métodos:
[277] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 livre de folato contendo (Gibco, NY), 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida com ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[278] As células KB que sobreexpressam FR-A foram semeadas em placas de 24 poços (100.000 células / poço) placas Falcon (BD Biosciences, CA) e deixou-se formar monocamadas durante um período de 12 h. Passado meio em cada poço foi combinado com 10 nM de [3H] ácido fólico (ácido fólico tritiado) na presença de concentrações crescentes de (0,1 nM - 1 μΜ) do artigo de teste ou do ácido fólico (SigmaAldrich, MO) em meio fresco (0,5 mL). Após incubação durante 1 h a 37 ° C, as células foram lavadas com PBS (3 x 0,5 mL, Gibco, NY) para remover quaisquer materiais não ligados radioativos. Após a adição de hidróxido de sódio 0,25 M (0,5 ml) e incubação durante 12 h a 4 ° C, as células foram transferidas para frascos de cintilação individuais contendo Coquetel Ecolite de cintilação (3,0 ml, MP Biomedicals, OH) e contadas num analisador de cintilação líquida (Packard) . As afinidades de ligação relativas foram calculadas usando um gráfico da % de células radioatividade ligada versus o log da concentração do artigo de teste
101/109 utilizando GraphPad Prism 4.
[279] Resultados:
[280] As constantes de dissociação (KD) derivadas a partir dos estudos foi calculada como sendo de 29,3 nM, 13,8 nM, 15,3 nM e 7,4 nM para os compostos OTL-050 - OTL-0052 e de ácido fólico, respectivamente. Afinidades de ligação relativas foram calculadas para ser de 0,25, 0,54, 0,48 e 1 para OTL-0050- OTL-0052 e de ácido fólico, respectivamente. Todos os artigos de teste competiram quantitativamente com [3H] ácido fólico.
[281] Conclusão:
[282] OTL-0050, OTL-0051 e OTL-0052 cada um tem uma afinidade para o receptor de folato e os compostos comparam razoavelmente bem com a afinidade de ligação de ácido fólico. Todos os compostos competiram bem com [3H] ácido fólico indicando que o receptor de folato constitui o único local de ligação sobre as células cancerosas e são altamente específicos para o receptor de folato.
[283] Exemplo 15: Estudos in vitro de Farmacologia de Conjugados de Corante de Pteroila-não aminoácido-NR [284] Material e Métodos:
[285] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 livre de folato contendo (Gibco, NY), 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida com ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[286] As células KB que sobreexpressam FR-A foram semeadas em placas de 24 poços (100.000 células / poço) placas Falcon (BD Biosciences, CA) e deixa-se formar monocamadas durante um período de 12 h. Passado meio em cada poço foi combinado com 10 nM de [3H] ácido fólico (ácido fólico tritiado) na presença de concentrações crescentes de
102/109 (0,1 nM - 1 μΜ) do artigo de teste ou do ácido fólico (Sigma-Aldrich, MO) em meio fresco (0,5 mL). Após incubação durante 1 h a 37 ° C, as células foram lavadas com PBS (3 x 0,5 mL, Gibco, NY) para remover quaisquer materiais não ligados radioativos. Após a adição de hidróxido de sódio 0,25 M (0,5 ml) e incubou-se durante 12 h a 4 ° C, as células foram transferidas para frascos de cintilação individuais contendo Coquetel Ecolite de cintilação (3,0 ml, MP Biomedicals, OH) e contadas num analisador de cintilação líquida (Packard) . As afinidades de ligação relativas foram calculadas usando um gráfico da % de células radioatividade ligada versus o log da concentração do artigo de teste utilizando GraphPad Prism 4.
[287] Resultados:
[288] As constantes de dissociação (KD) derivadas dos estudos foi calculada como sendo de 95,2 nM, 121 nM 0,3, 90,2 nM, 250,5 nM, 225,8 nM, 0,7 nM para a 41 compostos OTL-0056 (Pteroyl-DAP- S0456), OTL0057 (Pteroyl-BAMB-S0456), OTL-0058 (Pteroyl-AMHMB-S0456), OTL0059 (Pteroyl-DHDADS-S0456)! OTL-0060 (Pteroyl -DADS-30456), OTL0061 (Pteroyl- 4APEP-SG456) e ácido fólico, respectivamente. Afinidades de ligação relativas foram calculadas para ser de 0,078, 0,061, 0,082, 0,029, 0,033, 0,171 e 1 para OTL- 0056 - OTL-0061 e de ácido fólico, respectivamente. Todos os artigos de teste competiram quantitativamente com [3 H] ácido fólico.
[289] Conclusão:
[290] Os compostos OTL-0056 - OTL-0061 cada um tem uma afinidade para o receptor de folato e comparam moderadamente bem com a afinidade de ligação de ácido fólico. Todos os compostos competiram bem com [3H] ácido fólico indicando que o receptor de folato constitui o único local de ligação sobre as células cancerosas e são altamente específicos para o receptor de folato.
[291] EXEMPLO 16:
[292] Estudos farmacológicos in vitro de Conjugados de corante Pteroila- não aminoácido-NIR
103/109 [293] Material e Métodos:
[294] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 isento de ácido fólico contendo (Gibco, NY) a 10% soro fetal bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera de ar umidificado a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[295] As células KB que sobreexpressam FR-A foram semeadas em placas de 24 poços (100.000 células / poço) placas Falcon (BD Biosciences, CA) e deixa-se formar monocamadas durante um período de 12 h. Passado meio em cada poço foi combinado com 10 nM de [3H] ácido fólico (ácido fólico tritiado) na presença de concentrações crescentes de (0,1 nM - 1 μΜ) do artigo de teste ou do ácido fólico (Sigma-Aldrich, MO) em meio fresco (0,5 mL). Após incubação durante 1 h a 37 ° C, as células foram lavadas com PBS (3 x 0,5 mL, Gibco, NY) para remover quaisquer materiais não ligados radioativos. Após a adição de hidróxido de sódio 0,25 M (0,5 ml) e incubou-se durante 12 h a 4 ° C, as células foram transferidas para frascos de cintilação individuais contendo Coquetel Ecolite de cintilação (3,0 ml, MP Biomedicals, OH) e contadas num analisador de cintilação líquida (Packard) . As afinidades de ligação relativas foram calculadas usando um gráfico da % de células radioatividade ligada versus o log da concentração do artigo de teste utilizando GraphPad Prism 4.
[296] Resultados:
[297] As constantes de dissociação (KD) derivadas dos estudos foram calculados e considerados 95,2 nM, 121 nM 0,3, 90,2 nM, 250,5 nm,
225,8 nM, 41 nM 0,7 e 7,4 nM para os compostos OTL-0056 - OTL -0061 e ácido fólico, respectivamente. Afinidades de ligação relativas foram calculados e encontrados para ser 0,078, 0,061, 0,082, 0,029, 0,033, 0,171 e 1 para OTL-0056 (Pte-DAP-S0456), OTL-0057 (Pte-BAMB
104/109
S0456), OTL-0058 (Pteroyl -AMHMB-S0456), OTL-0059 (PTE-DHDADSS0456), OTL-0060 (PTE-DADS-S0456), OTL-0061 (Pte-4APEP-S0456) e ácido fólico, respectivamente. Todos os artigos de teste competiram quantitativamente com [3 H] ácido -fólico.
[298] Conclusão: Todos os compostos têm uma fraca afinidade para o receptor de folato. Todos os compostos competiram com [3H] ácido fólico indicando que o receptor de folato constitui o único local de ligação sobre as células cancerosas e são altamente específicos para o receptor de folato.
[299] EXEMPLO 17:
[300] Formação de Imagem de corpo inteiro e Biodistribuição de Conjugados de corante de Pteroila-aminoácido-NIR [301] Teste Artigos: OTL-0038 (Pte-Tyr-S0456), OTL-0053 (PteroylLys-S0456) e OTL-0054 (Pteroyl-Cys-S0456) [302] Material e Métodos:
[303] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 isento de ácido fólico contendo (Gibco, NY) a 10% soro fetal bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera de ar umidificado a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[304] Ratos atímicos fêmea nu (5 semanas de idade, em 18 - 20 g) foram adquiridos de Harlan (IN) e mantidos sob dieta especial deficiente de folato irradiada gama (Teklad, Wl) durante pelo menos 2 semanas antes do início do estude. Os animais foram alojados 5 / gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógenos. Água da torneira autoclavada e comida foram dadas conforme necessário. Os animais foram alojados num ambiente estéril num 12 h ciclo claro-escuro normal para o período de duração do estudo. Os ratos foram identificados individualmente por punção da orelha. Todos os procedimentos com
105/109 animais foram aprovados pela Purdue Animal Care e Comitê de Uso. Cuidados com animais e estudos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o tratamento humano dos animais.
[305] Formação de Imagem de corpo inteiro:
[306] Ratos nus femininos de sete semanas de idade nu / nu foram inoculados subcutaneamente com células KB (1 0,0 x 106 / rato em meio RPMI1640 livre de ácido fólico) no ombro. O crescimento dos tumores foi medido em direções perpendiculares a cada 2 dias utilizando um compasso de calibre (pesos corporais foram monitorizados no mesmo horário) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L = maior eixo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores atingiram entre 400 e 500 mm3 de volume, os animais (2-3 ratos / grupo) foram injetados por via intravenosa com 10 nmol de artigo de teste em solução salina tamponada de fosfato (100 pL). Após 2 horas, os animais foram sacrificados por asfixia com CO2. Imagens de corpo inteiro (tumor intacto) foram em seguida usando uma estação de imagens Caliper IVIS Lumina II com software Living Imagem 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (830nm); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s. No caso de TEP-LysS0456, excitação: 745nm, 710 nm, 675 nm, 640 nm, 605 nm; emissão: ICG e resto dos parâmetros são os mesmos.
[307] Biodistribuição de tecidos:
[308] A seguir formação de imagem de todo o corpo, os animais foram dissecados e injeção (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele e tumor) foram analisadas relativamente à atividade de fluorescência usando Formador de Imagem IVIS como antes. Configurações de formação de imagem: nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (830nm); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
106/109 [309] Resultados:
[310] Formação de Imagem de corpo inteiro:
[311] Conforme visto na Figura 29, OTL-0038 (PTE-Tyr-S0456) e OTL-0054 (PTE-Cys-S0456) acumulado predominantemente nos tumores com receptores positivos de folato, sem atividade de fluorescência substancial nos outros tecidos. Além disso, a comparação direta demonstrou que a intensidade de fluorescência do tumor de ratos injetados OTL-0038 era mais brilhante do que os ratos tratados com os outros conjugados. Por outro lado, Pte-Lys-S0456 tinha fluorescência tumor brilhante quando excitado a 605 - 675 comprimentos de onda nm e emitida em ICG (830 nm) com apenas um brilho moderado quando excitado a 710 - 745 nm e emitida em ICG, como pode ser visto na Figura 30 (os mesmos parâmetros utilizados com os outros conjugados).
[312] Biodistribuição de Tecidos:
[313] Análise de biodistribuição tecido foi realizada em animais nas mesmas condições por eutanásia de cada rato, remoção dos seus órgãos e formação de imagem usando um gerador de imagens IVIS. Como pode ser visto na Figura 31, a maior intensidade de fluorescência foi observada em tumores FR-positivos e os rins. A absorção renal foi antecipada, uma vez a membrana apical do túbulo proximal do rim tem sido conhecida para expressar níveis elevados de receptor de folato. Além disso, é possível que as sondas são excretadas através dos rins, devido aos seus pesos moleculares baixos e meia-vida (a maioria dos conjugados de folato tem <meia-vida de 30 min).
[314] Conclusão:
[315] O brilho e especificidade dos conjugados listados do melhor ao pior são os seguintes na Ex = 745 nm e Em = ICG: Pte-Tyr-S0456, PteCys-S0456 e Pte-Lys-S0456. Pte-Lys-S0456 todos apresentaram um deslocamento de Stoke maior, indicando que pode excitar a 605 nm e emitem a ICG (830 nm) para observar uma fluorescência brilhante do tumor.
[316] EXEMPLO 18:
107/109 [317] Imagem de corpo inteiro e Biodistribuição de derivados PteTyr-Kodak [OTL-0051 (Pteroyl-Tyr-IRD28) e OTL-0052 (Pteroyl-TyrKodak)] [318] Teste de Artigos: OTL-0051 (Pteroyl-Tyr-IRD28) e OTL-0052 (Pteroyl-Tyr-Kodak) [319] Material e Métodos:
[320] As células KB (uma linha de células nasofaríngea humana) foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e cultivadas como uma monocamada utilizando meio RPMI 1640 isento de ácido fólico contendo (Gibco, NY) a 10% soro fetal bovino inativado pelo calor (Atlanta Biológica, GA) e 1% de penicilina estreptomicina (Gibco, NY) em 5% de dióxido de carbono: 95% de atmosfera úmida de ar a 37 ° C durante pelo menos seis passagens antes de serem utilizados para os ensaios.
[321] Ratos atimicos fêmea nu (5 semanas de idade, em 18 - 20 g) foram adquiridos de Harlan (IN) e mantidos sob dieta especial deficiente de folato irradiada gama (Teklad, Wl) durante pelo menos 2 semanas antes do início do estude. Os animais foram alojados 5 / gaiola em uma barreira, bastidor camuflado livre de patógenos. Água da torneira autoclavada e comida foram dadas conforme necessário. Os animais foram alojados num ambiente estéril num 12 h ciclo claro-escuro normal para o período de duração do estudo. Os ratos foram identificados individualmente por punção da orelha. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Purdue Animal Care e Comitê de Uso. Cuidados com animais e estudos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais para o tratamento humano dos animais.
[322] Formação de Imagem de corpo inteiro:
[323] Ratos femininos de sete semanas de idade nu / nu foram inoculados subcutaneamente com células KB (1,0 x 106 / rato em meio RPMI1640 livre de folato) no ombro. O crescimento dos tumores foi medido em direções perpendiculares a cada 2 dias utilizando um compasso de calibre (pesos
108/109 corporais foram monitorizados no mesmo horário) e os volumes dos tumores foram calculados como 0,5 x L x W2 (L = maior eixo e W = eixo perpendicular a L em milímetros). Uma vez que os tumores atingiram entre 400 e 500 mm3 de volume, os animais (2-3 ratos / grupo) foram injetados por via intravenosa com 10 nmol de artigo de teste em solução salina tamponada de fosfato (100 pL). Após 2 horas, os animais foram sacrificados por asfixia com CO2. Imagem (tumor intacto) experiências de corpo inteiro foram então realizadas usando um Caliper IVIS Lumina II Imaging Station com software Living Image 4.0 (PerkinElmer Inc, MA). Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (830nm); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s. No caso de TEP-LysS0456, excitação: 745nm, 710 nm, 675 nm, 640 nm, 605 nm; emissão: ICG (830nm) e resto dos parâmetros são os mesmos.
[324] Biodistribuição de tecidos:
[325] Seguindo formação de imagem de todo o corpo, os animais foram dissecados e tecidos retirados (coração, pulmão, fígado, baço, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo, pele e tumor) foram analisados relativamente à atividade de fluorescência usando Formador de Imagem IVIS quanto antes. Configurações de formação de imagem: - nível lâmpada: médio; Excitação: 745nm; emissão: ICG (830nm); iluminação epi; binning: 4 (H), FOV = 12,5; parada-f = 2; tempo de aquisição = 1 s.
[326] Resultados:
[327] Formação de Imagem de corpo inteiro:
[328] Conforme visto na Figura 32, OTL-0051 (Pteroyl-Tyr-IRD28) e OTL0052 (Pteroyl-Tyr-Kodak) acumulado moderadamente bem nos tumores com receptores positivos de folato, sem atividade de fluorescência substancial nos outros tecidos. Enquanto a Kodak tingir animado com 800 nm, sistema de imagem IVIS não tem filtro para excitar a 800 nM. Portanto, a baixa absorção de fluorescência observada nos tumores pode ser devido à utilização de um comprimento de onda de excitação pobre.
[329] Biodistribuição de tecidos:
[330] Análise de biodistribuição tecido foi realizada em animais nas
109/109 mesmas condições por eutanásia de cada rato, remoção dos seus órgãos e formação de imagem usando um gerador de imagens IVIS. Como pode ser visto na Figura 33, a maior intensidade de fluorescência foi observada em tumores FR-positiva. Observamos, também, a absorção nos pulmões. Apesar de ter antecipado absorção renal (uma vez que a membrana apical do túbulo proximal do rim tem sido conhecida para expressar níveis elevados de receptor de folato), a absorção renal foi baixa.
[331] Conclusão:
[332] Estudos de Biodistribuição de Tecidos demonstraram que OTL-0051 (Pteroyl-Tyr-IRD28) e OTL-0052 (Pteroyl-Tyr-Kodak) conjuga captação nos tumores positivos para receptor de folato.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:
    Figure BR112015022810A2_C0001
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou isótopos disto, em que:
    X é um aminoácido ou um derivado do mesmo, e
    Y é um corante que possui uma excitação de fluorescência e espectro de emissão na faixa próxima a infravermelho, em que Y é representado pela fórmula:
    Figure BR112015022810A2_C0002
    ho,s secern que X’ é independentemente selecionado do grupo consistindo em O, S, N e C, e R’ é independentemente selecionado do grupo consistindo em CH2 e CH2CH2 e o composto mantém ou intensifica
  2. 2/15 a fluorescência do corante, Y.
    2. Composto, de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o aminoácido é selecionado a partir de um grupo que consiste em tirosina, cistina ou um derivado de tirosina ou cistina.
  3. 3. Composto, de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o aminoácido é a tirosina, em que o anel aromático de tirosina compreende um isótopo de carbono e/ou um isótopo de hidrogênio.
  4. 4. Composto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto tem uma fórmula selecionada do grupo consistindo em:
    Figure BR112015022810A2_C0003
    3/15 ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
  5. 5. Composto, de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o composto tem uma absorção e emissão máxima entre 600 nm e 800 nm.
  6. 6. Composto, de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o composto é feito para fluorescer após distribuição nas células de tecido.
  7. 7. Composto, de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o composto é altamente seletivo para alvejar a célula de tumor.
  8. 8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na Reivindicação 1 e um portador farmaceuticamente aceitável, excipiente ou diluente.
  9. 9. Método Para Identificar Tipo de Célula Alvo em Amostra Biológica, caracterizado por compreender
    a) entrar em contato com a amostra biológica com um composto, de acordo com a Reivindicação 1 por um tempo e sob condições que permitem a ligação do composto a pelo menos uma célula do tipo de célula alvo; e
    b) detectar oticamente a presença ou a ausência do composto de na amostra biológica, em que a presença do composto na detecção da etapa b) indica que o tipo de célula alvo está presente na amostra biológica.
  10. 10. Método Para Realizar Cirurgia Guiada por Imagem em Paciente, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) administrar uma composição compreendendo o composto, de acordo com a Reivindicação 1 sob condições e por um tempo suficiente para que o composto se acumule num dado local cirúrgico;
    4/15
    b) iluminar o composto para visualizar o composto usando luz infravermelha; e
    c) realizar resseção cirúrgica das áreas que fluorescein devido à excitação pela luz infravermelha.
  11. 11. Método Para Realizar Cirurgia Guiada por Imagem em Paciente, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as etapas de iluminação e detecção são realizadas usando um endoscópio, catéter, sistema tomográfico, sistema de formação de imagem óptica manual, óculos de proteção cirúrgico ou microscópio intra-operatório.
  12. 12. Método Para Realizar Cirurgia Guiada por Imagem em Paciente, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo consistindo em câncer, doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, doenças imunológicas, doenças autoimunes, doenças respiratórias, doenças metabólicas, doenças hereditárias, doenças infecciosas, doença dos ossos, e doenças do meio ambiente.
  13. 13. Método Para Realizar Cirurgia Guiada por Imagem em Paciente, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o comprimento de luz infravermelha está dentro da faixa de cerca de 650 a 900 nanômetros.
  14. 14. Método Para Diagnosticar Doença em Paciente, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) administrar a um paciente em necessidade de diagnóstico, uma quantia de um composto, de acordo com a Reivindicação 1 por um tempo e sob condições que permitem a ligação do composto a pelo menos uma célula do tipo de célula alvo;
    b) medir o sinal do composto, de acordo com a Reivindicação 1 presente na amostra biológica;
    5/15
    c) comparar o sinal medido em b) com pelo menos um conjunto de dados de controle, em que pelo menos um conjunto de dados de controle é compreendido por sinais do composto, de acordo com a Reivindicação 1 em contato com uma amostra biológica que não é compreendida pelo tipo de célula alvo; e
    d) fornecer um diagnóstico de doença em que a comparação na etapa c) indica a presença da doença.
  15. 15. Composto, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto tem uma fórmula selecionada do grupo que consiste em:
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0809442A2 (pt) 2007-03-27 2014-09-09 Radiomedix Inc Composições para terapia e formação de imagens direcionada
DK2721045T3 (en) 2011-06-20 2017-07-24 Radiomedix Inc COMPOSITIONS, METHODS OF SYNTHESIS AND USE OF CARBOHYDRATE TARGETED AGENTS
US20170232119A1 (en) * 2013-03-15 2017-08-17 Purdue Research Foundation Synthesis and composition of amino acid linking groups conjugated to compounds used for the targeted imaging of tumors
JP6192799B2 (ja) * 2013-03-15 2017-09-06 パーデュー・リサーチ・ファウンデーションＰｕｒｄｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 腫瘍の標的画像化に使用される化合物にコンジュゲートしているアミノ酸連結基の合成および組成物
EP3071971B1 (en) * 2013-11-19 2019-04-24 Purdue Research Foundation Patient selection method for inflammation
US10280307B2 (en) 2014-11-05 2019-05-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Class of stable heptamethine cyanine fluorophores and biomedical applications thereof
EP3294296A4 (en) 2015-05-12 2018-12-26 Medibeacon Inc. Compositions and methods for assessing eye vasculature
FR3036622B1 (fr) * 2015-05-25 2017-05-19 Fluoptics Traceur fluorescent ciblant multivalent optimise.
FR3036621B1 (fr) 2015-05-25 2017-05-19 Fluoptics Traceur fluorescent ciblant multivalent dans le proche infrarouge pour imagerie optique.
US10842887B2 (en) 2015-09-09 2020-11-24 On Target Laboratories, LLC PSMA-targeted NIR dyes and their uses
US9808538B2 (en) * 2015-09-09 2017-11-07 On Target Laboratories, LLC PSMA-targeted NIR dyes and their uses
US11555821B2 (en) 2016-03-16 2023-01-17 On Target Laboratories, Inc. CA IX-NIR dyes and their uses
US10557854B2 (en) * 2016-03-16 2020-02-11 On Target Laboratories, LLC CA IX—NIR dyes and their uses
EP3493855A4 (en) 2016-08-02 2020-04-01 ISI Life Sciences, Inc. METHOD FOR DETECTION OF CANCER CELLS.
EP3496762A1 (en) 2016-08-11 2019-06-19 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Near-ir light-cleavable conjugates and conjugate precursors
US10786580B2 (en) * 2016-09-09 2020-09-29 On Target Laboratories, LLC Cholecystokinin 2 receptor targeted NIR imaging and use thereof
EP3510399B1 (en) * 2016-09-09 2023-03-01 On Target Laboratories, LLC Psma-targeted nir dyes and their uses
WO2018081254A1 (en) * 2016-10-26 2018-05-03 Cao Group, Inc. Cancer binding chromatic peptides that are targeted for disintegration by radiant energy
WO2018101473A1 (ja) * 2016-12-02 2018-06-07 国立大学法人東京大学 化合物、葉酸受容体可視化蛍光プローブ及びそれらの使用
EP3555627B1 (en) 2016-12-14 2023-11-22 Purdue Research Foundation Fibroblast activation protein (fap)-targeted imaging and therapy
US10753942B2 (en) 2017-05-15 2020-08-25 Indicator Systems International, Inc. Methods to detect remnant cancer cells
US10539567B2 (en) * 2017-05-15 2020-01-21 Indicator Systems International, Inc. Biopsy methods and devices
JP2021513988A (ja) * 2018-02-15 2021-06-03 チルドレンズ ナショナル メディカル センターＣｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ 胆道系及び腎臓系の蛍光マーカーとして使用するためのヘプタメチン系シアニン
CN108840815A (zh) * 2018-05-29 2018-11-20 苏州百源基因技术有限公司 一种荧光标记的氨基酸及其制备方法和用途
CN108727245B (zh) * 2018-07-02 2021-09-28 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种水杨酸类化合物及其制备方法和应用
KR102150415B1 (ko) 2018-12-07 2020-09-01 원광대학교 산학협력단 암 표적용 화합물 및 이의 용도
JP7160694B2 (ja) 2019-01-08 2022-10-25 日立Ｇｅニュークリア・エナジー株式会社 流体接触部材及び流体接触部材の製造方法
US11892403B2 (en) 2019-06-20 2024-02-06 Cilag Gmbh International Image synchronization without input clock and data transmission clock in a pulsed fluorescence imaging system
US11716533B2 (en) 2019-06-20 2023-08-01 Cilag Gmbh International Image synchronization without input clock and data transmission clock in a pulsed fluorescence imaging system
US11986160B2 (en) 2019-06-20 2024-05-21 Cllag GmbH International Image synchronization without input clock and data transmission clock in a pulsed hyperspectral imaging system
US11516387B2 (en) 2019-06-20 2022-11-29 Cilag Gmbh International Image synchronization without input clock and data transmission clock in a pulsed hyperspectral, fluorescence, and laser mapping imaging system
US20200397246A1 (en) 2019-06-20 2020-12-24 Ethicon Llc Minimizing image sensor input/output in a pulsed hyperspectral, fluorescence, and laser mapping imaging system
US20210353151A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 On Target Laboratories, LLC Targeted fluorescent markers in combination with a flexible probe
CN112010862B (zh) * 2020-10-23 2021-03-30 南京诺源医疗器械有限公司 一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子及其制备方法
CN114014843B (zh) * 2021-11-17 2022-09-20 北京大学第一医院 一种psma靶向核素/荧光双模态配体和分子探针与应用
US11986540B2 (en) * 2022-02-23 2024-05-21 On Target Laboratories, LLC Compositions including pafolacianine for the identification of malignant lesions
CN114751907A (zh) * 2022-03-17 2022-07-15 南京诺源医疗器械有限公司 一种主动靶向叶酸受体近红外荧光分子及其制备方法和用途
CN115504984B (zh) * 2022-09-09 2023-07-25 南京诺源医疗器械有限公司 一种靶向α型叶酸受体的培美近红外荧光分子及其制备方法和应用
CN115490672B (zh) * 2022-09-30 2023-11-17 南华大学 一种兼具光热和光动力效应的光敏剂及其制备方法和应用
CN116621823B (zh) * 2023-07-06 2023-10-31 南京诺源医疗器械有限公司 诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂、合成方法及应用

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4337339A (en) * 1979-04-30 1982-06-29 Baker Instruments Corp. Process for preparation of folic acid derivatives
US5716596A (en) 1992-06-23 1998-02-10 Diatide, Inc. Radioactively labeled somatostatin-derived peptides for imaging and therapeutic uses
US5871711A (en) 1992-06-23 1999-02-16 Diatide, Inc. Radioactively-labeled somatostatin-derived peptides for imaging and therapeutic uses
DE19717904A1 (de) * 1997-04-23 1998-10-29 Diagnostikforschung Inst Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
JP2000095758A (ja) 1998-09-18 2000-04-04 Schering Ag 近赤外蛍光造影剤および蛍光造影方法
US7547721B1 (en) * 1998-09-18 2009-06-16 Bayer Schering Pharma Ag Near infrared fluorescent contrast agent and fluorescence imaging
BR9917587A (pt) 1999-12-15 2002-08-06 Schering Ag Agente de contraste fluorescente próximo ao infravermelho e formação de imagem por fluorescência
CZ304942B6 (cs) 2000-03-31 2015-02-04 Purdue Research Foundation Léčivo pro zvyšování specifické eliminace populace tumorových buněk a farmaceutický prostředek obsahující konjugát fosfát-FITC nebo fosfát-dinitrofenyl
US7597878B2 (en) 2000-09-19 2009-10-06 Li-Cor, Inc. Optical fluorescent imaging
JP4989013B2 (ja) * 2000-09-19 2012-08-01 リ−コール インコーポレーティッド シアニン色素
EP1363920B1 (en) 2001-02-07 2006-08-23 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified psma ligands and uses related thereto
IL158532A0 (en) * 2001-05-02 2004-05-12 Purdue Research Foundation Treatment and diagnosis of macrophage mediated disease
WO2006101845A2 (en) * 2005-03-16 2006-09-28 Endocyte, Inc. Synthesis and purification of pteroic acid and conjugates thereof
EP1904183B1 (en) * 2005-07-05 2014-10-15 Purdue Research Foundation Pharmaceutical composition for the treatment of osteoarthritis
US7547712B2 (en) * 2006-02-27 2009-06-16 Nabi Biopharmaceuticals Methods for decreasing the toxic effects of nicotine on fetuses in pregnant women
WO2007139815A2 (en) * 2006-05-23 2007-12-06 Purdue Research Foundation Imaging and therapeutic method using progenitor cells
CA2668197A1 (en) 2006-11-03 2008-05-15 Philip S. Low Ex vivo flow cytometry method and device
US8168804B2 (en) * 2007-06-29 2012-05-01 Vanderbilt University Large stoke shift NIR dyes
EP2268317B1 (en) * 2008-03-14 2020-02-26 VisEn Medical, Inc. Integrin targeting agents and in vivo and in vitro imaging methods using the same
WO2010033733A1 (en) 2008-09-17 2010-03-25 Endocyte, Inc. Folate receptor binding conjugates of antifolates
US8916137B2 (en) * 2008-11-07 2014-12-23 The General Hospital Corporation Monofunctional carbocyanine dyes for in vivo and in vitro imaging
CN101440282B (zh) * 2008-12-18 2012-06-27 中国药科大学 近红外荧光分子探针及其合成方法和用途
CA2754492A1 (en) * 2009-03-05 2010-09-10 Purdue Research Foundation Method for early imaging of atherosclerosis
EP2419478B1 (en) * 2009-04-17 2018-02-28 Li-Cor, Inc. Fluorescent imaging with substituted cyanine dyes
US20130071321A1 (en) 2010-05-28 2013-03-21 Purdue Research Foundation Delivery of agents to inflamed tissues using folate-targeted liposomes
US9377466B2 (en) * 2010-09-06 2016-06-28 Modpro Ab Compounds and methods
WO2012054784A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Li-Cor, Inc. Fluorescent imaging with substituted cyanine dyes
US10080805B2 (en) * 2012-02-24 2018-09-25 Purdue Research Foundation Cholecystokinin B receptor targeting for imaging and therapy
WO2013130776A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Purdue Research Foundation Folate receptor alpha binding ligands
JP6192799B2 (ja) * 2013-03-15 2017-09-06 パーデュー・リサーチ・ファウンデーションＰｕｒｄｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 腫瘍の標的画像化に使用される化合物にコンジュゲートしているアミノ酸連結基の合成および組成物

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