CN110167601A - 抑制剂-功能化超微小纳米粒子和其方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述新颖偶联物，其含有抑制剂(例如PSMA抑制剂，例如胃泌素释放肽受体抑制剂)和金属螯合剂，所述偶联物共价连接到巨分子(例如纳米粒子、聚合物、蛋白质)。所述偶联物相对于游离、未结合抑制剂/螯合剂构筑体展现不同的性质。

Description

抑制剂-功能化超微小纳米粒子和其方法
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2016年11月30日提交的美国申请案第62/427,845号的权益，其揭示内容是全文以引用方式并入本文中。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的许可号CA092629和CA199081的政府支持下作出。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本申请含有序列表，其是以ASCII格式以电子方式提交，并且其全文以引用方式并入本文中。所述ASCII拷贝创建于2017年11月20日，命名为2003080-1491_SL.txt且大小为1,041字节。
技术领域
本发明大概来说涉及用于将抑制剂和金属螯合剂连接到巨分子(例如纳米粒子、聚合物、蛋白质)的偶联物的研发。更特定来说，在某些实施例中，本发明涉及将前列腺特异性膜抗原(PSMA)抑制剂或胃泌素释放肽受体(GRPr)抑制剂连接到超微小纳米粒子。
背景技术
前列腺癌(PC)是最常见男性癌症类型之一。PC通常生长缓慢且最初保持限于前列腺中，其中其不引起严重损害。2017年在美国，预期估计有26,730名男性死于PC，使得这种癌症成为男性癌症相关死亡的第二最常见病因。前列腺癌特定死亡率的主要决定因素是高格里森评分(Gleason score)(大于或等于8)、贮精囊侵袭和淋巴结(LN)转移。在LN转移存在下，因PC死亡的长期风险显著增加，估计在23％与42％之间。另外，在肿瘤切除时，未能获得阴性手术边缘意指切除不足，可能在所述位点留下活的癌细胞。在多种癌症中，阳性手术边缘与疾病的局部复发和全身性进展的较高风险相关。与肿瘤阶段和等级不同，阳性手术边缘是唯一主要受外科医生的表现影响的预后因子。手术中的挑战通常包括解剖学限制，例如肿瘤侵袭神经血管或骨骼结构，如在用于PC的根治性前列腺切除术或切除四肢肉瘤的情形中。其它技术性挑战包括在手术期间难以用肉眼区分癌组织与健康组织，尤其对于微小浸润。实时检测确切肿瘤边缘以及残留癌症病灶的能力将使外科医生可切除残留癌症，以降低阳性手术边缘的比率，并且因此降低治疗失败率。其还可确保，在某些重要结构中不存在癌症，并且因此减小不必要的功能性组织损伤。
虽然一些类型的前列腺癌生长缓慢且可需要极少治疗或无需治疗，但其它类型是侵袭性的。已评估多种前列腺组织特异性表面蛋白作为潜在结合靶以改良治疗剂的肿瘤摄取和滞留。最广泛表征的表面蛋白是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
纳米治疗剂递送媒剂通常是大小为至多约1,000nm直径的巨分子或超分子多组分系统，其固有地具有治疗性(例如无活性医药成分)或起治疗剂递送系统的功能。迄今为止，脂质体纳米粒子和生物制品占用于治疗多种癌症类型的FDA批准产品或临床试验产品的数目中的大部分，而多种基于聚合物的粒子调配物目前处于早期试验中。
纳米治疗剂递送系统所需的候选者共享以受控方式纳入并释放药物化合物(例如PSMA抑制剂)的共同特征，其可有利地改变药物的生物利用度和药物代谢动力学，同时使脱靶毒性降到最低。理想地，将成像标记纳入其中以评价其在疾病位点的精确定位和滞留。
然而，这些系统使用不同机制发挥功能。例如，抗体药物偶联物(ADC)主要通过主动靶向肿瘤细胞和条件性释放药物分子来实现较低药物毒性。在结合细胞表面抗原时，在细胞内化和胞内体摄取后，发生活性药物释放。另一方面，被动加载较多酬载(对于Doxil，约10,000个药物分子)的脂质体和基于聚合物的药物递送系统(通常是显著较大的组装复合物(约20-150nm直径))通常缺乏靶向能力(BIND-014例外)。因此，这些复合物主要依赖于熟知的增强渗透性和滞留(EPR)效应。
此外，虽然放射性免疫偶联物和放射性标记的粒子探针也可用于使转移成像，但这些手段受限于其较大尺寸(例如大于20nm)、延长的动力学和较高背景信号。除了不适于手术中成像以外，食品药品管理局(Food and Drug Administration)未批准超顺磁性氧化铁纳米粒子在临床上用作MRI淋巴管照相术对比剂，但其显示有前景的临床前和临床结果。主要适用于高转移风险患者的111In标记的抗PSMA单克隆抗体(mAb)ProstaScint显示缓慢的全身分布，导致延长的(大于3天)注射后(p.i.)成像间隔。虽然已通过使用结合外部PSMA表位的J591mAb改良基于mAb的成像，和使用89Zr进行PET成像，但缓慢的mAb靶识别和清除导致并非最优选的成像时间范围。放射性标记的类固醇(如18F-氟代二氢睪固酮(18F-FDHT))极为疏水，导致显著背景活性。
横断面成像和成像示踪剂用于围手术期检测LN转移的作用仍受限，目前无法获得可靠的成像模态。近期的综合分析报道，CT检测LN转移的灵敏度为42％，特异性为82％。现有PET示踪剂表现也欠佳。虽然18F-FDG最常用，但其特异性和灵敏度随PC阶段和侵袭性变化极大。11C-胆碱具有90％报道特异性和57％灵敏度，而18F-氟甲基胆碱的特异性为94％且灵敏度为约56％。其它限制包括在11C和18F的正电子衰变期间的高能γ发射，使得难以用手持式手术中探针来定位结节；以及短物理半衰期，需要在即将手术前进行示踪剂注射且在前列腺切除术期间导致显著辐射曝露。
已显示靶向PSMA和GRPr的抑制剂和拮抗剂基于肽的试剂有前景用于使临床前PC异种移植物模型成像。多种这些基于肽的PC靶向探针已经多种连接体和放射性金属螯合剂修饰用于PC成像和疗法，例如广泛研究的Lys-脲-Glu PSMA抑制剂(PSMAi)探针。不幸的是，多种PSMA靶向肽探针经受极高肾和唾液腺摄取，从而限制放射性治疗给药并降低功效。此外，一般观察到68Ga-或177Lu-GRPr拮抗剂RM2的异常高的胰脏摄取，否则其在临床前和临床研究中显示增强的肿瘤摄取。重要的是，虽然68Ga-RM2相对于PSMAi-68Ga-HBED展现不同清除和组织分布概况，表明异质性受体表达的双重肽成像的可行性，但GRP(7-14)和PSMAi的异二聚构筑体显示具有高肠摄取的靶向，从而限制临床实用性。
替代性纳米治疗剂递送系统包括超微小纳米粒子。发现预先经PET放射性标记和整联蛋白靶向肽环-(Arg-Gly-Asp-Tyr)(cRGDY)(SEQ ID NO:1)表面调整的FDA批准的超微小(例如直径至多20nm)荧光有机二氧化硅粒子(C点)是人类中的有效分子癌症成像剂。例如，除了显示大多数肾清除以外，显示在小型动物和大型动物和人类个体黑色素瘤模型中，C点优先在表达αvβ3整联蛋白的原发性和/或转移病灶中累积。关于C点的详情描述于以下文献中：美国专利第8298677B2号“基于二氧化硅的荧光纳米粒子(Fluorescent silica-based nanoparticles)”、美国公开案第2013/0039848A1号“基于二氧化硅的荧光纳米粒子”和美国公开案第US 2014/0248210 A1号“基于二氧化硅的多模态纳米粒子(Multimodalsilica-based nanoparticles)”，其内容是全文以引用方式并入本文中。此外，发现直径可控减小到亚10nm范围且另外经14聚体肽类似物α-黑色素细胞刺激性激素(α-MSH)表面修饰的超微小聚(乙二醇)涂布(聚乙二醇化)的近红外(NIR)二氧化硅荧光纳米粒子(称为C’点)靶向在恶性黑色素瘤细胞上表达的黑皮质素-1受体(MC1-R)。
文献中称为PSMAi-HBED-CC的前列腺特异性膜抗原(PSMA)抑制剂和金属螯合剂构筑体目前是临床上最先进的用于检测原发性前列腺肿瘤和转移病灶的分子。
业内仍需要用于治疗前列腺癌的改良递送系统。所述系统需要提供多标记物检测能力，以解决尤其在多个病理阶段之间靶向不同生物过程的癌症标记物的异质性，以确定最优选治疗管理选择。
发明内容
本文描述靶向前列腺癌(PC)的纳米粒子(例如靶向PC的点(C’点))以检测疾病并使得能更可靠地将疾病分期。此技术提供相对于那些需要全身性疗法的患者鉴别潜在地可通过手术切除治愈的患者的能力。评价和手术治疗转移，同时经由鉴别两种评价不同生物过程的预测性生物标记物解决疾病异质性与全身性治疗选择的选择有关。描述表面化学设计用于准确鉴别PC模型和人类个体表达的一或多种转移标记物。在手术环境中增加实时光学驱动的分子表型分型能力有助于使得能检测多种已知可控制不同生物过程的关键癌症靶(多重化)。所述读出提供基于精密度的方法进行手术分期和管理，其可补充手术前PET-CT和对肿瘤淋巴管引流和手术边缘的解剖学评价。
本文所述技术可靠地检测并治疗带有癌症的结节和残存疾病的位点。所述技术提供多个癌症靶的实时活体内分子表征，可改良灵敏度、特异性和检测准确度。此外，所述平台通过以下方式提供改良的转移疾病评价和PC手术治疗：(1)促进与受体靶的多价相互作用，其增强功效和靶:背景比率(对比度)；和(2)利用其优越的光物理性质以及装置技术将检测灵敏度提到最高。
与替代性技术相比，所述技术提供至少以下优点：(1)“全合一(all-in-one)”双重模态和临床可转译的抑制剂(例如PSMA抑制剂，例如GRPr抑制剂)靶向平台，用于围手术期管控PC；(2)利用光谱不同的靶向PC的C’点和基于荧光的多重化策略，用于实时评估多种分子癌症表型；(3)用于直接临床验证的靶向不同生物过程的可靠分期生物标记物的资格审定；(4)用于新转移PC子克隆和可更忠实地再现人类疾病的基于人类前列腺类器官的模型的抑制剂表达程度的表征；(5)用于肾可清除的靶向PC的C’点的新表面设计的有效优化，其克服放射敏感性器官(例如肾、唾液腺)中的高非特异性摄取，其中所述非特异性摄取具有有限放射性治疗给药和治疗功效；(6)使用粒子囊封的NIR染料以避免使用NIR染料偶联抑制剂时所见的生物活性附带损失，后者排除NIR驱动的光学应用；和(7)在C’点连接前连接体-肽化学的化学适应，以在增强放射性标记和肿瘤靶向效率的同时保存药效团活性。
例如，市售PSMAi-HBED-CC化合物不适合与纳米治疗剂递送系统偶联。所有所报道评估PSMA抑制剂-金属螯合剂构筑体的研究迄今关注使用游离化合物。临床前研究已显示，PSMA抑制剂在偶合到某些类型的金属螯合剂时较单独使用时更有效(例如增强结合和细胞摄取)。虽然PSMA抑制剂已单独用于巨分子上以供PSMA靶向，但尚未报道适合于偶联到巨分子实体上的PSMA抑制剂-金属螯合剂构筑体(例如PSMAi-HBED-CC类似物)的研发。本文描述共价连接到巨分子(例如纳米粒子、聚合物、蛋白质)的包含PSMA抑制剂和金属螯合剂的偶联物。所述偶联物可展现超过游离、未结合PSMA抑制剂/螯合剂构筑体的增强的结合和细胞摄取性质(由于多价)和药物代谢动力学(由于分子量或大小增加)。例如，与单独的PSMA抑制剂构筑体相比，显示于巨分子(例如纳米粒子)表面上的PSMA抑制剂具有降低的肾摄取。
在一方面中，本发明涉及组合物(例如偶联物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂(PSMAi)/螯合剂构筑体。
在某些实施例中，所述构筑体具有以下结构：
其中：L1是包含1到约10个天然或非天然氨基酸残基的肽片段，或任选地经取代的二价C1-20饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；L2是任选地经取代的二价C1-10饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；L3是共价键或衍生自能将(PSMAi)/螯合剂构筑体的反应性部分与巨分子的反应性部分偶联的双官能交联试剂的交联剂，各-Cy-独立地是具有0-4个独立选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-8元二价、饱和、部分不饱和或芳基环，或具有0-5个独立选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元二价饱和、部分不饱和或芳基二环；Y是螯合剂部分；且R是氢、C1-6烷基或氮保护基团；其中除非另有指示，否则各氨基酸残基可在其末端和/或侧链基团上经保护或未经保护。
在某些实施例中，L1是包含1、2、3、4或5个天然或非天然氨基酸残基的肽片段。在某些实施例中，L1包含一个或两个6-氨基己酸(Ahx)单元。在某些实施例中，L1是-Ahx-Ahx-。在某些实施例中，L1是C1-10饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-NR-、-O-或-C(O)-。在某些实施例中，L1包含一或多个-(CH2CH2O)-或-(OCH2CH2)-单元。
在某些实施例中，L2是C1-3饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-或-C(O)O-。在某些实施例中，L2是C1-3饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中烃链的1、2或3个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-NR-或-C(O)-。在某些实施例中，-Cy-是亚苯基。在某些实施例中，L2是-C(O)-或-C(O)NH-亚苯基。
在某些实施例中，螯合剂是DOTA。在某些实施例中，螯合剂是NOTA。
在某些实施例中，L3衍生自能将(PSMAi)/螯合剂构筑体上的硫氢基与巨分子的部分偶联的双官能交联试剂。
在某些实施例中，双官能交联试剂是马来酰亚胺或卤代乙酰基。在某些实施例中，双官能交联试剂是马来酰亚胺。
在某些实施例中，巨分子是纳米粒子(例如超微小纳米粒子，例如C点，例如C’点)。在某些实施例中，巨分子的直径不大于20nm(例如直径不大于15nm，例如直径不大于10nm)。
在某些实施例中，组合物包含：基于二氧化硅的荧光纳米粒子，其包含：基于二氧化硅的核心；在核心内的荧光化合物；包围核心的一部分的二氧化硅壳；连接到纳米粒子、由此包覆纳米粒子的有机聚合物，其中所述纳米粒子的直径不大于20nm。
在某些实施例中，1到100(例如1到60，例如1到50，例如1到30，例如1到20)个PSMAi配体连接到巨分子。在某些实施例中，巨分子包含放射性标记(例如89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I、177Lu、225Ac、212Pb、67Cu和211At)。
在某些实施例中，螯合剂包含选自由以下组成的群组的成员：N,N'-双(2-羟基-5-(羧基乙基)-苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸(HBED-CC)(HBED-CC)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、去铁胺(DFO)和三亚乙基四胺(TETA)。
在某些实施例中，组合物包含：
在某些实施例中，组合物包含：
在某些实施例中，所述方法包含将包含适宜保护基团的经正交保护的赖氨酸构建组元(building block)(例如Fmoc-Lys(Dde)-OH)加载于树脂(例如2-ClTrt树脂)上(例如在人工反应容器中)；从树脂移除适宜保护基团以产生第一化合物；(例如在移除步骤的同时)使经保护谷氨酸(例如经二-tBU保护)与适宜试剂(例如三光气和DIEA，例如持续6h，在0℃下)接触以产生谷氨酸异氰酸酯构建组元[OCN-Glu-(OtBu)2]；使异氰酸酯构建组元[OCN-Glu-(OtBu)2]与第一化合物的游离α氨基接触(例如过夜，例如在室温下)，以在树脂上产生第二化合物上的经完全保护的脲。
在某些实施例中，通过移除第二化合物的Lys上的保护基团(例如通过2％肼)使第二化合物进一步反应；通过在第二化合物的Lys的ε-胺基上构建肽序列(例如Ac-Cys-Ahx-Ahx-dLys-Ahx-)来获得第三化合物；如果适当，移除适宜保护基团(例如Trt用于Cys及Mtt用于Lys)(例如经由用20％哌啶处理例如10min)；任选地，经由用“原位”活化的经适当保护的胺基酸(例如其中“原位”活化的Fmoc-胺基酸是使用脲鎓盐和DIEA来实施)连续酰化(例如20min用于偶合)来组装(例如和在每一循环再偶合)肽链；移除dLys上的适宜保护基团(例如在同一反应中)；从树脂裂解第三化合物(例如经由TFA处理)以产生第四化合物；使第四化合物与适宜螯合剂试剂(例如p-SCN-Bn-NOTA)在适宜碱存在下接触(例如过夜，例如在DMF中)，以产生经螯合剂标记(例如NOTA标记，例如DOTA标记，例如HBED-CC标记)的第五化合物；从第五化合物移除保护基团(例如经由TFA，例如在清除剂(例如以2.5％w/v浓度)存在下(例如其中清除剂包含苯酚、水、TIS、TA和EDT中的一或多者))以产生第六化合物(例如靶分子，例如PSMAi-NOTA，例如PSMAi-DOTA，例如PSMAi-HBED-CC)；任选地纯化所述第六化合物；以及将第六化合物连接(例如共价地，例如马来酰亚胺化学)至巨分子(例如纳米粒子(例如C’或C点)，例如聚合物，例如蛋白质)；(例如使用三苯甲基型保护基团(例如Trt、Cl-Trt、Mtt、Mmt)或类似基团选择性保护双保护的HBED-CC)。
在某些实施例中，第三化合物是或包含：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护。
在某些实施例中，第三化合物是：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护。
在另一方面中，本发明涉及以下化合物：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护，并且其中一个氨基酸任选地连接到树脂。
在另一方面中，本发明涉及以下化合物：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护，并且其中一个氨基酸任选地连接到树脂。
在另一方面中，本发明涉及选自以下的化合物：
在另一方面中，本发明涉及选自以下的化合物：
在另一方面中，本发明涉及治疗疾病或病况的方法，所述方法包含：向个体投与包含如技术方案1到24中任一技术方案所述的组合物的医药组合物(例如以靶向特定类型的组织(例如癌组织)(例如前列腺癌组织))。
在某些实施例中，医药组合物进一步包含载剂。
在另一方面中，本发明涉及活体内成像(例如手术中成像)方法，所述方法包含：向个体投与如技术方案1到24中任一技术方案所述的组合物(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部)，其中所述组合物包含成像剂；和检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂(PSMAi)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于治疗个体的癌症(例如前列腺癌)的方法，其中所述治疗包含将所述组合物递送到所述个体。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂(PSMAi)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于活体内诊断个体的癌症(例如前列腺癌)的方法，所述活体内诊断包含：将所述组合物递送到所述个体(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部)，其中所述组合物包含成像剂；和检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂(PSMAi)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于(a)治疗个体的癌症的方法，或(b)活体内诊断个体的癌症的方法，其中所述方法包含：将所述组合物递送到所述个体(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部)，其中所述组合物包含成像剂；和检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂(PSMAi)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于疗法中。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂(PSMAi)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于活体内诊断中。
在某些实施例中，巨分子是纳米粒子(例如超微小纳米粒子，例如C点，例如C’点)。在某些实施例中，巨分子的直径不大于20nm(例如直径不大于15nm，例如直径不大于10nm)。在某些实施例中，巨分子包含：基于二氧化硅的荧光纳米粒子，其包含：基于二氧化硅的核心；在核心内的荧光化合物；包围核心的一部分的二氧化硅壳；连接到纳米粒子、由此包覆纳米粒子的有机聚合物，其中所述纳米粒子的直径不大于20nm。
在某些实施例中，1到20个PSMAi配体连接到巨分子。
在某些实施例中，组合物包含放射性标记(例如89Zr、64Cu、68Ga、86Y、1241、177Lu、225Ac、212Pb和211At)。
在某些实施例中，螯合剂包含选自由以下组成的群组的成员：N,N'-二(2-羟基苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸单盐酸盐(HBED-CC)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、去铁胺(DFO)和三亚乙基四胺(TETA)。
在某些实施例中，组合物包含：
在某些实施例中，组合物包含：
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素(bombesin)/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的组合物(例如偶联物)。
在某些实施例中，铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体包含以下序列的肽：
其中：L2是任选地经取代的二价C1-10饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；各-Cy-独立地是具有0-4个独立选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-8元二价、饱和、部分不饱和或芳基环,或具有0-5个独立选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8-10元二价饱和、部分不饱和或芳基二环；Y是螯合剂部分；且R是氢、C1-6烷基或氮保护基团；其中除非另有指示，否则各氨基酸残基可在其末端和/或侧链基团上经保护或未经保护。
在某些实施例中，铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体经由所绘示半胱氨酸残基经由L3共价连接到巨分子，其中，L3是共价键或衍生自能将铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的反应性部分与巨分子的反应性部分偶联的双官能交联试剂的交联剂。
在某些实施例中，铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体具有以下结构：
其中L2、L3、Y各自如上文所定义且以单一和组合两种方式描述于本文中的类别和子类中。
在某些实施例中，L3衍生自能将铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体上的硫氢基与巨分子的部分偶联的双官能交联试剂。在某些实施例中，双官能交联试剂是马来酰亚胺或卤代乙酰基。在某些实施例中，双官能交联试剂是马来酰亚胺。
在一些实施例中，L2是键。
在某些实施例中，螯合剂是DOTA。在某些实施例中，螯合剂是NOTA。
在某些实施例中，巨分子是纳米粒子(例如超微小纳米粒子，例如C点，例如C’点)。在某些实施例中，巨分子的直径不大于20nm(例如直径不大于15nm，例如直径不大于10nm)。在某些实施例中，巨分子包含：基于二氧化硅的荧光纳米粒子，其包含：基于二氧化硅的核心；在核心内的荧光化合物；包围核心的一部分的二氧化硅壳；连接到纳米粒子、由此包覆纳米粒子的有机聚合物，其中所述纳米粒子的直径不大于20nm。
在某些实施例中，1到100(例如1到60，例如1到50，例如1到30，例如1到20)个铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体连接到巨分子。
在某些实施例中，组合物进一步包含放射性标记(例如89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I、177Lu、225Ac、212Pb、67Cu和211At)。
在某些实施例中，螯合剂包含选自由以下组成的群组的成员：N,N'-双(2-羟基-5-(羧基乙基)-苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸(HBED-CC)(HBED-CC)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、去铁胺(DFO)和三亚乙基四胺(TETA)。
在某些实施例中，组合物包含：
在某些实施例中，组合物包含：
在另一方面中，本发明涉及治疗疾病或病况的方法，所述方法包含：向个体投与包含如技术方案45到59中任一技术方案所述的组合物的医药组合物(例如以靶向特定类型的组织(例如癌组织)(例如前列腺癌组织))。
在某些实施例中，医药组合物进一步包含载剂。
在另一方面中，本发明涉及活体内成像(例如手术中成像)方法，所述方法包含：向个体投与如技术方案49到65中任一技术方案所述的组合物(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部)，其中所述组合物包含成像剂；和检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于治疗个体的癌症(例如前列腺癌)的方法，其中所述治疗包含将所述组合物递送到所述个体。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于活体内诊断个体的癌症(例如前列腺癌)的方法，所述活体内诊断包含：将所述组合物递送到所述个体(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部)，其中所述组合物包含成像剂；和检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于(a)治疗个体的癌症的方法，或(b)活体内诊断个体的癌症的方法，其中所述方法包含：将所述组合物递送到所述个体(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部)，其中所述组合物包含成像剂；和检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于疗法中。
在另一方面中，本发明涉及包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的组合物(例如医药组合物)，其用于活体内诊断中。
在某些实施例中，巨分子是纳米粒子(例如超微小纳米粒子，例如C点，例如C’点)。在某些实施例中，巨分子的直径不大于20nm(例如直径不大于15nm，例如直径不大于10nm)。在某些实施例中，巨分子包含：基于二氧化硅的荧光纳米粒子，其包含：基于二氧化硅的核心；在核心内的荧光化合物；包围核心的一部分的二氧化硅壳；连接到纳米粒子、由此包覆纳米粒子的有机聚合物，其中所述纳米粒子的直径不大于20nm。
在某些实施例中，1到20个铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体连接到巨分子。
在某些实施例中，组合物进一步包含放射性标记(例如89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I、177Lu、225Ac、212Pb和211At)。
在某些实施例中，螯合剂包含选自由以下组成的群组的成员：N,N'-二(2-羟基苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸单盐酸盐(HBED-CC)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、去铁胺(DFO)和三亚乙基四胺(TETA)。
在某些实施例中，组合物包含：
在某些实施例中，组合物包含：
涉及本发明一个方面的实施例的要素(例如方法)可应用于涉及本发明其它方面的实施例中，并且反之亦然。
定义
为了更容易地理解本发明，首先在下文定义某些术语。以下术语和其它术语的其它定义陈述于通篇说明书中。
在本申请案中，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。如本申请中所用术语“包含(comprise)”和所述术语的变化形式(例如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”)不打算排除其它添加剂、组分、整数或步骤。如本申请中所用术语“约”和“大约”是作为等效术语使用。本申请中所用具有或不具有约/大约的任何数字打算涵盖相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。在某些实施例中，除非另外陈述或另外从上下文显而易见，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)落在所述参照值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围(所述数字会超过可能值的100％的情况除外)。
“投与”：术语“投与”是指将物质引入个体中。通常，可利用任何投与途径，包括例如非经肠(例如静脉内)、经口、局部、皮下、经腹膜、动脉内、吸入、经阴道、经直肠、经鼻、引入脑脊髓液中或滴注到体腔中。在某些实施例中，投与是经口投与。另外或或者，在某些实施例中，投与是非经肠投与。在某些实施例中，投与是静脉内投与。
“脂肪族”：如本文所用术语“脂肪族”或“脂肪族基团”意指完全饱和或含有一或多个不饱和单元的直链(例如无支链)或具支链、经取代或未经取代的烃链，或完全饱和或含有一或多个不饱和单元的单环烃或二环烃，但其并非芳香族(在本文中还称为“碳环基”、“环脂肪族”或“环烷基”)，其具有连接到分子其它部分的单一点。除非另外指定，否则脂肪族基团含有1-6个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-5个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-4个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-3个脂肪族碳原子，并且在其它实施例中，脂肪族基团含有1-2个脂肪族碳原子。在一些实施例中，“环脂肪族”(或“碳环基”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一或多个不饱和单元的单环C3-C7烃，但其并非芳香族，其具有连接到分子其它部分的单一点。适宜脂肪族基团包括但不限于直链或具支链、经取代或未经取代的烷基、烯基、炔基和其杂合物，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
“亚烷基”：术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基，例如-(CH2)n-，其中n是正整数，优选1到6、1到4、1到3、1到2或2到3。经取代亚烷基链是其中一或多个亚甲基氢原子经取代基置换的聚亚甲基。
“亚烯基”：术语“亚烯基”是指二价烯基。经取代亚烯基链是含有至少一个双键的聚亚甲基，其中一或多个氢原子经取代基置换。
“亚炔基”：术语“亚炔基”是指二价炔基。经取代亚炔基链是含有至少一个三键的聚亚甲基，其中一或多个氢原子经取代基置换。
“芳基”：单独使用或作为较大部分的一部分(如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳基氧基烷基”中)使用的术语“芳基”是指具有总计5到10个环成员的单环和二环系统，其中系统中的至少一个环是芳香族且其中系统中的每一环含有3到7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。在一些实施例中，8-10元二环芳基是任选地经取代的萘基环。在本发明的某些实施例中，“芳基”是指可具有一或多个取代基的芳香族环系统，其包括但不限于苯基、联苯基、萘基、蒽基和诸如此类。如其在本文中所用，术语“芳基”范围内还包括其中芳香族环与一或多个非芳香族环稠合的基团，例如二氢茚基、酞酰亚胺基、萘酰亚胺基、菲啶基或四氢萘基和诸如此类。
“生物相容”：如本文所用术语“生物相容”打算描述在活体内不引发实质有害反应的材料。在某些实施例中，如果材料对细胞无毒，那么其为“生物相容”。在某些实施例中，如果将材料在活体外添加到细胞会导致小于或等于20％细胞死亡，和/或其活体内投与不引发炎症或其它所述不良效应，那么其为“生物相容”。在某些实施例中，材料是生物可降解的。
“生物可降解”：如本文所用“生物可降解”材料是那些在引入细胞中时通过细胞机构(例如酶降解)或通过水解分解为细胞可再利用或处置且对细胞无严重毒性效应的组分的材料。在某些实施例中，生物可降解材料的分解所生成组分在活体内不引发炎症和/或其它不良效应。在某些实施例中，生物可降解材料经酶分解。或者或另外，在某些实施例中，生物可降解材料通过水解分解。在某些实施例中，生物可降解聚合材料分解为其组分聚合物。在某些实施例中，生物可降解材料(包括例如生物可降解聚合材料)的分解包括酯键水解。在某些实施例中，材料(包括例如生物可降解聚合材料)的分解包括氨基甲酸酯链接的裂解。
“二价链”：如本文所用术语“二价C1-20(或C1-10、C1-6、C1-3等)饱和或不饱和、直链或具支链的烃链”是指如本文所定义直链或具支链的二价亚烷基、亚烯基和亚炔基链。
“癌症”：如本文所用术语“癌症”是指恶性赘瘤或肿瘤(斯特德曼氏医学词典(Stedman’s Medical Dictionary)，第25版；亨斯利(Hensly编辑)；威廉姆斯和威尔金斯(Williams&Wilkins)：费城(Philadelphia)，1990)。实例性癌症包括但不限于前列腺癌。
“载剂”：如本文所用“载剂”是指化合物可与其一起投与的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。所述医药载剂可为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和诸如此类。优选采用水或水溶液盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液作为载剂，尤其用于可注射溶液。适宜医药载剂描述于“雷明顿的制药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”，E.W.马丁(E.W.Martin)中。
“卤素”：术语“卤素”意指F、Cl、Br或I。
“杂芳基”：单独使用或作为较大部分(例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”)的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指具有5到10个环原子、优选5、6或9个环原子；具有6、10或14个以环状阵列共享的π电子；且除碳原子外具有1到5个杂原子的基团。杂芳基包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。如本文所用术语“杂芳基”和“杂芳-”还包括其中杂芳香族环与一或多个芳基、环脂肪族或杂环基环稠合的基团，其中连接基团或连接点在杂芳香族环上。非限制性实例包含吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可为单环或双环。术语“杂芳基”可与术语“杂芳基环”、“杂芳基”或“杂芳香族”互换使用，所述术语中的任一者包括任选地经取代的环。术语“杂芳烷基”是指经杂芳基取代的烷基，其中烷基和杂芳基部分独立地任选地经取代。
“杂原子”：术语“杂原子”意指氧、硫、氮、磷或硅中的一或多者(包括氮、硫、磷或硅的任一氧化形式；任一碱性氮的季铵化形式或；杂环的可取代氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-取代的吡咯烷基中))。
“杂环”：如本文所用术语“杂环基”、“杂环基团”和“杂环状环”可互换使用且是指饱和或部分不饱和，并且除碳原子外具有一或多个、优选1到4个如上文所定义的杂原子的稳定5到7元单环或7到10元二环杂环部分。当在这种情况下参照环原子使用时，术语“氮”包括经取代氮。作为实例，在具有0到3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可为N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或+NR(如在N-经取代吡咯烷基中)。
杂环可在产生稳定结构的任一杂原子或碳原子连接到其侧基，并且任一环原子可任选地经取代。所述饱和或部分不饱和杂环基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮呯基、氧氮呯基、硫氮呯基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团(heterocyclic group)”、“杂环部分”和“杂环基团(heterocyclic radical)”在本文中可互换使用，并且还包括其中杂环基环与一或多个芳基、杂芳基或环脂肪族环稠合的基团，例如二氢吲哚基、3H-吲哚基、色原烷基、菲啶基或四氢喹啉基，其中连接基团或连接点位于杂环基环上。杂环基可为单环或双环。术语“杂环基烷基”是指经杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地任选地经取代。
“天然氨基酸”：如本文所用词组“天然氨基酸”是指天然存在于蛋白质中的20种氨基酸中的任一种。所述天然氨基酸包括非极性或疏水氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸。半胱氨酸有时归类为非极性或疏水且其它时间归类为极性。天然氨基酸还包括极性或亲水氨基酸，例如酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸(在带电荷时还称为天冬氨酸盐)、谷氨酸(在带电荷时还称为谷氨酸盐)、天冬酰胺和谷氨酰胺。某些极性或亲水氨基酸具有带电荷侧链。所述带电荷氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。所属领域技术人员将了解到，保护极性或亲水氨基酸侧链可赋予所述氨基酸非极性。例如，经适当保护的酪氨酸羟基可借助保护羟基赋予所述酪氨酸非极性和疏水性。
“任选地经取代”：如本文所述，本发明化合物可在指定时含有“任选地经取代”的部分。通常，术语“经取代”不管之前是否有术语“任选地”，都意指指定部分之一或多个氢经适宜取代基置换。除非另外指示，否则“任选地经取代”的基团可在所述基团的每一可取代位置处具有适宜取代基，并且在任一给定结构中的一个以上的位置可经一个以上选自指定基团的取代基取代时，每一位置的取代基可相同或不同。本发明所设想的取代基组合优选是导致形成稳定或化学可行化合物的那些取代基。如本文所用术语“稳定”是指化合物在经受容许其产生、检测和在某些实施例中其回收、纯化和用于本文所揭示的一或多个目的中的条件时，无实质性变化。
“任选地经取代”基团的可取代碳原子上的适宜单价取代基独立地是卤素；-(CH2)0-4Ro；-(CH2)0-4ORo；-O(CH2)0-4Ro、-O-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4CH(ORo)2；-(CH2)0- 4SRo；-(CH2)0-4Ph，其可经Ro取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可经Ro取代；-CH＝CHPh,，其可经Ro取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可经Ro取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(Ro)2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)C(S)Ro；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)C(S)NRo 2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)ORo；-N(Ro)N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)N(Ro)C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)Ro；-C(S)Ro；-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)SRo；-(CH2)0-4C(O)OSiRo 3；-(CH2)0-4OC(O)Ro；-OC(O)(CH2)0-4SRo；-SC(S)SRo；-(CH2)0-4SC(O)Ro；-(CH2)0-4C(O)NRo 2；-C(S)NRo 2；-C(S)SRo；-SC(S)SRo；-(CH2)0-4OC(O)NRo 2；-C(O)N(ORo)Ro；-C(O)C(O)Ro；-C(O)CH2C(O)Ro；-C(NORo)Ro；-(CH2)0-4SSRo；-(CH2)0-4S(O)2Ro；-(CH2)0-4S(O)2ORo；-(CH2)0-4OS(O)2Ro；-S(O)2NRo 2；-(CH2)0-4S(O)Ro；-N(Ro)S(O)2NRo 2；-N(Ro)S(O)2Ro；-N(ORo)Ro；-C(NH)NRo 2；-P(O)2Ro；-P(O)Ro 2；-OP(O)Ro 2；-OP(O)(ORo)2；SiRo 3；-(C1-4直链或具支链亚烷基)O-N(Ro)2；或-(C1-4直链或具支链亚烷基)C(O)O-N(Ro)2，其中各Ro可如下文所定义经取代且独立地是氢、C1-6脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、具有0-4个独立选自氮、氧或硫的杂原子的-CH2-(5-6元杂芳基环)或5-6-元饱和、部分不饱和或芳基环，或尽管如上文所定义，两次独立出现的Ro与其间插原子一起形成具有0-4个独立选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和、部分不饱和或芳基单环或二环，其可如下文所定义经取代。
Ro(或两次独立出现的Ro与其间插原子一起形成的环)上的适宜单价取代基独立地为卤素、-(CH2)0-2Ro、-(卤代Ro)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR·、-(CH2)0-2CH(OR·)2；-O(卤代R·)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R·、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR·、-(CH2)0-2SR·、-(CH2)0- 2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR·、-(CH2)0-2NR· 2、-NO2、-SiR· 3、-OSiR· 3、-C(O)SR·、-(C1-4直链或具支链亚烷基)C(O)OR·或-SSR·，其中各R·未经取代或在前面有“卤基”时仅经一或多个卤素取代，并且独立地选自C1-4脂肪族基团、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0-4个独立选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。Ro的饱和碳原子上的适宜二价取代基包括＝O和＝S。
“任选地经取代”的基团的饱和碳原子上的适宜二价取代基包括以下基团：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中每次独立出现的R*选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基团或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。结合到“任选地经取代”基团的邻位可取代碳的适宜二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-，其中每次独立出现的R*选自氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基团或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
R*的脂肪族基团上的适宜取代基包括卤素、-R·、-(卤代R·)、-OH、-OR·、-O(卤代R·)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR·、-NH2、-NHR·、-NR· 2或-NO2，其中各R·未经取代或在前面有“卤基”时仅经一或多个卤素取代，并且独立地是C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0-4个独立选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
“任选地经取代”基团的可取代氮上的适宜取代基包含 或其中每一独立地是氢、可如下文所定义经取代的C1-6脂肪族基团、未经取代的-OPh或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代5-6元饱和、部分不饱和或芳基环，或虽然如上文所定义，但两次独立出现的与其间插原子一起形成具有0-4个独立选自氮、氧或硫的杂原子的未经取代3-12元饱和、部分不饱和或芳基单环或二环。
的脂肪族基团上的适宜取代基独立地是卤素、-R·、-(卤代R·)、-OH、-OR·、-O(卤代R·)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR·、-NH2、-NHR·、-NR· 2或-NO2，其中各R·未经取代或在前面有“卤基”时仅经一或多个卤素取代，并且独立地是C1-4脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0-4个独立选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。
“氧代基”：如本文所用术语“氧代基”意指双键键结到碳原子，由此形成羰基的氧。
“部分不饱和”：如本文所用术语“部分不饱和”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和”打算涵盖具有多个不饱和位点的环，但不打算包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。
“肽”或“多肽”：术语“肽”或“多肽”是指通过肽键连接在一起的一串至少两个(例如至少三个)氨基酸。在某些实施例中，多肽包含天然氨基酸；或者或另外，在某些实施例中，多肽包含一或多个非天然氨基酸(例如在自然界中不存在但可纳入多肽链中的化合物；例如参见http://www.cco.caltech.edu/～dadgrp/Unnatstruct.gif，其显示已成功纳入功能性离子通道中的非天然氨基酸的结构)和/或可替代性地采用如业内已知的氨基酸类似物。在某些实施例中，蛋白质中的一或多个氨基酸可通过例如添加化学实体(例如碳水化合物基团、磷酸酯基团、法尼基、异法尼基、脂肪酸基团、偶联用连接体)、官能化或其它修饰等来修饰。
“保护基团”：所属领域技术人员将了解，如本文所述化合物和合成方法可利用多种保护基团。如本文所用术语“保护基团”意指，如果需要，遮蔽或封阻特定官能部分(例如O、S或N)，从而允许反应在多官能化合物中的另一反应性位点选择性进行。适宜保护基团为业内所熟知且包括那些详细描述于以下文献中者：有机合成中的保护基团(ProtectingGroups in Organic Synthesis)，T.W.格林(T.W.Greene)和P.G.M.瓦次(P.G.M.Wuts)，第3版，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，1999，其全文是以引用方式并入本文中。在某些实施例中，保护基团以良好产率选择性反应以得到对所计划反应稳定的经保护底物；保护基团优选可通过不攻击其它官能团的易于获得、优选无毒性的试剂选择性移除；保护基团形成可分离衍生物(更优选不生成新立体源中心)；且保护基团优选将具有极小额外官能性以避开其它反应位点。如本文所详述，可利用氧、硫、氮和碳保护基团。氨基保护基团包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)、氨基甲酸9-(2-磺基)芴基甲酯、氨基甲酸9-(2,7-二溴)芴基甲酯、氨基甲酸2,7-二叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基)]甲酯(DBD-Tmoc)、氨基甲酸4-甲氧基苯甲酰甲酯(Phenoc)、氨基甲酸2,2,2-三氯乙酯(Troc)、氨基甲酸2-三甲基硅基乙酯(Teoc)、氨基甲酸2-苯基乙酯(hZ)、氨基甲酸1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙酯(Adpoc)、氨基甲酸1,1-二甲基-2-卤代乙酯、氨基甲酸1,1-二甲基-2,2-二溴乙酯(DB-t-BOC)、氨基甲酸1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙酯(TCBOC)、氨基甲酸1-甲基-1-(4-联苯基)乙酯(Bpoc)、氨基甲酸1-(3,5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙酯(t-Bumeoc)、氨基甲酸2-(2’-和4’-吡啶基)乙酯(Pyoc)、氨基甲酸2-(N,N-二环己基甲酰胺基)乙酯、氨基甲酸叔丁基酯(BOC)、氨基甲酸1-金刚烷基酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯基酯(Voc)、氨基甲酸烯丙基酯(Alloc)、氨基甲酸1-异丙基烯丙基酯(Ipaoc)、氨基甲酸桂酰基酯(Coc)、氨基甲酸4-硝基桂酰基酯(Noc)、氨基甲酸8-喹啉基酯、氨基甲酸N-羟基哌啶基酯、氨基甲酸烷基二硫基酯、氨基甲酸苄基酯(Cbz)、氨基甲酸对甲氧基苄基酯(Moz)、氨基甲酸对硝基苄基酯、氨基甲酸对溴苄基酯、氨基甲酸对氯苄基酯、氨基甲酸2,4-二氯苄基酯、氨基甲酸4-甲基亚磺酰基苄基酯(Msz)、氨基甲酸9-蒽基甲酯、氨基甲酸二苯基甲酯、氨基甲酸2-甲硫基乙基酯、氨基甲酸2-甲基磺酰基乙基酯、氨基甲酸2-(对甲苯磺酰基)乙基酯、氨基甲酸[2-(1,3-二噻烷基)]甲酯(Dmoc)、氨基甲酸4-甲基苯硫基酯(Mtpc)、氨基甲酸2,4-二甲基苯硫基酯(Bmpc)、氨基甲酸2-磷基乙酯(Peoc)、氨基甲酸2-三苯基磷基异丙基酯(Ppoc)、氨基甲酸1,1-二甲基-2-氰基乙基酯、氨基甲酸间氯-对酰氧基苄基酯、氨基甲酸对(二羟基硼基)苄基酯、氨基甲酸5-苯并异噁唑基甲酯、氨基甲酸2-(三氟甲基)-6-色酮基甲酯(Tcroc)、氨基甲酸间硝基苯基酯、氨基甲酸3,5-二甲氧基苄基酯、氨基甲酸邻硝基苄基酯、氨基甲酸3,4-二甲氧基-6-硝基苄基酯、氨基甲酸苯基(邻硝基苯基)甲酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N’-苯基氨基硫代羰基衍生物、氨基甲酸叔戊基酯、硫代氨基甲酸S-苄基酯、氨基甲酸对氰基苄基酯、氨基甲酸环丁基酯、氨基甲酸环己基酯、氨基甲酸环戊基酯、氨基甲酸环丙基甲酯、氨基甲酸对癸氧基苄基酯、氨基甲酸2,2-二甲氧基羰基乙烯基酯、氨基甲酸邻-(N,N-二甲基甲酰胺基)苄基酯、氨基甲酸1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基酯、氨基甲酸1,1-二甲基丙炔基酯、氨基甲酸二(2-吡啶基)甲酯、氨基甲酸2-呋喃基甲酯、氨基甲酸2-碘乙基酯、氨基甲酸异硼基酯、氨基甲酸异丁基酯、氨基甲酸异烟酰基酯、氨基甲酸对-(p’-甲氧基苯基偶氮基)苄基酯、氨基甲酸1-甲基环丁基酯、氨基甲酸1-甲基环己基酯、氨基甲酸1-甲基-1-环丙基甲酯、氨基甲酸1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-(对苯基偶氮基苯基)乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-苯基乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基酯、氨基甲酸苯基酯、氨基甲酸对-(苯基偶氮基)苄基酯、氨基甲酸2,4,6-三叔丁基苯基酯、氨基甲酸4-(三甲铵)苄基酯、氨基甲酸2,4,6-三甲基苄基酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯丙胺酰基衍生物、苯甲酰胺、对-苯基苯甲酰胺、邻-硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’-二硫苄基氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对-羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻-苯基偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻-(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-酞酰亚胺、N-二硫杂琥珀酰亚胺(Dts)、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二硅基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、5-取代1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、1-取代3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-烯丙基胺、N-[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲基胺、N-二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N-2-甲基吡啶氨基N’-氧化物、N-1,1-二甲硫基亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对-甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺、N-[(2-吡啶基)均三甲苯基]亚甲基胺、N-(N’,N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N,N’-亚异丙基二胺、N-对-硝基亚苄基胺、N-亚柳基胺、N-5-氯亚柳基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基胺、N-亚环己基胺、N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基次硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝基胺、N-氧化胺、二苯基膦酰胺(Dpp)、二甲硫基膦酰胺(Mpt)、二苯基硫代膦酰胺(Ppt)、氨基磷酸二烷基酯、氨基磷酸二苄基酯、氨基磷酸二苯基酯、苯次磺酰胺、邻硝基苯次磺酰胺(Nps)、2,4-二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺酰胺、三苯基甲基次磺酰胺、3-硝基吡啶次磺酰胺(Npys)、对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6-三甲苯磺酰胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基色原烷-6-磺酰胺(Pmc)、甲烷磺酰胺(Ms)、β-三甲基硅基乙烷磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’,8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。本文中描述实例性保护基团，然而，应了解本发明不打算受限于这些保护基团；相反，使用上述准则可容易地鉴别多种其它等效保护基团且用于本发明方法中。另外，多种保护基团(包括用于羧基的保护基团)描述于格林和瓦次(上文文献)中。
“放射性标记”：如本文所用术语“放射性标记”是指包含至少一种元素的放射性同位素的部分。实例性适宜放射性标记包括但不限于本文描述的那些。在某些实施例中，放射性标记是用于正电子发射断层摄影术(PET)中者。在某些实施例中，放射性标记是用于单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)中者。在一些实施例中，放射性核素的非限制性列表包括99mTc、111In、64Cu、67Ga、68Ga、186Re、188Re、153Sm、177Lu、67Cu、123I、124I、125I、126I、131I、11C、13N、15O、18F、153Sm、166Ho、177Lu、149Pm、90Y、213Bi、103Pd、109Pd、159Gd、140La、198Au、199Au、169Yb、175Yb、165Dy、166Dy、105Rh、111Ag、89Zr、225Ac、82Rb、75Br、76Br、77Br、80Br、80mBr、82Br、83Br、211At和192Ir。
“个体”：如本文所用术语“个体”包括人类和哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在多个实施例中，个体是哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其人类。在某些实施例中，个体是家畜，例如牛、绵羊、山羊、母牛、猪和诸如此类；家禽，例如鸡、鸭、鹅、火鸡和诸如此类；和驯养动物，尤其宠物，例如狗和猫。在某些实施例中(例如尤其在研究情况下)，个体哺乳动物将为例如啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物或猪，例如近交猪和诸如此类。
“大体上”：如本文所用术语“大体上”是指展现完全或接近完全范围或程度的所关注特征或性质的定性情况。生物领域普通技术人员应了解，生物和化学现象极少(如果曾经)完全完成和/或进行到完全或实现或避免绝对结果。因此，术语“大体上”在本文中用于捕捉多种生物和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
“治疗剂”：如本文所用词组“治疗剂”是指在投与个体时具有治疗效应和/或引发所需生物和/或药理学效应的任何试剂。
“治疗”：如本文所用术语“治疗(treatment)”(还是“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全缓和、改善、减轻、抑制特定疾病、病症和/或病况的一或多种症状、特征和/或病因，延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发病率的物质的任何投与。所述治疗可针对未展现相关疾病、病症和/或病况的体征的个体，和/或仅展现疾病、病症和/或病况的早期体征的个体。或者或另外，所述治疗可针对展现相关疾病、病症和/或病况的一或多种已确立体征的个体。在某些实施例中，治疗可针对已经诊断为患有相关疾病、病症和/或病况的个体。在某些实施例中，治疗可针对已知具有一或多个在统计学上与发生相关疾病、病症和/或病况的风险增加相关联的敏感性因子的个体。在某些实施例中，治疗包含递送治疗剂，包括但不限于小分子递送、放射疗法、免疫疗法、固有治疗性质(例如铁死亡(ferroptosis))和粒子驱动的对肿瘤微环境的调节。在某些实施例中，治疗剂连接到粒子，例如本文所述的那些。
“非天然氨基酸”：如本文所用词组“非天然氨基酸”是指如上文所述天然存在于蛋白质中的20种氨基酸的列表中未包括的氨基酸。所述氨基酸包括20种天然氨基酸中任一者的D-异构体。非天然氨基酸还包括6-氨基己酸、高丝氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸和甲状腺素。其它非天然氨基酸为所属领域技术人员所熟知且包括非天然脂肪族侧链。其它非天然氨基酸包括经修饰氨基酸，包括经N-烷基化、环化、磷酸化、乙酰化、酰胺化、叠氮化、经标记和诸如此类的那些。在一些实施例中，非天然氨基酸是D-异构体。在一些实施例中，非天然氨基酸是L-异构体。
“不饱和”：如本文所用术语“不饱和”意指，部分具有一或多个不饱和单元。
本文中出于说明目的而非限制目的呈现多个图式。
附图说明
本发明的前述和其它目标、方面、特征和优点将通过参照以下说明结合附图一起更显而易见且更好理解，其中：
图1A-1B是根据本发明的说明性实施例，用于获得成功偶联到纳米粒子上的PSMAi-HBED-CC的经修饰形式的合成途径的示意图。
图2是根据本发明的说明性实施例，生成中间体组合物“PSMAi中间体‘X’”的示意图，所述中间体组合物随后用于连接金属螯合剂(例如DOTA，例如HBED，例如其中所述螯合剂是任何经保护螯合剂)和纳米粒子。
图3是根据本发明的说明性实施例，以PSMAi中间体“X”(图2)开始，用DOTA合成连接到纳米粒子的PSMAi偶联物，以生成PSMAi-DOTA-C’点的示意图。注意，此策略可扩展为包括任何经保护螯合剂单体，例如经保护NOTA(tBu)2、NODA-GA(tBu)3、DTPA(tBu)4。
图4是根据本发明的说明性实施例，合成SCN-Bn-PSMAi-Bn-NOTA的示意图。注意，此策略可扩展为包括任何未经保护螯合剂。
图5显示根据本发明的说明性实施例，用于悬垂NOTA或DOTA构筑体的分子。图5显示根据本发明的说明性实施例的实例性最小结构。从图5中所示结构，可将任一数目的dLys上的螯合剂和连接体添加到C点(或其它巨分子)。例如，NOTA和/或DOTA类似物可从此中间体结构制得。此外，可连接PEG间隔体而非(Ahx)2间隔体。在某些实施例中，选择经适当保护的dLys来更新间隔体。
图6A和6B显示67Ga-NOTA-PSMAi-C’点(图6A)和64Cu-NOTA-PSMAi-C’点(图6B)在三个时间点的活体外细胞结合数据。连接到纳米粒子的各PSMAi/螯合剂构筑体在PSMA表达高的LNCaP细胞中展现良好摄取和内化，并且在PSMA表达低的PC3细胞中具有较低摄取。使用2-(膦酰基甲基)戊二酸(PMPA)的阻断研究显示特异性摄取。数据还显示，放射性标记的PSMAi-C'点的摄取随时间稳定增加。
图7A显示在注射后24h，67Ga-NOTA-PSMAi-C'点在裸鼠(图7A)和带有LNCaP肿瘤的小鼠(图7B)中的生物分布。令人惊讶的是，67Ga-NOTA-PSMAi-C'点展现低肾摄取。
图8A和8B显示注射后24h，LNCaP肿瘤的67Ga-NOTA-PSMAi-C点SPECT成像。图8A和8B显示在小鼠模型中投与0.5mCi 67Ga-NOTA-PSMAi-C点(图8A)或共注射0.5mCi 67Ga-NOTA-PSMAi-C和2-(膦酰基甲基)戊二酸(PMPA)(160μg/20 g)(图8B)。PMPA是黑色，显示67Ga-NOTA-PSMAi-C点的摄取减少，从而显示特异性并确认图6A中呈现的活体外资料中呈现的结果。
图9A-9D显示C’点合成的初步数据。
图9A显示对经不同NIR荧光染料(Cy5.5和CW800)和靶向肽(GRP-DOTA)功能化的C’点的图解说明。根据本文所述的某些实施例，不同NIR荧光染料也可与PSMAi-NOTA靶向肽一起使用。
图9B-9D显示PSMAi-NOTA-PEG-Cy5.5-C’点的FCS关联、曲线和拟合(图1B)、UV-vis吸光度光谱(图1C)和具有高斯拟合(Gaussian fit)的GPC洗脱曲线(elugram)(图9D)。样品的TEM显示于图9B的插图中。
图10显示肽IC50测定：PSMAi-NOTA-(④)和GRP-DOTA肽(⑤)与其67Ga放射性标记对应体分别在LNCaP和PC3细胞中的竞争性结合曲线。
图11A-11B显示(图11A)PSMAi-(64Cu)NOTA-C’点和(图11B)GRP-(177Lu)DOTA-C’点与PC3和LNCaP PC细胞膜(Mem)和内化(Int)部分的细胞结合。各数据点表示3个重复的平均值±sd。
图11C显示在培育后4h，PSMAi-PEG-C’点(1μM，粉色)在22RV1细胞中的定位。
图12显示在p.i.1h、4h、24h、48h、72h，PSMAi-(64Cu)NOTA-C’点在正常CD-1小鼠中的生物分布。数据报告为注射剂量/克组织的平均％(n＝4只小鼠/时间点)。
图13显示对PSMAi-89ZR(DFO)-C’点在带有PC-3(n＝5)和LNCaP(n＝2)肿瘤的小鼠中的生物分布的研究。条形表示平均％ID/g±sd。插图：p.i.72h PET扫描和相应组织学，以及探针的放射自显影。
图14显示C’点合成中的示意性突出显示步骤。
图15显示在转移黑色素瘤小型猪中用124I-cRGDY-CW800-C'点(如SEQ ID NO:1所揭示的“cRGDY”)进行的筛选手术前模态映射PET研究。
图16A显示使用光谱不同的粒子探针对淋巴结转移的多重化检测。图揭示“cRGDY”为SEQ ID NO:1。
图16B-16C显示αMSH-Cy5.5-C'点和cRGDY-CW800-C'点(如SEQ ID NO:1所揭示的“cRGDY”)在具有相关组织病理学的代表性高肿瘤负荷淋巴结(图16A；第3列)中的特异性结合/累积，包括(图16B)H&E染色、荧光显微镜术和(图16C)黑色素瘤标记物(αv-整联蛋白和MiTF)在淋巴结和肿瘤组织中的免疫组织化学(IHC)。
图17显示67Ga(NOTA)-PSMAi-C’点和177Lu(DOTA)-PSMAi-C’点与单独的TRAMP C2细胞系或在选择性抑制剂存在下的细胞结合。
图18A使用生物发光成像(BLI)和18F-NaF PET-CT成像(箭头)显示在心内注射表达荧光素酶的细胞后4周从LAPC4子克隆产生的骨转移(箭头)。
图18B显示基于BLI鉴别的LAPC4子克隆的自发远端转移。
图18C显示在B中收获的不同器官的BLI，显示肝、肾和股骨中的转移。
图19显示68Ga-RM2(GRPr配体)在新近诊断患有格里森9PC的患者中的摄取。
图20A-20B显示经PSMA配体68Ga-PSMA-11和GRPr配体68Ga-RM2成像具有PC的生物化学复发的患者。在68Ga-RM2扫描后4周获取68Ga-PSMA-11扫描。腹膜后LN转移基于GRPr扫描的可视化由于基于PSMA扫描。
图21显示螯合到C'点的PSMAi NOTA和DFO。PSMA靶向部分、Glu-脲-Lys和放射性金属螯合剂单独连接到C’点。
图22绘示热图，显示AR、PSMA和GRPr的基因表达的Z-评分。
图23A-23D显示对原发性人类PC中PSMA表达的分析。
图23A显示放射自显影图。
图23B显示H&E染色。
图23C和23D显示PSMA IHC(另一样品)。
图24A-24B显示对原发性PC中GRPr表达的分析。
图24A显示GPRr放射自显影。
图24B显示同一样品的H&E染色。
具体实施方式
在说明书通篇中，如果将物组合物描述为具有、包括或包含特定组分，或如果将方法描述为具有、包括或包含特定步骤，那么预期另外存在基本上由所列举组分组成或由其组成的本发明组合物，并且存在基本上由所列举处理步骤组成或由其组成的本发明方法。
应理解，只要本发明保持可操作，步骤顺序或实施某个动作的顺序无关紧要。此外，两个或更多个步骤或动作可同时实施。
本文例如在背景技术部分所提到的任何出版物并非承认所述出版物用作关于本文中所呈现任何权利要求书的现有技术。背景技术部分是出于清晰目的而呈现，并且不打算作为对关于任何权利要求书的现有技术的说明。
本文描述偶联物的研发，其中将含有PSMA抑制剂和金属螯合剂的构筑体共价连接到巨分子(例如纳米粒子、聚合物、蛋白质)。所述偶联物可展现结合和细胞摄取性质(例如由于多价)和药物代谢动力学(例如由于分子量或大小增加)相对于游离、未结合PSMA抑制剂/螯合剂构筑体的增强。例如，与游离、未结合PSMA抑制剂构筑体相比，巨分子(例如纳米粒子)表面上显示的PSMA抑制剂具有减少的肾摄取。
适用于本文所述系统和方法的各种实施例的详情还提供于例如以下文献中：PCT/US14/30401(WO 2014/145606)，布拉德伯里(Bradbury)等人；PCT/US16/26434(“纳米粒子偶联物(Nanoparticle Immunoconjugates)”，2016年4月7日提出申请)，布拉德伯里等人；PCT/US14/73053(WO2015/103420)，布拉德伯里等人；PCT/US15/65816(WO2016/100340)，布拉德伯里等人；PCT/US16/34351(“使用超微小纳米粒子以经由铁死亡诱导营养丧失的癌细胞的细胞死亡的方法和治疗(Methods and Treatment Using Ultrasmall Nanoparticlesto Induce Cell Death of Nutrient-Deprived Cancer Cells via Ferroptosis)”，2016年5月26日提出申请)，布拉德伯里等人；US 62/267,676(“包含环状肽的组合物、其用于外科手术期间神经组织的可视区分的用途(Compositions Comprising Cyclic Peptides,and Use of Same for Visual Differentiation of Nerve Tissue During SurgicalProcedures)”，2015年12月15日提出申请)，布拉德伯里等人；US62/330,029(“用于恶性脑肿瘤中靶向粒子渗透、分布和反应的组合物和方法(Compositions and Methods forTargeted Particle Penetration,Distribution,and Response in Malignant BrainTumors)”，2016年4月29日提出申请)，布拉德伯里等人；US 14/588,066“用于实时荧光源的多通道成像的系统、方法和设备(Systems,methods,and apparatus for multichannelimaging of fluorescent sources in real time)”，布拉德伯里等人；和US62/349,538(“用于淋巴结分化和/或神经分化、例如用于手术中成像的成像系统和方法(ImagingSystems and Methods for Lymph Node Differentiation and/or NerveDifferentiation,e.g.,for Intraoperative Visualization)”，2016年6月13日提出申请)，布拉德伯里等人，所述文献的内容是全文以引用方式并入本文中。在某些实施例中，本发明偶联物是包含共价连接到巨分子的靶向肽/螯合剂构筑体的组合物。在某些实施例中，靶向肽包含前列腺特异性膜抗原抑制剂(PSMAi)。在某些实施例中，靶向肽包含铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)。
在某些实施例中，本发明PSMAi偶联物具有下式：
其中：
L1是包含1到约10个天然或非天然氨基酸残基的肽片段，或任选地经取代的二价C1-20饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；
L2是任选地经取代的二价C1-10饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；
L3是共价键或衍生自能将(PSMAi)/螯合剂构筑体上的反应性部分与巨分子的部分偶联的双官能交联试剂的交联剂；
各-Cy-独立地是具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5到8元二价饱和、部分不饱和或芳基环或具有0到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8到10元二价饱和、部分不饱和或芳基二环；
Y是螯合剂部分；且
R是氢、C1-6烷基或氮保护基团；
其中除非另有指示，否则各氨基酸残基可在其末端和/或侧链基团上经保护或未经保护。
应了解，在本发明通篇中，如果将巨分子(通常或特定地)示意性绘示为偶联物的一部分，例如那么所述示意图涵盖巨分子与其与偶联物其余部分的所绘示连接之间的适宜连接部分。
在某些实施例中，铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体包含以下序列的肽：
其中，
L2是任选地经取代的二价C1-10饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；
各-Cy-独立地是具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5到8元二价饱和、部分不饱和或芳基环或具有0到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8到10元二价饱和、部分不饱和或芳基二环；
Y是螯合剂部分；且
R是氢、C1-6烷基或氮保护基团；
其中除非另有指示，否则各氨基酸残基可在其末端和/或侧链基团上经保护或未经保护。
在一些实施例中，铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体经由交联剂L3经由所绘示半胱氨酸残基共价连接到巨分子，其中L3是共价键或衍生自能将铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体上的反应性部分与巨分子的反应性部分偶联的双官能交联试剂的交联剂。
应了解，在本发明通篇中，除非另外指定，否则氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护。
在一些实施例中，L1是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个天然或非天然氨基酸残基的肽片段。在一些实施例中，L1是包含1、2、3、4或5个天然或非天然氨基酸残基的肽片段。在一些实施例中，L1是包含1、2或3个天然或非天然氨基酸残基的肽片段。在一些实施例中，L1是包含2个非天然氨基酸残基的肽片段。在一些实施例中，L1包含一个或两个6-氨基己酸(Ahx)单元。在一些实施例中，L1是-Ahx-Ahx-。
在一些实施例中，L1是任选地经取代的C1-10饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-。在一些实施例中，L1是C1-10饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-NR-、-O-或-C(O)-。在一些实施例中，L1包含一或多个乙二醇单元。在某些实施例中，L1包含一或多个-(CH2CH2O)-或-(OCH2CH2)-单元。
在某些实施例中，L2是C1-6饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-或-C(O)O-。在某些实施例中，L2是C1-3饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-或-C(O)O-。在某些实施例中，L2是C1-3饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中烃链的1、2或3个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-NR-或-C(O)-。在一些实施例中，L2是-C(O)-或-C(O)NH-Cy-。
所属领域技术人员熟知多种根据所提供方法使用的适宜交联试剂。所述适宜交联试剂描述于赫曼森(Hermanson),G.T.(2008)，生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)，第2版，学术出版社(纽约)中。在某些实施例中，交联试剂是异双官能试剂。在某些实施例中，交联试剂是同双官能试剂。在一些实施例中，双官能交联试剂选自：
i)马来酰亚胺(双-马来酰亚胺基乙烷、1,4-双马来酰亚胺基丁烷、双马来酰亚胺基己烷、三[2-马来酰亚胺基乙基]胺、1,8-双-马来酰亚胺基二乙二醇、1,11-双-马来酰亚胺基二乙二醇、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷、二硫代-双马来酰亚胺基乙烷)，
ii)吡啶基二硫醇(1,4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)，
iii)芳基叠氮化物(双-[b-(4-叠氮基柳基酰胺基)乙基]二硫化物)，
iv)NHS酯/马来酰亚胺(N-(a-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯、N-[β-马来酰亚胺基丙氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[g-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[g-马来酰亚胺基丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯、[N-e-马来酰亚胺基己酰氧基]琥珀酰亚胺酯、[N-e-马来酰亚胺基己酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯、4-[对-马来酰亚胺基苯基]丁酸琥珀酰亚胺基酯、4-[对-马来酰亚胺基苯基]丁酸磺基琥珀酰亚胺基酯、6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺基酯、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸]琥珀酰亚胺基酯、N-[k-马来酰亚胺基十一酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基-([N-马来酰亚胺基丙酰胺基]-#乙二醇)酯)，
v)NHS酯/吡啶基二硫醇(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫代]甲苯、6-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基己酸4-磺基琥珀酰亚胺基酯)，
vi)NHS酯/(N-琥珀酰亚胺基碘乙酸卤代乙酰基酯、3-[溴乙酰胺基]丙酸琥珀酰亚胺基酯、[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺基酯、[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸N-磺基琥珀酰亚胺基酯)，
vii)吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物(N-[4-(对-叠氮基柳基酰胺基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺)，
viii)马来酰亚胺/酰肼(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼、三氟乙酸盐、[N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼、三氟乙酸盐、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼盐酸盐、N-[k-马来酰亚胺基十一酸]酰肼)，
ix)吡啶基二硫醇/酰肼(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼)，
x)异氰酸酯/马来酰亚胺(N-[对-马来酰亚胺基苯基]异氰酸酯)和1,6-己烷-双-乙烯基砜，仅提到几种。
在上述方法、肽和偶联物的某些实施例中，交联剂是衍生自如上文所述双官能交联试剂的部分。在一些实施例中，交联剂是衍生自能将巨分子的表面胺与靶向肽的硫氢基偶联的双官能交联试剂的部分。在某些实施例中，交联剂是衍生自能将巨分子的表面羟基与靶向肽的硫氢基偶联的双官能交联试剂的部分。在一些实施例中，交联剂是衍生自能将巨分子的表面硫氢基与靶向肽的硫醇偶联的双官能交联试剂的部分。在一些实施例中，交联剂是衍生自能将巨分子的表面羧基与靶向肽的硫氢基偶联的双官能交联试剂的部分。在一些实施例中，交联剂是具有以下结构的部分：
在一些实施例中，L3是共价键。在某些实施例中，L3是衍生自能将(PSMAi)/螯合剂构筑体的反应性部分与巨分子的反应性部分偶联的双官能交联试剂的交联剂。在某些实施例中，L3是衍生自能将铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的反应性部分与巨分子的反应性部分偶联的双官能交联试剂的交联剂。在某些实施例中，L3是衍生自能将铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体(GRP)/螯合剂构筑体的硫氢基与巨分子的反应性部分偶联的双官能交联试剂的交联剂。在某些实施例中，双官能交联试剂是马来酰亚胺或卤代乙酰基。在某些实施例中，双官能交联试剂是马来酰亚胺。
在一些实施例中，各-Cy-独立地是具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5-8元二价饱和、部分不饱和或芳基环。在一些实施例中，各-Cy-独立地是具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的6元二价饱和、部分不饱和或芳基环。在一些实施例中，-Cy-是亚苯基。
在某些实施例中，纳米粒子包含二氧化硅、聚合物(例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA))、生物制品(例如蛋白质载剂)和/或金属(例如金、铁)。在某些实施例中，纳米粒子是“C点”或“C’点”，如Bradbury等人的美国公开案第2013/0039848 A1号(参见附录A)中所述，所述案件是全文以引用方式并本文中。
在某些实施例中，纳米粒子是球形。在某些实施例中，纳米粒子是非球形。在某些实施例中，纳米粒子是或包含选自由以下组成的群组的材料：金属/半金属/非金属、金属/半金属/非金属-氧化物、-硫化物、-碳化物、-氮化物、脂质体、半导体和/或其组合。在某些实施例中，金属选自由以下组成的群组：金、银、铜和/或其组合。
纳米粒子可包含金属/半金属/非金属氧化物，包括二氧化硅(SiO2)、氧化钛(TiO2)、氧化铝(Al2O3)、氧化锆(ZrO2)、氧化锗(GeO2)、五氧化钽(Ta2O5)、NbO2等，和/或非氧化物，包括金属/半金属/非金属硼化物、碳化物、硫化物和氮化物，例如钛和其组合(Ti、TiB2、TiC、TiN等)。
纳米粒子可包含一或多种聚合物，例如一或多种美国食品药品管理局(FDA)已根据21C.F.R.§177.2600批准用于人类的聚合物，包括但不限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1,3-二噁烷-2-酮))；聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚氰基丙烯酸酯；PEG与聚(氧化乙烯)(PEO)的共聚物。
纳米粒子可包含一或多种可降解聚合物，例如某些聚酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷氮烯、聚磷酸酯、某些聚羟酸、聚延胡索酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚缩醛、聚醚、生物可降解聚氰基丙烯酸酯、生物可降解聚氨酯和多糖。例如，可用特定生物可降解聚合物包括但不限于聚赖氨酸、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(己内酯)(PCL)、聚(乳酸交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚(乳酸交酯-共-己内酯)(PLC)和聚(乙交酯-共-己内酯)(PGC)。另一实例性可降解聚合物是聚(β-氨基酯)，其可适于根据本申请案使用。
在某些实施例中，纳米粒子可具有或经修饰而具有一或多个官能团。所述官能团(在纳米粒子内或在纳米粒子表面上)可结合任何试剂(例如可检测实体、靶向实体、治疗实体或PEG)使用。除了通过引入或修饰表面官能团来改变表面电荷，引入不同官能团容许连接体(例如(可裂解或(生物)可降解)聚合物(例如但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、PLGA等)、靶向/归巢剂和/或其组合的偶联。
连接到纳米粒子的配体数可介于约1到约20、约2到约15、约3到约10、约1到约10或约1到约6范围内。连接到纳米粒子的配体的小数目有助于维持本发明纳米粒子的流体动力学直径符合肾清除截止大小范围。希尔德布兰德(Hilderbrand)等人，近红外荧光：应用于活体内分子成像(Near-infrared fluorescence:application to in vivo molecularimaging),化学生物学的当前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.),14:71-9,2010。
在某些实施例中，除PSMAi以外的治疗剂可连接到纳米粒子。治疗剂包括抗生素、抗微生物剂、抗增殖剂、抗瘤剂、抗氧化剂、内皮细胞生长因子、凝血酶抑制剂、免疫抑制剂、抗血小板聚集剂、胶原合成抑制剂、治疗性抗体、一氧化氮供体、反义寡核苷酸、伤口愈合剂、治疗性基因转移构筑体、细胞外基质组分、血管舒张剂、血栓溶解剂、抗代谢物、生长因子激动剂、抗有丝分裂剂、抑制素(statin)、类固醇、类固醇和非类固醇消炎剂、血管收缩肽转化酶(ACE)抑制剂、自由基清除剂、PPAR-γ激动剂、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA和抗癌化学治疗剂。本发明实施例所涵盖治疗剂还包括放射性核素，例如90Y、131I和177Lu。治疗剂可经放射性标记，例如通过结合到放射性氟18F来标记。
可治疗癌症包括例如任何癌症。在某些实施例中，癌症是前列腺癌。
在某些实施例中，对比剂可连接到本发明纳米粒子用于医学或生物成像。在某些实施例中，可包括正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机断层摄影(SPECT)、计算机化断层摄影(CT)、磁共振成像(MRI)、光学生物发光成像、光学荧光成像和其组合。在某些实施例中，对比剂可为业内已知用于PET、SPECT、CT、MRI和光学成像的任何分子、物质或化合物。对比剂可为放射性核种、放射性金属、正电子发射体、β发射体、γ发射体、α发射体、顺磁性金属离子和超顺磁性金属离子。对比剂包括但不限于碘、氟、Cu、Zr、Lu、At、Yt、Ga、In、Tc、Gd、Dy、Fe、Mn、Ba和BaSO4。可用作对比剂连接到本发明实施例的纳米粒子的放射性核素包括但不限于89Zr、64Cu、68Ga、86Y、1241、177Lu、225Ac、212Pb和211At。或者，对比剂可通过连接到连接体或螯合剂间接偶联到纳米粒子。螯合剂可经调整以结合放射性核素。可连接到本发明纳米粒子的螯合剂可包括但不限于N,N'-双(2-羟基-5-(羧基乙基)-苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸(HBED-CC)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、去铁胺(DFO)、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N″-三乙酸(NOTA)和三亚乙基四胺(TETA)。
在某些实施例中，本发明偶联物具有下式：
在某些实施例中，本发明偶联物具有下式：
在某些实施例中，本发明偶联物具有下式：
在某些实施例中，本发明偶联物具有下式：
在某些实施例中，探针物质包含纳米粒子。在某些实施例中，纳米粒子具有二氧化硅架构和富染料核心。在某些实施例中，富染料核心包含荧光报告剂(reporter)。在某些实施例中，荧光报告剂是近红外或远红染料。在某些实施例中，荧光报告剂选自由以下组成的群组：荧光团、荧光染料、染料、颜料、荧光过渡金属和荧光蛋白。在某些实施例中，荧光报告剂选自由以下组成的群组：Cy5、Cy5.5、Cy2、FITC、TRITC、Cy7、FAM、Cy3、Cy3.5、德克萨斯红、ROX、HEX、JA133、AlexaFluor 488、AlexaFluor 546、AlexaFluor 633、AlexaFluor 555、AlexaFluor 647、DAPI、TMR、R6G、GFP、强化GFP、CFP、ECFP、YFP、柠檬黄、维纳斯(Venus)、YPet、CyPet、AMCA、光谱绿、光谱橙、光谱青、丽丝胺(Lissamine)和铕。在某些实施例中，成像是在正常照明环境中执行。在某些实施例中，成像是用一定值到零的周围照明环境执行。
本文中的成像方法可与多种不同荧光探针物质一起使用(或，如在使用串联生物发光报告剂/荧光探针的实施例中，其荧光物质)，例如(1)在靶接触(例如，结合或相互作用)后活化的探针(维斯莱德(Weissleder)等人，自然生物技术(Nature Biotech.),17:375-378,1999；布雷默(Bremer)等人，自然医学(Nature Med.),7:743-748,2001；坎普(Campo)等人，光化学与光生物学(Photochem.Photobiol.)83:958-965,2007)；(2)波长移动信标(特亚吉(Tyagi)等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.),18:1191-1196,2000)；(3)多色(例如，荧光)探针(特亚吉等人，自然生物技术,16:49-53,1998)；(4)与靶具有高结合亲和性的探针，例如在非特异性探针从体内清除时保留在靶区域内的探针(阿奇雷夫(Achilefu)等人，研究放射学杂志(Invest.Radiol.),35:479-485,2000；贝克尔(Becker等人)，自然生物技术，19:327-331,2001；布寨(Bujai)等人，生物医学光学杂志(J.Biomed.Opt.)6:122-133,2001；巴罗(Ballou)等人，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)13:649-658,1997；和内里(Neri)等人，自然生物技术15:1271-1275,1997)；(5)基于量子点或纳米粒子的成像探针，包括多价成像探针，和荧光量子点，例如胺T2MP(艾文特技术公司(Evident Technologies))或纳米晶体(InvitrogenTM)；(6)非特异性成像探针，例如吲哚菁绿、(VisEn医学)；(7)经标记细胞(例如，使用外源荧光团(例如VivoTagTM680)、纳米粒子或量子点标记的细胞，或通过遗传操纵细胞表达荧光或发光蛋白(例如绿色或红色荧光蛋白)标记的细胞)；和/或(8)X-射线、MR、超声波、PET或SPECT对比剂(例如钆)、金属氧化物纳米粒子、X-射线对比剂(包括碘基成像剂)或金属(例如铜、镓、铟、锝、钇和镏)的放射性同位素形式(包括但不限于99m-Tc、111-In、64-Cu、67-Ga、186-Re、188-Re、153-Sm、177-Lu和67-Cu)。另一群适宜成像探针是镧系元素金属-配体探针。荧光镧系元素金属包括铕和铽。镧系元素的荧旋光性质描述于莱克沃维茨(Lackowicz),1999,荧光光谱原理(Principles of Fluorescence Spectroscopy),第2版,库瓦学术(KluwarAcademic)(纽约)中，相关文本是以引用方式并入本文中。在此实施例的方法中，成像探针可通过注射成像探针或通过局部或其它局部投与途径(例如“喷雾”)全身或局部投与。此外，本发明实施例中所用成像探针可偶联到能引发光动力疗法的分子。这些分子包括但不限于光卟啉、卢特林(Lutrin)、安特林(Antrin)、氨基乙酰丙酸、金丝桃素、苯并卟啉衍生物和选择卟啉。在某些实施例中，两种或更多种探针物质可图解区分，例如以不同色彩(例如绿色和红色，例如绿色和蓝色)显示，以分开表示两个淋巴引流路径和/或淋巴结。在某些实施例中，两种或更多种探针物质的图像在图形显示上叠加，或重叠部分以不同(例如第三种)色彩(例如黄色)表示。例如，对于淋巴引流路径既引流到远端又引导到肿瘤位点的淋巴引流路径，所述路径可含有第一和第二探针物质二者(分别对应于显示上的第一和第二色彩)，并且为显示上的重叠区域分配与第一和第二色彩不同的新色彩。所述色彩可指示，相关淋巴结不应移除，以避免淋巴水肿。
通常，本发明要素的实践中所用荧光量子点是含有半导体材料(包括但不限于含有以下的那些：镉和硒、硫化物或碲；硫化锌、铟-锑、硒化铅、砷化镓和二氧化硅或有机修饰二氧化硅(ormosil))的若干原子的纳米晶体，其可经硫化锌涂布以改良荧光剂的性质。
特定来说，荧光探针物质是优选类型的成像探针。荧光探针物质是荧光探针，其靶向生物标记物、分子结构或生物分子，例如细胞表面受体或抗原、细胞内的酶或与探针杂交的特定核酸，例如DNA。荧光成像探针可靶向的生物分子包括例如抗体、蛋白质、糖蛋白、细胞受体、神经传递质、整联蛋白、生长因子、细胞因子、淋巴介质、凝集素、选择蛋白、毒素、碳水化合物、内化受体、酶、蛋白酶、病毒、微生物和细菌。
在某些实施例中，探针物质的激发和发射波长在红光和近红外光谱中，例如在550-1300或400-1300nm或约440到约1100nm、约550到约800nm、或约600到约900nm范围内。使用此部分电磁光谱使组织渗透最大化且使生理上丰富的吸收剂(例如血红素(<650nm)和水(>1200nm))的吸收最小化。激发和发射波长在其它光谱(例如可见光和紫外光光谱)中的探针物质还可用于本发明实施例的方法中。特定来说，荧光团(例如某些羰花青或多甲川荧光荧光染料或染料)可用于构筑光学成像剂，例如授予卡普托(Caputo)等人的美国专利第6,747,159号(2004)；授予卡普托等人的美国专利第6,448,008号(2002)；授予德拉西亚娜(Della Ciana)等人的美国专利第6,136,612号(2000)；授予索思威克(Southwick)等人的美国专利第4,981,977号(1991)；授予瓦格纳(Waggoner)等人的第5,268,486号(1993)；授予瓦格纳的美国专利第5,569,587号(1996)；授予瓦格纳等人的第5,569,766号(1996)；授予瓦格纳等人的美国专利第5,486,616号(1996)；授予瓦格纳的美国专利第5,627,027号(1997)；授予布什(Brush)等人的美国专利第5,808,044号(1998)；授予雷丁顿(Reddington)等人的美国专利第5,877,310号(1999)；授予沈(Shen)等人的美国专利第6,002,003号(1999)；授予梁(Leung)等人的美国专利第6,004,536号(1999)；授予瓦格纳等人的美国专利第6,008,373号(1999)；授予明登(Minden)等人的美国专利第6,043,025号(2000)；授予明登等人的美国专利第6,127,134号(2000)；授予瓦格纳等人的美国专利第6,130,094号(2000)；授予瓦格纳等人的美国专利第6,133,445号(2000)；授予理查(Licha)等人的美国专利第7,445,767号(2008)；授予理查等人的美国专利第6,534,041号(2003)；授予米娃(Miwa)等人的美国专利第7,547,721号(2009)；授予米娃等人的美国专利第7,488,468号(2009)；授予川上(Kawakami)等人的美国专利第7,473,415号(2003)；以及WO 96/17628、EP 0 796 111 B1、EP 1 181 940 B1、EP 0 988 060 B1、WO 98/47538、WO 00/16810、EP 1 113 822 B1、WO 01/43781、EP 1 237 583 A1、WO 03/074091、EP 1 480 683B1、WO 06/072580、EP 1 833 513 A1、EP 1 679 082 A1、WO 97/40104、WO 99/51702、WO01/21624和EP 1 065 250 A1；和四面体字母(Tetrahedron Letters)41,9185-88(2000)。
用于探针物质的实例性荧光染料包括例如以下：Cy5.5、Cy5、Cy7.5和Cy7(Healthcare)；AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor790和AlexaFluor750(英杰(Invitrogen))；VivoTagTM680、VivoTagTM-S680、VivoTagTM-S750(VISEN医学)；Dy677、Dy682、Dy752和Dy780 547和/或647(皮尔斯(Pierce))；HiLyte FluorTM647、HiLyte FluorTM680和HiLyte FluorTM750 800CW、800RS和700DXADS780WS、ADS830WS和ADS832WS(美国染料来源(American Dye Source))；XenoLight CFTM680、XenoLight CFTM750、XenoLight CFTM770和XenoLight DiR(生命科学)；和650、X-SIGHT 691、X-SIGHT 751(Health)。
用于成像、检测、记录或测量本发明纳米粒子的适宜方式还可包括例如流式细胞计数器、激光扫描细胞计数器、荧光微量读板仪、荧光显微镜、共焦显微镜、明视野显微镜、高内涵扫描系统和类似装置。多于一种成像技术可同时或连续使用以检测本发明纳米粒子。在一个实施例中，使用光学成像作为灵敏、高通量筛选工具以在同一个体中获得多个时间点，从而允许肿瘤标记物含量的半定量评估。此补偿以PET获得的相对降低的时间分辨率，但PET需要实现足够深度渗透以获取体积数据，并且需要检测、定量和监测受体和/或其它细胞标记物含量的变化作为评价疾病进展或改良的方式，以及将患者分层到适宜治疗方案。
本文所述系统和方法可与其它成像方法一起使用，例如使用多种装置，包括但不限于各种观测设施(显微镜、内视镜)、导管和光学成像设备，例如用于断层摄影呈现的基于计算机的硬件。前列腺癌(PC)的成功手术管控依赖于可在围手术期检测疾病的准确度。总体存活和长期发病的改良依赖于外科医生获得阴性手术边缘和完全切除区域性转移淋巴结(LN)的能力。然而，手术中成像指导主要基于人类视觉提示和触觉信息，无法基于癌症本身鉴别分子决定因素。已出现一种方法，即手术中荧光成像作为高度可靠的工具来改良可视化，并且可无缝整合到手术工作流程中。
如实例中所述，含有含核心且表面承载二氧化硅纳米粒子官能团的模块C’点平台有所改良。将光谱不同的NIR反应性染料(例如，Cy5.5，例如CW800)囊封到C’点核心中可区分表面结合的靶向部分。
可使用针对靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)和胃泌素释放肽受体(GRPr)或其它前列腺癌靶优化的肽。例如，PSMA靶向C’点和GRPr靶向C’点可纳入染料和表面放射性金属。在常规细胞系、PC系的转移子克隆和表达PSMA或GRPr转录物的患者源人类前列腺类器官培养物中通过RNA-seq筛选经PSMA抑制剂(PSMAi)和GRP配体功能化的PSMA和GRPr靶向肽和粒子的生物性质。随后在异种移植物和/或正位注射的PC模型中通过PET-光学成像方法评价先导候选者。可针对先导PSMA靶向产品实施试验药(IND)研究，其用于早期图像指导的手术试验中，所述手术试验经设计以检测表达PSMA的转移淋巴结和/或阳性肿瘤边缘。平行地，光谱不同的粒子探针和多重化策略可准确检测表达PSMA和GRPr的转移淋巴结用于下一阶段临床试验设计并加以检查。
本发明提供测定并优化囊封NIR染料的靶向PSMA和GRPr的C'点的可调谐表面化学，以实现前列腺癌(PC)细胞系中的有利结合动力学/摄取此外，本发明提供合成和表征原型荧光PSMAi-PEG-C'点和GRP-PEG-C'点。此外，本发明提供改良光物理性质以提高检测灵敏度和组织对比度。此外，本发明提供在表达PSMA和GRPr的常规(例如LNCaP、PC3)前列腺癌细胞系中针对结合亲和性、内化、特异性和细胞毒性评价粒子探针。此外，本发明提供在人类前列腺类器官培养物和PC系(LAPC4、VCaP)的转移子克隆中PSMA和/或GRPr靶表达程度的变化，以选择用于活体内研究的先导候选者。
本发明还提供评价在表达PSMA和GRPr的模型中经优化杂合C’点的肿瘤选择性累积和PK曲线，以鉴别具有有利靶向动力学和清除概况的探针。例如，在某些实施例中，本发明提供优化用64Cu、67Ga或89Zr对偶联PSMAi和GRP的C'点进行表面放射性标记的条件。此外，在某些实施例中，本发明提供在最大表达一种/两种靶的衍生自常规/转移细胞系的正位和异种移植物模型和人类前列腺类器官模型中用先导偶联PSMAi和GRP-偶联的点执行筛选PK和成像研究，以鉴别具有有利靶向/清除动力学的探针。此外，在某些实施例中，本发明提供从先导C'点候选者研发含有光谱不同的NIR染料的产品，以允许在临床前模型中使用MRI-PET成像和基于荧光的多重化策略和相关组织学准确且灵敏地检测在淋巴结和/或远端转移上表达的多种标记物。
本发明还提供执行PSMAi-C’点的临床试验的IND致能(enabling)研究，测定先导候选产品在小鼠中的有效剂量范围(微小剂量)和暴露(PK和清除/剂量测定法)以告知IND致能非临床安全性研究，使用单一啮齿类动物模型实施单一剂量准确毒性评估作为微量给药研究，并且使用手术中光学和手术前PET/MR成像实施前导性临床试验以评估先导PSMA靶向C’点的安全性和辐射剂量测定，以及获得关于PC检测、沿手术边缘的残留肿瘤和局部淋巴结的前导性数据。
在某些实施例中，可使用PET-NIR光学成像探针能力使得能以高分辨率同时使PC中肿瘤细胞表面上的多个分子靶可视化。例如，可用两个不同的靶向PC的配体调整两个NIR粒子(例如C’点)。还可连接放射性金属以使得能进行手术前PET成像用于筛选转移。总之，这些研发应最终改良手术分期和PC患者的管控。外科医生能更精确地评价PC和转移疾病的确切位置，从而有助于更完全地切除癌性病灶，降低肿瘤复发概率，并且改良局部控制和肿瘤学结果。
横断面成像选择很少用于转移淋巴结和/或沿手术边缘的残存疾病的围手术期检测。虽然已发展出大量基于放射性标记的肽剂用于临床前/临床成像研究，其在疾病位点显示特异性靶向摄取，但限制包括：(i)可用于癌性病灶可视化的NIR光学活性手术探针的缺乏；(ii)非特异性探针在放射敏感性器官/组织中大量累积，具有相关不良治疗后果；(iii)不能分析控制不同生物事件的不同PC标记物；和(iv)因疏水NIR染料直接连接到基于PSMAi的试剂而丧失生物活性。克服所述限制需要在产品研发的每一层面创新，包括在水性环境中合成新一代C’点以实现较佳表面化学控制，囊封染料以防止生物活性丧失；利用一锅式(one-pot)合成方法进行有效表面官能化，和调整连接体和肽设计以促进粒子连接。在两种靶向整联蛋白的囊封NIR染料的二氧化硅粒子产品(一种用于定位黑色素瘤中的转移淋巴结和另一种用于定位恶性脑瘤中的粒子分布)已接受FDA-IND认证(clearance)时，生成其它IND致能技术，即纳入Cy5.5染料的PSMAi-PEG-C’点和纳入CW800染料的GRP-PEG-C’点，用于改良图像指导PC中癌性淋巴结和残存疾病的定位。此外，这些产品组合用于在PC模型中的实时肿瘤表型分型，结合经调谐以同时检测发射在700nm(Cy5.5)和800nm(CW800)左右的光谱不同的光学信号的高灵敏度手持式多光谱荧光照像机系统(Quest SpectrumTM,探索医学成像(Quest Medical Imaging),荷兰)，有助于增进对所述粒子探针靶向的生物过程的理解。此可携式照像机系统适用于开放和腹腔镜成像应用二者，克服与现有“黑箱(blackbox)”式小动物成像技术相关的限制，同时实现更高的空间和波长分辨率。
中间体
本发明还包括可用于合成所提供偶联物的中间体。因此，在一些实施例中，本发明提供下式的化合物：
其中L1、L2和Y各自是如上文所定义且以单一和组合两种方式描述于本文中的类别和子类中。
在一些实施例中，本发明提供下式的化合物：
其中L1、L3和巨分子各自如上文所定义且以单一和组合两种方式描述于本文中的类别和子类中。在一些实施例中，本发明提供下式的化合物：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护，并且其中一个氨基酸任选地连接到树脂。
在一些实施例中，本发明提供下式的化合物：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护。
在一些实施例中，本发明提供以下化合物：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护，并且其中一个氨基酸任选地连接到树脂。
在一些实施例中，本发明提供下式的化合物：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护。
在某些实施例中，本发明提供选自以下的化合物：
实例
本发明实例提供偶联物的研发，其中含有PSMA抑制剂(“PSMAi”)和金属螯合剂的构筑体共价连接到巨分子。可使用多种巨分子和螯合剂。在优选实施例中，巨分子包括基于二氧化硅的超微小纳米粒子(例如直径不大于20nm的纳米粒子，例如C点，例如C’点)。在某些实施例中，金属螯合剂包括HBED-CC。在某些其它实施例中，金属螯合剂包括NOTA、在其它优选实施例中，金属螯合剂包括DOTA。在某些实施例中，所揭示螯合剂可经保护且可添加到所述偶联物，如图3中所示。在某些实施例中，所揭示螯合剂可经去保护且可添加到所述偶联物，如图4中所示。
得自这些偶联化学的组合物生成具支链结构靶向分子和巨分子结构(例如，纳米粒子结构(例如，C点结构))，其提供游离且未结合的PSMAi靶向分子未展现的性质。例如，巨分子(例如，纳米粒子)用作PSMAi-螯合剂构筑体的支架。在某些实施例中，多个PSMAi-螯合剂构筑体可连接到巨分子(例如超微小纳米粒子，例如C点)的表面，由此使得粒子与PSMA阳性组织之间能进行多价(multivalent)或多价(polyvalent)相互作用。在某些实施例中，可将2到30个PSMAi-螯合剂构筑体连接到巨分子表面。在某些实施例中，可将2到25个PSMAi-螯合剂构筑体连接到巨分子表面。在某些实施例中，可将2到20个PSMAi-螯合剂构筑体连接到巨分子表面。在某些实施例中，可将5到10个PSMAi-螯合剂构筑体连接到巨分子表面。
与将多个个别游离PSMAi-HBED-CC/螯合剂分子递送和结合到靶组织相比，将PSMAi-螯合剂-纳米粒子组合物递送到靶组织且随后与其结合可以指数方式增强。例如，通过投与呈PSMAi-螯合剂-纳米粒子组合物形式的构筑体而非投与游离PSMAi-螯合剂，可将PSMAi-螯合剂构筑体更有效地递送到靶组织且与其结合。
实例1
如图1中所示的靶分子PSMAi-HBED-CC的合成方案
图1显示用于获得成功偶联到纳米粒子的PSMAi-HBED-CC的经修饰形式的合成途径的示意图。下文提供合成方案。
试剂
购自商业来源的溶剂和试剂不经进一步纯化即加以使用。HBED-CC-二(tBu)酯(1)购自ABX。乙腈、二乙醚、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、己烷、六氟异丙醇(HFIP)、甲醇、二氯甲烷(DCM)和三氟乙酸(TFA)得自费舍尔(Fisher)。二甲亚砜(DMSO)、二异丙基乙胺(DIEA)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和三乙胺(TEA)购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)购自金斯瑞(Genescript)。
急速色谱
在Teledyne ISCO CombiFlash Rf上使用4g、12g、24g和40g柱体使用己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷和/或甲醇实施正相(硅胶)纯化。
分析型HPLC
在沃特世联盟(Waters Alliance)HPLC系统或奥托皮尤(Autopure)LCMS系统(2767样品管理器、2996光电二极管阵列检测器、2420ELS检测器、迈克马斯(Micromass)ZQ、2525二元梯度模块、管柱流控管理器、515HPLC泵、泵控制模块II)上，在C4或C18 4.6×50mm反相XBridge分析型管柱(沃特世)上，使用水中的5-95％乙腈(0.5％TFA)的线性梯度将样品以1.2mL/min运行10分钟。在348nm或650nm下分析样品。
制备型HPLC
在沃特世制备型系统(2996光电二极管阵列检测器、2545二元梯度模块)或奥托皮尤LCMS系统上，在C18 19×150mm反相XBridge制备型管柱(沃特世)上，使用水中的5-95％乙腈(0.5％TFA)将样品以20mL/min纯化30分钟。在220nm或348nm下分析样品。
靶分子PSMAi-HBED-CC的合成方案
将HBED-CC-二(tBu)酯(1)溶解于rbf中的DCM和TEA(3eq)中且将其搅拌。添加氯三苯甲基氯(2)(1.2eq)并通过TLC和LCMS监测。在3hr后，将溶液在真空中浓缩，然后通过急速色谱纯化。分离灰白色固体3，然后溶解于DMF和DIEA(4eq)中。添加叔丁基氧基羰基-二氨基乙烷(1.5eq)，之后添加HATU(2eq)。反应在30min内完成(如通过LCMS所测定)，然后在真空中浓缩。分离呈油的4且再悬浮于DCM中，然后通过急速色谱纯化。将白色固体溶解于50％HFIP于DCM中的溶液中并培育2hr。将溶液在真空中浓缩，然后用二乙醚洗涤。通过LCMS确认去保护产物。将残留物再悬浮于DCM中，在冰浴中冷却。添加EDC(5eq)，搅拌30min，然后添加NHS(3eq)。通过TLC监测反应。在4小时后，将反应物在真空中浓缩，然后通过急速色谱纯化。分离白色固体5，溶解于DCM和TEA(5eq)中，向其添加6并使反应进行过夜。在真空中移除溶剂，并且将所得油再悬浮于ACN中并通过反相HPLC(RP-HPLC)纯化，其中冻干得到白色固体7(通过LCMS确认)。将TFA(5％水)添加到固体并搅拌30min。将溶液在真空中浓缩，然后用冷醚洗涤，溶解于水/ACN(1:1)中并冻干。将DMF和TEA(5eq)添加到白色固体，搅拌，然后添加活化半胱氨酸酯(Ac-Cys(Trt)-NHS,3eq)。在4hr后，将反应物在真空中浓缩，然后通过RP-HPLC纯化并冻干。用TFA:TIS:水(比率90:0.5:0.5)溶液将白色固体处理2hr，蒸发并通过RP-HPLC纯化。在冻干后，如先前所述将白色固体8纳入纳米粒子中。
如图3中所示的经保护螯合剂-PSMAi偶联物的合成
图3是根据本发明的说明性实施例，以中间体“X”开始(图2)，用DOTA合成连接到纳米粒子的PSMAi偶联物，生成PSMAi-DOTA-C’点的示意图。图2显示生成中间体组合物“PSMAi中间体‘X’”的示意图，所述中间体组合物随后用于将金属螯合剂(例如DOTA，例如HBED，例如NOTA)与巨分子(例如纳米粒子)连接。
图3中的策略(PSMAi-DOTA)用于添加经保护螯合剂。例如，NCS-DFO可以与NCS-NOTA相同的方式添加。作为另一实例，此策略可扩展为包括任何经保护螯合剂单体，例如经保护NOTA(tBu)2、NODA-GA(tBu)3、DTPA9(tBu)4。
在某些实施例中，螯合剂通常必须在合成的最后一个步骤或倒数第二个步骤添加。
如图4中所示的靶分子SCN-Bn-PSMAi-Bn-NOTA的合成方案
图4是根据本发明的说明性实施例，合成SCN-Bn-PSMAi-Bn-NOTA的示意图。PSMAi-NOTA-C点的合成描述于下文中。图4中所示的合成方案用于将NCS-DFO连接到PSMAi构筑体。
PSMAi-DOTA构筑体与PSMAi-NOTA构筑体之间的差异在于，DOTA是在肽构筑体仍连接到树脂时连接。此是可能的，这是因为经完全保护的DOTA可购得且可使用SPPS方法活化。相反，对于PSMAi-NOTA合成来说，SCN-Bn-NOTA是在肽构筑体从树脂裂解后添加。在某些优选实施例中，使用使连接体脱离螯合剂主链的NOTA衍生物。在某些实施例中，使用p-SCN-Bn-NOTA来构筑PSMAi-NOTA构筑体。NOTA螯合剂可容易且稳定地经Ga和Cu放射性同位素放射性标记。在某些实施例中，与DOTA相比，使用64Cu时，NOTA具有优选标记效率和稳定性。注意，SCN-Bn-NOTA仅可作为未经保护螯合剂购得。
然而，有多种经保护NOTA螯合剂可供购买。如果使用经保护NOTA(tBu)2，那么其可以与将经保护DOTA(tBu)3添加到构筑体类似的方式来添加。通常，任何经保护螯合剂的添加可能使用图3中的策略，并且任何未经保护螯合剂可使用图4中的策略。
连接具有悬垂NOTA的连接体以供偶联到粒子。对于此连接体与C点的作用，例如使用具有末端Cys的连接体序列来将Lys-脲-链接-Glu药效团接合到粒子。图5显示用于生成悬垂NOTA或DOTA构筑体的分子。根据所用正交保护方案，可容许使用任一数目的具有末端乙酰基化Cys的连接体连接到C点的能力，包括(Ahx)2-Cys-Ac或PEG-Cys-Ac或由天然或非天然氨基酸-Cys-Ac组成的连接体。其还容许任一数目的螯合剂或荧光染料连接到D-Lys的侧链。
缩写
Ac-：乙酰基；Ahx：6-氨基己酸；Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧杂亚环己基)乙基；DIEA：N,N-二异丙基乙胺；EDT：1,2-乙二硫醇；Fmoc：9-芴基甲基氧基羰基；HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；HOBt：1-羟基苯并三唑；HPLC：高压液相色谱；-NCO：异氰酸酯；LC-ESI-MS：液相色谱-电喷雾离子化-质谱；Mtt：4-甲基三苯甲基；p-SCN：对异硫氰酸酯；Sta：抑胃酶氨酸(4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸)；tBu：叔丁基；SPPS：固相肽；TA：茴香硫醚合成；TFA：三氟乙酸；Trt：三苯甲基；TIS：三异丙基硅烷。
材料
所有试剂均是HPLC级或肽合成级。TFA、HBTU、HOBt得自奥克伍德产品公司(Oakwood Product INC),埃斯蒂尔(Estill),SC；所有Fmoc-氨基酸衍生物和2ClTrt树脂得自Chem-Impex国际公司，SC伊利诺伊州伍德戴尔(Wood Dale,IL)。所有溶剂(哌啶、DIEA、酚和TIS)由密苏里州圣路易斯市(St Louis,MO)的奥德里奇(Aldrich)公司购得。p-SCN-NOTA购自克萨斯州普莱诺德大环公司(Macrocyclics,Plano,TX)。
靶分子PSMAi-NOTA的合成方案
首先在人工反应容器(开格拉斯(Chemglass)，新泽西州瓦恩兰(Vineland,NJ))中在2-ClTrt树脂上加载经正交保护的构建组元Fmoc-Lys(Dde)-OH并移除Fmoc保护基团以得到化合物1。
同时通过使二-tBU保护的谷氨酸与三光气和DIEA在0℃下反应6h来制备谷氨酸异氰酸酯构建组元[OCN-Glu-(OtBu)2]。
在室温下异氰酸酯构建组元[OCN-Glu-(OtBu)2]与化合物1的游离α氨基过夜反应，在树脂上产生经完全保护的脲2。
通过2％肼移除Lys 2上的Dde保护基团，并且化合物3是通过使用AAPPTEC 396ω多重肽合成器(AAPPTEC,肯塔基州路易斯维尔(Louisville,KY))采用标准Fmoc化学品和标准SPPS在化合物2的Lys的ε-氨基上构建肽序列Ac-Cys-Ahx-Ahx-dLys-Ahx-来获得。经选择用于氨基酸侧链的持久保护基团是：Trt用于Cys，和Mtt用于Lys。Trt和Mtt保护基团是基于正交保护方案来选择。选择Mtt保护基团来保护Lys，使得可在不移除其它保护基团的情况下移除Mtt。例如，Cys上的Trt在1％TFA中不会脱离，但Lys上的Mtt可在1％TFA中移除。在某些实施例中，可使用其它正交保护方案。在每一后续循环通过用20％哌啶处理10min来移除Fmoc保护基团。通过用“原位”活化的Fmoc-氨基酸连续酰化(20min以供偶合)来组装肽链。在每一循环自动执行再偶合。
Fmoc-氨基酸(3eq.，与树脂的量相比)的“原位”活化是使用脲鎓盐(HBTU,2.7eq.,HOBT 3eq.)和DIEA(6eq.)来实施。
移除dLys上的Mtt保护基团，并且在同一反应中通过用1％TFA处理从树脂裂解呈原本经保护形式的化合物3。使所获得化合物4在DMF中与p-SCN-Bn-NOTA在DIEA存在下反应过夜，以获得NOTA标记的化合物5。
最后通过在以下清除剂以各自2.5％浓度存在下用TFA处理从化合物5移除侧链保护基团：苯酚、水、TIS、TA和EDT。
通过LC-MS表征靶分子(TM)PSMAi-NOTA且最后通过MS辅助的半制备型HPLC使用内部优化梯度来纯化。
分析和纯化
HPLC分析和半制备型纯化是在配备有168二极管阵列检测器、507e自动注射器和32KARAT软件包(贝克曼库尔特(Beckmann Coulter)，加利福尼亚州富勒顿(Fullerton,CA))的贝克曼库尔特系统金HPLC上执行。
用于HPLC的分析管柱购自赛默费舍尔(Thermo Fisher)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA)。(贝塔贝斯克(BetaBasic)C18,0.46cm×15cm,5μm)。对于制备型HPLC，所用管柱购自马萨诸塞州沃尔瑟姆的沃特世公司(Prep NovaPak,HR-C18,7.8×300mm,6μM,)。
将分析运行的流速维持在1mL/min，并且将半制备型纯化的流速维持在10ml/min。
用于监测此梯度的波长在分析运行中是214/280nm，并且对于半制备型运行是225/235nm。
所有运行中所用移动相洗脱液是水(A)和乙腈(B)，其各自含有0.1％TFA。用于分析粗制备物的梯度为：在30min中从10％到50％B的线性梯度。对于制备型纯化，可将极小部分流量(0.5mL/min)转向到MS离子阱，由此利用实时观察任何所洗脱物的m/z曲线的可能性。
此‘MS辅助制备型HPLC技术’显著促进原本极复杂的混合物的纯化。用于制备型纯化中的梯度是：在40min中从15％到35％B的线性梯度。ESI-MS：所有LC-MS分析和MS辅助的制备型纯化是用来自马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默费舍尔的LCQ Fleet执行。
与单独的放射性标记的PSMAi配体相比，使用连接到巨分子的PSMAi-螯合剂偶联物时肾摄取显著较少
图6A和6B显示67Ga-NOTA-PSMAi-C’点(图6A)和64Cu-NOTA-PSMAi-C’点(图6B)在三个时间点的活体外细胞结合数据。连接到纳米粒子的各PSMAi/螯合剂构筑体在PSMA表达高的LNCaP细胞中展现良好摄取和内化，并且在PSMA表达低的PC3细胞中具有较低摄取。阻断研究显示特异性摄取。数据还显示，放射性标记的PSMAi-C'点的摄取随时间稳定增加。
令人惊讶的是，似乎存在基于放射性核素的选择的摄取差异。例如，与64Cu组合物的摄取相比，67Ga标记组合物的摄取展现摄取差异。不希望受限于任何理论，此意外变化可由于可变阻断所致。
图7A显示在注射后24h，67Ga-NOTA-PSMAi-C'点在裸鼠(图7A)和带有LNCaP肿瘤的小鼠(图7B)中的生物分布。令人惊讶的是，67Ga-NOTA-PSMAi-C'点展现低肾摄取。
67Ga-NOTA-PSMAi-C'点的低肾摄取令人意外，这是因为其它PSMAi/螯合剂构筑体已显示高肾摄取(参见韦奈森(Weineisen)等人，核医学杂志(J Nucl Med)2015；56:1169-1179)(参见班纳吉(Banerjee)等人，医药化学杂志(J.Med.Chem.)2010,53,5333-5341)。因此，与游离PSMAi/螯合剂构筑体相比，将PSMAi/螯合剂构筑体连接到巨分子(例如纳米粒子(例如C'点))至少提供此益处。
图8A和8B显示注射后24h，LNCaP肿瘤的67Ga-NOTA-PSMAi-C点SPECT成像。图8A和8B显示在小鼠模型中投与0.5mCi 67Ga-NOTA-PSMAi-C点(图8A)或共注射0.5mCi 67Ga-NOTA-PSMAi-C和2-(膦酰基甲基)戊二酸(PMPA)(160μg/20g)(图8B)。PMPA是黑色，显示67Ga-NOTA-PSMAi-C点的摄取减少，从而显示特异性并确认图6A中呈现的活体外资料中呈现的结果。
构筑性实例2
测定并优化囊封NIR染料的靶向PSMA和GRPr的C'点的可调谐表面化学，以实现前列腺癌(PC)细胞系中的有利结合动力学/摄取
前列腺靶向C’点肽
Glu-脲-Lys PSMAi抑制剂和铃蟾素/胃泌素释放肽(GRP)拮抗剂的类似物经设计以含有用于放射性标记和用于连接到超微小(亚10nm)荧光核心-壳二氧化硅纳米粒子的官能团(图3、图9A-9D)。肽是使用标准固相肽合成来合成。PSMAi是通过使谷氨酸异氰酸酯构建组元与加载有NH2-Lys(Dde)-OH的2-ClTrt树脂反应以产生经完全保护的Glu-脲-Lys树脂来合成。在移除Dde保护后将肽序列Ac-Cys(Trt)-Ahx-Ahx-dLys(Mtt)-Ahx添加到树脂结合的Glu-脲-Lys的Lysε-氨基。最后，从dLysε-氨基移除Mtt基团且与pSCN-Bn-NOTA反应。通过TFA处理移除侧链保护基团。
GRP拮抗剂(Ac-Cys-Ahx-Ahx-Lys(DOTA)-4-氨基-1-羧基-甲基-哌啶-His-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)(SEQ ID NO:2)是通过固相肽合成(SPPS)基于RM2序列合成。Lys-DOTA是经由带正电荷的4-氨基-1-羧基甲基-哌啶连接体连接。
去保护PSMAi和GRP肽是通过LC-MS表征且通过MS辅助半制备型HPLC纯化。纯化肽是经由其N-末端Cys-硫醇偶联到马来酰亚胺-PEG-硅烷。将PSMAi-NOTA和GRP-DOTA PEG-硅烷偶联物与单官能PEG-硅烷一起添加到粒子合成溶液中用于表面附加到C’点。通过粒径筛析色谱从游离肽分离经偶联C’点。通过肽配体-PEG-硅烷对粒子的反应浓度比来估计每个粒子连接的肽数，并且使用肽吸光度光谱来确认。粒子重构是通过荧光关联光谱(FCS)分析来确认。
合成PSMA-HBED-CC-酰胺基乙基硫醇类似物且纳入C’点上。以二叔丁基保护的HBED-CC(ABX Chemicals)开始，一个游离羧酸经三苯甲基保护。将剩余游离羧酸如上文偶合到PSMAi。移除三苯甲基，并且羧酸经S-三苯甲基氨基乙基硫醇修饰。在酸性条件下实现全面去保护以产生所需PSMAi-HBED-CC-酰胺基乙基硫醇。然后使用硫醇-马来酰亚胺化学将化合物偶联到C’点。
竞争性细胞结合(IC50)
PSMAi-NOTA-C’点和GRP-DOTA-C’点肽分别使用相应67Ga标记肽在使用LNCaP和PC3前列腺癌细胞的竞争性前列腺癌细胞结合研究中检查(图10)。PSMAi-NOTA-C’点和GRP-DOTA-C’点肽的表观Kd值分别为4.92×10-9和3.38×10-8。
方法
表5显示根据本发明实施例，多种肽构筑体的改良的亲和性和粒子链接。例如，PSMA靶向和GRPr靶向肽序列可经化学调整以在偶联到马来酰亚胺官能化PEG链，然后偶联到在水性环境中合成的C’点时保存药效团活性。每个粒子的肽配体数可通过吸收光谱法来估计。C’点核心大小可经调节以优化反应性NIR染料数以使粒子亮度最大化。表5显示约8种具有不同连接体化学的C’点构筑体的实例且每个粒子的多个PSMAi和GRP配体可经调谐以使生物性质最大化。可使用竞争性结合研究来选择PK分析的最优选粒子探针。
表5
研发并表征原型荧光PSMAi偶联的C’点和GRP偶联的C'点。
本发明提供可用于告知PSMAi和GRP配体的连接、放射性标记、和相应原型C’点靶向平台的设计和表征策略。此外，本发明提供可用于允许C'点的较佳表面化学控制和放射性化学稳定性的水性环境中的合成方法。
结构优化PSMA靶向和GRPr靶向肽。
本发明还提供结构性优化PSMA靶向肽和GRPr靶向肽以在降低非靶组织摄取的同时增强PC摄取。例如，Glu-脲-Lys药效团与放射性金属螯合剂与连接体之间用于将肽偶联到粒子的Axh连接体部分(图9A-9D)可经PEG取代以增加亲水性(表5)。注意，偶联到PSMA靶向肽以及连接体的螯合剂的性质和电荷的变化显著影响肿瘤摄取，但对清除性质还具有更显著结果。例如，尤其对于肾和唾液腺，改良肿瘤对正常组织的比率对于放射性治疗应用很重要。或者，可检查将螯合剂直接偶联到粒子表面以改良这些平台的受体结合和摄取(图21)。
可采用SPPS化学使用Advanced ChemTech Tetras或AAPPTEC 396肽合成器来合成PSMAi、铃蟾素GRP和相关肽-螯合剂构筑体。可使用制备型LC-MS HPLC使用连接到LCQ-Fleet离子阱质谱仪(MS)的贝克曼库尔特系统鉴别和纯化靶化合物。可在粒子表面功能化之前将纯化肽经由N-末端Cys-硫醇偶联到马来酰亚胺封端的PEG-硅烷。或者，含有游离表面胺的粒子可通过聚乙二醇化后通过插入表面修饰(PPSMI，见下文)而与NHS或SCN螯合剂直接偶联。
合成并表征具有变化配体数的PSMAi-NOTA-C’点、PSMAi-HBED-CC-C’点、PSMAi-DFO-C’点和GRP-DOTA-C'点。
根据某些实施例，超微小(例如亚10nm)荧光核心-壳二氧化硅纳米粒子可经以下螯合肽功能化：PSMAi-NOTA、PSMAi-HBED-CC、PSMAi-去铁胺(DFO)和GRP-DOTA。例如，所述肽可在水性介质中从单批次反应合成。
图14显示合成步骤的简化流程图。简单地说，可将水溶性二氧化硅前体(TMOS；四甲氧基正硅酸盐)与分开制备的染料-硅烷偶联物一起添加到弱碱性约pH8的水中以加速硅烷水解和粒子形成。在明确界定的时间段后，粒子生长可通过同时添加带有肽配体的PEG-硅烷和PEG-硅烷来终止。在合成后，可将粒子提交到一组纯化和表征步骤。例如，纯化步骤可包括凝胶渗透色谱(GPC)以从聚集产物和游离染料分离粒子。此外，表征步骤可包括FCS以评价相对于水中的游离染料的流体动力学大小、浓度和亮度，包括荧光和光学光谱法以测定每个粒子的染料和配体数目，包括ζ-电位测量以评价粒子表面电荷，以及包括动态光散射(DLS)用于与FCS比较大小结果。
对于用于89Zr放射性标记的PSMAi-DFO的合成，研发一种方法，即聚乙二醇化后通过插入表面修饰(PPSMI)。在用普通PEG-硅烷以及带有PSMAi的PEG-硅烷进行聚乙二醇化步骤后，首先将少量官能性硅烷(例如胺-硅烷)引入聚乙二醇化表面，然后使其与DFO-NCS反应，由此在PEG链之间插入DFO分子(见图14)。DFO分子经有效放射性标记，得到在使用PSMA靶向C’点(图13)或整联蛋白靶向C’点的初始生物分布研究中所见的高靶向效率(高于10％ID/g)和肿瘤对背景的比率。在合成后，可如本文所述执行粒子纯化和表征。
改良光物理性质以提高检测灵敏度和组织对比度。
本发明提供改良所述纳米粒子组合物的最优选靶向效率和灵敏度。注意，对于每一类型的所选配体/靶向部分(例如PSMAi，例如GRPr抑制剂)，粒子需要再次优化以实现靶向效率和灵敏度的最优选结果。因此，每个粒子的配体数和随配体数而变的二氧化硅核心大小需要经优化，其继而可影响每个粒子的相关染料数，如通过FCS和光学光谱法的组合所测定。为此，除了改变给定纳米粒子大小的配体数用于约5到约100(例如约15到约20)的数目的更高离散配体数(对于其可发生粒径的可检测增加)以外，可执行实验，其中配体数保持恒定，但改变二氧化硅核心直径以找到亮度和靶向效率的最优选结果。此可例如通过在将硅烷添加到水性反应混合物和添加PEG-硅烷中止粒子生长后改变粒子生长步骤的时间来实现。粒子纯化和表征步骤保持不变。
PSMA-C’点和GRPr靶向C’点的活体外生物性质。
使用常规PSMA表达细胞系和GRPr表达细胞系，可基于竞争性结合分析和光学检测方法测定先导PSMAi结合和GRP结合C’点候选者对其相应靶PSMA和GRPr的结合亲和性、功效和特异性。可将每一组合物的结果与使用原型PSMAi-NOTA-C’点和GRP-DOTA C’点和天然PSMA和GRP肽得到的结果相比较。例如，可测定C’点构筑体在10-13到10-5mol/L范围内的IC50或抑制50％标准放射性标记的PSMAi激动剂和GRP拮抗剂结合所需的C’点浓度。可对PSMAi和GRP肽构筑体执行与125I-[博尔顿-亨特(Bolton-Hunter)]标记的Glu-脲-Lys(PSMAi)和125I-(Tyr4)-铃蟾素的竞争性结合分析以及有限PK研究。此外，C’点经由胞吞路径的细胞运输还可使用荧光报告剂来研究，并使用间时显微术检查与所摄取荧光粒子的共定位。
筛选人类前列腺类器官培养物和PC系的转移子克隆中PSMA和/或GRPr靶表达程度的变化，以选择用于活体内实验的先导候选者。
还可在人类细胞系中测试所述组合物以选择用于活体内应用的候选者。可使用抗体介导的检测在以下各项中利用IHC评价PSMA(达扣(Dako)，M3620，克隆3E6，1:100稀释度)和GRPR(艾博抗(Abcam)，ab39963；5μg/ml)靶蛋白表达程度：(1)PC系(例如LAPC4、VCaP)的转移子克隆；(2)通过RNA-seq表达PSMA(FOLH1)(n＝7；例如MSK-PCa1、-PCa3、-PCa5、-PCa8、-PCa9、-PCa10、-PCa11)或GRPr转录物(n＝1；MSK-PCa1)的患者源人类前列腺类器官培养物(图22)；和(3)常规细胞系(例如LNCaP、PC3)，其用作其相应靶的对照。对于每一标记物，可在1-100％的强度百分比范围内为IHC染色强度分配1、2或3的评分。此可与表达PSMA或GRPr的细胞的％一起用于界定用于选择活体内研究的先导候选者的H评分。正位注射的类器官培养物可发生皮肤或转移肿瘤，以及导致LN、骨骼和其它软组织转移的具有高转移效率的子克隆；这些是高度相关的模型，这是因为其基因型/表型重述人类前列腺生物学的关键特征。表达所关注靶的细胞可用于活体内实验。
此外，带有可变数目的靶向肽的C’点的最大差异性结合/摄取、特异性、IC50和毒性可用于选择先导候选者。在一定范围的粒子浓度和培育时间下培育细胞后，可通过光学检测和/或γ计数方法来测定结合百分比(％)；可用锥虫蓝细胞存活率分析(Vi-细胞存活率分析仪)来测量存活细胞％。
可在常规PC细胞系中基于最大差异性摄取和受体结合参数(K0、Bmax、IC50)使用活体外结合实验来测定最优选肽化学和所靶向C'点设计。可使用具有确切或排列参考分布的秩检定来比较不同配体数之间的参数。为测定用于活体内应用的先导候选细胞系，可使用相同统计方法来比较H评分。
构筑性实例3
在PSMA和GRPr阳性模型中评价优化C’点成像探针的肿瘤选择性摄取和PK曲线，以鉴别具有有利靶向动力学和清除曲线的候选者。
放射性核素
多种放射性核素可与所述组合物一起使用。例如，铜-64(t1/2＝12.7小时，β+＝0.65MeV，β-＝0.58MeV)半衰期和衰变特征与粒子的生物分布完全匹配，并且适于PET成像。或者，例如，镓-67(t1/2＝78小时，91、93、185、296和388keVγ-发射)因电子捕获而衰变，并且可通过SPECT成像。铜和镓二者由NOTA有效螯合。较长半衰期容许在晚于24h的时间点成像。此外，锆-89(t1/2＝78小时，β+ avg＝395keV)是正电子发射放射性核素，其可用于在与C’点的药物代谢动力学一致的较长时间点PET成像。89Zr可通过DFO螯合或经由表面硅醇基团直接配位到微孔二氧化硅纳米粒子。
放射性标记的PSMAi-NOTA-C’点和GRP-DOTA-C’点
PSMAi-NOTA-C’点(21pmol)在NH4Ac缓冲液(pH 5.5)中在70℃下经64Cu或177Lu(210pmol)放射性标记20min。平均放射性标记产率为98.6％和99.3％，其中放射化学纯度为98％和99.9％。在水、盐水和血清中检查放射性标记的粒子复合物的稳定性(表1)。
表1显示放射性标记的C’点稳定性的百分比。
表1
放射性标记的粒子细胞结合
检查PSMAi-(64Cu)NOTA-C’点和GRP-(177Lu)DOTA-C’点与LNCaP和PC3细胞的细胞结合(图11A-11C)。将细胞与100,000CPM的PD10纯化的放射性标记的C’点一起培育。使用PMPA和铃蟾素阻断PSMAi和GRP放射性标记的C’点。在3次PBS洗涤后，用40mM NaOAc(pH＝4.5,0.9％NaCl,0.2％BSA)移除膜表面结合部分，之后将细胞溶解于NaOH中以获得内化计数。在1h、4h和24h的时程摄取研究揭露最优选结合是在24h时实现。所结合PSMAi-(64Cu)NOTA-C’点内化到LNCaP细胞中。结合和内化由PSMA抑制剂PMPA阻断，显示PSM非特异性。不表达PSMA的PC3细胞显示显著较低的结合。使用PSMAi-(67Ga)NOTA-C’点观察到类似结果(数据未显示)。但结合GRP-(177Lu)DOTA-C’点的PC3细胞未有效内化。结合由铃蟾素阻断，显示对GRPr的特异性。使用不表达GRPr的LNCaP细胞时仅观察到低程度的结合。
使用64Cu和89Zr标记的PSMAi-C’点的生物分布和肿瘤靶向
经64Cu放射性标记、且在PD10管柱上纯化的PSMAi-NOTA-C’点具有97.5％的RCP和2.46Ci/μmol的比活性。经由尾静脉向正常CD-1小鼠注射100μl盐水中的20μCi的PSMAi-(64Cu)NOTA-C’点。在预定时间点杀死多组小鼠，解剖组织并称重，并且将放射性定量。图12显示呈现为％注射剂量/克(％ID/g)组织的数据。PSMAi-(64Cu)NOTA-C’点从血液快速消失且主要经由肾排泄。在p.i.24-h，正常组织中的粒子摄取小于5％ID/g，包括肝和脾。使用标准人(70Kg)医学内部辐射剂量形式法执行剂量测定法计算。C57小鼠中的PK数据是使用OLINDA来计算(表2)。发现剂量测定法以每mCi计在正常器官中有利，与其它常用诊断性放射示踪剂的那些相当。数据未产生关于过量正常器官剂量的问题。
表2
还研发89Zr标记的PSMAi-C’点(例如PSMAi-(89Zr)DFO-C’点)并测试在PSMAi阳性(LNCaP)和阴性肿瘤(PC-3)模型中的特异性肿瘤靶向。如图13中所示(插图)，在带有LNCaP肿瘤的小鼠中观察超过两倍的肿瘤摄取增强(约9％ID/g相对于约3.5％ID/g)。在p.i.72h的离体生物分布进一步确认如所设计的探针的特异性肿瘤摄取(图13)。在p.i.24h，活体内放射稳定性大于90％。放射自显影进一步确认PSMAi-(89Zr)DFO-C’点在PSMA阳性肿瘤模型中的特异性摄取和组织渗透(图13-插图)。
方法
在用放射性金属优化标记程序后，筛选分析可确定可选择哪种先导候选粒子探针和细胞系进行内化、PK和肿瘤靶向研究。例如，通过初始PK评估在带有肿瘤的小鼠中确立的靶向效率、清除、剂量测定法和产物放射稳定性可用于鉴别用于具有组织学关联的原发性病灶和转移疾病的活体内成像评估的先导粒子产物。
优化用64Cu、67Ga或89Zr对PSMAi偶联的C’点和GRP偶联的C'点进行表面放射性标记的条件。
在最后步骤中，靶向PSMA和GRPr的C’点可在70℃下经64Cu和67Ga以不同浓度(约0.3-300nmol)在乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中放射性标记30min，以获得PSMAi-(64Cu)NOTA-C'点和GRP-(67Ga)DOTA-C’点。对于89Zr标记，可将如所合成的PSMAi-DFO-C’点与89Zr-草酸盐在37℃下一起培育30min(pH 7-8)。放射标记的PSMA靶向C’点和GRPr靶向C’点可使用PD-10(G-25)粒径筛析色谱纯化。对于放射标记实验，可针对最优化放射标记效率和高特异性活性测定特异性放射标记参数。标记可始于显示产生最高比活性的条件。质量控制包括ITLC、HPLC和基于细胞的受体结合生物分析。放射标记的C’点的稳定性可在H2O、PBS中在25℃下以及在小鼠和人类血清中在37℃下测定。
放射性标记的C’点的细胞内化和流出.
使用放射性标记的粒子偶联物，可基于使用间时显微术和活体外分析的结合和内化研究来研究在表达PSMA和表达GRPr的LNCaP和PC3细胞中的粒子分布。可将放射性标记的C’点示踪剂与细胞随时间(0.5-4h)一起培育，用酸性缓冲液洗涤以移除膜结合粒子，并且在细胞和酸性洗涤部分中将放射性定量。结合特异性可通过在与结合研究相同的时间范围内将C’点示踪剂与过量未经放射性标记的PSMAi和GRP肽和C’点一起培育来测定。放射性的流出量可通过容许细胞摄取放射性标记的粒子、用酸性缓冲液洗涤、更换细胞培养基和监测释放回培养基中的放射性来测定。非特异性结合可通过用用于PSMA的PMPA和用于GRPr拮抗剂结合的RM2肽阻断受体靶来测定。
此外，可在衍生自常规/转移细胞系的皮下和正位模型以及最大表达一种/两种靶的基于人类前列腺类器官的模型中对先导PSMAi偶联的C’点示踪剂和GRP偶联的C’点示踪剂执行PK筛选和活体内成像，以鉴别具有有利靶向/清除动力学的探针。
例如，可在将每种放射性标记的先导候选者PSMA、GRPr靶向粒子示踪剂静脉内(i.v.)注射到以下小鼠中之后，执行所提供组合物的筛选PK研究：(i)无肿瘤的无胸腺nu/nu小鼠(n＝3只小鼠/C’点示踪剂；约20μCi/小鼠)和(ii)带有NOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid)肿瘤的小鼠的单独同类群组(每个同类群组至少3只动物)。例如，可研究以下肿瘤异种移植物：使用15.0×106个细胞(例如LNCaP、22RV1、PC3)的常规模型、使用15.0×106个细胞(例如表达PSMA+的LAPC4、VCaP)的转移子克隆，和使用5.0×105个细胞的类器官模型。其它同类群组用作生物对照(例如PC3，用于非PSMA模型)。可在p.i.至多72小时的4个指定时间点杀死小鼠，以选择先导C’点产物用于后续PET和SPECT成像。可在井式闪烁计数器中评价重要器官、肿瘤、血液和尿液的衰变校正的注射剂量/克的百分比(％ID/g)值。可使用分析型放射性HPLC和放射性TLC来评价生物样本中的放射稳定性和代谢物。
活体内PET成像和分析.
可使用产生最大靶向肿瘤摄取的粒子示踪剂和肿瘤模型、清除曲线、剂量测定法和放射稳定性来鉴别用于PET和SPECT成像以及用于转移淋巴结定位实验的单一先导PSMAi功能化C’点探针或GRP功能化C’点探针。对于成像评估，可在i.v.注射约300μCi的C’点示踪剂/小鼠后，在72-hr间隔中，连续扫描(例如15-30min静态图像)小鼠的单独同类群组(每个同类群组n＝10)。可在肿瘤区域中和在重要器官/组织中执行目标区域(ROI)分析以记录平均活性和靶:背景比率。
构筑性实例4
从先导C'点候选者研发含有光谱不同的NIR染料的产物，以在临床前模型中使用多重化策略和相关组织学鉴别表达PSMA的淋巴结转移、表达GRPr的淋巴结转移
所提供组合物可包含含有光谱不同的NIR染料的产物以鉴别临床前模型中的淋巴结转移。
例如，如图14中所示，将Cy5.5和CW800染料-硅烷偶联物与TMOS一起添加到反应混合物中，以生成染料囊封二氧化硅核心，其经表面官能化以产生最终靶向且经放射性标记的粒子产物，全部呈一锅式工艺。通过FCS，测定本文所用PSMAi-PEG-Cy5.5-C’点(表3)和GRP-PEG-CW800-C’点(表4)的代表性批次的每粒子大小和亮度指数。
与通常利用结合到单一靶的非特异性荧光染料或探针的常规方法相比，根据某些实施例，可使用多重化成像策略，其使得能同时对淋巴系统内的多种癌症标记物进行光学检测。此可在手术中环境中促进更早检测，改良表征，并且更准确地定位分子癌症表型。在动物模型和人类中，所述多重化工具提供解决癌症靶表达、分期和治疗管理的异质性的检测能力。此外，这些成像策略用作可靠、实时的手术中路线图以在SLN生检或切除期间指导做手术之外科医生。
在概念验证(proof-of-concept)大型动物转移黑色素瘤研究中，实施基于荧光的多重化研究(以及手术前PET)以通过分析多种癌症标记物(具体来说整联蛋白和黑皮质素-1受体MC1-R(例如α-黑色素细胞刺激激素αMSH的靶))来确定使用粒子介导的检测进行的实时图像指导的肿瘤表型分型是否鉴别转移淋巴结。采用两种含有光谱不同的NIR染料的C’点，其各自经不同黑色素瘤导向肽(例如cRGDY-PEG-CW800-C'点(如SEQ ID NO:1所揭示的“cRGDY”)和αMSH-PEG-Cy5.5-C'点)功能化。在代表性小型猪中，在脊椎旁黑色素瘤病灶(未显示)附近真皮下、瘤周注射这些放射性标记的粒子之一124I-cRGDY-PEG-CW800-C'点(如SEQ ID NO:1所揭示的“cRGDY”)之后，首先执行PET-CT筛选用于鉴别转移淋巴结疾病。在高分辨率PET-CT成像(图15，右上图、右下图)上的左上/左下颈中见到PET-avid淋巴结(箭头)。标记淋巴结，并将猪送入手术室中以供共注射2.0纳摩尔的光谱不同的“冷”cRGDY-PEG-CW800-C'点(如SEQ ID NO:1所揭示的“cRGDY”)和αMSH-PEG-Cy5.5-C’点的每一者(图16A)。执行实时光学成像指导，其显示定位到引流原发性肿瘤位点的肿瘤淋巴管和淋巴结的高荧光信号(顶部到底部)。在多通道荧光照像机系统的700nm(绿色；αMSH-Cy5.5-C’点)和800nm(红色；cRGDY-CW800-C’点(如SEQ ID NO:1所揭示的“cRGDY”))通道中检测病理学证实高(图16A；第3列)和低(图16A；第5列)肿瘤负荷淋巴结中的信号；黄色信号反映每一淋巴结中两种信号(例如标记物)的共表达。高肿瘤负荷淋巴结的相关组织病理学(图16B，上图)显示在高功率共焦显微图像上，基于H&E染色和相应高Cy5.5荧光信号，所述淋巴结完全经黑色素瘤置换。取自此高肿瘤负荷淋巴结的切片的相对荧光强度(图16B，下图)还显示用DAPI复染对MC1R靶向粒子和整联蛋白靶向粒子二者的共定位。不希望受限于任何理论，此数据表明粒子探针在此黑色素瘤置换的淋巴结中的特异性结合/累积。为提高检测微小转移的灵敏度，并且为容许区分黑色素瘤细胞与充满黑色素的巨噬细胞，通过免疫组织化学(IHC)针对HMB-45和MITF以及整联蛋白将所选切片染色(图16C)。MiTF是黑色素瘤细胞中通过MC1-R活化上调的转录因子，其在取自高肿瘤负荷淋巴结(“LN”)和原发性肿瘤组织的多个切片中呈阳性。
用于转移疾病在淋巴结和其它组织中的定位的PC转基因小鼠模型
本文所提供实例使用转基因腺癌小鼠前列腺(TRAMP)癌症模型。前列腺癌在其中前列腺上皮中SV40-T抗原致癌基因由大鼠前列腺碱性蛋白(probasin)基因启动子驱动的小鼠中发生。TRAMP模型的特征为在4-7个月内发生前列腺神经内分泌癌，并且在4-9个月内在LN、肺、肾上腺和骨骼中形成转移。转移发病率接近100％。
TRAMP模型的优点是发生的疾病在免疫感受态小鼠中反映人类病理学，以及形成LN和骨转移。缺点在于，小鼠前列腺的生物学/生理学与人类器官不同。例如，小鼠前列腺并非如人类中一般是单一器官，而是具有4个叶，与单一器官人类前列腺不同。TRAMP模型的优点是能使用PET和基于荧光的多重化使具有PSMA和GRPr靶向C’点的转移疾病和淋巴结转移成像。检查PSMAi-(67Ga)NOTA-C’点和GRP-(177Lu)DOTA-C’点与TRAMP-C2细胞系的结合研究(图17)。TRAMP-C2细胞系衍生自TRAMP前列腺肿瘤。PSMAi-(67Ga)NOTA-C’点和GRP-(177Lu)DOTA-C’点二者都结合TRAMP-C2细胞系。PSMAi-(67Ga)NOTA-C’点结合可通过添加PSMA抑制剂PMPA显著减少，而GRP-(177Lu)DOTA-C’点结合通过添加过量GRPr靶向RM2肽而显著减少，此显示两种C’点偶联物与TRAMP细胞系的选择性和受体介导的结合。此模型使得能实施概念验证研究以供使用PSMAi-PEG-Cy5.5-C’点和GRP-PEG-CW800-C’点的混合(cocktail)进行淋巴结转移的多重化检测。
虽然小鼠模型已对鉴别高级前列腺上皮内瘤样病变病灶和局部侵袭性前列腺癌中所涉及的遗传病灶做出贡献，但大多数小鼠模型在对进展到转移疾病建模时较不准确。最近，若干种自发和实验转移模型(例如LAPC4(和VCaP)子克隆)已显示高转移效率(例如约70-80％；未公开数据)，具有激素依赖性生长和转移的所得特征。一种此类LAPC4转移子克隆(图18A-18C)可更优选地重述人类疾病。在心内注射表达荧光素酶(luc+)的LAPC4转移子克隆后，每周用生物发光成像(BLI)和18F-氟化钠(NaF)监测小鼠。使用此模型，在数月过程期间在80％小鼠中的多个器官(肝、肾和骨)中基于双模态(PET-BLI)成像检测转移肿瘤。
方法
这些研究可与1期临床试验平行执行，并且可用于对可在1期试验和在多重化临床试验设计中验证的可靠生物标记物进行鉴别和资格审定。
TRAMP模型
基于在已充分建立的TRAMP小鼠模型中显示PSMA和GRPr(图17)靶的共表达的数据(https://www.jax.org/strain/003135)，可在i.v.注射18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)后截至至少30周龄使用PET-CT成像针对转移淋巴结和转移疾病的其它位点(例如骨)执行TRAMP小鼠的初始筛选。此后可进行先导双模态(PET-光学)C’点探针的单一剂量i.v.注射(1-2天后)，所述探针用于靶向表达(i)PSMA(n＝10只小鼠)、(ii)GRPr(n＝10只小鼠)或(iii)两种标记物(n＝10只小鼠)的肿瘤、淋巴结或其它转移。
根据某些实施例，使用用于淋巴结疾病的多重化检测(参见数据，图16A-16C)的多光谱荧光照像机系统(例如Quest Spectrum)使所述组合物成像。在这些研究中，疾病定位的定时可通过在i.v.粒子示踪剂注射后每周混合PET-MR成像扫描来优化。一旦鉴别PET-avid疾病，可在手术暴露后且使用用于在一个或两个荧光通道(例如Cy5.5、CW800)检测光学信号的Quest SpectrumTM照像机来评价光学信号强度关于其是否足以使转移疾病位点(例如淋巴结)可视化。
在已确定前述条件用于此模型中的每一先导候选C’点探针的原发性/转移疾病检测时，可重复作为多重化实验的实验以独立获取每一未经放射性标记的探针的数据(n＝10只小鼠/C’点探针)，然后一起获取(n＝10只小鼠)。对于NIR光学成像评估，最大原位肿瘤、淋巴结和背景信号强度可使用用于照像机系统的ROI分析工具(结构师可视套件(Architector Vision Suite)，QMI)来测量，并且需要对比:背景比率大于或等于1.1(临床试验研究中所用)才可视为阳性。重要的是，活体内检测灵敏度还可通过将连续粒子稀释液注射到前列腺本身中并在不同增益、曝光时间和照像机工作距离测量光学信号来测定。
转移模型(LAPC4、VCaP、PC3).
然后可通过经由剖腹术将5.0×105个表达荧光素酶(luc+)的VCaP、LAPC4或PC3细胞正位注射到NOD-SCID小鼠(每种细胞类型n＝10只小鼠)的前列腺中来将上述程序应用于自发转移模型。可在p.i.3周手术移除原发肿瘤以使得能长期监测转移淋巴结疾病。原发性和转移肿瘤可每周通过BLI成像。对于这些高度转移模型，可在p.i.3-4周间隔期间在约70％小鼠中全身(包括LN)检测转移。
临床PET实验已显示68Ga-RM2示踪剂在新诊断的PC病灶中(图19)或在具有PC生物化学复发的患者的转移LN中(图20A-20B)的高摄取。在后一情形中，投与68Ga-RM2和68Ga-PSMA-11示踪剂二者，注意使用68Ga-RM2时淋巴结的可视化显著更优选；此观察结果强调在这些患者同类群组中检查多种临床PC标记物的重要性。值得注意的是，除了68Ga-RM2探针的高胰脏摄取(右图)以外，注意到PSMA靶向探针的极高RES和肾摄取(左图)。
序列表
<110> 纪念斯隆凯特林癌症中心
康奈尔大学
密苏里大学董事会
<120> 抑制剂-功能化超微小纳米粒子和其方法
<130> 2003080-1491
<140>
<141>
<150> 62/427,845
<151> 2016-11-30
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=“人工序列说明：合成肽”
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(4)
<223> /注意=“环状”
<400> 1
Arg Gly Asp Tyr
1
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=“人工序列说明：合成肽”
<220>
<221> source
<223> /注意=“N-末端经4-氨基-1-羧基-甲基-哌啶修饰”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 抑胃酶氨酸
<400> 2
His Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Leu
1 5

Claims (81)

1.一种组合物(例如偶联物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂PSMAi/螯合剂构筑体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述构筑体具有以下结构：
其中：
L1是包含1到约10个天然或非天然氨基酸残基的肽片段，或任选地经取代的二价C1-20饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；
L2是任选地经取代的二价C1-10饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；
L3是共价键或衍生自能将所述PSMAi/螯合剂构筑体的反应性部分与所述巨分子的反应性部分偶联的双官能交联试剂的交联剂，
各-Cy-独立地是具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5到8元二价饱和、部分不饱和或芳基环或具有0到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8到10元二价饱和、部分不饱和或芳基二环；
Y是螯合剂部分；且
R是氢、C1-6烷基或氮保护基团；
其中除非另有指示，否则各氨基酸残基可在其末端和/或侧链基团上经保护或未经保护。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中L1是包含1、2、3、4或5个天然或非天然氨基酸残基的肽片段。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中L1包含一个或两个6-氨基己酸Ahx单元。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中L1是-Ahx-Ahx-。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中L1是C1-10饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-NR-、-O-或-C(O)-。
7.根据权利要求2或6所述的组合物，其中L1包含一或多个-(CH2CH2O)-或-(OCH2CH2)-单元。
8.根据权利要求2到7中任一权利要求所述的组合物，其中L2是C1-3饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-或-C(O)O-。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中L2是C1-3饱和或不饱和、直链或具支链烃链，其中所述烃链的1、2或3个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-NR-或-C(O)-。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中-Cy-是亚苯基。
11.根据权利要求8到10中任一权利要求所述的组合物，其中L2是-C(O)-或-C(O)NH-亚苯基。
12.根据权利要求2到11中任一权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂是DOTA。
13.根据权利要求2到11中任一权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂是NOTA。
14.根据权利要求2到13中任一权利要求所述的组合物，其中L3衍生自能将所述PSMAi/螯合剂构筑体上的硫氢基与所述巨分子的部分偶联的双官能交联试剂。
15.根据权利要求2到13中任一权利要求所述的组合物，其中所述双官能交联试剂是马来酰亚胺或卤代乙酰基。
16.根据权利要求2到13中任一权利要求所述的组合物，其中所述双官能交联试剂是马来酰亚胺。
17.根据权利要求2到16中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子是纳米粒子(例如超微小纳米粒子，例如C点，例如C’点)。
18.根据权利要求2到17中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子的直径不大于20nm(例如直径不大于15nm，例如直径不大于10nm)。
19.根据权利要求2到18中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子包含：
基于二氧化硅的荧光纳米粒子，其包含：
基于二氧化硅的核心；
在所述核心内的荧光化合物；
包围所述核心的一部分的二氧化硅壳；
连接到所述纳米粒子、由此包覆所述纳米粒子的有机聚合物，
其中所述纳米粒子的直径不大于20nm。
20.根据权利要求2到19中任一权利要求所述的组合物，其中1到100(例如1到60，例如1到50，例如1到30，例如1到20)个PSMAi配体连接到所述巨分子。
21.根据权利要求2到20中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含放射性标记(例如89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I、177Lu、225Ac、212Pb、67Cu和211At)。
22.根据权利要求2到11或12到21中任一权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂包含选自由以下组成的群组的成员：N,N'-双(2-羟基-5-(羧基乙基)-苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸HBED-CC HBED-CC、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸DOTA、二亚乙基三胺五乙酸DTPA、去铁胺DFO和三亚乙基四胺TETA。
23.根据权利要求2到12和14到22中任一权利要求所述的组合物，其包含：
24.根据权利要求2到11和13到22中任一权利要求所述的组合物，其包含：
25.一种制备根据权利要求1到24中任一权利要求所述的组合物的方法，所述方法包含：
将包含适宜保护基团的经正交保护的赖氨酸构建组元(例如Fmoc-Lys(Dde)-OH)加载于树脂(例如2-ClTrt树脂)上(例如在人工反应器中)；
从所述树脂移除所述适宜保护基团以产生第一化合物；
使经保护谷氨酸(例如经二-tBU保护)与适宜试剂(例如三光气和DIEA，例如在0℃下6h)接触(例如在移除步骤的同时)，以产生谷氨酸异氰酸酯构建组元[OCN-Glu-(OtBu)2]；
使所述异氰酸酯构建组元[OCN-Glu-(OtBu)2]与所述第一化合物的游离α氨基接触(例如过夜，例如在室温下)，以在所述树脂上产生第二化合物上的经完全保护的脲。
26.根据权利要求25所述的方法，其中通过移除所述第二化合物的Lys上的保护基团(例如通过2％肼)使所述第二化合物进一步反应；
通过在所述第二化合物的所述Lys的ε-氨基上构建肽序列(例如Ac-Cys-Ahx-Ahx-dLys-Ahx-)来获得第三化合物；
如果适当，移除适宜保护基团(例如Trt用于Cys和Mtt用于Lys)(例如经由用20％哌啶处理例如10min)；
任选地，经由用“原位”活化的经适当保护的氨基酸(例如其中“原位”活化的Fmoc-氨基酸是使用脲鎓盐和DIEA来实施)连续酰化(例如20min用于偶合)来组装(例如和在各循环再偶合)肽链；
移除dLys上的适宜保护基团(例如在同一反应中)；
从所述树脂裂解所述第三化合物(例如经由TFA处理)以产生第四化合物；
使所述第四化合物与适宜螯合剂试剂(例如p-SCN-Bn-NOTA)在适宜碱存在下接触(例如过夜，例如在DMF中)，以产生经螯合剂标记(例如NOTA标记，例如DOTA标记，例如HBED-CC标记)的第五化合物；
从所述第五化合物移除保护基团(例如经由TFA，例如在清除剂(例如以2.5％w/v浓度)存在下(例如其中所述清除剂包含苯酚、水、TIS、TA和EDT中的一或多者))，以产生第六化合物(例如靶分子，例如PSMAi-NOTA，例如PSMAi-DOTA，例如PSMAi-HBED-CC)；
任选地纯化所述第六化合物；且
将所述第六化合物连接(例如共价地，例如马来酰亚胺化学)到巨分子(例如纳米粒子(例如C’或C点)，例如聚合物，例如蛋白质)；
(例如使用三苯甲基型保护基团(例如Trt、Cl-Trt、Mtt、Mmt)或类似基团选择性保护双保护的HBED-CC)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第三化合物是或包含：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述第三化合物是：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护。
29.一种化合物：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护，并且其中一个氨基酸任选地连接到树脂。
30.一种化合物：
其中一或多个氨基酸侧链基团或末端任选地经适宜保护基团保护，并且其中一个氨基酸任选地连接到树脂。
31.一种化合物，其选自：
32.一种化合物，其选自：
33.一种治疗疾病或病况的方法，所述方法包含：
向个体投与包含根据权利要求1到24中任一权利要求所述的组合物的医药组合物(例如以靶向特定类型的组织(例如癌组织)(例如前列腺癌组织))。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述医药组合物进一步包含载剂。
35.一种活体内成像(例如手术中成像)方法，所述方法包含：
向个体投与根据权利要求1到24中任一权利要求所述的组合物(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部))，其中所述组合物包含成像剂；和
检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
36.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂PSMAi/螯合剂构筑体，
其用于治疗个体的癌症(例如前列腺癌)的方法中，其中所述治疗包含将所述组合物递送到所述个体。
37.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂PSMAi/螯合剂构筑体，
其用于活体内诊断个体的癌症(例如前列腺癌)的方法中，所述活体内诊断包含：
将所述组合物递送到所述个体(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部))，其中所述组合物包含成像剂；和
检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
38.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂PSMAi/螯合剂构筑体，
其用于(a)治疗个体的癌症的方法中，或(b)活体内诊断个体的癌症的方法中，其中所述方法包含：
将所述组合物递送到所述个体(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部))，其中所述组合物包含成像剂；和
检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
39.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂PSMAi/螯合剂构筑体，其用于疗法中。
40.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的前列腺特异性膜抗原抑制剂PSMAi/螯合剂构筑体，其用于活体内诊断中。
41.根据权利要求36到40中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子是纳米粒子(例如超微小纳米粒子，例如C点，例如C’点)。
42.根据权利要求36到41中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子的直径不大于20nm(例如直径不大于15nm，例如直径不大于10nm)。
43.根据权利要求36到42中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子包含：
基于二氧化硅的荧光纳米粒子，其包含：
基于二氧化硅的核心；
在所述核心内的荧光化合物；
包围所述核心的一部分的二氧化硅壳；
连接到所述纳米粒子、由此包覆所述纳米粒子的有机聚合物，
其中所述纳米粒子的直径不大于20nm。
44.根据权利要求36到43中任一权利要求所述的组合物，其中1到20个PSMAi配体连接到所述巨分子。
45.根据权利要求36到44中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含放射性标记(例如89Zr、64Cu、68Ga、86Y、1241、177Lu、225Ac、212Pb和211At)。
46.根据权利要求36到45中任一权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂包含选自由以下组成的群组的成员：N,N'-二(2-羟基苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸单盐酸盐HBED-CC、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸DOTA、二亚乙基三胺五乙酸DTPA、去铁胺DFO和三亚乙基四胺TETA。
47.根据权利要求36到46中任一权利要求所述的组合物，其包含：
48.根据权利要求36到46中任一权利要求所述的组合物，其包含：
49.一种组合物(例如偶联物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体包含以下序列的肽：
其中：
L2是任选地经取代的二价C1-10饱和或不饱和、直链或具支链的烃链，其中所述烃链的一或多个亚甲基单元任选地且独立地经以下基团置换：-Cy-、-CHOH-、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(＝S)-或-C(＝NR)-；
各-Cy-独立地是具有0到4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的5到8元二价饱和、部分不饱和或芳基环或具有0到5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选地经取代的8到10元二价饱和、部分不饱和或芳基二环；
Y是螯合剂部分；且
R是氢、C1-6烷基或氮保护基团；
其中除非另有指示，否则各氨基酸残基可在其末端和/或侧链基团上经保护或未经保护。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体经由所绘示半胱氨酸残基经由L3共价连接到所述巨分子，
其中，L3是共价键或衍生自能将所述铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体的反应性部分与所述巨分子的反应性部分偶联的双官能交联试剂的交联剂。
52.根据权利要求51中任一权利要求所述的组合物，其中L3衍生自能将所述铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体上的硫氢基与所述巨分子的部分偶联的双官能交联试剂。
53.根据权利要求51到52中任一权利要求所述的组合物，其中所述双官能交联试剂是马来酰亚胺或卤代乙酰基。
54.根据权利要求51到53中任一权利要求所述的组合物，其中所述双官能交联试剂是马来酰亚胺。
55.根据权利要求51所述的组合物，其中L2是共价键。
56.根据权利要求50到55中任一权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂是DOTA。
57.根据权利要求50到55中任一权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂是NOTA。
58.根据权利要求50到57中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子是纳米粒子(例如超微小纳米粒子，例如C点，例如C’点)。
59.根据权利要求50到58中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子的直径不大于20nm(例如直径不大于15nm，例如直径不大于10nm)。
60.根据权利要求50到59中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子包含：
基于二氧化硅的荧光纳米粒子，其包含：
基于二氧化硅的核心；
在所述核心内的荧光化合物；
包围所述核心的一部分的二氧化硅壳；
连接到所述纳米粒子、由此包覆所述纳米粒子的有机聚合物，
其中所述纳米粒子的直径不大于20nm。
61.根据权利要求50到60中任一权利要求所述的组合物，其中1到100(例如1到60，例如1到50，例如1到30，例如1到20)个铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体连接到所述巨分子。
62.根据权利要求50到61中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含放射性标记(例如89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I、177Lu、225Ac、212Pb、67Cu和211At)。
63.根据权利要求50到55和58到62中任一权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂包含选自由以下组成的群组的成员：N,N'-双(2-羟基-5-(羧基乙基)-苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸HBED-CC HBED-CC、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸DOTA、二亚乙基三胺五乙酸DTPA、去铁胺DFO和三亚乙基四胺TETA。
64.根据权利要求50到56和58到63中任一权利要求所述的组合物，其包含：
65.根据权利要求50到55和57到63中任一权利要求所述的组合物，其包含：
66.一种治疗疾病或病况的方法，所述方法包含：
向个体投与包含根据权利要求45到59中任一权利要求所述的组合物的医药组合物(例如以靶向特定类型的组织(例如癌组织)(例如前列腺癌组织))。
67.根据权利要求60所述的方法，其中所述医药组合物进一步包含载剂。
68.一种活体内成像(例如手术中成像)方法，所述方法包含：
向个体投与根据权利要求49到65中任一权利要求所述的组合物(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部))，其中所述组合物包含成像剂；和
检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
69.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体，
其用于治疗个体的癌症(例如前列腺癌)的方法中，其中所述治疗包含将所述组合物递送到所述个体。
70.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体，
其用于活体内诊断个体的癌症(例如前列腺癌)的方法中，所述活体内诊断包含：
将所述组合物递送到所述个体(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部))，其中所述组合物包含成像剂；和
检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
71.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体，
其用于(a)治疗个体的癌症的方法中，或(b)活体内诊断个体的癌症的方法中，其中所述方法包含：
将所述组合物递送到所述个体(例如使得所述组合物优选集中于特定区域中(例如特定组织类型、例如癌组织、例如前列腺癌组织附近或其内部))，其中所述组合物包含成像剂；和
检测(例如经由PET、X-射线、MRI、CT)所述成像剂。
72.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体，其用于疗法中。
73.一种组合物(例如医药组合物)，其包含共价连接到巨分子(例如纳米粒子，例如聚合物，例如蛋白质)的铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体GRP/螯合剂构筑体，其用于活体内诊断中。
74.根据权利要求69到73中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子是纳米粒子(例如超微小纳米粒子，例如C点，例如C’点)。
75.根据权利要求69到74中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子的直径不大于20nm(例如直径不大于15nm，例如直径不大于10nm)。
76.根据权利要求69到75中任一权利要求所述的组合物，其中所述巨分子包含：
基于二氧化硅的荧光纳米粒子，其包含：
基于二氧化硅的核心；
在所述核心内的荧光化合物；
包围所述核心的一部分的二氧化硅壳；
连接到所述纳米粒子、由此包覆所述纳米粒子的有机聚合物，
其中所述纳米粒子的直径不大于20nm。
77.根据权利要求70到76中任一权利要求所述的组合物，其中1到20个铃蟾素/胃泌素释放肽受体配体连接到所述巨分子。
78.根据权利要求69到77中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含放射性标记(例如89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124I、177Lu、225Ac、212Pb和211At)。
79.根据权利要求69到78中任一权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂包含选自由以下组成的群组的成员：N,N'-二(2-羟基苄基)乙二胺-N,N'-二乙酸单盐酸盐HBED-CC、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸DOTA、二亚乙基三胺五乙酸DTPA、去铁胺DFO和三亚乙基四胺TETA。
80.根据权利要求69到79中任一权利要求所述的组合物，其包含：
81.根据权利要求69到79中任一权利要求所述的组合物，其包含：
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