JP2023516111A - ナノ粒子を官能化する方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を生成するためなど、例えば標的化リガンドおよび／またはペイロード部分をコンジュゲートするために、ナノ粒子を官能化する方法に関する。本開示は、ナノ粒子を官能化する方法を特徴とする。方法は、化合物をナノ粒子表面（例えば、がん標的化リガンドなどの標的化リガンド、例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸；および細胞毒性化合物などの治療剤、例えばエキサテカン）にコンジュゲートして、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を形成するのに適したナノ粒子の調製を含むことができる。得られたＮＤＣは、コンジュゲートされた分子とナノ粒子との非常に安定した連結を示し、また標的化された生体系における、例えばがん細胞における有効な薬物放出をもたらす。

Description

関連出願
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書にそれぞれ組み込まれる、２０２０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６３／１０５，９９５号、２０２０年１１月２０日に出願された米国仮出願第６３／１１６，３９３号、２０２０年１１月２３日に出願された米国仮出願第６３／１１７，１１０号、２０２１年３月１日に出願された米国仮出願第６３／１５５，０４３号、２０２１年７月１５日に出願された米国仮出願第６３／２２２，１８１号、２０２１年９月９日に出願された米国仮出願第６３／２４２，２０１号、および２０２１年１０月１２日に出願された米国仮出願第６３／２５４，８３７号の利益を主張する。
背景
ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などのその他の薬物担体プラットフォームの欠点の多くを解決する可能性を提供する。例えば、超小型サイズ（例えば、２０ｎｍまたはそれよりも小さい直径）のＮＤＣは、ＡＤＣなどのその他のプラットフォームを使用すると不可能な、破壊された血液脳関門を通過しかつ治療物質を脳腫瘍に送達することができる。超小型ナノ粒子は、治療分子の腫瘍に対する深い腫瘍浸透を示すことができかつ均質な送達をもたらすことができ、一方、ＡＤＣなどのその他の薬物担体プラットフォームは、遅い腫瘍内拡散に起因して、限定された腫瘍浸透を有する。ＮＤＣは、ＡＤＣなどの従来の薬物送達プラットフォームよりも著しく多くの薬物分子を運ぶこともでき、それによってＮＤＣは、比較的より多くの量の薬物をがん細胞に送達することが可能になる。このことは、十分な量の薬物の送達を困難にする、受容体発現が低いがん細胞を標的とする場合に、特に有用である。ＮＤＣの別の利点は、有機ポリマー層でナノ粒子をコーティングする、例えばナノ粒子表面をＰＥＧ基の層でコーティングする可能性であり、生理学的環境において（例えば、対象において）血清タンパク質のナノ粒子への吸着を防止することができ、効率的な尿排泄を容易にし、かつナノ粒子の凝集を減少させ得る（例えば、Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ． ”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ”， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００９） ９（１）：４４２－４４８参照）。
しかしながら、ＮＤＣの開発および製造には著しい障害がある。例えば、臨床移行に必要とされる、製造制御、安定性、薬物放出、安全性、および有効性の厳しい基準を満たすＮＤＣを創出することは、非常に困難である。特に、これらの基準を満たすコンジュゲートされた分子（例えば、薬物分子および／または標的化リガンド）とナノ粒子担体との間に連結を創出することは、特に難しい。
［０００４］
したがって、ナノ粒子を官能化しかつ分子とナノ粒子、例えば薬物分子または標的化リガンドとのコンジュゲーションを可能にするための方法に、未だ満たされないニーズがある。
Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ． "Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ"， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００９） ９（１）：４４２－４４８
概要
本開示は、ナノ粒子を官能化する方法を特徴とする。方法は、化合物をナノ粒子表面（例えば、がん標的化リガンドなどの標的化リガンド、例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸；および細胞毒性化合物などの治療剤、例えばエキサテカン）にコンジュゲートして、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を形成するのに適したナノ粒子の調製を含むことができる。得られたＮＤＣは、コンジュゲートされた分子とナノ粒子との非常に安定した連結を示し、また標的化された生体系における、例えばがん細胞における有効な薬物放出をもたらす。
本明細書に開示される合成方法は、一連の種々の反応性基（本明細書では、官能基と呼ばれることもある）または化合物（例えば、ペイロード部分または標的化リガンド）をナノ粒子表面に導入することができる、反応シーケンスを含むことができる。これらの反応は、とりわけシラン縮合、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応、および「クリックケミストリー」、２＋３または２＋４付加環化反応、例えば本明細書に記述されるその他の反応を含むことができる。方法は、有機ポリマーでコーティングされたナノ粒子、および／またはシリカナノ粒子（例えば、超小型ＰＥＧ化シリカナノ粒子、例えばＣ’ドット）を含む、超小型ナノ粒子を官能化するのに使用されてもよい。
ナノ粒子を官能化する方法は、ナノ粒子と、第１の二官能性前駆体、例えばシラン部分および別の反応性基（例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、またはアルキン）を含む二官能性前駆体とを接触させるステップを含むことができ、このナノ粒子は、シラン（例えば、シリカ表面）と反応性のある表面を含み、接触させるステップは、シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件（例えば、シラン縮合に適した本明細書に記述される条件）下にあり、それによって、シラン部分とナノ粒子の表面との間に共有結合が形成され、反応性基（例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、またはアルキン）で官能化されたナノ粒子が提供される。この方法は、複数の反応性基を含むナノ粒子を提供するのに使用できることが理解されよう。
ナノ粒子と第１の二官能性前駆体との接触は、ＰＥＧでコーティングされた表面を含むナノ粒子を使用したときなど、ナノ粒子に付着された有機ポリマー分子（例えば、ＰＥＧ鎖）間の間隙空間への二官能性前駆体の挿入を含んでいてもよい。したがってこの方法は、官能化のために有機ポリマー層（例えば、ＰＥＧ分子の層）を含むナノ粒子の表面に前駆体分子を効果的に送達できないナノ粒子官能化の、従来の方法における困難を克服する。
本明細書に開示される方法は、反応性基で官能化されたナノ粒子（例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、またはアルキンで官能化されたナノ粒子）を、第２の二官能性前駆体と接触させることをさらに含んでいてもよく、この第２の二官能性前駆体は、ナノ粒子上の反応性基に反応性のある基を含み、この第２の二官能性前駆体は、別の官能基（例えば、アルキン部分（例えば、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ））、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アルケン、またはアジド）を含む。例えば、第２の二官能性前駆体は、ナノ粒子上の反応性基（例えば、ジエン）と反応性のあるジエノフィル（例えば、マレイミド）を含んでいてもよく、第２の二官能性前駆体は、アルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）を含んでいてもよい。接触は、官能化ナノ粒子と第２の二官能性前駆体との間の反応に適した条件（例えば、本明細書に開示される反応条件）下にあってもよく、それによって、第２の二官能性前駆体をナノ粒子に共有結合し、別の官能基（例えば、ＤＢＣＯなどのアルキン部分）で官能化されたナノ粒子が提供される。方法は、複数の別の官能基（例えば、複数のＤＢＣＯ部分）で官能化させたナノ粒子を提供するのに使用できることが理解されよう。
方法はさらに、別の官能基で官能化させたナノ粒子（例えば、ＤＢＣＯ官能化ナノ粒子）と、ナノ粒子上の別の官能基に反応性のある基を含む化合物とを接触させることを、含んでいてもよい。例えば、化合物は、アルキン官能化ナノ粒子のアルキン基と反応させるのに適切な、アルキン反応性基（例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）を含んでいてもよい。接触は、アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件、例えば本明細書に記述される反応条件、例えばクリックケミストリー条件、またはその他の付加環化条件（例えば、３＋２付加環化または４＋２付加環化）下であってもよく、それによって、化合物で官能化されたナノ粒子が形成される。ナノ粒子上の官能基に反応性のある基を含む化合物は、ペイロード部分（例えば、本明細書に開示される細胞毒性薬物、例えばエキサテカン）または標的化リガンド（例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸）を含んでいてもよい。方法は、複数の化合物をナノ粒子表面に共有結合で付着するのに使用されてもよい。例えば、方法は、官能化ナノ粒子に反応性のある基を含む複数の化合物を導入してもよく、または官能化ナノ粒子に反応性のある基をそれぞれが含む複数の種々の化合物（例えば、複数の標的化リガンド、複数のペイロード部分、またはこれらの組合せ）を導入してもよく、前記化合物はナノ粒子に共有結合により付着されるものであってもよい。
方法の各ステップは、複数の官能基をナノ粒子に導入するのに使用され得ることが理解されよう。例えば、ナノ粒子は、シラン基および反応性基を含む、複数の第１の二官能性前駆体に接触することができ、複数の反応性基（例えば、複数のジエン部分）で官能化されたナノ粒子を提供する。複数の反応性基（例えば、複数のジエン部分）で官能化されたナノ粒子は、複数の第２の二官能性前駆体に接触することができ、第２の二官能性前駆体は、ナノ粒子上の反応性基に反応性のある基を含み、第２の二官能性前駆体は、別の官能基（例えば、アルキン、例えばＤＢＣＯ）を含み、それによって、第２の二官能性前駆体からの複数の官能基（例えば、複数のＤＢＣＯ部分）で官能化されたナノ粒子が提供される。次いで第２の二官能性前駆体からの複数の官能基で官能化されたナノ粒子は、ナノ粒子上の官能基に反応性のある基を含む複数の化合物と接触してもよく、複数の化合物を含むナノ粒子が提供される。第２の二官能性前駆体からの複数の官能基で官能化されたナノ粒子は、ナノ粒子上の官能基に反応性のある基を含む第１の複数の化合物（例えば、アジドを含む標的化リガンド）に接触してもよく、その後、ナノ粒子上の官能基に反応性のある基を含む第２の複数の化合物（例えば、アジドを含むペイロード－リンカーコンジュゲート）に接触してもよく、第１および第２の複数の化合物は、構造的に異なる化合物を含み、それによって、２つの異なる複数の化合物（例えば、複数の標的化リガンド、および複数のペイロード部分）を含むナノ粒子が提供される。
例えば、方法は、シラン部分とナノ粒子の表面との間の反応に十分な条件下、例えばナノ粒子と、シラン部分およびジエン部分を含む複数の第１の二官能性前駆体とを接触させることにより、複数のジエン部分（例えば、シクロペンタジエン部分）で官能化されたナノ粒子を形成することを含むことができる。方法は、例えば複数のジエン部分（例えば、シクロペンタジエン部分）を含むナノ粒子を、ジエン部分とジエノフィルとの間の反応に十分な条件下、ジエノフィル（例えば、マレイミド）およびアルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）を含む複数の第２の二官能性前駆体に接触させることにより、複数のアルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ部分）で官能化されたナノ粒子を形成することを含むことができる。方法は：（ａ）ナノ粒子上の複数のアルキン部分の第１の部分を、アルキン反応性基を含む第１の化合物と反応させること（アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に十分な条件下）；および（ｂ）ナノ粒子上の複数のアルキン部分の第２の部分を、アルキン反応性基を含む第２の化合物と反応させること（アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に十分な条件下）をさらに含み、それによって、複数の第１の化合物および複数の第２の化合物で官能化されたナノ粒子を形成してもよく、第１の化合物および第２の化合物は化学的に異なるものである。例えば、（ａ）第１の化合物は、本明細書に開示された式（Ｄ）の化合物（例えば、式（Ｄ－１）の化合物）であってもよく；第２の化合物は、本明細書に開示された式（Ｅ）の化合物（例えば、式（Ｅ－１）の化合物）であってもよい。あるいは、第１の化合物は、本明細書に開示される式（Ｅ）の化合物（例えば、式（Ｅ－１）の化合物）であってもよく、第２の化合物は、本明細書に開示される式（Ｄ）の化合物（例えば、式（Ｄ－１）の化合物）である。
本開示は、シリカナノ粒子を官能化する方法も対象とし、この方法は：（ｉ）シリカナノ粒子と第１の二官能性前駆体とを接触させることであって、第１の二官能性前駆体がシラン部分およびシクロペンタジエン部分を含み、シリカナノ粒子が、シラン部分に反応性のある表面（例えば、シリカ表面）を含み、接触は、シラン部分とシリカナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にあり、それによって、シラン部分とナノ粒子の表面との間に共有結合が形成され、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子が提供されるものであること；（ｉｉ）シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を第２の二官能性前駆体と接触させることであって、第２の二官能性前駆体がアルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）およびジエノフィル（例えば、マレイミド）を含み、接触が、ジエノフィルとシクロペンタジエン部分との間の反応に適した条件下にあり、それによって、ナノ粒子のジエン部分と第２の二官能性前駆体とを反応させ、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供するものであること；および（ｉｉｉ）アルキン部分と、アジド部分を含む化合物とを、アルキン部分とアジド部分との間の反応に適した条件（例えば、クリックケミストリー条件）下で接触させ、それによって、ナノ粒子のアルキン部分とアジド部分とを反応させ、化合物（例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物）で官能化されたナノ粒子を提供することを含む。
本開示は、シリカナノ粒子を官能化する方法であって：（ｉ）シリカナノ粒子と、式（Ａ）の構造を含む第１の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供すること；（ｉｉ）シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を、式（Ｂ）の構造を含む第２の二官能性前駆体と接触させ、それによって、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供すること；および（ｉｉｉ）アルキン部分を、式（Ｄ）の化合物もしくは式（Ｅ）の化合物またはその両方の化合物と接触させ、それによって、標的化リガンド、ペイロード部分、またはその両方で官能化されたナノ粒子を提供することを含む方法も対象とする。
第１の二官能性前駆体は、本明細書で提供される式（Ａ－１）の構造を含んでいてもよい。第２の二官能性前駆体は、本明細書で提供される式（Ｂ－１）の構造を含んでいてもよい。式（Ｄ）の化合物は、本明細書で提供される式（Ｄ－１）の構造を含んでいてもよい。式（Ｅ）の化合物は、本明細書で提供される式（Ｅ－１）の構造を含んでいてもよい。
本明細書に開示される方法は、本明細書で提供される式（ＮＰ－２）の化合物を含むナノ粒子を提供することができる。ナノ粒子の（ＮＰ－２）に対する平均比は、約１：１から約１：５０であってもよく（各ナノ粒子は、平均して１～５０単位のＮＰ－２を含む）、例えば約１：４０、約１：３０、約１：２５、約１：２０、約１：１５、約１：１４、約１：１３、約１：１２、約１：１１、または約１：１０であってもよい。
方法は、本明細書で提供される式（ＮＰ－３）の化合物を含むナノ粒子を提供することができる。ナノ粒子の（ＮＰ－３）に対する平均比は、約１：１から約１：８０（各ナノ粒子は、平均して１～８０単位のＮＰ－３を含む）、例えば約１：６０、約１：４０、約１：３０、約１：２８、約１：２６、約１：２５、約１：２４、約１：２３、約１：２２、約１：２１、約１：２０、約１：１９、または約１：１８であってもよい。
方法は、式（ＮＰ－２）の化合物および式（ＮＰ－３）の化合物を含むナノ粒子を提供することができ、その構造は本明細書で提供され、ナノ粒子：（ＮＰ－３）：（ＮＰ－２）の比は、約１：２０：１０、１：２０：１１、１：２０：１２、１：２０：１３、１：２０：１４、１：２０：１５、１：２１：１０、１：２１：１１、１：２１：１２、１：２１：１３、１：２１：１４、１：２１：１５、１：２２：１０、１：２２：１１、１：２２：１２、１：２２：１３、１：２２：１４、１：２２：１５、１：２３：１０、１：２３：１１、１：２３：１２、１：２３：１３、１：２３：１４、１：２３：１５、１：２４：１０、１：２４：１１、１：２４：１２、１：２４：１３、１：２４：１４、１：２４：１５、１：２５：１０、１：２５：１１、１：２５：１２、１：２５：１３、１：２５：１４、または１：２５：１５である。
本明細書に開示される方法の利点は、比較的安定した前駆体（例えば、ジエン－シラン前駆体）の使用であり、安定な官能化ナノ粒子をもたらす。例えば、本明細書に開示される方法を使用して生成され得る官能化ナノ粒子（例えば、ＮＤＣ）は、その他の方法を使用してまたはその他の前駆体で生成された官能化ナノ粒子（例えば、ＮＤＣ）で生じる可能性のある早期のまたは望ましくない切断を回避することができる。例えば、ナノ粒子を官能化するその他の方法は、ナノ粒子の表面に反応性部分を持つナノ粒子をもたらす前駆体を用い、これは例えばペイロードの早期の放出または標的化リガンドの望ましくない放出をもたらし得る望ましくない反応性を促進させる可能性があるものである。さらに、ナノ粒子官能化のその他の方法は、不安定な前駆体を使用し、反応中に自己縮合する可能性があり、望ましくない凝集を引き起こす可能性がある。凝集体は、官能化ナノ粒子から分離することが非常に難しくなる可能性がある。
対照的に、本明細書に開示される方法は、比較的安定な前駆体を用いることができ、得られた官能化ナノ粒子（例えば、ＮＤＣ）は、安定でありかつ高度に純粋である。例えば、本開示の官能化ナノ粒子は、ジエン－シラン前駆体（シクロペンタジエン－シラン前駆体など）で調製して、１個または複数のジエン基で官能化されたナノ粒子を得ることができる。次いでジエン基は、ジエノフィル含有前駆体（例えば、ＰＥＧ－マレイミド誘導体、例えばＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミド）などの第２の前駆体と反応させてもよく、安定な付加環化物が形成される。付加環化物を含む、得られた官能化ナノ粒子は、必要に応じて１つまたは複数の後続の前駆体（本明細書に記述される標的化リガンド前駆体および／またはペイロード－リンカーコンジュゲート前駆体など）と反応させて、さらにナノ粒子を官能化してもよい。ジエン－シラン前駆体と、生成された付加環化物は、その他の官能化ナノ粒子またはそれらの前駆体で見い出すことができる望ましくない特徴を示さない。例えば、本明細書に開示される方法を使用して調製された官能化ナノ粒子（例えば、ＮＤＣ）は、比較的高い血清安定性を有し、高い収率および純度（例えば、凝集した前駆体を含まない）で生成することができる。さらに、この手法は高度にモジュール的であるので、ペイロード、標的化リガンド、またはその他のものの任意の所望の比を、ナノ粒子に導入することができる。これらの方法、およびそれらの利益を使用してナノ粒子を調製する例を、実施例で提示する。
ナノ粒子を官能化する例示的なシーケンスを、スキーム１に示す。
スキーム１． ナノ粒子（Ｃ’ドット）を修飾する例示的なシーケンス。
Figure 2023516111000002
図１は、本明細書に開示される方法を使用して調製することができる、例示的なナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）の構造を示す。
図２は、ＤＢＣＯ部分でナノ粒子を官能化するための種々の手法間の効率を比較するグラフである。
図３Ａ～３Ｄは、ＲＰ－ＨＰＬＣおよびＳＥＣクロマトグラムである。図３Ａは、ＰＢＳ中で２４時間インキュベートする前後での、アミン系二官能性前駆体を使用して調製されたＤＢＣＯ官能化ナノ粒子のＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。図３Ｂは、ＰＢＳ中で２４時間インキュベートする前後での、ジエン系二官能性前駆体を使用して調製されたＤＢＣＯ官能化ナノ粒子のＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。図３Ｃは、アミン系二官能性前駆体を使用して調製されたＤＢＣＯ官能化ナノ粒子のＳＥＣクロマトグラムを提供する。図３Ｄは、ジエン系二官能性前駆体を使用して調製されたＤＢＣＯ官能化ナノ粒子のＳＥＣクロマトグラムを提供する。
図４は、平均流体力学直径を示す、本明細書に開示される方法を使用して調製された例示的なＮＤＣの、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）からのスペクトログラフである。
図５は、官能化の種々の段階での例示的な官能化ナノ粒子の、重ね合わせたＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを示し、粒子当たりの各コンジュゲート（例えば、標的化リガンド、例えば葉酸（ＦＡ）、またはペイロード、例えばエキサテカン）の存在および平均数を検証するのに使用することができる特徴的吸収ピークを示している。
図６Ａ～６Ｂは、本明細書に開示された方法を使用して調製された例示的なＮＤＣの２つの波長での、ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラム（図６Ａ）およびＳＥＣクロマトグラム（図６Ｂ）を提供する。
図７は、３７℃でカテプシン－Ｂと共にインキュベートしながら、例示的なＮＤＣから経時的に放出された薬物（エキサテカン）の量を提供するグラフである。挿入図は、各時点で記録された、重ね合わせたＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを提供する。
図８Ａ～８Ｂは、本明細書に開示された方法を使用して調製された例示的なＮＤＣの血清安定性を示すグラフである。図８Ａは、３７℃で７日間にわたる１０％ヒト血清中の、ジエン系二官能性前駆体を使用して生成されたＮＤＣ、およびアミン系二官能性前駆体を使用して生成されたＮＤＣの安定性を比較する。図８Ｂは、３７℃で７日間にわたる１０％マウス血清中の、ジエン系二官能性前駆体を使用して生成されたＮＤＣ、およびアミン系二官能性前駆体を使用して生成されたＮＤＣの安定性を比較する。
詳細な説明
選択された化学的定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１から１８個の炭素原子、例えば１から約１２個の炭素原子、または１から約６個の炭素原子を含んでいてもよい１価の脂肪族炭化水素基（「Ｃ１～１８アルキル」）を指す。アルキル基は、直鎖、分岐鎖、単環式部分、または多環式部分、またはこれらの組合せとすることができる。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニル、および同様のものが含まれる。アルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても（「非置換アルキル」）または１個または複数の置換基で、例えば１から５個の置換基、１から３個の置換基、または１個の置換基で置換されても（「置換アルキル」）よい。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、２から１８個の炭素原子、１つまたは複数の炭素－炭素二重結合を有し、三重結合を持たない、１価の直鎖または分岐状炭化水素基（「Ｃ２～１８アルケニル」）を指す。アルケニル基は、２から８個の炭素原子、２から６個の炭素原子、２から５個の炭素原子、２から４個の炭素原子、または２から３個の炭素原子を有していてもよい。１つまたは複数の炭素－炭素二重結合は、内部（２－ブチルなど）または末端（１－ブテニルなど）とすることができる。アルケニル基の例には、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、ブタジエニル、ペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、オクタトリエニル、および同様のものが含まれる。アルケニル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても（「非置換アルケニル」）または１個または複数の置換基で、例えば１から５個の置換基、１から３個の置換基、または１個の置換基で置換されても（「置換アルケニル」）よい。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、２から１８個の炭素原子、および１つまたは複数の炭素－炭素三重結合を有する、１価の直鎖または分岐状炭化水素基（「Ｃ２～１８アルキニル」）を指す。アルキニル基は、２から８個の炭素原子、２から６個の炭素原子、２から５個の炭素原子、２から４個の炭素原子、または２から３個の炭素原子を有していてもよい。１つまたは複数の炭素－炭素三重結合は、内部（２－ブチニルなど）または末端（１－ブチニルなど）とすることができる。アルキニル基の例には、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、および同様のものが含まれる。アルキニル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても（「非置換アルキニル」）または１個または複数の置換基で、例えば１から５個の置換基、１から３個の置換基、または１個の置換基で置換されても（「置換アルキニル」）よい。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、非環式の安定な直鎖または分岐鎖、またはこれらの組合せであって、少なくとも１個の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、およびＳからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子とを含み、窒素および硫黄原子が必要に応じて酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が必要に応じて第四級化されていてもよいものを指す。ヘテロ原子（複数可）Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置されてもよい。
「アルキレン」、「アルケニレン」、「アルキニレン」、または「ヘテロアルキレン」という用語は、単独でまたは別の置換基の部分として、他に指示しない限り、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはヘテロアルキルからそれぞれ誘導された２価のラジカルを意味する。「アルケニレン」という用語は、それ自体または別の置換基の部分として、他に指示しない限り、アルケンから誘導された２価のラジカルを意味する。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、またはヘテロアルキレン基は、例えば、Ｃ１～６員アルキレン、Ｃ１～６員アルケニレン、Ｃ１～６員アルキニレン、またはＣ１～６員ヘテロアルキレンと記述されてもよく、「員」という用語は、その部分における非水素原子を指す。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は、鎖末端のいずれかまたはその両方を占有することもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、および同様のもの）。さらになお、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の式が書かれる方向によって連結基の配向は示唆されない。例えば、式－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－および－Ｒ’Ｃ（Ｏ）２－の両方を表してもよい。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、またはヘテロアルキレン基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても（「非置換アルキレン」）または１個または複数の置換基で置換されても（「置換ヘテロアルキレン」）よい。
本明細書で使用される場合、「置換アルキル」、「置換アルケニル」、「置換アルキニル」、「置換ヘテロアルキル」、「置換ヘテロアルケニル」、「置換ヘテロアルキニル」、「置換シクロアルキル」、「置換ヘテロシクリル」、「置換アリール」、および「置換ヘテロアリール」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール部分をそれぞれ指し、その部分の１個または複数の炭素またはヘテロ原子上の１個または複数の水素原子を置き換える置換基を有するものである。そのような置換基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含むことができる。シクロアルキルは、例えば上述の置換基でさらに置換することができる。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、式－Ｏ－アルキルの基を指す。「アルコキシ」または「アルコキシル」という用語は、酸素原子に共有結合で連結された置換または非置換アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基またはアルコキシルラジカルの例には、限定するものではないがメトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が含まれる。置換アルコキシ基の例には、ハロゲン化アルコキシ基が含まれる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの基で置換することができる。ハロゲン置換アルコキシ基の例には、限定するものではないがフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、およびトリクロロメトキシが含まれる。
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、その全ての環原子が炭素でありかつ置換されても置換されなくてもよい、単環式または多環式であってもよい安定な芳香族環系を指す。芳香族環系は、例えば３～７個の環原子を有していてもよい。例には、フェニル、ベンジル、ナフチル、アントラシル、および同様のものが含まれる。アリール基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち置換されなくても（「非置換アリール」）または１個または複数の置換基で置換されても（「置換アリール」）よい。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、１個または複数の環ヘテロ原子を含むアリール基を指す。例えば、ヘテロアリールは、炭素原子と、窒素、酸素、および硫黄からなる群より独立して選択される１個または複数のヘテロ原子とからなる安定な５－、６－、または７員単環式、または７－、８－、または９員二環式芳香族複素環式環を含むことができる。窒素原子は、置換されても置換されなくてもよい（例えば、ＮまたはＮＲ４であり、式中、Ｒ４は、定義されるようにＨまたはその他の置換基である）。ヘテロアリール基の例には、ピロール、フラン、インドール、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、および同様のものが含まれる。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキレン」、「ヘテロシクリレン」、「アリーレン」、および「ヘテロアリーレン」という用語は、単独でまたは別の置換基の部分として、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからそれぞれ誘導された２価のラジカルを意味する。シクロアルキレン、ヘテロシクリレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンのそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても（「非置換アリーレン」）または１個または複数の置換基で置換されても（「置換ヘテロアリーレン」）よい。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、非芳香族環式炭化水素環、例えばその環構造内に３から８個の炭素原子を有する炭化水素環を含むものとする。シクロアルキルは、シクロブチル、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、および同様のものを含むことができる。シクロアルキル基は、単環式（「単環式シクロアルキル」）であってもよく、または二環式系（「二環式シクロアルキル」）などの縮合、架橋、もしくはスピロ環系を含有していてもよく、飽和され得るかまたは部分的に不飽和にされ得る。「シクロアルキル」は、上記定義されたシクロアルキル環が１個または複数のアリール基と縮合された環系であって、付着点がシクロアルキル環上にあり、そのような場合には炭素の数が、シクロアルキル環系内の炭素の数を示し続けるものも含む。シクロアルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても（「非置換シクロアルキル」）または１個または複数の置換基で置換されても（「置換シクロアルキル」）よい。
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」という用語は、１個または複数の環内に（即ち、複素環式環のラジカル）、少なくとも２個の異なる元素の原子を含む、１価の環式分子構造を指す。複素環式環が有機化学の分野で十分に確立された用語である証拠として、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９９７をさらに参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ジペプチド」という用語は、－Ａ１－Ａ２－と本明細書で示され得る２個のアミノ酸残基から構成されるペプチドを指す。例えば、本開示のプロテアーゼ切断可能リンカー－ペイロードコンジュゲートの合成で用いられるジペプチドは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、およびＶａｌ－Ａｌａからなる群より選択されてもよい。
本明細書で使用される場合、「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを指す。
アリールまたはヘテロアリール芳香族環は、１つまたは複数の環位置で、上述のような置換基、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分で置換することができる。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」という用語は、式－ＯＨの基を指す。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル」という用語は、ヒドロキシルラジカル（．ＯＨ）を指す。
本明細書で使用される場合、「オキソ」という用語は、炭素または別の元素に二重結合された酸素（即ち、＝Ｏ）を指す。
本明細書で使用される場合、句「必要に応じて置換された」は、非置換または置換を意味する。一般に、「置換された」という用語は、基（例えば、炭素または窒素原子）上に存在する少なくとも１個の水素が、許容される置換基、例えば置換後に安定な化合物をもたらす置換基で、置き換えられることを意味する。「置換された」という用語は、安定な化合物の形成をもたらす本明細書に記述される置換基のいずれかなど、有機化合物の全ての許容される置換基で置換を含むことができる。本開示の目的のため、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の価数を満たしかつ安定な部分の形成をもたらす水素置換基および／または本明細書に記述される任意の適切な置換基を有していてもよい。
本明細書で使用される場合、「標的化リガンド」は、ナノ粒子に結合し、かつ典型的には腫瘍またはがん細胞に結合することによって（例えば、腫瘍またはがん細胞の表面に発現したタンパク質に結合することによって）ナノ粒子を腫瘍またはがん細胞に標的化することができる分子である。標的化リガンドは、小さい有機分子（例えば、葉酸塩または葉酸類似体）、抗体の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、または単離された相補的決定領域（ＣＤＲ）領域）、抗体模倣体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）（例えば、アプタマー、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ダルピン（Ｄａｒｐｉｎ）、および同様のもの）、受容体の結合ドメイン、核酸、脂質、および同様のものなどの任意の適切な分子とすることができる。
さらに、本明細書に記述される合成方法は様々な保護基を利用することが、当業者に理解されよう。本明細書で使用される場合、「保護基」という用語は、特定の官能性部分、例えば、反応を多官能性化合物の別の反応性部位で選択的に実施することができるように一時的に遮断されるＯ、Ｓ、またはＮを指す。保護基は、当業者に公知の方法を使用して、化合物の合成の適切な段階で導入され除去されてもよい。保護基は、文献に記述される有機合成の標準的な方法に従い適用される（保護基に関して参照により組み込まれる、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ （２００７） Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）。
例示的な保護基には、限定するものではないが酸素、硫黄、窒素、および炭素保護基が含まれる。例えば、酸素保護基には、限定するものではないがメチルエーテル、置換メチルエーテル（例えば、ＭＯＭ（メトキシメチルエーテル）、ＭＴＭ（メチルチオメチルエーテル）、ＢＯＭ（ベンジルオキシメチルエーテル）、ＰＭＢＭ（ピメトキシベンジルオキシメチルエーテル）、必要に応じて置換されたエチルエーテル、必要に応じて置換されたベンジルエーテル、シリルエーテル（例えば、ＴＭＳ（トリメチルシリルエーテル）、ＴＥＳ（トリエチルシリルエーテル）、ＴＩＰＳ（トリイソプロピルシリルエーテル）、ＴＢＤＭＳ（ｔ－ブチルジメチルシリルエーテル）、トリベンジルシリルエーテル、ＴＢＤＰＳ（ｔ－ブチルジフェニルシリルエーテル）、エステル（例えば、ホルメート、アセテート、ベンゾエート（Ｂｚ）、トリフルオロアセテート、ジクロロアセテート）カーボネート、環式アセタール、およびケタールが含まれる。さらに、窒素保護基には、限定するものではないがカルバメート（メチル、エチル、および置換エチルカルバメート（例えば、Ｔｒｏｃ）を含む）、アミド、環式イミド誘導体、Ｎ－アルキルおよびＮ－アリールアミン、イミン誘導体、およびエナミン誘導体などが含まれる。アミノ保護基には、限定するものではないがフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、アセトアミド、トリフルオロアセトアミドなどが含まれる。ある特定のその他の例示的な保護基について本明細書で詳述するが、本開示は、これらの保護基に限定するものではなく；むしろ当業者に公知の方法により様々な追加の均等な保護基が利用され得ることが理解されよう。
本開示の全体を通して、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）は時々、ＣＤＣ（Ｃ’ドット－薬物－コンジュゲート）、例えばＦＡ－ＣＤＣ、または単に官能化ナノ粒子と呼んでもよい。
ナノ粒子
本明細書に開示される方法は、任意の適切なナノ粒子を官能化するのに使用されてもよい。例えば、シリカナノ粒子は、本明細書に開示される方法を使用して、官能化することができる（シリカから部分的に構成される、またはシリカから完全に構成されるナノ粒子を含む）。ナノ粒子は、約０．５ｎｍから約１００ｎｍ、例えば約０．１ｎｍから約５０ｎｍ、約０．５ｎｍから約２５ｎｍ、約１ｎｍから約２０ｎｍ、約０．８ｎｍから約１５ｎｍ、約１ｎｍから約１０ｎｍ、または約１ｎｍから約８ｎｍ、例えば約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、または約１２ｎｍの直径を有することができる。
ナノ粒子は、シェルによって取り囲まれたコアを含んでいてもよい（即ち、コア－シェルナノ粒子）。あるいはナノ粒子は、コアのみを有してシェルがなくてもよい。ナノ粒子は、シラン部分、例えばシリカ表面に対して反応性のある材料を含んでいてもよい（例えば、その表面に）。ナノ材料のシェルは、シラン部分、例えばシリカシェルに対して反応性のある材料であってもよい。本明細書に開示される方法は、シリカ系コアおよびコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカ系シェルを含むシリカナノ粒子（コア－シェルシリカナノ粒子）を修飾するのに使用することができる。ナノ粒子は、非メソポーラスナノ粒子（例えば、非メソポーラスコア－シェルナノ粒子）、例えば非メソポーラスシリカナノ粒子（例えば、非メソポーラスコア－シェルシリカナノ粒子）であってもよい。
ナノ粒子は、その表面に有機ポリマーコーティングを含んでいてもよい。ナノ粒子に付着され得る有機ポリマーには、限定するものではないがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、およびこれらの組合せが含まれる。例えば、ナノ粒子は、表面に付着されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の層を有していてもよい。ある特定の有機ポリマーコーティングは、生体系に適した性質など、有利な性質を持つナノ粒子を提供することができる。例えば、動物（例えば、ヒト）へのＰＥＧコーティングを含むナノ粒子の投与の後、ＰＥＧ基は、ナノ粒子への血清タンパク質の吸着を防止してもよく、効率的な尿排泄を容易にしてもよく、ナノ粒子の凝集を減少させてもよい（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ． ”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ”， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００９） ９（１）：４４２－４４８参照）。
ナノ粒子のシェルは、ある範囲の層を有していてもよい。例えば、シェルは、約１から約２０層、約１から約１５層、約１から約１０層、または約１から約５層を含んでいてもよい。例えば、シェルは、約１から約３層を含んでいてもよい。シェルの厚さは、約０．５ｎｍから約９０ｎｍ、例えば約１ｎｍから約４０ｎｍ、約１ｎｍから約２０ｎｍ、約１ｎｍから約１０ｎｍ、または約１ｎｍから約５ｎｍに及んでもよい。例えば、シェルの厚さは、約１ｎｍから約２ｎｍであってもよい。ナノ粒子のシェルは、ナノ粒子の一部分のみまたは粒子全体を覆ってもよい。例えば、シェルは、ナノ粒子の約１から約１００パーセント、約１０から約８０パーセント、約２０から約６０パーセント、または約３０から約５０パーセントを覆ってもよい。ナノ粒子のシェルはシリカを含むことができ、および／またはテトラアルキルオルトシリケート（例えばテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ））などのシリカの形成化合物の反応生成物であってもよい。
ナノ粒子（例えば、ナノ粒子コアおよび／またはシェル）は、実質的に非多孔質、メソポーラス、半多孔質、または多孔質とすることができる。ナノ粒子は、非細孔表面（ｎｏｎ－ｐｏｒｅ ｓｕｒｆａｃｅ）および細孔表面（ｐｏｒｅ ｓｕｒｆａｃｅ）を含んでいてもよい。細孔表面は、内面と呼んでもよい。ナノ粒子は、非細孔表面（または非多孔質表面）を有していてもよい。非細孔表面は、本明細書では、外側ナノ粒子表面と呼んでもよい。ナノ粒子の細孔表面（例えば、細孔表面の少なくとも一部分）および／または非細孔表面（例えば、非細孔表面の少なくとも一部分）は、官能化することができる。上述のように、ナノ粒子および／またはナノ粒子のシェルは、非メソポーラスであってもよい。
ナノ粒子は、蛍光化合物などの色素を含有していてもよい。色素は、ナノ粒子コア内に含有され得る。例えば、ナノ粒子は、ナノ粒子内に共有結合で被包された色素を含有してもよい。シリカナノ粒子の色素は、反応性色素（例えば、蛍光化合物）と共反応性（ｃｏ－ｒｅａｃｔｉｖｅ）有機シラン化合物との反応生成物であってもよい。シリカナノ粒子は、反応性色素化合物と共反応性有機シラン化合物との反応生成物、およびシランを含有していてもよい。
ナノ粒子は、任意の公知の蛍光化合物、例えば蛍光有機化合物、色素、顔料、またはこれらの組合せを組み込んでもよい。そのような蛍光化合物は、シリカナノ粒子のコアのシリカマトリクス中に組み込むことができる。広く様々な適切な化学反応性蛍光色素／フルオロフォアが公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ６ｔｈ ｅｄ．， Ｒ． Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄ， ｅｄ． （１９９６）を参照されたい。蛍光化合物は、ナノ粒子のコア内に、共有結合により被包されてもよい。
蛍光化合物は、限定するものではないが、遊離蛍光色素よりもさらに大きい輝度および蛍光量子収量を提供することができる、ナノ粒子のコア内に位置決めされた近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）色素とすることができる。近赤外放出プローブは、低下した組織減衰および自己蛍光を示すことが周知である（上記Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．）。本開示で使用され得る（例えば、ＮＤＣにより被包される）蛍光化合物には、限定するものではないがＣｙ５、Ｃｙ５．５（Ｃｙ５＋＋としても公知である）、Ｃｙ２、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリスリン、Ｃｙ７、フルオレセイン（ＦＡＭ）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５（Ｃｙ３＋＋としても公知である）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（スルホローダミン１０１酸塩化物）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）－Ｒｅｄ ６４０、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）－Ｒｅｄ ７０５、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、ローダミン、ローダミン誘導体（ＲＯＸ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン誘導体ＪＡ１３３、Ａｌｅｘａ蛍光色素（例えば、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７）、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムアクア、ＬＩＳＳＡＭＩＮＥ（商標）、および蛍光遷移金属錯体、例えばユーロピウムが含まれる。使用することができる蛍光化合物には、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質および誘導体（ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質および誘導体（ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、ならびに黄色蛍光タンパク質および誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）も含まれる（ＷＯ ２００８／１４２５７１、ＷＯ ２００９／０５６２８２、ＷＯ １９９９／２２０２６）。好ましい態様では、蛍光化合物がＣｙ５である。
ナノ粒子は：（１）マレイミド、ヨードアセトアミド、チオスルフェート、アミン、Ｎ－ヒドロキシスクシミドエステル、４－スルホ－２，３，５，６－テトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、スルホスクシニミジルエステル、スルホジクロロフェノールエステル、塩化スルホニル、ヒドロキシル、イソチオシアネート、カルボキシルを含むがこれらに限定されない反応性部分を持つ反応性蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）などの蛍光化合物と、共反応性有機シラン化合物などの有機シラン化合物とを、共有結合によりコンジュゲートして蛍光シリカ前駆体を形成し、蛍光シリカ前駆体を反応させて、蛍光コアを形成するステップ；または（２）蛍光シリカ前駆体と、テトラアルコキシシランなどのシリカ形成化合物とを反応させて蛍光コアを形成し、得られたコアと、テトラアルコキシシランなどのシリカ形成化合物とを反応させて、コア上にシリカシェルを形成することにより、蛍光ナノ粒子を提供するステップによって、合成されてもよい。
蛍光シリカ系ナノ粒子は、当技術分野で公知であり、参照によりその内容全体が本明細書にそれぞれ組み込まれる米国特許第８，２９８，６７７号；第９，６２５，４５６号；第１０，５４８，９９７号；第９，９９９，６９４号；第１０，０３９，８４７号；および第１０，５４８，９９８号に記載されている。
本明細書に開示される方法によって官能化されたナノ粒子は、シリカ系コアとコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含むナノ粒子、ならびにナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでいてもよい。ナノ粒子は、ナノ粒子のコア内に共有結合により被包された蛍光化合物を有していてもよい。例えば、Ｃ’ドットとも呼ばれる超小型ＰＥＧ化シリカナノ粒子は、本明細書に開示される方法を使用して官能化することができる。Ｃ’ドットは、既に記述されたように調製することができる（例えば、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （２０１５） ２７（１１）：４１１９－４１３３参照）。本明細書に記述される方法で使用されるナノ粒子は、Ｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｍａｔｅｒ． （２０１３）， ２５：６７７－６９１； Ｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｍａｔｅｒ． （２０１６） ２８：１５３７－１５４５； Ｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｍａｔｅｒ． （２０１７） ２９：６８４０－６８５５； ＷＯ ２０１６／１７９２６０；およびＷＯ ２０１８／２１３８５１に記載されるように調製されてもよい。各Ｃ’ドットは、近赤外蛍光Ｃｙ５色素が共有結合により被包されるＰＥＧ化シリカ粒子（直径約６ｎｍ）を含む。
ナノ粒子を官能化する方法
本明細書に開示される方法を使用して、ナノ粒子の表面に１個または複数の官能基を組み込むようにナノ粒子を修飾することができ、これをさらに修飾してもよい（例えば、分子に官能基をコンジュゲートすることによって）。例えば、シラン（例えば、シラノール基）に反応性のあるナノ粒子の表面の材料を、シラン基および別の官能基を含む二官能性前駆体などの本明細書に開示される二官能性前駆体と反応させて、別の官能基をナノ粒子表面に付着することができる。シラン基に反応性のある材料は、ナノ粒子の有機ポリマー層コーティングの下（例えば、ＰＥＧ層の下）にあってもよく、二官能性前駆体は、有機ポリマー分子の間隙空間に挿入され、ナノ粒子表面の材料と反応してもよい。
本明細書に開示される方法を使用して、ナノ粒子を１つまたは複数のアルキン部分で官能化することができ、これをさらに、アルキン反応性基（例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）を含む化合物でコンジュゲートすることができる。したがって本明細書に開示される方法は、特定の使用のために、例えば標的化がん治療で使用するために、ナノ粒子の官能化を可能にすることができる。例えば、アルキン反応性基を含む化合物は、特定の生物学的標的（例えばがん細胞、例えばがん細胞によって発現された受容体）を標的とする（例えば、親和性を有する）ことができる部分を含んでもよい。例えば、分子は、ある特定の受容体に結合する化合物、例えば葉酸またはその誘導体など、葉酸受容体に結合する化合物などの標的化リガンドであってもよい。したがって本明細書に開示される方法は、がん細胞を標的とするのに適したナノ粒子を官能化するのに使用することができる。アルキン反応性基を含む化合物は、細胞毒性化合物であってもよく、切断可能リンカーを含むことができ、したがって細胞毒性化合物は、リンカーの切断後に生体系内（例えば、がん細胞内）で放出され得る。ペイロードは、小分子化学治療薬などの細胞毒性薬、例えばエキサテカンまたはその誘導体とすることができ、リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカーとすることができる。例えば、本明細書に開示される方法を使用して作製されたエキサテカンペイロードおよび葉酸標的化リガンドを含む例示的なナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を、図１に示す。
本明細書に開示される方法は、有機ポリマーでコーティングされたナノ粒子を官能化するのに使用することができる。例えば、本明細書に記述される方法は、ナノ粒子がポリエチレングリコールでコーティングされた後（ＰＥＧ化後）に実施されてもよい。このことは、反応最適化の必要性を低減させ、合成プロトコールおよびナノ粒子そのものの両方に必要とされる変更を最小限に抑え（例えば、本明細書に開示される方法を実施する前にナノ粒子の表面化学を最適化するのに変更を必要としない）、このことは、ナノ粒子官能化に関する従来の方法よりも効率的である。従来のナノ粒子官能化手法を使用して、通常は、官能基を、有機ポリマーコーティング（例えば、ＰＥＧ）を有するナノ粒子に導入するのは可能ではないか、または非常に非効率的である。それは部分的には、前駆体分子をナノ粒子表面にコンジュゲートするのを防止する有機ポリマーの立体障害に起因するからであり、これらの従来の方法は、典型的には、低い収率を提供しまたは任意の官能化ナノ粒子を提供することができない。ナノ粒子を官能化するためのこれらの課題を回避する典型的な方法は、有機ポリマーコーティング分子の添加と同時に、前駆体分子（所望の官能基を含有する）をナノ粒子の表面に導入することである。しかしながらこの手法には、予測不能な反応動態（例えば、前駆体分子の官能基とナノ粒子表面との間の引力または反発力に起因する）、合成中にナノ粒子の有機ポリマー層に「埋め込まれる」ようになる官能基、および合成中に部分的にコーティングされたナノ粒子の凝集などの著しい欠点があり、そのそれぞれは、ナノ粒子の低い収率および最適以下の官能化をもたらす。このことは、荷電表面を保有するシリカナノ粒子を使用したときの特定の課題であり、望ましくない分子間相互作用を悪化させかつ予測不能な方法で反応動態に影響を及ぼす可能性がある。本明細書に開示される方法は、これらの問題を克服することができる。
さらに、本明細書に開示される方法は、ＤＢＣＯなどの嵩高い分子を、有機ポリマーコーティング（例えば、ＰＥＧ層）により立体的に障害されたナノ粒子の表面にどのように付着するのかの問題に対する解決策を提供する。ある特定の分子、特に、より大きいサイズおよび立体障害を有する分子は、ナノ粒子の表面へのアクセスを制限しており、より低い反応性をもたらしかつナノ粒子表面への分子の付着を妨げる。例えば、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シラン前駆体が反応混合物中で比較的高い比にある場合であっても、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シランを二官能性前駆体として使用するときに２個のＤＢＣＯ基しかナノ粒子に付着できない（例えば、実施例１および図２参照）。
開示された方法は、２ステップ反応シーケンスを含むことができ、比較的高い拡散係数を有する小さい第１の二官能性前駆体（例えば、シラン基を含む前駆体）は、最初にナノ粒子表面に結合され、次いで引き続き、別の化合物、例えば追加の二官能性前駆体（複数可）により修飾される。例えば、シラン部分および別の反応性基（例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、ニトロン、酸化ニトリル、またはアルキン）を含む、小さい二官能性前駆体は、ナノ粒子表面とシラン基との間の反応に適した条件下、シラン基に対して反応性のある表面を含むナノ粒子の溶液に添加することができ、それによって、別の反応性基で官能化されたナノ粒子が提供される。
シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件は、ナノ粒子と第１の二官能性前駆体とを水性反応媒体（例えば、実質的に水である反応媒体）中で組み合わせることを含んでいてもよい。反応媒体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはアセトニトリルなどの非プロトン有機溶媒を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、２０ｖ／ｖ％以下の非プロトン溶媒、例えば１８ｖ／ｖ％未満、１６ｖ／ｖ％未満、１４ｖ／ｖ％未満、１２ｖ／ｖ％未満、１０ｖ／ｖ％未満、８ｖ／ｖ％未満、６ｖ／ｖ％未満、４ｖ／ｖ％未満、２ｖ／ｖ％未満、または１ｖ／ｖ％未満の非プロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、アルコール（例えば、ｔｅｒｔ－ブタノール）などのプロトン有機溶媒を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、２０ｖ／ｖ％以下のプロトン溶媒、例えば１８ｖ／ｖ％未満、１６ｖ／ｖ％未満、１４ｖ／ｖ％未満、１２ｖ／ｖ％未満、１０ｖ／ｖ％未満、８ｖ／ｖ％未満、６ｖ／ｖ％未満、４ｖ／ｖ％未満、２ｖ／ｖ％未満、または１ｖ／ｖ％未満のプロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液（例えば、水性緩衝液）を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、緩衝液（例えば、ＰＢＳなどの水性緩衝液）を、約１×から約５×の間、例えば約１×、約２×、約３×、約４×、または約５×の最終濃度で含んでいてもよい。反応媒体は、有機溶媒を実質的に含まなくてもよい（例えば、有機プロトン溶媒を実質的に含まない、非プロトン溶媒を実質的に含まない、またはいかなる有機溶媒も実質的に含まない）。反応媒体は、緩衝液を実質的に含まなくてもよい。反応媒体は、実質的に水であってもよい。
シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件は、ナノ粒子と第１の二官能性前駆体とを反応媒体中で、ある特定の期間にわたり、例えば約１分から約６０分の間、約０．５時間から約２４時間の間、約０．５時間から約１８時間の間、約０．５時間から約１２時間の間、約０．５時間から約６時間の間、約０．５時間から約４時間の間、約０．５時間から約３時間の間、約０．５時間から約２時間の間、約０．５時間から約１時間の間、または約１時間から約４８時間の間で組み合わせることを含んでいてもよい。例えば、条件は、反応媒体を一晩、保持することを含んでいてもよい。
シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件は、ナノ粒子と第１の二官能性前駆体とを反応媒体中で組み合わせ、反応媒体を、例えば約２０℃またはそれよりも高い温度、例えば約３５℃またはそれよりも高い、約４０℃またはそれよりも高い、約４５℃またはそれよりも高い、約５０℃またはそれよりも高い、約６０℃またはそれよりも高い、約７０℃またはそれよりも高い、約８０℃またはそれよりも高い、約９０℃またはそれよりも高い、約１００℃またはそれよりも高い、約１１０℃またはそれよりも高い、または１２０℃またはそれよりも高い、例えば約２０℃から約６０℃の間、約４０℃から約８０℃の間、約６０℃から約１００℃の間、約２０℃から約４０℃の間、約３０℃から約５０℃の間、約４０℃から約６０℃の間、約５０℃から約７０℃の間、約６０℃から約８０℃の間、約７０℃から約９０℃の間、約８０℃から約１００℃の間、または約９０℃から約１１０℃の間の温度に加熱することを含んでいてもよい。条件は、ナノ粒子および第１の二官能性前駆体を室温で維持することを含んでいてもよい。シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件は、撹拌、振盪、またはその他の混合方法の反応媒体への適用を含んでいてもよい。
第１の二官能性前駆体は、ナノ粒子表面に反応性のある任意の適切なシラン含有化合物とすることができ、さらなる修飾に、例えば第１の二官能性前駆体をナノ粒子に付着した後に利用可能である官能基を含んでいてもよい。官能基は、ナノ粒子に対して反応性ではない、および／またはシランに対して反応性ではない基であってもよい。第１の二官能性前駆体は、シラン基が一端にありかつ別の官能基（例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、ニトロン、酸化ニトリル、またはアルキン）が他端にあるアルキレン基（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキレン基）を含んでいてもよい。第１の二官能性前駆体は、シラン基が一端にありかつ別の官能基（例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、ニトロン、酸化ニトリル、またはアルキン）が他端にあるヘテロアルキレン基（例えば、Ｃ１～Ｃ６ヘテロアルキレン基）を含んでいてもよい。第１の二官能性前駆体は、シラン基が一端にありかつジエン基、例えば環式ジエニル基（例えば、シクロペンタジエニル基）が他端にあるアルキレン基（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキレン基）を含むことができる。任意の適切なジエン基が使用されてもよい。例えば、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（またはＨｅｔｅｒｏ－Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒ）付加環化を受けるのに適した任意のジエンが使用されてもよい。第１の二官能性前駆体中に存在し得るジエンの例には、限定するものではないがシクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、ブタジエン、およびこれらの誘導体が含まれる。また、例えば別の実体との反応によって修飾が可能なその他の部分は、第１の二官能性前駆体上に存在してもよく、方法は、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加環化の使用に限定されない（例えば、その他の付加環化、またはその他の結合形成反応、例えば本明細書に記述される別の結合形成反応を、使用することができる）。
第１の二官能性前駆体は、式（Ａ）：
Figure 2023516111000003
 の構造を含むことができ、式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、－ＯＲＡ、－ＮＲＢＲＣ、－ＮＯ２、または－ＣＮであり、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく；各Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、ハロ、または－ＯＲＡであり；ＲＡ、ＲＢ、およびＲＣはそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｎは、０から１２の整数であり；およびｍは、０から５の整数である。例えば、Ｒ１は、アルキル、Ｃ３－アルケニル、Ｃ３－アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、－ＯＲＡとすることができ、各アルキル、Ｃ３－アルケニル、Ｃ３－アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく；各Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、ハロ、または－ＯＲＡであり；ＲＡは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｎは０から１２の整数であり；およびｍは０から５の整数である。例えば、Ｒ２は、－ＯＲＡであってもよく、式中、ＲＡは、アルキル（例えば、メチルまたはエチル）であり；ｎは、１から５の整数（例えば、３）であってもよく；およびｍは、０であってもよい。一部の態様では、Ｒ２が－ＯＥｔであり；ｎは３であり；およびｍは０である。例えば、第１の二官能性前駆体は、式（Ａ－１）：
Figure 2023516111000004
 の構造を含むことができる。
第１の二官能性前駆体は、（３－シクロペンタジエニルプロピル）トリエトキシシラン（例えば、実施例３で実証されるように）であってもよく、方法は、１個または複数のシクロペンタジエニル基で官能化されたナノ粒子を提供する。あるいは、第１の二官能性前駆体は、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（例えば、実施例２で実証されるように）であってもよく、方法は、１個または複数のアミン基で官能化されたナノ粒子を提供する。
ナノ粒子と第１の二官能性前駆体とを反応させるステップは、さらに修飾されてもよい、第１の反応性基で官能化されたナノ粒子を提供することができる。例えば、第１の反応性基で官能化されたナノ粒子は、第１の反応性基に対して反応性のある部分を含む第２の二官能性前駆体と接触してもよい。
第１の反応性基で官能化されたナノ粒子と第２の二官能性前駆体とを接触させることは、第１の反応性基と、第１の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した任意の条件下とすることができる。例えば、第１の反応性基と、第１の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、水性反応媒体（例えば、実質的に水である反応媒体）を含むことができる。反応媒体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液（例えば、水性緩衝液）を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、約１×から約５×の間、例えば約１×、約２×、約３×、約４×、または約５×の最終濃度の緩衝液（例えば、ＰＢＳなどの水性緩衝液）を含んでいてもよい。反応媒体は、非プロトン有機溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはアセトニトリルを含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、２０ｖ／ｖ％以下の非プロトン溶媒、例えば１８ｖ／ｖ％未満、１６ｖ／ｖ％未満、１４ｖ／ｖ％未満、１２ｖ／ｖ％未満、１０ｖ／ｖ％未満、８ｖ／ｖ％未満、６ｖ／ｖ％未満、４ｖ／ｖ％未満、２ｖ／ｖ％未満、または１ｖ／ｖ％未満の非プロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、プロトン有機溶媒、例えばアルコール（例えば、ｔｅｒｔ－ブタノール）を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、２０ｖ／ｖ％以下のプロトン溶媒、例えば１８ｖ／ｖ％未満、１６ｖ／ｖ％未満、１４ｖ／ｖ％未満、１２ｖ／ｖ％未満、１０ｖ／ｖ％未満、８ｖ／ｖ％未満、６ｖ／ｖ％未満、４ｖ／ｖ％未満、２ｖ／ｖ％未満、または１ｖ／ｖ％未満のプロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、有機溶媒を実質的に含まなくてもよい（例えば、有機プロトン溶媒を実質的に含まない、非プロトン溶媒を実質的に含まない、またはいかなる有機溶媒も実質的に含まない）。反応媒体は、実質的に水であってもよい。
第１の反応性基と、第１の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、反応混合物を、ある特定の期間にわたり、例えば約１分から約６０分の間、約０．５時間から約２４時間の間、約０．５時間から約１８時間の間、約０．５時間から約１２時間の間、約０．５時間から約６時間の間、約０．５時間から約４時間の間、約０．５時間から約３時間の間、約０．５時間から約２時間の間、約０．５時間から約１時間の間、または約１時間から約４８時間の間の期間にわたり、保持することを含むことができる。例えば、反応媒体は一晩保持されてもよい。
第１の反応性基と、第１の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、反応媒体を、例えば約２０℃またはそれよりも高い温度に、例えば約３５℃またはそれよりも高い、約４０℃またはそれよりも高い、約４５℃またはそれよりも高い、約５０℃またはそれよりも高い、約６０℃またはそれよりも高い、約７０℃またはそれよりも高い、約８０℃またはそれよりも高い、約９０℃またはそれよりも高い、約１００℃またはそれよりも高い、約１１０℃またはそれよりも高い、または約１２０℃またはそれよりも高い、例えば約２０℃から約６０℃の間、約４０℃から約８０℃の間、約６０℃から約１００℃の間、約２０℃から約４０℃の間、約３０℃から約５０℃の間、約４０℃から約６０℃の間、約５０℃から約７０℃の間、約６０℃から約８０℃の間、約７０℃から約９０℃の間、約８０℃から約１００℃の間、または約９０℃から約１１０℃の間の温度に加熱することを含むことができる。条件は、反応混合物を室温で維持することを含んでいてもよい。第１の反応性基と、第１の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、撹拌、振盪、またはその他の混合方法を反応媒体に適用することを含むこともできる。
第１の反応性基は、ジエン（例えば、シクロペンタジエン）とすることができ、第２の二官能性前駆体は、第１の反応性基に対して反応性のあるジエノフィル（例えば、本明細書に記述されるジエノフィル、例えばマレイミド）を含むことができ、接触は、ジエンとジエノフィルとの間のＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加環化を促進させるのに十分な条件下にあってもよい。
ジエノフィルは、任意の適切なジエノフィル、例えば電子欠乏アルケンを含む部分とすることができる。ジエノフィルは、環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、無水マレイン酸、ジアルキルアセチレンジカルボン酸、またはこれらの任意の誘導体を含んでいてもよい。
ジエンおよびジエノフィルの位置は、それぞれ第１の二官能性前駆体上または第２の二官能性前駆体上のいずれかにすることができることが、理解されよう。言い換えれば、本明細書で例示されたある特定の方法は、ジエンを含む第１の二官能性前駆体およびジエノフィルを含む第２の二官能性前駆体を特徴とするが、これらの方法または前駆体は、第１の二官能性前駆体がジエノフィルを含みかつ第２の二官能性前駆体がジエンを含むように、容易に修飾することができる。さらに、ジエンとジエノフィルとの間の反応は本開示において例示されてきたが、第１の反応性基と第２の二官能性前駆体との間のコンジュゲーションは、任意のその他の適切な共有結合形成反応を含むことができ、これは第１の二官能性前駆体および第２の二官能性前駆体上の基を選択することによって決定することができる。例えば、ナノ粒子を官能化する（例えば、プロセスの任意のステップで）、本明細書に開示される方法は、エーテル化、アミド結合形成、クリックケミストリー、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加環化、Ｈｅｔｅｒｏ－Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加環化、１，２－付加、例えばＭｉｃｈａｅｌ付加、Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化、ニトロン－オレフィン付加環化、３＋２付加環化、４＋２付加環化、オレフィンメタセシス、またはＫｏｌｂ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． （２００１） ４０：２００４－２０２１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される任意の反応を、含むことができる。例えば、第２の二官能性前駆体を第１の反応性基を介してナノ粒子にコンジュゲートするのにＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応を使用する代わりに、方法は、第１の反応性基（第１の二官能性前駆体によって導入された）をアミンとすることができるように、および第２の二官能性前駆体がＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を含むことができるように修飾することができ、第２の二官能性前駆体およびアミン基を含む官能化ナノ粒子は、アミン－エステル反応を促進させかつ第１の反応性基と第２の二官能性前駆体との間に結合を形成するのに十分な条件下で接触させることができる。あるいは、第１の反応性基を介して第２の二官能性前駆体をナノ粒子にコンジュゲートするのにＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応を使用する代わりに、クリックケミストリー反応を使用することができ、例えば第１の反応性基（第１の二官能性前駆体により導入された）がアジドまたはアルキンであり、第２の二官能性前駆体がアルキンまたはアジドであり、第２の二官能性前駆体および官能化ナノ粒子は、第１の反応性基と第２の二官能性前駆体との間でクリックケミストリー反応を促進させるのに十分な条件下で、接触することができる。
特定の態様では、第１の二官能性前駆体はジエン（例えば、シクロペンタジエン）を含み、第２の二官能性前駆体は、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応でジエンと反応することができるジエノフィル（例えば、マレイミド）を含み、実施例３で実証されるようにおよびスキーム１にも示されるように、第２の二官能性前駆体をナノ粒子に付着させる（第１の二官能性前駆体を介して）。
第２の二官能性前駆体は、さらに別の反応性基を、例えば第１の反応性基に対して反応性のある部分の反対側にある第２の二官能性前駆体の末端に含んでいてもよい。例えば、第２の二官能性前駆体は、ジエン部分（例えば、ジエノフィル、例えばマレイミド）に対して反応性のある一端に基を含むことができ、かつさらなる修飾に適した他端に別の基を含むことができる。第２の二官能性前駆体上の別の反応性基（官能基と呼ばれることもある）は、アルキン、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリルに対して反応性のある部分であってもよい。反応性基は、クリックケミストリー反応を受けるのに適した部分であってもよい。例えば、反応性基は、アルキン、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリルを含んでいてもよい。アルキンは、歪んだアルキン（ｓｔｒａｉｎｅｄ ａｌｋｙｎｅ）とすることができる。例えば、反応性基は、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基またはその誘導体（ＤＩＢＡＣと呼ばれることもある）を含んでいてもよい。アルキンは、ジベンゾシクロオクチン基（ＤＩＢＯ）またはその誘導体を含んでいてもよい。アルキンは、末端アルキンであってもよい。あるいは、第２の二官能性前駆体上の反応性基は、コンジュゲーションに適した任意のその他の基、例えばジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、ニトロン、酸化ニトリル、アルケン、またはアルケンであってもよい。
第２の二官能性前駆体は、２価のリンカー、例えば、アルキレンまたはヘテロアルキレン基を含むこともでき、アルキレンまたはヘテロアルキレン基は、置換されていないかまたは置換されている（例えば、１個または複数のオキソ基で置換されたアルキレンまたはヘテロアルキレン）。２価のリンカーは、ＰＥＧ基、例えばＰＥＧ４を含むことができる。２価のリンカーは、アミド結合、例えば１、２、３、またはそれよりも多くのアミド結合を含むことができる。各アミド結合は、任意の配向にあってもよい。例えば、アミド結合は、ＰＥＧ基とアルキレン基との間の２価のリンカーに据えられてもよく、アミドのカルボニル基の炭素原子はＰＥＧ基の原子に共有結合により付着され、アミドの窒素原子はアルキレン基の原子に共有結合により付着され；またはアミドのカルボニル基の炭素原子はアルキレン基の原子に付着されてもよく、アミド基の窒素原子はＰＥＧ基の原子に付着されてもよい。２価のリンカー（例えば、ヘテロアルキレン基）は、一端にジエノフィル部分を、および他端にアルキンを、例えばＤＢＣＯ基を含んでいてもよい。あるいは、第２の二官能性前駆体は、ＮＨＳエステルを一端に持ちかつＤＢＣＯ基などのアルキンを他端に持つ２価のリンカー（例えば、ヘテロアルキレン基）を含むことができる。２価のリンカーは、ＰＥＧ基（例えば、ＰＥＧ４部分）、アミド基、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。
第２の二官能性前駆体は、式（Ｂ）
Figure 2023516111000005
 の構造を含むことができ、
式中：Ｘは、反応性基、例えばジエノフィル（例えば、電子欠乏アルケン基を含む部分；または環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、または無水マレイン酸）であり；Ｙは、２価のリンカー（例えば、置換または非置換アルキレンまたはヘテロアルキレン基）であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、－ＯＲＡ、－ＮＲＢＲＣ、－ＮＯ２、または－ＣＮであり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく；ＲＡ、ＲＢ、およびＲＣはそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｑおよびｐはそれぞれ独立して、０から４の整数であり；ｖは、０から２の整数である。例えば、Ｘはマレイミドであってもよく；ｑおよびｐはそれぞれ独立して０の整数であってもよく；およびｖは、１の整数であってもよい。
２価のリンカーは、式（Ｇ）：
Figure 2023516111000006
 の構造を含むことができ、
式中、Ａ１、Ａ２、およびＡ３はそれぞれ独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）－、－Ｎ（ＲＢ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＢ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、および－Ｃ（Ｏ）Ｏ－からなる群より選択され；ＲＢは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｋ、ｖ、ｗ、およびｘはそれぞれ独立して、０から１０の整数であり；および各
Figure 2023516111000007
 は独立して、第２の二官能性前駆体の別の部分との付着点を示す。例えば、Ａ１およびＡ２はそれぞれ独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）－であってもよく；Ａ３は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であってもよく；ＲＢのそれぞれの場合は独立して、水素であってもよく；ｋ、ｖ、およびｗはそれぞれ独立して、２の整数であってもよく；およびｘは、４の整数であってもよい。
２価のリンカーは、式（Ｃ）：
Figure 2023516111000008
 の構造を含むことができ、
式中、各ＲＢは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｘは、０から１０の整数であり；および各
Figure 2023516111000009
 は独立して、第２の二官能性前駆体の別の部分との付着点を示す（例えば、ジエノフィルとのまたはＤＢＣＯの複素環式環の窒素原子との付着）。
２価のリンカーは、式（Ｃ’）：
Figure 2023516111000010
 の構造を含むことができ、
式中、各ＲＢは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｘは、０から１０の整数であり；および各
Figure 2023516111000011
 は独立して、第２の二官能性前駆体の別の部分との付着点を示す（例えば、ジエノフィルとのまたはＤＢＣＯの複素環式環の窒素原子との付着）。
２価のリンカーは、式（Ｃ”）：
Figure 2023516111000012
 の構造を含むことができ、
式中、各ＲＢは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｘは、０から１０の整数であり；および各
Figure 2023516111000013
 は独立して、第２の二官能性前駆体の別の部分との付着点を示す（例えば、ＮＨＳ部分の窒素原子とのまたはＤＢＣＯの複素環式環の窒素原子との付着）。
第２の二官能性前駆体は、式（Ｂ－１）
Figure 2023516111000014
 の構造を含んでいてもよく、
式中、ｘは０から１０の整数である（例えば、４）。例えば、ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってもよい。好ましい実施形態では、ｘが４である。
ジエン部分（例えば、ナノ粒子表面に共有結合により付着されたジエン部分）と第２の二官能性前駆体との反応は、式（ＮＰ－１）
Figure 2023516111000015
 の化合物を提供してもよく、
式中、ｘは０から１０の整数であり（例えば、４）、ケイ素原子はナノ粒子の一部である。例えば、ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってもよい。好ましい実施形態では、ｘが４である。
第２の二官能性前駆体（例えば、ＤＢＣＯ含有前駆体、例えばＤＢＣＯ－マレイミド）と官能化ナノ粒子（例えば、ジエン部分を含むナノ粒子）との間の反応の効率は、第２の二官能性前駆体の拡散係数とは無関係であってもよい。例えば、様々な長さのＰＥＧ基を含む本明細書に開示される第２の二官能性前駆体は、ＰＥＧ長とは無関係に、官能化ナノ粒子と類似の反応性を有していてもよい（例えば、実施例４および図２を参照、様々な長さのＰＥＧを持つＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミド前駆体を用いることは、反応性に著しい影響を及ぼさなかった）。このことは、他の前駆体（例えば、スキーム３または４に示される前駆体）を含む典型的な方法から逸脱しており、反応効率は、前駆体のサイズまたは分子量によって大きな影響を受ける可能性があるものである。本明細書に開示された二官能性前駆体（例えば、第２の二官能性前駆体）は、シラノール基、例えば別の前駆体上またはナノ粒子上のシラノール基との望ましくない静電的相互作用（例えば、反発力）を回避することができる特定の溶解度または極性を有していてもよい。さらに、本明細書に開示される二官能性前駆体（例えば、第２の二官能性前駆体）は、例えばクリックケミストリー反応を使用した、別の前駆体による後続の修飾に関して改善されたアクセス可能性などの所望の性質を持つ、結果として得られる官能化ナノ粒子を得るために（第２の二官能性前駆体とのコンジュゲーション後）、特定の長さ（例えば、ＰＥＧスペーサーに起因して）を有していてもよい。
本明細書に開示された方法は、治療適用などの特定の適用に適したナノ粒子を提供するのに使用されてもよい。例えば、方法は、例えば治療（例えば、がん治療）、外科的ナビゲーション、撮像、診断、またはこれらの組合せで使用するために、生物学的標的を標的とするのに適したナノ粒子を提供するのに使用することができる。ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏ使用に適切であってもよく、またはｅｘ ｖｉｖｏで、例えば分析または診断の適用で使用することができる。本明細書に開示される方法は、生体系の特定の受容体（または受容体の群）を標的とするのに適したナノ粒子を作製するのに使用されてもよい。方法は、ペイロードを１つ（または複数）の生物学的標的に送達するのに適した官能化ナノ粒子（例えば、ＮＤＣ）を調製するのに使用されてもよい。例えば、本明細書に開示される方法を使用して、ナノ粒子を標的化リガンドにおよびペイロード部分にコンジュゲートすることができる。例えば、本明細書に開示される方法は、例えば図１に示される例示的なＮＤＣなど、標的化がん治療のための葉酸受容体標的化ＮＤＣを調製するのに使用することができる。
ナノ粒子と第２の二官能性前駆体との反応は、分子（例えば、標的化リガンドおよび／またはペイロード）とコンジュゲートするのに適した１個または複数の基を含むナノ粒子を提供することができる。例えば、ナノ粒子と、アルキン基を含む第２の二官能性前駆体との反応は、１個または複数のアルキン基で官能化されたナノ粒子を提供することができ、アルキン基はさらに、アルキン反応性基を含む化合物とコンジュゲートされてもよい。
反応性基を含む任意の所望の化合物は、適切な対応する反応性基で官能化された本明細書に開示されるナノ粒子に付着されてもよい。例えば、アルキン反応性基を含む任意の所望の化合物は、アルキンで官能化されたナノ粒子に付着されてもよい。例えば、ペイロード部分（例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカンを含む）またはリンカー－ペイロードコンジュゲート（アルキン反応性基を含む）を、ナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。あるいは、アルキン反応性基を含む標的化リガンド（例えば、葉酸受容体（ＦＲ）標的化リガンド、例えば葉酸）を、ナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。化合物の任意の組合せを、この方法を使用してナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。例えば、標的化リガンドおよびペイロード部分は共に、ナノ粒子にコンジュゲートすることができる。標識（例えば、放射性標識または色素）、ポリマー、および／または高分子などのその他の分子も、この方法を使用してナノ粒子にコンジュゲートすることができる。
例えば、アルキン部分を含むナノ粒子（例えば、本明細書に開示される方法を使用して調製された）は、アルキン反応性基（例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）を含む化合物に、アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件下で接触させることができ、それによって、化合物（例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物）で官能化されたナノ粒子が形成される。
アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件は、任意の適切なクリックケミストリー条件を含んでいてもよい（例えば、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． （２００１） ４０：２００４－２０２１参照）。例えば、アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応を容易にすることは、アルキン部分を含むナノ粒子と、アルキン反応性基を含む化合物とを、銅触媒（例えば、ＣｕＳＯ４、ＣｕＩ、ＣｕＣｌ、Ｃｕ（ＯＡｃ）２、ＣｕＳＯ２、ＣｕＢｒ）などの触媒とともに組み合わせることを含んでいてもよい。クリックケミストリー反応をもたらすことが公知のその他の金属触媒、例えばルテニウム触媒を使用してもよい。あるいは、反応は、触媒なしで（即ち、無触媒条件、例えば銅を含まない条件）実施されてもよい。例えば、官能化ナノ粒子上のアルキンは、無触媒クリックケミストリー反応（例えば、歪み促進型付加環化（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ））に適し得る。例えば、ＤＢＣＯは、触媒なしでクリックケミストリー反応で使用することができる。
アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件は、アルキン部分を含むナノ粒子とアルキン反応性基を含む化合物とを水性反応媒体（例えば、実質的に水である反応媒体）中で組み合わせることを含んでいてもよい。反応媒体は、緩衝液（例えば、水性緩衝液）、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、緩衝液（例えば、ＰＢＳなどの水性緩衝液）を、約１×から約５×の間の最終濃度、例えば約１×、約２×、約３×、約４×、または約５×で含んでいてもよい。反応媒体は、非プロトン有機溶媒、例えばＤＭＳＯまたはアセトニトリル）を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、２０ｖ／ｖ％以下の非プロトン溶媒、例えば１８ｖ／ｖ％未満、１６ｖ／ｖ％未満、１４ｖ／ｖ％未満、１２ｖ／ｖ％未満、１０ｖ／ｖ％未満、８ｖ／ｖ％未満、６ｖ／ｖ％未満、４ｖ／ｖ％未満、２ｖ／ｖ％未満、または１ｖ／ｖ％未満の非プロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体はまた、アルコールなどのプロトン有機溶媒、例えばｔｅｒｔ－ブタノール）を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、２０ｖ／ｖ％以下のプロトン溶媒、例えば１８ｖ／ｖ％未満、１６ｖ／ｖ％未満、１４ｖ／ｖ％未満、１２ｖ／ｖ％未満、１０ｖ／ｖ％未満、８ｖ／ｖ％未満、６ｖ／ｖ％未満、４ｖ／ｖ％未満、２ｖ／ｖ％未満、または１ｖ／ｖ％未満のプロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、有機溶媒を実質的に含まなくてもよい（例えば、有機プロトン溶媒を実質的に含まない、非プロトン溶媒を実質的に含まない、またはいかなる有機溶媒も実質的に含まない）。反応媒体は、実質的に水であってもよい。
アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件は、アルキン部分を含むナノ粒子とアルキン反応性基を含む化合物とを、反応媒体中で、ある特定の期間にわたり、例えば約１分から約６０分の間、約０．５時間から約２４時間の間、約０．５時間から約１８時間の間、約０．５時間から約１２時間の間、約０．５時間から約６時間の間、約０．５時間から約４時間の間、約０．５時間から約３時間の間、約０．５時間から約２時間の間、約０．５時間から約１時間の間、または約１時間から約４８時間の間、組み合わせることを含んでいてもよい。例えば、反応媒体は一晩保持されてもよい。
アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件は、アルキン部分を含むナノ粒子と、アルキン反応性基を含む化合物とを、反応媒体中で組み合わせること、および反応媒体を、例えば約２０℃またはそれよりも高い温度、例えば約３５℃またはそれよりも高い、約４０℃またはそれよりも高い、約４５℃またはそれよりも高い、約５０℃またはそれよりも高い、約６０℃またはそれよりも高い、約７０℃またはそれよりも高い、約８０℃またはそれよりも高い、約９０℃またはそれよりも高い、約１００℃またはそれよりも高い、約１１０℃またはそれよりも高い、あるいは約１２０℃またはそれよりも高い、例えば約２０℃から約６０℃の間、約４０℃から約８０℃の間、約６０℃から約１００℃の間、約２０℃から約４０℃の間、約３０℃から約５０℃の間、約４０℃から約６０℃の間、約５０℃から約７０℃の間、約６０℃から約８０℃の間、約７０℃から約９０℃の間、約８０℃から約１００℃の間、または約９０℃から約１１０℃の間の温度に加熱することを含んでいてもよい。あるいは、反応条件は、反応混合物を室温で維持することを含んでいてもよい。第１の反応性基と、第１の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、撹拌、振盪、またはその他の混合方法の反応媒体への適用を含むこともできる。
反応性基（例えば、アルキン反応性基）を含む化合物は、標的化リガンドを含んでいてもよく、さらにリンカー（例えば、切断不能リンカー）を含んでいてもよい。標的化リガンドは、葉酸受容体標的化リガンドとすることができる。例えば、標的化リガンドは、葉酸受容体、例えばがん細胞または腫瘍上に発現する葉酸受容体に結合することができる分子であってもよい。葉酸受容体（ＦＲ）標的化リガンドは、葉酸、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、またはその葉酸受容体結合誘導体であってもよい。葉酸受容体標的化リガンドは、葉酸受容体を標的にすることができる高分子、例えばタンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、または抗体断片であり得る。例えば、葉酸受容体標的化リガンドは、インタクトな抗体の一部分、例えば、抗体の抗原結合または可変領域などを含んでいてもよい。葉酸受容体標的抗体断片の例には、限定するものではないがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦＶダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、または単離された相補的決定領域（ＣＤＲ）領域が含まれる。抗体の抗原結合断片は、任意の手段によって生成されてもよい。例えば、抗体の抗原結合断片は、インタクトな抗体の断片化により、酵素によってまたは化学的に生成されてもよく、および／または部分抗体配列をコード化する遺伝子から組換えにより生成されてもよい。あるいは、または追加として、抗体の抗原結合断片は、全体的にまたは部分的に合成により生成されてもよい。リンカーは、任意の適切な２価のリンカー、例えばアルキレンまたはヘテロアルキレン基とすることができる。２価のリンカーは、ＰＥＧ基（例えば、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、またはＰＥＧ４、基）であってもよい。
反応性基（例えば、アルキン反応性基）を含む化合物は、式（Ｄ’）：
Figure 2023516111000016
 の構造を含んでいてもよく、式中、Ｊは反応性基、例えばアルキン反応性基であり；例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリルであり）；Ｔは、標的化リガンド（例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸またはその誘導体）であり；ｙは、０から２０の整数（例えば、３）である。例えば、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば２、３、または４であってもよい。
アルキン反応性基を含む化合物は、式（Ｄ）：
Figure 2023516111000017
 の構造を含んでいてもよく、式中、Ｔは、標的化リガンド（例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸またはその誘導体）であり；およびｙは、０から２０の整数（例えば、３）である。例えば、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば２、３、または４であってもよい。
反応性基（例えば、アルキン反応性基）を含む化合物は、式（Ｄ－１’）：
Figure 2023516111000018
 の構造を含んでいてもよく、
式中、Ｊは、反応性基（例えば、アルキン反応性基；例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）であり；ｙは、０から２０の整数（例えば、３）である。例えば、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば２、３、または４であってもよい。
アルキン反応性基を含む化合物は、式（Ｄ－１）：
Figure 2023516111000019
 の構造を含んでいてもよく、
式中、ｙは、０から２０の整数（例えば、３）である。例えば、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば２、３、または４であってもよい。
反応性基（例えば、アルキン反応性基）を含む化合物は、ペイロード部分を含んでいてもよく、リンカー（例えば、切断可能リンカー）をさらに含んでいてもよい。ペイロード部分は、がん治療での使用など、治療上の使用を有する分子とすることができる。例えば、ペイロード部分は、細胞毒性化合物、例えば細胞毒性の性質を持つ小分子とすることができる。
例示的なペイロードには、酵素阻害剤（例えば、”Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，” Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｃｏｐｅｌａｎｄ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ参照）、例えばトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エキサテカン、ＳＮ－３８、トポテカン、イリノテカン、カムプトテシン、ベロテカン、インデノイソキノリン、フェナントリジン、インドロカルバゾール、およびこれらの類似体）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝バインダー、チューブリン擾乱剤（ｔｕｂｕｌｉｎ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）、ＤＮＡ切断剤（ＤＮＡ ｃｌｅａｖｅｒ）、アントラサイクリン、ビンカ薬物、マイトマイシン（例えば、マイトマイシン－Ｃ、マイトマイシン－Ａ）、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン、ジイネン、エネジイン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、アウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ））、マイタンシノイド、分化誘導剤、デュオカルマイシン、およびタキサン（例えば、タキソール）が含まれる。例えば、ペイロードは、エキサテカン、ＳＮ－３８、トポテカン、イリノテカン、ベロテカン、９－アミノカムプトテシン、エトポシド、カムプトテシン、タキソール、エスペラマイシン、１，８－ジヒドロキシ－ビシクロ［７．３．１］トリデカ－４－９－ジエン－２，６－ジイン－１３－オン、ポドフィロトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、モルホリン－ドキソルビシン、Ｎ－（５，５－ジアセトキシ－ペンチル）ドキソルビシン、米国特許第５，１９８，５６０号に記載される化合物、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、ピロロベンゾジアゼピン、１－（２ クロロエチル）－１，２－ジメタンスルホニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、ドラスタチン、アウリスタチン、カリケアマイシンヒドラジド、エスペラマイシン、および６－メルカプトプリン、メトトレキセート、酪酸、レチノイン酸、またはこれらの誘導体であってもよい。
本開示のコンジュゲートを調製する目的で、ペイロードとリンカーとの反応をより都合良く行うために、化学修飾は所望のペイロードになされてもよいことが理解されよう。例えば、官能基、例えばアミン、ヒドロキシル、またはスルフヒドリルは、薬物の活性またはその他の性質に対して最小限のまたは許容される効果を発揮する位置で、薬物に付加されてもよい。
リンカーは、任意の適切な２価のリンカーであってもよく、ある特定の条件下で切断可能な一部分を含むことができる。例えば、リンカーは、ある特定の条件下、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでペイロードを放出することが可能な自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒ）とすることができる。リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカー（例えば、カテプシンまたはトリプシンなどのプロテアーゼによって切断可能）、ｐＨ感受性リンカー、またはレドックス感受性リンカーであってもよい。プロテアーゼ切断可能リンカーは、カテプシンＢ（Ｃａｔ－Ｂ）切断可能リンカーとすることができる。リンカーは、例えばがん細胞などの細胞内での有効な切断のために、ペプチド部分（例えば、ジペプチド）、ＰＥＧスペーサー、および／または自己犠牲部分（例えば、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ））を含んでいてもよい。切断可能なリンカーは、所望の場所でまたは選択された時間の後（例えば、標的化されたがん細胞に進入した後）に選択的に切断されてもよい。
反応性基（例えば、アルキン反応性基）を含む化合物は、式（Ｅ’）：
Figure 2023516111000020
 の構造を含んでいてもよく、式中、Ｊは、反応性基（例えば、アルキン反応性基；例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）であり；Ｌは、切断可能なリンカー部分（例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー部分）であり；Ｐは、ペイロード部分（例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン）であり；およびｙは０から２０の整数（例えば、９）である。例えば、Ｌは、プロテアーゼ切断可能リンカー部分であってもよく、Ｐは、エキサテカンであってもよく、およびｙは、０から２０の整数（例えば、７、８、９、１０、または１１）であってもよい。
アルキン反応性基を含む化合物は、式（Ｅ）：
Figure 2023516111000021
 の構造を含んでいてもよく、式中、Ｌは切断可能リンカー部分（例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー部分）であり；Ｐは、ペイロード部分（例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン）であり；およびｙは、０から２０の整数（例えば、９）である。例えば、Ｌは、プロテアーゼ切断可能リンカー部分であってもよく、Ｐはエキサテカンであってもよく、およびｙは、０から２０の整数（例えば、７、８、９、１０、または１１）であってもよい。
切断可能リンカー部分は、式（Ｆ）：
Figure 2023516111000022
 の構造を含むことができ、
式中、［ＡＡ］のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり；ｚは１から５の整数であり；ｗは１から４の整数（例えば、２または３であり）；および各
Figure 2023516111000023
 は、反応性基を含む化合物の別の部分との付着点（例えば、アルキン反応性基、例えばＰＥＧ基との付着、アルキン反応性基との付着、またはペイロード部分との付着）を示す。例えば、－［ＡＡ］ｗ－は、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、またはＶａｌ－Ａｌａを含んでいてもよく、ｚは２であってもよく、１つの
Figure 2023516111000024
 は、ＰＥＧ基の酸素原子との付着点を示し、他の
Figure 2023516111000025
 は、エキサテカンの窒素原子との付着点を示す。
切断可能リンカー部分は、式（Ｆ－１）：
Figure 2023516111000026
 の構造を含むことができ、
式中、１つの
Figure 2023516111000027
 は、反応性基を含む化合物の別の部分との付着点を示す（例えば、アルキン反応性基；例えばＰＥＧ基との付着、アルキン反応性基との付着、またはペイロード部分との付着）。例えば、１つの
Figure 2023516111000028
 は、ＰＥＧ基の酸素原子との付着を示してもよく、他の
Figure 2023516111000029
 は、エキサテカンの窒素原子との付着を示してもよい。
反応性基（例えば、アルキン反応性基）を含む化合物は、式（Ｅ－１’）：
Figure 2023516111000030
 の構造を含んでいてもよく、
式中、Ｊは反応性基（例えば、アルキン反応性基；例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）であり；ｙが０から２０の整数（例えば、９）である。
アルキン反応性基を含む化合物は、式（Ｅ－１）：
Figure 2023516111000031
 の構造を含んでいてもよく、
式中、ｙは０から２０の整数（例えば、９）である。
アルキン部分（例えば、ナノ粒子に共有結合により付着されたアルキン）と、アルキン反応性基を含む化合物（例えば、式Ｄの化合物、例えばＤ－１）との反応は、式（ＮＰ－２）：
Figure 2023516111000032
 の化合物を提供することができ、
式中、ｘは、０から１０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、例えば４）であり、ｙは、０から２０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば３）であり、ケイ素原子はナノ粒子の一部である（例えば、コア－シェルシリカナノ粒子のシリカシェルに結合される）。
アルキン部分（例えば、ナノ粒子に共有結合により付着されたアルキン部分）と、アルキン反応性基を含む化合物（例えば、式Ｅの化合物、例えばＥ－１）との反応は、式（ＮＰ－３）：
Figure 2023516111000033
 の化合物を提供することができ、
式中、ｘは、０から１０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、例えば４）であり、ｙは、０から２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば９）であり、ケイ素原子はナノ粒子の一部（例えば、コア－シェルシリカナノ粒子のシリカシェルで結合された）である。
プロテアーゼ切断可能リンカーを介して連結されたペイロード（エキサテカン）を含む例示的なＮＤＣと、リンカーの切断およびペイロードの放出のメカニズムを、スキーム２に示す。
スキーム２． 本明細書に開示された方法により生成された例示的なＮＤＣおよびカテプシンＢ（Ｃａｔ－Ｂ）によるその切断。
Figure 2023516111000034
本明細書に開示される方法は、所望の数の標的化リガンドまたはペイロード部分を持つナノ粒子薬物コンジュゲートを得るのに使用することができる。例えば、本明細書に開示される方法を使用して生成されたＮＤＣは、ナノ粒子のペイロード（例えば、エキサテカンまたはその塩もしくは類似体）に対する平均比が約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３２、１：３４、１：３６、１：３８、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、または１：８０であってもよい。例えば、各ナノ粒子上のエキサテカン分子の平均数は、ナノ粒子当たり約５から約１０個の間、約１０から約１５個の間、約１５から約２０個の間、約２０から約２５個の間、または約２５から約３０個の間、例えば約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０個のエキサテカン分子であってもよい。本明細書に開示される方法を使用して生成されたＮＤＣは、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、または１：３０の、ナノ粒子の標的化リガンド（例えば、葉酸）に対する平均比を有していてもよい。例えば、ナノ粒子の標的化リガンドに対する平均比は、約１から約２０に及ぶことができ、例えば各ナノ粒子上の葉酸分子の平均数は、ナノ粒子当たり約５から約１０個の間、約１０から約１５個の間、または約１５から約２０個の間、たとえば約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５個の葉酸分子であってもよい。
本明細書で例示される方法は、アルキンでナノ粒子を官能化し、アルキン反応性部分を含む化合物をナノ粒子にコンジュゲートすることを特徴とするが、これらの官能基は逆転させてもよいことが理解されよう。例えば、本明細書に開示される方法は、アルキン反応性部分（例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）でナノ粒子を官能化し、さらに官能化ナノ粒子を、アルキンを含む化合物とコンジュゲートするように修正することができる。例えば、ナノ粒子は、第１の二官能性前駆体で官能化することができ、その後、アルキン反応性基を含む第２の二官能性前駆体とコンジュゲートすることができ、それによって、アルキン反応性基（例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）で官能化されたナノ粒子が提供される。次いでアルキンを含む化合物（例えば、標的化リガンドまたはペイロード）をナノ粒子と反応させて、化合物をナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。
本明細書に開示される方法は、ナノ粒子を官能化するためのその他の方法の欠点を克服することができる。例えば、本明細書に開示される方法は、その他の方法を使用して作製されたナノ粒子コンジュゲートの限られた安定性に対処することができる。特に、本明細書に開示される方法は、反応性の高い基（例えば、ある特定のアミン基）を含む二官能性前駆体を使用したときに生じる可能性のある、リンカー部分における結合の加水分解を促進させない、比較的安定した二官能性前駆体を特徴とする。さらに、本明細書に開示される方法は、例えば静電気引力またはその他の望ましくない分子間もしくは分子内相互作用に起因する、その他の二官能性前駆体（例えば、アミン含有二官能性前駆体）を使用したときに生じる可能性のある自己縮合を反応中に実質的に行わない二官能性前駆体を用いる。これらの課題の克服は、収率を大幅に増大させることができ、臨床使用が意図されるＮＤＣの生成に特に関連のある、通常なら必要と考えられる困難または不可能な精製プロセスを回避することができる。したがって本明細書に開示される方法は、高度に純粋な官能化ナノ粒子を生成する際のその容易さおよび信頼性に起因して、臨床使用に意図されるＮＤＣを生成するのに特に有用である。
本明細書に開示された方法を使用して生成された官能化ナノ粒子は、例えば透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により測定されたとき、均一な形態および狭いサイズ分布を示すことができる。ナノ粒子は、例えばナノ粒子の内部または表面の色素またはリガンドの吸収ピーク特性を同定するために、ＴＥＭまたはＵＶ分光法によって特徴付けられてもよい。ナノ粒子の純度は、クロマトグラフィー、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して評価することができる。本明細書に開示される方法は、様々な反応規模の全体を通しておよびバッチごとに、高度に一貫したナノ粒子特性を提供することもできる。
本明細書に記述される本発明を、より十分に理解し得るようにするために、下記の実施例について述べる。これらの実施例は、本明細書に提供される方法および官能化ナノ粒子を示すために提供され、いかなる方法によってもそれらの範囲を限定すると解釈するものではない。
本明細書で提供される化合物は、当業者に周知と考えられる、以下に述べる特定の合成プロトコールに対する改変を使用して、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的なまたは好ましいプロセス条件（即ち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられる場合、他に述べない限りその他のプロセス条件を使用できることも理解されよう。最適な反応条件は、使用される特定の反応物または溶媒と共に変えてもよく、しかしそのような条件は、通常の最適化手順によって当業者が決定することができる。
さらに、当業者に明らかにされるように、従来の保護基は、ある特定の官能基が所望の反応を受けないようにするのに必要と考えられる。特定の官能基に適した保護基、ならびに保護および脱保護に適した条件の選択は、当技術分野で周知である。例えば、数多くの保護基とそれらの導入および除去は、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１、およびそこに引用される参考文献に、記載されている。
［０１４５］
材料および方法
全ての材料は、受け取ったままの状態で使用した。全ての非水性反応は、火炎乾燥したガラス器具で、アルゴンの陽圧下で実行した。無水溶媒は、商業上の供給元（ＲＡＮＫＥＭ）から購入した。フラッシュクロマトグラフィーを、指示される溶媒系により２３０～４００メッシュのシリカゲル上で行った。プロトン核磁気共鳴スペクトルを、重水素化クロロホルムまたはＤＭＳＯを溶媒として使用して、Ｂｒｕｋｅｒ分光計で、４００ＭＨＺで記録した。ピーク位置は、内部標準としてのテトラメチルシランから百万分率単位で低磁場に与えられた。Ｊ値は、ヘルツを単位として表される。質量分析は、エレクトロスプレー（ＥＳ）技法を使用する（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｓｈｉｍａｄｚｕ）分光計で行った。ＨＰＬＣ分析は、（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｗａｔｅｒｓ）、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ－１８（１０００×４．６ｍｍ；５ｕ）を備えたＰＤＡ－ＵＶ検出器で行い、試験した全ての化合物は、この方法を使用して＞９５％純粋であることを決定した。本明細書に記述される手順に従い調製された化合物は、分取ＨＰＬＣ法によって単離されてもよい。シアニン５マレイミドは、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅから購入した。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド、葉酸－ＰＥＧ－アジド、およびエキサテカン－リンカーコンジュゲートは、ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ、Ｔｉａｎｊｉｎ、Ｃｈｉｎａによるカスタム合成から得た。（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）６－９プロピル］トリメトキシシラン、および（３－シクロペンタジエニルプロピル）トリエトキシシラン前駆体を、Ｇｅｌｅｓｔから購入した。１０×ＰＢＳを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ヒトカテプシン－Ｂは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから購入した。ヒトおよびマウス血清は、ＢＩＯＩＶＴ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から購入した。全てのその他の化学物質は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから購入した。Ｃｙ５－Ｃ’ドットは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （２０１５） ２７（１１）：４１１９－４１３３に記載されたプロトコールに従い調製した。
ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）の特徴付けおよび精製は、Ｃｈｅｎ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （２０１７） ２９（２０）：８７６６－８７７９に概説された手順に従い行った。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）の特徴付けは、ナノ粒子の分布を実証するために、Ｔｉｔａｎ Ｃｕｂｅｄ Ｔｈｅｍｉｓ ３００ ＴＥＭおよび高角度環状暗視野（ＨＡＡＤＦ）撮像を使用して行った。試料のＵＶ－可視分光法分析を、Ｃａｒｙ ５０００ ＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲ分光光度計を使用して行った。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）測定は、Ｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （２０１６） ２８（５）：１５３７－１５４５に記載されている自作のＦＣＳ装置を使用して行った。６３３ｎｍの固体レーザーを使用して、Ｃ’ドットのシリカコアに被包されたＣｙ５色素を励起した。フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器に連結されたＲＰ－ＨＰＬＣは、市販のＷａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（５０×４．６ｍｍ）を使用してナノ粒子コンジュゲート（ＦＡ－ＣＤＣを含む）の純度を評価するのに使用した。分離のための移動相は、８５％Ａ（脱イオン水中０．１体積％のトリフルオロ酢酸）／１５％Ｂ（アセトニトリル）の組成で開始する勾配溶出であり、組成は、１５分間にわたって５％Ａ／９５％Ｂに直線的に変化する。ＲＰ－ＨＰＬＣは、異なる極性を持つ分子を分離し、その超小型の１０ｎｍに満たない粒度により、ＦＡ－ＣＤＣの分析法として適している。ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、ナノ粒子は、ナノ粒子と非共有結合により関連付けられ、分解されたリガンドまたは強制的に放出された成分などのその他の化学的部分から十分に分離される。種々の化学的部分は、ＰＤＡ検出器を使用して収集された溶出時間および固有のＵＶ／可視スペクトルに基づいて特定される。試料中の不純物含量は、主要な不純物に関する参照標準材料により作成した較正曲線を使用して定量することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の特徴付けを、ＰＤＡ検出器に連結されたＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰＷＸＬ ４０００ ７．８ｍｍ×３００ｍｍカラムを使用して、８０％の脱イオン水中０．９重量％塩化ナトリウムと、２０％のアセトニトリルとで構成された移動相により行った。分離は、均一溶媒モードで３０分間にわたり行い、分離の典型的な流量は０．６ｍＬ／分であった。
（実施例１）
ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シランを使用した例示的な官能化ナノ粒子の合成。
Figure 2023516111000035
 スキーム３． ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シランを使用してＤＢＣＯでナノ粒子を官能化する例示的な１ステップ法。
Ｃｙ５－Ｃ’ドットを、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で、脱イオン水で希釈して所望の濃度にし、典型的には１５から３０μＭの間の濃度にした。ＤＢＣＯ－ＰＥＧｎ－シラン（ｎ＝４または１２）をＤＭＳＯに溶解し、撹拌しながら反応に添加して、粒子のＤＢＣＯに対する所望のモル比を達成した。室温で一晩の反応後、反応溶液を濃縮し、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して精製した。ナノ粒子に付着されたＤＢＣＯ基の数を、図２に提示する。
（実施例２）
アミン系前駆体を使用した例示的な官能化ナノ粒子の合成。
有機ポリマーコーティング（例えば、ＰＥＧ層）の下のナノ粒子の表面のシラノール基は、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シランなどの嵩高い分子に対して容易にアクセス可能ではない。結果は、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シランを二官能性前駆体として使用した場合（例えば、実施例１におけるように）、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－シランのナノ粒子に対する反応比が高い場合であっても（図２参照）、１個または２個のＤＢＣＯ基しか各ナノ粒子（例えば、Ｃ’ドット）に付着できない。したがって、代替の２ステップ反応が設計され、スキーム４に示されるように高い拡散係数をもつ比較的小さいシラン分子を用いた。
Figure 2023516111000036
 スキーム４． アミン－シラン二官能性前駆体を使用してＤＢＣＯでナノ粒子を官能化する例示的な２ステップ法。
Ｃｙ５－Ｃ’ドットを、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で脱イオン水で希釈して所望の濃度にし、典型的には１５から３０μＭの間にした。（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）をＣ’ドット溶液中に撹拌しながら添加して、粒子のＡＰＴＭＳに対する所望のモル比を達成した。一晩反応後、ＤＭＳＯ中のＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルを添加して、粒子のＤＢＣＯに対する所望のモル比に到達させ、かつアミン－エステル反応を介してＣ’ドット上のアミン基にさらにコンジュゲートした。反応を室温で一晩そのままにし、次いで濃縮し、ＧＰＣを使用して精製した。ＧＰＣ精製後、０．９％の食塩水中の精製された粒子を、水浴中で一晩、８０℃に加熱した。熱処理後、溶液を濃縮し、ＧＰＣを使用して再び精製して、アミン系ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットを得た。単一ステップ反応と比較して、この２ステップ反応は、小さいシラン分子の高速拡散を利用して、ＰＥＧ層下のそれらのシラノール基に対する反応性を高め、２０個よりも多いＤＢＣＯ基を各Ｃ’ドット上に容易に付着させることが可能になる（図２参照）。
しかしながら、この手法を使用して生成されるアミン系ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットは、限られた安定性を示した。例えば、かなりの量のＤＢＣＯが、３７℃のＰＢＳ中で一晩インキュベートされた後にＣ’ドットから脱離し（図３Ａ参照）、これはＤＢＣＯ基とＣ’ドットとの間のアミド結合の加水分解に起因する可能性があり、Ｃ’ドット表面に残留する第一級アミン基によって加速される。さらに、アミン－シラン分子は、それらの正に帯電したアミン部分と負に帯電したシラノール部分との間の静電的引力に起因して反応中に自己縮合する可能性がある。アミン－シラン凝集体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってＣ’ドット溶液から除去するのが難しく（図３Ｃ参照）、望ましくない下流の影響をもたらす可能性がある。例えば、投与される場合、これらの凝集体は、アミンの正電荷に起因して腎臓貯留をもたらし得る。
（実施例３）
コンジュゲーション化学合成のスクリーニング
実施例２に記述されるアミン－シラン前駆体を使用することの欠点を克服するために、コンジュゲーション化学のライブラリーをスクリーニングし、これを表１にまとめる。
表１． コンジュゲーション化学のスクリーニング。
Figure 2023516111000037
 ａ 粒子当たりのアジド基の数は、ＵＶ－Ｖｉｓスペクトルから直接定量できない。したがってＤＢＣＯ－Ｃｙ３分子を、アジド官能化Ｃ’ドットにさらにコンジュゲートし、ＤＢＣＯとアジドとの間のクリックケミストリー反応を介してＣｙ３を粒子に付着させた； ｂ Ｃ’ドット上のアルキン基の存在は、２９０ｎｍでのアルキンの特異的な吸光度ピークによって検証された； ｃ合成プロトコールの最適化後に得られた； ｄ ＤＢＣＯ－Ｃｙ３分子をさらに、アジド官能化Ｃ’ドットにコンジュゲートし、Ｃｙ３を、ＤＢＣＯとアジドとの間のクリックケミストリー反応を介して粒子に付着させた。
（実施例４）
ジエン系ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットの合成
Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応の使用は、アミン－エステル反応の適切な置換えとして実施例３で特定された。例えば、実施例２に記述される方法で使用したアミン－シランは、シクロペンタジエン基でＣ’ドットを最初に官能化するために（３－シクロペンタジエニルプロピル）トリエトキシシラン（「ジエン－シラン」）と置き換えることができ、実施例２の方法で使用したＤＢＣＯ－ＰＥＧ－ＮＨＳエステルは、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミドと置き換えることができる。この方法をスキーム５に示し、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミド上のマレイミド基とＣ’ドット上のジエン基との間のＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応を使用して、ＤＢＣＯ（リンカーを介して）をナノ粒子に付着することができる。
Figure 2023516111000038
 スキーム５． ジエン－シラン二官能性前駆体を使用してＤＢＣＯでナノ粒子を官能化する例示的な２ステップ法。
Ｃｙ５－Ｃ’ドットを、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で、脱イオン水で希釈して所望の濃度にし、典型的には１５から３０μＭの間にした。（３－シクロペンタジエニルプロピル）トリエトキシシラン（シクロペンタジエン）を最初にＤＭＳＯ中で１００×に希釈し、次いで撹拌しながら反応に添加して、粒子のシクロペンタジエンに対する所望のモル比に到達させた。一晩の反応後、１０×ＰＢＳを反応に添加して、１×ＰＢＳの最終濃度に到達させた。次に、ＤＢＣＯ－マレイミド前駆体（ＤＢＣＯ－ｍａｌ、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ｍａｌ、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ｍａｌ、またはＤＢＣＯ－スルホ－ｍａｌ）をＤＭＳＯに溶解し、反応に添加して、粒子のＤＢＣＯに対する所望のモル比に到達させた。約３０分から１時間混合後、反応混合物を、一晩撹拌しながら８０℃に加熱した。次いで反応溶液を濃縮し、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して精製し、ジエン系ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットを得た。
理論に拘束されることを望まないが、シクロペンタジエン基の中性電荷は、前駆体としてアミン－シランを使用したときにＣ’ドット上の第一級アミンによって加速する可能性がある、連結におけるアミド結合の加水分解を、回避すると考えられる。したがって、この方法を使用して生成されるＣ’ドットは、非常に安定している（図３Ｂ参照）。さらに、シクロペンタジエン基の使用は、反応中のシランの自己縮合を大幅に減じ（図３Ｄ参照）、官能化ナノ粒子（例えば、ＤＢＣＯ－Ｃ’ドット）の安定性、サイズの均質性、反応収率、および純度を改善する。
ＤＢＣＯ含有前駆体（例えば、ＤＢＣＯ－マレイミド）の反応効率は、その拡散係数とは無関係である。例えば、様々なＰＥＧスペーサー長および分子量を持つＤＢＣＯ－マレイミド前駆体を、Ｃ’ドットの官能化に用いる場合であっても、得られたＣ’ドットのそれぞれに付着されたＤＢＣＯ基の数は一定のままであった（図２参照）。このことは、反応効率がシランのモル質量に大きく影響を受ける可能性がある、その他の二官能性前駆体を含む典型的な方法から逸脱している。このことは、Ｃ’ドットと嵩高いシランとの反応からの低収率が、シランの自己縮合により主に引き起こされ、そのナノ粒子の有機ポリマーコーティング（例えば、Ｃ’ドットＰＥＧ層）内への拡散および後続の反応と競合することも示唆している。ＤＢＣＯ－マレイミド前駆体とナノ粒子（例えば、Ｃ’ドット）との間の反応は、使用されるＤＢＣＯ－マレイミド前駆体の疎水性および電荷状態に対して感受性がある可能性がある。例えば、負電荷を持つ比較的親水性の分子、例えば親水性スルホン化スペーサーを持つＤＢＣＯ－スルホ－マレイミドは、比較的乏しい反応性を示す。理論に拘束されることを望まないが、この乏しい反応性は、増大した水溶解度と、負に帯電したシラノール基からの静電反発力に起因する可能性がある。これらの結果に基づいて、４つのエチレングリコール単位を持つ短いＰＥＧスペーサーをＤＢＣＯ－マレイミド前駆体で使用して、Ｃ’ドット表面のＤＢＣＯ基に、例えばクリックケミストリー反応を使用して後続の修飾用に所望のアクセス可能性を与えた。
（実施例５）
ＦＡ－ＣＤＣの合成
本明細書に開示される方法によって生成されたアルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）を含むＮＤＣを、反応性基、例えばアルキン反応性基（例えば、アジド）を含む化合物とさらにコンジュゲートすることができる。これらの化合物は、例えば合成実施例１に記述されるようにペイロード－リンカーコンジュゲート前駆体、および／または例えば合成実施例２に記述されるように葉酸塩標的化リガンド前駆体を含むことができる。
例えば、クリックケミストリーを使用して、本明細書に開示される方法によって生成されたＤＢＣＯ－Ｃ’ドットをアジド官能化葉酸－リンカーコンジュゲート（葉酸受容体（ＦＲ）を発現するがんを標的にするための標的化リガンドとして適切である）、およびアジド官能化エキサテカン－リンカーコンジュゲート（エキサテカンは、がんの処置に適したトポイソメラーゼＩ阻害剤薬物である）とコンジュゲートした。葉酸部分を、切断不能リンカーを通して付着し、一方、エキサテカン部分は、カテプシン－Ｂ（Ｃａｔ－Ｂ）切断可能リンカー（Ｃａｔ－Ｂは、細胞リソソームに存在する酵素であり、様々な悪性疾患で過剰発現される）を通して付着した。これらの方法を、スキーム６に示す。
Figure 2023516111000039
 スキーム６． 葉酸部分およびエキサテカン部分でナノ粒子を官能化する例示的な方法。
ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットを、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で、脱イオン水で希釈して所望の濃度にし、典型的には１５から３０μＭの間にした。ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットを葉酸リガンドで官能化するため、葉酸塩－ＰＥＧ－アジドをＤＭＳＯに溶解し、撹拌しながら反応に添加して、粒子当たり所望の数のリガンドを達成した。反応を室温で一晩そのままにし、変換率を、プロセス内ＨＰＬＣ純度試験によりチェックした（典型的には９５％よりも高い）。純度が９５％よりも下である場合、反応溶液を濃縮し、ＧＰＣを使用して精製することができると考えられる。葉酸官能化Ｃ’ドットを中間体として単離して、ＵＶ－Ｖｉｓを使用して粒子当たりの葉酸リガンドの数を決定した。葉酸官能化Ｃ’ドットと切断可能エキサテカンとをさらにコンジュゲートするため、粒子濃度を必要に応じて調節した。切断可能リンカー－エキサテカンコンジュゲートをＤＭＳＯに溶解し、撹拌しながら粒子溶液に添加して、粒子当たり所望の数のペイロードを達成した。反応を室温で一晩そのままにし、次いで反応溶液を濃縮し、ＧＰＣを使用して精製して、ＦＡ－ＣＤＣを得た。
得られた標的化されたＮＤＣは、平均コアサイズ３．９ｎｍで、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）の下、均一な形態および狭いサイズ分布を示した。ＮＤＣの平均流体力学直径は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により６．４ｎｍであることが決定され（図４）、ＴＥＭと一致したが、これは２．５ｎｍの差が、ＴＥＭで観察することができない有機ＰＥＧ層に起因するからである。最終精製ＮＤＣは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）およびＳＥＣ（図６Ａ～６Ｂ）の両方によって特徴付けられたように、９９．０％よりも高い純度を有した。ＮＤＣのこれらの品質属性は、様々な反応規模にわたりバッチごとに高度に一貫していることが実証された（表２）。
表２． 例示的な規模でのバッチ間でのＮＤＣの特性。
Figure 2023516111000040
ＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを、標的化されたＮＤＣを生成するために、Ｃ’ドットがシクロペンタジエン、ＤＢＣＯ、葉酸、およびエキサテカンで順次官能化されたときに各ステップで収集した。特性吸収ピークを使用して、各リガンドの存在を検証しかつ粒子当たりのリガンドの数を決定した（図５）。ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットは、共有結合により被包されたＣｙ５に相当する６４７ｎｍで１つの吸収ピークを示し、ＤＢＣＯ基に相当する３０８ｎｍおよび２９０ｎｍでダブレットピークを示した。Ｃｙ５およびＤＢＣＯのモル濃度は、それらの吸光係数を使用してそれぞれ６４７ｎｍおよび３０８ｎｍでＢｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則を適用することにより、決定することができる。粒子濃度は、ＦＣＳにより決定されるように、Ｃｙ５のモル濃度を、粒子当たりのＣｙ５色素の数で割ることによって得られた。粒子当たりのＤＢＣＯ基の数は、ＤＢＣＯ基のモル濃度を粒子濃度で割ることによって得た。
エキサテカンペイロードを付着する前の葉酸官能化Ｃ’ドットのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを使用して、粒子の濃度およびＦＲ標的化リガンドの濃度を、それぞれ６４７ｎｍ（共有結合により被包されたＣｙ５に相当）および３６０ｎｍ（葉酸標的化リガンドに相当）で、Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則を適用することによって決定した。粒子当たりのＦＲ標的化リガンドの数は、ＦＲ標的化リガンドのモル濃度を、粒子濃度で割ることによって決定した。ＦＲ標的化リガンドの数は、ＦＡ－ＣＤＣを生成する後続の処理において変化しないままであることが確認されてきた。
同様に、ＦＡ－ＣＤＣのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを使用して、ＦＡ－ＣＤＣ粒子の濃度ならびに切断可能エキサテカンの濃度を、Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則を６４７ｎｍおよび３６０ｎｍ（葉酸標的化リガンドおよびエキサテカンの両方に相当する）で適用することによって、３６０ｎｍでＦＲ標的化リガンドの吸光度を差し引いた後に、決定することができる。次いでエキサテカンの濃度を、ＦＡ－ＣＤＣ粒子の濃度で割ることにより、粒子当たりのエキサテカンの数を決定した。
（実施例６）
食塩水、ＰＢＳ、ヒトおよびマウス血清におけるＮＤＣの安定性
本明細書で生成されたＮＤＣの安定性を、０．９％の食塩水、ＰＢＳ、ヒト血漿（１０％）、およびマウス血漿（１０％）中、３７℃で、振盪乾燥浴内で種々の期間にわたりインキュベーションした後、評価した。分析前に、試料中の血漿タンパク質を、等体積の冷アセトニトリルの添加を経た沈殿によって除去し、その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４２５微量遠心分離機で１００００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、透明な上澄みを、遠心管から透明な完全回収ＨＰＬＣバイアルに移した。目に見えるいかなる凝集もない上澄みを、等体積の脱イオン水で希釈して、ＨＰＬＣ分離の出発条件に一致するようにかつ感度の損失が回避されるように、試料マトリクスを調節した。次いで各試料の純度および不純物を、上述のようにＲＰ－ＨＰＬＣにより定量した。実施例２および実施例４の方法により生成されたＮＤＣのヒトおよびマウス血清における安定性を、図８Ａ～８Ｂに提示する。
ナノ粒子コンジュゲート試料（例えば、ＦＡ－ＣＤＣ）は、最初にＦＡ－ＣＤＣ試料のアリコートを２μＭ濃度に希釈し、次いで３７℃の振盪乾燥浴で活性化組換えヒトカテプシン－Ｂと共にインキュベートすることにより、強制放出のために調製した。組換えヒトカテプシン－Ｂを、下記の通り調製した：４μＬの０．３３μｇ／μＬのカテプシン－Ｂを、ジチオトレイトールおよび（ＭＥＳ）からなる活性化緩衝液に添加し、ｐＨ５．０に調節した。適切なｐＨを、調製後にｐＨ試験片で確認した。２４時間のインキュベーション後、強制放出された遊離エキサテカンを、ＲＰ－ＨＰＬＣの遊離エキサテカン溶出時間で存在する積分面積のパーセンテージによって決定した。この研究の結果を図７に提示する。
標的化されたＮＤＣを組換えヒトＣａｔ－Ｂ（ＳＩ）と共にインキュベートしたとき、エキサテカン薬物の９５％超が、当て嵌めから約３．０時間の半減期で４８時間以内にＮＤＣから放出され（図７）、がん環境における有効な薬物放出を実証している。ジエン－シラン前駆体を使用して生成された標的化されたＮＤＣ（スキーム５に示される）も、マウスおよびヒト血漿中で高い安定性を示し、アミン－シラン前駆体を使用して生成されたそれらの対応物と比べて（スキーム４に示す）著しい安定性の改善を示した（図８Ａおよび８Ｂ）。エキサテカン薬物の９５％超が、マウスおよびヒト血清中で最長７日間にわたりＮＤＣ上に残り、これはＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるＮＤＣピークのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルにより得られたものであった。一方、遊離エキサテカンをモニタリングする独立したＲＰ－ＨＰＬＣアッセイは、放出されたエキサテカンがＲＰ－ＨＰＬＣの検出限界、即ち０．０２％よりも下にあることを示し、望ましくない遊離薬物が存在しないことは、それらの高い血漿安定性をさらに実証する。標的化されたＮＤＣは、０．９％の食塩水中、４℃で、高い保存安定性も示した。それらの純度、サイズ分布、および流体力学直径を、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびＦＣＳによりそれぞれ特徴付け、これらは保存条件下で６カ月間にわたり変化しないままであった。そのような高い保存安定性は、臨床移行および商業的製造の両方に関して重要な、別の主要なパラメーターである。
（合成実施例１）
リンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体の合成
本明細書に開示される方法での使用に適したリンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体は、下記の例示的なプロトコールに従い合成することができる。
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐトリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６１）の合成
Figure 2023516111000041
 スキーム７： 化合物（１６１）の合成。
４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）アニリン（１５９）の合成： イミダゾール（５．５４ｇ、８１．２２ｍｍｏｌ）を、（４－アミノフェニル）メタノール（７５）（５．０ｇ、４０．６１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２５ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、その後、ｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（１３．３９ｇ、４８．７３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水（２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮し、石油エーテル中１０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲル（２３０～４００メッシュ）を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）アニリン（１５９；６．６ｇ）をガムとして得た。ＬＣＭＳ： ｍ／ｚ ３６２．３１［（Ｍ＋Ｈ）＋］；Ｒｔ：２．５８分；純度９３．６８％。
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（Ｓ）－（１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）カルバメート（１６０）の合成： ジイソプロピルエチルアミン（４．１８ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６．０８ｇ、１６ｍｍｏｌ）、および４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）アニリン（１５９）（２．８９ｇ、８ｍｍｏｌ）を、Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）－Ｌ－リシン（１４９）（５．０ｇ、８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を氷水でクエンチした。沈殿した固体を濾過し、真空乾燥して、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（Ｓ）－（１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）カルバメート（１６０；５．５ｇ）を固体として得た。ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ９９０．３７［（Ｍ＋Ｈ）＋］；Ｒｔ：２．８４分；純度９６．７９％。
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐトリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６１）の合成： ピペリジン（１６．５ｍＬ）を、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（Ｓ）－（１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）カルバメート（１６０）（５．５ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３８．５ｍＬ）中の溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、１００％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲル（２３０～４００メッシュ）を使用したカラムクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６０；３．５ｇ）をガムとして得た。ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ７４４．２４［（Ｍ－Ｈ）－］；Ｒｔ：２．２０分；純度９０．１６％。
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１）の合成。
Figure 2023516111000042
 スキーム８： 化合物（１９１）の合成。
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（１８７）の合成： ジイソプロピルエチルアミン（１．５４ｍＬ、８．８３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２．２４ｇ、５．８９ｍｍｏｌ）、および（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６１）（２．１９ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を、（（（Ｎ－（９－フルオレニルメトキシカルボニル）－Ｌ－バリン（１ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を氷水でクエンチした。沈殿した固体を濾過し、真空乾燥して、（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（１８７；２．５ｇ）を固体として得た。ＬＣＭＳ：ＭＨ＋ １０６７、保持時間２．４２分。
（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１８８）の合成： ピペリジンのＤＭＦ（４．５ｍＬ）中の３０％溶液を、（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（１８７）（１．５ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６ｍＬ）中の溶液に、室温で添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、１００％ＥｔＯＡｃで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１８８；１．１ｇ）を固体として得た。
Figure 2023516111000043
１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１８９）の合成： ジイソプロピルエチルアミン（０．４９ｍＬ、２．８３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（７１９．４７ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）、および（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１８８）（８００ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、１－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－オイック酸（８６）（４８４ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水（１５ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１８９；０．６０ｇ）をガムとして得た。
Figure 2023516111000044
１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１９０）の合成： ＮＨ４Ｆ（１６６ｍｇ、４．４８ｍｍｏｌ）を、１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１８９）（６００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）中の溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残留物を水（１５ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１９０；０．４０ｇ）をガムとして得た。
Figure 2023516111000045
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１）の合成： ピリジン（０．１４ｍＬ、１．８０ｍｍｏｌ）および４－ニトロフェニルクロロホルメート（１４）（１４５ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を、１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１９０）（４００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１；０．３４ｇ）をガムとして得た。ＬＣＭＳ：ＭＨ＋ １２６５、保持時間１．３３分。
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－３５－（４－アミノブチル）－１－アジド－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０２）の合成。
Figure 2023516111000046
 スキーム９： プロテアーゼ切断可能リンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体（２０２）の合成。
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０１）の合成： トリエチルアミン（０．０９ｍＬ、０．６２ｍｍｏｌ）および（１Ｒ，９Ｒ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオンメタンスルホネート（エキサテカンメシレート；１６；１３１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１；３１１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２．５ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、混合物を室温で８時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水（１５ｍＬ）でクエンチし、クロロホルム中１０％のメタノール（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）上で乾燥し、減圧下で濃縮した。ジエチルエーテルを粗製材料に添加し、得られた沈殿物を濾過し、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで溶出するカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標））を使用して精製して、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０１）を固体（０．３ｇ）として得た。ＬＣＭＳ：ＭＨ＋ １５６１、保持時間２．１８分。
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－３５－（４－アミノブチル）－１－アジド－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０２）の合成： トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＤＣＭ中の１％溶液を、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０１；３００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をジエチルエーテルで粉砕し、ＲＰ分取ＨＰＬＣにより精製して、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－３５－（４－アミノブチル）－１－アジド－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０２）（７０ｍｇ）を固体として得た。
Figure 2023516111000047
（合成実施例２）
標的化リガンド前駆体の合成
本明細書に開示される方法で使用するのに適した標的化リガンド前駆体は、下記の例示的な合成プロトコールに従い調製することができる。
［０１４６］
（Ｓ）－１６－（４－（（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）－１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデカン－１７－オイック酸（６０６）の合成
Figure 2023516111000048
 スキーム１０： 葉酸受容体標的化リガンド（６０６）の合成。
化合物６００の調製： 化合物５９９（１６０ｇ、５１２ｍｍｏｌ）をＴＦＡＡ（８００ｍＬ）に２５℃で溶解し、暗所で５時間、窒素雰囲気下で撹拌した。次いで溶媒を５０℃で真空除去して、粗製生成物を得た。粗製生成物をＭＴＢＥ（７５０ｍＬ）で６０分間粉砕し、次いで濾過して、化合物６００（２０３ｇ、粗製）を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
Figure 2023516111000049
化合物６０２の調製： ＴＢＴＵ（２３８ｇ、７４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９５．７ｇ、７４０ｍｍｏｌ）を、化合物６０１（２２５ｇ、５２９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．２５Ｌ）中の溶液に添加した。２０℃で３０分間撹拌した後、２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（試薬Ａ；１２１ｇ、５５５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で１２時間撹拌した。２種の反応混合物を合わせ、後処理し、残留物をＨ２Ｏ（３Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（１５００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（８００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１から１／１）により精製して、化合物６０２（５９０ｇ）を油として得た。
Figure 2023516111000050
化合物６０３の調製： Ｎ－エチルエタンアミン（１．２７ｋｇ、１７．４ｍｏｌ）を、化合物６０２（４３５ｇ、６９５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４．３５Ｌ）中の溶液に添加し、混合物を２５℃で３時間撹拌した。次いで溶媒を室温で真空除去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１００／１から１／１）により精製して、化合物６０３（２４５ｇ）を油として得た。
Figure 2023516111000051
 化合物６０４の調製： ＴＢＴＵ（１１９ｇ、３７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１６０ｇ、１．２４ｍｏｌ）を、化合物６００（１０１ｇ、２４８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（９００ｍＬ）中の溶液に添加し、混合物を３０分間撹拌した。次いでＤＭＦ（１００ｍＬ）中の化合物６０３（１００ｇ、２４８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。２種の反応混合物を合わせ、濃縮し、残留物をＨ２Ｏ（２．５Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（１Ｌ×５）で抽出した。合わせた有機層をブライン（６００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物４（４２０ｇ、粗製）を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
化合物６０５の調製： Ｋ２ＣＯ３（５８５ｇ、４．２３ｍｏｌ）を、化合物６０４（４２０ｇ、５２９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５００ｍＬ）中の溶液に添加し、混合物を６０℃で０．５時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、ＴＨＦを除去し、残留物をＨ２Ｏ（５００ｍＬ）で希釈し、ＨＣｌ（Ｍ＝１）でｐＨを３に調節し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物６０５（２６０ｇ、粗製）を固体として得、これを精製することなく直接使用した。
化合物６０６の調製： トリフルオロ酢酸（２．１２ｋｇ、１８．６ｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２．６Ｌ）中の化合物６０５（２６０ｇ、３７３ｍｍｏｌ）の混合物に２０℃で、窒素下で一度に添加し、混合物を２０℃で５時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＨＰＬＣ（カラム：Ａｇｅｌａ ＤｕｒａＳｈｅｌｌ Ｃ１８ ２５０×８０ｍｍ×１０ｕｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＭｅＯＨ］；Ｂ％：５％～４０％、２０分）により精製して、与えられた化合物６０６（５２．５ｇ）を固体として得た。（Ｍ＋Ｈ）６４２．８０；ＩＲ：２１０７（Ｎ３結合）。
図１は、本明細書に開示される方法を使用して調製することができる、例示的なナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）の構造を示す。 同上。
化合物６０６の調製： トリフルオロ酢酸（２．１２ｋｇ、１８．６ｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２．６Ｌ）中の化合物６０５（２６０ｇ、３７３ｍｍｏｌ）の混合物に２０℃で、窒素下で一度に添加し、混合物を２０℃で５時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＨＰＬＣ（カラム：Ａｇｅｌａ ＤｕｒａＳｈｅｌｌ Ｃ１８ ２５０×８０ｍｍ×１０ｕｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＭｅＯＨ］；Ｂ％：５％～４０％、２０分）により精製して、与えられた化合物６０６（５２．５ｇ）を固体として得た。（Ｍ＋Ｈ）６４２．８０；ＩＲ：２１０７（Ｎ３結合）。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
ナノ粒子を官能化する方法であって、
ナノ粒子と第１の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第１の二官能性前駆体がシラン部分およびジエン部分を含み、前記ナノ粒子が、シランに反応性のある表面（例えば、シリカ表面）を含み、および前記接触させるステップが、前記シラン部分と前記ナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にある、ステップ、ならびに
前記シラン部分と前記ナノ粒子の表面との間に共有結合を形成し、それによってジエン部分で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
を含む、方法。
(項目２)
ジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、第２の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第２の二官能性前駆体が、アルキン部分と、ジエン部分に反応性のある基（例えばジエノフィル、例えばマレイミド）とを含み、前記接触させるステップが、ジエン部分に反応性のある前記基と前記ジエン部分との間の反応に適した条件下にある、ステップ、および
前記ナノ粒子の前記ジエン部分と前記第２の二官能性前駆体とを反応させ、それによってアルキン部分で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
をさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記アルキン部分と、アルキン反応性基（例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）を含む化合物とを、前記アルキン部分と前記アルキン反応性基との間の反応に適した条件（例えば、クリックケミストリー条件）下で接触させ、それによって、前記化合物（例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物）で官能化されたナノ粒子を形成するステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記ジエン部分が、シクロペンタジエン部分である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
前記第１の二官能性前駆体が、式（Ａ）：
Figure 2023516111000094
 の構造を含み、
式中、
Ｒ １ は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、または－ＯＲ Ａ －であり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく、
各Ｒ ２ は、独立して、水素、アルキル、ハロ、または－ＯＲ Ａ であり、
Ｒ Ａ は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ｎは、０から１２の整数であり、および
ｍは、０から５の整数である、
前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
Ｒ ２ が、－ＯＲ Ａ であり、
Ｒ Ａ が、アルキル（例えば、エチル）であり、
ｎが、１から５の整数（例えば、３）であり、および
ｍが０である、
項目５に記載の方法。
(項目７)
前記第１の二官能性前駆体が、式（Ａ－１）：
Figure 2023516111000095
 の構造を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記第２の二官能性前駆体が、式（Ｂ）：
Figure 2023516111000096
 の構造を含み、
式中、
Ｘは、ジエノフィル（例えば、電子欠乏アルケン基を含む部分；または環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、または無水マレイン酸）であり、
Ｙは、２価のリンカー（例えば、置換または非置換ヘテロアルキレン基）であり、
Ｒ ３ およびＲ ４ はそれぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、－ＯＲ Ａ 、－ＮＲ Ｂ Ｒ Ｃ 、－ＮＯ ２ 、－ＣＮであり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく、
Ｒ Ａ 、Ｒ Ｂ 、およびＲ Ｃ は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ｑおよびｐはそれぞれ独立して、０から４の整数であり、および
ｖは、０から２の整数である、
項目２から７のいずれか一項に記載の方法。
(項目９)
Ｘがマレイミドであり、
ｑおよびｐがそれぞれ独立して、０の整数であり、および
ｖが１の整数である、
項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記２価のリンカーが、アルキレンまたはヘテロアルキレン基であり、前記アルキレンまたはヘテロアルキレン基は、置換されていないかまたは置換されている（例えば、１個または複数のオキソ基で置換されたアルキレンまたはヘテロアルキレン）、項目８または９に記載の方法。
(項目１１)
前記２価のリンカーが、式（Ｃ）：
Figure 2023516111000097
 の構造を含み、
式中、各Ｒ Ｂ は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ｘは、０から１０の整数であり、および
各
Figure 2023516111000098
 は独立して、前記第２の二官能性前駆体の一部分との付着点（例えば、前記ジエノフィルとのまたは複素環式環の窒素原子との付着）を示す、
項目８から１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記第２の二官能性前駆体が、式（Ｂ－１）：
Figure 2023516111000099
 の構造を含み、
式中、ｘは０から１０の整数（例えば、４）である、
項目８から１１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３)
前記ジエン部分と前記第２の二官能性前駆体とを反応させるステップが、式（ＮＰ－１）：
Figure 2023516111000100
 の化合物を提供し、
式中、ｘは０から１０の整数（例えば、４）であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
項目１２に記載の方法。
(項目１４)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、ペイロード部分（例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン）または標的化リガンド（例えば、葉酸受容体（ＦＲ）標的化リガンド、例えば葉酸）を含む、項目３から１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、式（Ｄ）または式（Ｅ）：
Figure 2023516111000101
 の構造を含み、
式中、
Ｔは、標的化リガンド（例えば、ＦＲ標的化リガンド、例えば葉酸）であり、
Ｌは、切断可能リンカー部分（例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー部分）であり、
Ｐは、ペイロード部分（例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン）であり、および
ｙは、０から２０の整数（例えば、３または９）である、
項目３から１４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記切断可能リンカー部分が、式（Ｆ）：
Figure 2023516111000102
 の構造を含み、
式中、
［ＡＡ］のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり、
ｚは、１から５の整数であり、
ｗは、２または３の整数であり、および
各
Figure 2023516111000103
 は、独立して、アルキン反応性基を含む前記化合物の一部分との付着点（例えば、アジド基との付着またはペイロード部分との付着）を示す、
項目１５に記載の方法。
(項目１７)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、
Figure 2023516111000104
 からなる群より選択される構造を含み、
式中、ｙは０から２０の整数である、
項目３から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記アルキン部分と、アルキン反応性基を含む前記化合物とを反応させるステップが、式（ＮＰ－２）または（ＮＰ－３）：
Figure 2023516111000105
 の化合物を提供し、
式中、
ｘのそれぞれの場合は、独立して、０から１０の整数（例えば、４）であり、
ｙのそれぞれの場合は、独立して、０から２０の整数（例えば３または９）であり、ならびに
（ＮＰ－２）および（ＮＰ－３）のそれぞれのケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部である、
項目３から１７のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９)
前記ナノ粒子が、シリカナノ粒子（例えば、コア－シェルシリカナノ粒子）である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記ナノ粒子（例えば、前記ナノ粒子の表面）が、有機ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）でコーティングされる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記第１の二官能性前駆体の前記シラン部分と、前記ナノ粒子の表面との間に前記共有結合を形成するステップが、前記第１の二官能性前駆体を、前記有機ポリマーの有機ポリマー分子間（例えば、ＰＥＧ分子間）の間隙空間内に挿入することを含む、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
複数のジエン部分で官能化されたナノ粒子が形成される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
複数のアルキン部分で官能化されたナノ粒子が形成される、項目２に記載の方法。
(項目２４)
（ａ）前記複数のアルキン部分の第１の部分と、アルキン反応性基を含む第１の化合物とを反応させるステップ、および
（ｂ）前記複数のアルキン部分の第２の部分と、アルキン反応性基を含む第２の化合物とを反応させ、それによって、前記第１の化合物および前記第２の化合物で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
をさらに含み、
前記第１の化合物および前記第２の化合物が化学的に異なる、
項目２３に記載の方法。
(項目２５)
（ａ）前記第１の化合物が式（Ｄ）の化合物（例えば、式（Ｄ－１）の化合物）であり、前記第２の化合物が式（Ｅ）の化合物（例えば、式（Ｅ－１）の化合物）である、または
（ｂ）前記第１の化合物が式（Ｅ）の化合物であり、前記第２の化合物が式（Ｄ）の化合物である、
項目２４に記載の方法。
(項目２６)
シリカナノ粒子を官能化する方法であって、
（ｉ）シリカナノ粒子を第１の二官能性前駆体と接触させるステップであって、前記第１の二官能性前駆体が、シラン部分およびシクロペンタジエン部分を含み、前記シリカナノ粒子が、前記シラン部分に反応性のある表面（例えば、シリカ表面）を含み、および前記接触させるステップが、前記シラン部分と前記シリカナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にあり、それによって、前記シラン部分と前記ナノ粒子の表面との間に共有結合を形成し、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供する、ステップ、
（ｉｉ）シクロペンタジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、第２の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第２の二官能性前駆体が、アルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）およびジエノフィル（例えば、マレイミド）を含み、前記接触させるステップが、前記ジエノフィルと前記シクロペンタジエン部分との間の反応に適した条件下にあり、それによって、前記ナノ粒子のジエン部分と前記第２の二官能性前駆体とを反応させ、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供する、ステップ、ならびに
（ｉｉｉ）前記アルキン部分と、アジド部分を含む化合物とを、前記アルキン部分とアジド部分との間の反応に適した条件（例えば、クリックケミストリー条件）下で接触させ、それによって、前記ナノ粒子の前記アルキン部分と前記アジド部分とを反応させ、前記化合物（例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物）で官能化されたナノ粒子を提供するステップ
を含む、方法。
(項目２７)
シリカナノ粒子を官能化する方法であって、
（ｉ）シリカナノ粒子と、式（Ａ）の構造を含む第１の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供するステップ、
（ｉｉ）シクロペンタジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、式（Ｂ）の構造を含む第２の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供するステップ、および
（ｉｉｉ）前記アルキン部分と、式（Ｄ）の化合物もしくは式（Ｅ）の化合物またはその両方の化合物とを接触させ、それによって、標的化リガンド、ペイロード部分、またはその両方で官能化されたナノ粒子を提供するステップ
を含む、方法。
(項目２８)
前記第１の二官能性前駆体が、式（Ａ－１）：
Figure 2023516111000106
 の構造を含む、項目２６または２７に記載の方法。
(項目２９)
前記第２の二官能性前駆体が、式（Ｂ－１）：
Figure 2023516111000107
 の構造を含み、
式中、ｘは０から１０の整数（例えば、４）である、
項目２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
式（Ｄ）の化合物が、式Ｄ－１：
Figure 2023516111000108
 の構造を含み、
式中、ｙは０から１０の整数（例えば、３）である、
項目２７に記載の方法。
(項目３１)
式（Ｅ）の化合物が、式Ｅ－１：
Figure 2023516111000109
 の構造を含み、
式中、ｙは０から２０の整数（例えば、９）である、
項目２７に記載の方法。
(項目３２)
前記方法は、式（ＮＰ－２）：
Figure 2023516111000110
 の化合物を含むナノ粒子を提供し、式中、ｘは４であり、ｙは３であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
項目２９に記載の方法。
(項目３３)
前記方法は、式（ＮＰ－３）：
Figure 2023516111000111
 の化合物を提供し、式中、ｘは４であり、ｙは９であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
項目３１に記載の方法。

Claims (33)

  1. ナノ粒子を官能化する方法であって、
    ナノ粒子と第１の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第１の二官能性前駆体がシラン部分およびジエン部分を含み、前記ナノ粒子が、シランに反応性のある表面（例えば、シリカ表面）を含み、および前記接触させるステップが、前記シラン部分と前記ナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にある、ステップ、ならびに
    前記シラン部分と前記ナノ粒子の表面との間に共有結合を形成し、それによってジエン部分で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
    を含む、方法。
  2. ジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、第２の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第２の二官能性前駆体が、アルキン部分と、ジエン部分に反応性のある基（例えばジエノフィル、例えばマレイミド）とを含み、前記接触させるステップが、ジエン部分に反応性のある前記基と前記ジエン部分との間の反応に適した条件下にある、ステップ、および
    前記ナノ粒子の前記ジエン部分と前記第２の二官能性前駆体とを反応させ、それによってアルキン部分で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アルキン部分と、アルキン反応性基（例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル）を含む化合物とを、前記アルキン部分と前記アルキン反応性基との間の反応に適した条件（例えば、クリックケミストリー条件）下で接触させ、それによって、前記化合物（例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物）で官能化されたナノ粒子を形成するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ジエン部分が、シクロペンタジエン部分である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第１の二官能性前駆体が、式（Ａ）：
    Figure 2023516111000052
     の構造を含み、
    式中、
    Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、または－ＯＲＡ－であり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく、
    各Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、ハロ、または－ＯＲＡであり、
    ＲＡは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｎは、０から１２の整数であり、および
    ｍは、０から５の整数である、
    前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  6. Ｒ２が、－ＯＲＡであり、
    ＲＡが、アルキル（例えば、エチル）であり、
    ｎが、１から５の整数（例えば、３）であり、および
    ｍが０である、
    請求項５に記載の方法。
  7. 前記第１の二官能性前駆体が、式（Ａ－１）：
    Figure 2023516111000053
     の構造を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第２の二官能性前駆体が、式（Ｂ）：
    Figure 2023516111000054
     の構造を含み、
    式中、
    Ｘは、ジエノフィル（例えば、電子欠乏アルケン基を含む部分；または環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、または無水マレイン酸）であり、
    Ｙは、２価のリンカー（例えば、置換または非置換ヘテロアルキレン基）であり、
    Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、－ＯＲＡ、－ＮＲＢＲＣ、－ＮＯ２、－ＣＮであり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく、
    ＲＡ、ＲＢ、およびＲＣは、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｑおよびｐはそれぞれ独立して、０から４の整数であり、および
    ｖは、０から２の整数である、
    請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. Ｘがマレイミドであり、
    ｑおよびｐがそれぞれ独立して、０の整数であり、および
    ｖが１の整数である、
    請求項８に記載の方法。
  10. 前記２価のリンカーが、アルキレンまたはヘテロアルキレン基であり、前記アルキレンまたはヘテロアルキレン基は、置換されていないかまたは置換されている（例えば、１個または複数のオキソ基で置換されたアルキレンまたはヘテロアルキレン）、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記２価のリンカーが、式（Ｃ）：
    Figure 2023516111000055
     の構造を含み、
    式中、各ＲＢは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    ｘは、０から１０の整数であり、および
    各
    Figure 2023516111000056
     は独立して、前記第２の二官能性前駆体の一部分との付着点（例えば、前記ジエノフィルとのまたは複素環式環の窒素原子との付着）を示す、
    請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第２の二官能性前駆体が、式（Ｂ－１）：
    Figure 2023516111000057
     の構造を含み、
    式中、ｘは０から１０の整数（例えば、４）である、
    請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ジエン部分と前記第２の二官能性前駆体とを反応させるステップが、式（ＮＰ－１）：
    Figure 2023516111000058
     の化合物を提供し、
    式中、ｘは０から１０の整数（例えば、４）であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
    請求項１２に記載の方法。
  14. アルキン反応性基を含む前記化合物が、ペイロード部分（例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン）または標的化リガンド（例えば、葉酸受容体（ＦＲ）標的化リガンド、例えば葉酸）を含む、請求項３から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. アルキン反応性基を含む前記化合物が、式（Ｄ）または式（Ｅ）：
    Figure 2023516111000059
     の構造を含み、
    式中、
    Ｔは、標的化リガンド（例えば、ＦＲ標的化リガンド、例えば葉酸）であり、
    Ｌは、切断可能リンカー部分（例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー部分）であり、
    Ｐは、ペイロード部分（例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン）であり、および
    ｙは、０から２０の整数（例えば、３または９）である、
    請求項３から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記切断可能リンカー部分が、式（Ｆ）：
    Figure 2023516111000060
     の構造を含み、
    式中、
    ［ＡＡ］のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり、
    ｚは、１から５の整数であり、
    ｗは、２または３の整数であり、および
    各
    Figure 2023516111000061
     は、独立して、アルキン反応性基を含む前記化合物の一部分との付着点（例えば、アジド基との付着またはペイロード部分との付着）を示す、
    請求項１５に記載の方法。
  17. アルキン反応性基を含む前記化合物が、
    Figure 2023516111000062
     からなる群より選択される構造を含み、
    式中、ｙは０から２０の整数である、
    請求項３から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記アルキン部分と、アルキン反応性基を含む前記化合物とを反応させるステップが、式（ＮＰ－２）または（ＮＰ－３）：
    Figure 2023516111000063
     の化合物を提供し、
    式中、
    ｘのそれぞれの場合は、独立して、０から１０の整数（例えば、４）であり、
    ｙのそれぞれの場合は、独立して、０から２０の整数（例えば３または９）であり、ならびに
    （ＮＰ－２）および（ＮＰ－３）のそれぞれのケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部である、
    請求項３から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ナノ粒子が、シリカナノ粒子（例えば、コア－シェルシリカナノ粒子）である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ナノ粒子（例えば、前記ナノ粒子の表面）が、有機ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）でコーティングされる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第１の二官能性前駆体の前記シラン部分と、前記ナノ粒子の表面との間に前記共有結合を形成するステップが、前記第１の二官能性前駆体を、前記有機ポリマーの有機ポリマー分子間（例えば、ＰＥＧ分子間）の間隙空間内に挿入することを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 複数のジエン部分で官能化されたナノ粒子が形成される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  23. 複数のアルキン部分で官能化されたナノ粒子が形成される、請求項２に記載の方法。
  24. （ａ）前記複数のアルキン部分の第１の部分と、アルキン反応性基を含む第１の化合物とを反応させるステップ、および
    （ｂ）前記複数のアルキン部分の第２の部分と、アルキン反応性基を含む第２の化合物とを反応させ、それによって、前記第１の化合物および前記第２の化合物で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
    をさらに含み、
    前記第１の化合物および前記第２の化合物が化学的に異なる、
    請求項２３に記載の方法。
  25. （ａ）前記第１の化合物が式（Ｄ）の化合物（例えば、式（Ｄ－１）の化合物）であり、前記第２の化合物が式（Ｅ）の化合物（例えば、式（Ｅ－１）の化合物）である、または
    （ｂ）前記第１の化合物が式（Ｅ）の化合物であり、前記第２の化合物が式（Ｄ）の化合物である、
    請求項２４に記載の方法。
  26. シリカナノ粒子を官能化する方法であって、
    （ｉ）シリカナノ粒子を第１の二官能性前駆体と接触させるステップであって、前記第１の二官能性前駆体が、シラン部分およびシクロペンタジエン部分を含み、前記シリカナノ粒子が、前記シラン部分に反応性のある表面（例えば、シリカ表面）を含み、および前記接触させるステップが、前記シラン部分と前記シリカナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にあり、それによって、前記シラン部分と前記ナノ粒子の表面との間に共有結合を形成し、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供する、ステップ、
    （ｉｉ）シクロペンタジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、第２の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第２の二官能性前駆体が、アルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）およびジエノフィル（例えば、マレイミド）を含み、前記接触させるステップが、前記ジエノフィルと前記シクロペンタジエン部分との間の反応に適した条件下にあり、それによって、前記ナノ粒子のジエン部分と前記第２の二官能性前駆体とを反応させ、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供する、ステップ、ならびに
    （ｉｉｉ）前記アルキン部分と、アジド部分を含む化合物とを、前記アルキン部分とアジド部分との間の反応に適した条件（例えば、クリックケミストリー条件）下で接触させ、それによって、前記ナノ粒子の前記アルキン部分と前記アジド部分とを反応させ、前記化合物（例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物）で官能化されたナノ粒子を提供するステップ
    を含む、方法。
  27. シリカナノ粒子を官能化する方法であって、
    （ｉ）シリカナノ粒子と、式（Ａ）の構造を含む第１の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供するステップ、
    （ｉｉ）シクロペンタジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、式（Ｂ）の構造を含む第２の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供するステップ、および
    （ｉｉｉ）前記アルキン部分と、式（Ｄ）の化合物もしくは式（Ｅ）の化合物またはその両方の化合物とを接触させ、それによって、標的化リガンド、ペイロード部分、またはその両方で官能化されたナノ粒子を提供するステップ
    を含む、方法。
  28. 前記第１の二官能性前駆体が、式（Ａ－１）：
    Figure 2023516111000064
     の構造を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. 前記第２の二官能性前駆体が、式（Ｂ－１）：
    Figure 2023516111000065
     の構造を含み、
    式中、ｘは０から１０の整数（例えば、４）である、
    請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 式（Ｄ）の化合物が、式Ｄ－１：
    Figure 2023516111000066
     の構造を含み、
    式中、ｙは０から１０の整数（例えば、３）である、
    請求項２７に記載の方法。
  31. 式（Ｅ）の化合物が、式Ｅ－１：
    Figure 2023516111000067
     の構造を含み、
    式中、ｙは０から２０の整数（例えば、９）である、
    請求項２７に記載の方法。
  32. 前記方法は、式（ＮＰ－２）：
    Figure 2023516111000068
     の化合物を含むナノ粒子を提供し、式中、ｘは４であり、ｙは３であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
    請求項２９に記載の方法。
  33. 前記方法は、式（ＮＰ－３）：
    Figure 2023516111000069
     の化合物を提供し、式中、ｘは４であり、ｙは９であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
    請求項３１に記載の方法。

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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4237008A2 (en) 2020-10-27 2023-09-06 Elucida Oncology, Inc. Carrier particle-drug conjugates, self-immolative linkers, and uses thereof
WO2024003002A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Diaccurate N-substituted indole derivatives and conjugates for the treatment of cancer
CN115028551B (zh) * 2022-07-15 2024-01-05 成都普康生物科技有限公司 一种叠氮-九甘醇-丙酸的制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110196285A1 (en) * 2008-10-10 2011-08-11 Dong Chen Hollow Mesoporous Silica Sphere Coated with Gold and Preparation Method Thereof and Use in Cancer Therapy
JP2012229252A (ja) * 2000-02-08 2012-11-22 Rice Univ 治療法および診断法において使用される光学活性なナノ粒子
JP2016516729A (ja) * 2013-03-15 2016-06-09 スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ マルチモーダルシリカ系ナノ粒子
WO2016100376A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Nanotherapeutic for treating infections caused by intracellular and extracellular pathogens
JP2018070626A (ja) * 2017-11-24 2018-05-10 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 標的化ナノ粒子
JP2018115145A (ja) * 2016-08-19 2018-07-26 ナショナル タイワン ユニバーシティ 生物活性成分を内包した中空シリカナノ粒子、調製プロセス、および、その応用
JP2019196369A (ja) * 2013-08-13 2019-11-14 ノースウェスタン ユニバーシティ ペプチドコンジュゲート粒子

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1002942A (en) 1910-08-29 1911-09-12 Edward Hiram Taylor Hair-ironing comb.
US3870791A (en) 1972-04-24 1975-03-11 Heskel M Haddad Solid state ophthalmic medication delivery method
US3867519A (en) 1972-04-27 1975-02-18 Alza Corp Bioerodible drug delivery device
US4051842A (en) 1975-09-15 1977-10-04 International Medical Corporation Electrode and interfacing pad for electrical physiological systems
DE2626348C3 (de) 1976-06-11 1980-01-31 Siemens Ag, 1000 Berlin Und 8000 Muenchen Implantierbare Dosiereinrichtung
US4136177A (en) 1977-01-31 1979-01-23 American Home Products Corp. Xanthan gum therapeutic compositions
US4255415A (en) 1978-11-22 1981-03-10 Schering Corporation Polyvinyl alcohol ophthalmic gel
US4383529A (en) 1980-11-03 1983-05-17 Wescor, Inc. Iontophoretic electrode device, method and gel insert
US4931279A (en) 1985-08-16 1990-06-05 Bausch & Lomb Incorporated Sustained release formulation containing an ion-exchange resin
US4668506A (en) 1985-08-16 1987-05-26 Bausch & Lomb Incorporated Sustained-release formulation containing and amino acid polymer
US4788603A (en) 1985-10-19 1988-11-29 Fuji Photo Film Co., Ltd. Camera for sequentially photographing a subject using a reference optical system and a telescopic optical system
US4713224A (en) 1986-03-31 1987-12-15 The Boc Group, Inc. One-step process for purifying an inert gas
US5198560A (en) 1990-04-27 1993-03-30 Bristol-Myers Squibb Company Cytotoxic bicyclo[7.3.1]tridec-4-ene-2,6-diyne compounds and process for the preparation thereof
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB2330907A (en) 1997-10-28 1999-05-05 Applied Imaging Int Ltd A karyotyper and methods for producing karyotypes
US6548264B1 (en) 2000-05-17 2003-04-15 University Of Florida Coated nanoparticles
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US20040101822A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Ulrich Wiesner Fluorescent silica-based nanoparticles
NZ541846A (en) 2003-01-27 2008-12-24 Endocyte Inc Vitamin receptor binding drug delivery conjugates
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
US8084001B2 (en) 2005-05-02 2011-12-27 Cornell Research Foundation, Inc. Photoluminescent silica-based sensors and methods of use
EP1973575B1 (en) 2005-12-22 2019-07-24 Visen Medical, Inc. Biocompatible fluorescent metal oxide nanoparticles
EP1995327A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Humboldt Universität zu Berlin Probe for detecting a particular nucleic acid sequence
US20110028662A1 (en) 2007-08-31 2011-02-03 Hybrid Silica Technologies, Inc. Peg-coated core-shell silica nanoparticles and methods of manufacture and use
DE102007052517A1 (de) 2007-10-29 2009-04-30 Autoimmun Diagnostika Gmbh ELISPOT-Verfahren mit zwei Filtersystemen
MY157165A (en) 2008-04-30 2016-05-13 Immunogen Inc Cross-linkers and their uses
US20100179075A1 (en) * 2008-07-30 2010-07-15 Life Technologies Corporation Particles for use in supported nucleic acid ligation and detection sequencing
US8546425B2 (en) 2008-09-17 2013-10-01 Purdue Research Foundation Folate receptor binding conjugates of antifolates
EP2419373B1 (en) 2009-04-15 2018-09-19 Cornell University Improved fluorescent silica nanoparticles through silica densification
EP2449379B1 (en) 2009-07-02 2017-05-17 Sloan-Kettering Institute for Cancer Research Fluorescent silica-based nanoparticles
EP2486409A1 (en) 2009-10-09 2012-08-15 Universite De Strasbourg Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
ES2605990T3 (es) 2010-12-29 2017-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de molécula pequeña para la administración intracelular de ácidos nucleicos
US9011735B2 (en) 2010-12-30 2015-04-21 Ut-Battelle, Llc Volume-labeled nanoparticles and methods of preparation
EP2634179A1 (en) 2012-02-28 2013-09-04 Sanofi Functional PLA-PEG copolymers, the nanoparticles thereof, their preparation and use for targeted drug delivery and imaging
US10732115B2 (en) 2012-06-22 2020-08-04 Cornell University Mesoporous oxide nanoparticles and methods of making and using same
CN112587658A (zh) 2012-07-18 2021-04-02 博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
JP6568802B2 (ja) 2013-02-20 2019-08-28 コーネル ユニバーシティＣｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 多層蛍光性ナノ粒子及びその製造並びに使用方法
AU2014312086B2 (en) 2013-08-30 2020-03-12 Immunogen, Inc. Antibodies and assays for detection of folate receptor 1
BR112016015198A2 (pt) 2013-12-31 2017-08-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Sistemas, métodos e aparelho para a produção de imagens multicanal de fontes fluorescentes em tempo real
RU2016144055A (ru) 2014-05-29 2018-07-02 Мемориал Слоун Кеттеринг Кэнсэ Сентр Конъюгаты лекарственного средства с наночастицами
EP3233134B1 (en) 2014-12-15 2020-03-25 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cyclic peptides with enhanced nerve-binding selectivity, nanoparticles bound with said cyclic peptides, and use of same for real-time in vivo nerve tissue imaging
US10548989B2 (en) 2015-04-07 2020-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Nanoparticle immunoconjugates
JP6908276B2 (ja) 2015-05-04 2021-07-21 コーネル ユニバーシティ 極小ナノ粒子及びそれを製造する方法並びに使用する方法
JP6987641B2 (ja) 2015-05-12 2022-01-05 ブリンクバイオ インコーポレイテッド シリコン系薬物複合体及びその使用方法
US10736972B2 (en) 2015-05-29 2020-08-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of treatment using ultrasmall nanoparticles to induce cell death of nutrient-deprived cancer cells via ferroptosis
CZ307488B6 (cs) 2015-11-20 2018-10-10 Univerzita Karlova V Praze Sloučeniny na bázi cyklamu, jejich konjugáty, cílicí konjugáty, koordinační sloučeniny, farmaceutický přípravek je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití
JP2019509252A (ja) 2015-12-15 2019-04-04 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 組織の区別、例えば、手術中の可視化のための、イメージングシステムおよび方法
JP2019510085A (ja) 2016-03-08 2019-04-11 ロス ガトス ファーマスーティカルズ， インク．Ｌｏｓ Ｇａｔｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 癌治療のためのナノ粒子ならびに方法および化合物
JP7455510B2 (ja) 2016-04-29 2024-03-26 メモリアル スローン－ケタリング キャンサー センター 悪性脳腫瘍における標的化粒子の浸透、分布および応答のための組成物及び方法
JP2019517564A (ja) 2016-06-09 2019-06-24 ブリンクバイオ インコーポレイテッド シラノール系治療的ペイロード
WO2018003739A1 (ja) 2016-06-30 2018-01-04 レナセラピューティクス株式会社 機能的リガンドを含む核酸複合体
JP2019530485A (ja) 2016-07-07 2019-10-24 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 粒子駆動型、知識ベースかつ予測的がんラジオゲノミクスのためのイメージングシステムおよび方法
JP7058666B2 (ja) 2016-11-25 2022-04-22 マブウェル （シャンハイ） バイオサイエンス カンパニー リミテッド 抗体－薬物複合体化のための二置換マレインアミドリンカーならびにその調製方法および使用
AU2017368005A1 (en) 2016-11-30 2019-06-20 Cornell University Inhibitor-functionalized ultrasmall nanoparticles and methods thereof
WO2018191316A1 (en) 2017-04-10 2018-10-18 Cornell University Sulfur- or heavy atom-containing nanoparticles, methods of making same, and uses thereof
EP3624777A4 (en) 2017-05-19 2021-03-10 Cornell University FUNCTIONALIZED NANOPARTICLE AND METHOD FOR MANUFACTURING AND USING THEREOF
CN110869057A (zh) 2017-05-25 2020-03-06 纪念斯隆凯特琳癌症中心 用锆-89标记的超小纳米颗粒及其方法
US20210145985A1 (en) 2017-06-23 2021-05-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Method of imaging in vivo tissues using nanoparticles comprising a reference dye and a sensor dye
CN109106951A (zh) 2017-08-18 2019-01-01 四川百利药业有限责任公司 一种喜树碱-抗体偶联物
JP7381478B2 (ja) 2017-10-23 2023-11-15 マブリンク ビオシオンス 単一分子量ポリサルコシンを含むリガンド－薬物－複合体
WO2019113004A1 (en) 2017-12-04 2019-06-13 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of cancer treatment via regulated ferroptosis
IL277748B1 (en) 2018-04-06 2024-03-01 Seagen Inc Camptothecin peptide conjugates
WO2019195858A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Cornell University Inorganic nanocages, and methods of making and using same
EP3788000A4 (en) 2018-05-02 2022-04-27 Cornell University ULTRASMALL NANOPARTICLES AND METHODS OF PRODUCTION, USE AND ANALYSIS THEREOF
EP3790491A1 (en) 2018-05-10 2021-03-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Systems for augmented reality surgical and clinical visualization
CN111001012A (zh) 2018-10-19 2020-04-14 四川百利药业有限责任公司 一种亲水碳酸酯型抗体偶联药物
WO2020214741A1 (en) 2019-04-15 2020-10-22 Cornell University Functionalized silica nanorings, methods of making same, and uses thereof
JP2022533400A (ja) 2019-05-20 2022-07-22 ノバルティス アーゲー Ｍｃｌ－１阻害剤抗体－薬物コンジュゲートおよび使用方法
WO2021092065A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Cornell University Ultrasmall nanoparticles and methods of making, using and analyzing same
EP4237008A2 (en) 2020-10-27 2023-09-06 Elucida Oncology, Inc. Carrier particle-drug conjugates, self-immolative linkers, and uses thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012229252A (ja) * 2000-02-08 2012-11-22 Rice Univ 治療法および診断法において使用される光学活性なナノ粒子
US20110196285A1 (en) * 2008-10-10 2011-08-11 Dong Chen Hollow Mesoporous Silica Sphere Coated with Gold and Preparation Method Thereof and Use in Cancer Therapy
JP2016516729A (ja) * 2013-03-15 2016-06-09 スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ マルチモーダルシリカ系ナノ粒子
JP2019196369A (ja) * 2013-08-13 2019-11-14 ノースウェスタン ユニバーシティ ペプチドコンジュゲート粒子
WO2016100376A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Nanotherapeutic for treating infections caused by intracellular and extracellular pathogens
JP2018115145A (ja) * 2016-08-19 2018-07-26 ナショナル タイワン ユニバーシティ 生物活性成分を内包した中空シリカナノ粒子、調製プロセス、および、その応用
JP2018070626A (ja) * 2017-11-24 2018-05-10 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 標的化ナノ粒子

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