ES2963150T3 - Procedimientos para funcionalizar nanopartículas - Google Patents

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Feng Chen
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Abstract

Esta divulgación se refiere a métodos para funcionalizar una nanopartícula, por ejemplo, para la conjugación con un ligando de direccionamiento y/o un resto de carga útil, tal como para la producción de un conjugado de fármaco en nanopartícula (NDC). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para funcionalizar nanopartículas
SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 63/105,995, presentada el 27 de octubre de 2020, la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 63/116,393, presentada el 20 de noviembre de 2020, la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 63/117,110, presentada el 23 de noviembre de 2020, la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 63/155,043, presentada el 1 de marzo de 2021, la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 63/222,181, presentada el 15 de julio de 2021, la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 63/242,201, presentada el 9 de septiembre de 2021, y la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. 63/254,837, presentada el 12 de octubre de 2021.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
[0002] Los conjugados de fármacos y nanopartículas (NDC,nanoparticle drug conjúgate)ofrecen el potencial de resolver muchas de las deficiencias de otras plataformas portadoras de fármacos, como los conjugados de fármacosanticuerpos (ADC,antibody drug conjúgate).Por ejemplo, los NDC con un tamaño ultrapequeño (por ejemplo, un diámetro de 20 nm o menos) pueden atravesar barreras hematoencefálicas alteradas y administrar agentes terapéuticos a tumores cerebrales, lo que no es posible utilizando otras plataformas, tales como los ADC. Las nanopartículas ultrapequeñas pueden mostrar una penetración tumoral profunda y proporcionar una administración homogénea de moléculas terapéuticas a los tumores, mientras que otras plataformas portadoras de fármacos, ales como los ADC, tienen una penetración tumoral limitada debido a la lenta difusión intratumoral. Los NDC también pueden transportar muchas más moléculas de fármacos que las plataformas de administración de fármacos convencionales, tales como los ADC, lo que permite a los NDC administrar una cantidad relativamente mayor de fármacos a las células cancerosas. Esto es particularmente útil cuando se dirige a células cancerosas con baja expresión de receptores, lo que complica la administración de una cantidad suficiente de fármaco. Otra ventaja de los NDC es la posibilidad de recubrir la nanopartícula con una capa de polímero orgánico, por ejemplo, recubrir la superficie de la nanopartícula con una capa de grupos PEG, lo que puede evitar la adsorción de proteínas séricas a la nanopartícula en un entorno fisiológico (por ejemplo, en un sujeto), y puede facilitar la excreción urinaria eficiente y disminuir la agregación de la nanopartícula (ver, por ejemplo, Burns et al. "Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine", Nano Letters (2009) 9(1): 442-448). Las estrategias de conjugación para la producción de ADC utilizando la reacción de Diels-Alder se describen en, por ejemplo, St. Amant, "Novel Conjugation Strategies Using the DielsAlder Reaction", tesis doctoral, UC Santa Barbara (2018); St. Amant et al., "Tuning the Diels-Alder reaction for bioconjugation to maleimide drug-linkers", Bioconjugate Chem. (2018) 29(7):2406-2414; y St. Amant et al., "A reactive antibody platform for one-step production of antibody-drug conjugates through a Diels-Alder reaction with maleimide", Bioconjugate Chem. (2019) 30(9):2340-2348.
[0003] Sin embargo, existen obstáculos importantes en el desarrollo y fabricación de NDC. Por ejemplo, es un gran desafío crear NDC que cumplan con los estrictos criterios en los controles de fabricación, estabilidad, liberación de fármaco, seguridad y eficacia necesarios para la traducción clínica. En particular, es especialmente difícil crear un enlace entre moléculas conjugadas (por ejemplo, moléculas de fármaco y/o ligandos de reconocimiento) y el portador de nanopartículas que cumplan estos criterios.
[0004] Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha de procedimientos para funcionalizar nanopartículas y permitir la conjugación de moléculas a la nanopartícula, tales como moléculas de fármaco o ligandos de reconocimiento.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0005] La presente invención da a conocer procedimientos para funcionalizar una nanopartícula, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas. De manera específica, la presente invención da a conocer un procedimiento para funcionalizar una nanopartícula, que comprende:
poner en contacto una nanopartícula con un primer precursor bifuncional, en el que el primer precursor bifuncional comprende un resto de silano y un resto de dieno, y en el que el contacto se realiza en condiciones adecuadas para la reacción entre el resto de silano y la superficie de la nanopartícula;
formar un enlace covalente entre el resto de silano y una superficie de la nanopartícula, formando de este modo una nanopartícula funcionalizada con un resto de dieno;
poner en contacto la nanopartícula funcionalizada con un resto de dieno con un segundo precursor bifuncional, en el que el segundo precursor bifuncional comprende un resto de alquino y un dienófilo, en el que el contacto se realiza en condiciones adecuadas para una reacción entre el dienófilo y el resto de dieno; y
hacer reaccionar el resto de dieno de la nanopartícula con el segundo precursor bifuncional, formando de este modo una nanopartícula funcionalizada con un resto de alquino;
en el que la nanopartícula es una nanopartícula de sílice.
[0006] De manera más general, la presente divulgación presenta procedimientos para funcionalizar una nanopartícula. El procedimiento puede incluir la preparación de nanopartículas adecuadas para conjugar compuestos a la superficie de la nanopartícula (por ejemplo, ligandos dirigidos, tales como ligandos dirigidos a cáncer, por ejemplo, ligandos dirigidos a receptores de folato, por ejemplo, ácido fólico; y agentes terapéuticos, tales como compuestos citotóxicos, por ejemplo, exatecán) para formar conjugados de fármacos y nanopartículas (NDC). Los NDC resultantes muestran un enlace altamente estable de la molécula conjugada a la nanopartícula y proporcionan una liberación eficaz del fármaco en sistemas biológicos diana, por ejemplo, en células cancerosas.
[0007] El procedimiento sintético descrito en el presente documento puede implicar una secuencia de reacciones, que pueden introducir una serie de diferentes grupos reactivos (a veces denominados en el presente documento grupos funcionales) o compuestos (por ejemplo, restos de carga útil o ligandos dirigidos) a la superficie de la nanopartícula. Estas reacciones pueden incluir condensación de silano, reacción de Diels-Alder y "química Click", reacciones de cicloadición 2+3 o 2+4, entre otras, por ejemplo, otras reacciones descritas en el presente documento. El procedimiento puede usarse para funcionalizar nanopartículas ultrapequeñas, incluidas nanopartículas que están recubiertas con un polímero orgánico y/o nanopartículas de sílice (por ejemplo, nanopartículas de sílice PEGilada ultrapequeñas, tales como C'Dots).
[0008] El procedimiento para funcionalizar una nanopartícula descrita en el presente documento puede comprender una etapa de poner en contacto una nanopartícula con un primer precursor bifuncional, tal como un precursor bifuncional que comprende un resto de silano y otro grupo reactivo (por ejemplo, un dieno, una amina, un tiol, un hidroxilo, una azida, un alqueno o un alquino), en el que la nanopartícula comprende una superficie que es reactiva con el silano (por ejemplo, una superficie de sílice), y en el que el contacto se realiza en condiciones adecuadas para reacción entre el resto de silano y la superficie de la nanopartícula (por ejemplo, condiciones descritas en el presente documento adecuadas para la condensación de silano), formando así un enlace covalente entre el resto de silano y una superficie de la nanopartícula, y proporcionar una nanopartícula funcionalizada con el grupo reactivo (por ejemplo, un dieno, una amina, un tiol, un hidroxilo, una azida, un alqueno o un alquino). Se entenderá que este procedimiento se puede utilizar para proporcionar una nanopartícula que comprende una pluralidad de los grupos reactivos. En el procedimiento de la presente invención, el primer precursor bifuncional comprende un resto de silano y un resto de dieno y la nanopartícula es una nanopartícula de sílice, de modo que el paso de poner en contacto una nanopartícula con el primer precursor bifuncional forma una nanopartícula funcionalizada con un resto de dieno.
[0009] El contacto de la nanopartícula con el primer precursor bifuncional puede implicar la inserción del precursor bifuncional en el espacio intersticial entre moléculas de polímero orgánico (por ejemplo, cadenas de PEG) unidas a la nanopartícula, tal como cuando se usa una nanopartícula que comprende una superficie recubierta con PEG. Por tanto, este procedimiento supera las dificultades de los procedimientos convencionales de funcionalización de nanopartículas que no pueden suministrar eficazmente moléculas precursoras a la superficie de una nanopartícula que comprende una capa de polímero orgánico (por ejemplo, una capa de moléculas de PEG) para su funcionalización.
[0010] El procedimiento descrito en el presente documento puede comprender además poner en contacto la nanopartícula funcionalizada con el grupo reactivo (por ejemplo, la nanopartícula funcionalizada con un dieno, una amina, un tiol, un hidroxilo, una azida, un alqueno o un alquino) con un segundo precursor bifuncional, en donde el segundo precursor bifuncional comprende un grupo que es reactivo con el grupo reactivo en la nanopartícula, y en donde el segundo precursor bifuncional comprende otro grupo funcional (por ejemplo, un resto de alquino (por ejemplo, dibenzoazaciclooctino (DBCO)), un dieno, una amina, un tiol, un hidroxilo, un alqueno o una azida). Por ejemplo, el segundo precursor bifuncional puede comprender un dienófilo (por ejemplo, maleimida) que es reactivo con el grupo reactivo en la nanopartícula (por ejemplo, un dieno), y el segundo precursor bifuncional también puede comprender un resto de alquino (por ejemplo, DBCO). El contacto puede realizarse en condiciones adecuadas para una reacción entre la nanopartícula funcionalizada y el segundo precursor bifuncional (por ejemplo, condiciones de reacción descritas en el presente documento), uniendo así de manera covalente el segundo precursor bifuncional a la nanopartícula y proporcionando una nanopartícula funcionalizada con el otro grupo funcional (por ejemplo, un resto de alquino, tal como DBCO). Se entenderá que el procedimiento puede usarse para proporcionar una nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de otro grupo funcional (por ejemplo, una pluralidad de restos de DBCO). En el procedimiento de la presente invención, la nanopartícula funcionalizada con un resto dieno se pone en contacto con un segundo precursor bifuncional, en el que el segundo precursor bifuncional comprende un resto de alquino y un dienófilo, de modo que se forma una nanopartícula funcionalizada con un resto de alquino.
[0011] El procedimiento puede comprender además poner en contacto la nanopartícula funcionalizada con el otro grupo funcional (por ejemplo, una nanopartícula funcionalizada con DBCO) con un compuesto que comprende un grupo que es reactivo con el otro grupo funcional de la nanopartícula. Por ejemplo, el compuesto puede comprender un grupo reactivo con alquino (por ejemplo, una azida, dieno, nitrona u óxido de nitrilo), adecuado para reaccionar con un grupo alquino de una nanopartícula funcionalizada con alquino. El contacto puede realizarse en condiciones adecuadas para una reacción entre el resto de alquino y el grupo reactivo con alquino, por ejemplo, condiciones de reacción descritas en el presente documento, tales como condiciones de química Click u otras condiciones de cicloadición (por ejemplo, cicloadición 3+2 o cicloadición 4+2), formando así una nanopartícula funcionalizada con el compuesto. El compuesto que comprende un grupo que es reactivo con el grupo funcional en la nanopartícula puede comprender un resto de carga útil (por ejemplo, un fármaco citotóxico descrito en el presente documento, tal como el exatecán) o un ligando dirigido (por ejemplo, un ligando dirigido al receptor de folato, tal como el ácido fólico). El procedimiento puede usarse para unir de manera covalente una pluralidad de compuestos a la superficie de la nanopartícula. Por ejemplo, el procedimiento puede introducir una pluralidad del compuesto que comprende un grupo que es reactivo con la nanopartícula funcionalizada, o introducir una pluralidad de compuestos diferentes, comprendiendo cada uno de ellos un grupo que es reactivo con la nanopartícula funcionalizada (por ejemplo, una pluralidad de ligandos dirigidos, una pluralidad de restos de carga útil, o una combinación de los mismos), y unir de manera covalente dichos compuestos a la nanopartícula.
[0012] Se entenderá que cada etapa del procedimiento puede usarse para introducir una pluralidad de grupos funcionales en la nanopartícula. Por ejemplo, la nanopartícula se puede poner en contacto con una pluralidad del primer precursor bifuncional que comprende un grupo silano y un grupo reactivo, proporcionando una nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de grupos reactivos (por ejemplo, una pluralidad de restos de dieno). La nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de grupos reactivos (por ejemplo, una pluralidad de restos de dieno) se puede poner en contacto con una pluralidad de segundos precursores bifuncionales, en donde el segundo precursor bifuncional comprende un grupo que es reactivo con el grupo reactivo en la nanopartícula, y en donde el segundo precursor bifuncional comprende otro grupo funcional (por ejemplo, un alquino, por ejemplo, DBCO), proporcionando así una nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de grupos funcionales del segundo precursor bifuncional (por ejemplo, una pluralidad de restos de DBCO). La nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de los grupos funcionales del segundo precursor bifuncional puede entonces ponerse en contacto con una pluralidad de compuestos que comprenden un grupo que es reactivo con el grupo funcional en la nanopartícula, proporcionando una nanopartícula que comprende una pluralidad de compuestos. La nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de grupos funcionales del segundo precursor bifuncional se puede poner en contacto con una primera pluralidad de compuestos que comprenden un grupo que es reactivo con el grupo funcional de la nanopartícula (por ejemplo, un ligando dirigido que comprende una azida), y posteriormente se puede poner en contacto con una segunda pluralidad de compuestos que comprenden un grupo que es reactivo con el grupo funcional en la nanopartícula (por ejemplo, un conjugado de carga útil-enlazador que compren de una azida), donde la primera y segunda pluralidad comprenden compuestos estructuralmente distintos, proporcionando de este modo una nanopartícula que comprende dos pluralidades distintas de compuestos (por ejemplo, una pluralidad de ligandos dirigidos y una pluralidad de restos de carga útil).
[0013] Por ejemplo, el procedimiento puede comprender formar una nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de restos de dieno (por ejemplo, restos de ciclopentadieno), por ejemplo, poniendo en contacto una nanopartícula con una pluralidad de primeros precursores bifuncionales que comprenden un resto de silano y un resto de dieno, en condiciones suficientes para una reacción entre un resto de silano y una superficie de la nanopartícula. El procedimiento puede comprender formar una nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de restos de alquino (por ejemplo, restos DBCO), por ejemplo, poniendo en contacto una nanopartícula que comprende una pluralidad de restos de dieno (por ejemplo, restos de ciclopentadieno) con una pluralidad de segundos precursores bifuncionales que comprenden un dienófilo (por ejemplo, maleimida) y un resto de alquino (por ejemplo, DBCO), en condiciones suficientes para una reacción entre un resto de dieno y un dienófilo. El procedimiento puede comprender además: (a) hacer reaccionar una primera parte de la pluralidad de restos de alquino en una nanopartícula con un primer compuesto que comprende un grupo reactivo a alquino (en condiciones suficientes para una reacción entre un resto de alquino y un grupo reactivo a alquino); y (b) hacer reaccionar una segunda parte de la pluralidad de restos de alquino en una nanopartícula con un segundo compuesto que comprende un grupo reactivo a alquino (en condiciones suficientes para una reacción entre un resto de alquino y un grupo reactivo a alquino), formando de este modo una nanopartícula funcionalizada. con una pluralidad del primer compuesto y una pluralidad del segundo compuesto, en el que el primer compuesto y el segundo compuesto son químicamente distintos. Por ejemplo, (a) el primer compuesto puede ser un compuesto de Fórmula (D) (por ejemplo, un compuesto de Fórmula (D-1)) descrito en el presente documento; y el segundo compuesto puede ser un compuesto de Fórmula (E) (por ejemplo, un compuesto de Fórmula (E-1)), descrito en el presente documento. De manera alternativa, el primer compuesto puede ser un compuesto de Fórmula (E) (por ejemplo, un compuesto de Fórmula (E-1)) descrito en el presente documento, y el segundo compuesto es un compuesto de Fórmula (D) (por ejemplo, un compuesto de Fórmula (D-1)) descrito en el presente documento.
[0014] La presente divulgación también está dirigida a un procedimiento para funcionalizar una nanopartícula de sílice, que comprende: (i) poner en contacto una nanopartícula de sílice con un primer precursor bifuncional, en el que el primer precursor bifuncional comprende un resto de silano y un resto de ciclopentadieno, en el que la nanopartícula de sílice comprende un superficie que es reactiva con el resto de silano (por ejemplo, una superficie de sílice), y en el que el contacto se realiza en condiciones adecuadas para la reacción entre el resto de silano y la superficie de la nanopartícula de sílice, formando de este modo un enlace covalente entre el resto de silano y una superficie de la nanopartícula, y proporcionar una nanopartícula funcionalizada con un resto de ciclopentadieno; (ii) poner en contacto la nanopartícula funcionalizada con un resto de ciclopentadieno con un segundo precursor bifuncional, en el que el segundo precursor bifuncional comprende un resto de alquino (por ejemplo, DBCO) y un dienófilo (por ejemplo, maleimida), en el que el contacto se realiza en condiciones adecuadas para una reacción entre el dienófilo y el resto de ciclopentadieno, haciendo reaccionar de este modo el resto de dieno de la nanopartícula con el segundo precursor bifuncional, y proporcionando una nanopartícula funcionalizada con un resto de alquino; y (iii) poner en contacto el resto de alquino con un compuesto que comprende un resto de azida, en condiciones adecuadas para una reacción entre el resto de alquino y el resto de azida (por ejemplo, condiciones de química clic), haciendo reaccionar de este modo el resto de alquino de la nanopartícula con el resto de azida y proporcionando una nanopartícula funcionalizada con el compuesto (por ejemplo, un compuesto que comprende una carga útil o un ligando dirigido).
[0015] La presente divulgación también se dirige a un procedimiento para funcionalizar una nanopartícula de sílice, que comprende: (i) poner en contacto una nanopartícula de sílice con un primer precursor bifuncional que comprende una estructura de Fórmula (A), proporcionando de este modo una nanopartícula funcionalizada con un resto de ciclopentadieno; (ii) poner en contacto la nanopartícula funcionalizada con un resto de ciclopentadieno con un segundo precursor bifuncional que comprende una estructura de Fórmula (B), proporcionando de este modo una nanopartícula funcionalizada con un resto de alquino; y (iii) poner en contacto el resto de alquino con un compuesto de Fórmula (D) o Fórmula (E), o ambos, proporcionando de este modo una nanopartícula funcionalizada con un ligando dirigido, un resto de carga útil o ambos.
[0016] El primer precursor bifuncional puede comprender la estructura de Fórmula (A-1) proporcionada en el presente documento. El segundo precursor bifuncional puede comprender una estructura de Fórmula (B-1) proporcionada en el presente documento. El compuesto de Fórmula (D) puede comprender una estructura de Fórmula (D-1) proporcionada en el presente documento. El compuesto de Fórmula (E) puede comprender una estructura de Fórmula (E-1) proporcionada en el presente documento.
[0017] Los procedimientos descritos en el presente documento pueden proporcionar una nanopartícula que comprende un compuesto de Fórmula (NP-2) proporcionado en el presente documento. La relación promedio de nanopartículas con respecto a (NP-2) puede ser de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:50 (cada nanopartícula comprende un promedio de 1-50 unidades de NP-2), por ejemplo, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:25, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:15, aproximadamente 1:14, aproximadamente 1:13, aproximadamente 1:12, aproximadamente 1:11 o aproximadamente 1:10.
[0018] El procedimiento puede proporcionar una nanopartícula que comprende un compuesto de Fórmula (NP-3) proporcionado en el presente documento. La relación promedio de nanopartículas con respecto a (NP-3) puede ser de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:80 (cada nanopartícula comprende un promedio de 1-80 unidades de NP-3), por ejemplo, aproximadamente 1:60, aproximadamente 1:40 , aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:28, aproximadamente 1:26, aproximadamente 1:25, aproximadamente 1:24, aproximadamente 1:23, aproximadamente 1:22, aproximadamente 1:21, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:19 , o alrededor de 1:18.
[0019] El procedimiento puede proporcionar una nanopartícula que comprende un compuesto de Fórmula (NP-2) y un compuesto de Fórmula (NP-3), cuyas estructuras se proporcionan en el presente documento, en donde la relación de nanopartícula: (NP-3): (NP-2) es aproximadamente 1:20:10, 1:20:11, 1:20:12, 1:20:13, 1:20:14, 1:20:15, 1:21:10, 1 :21:11, 1:21:12, 1:21:13, 1:21:14, 1:21:15, 1:22:10, 1:22:11, 1:22:12, 1:22 :13, 1:22:14, 1:22:15, 1:23:10, 1:23:11, 1:23:12, 1:23:13, 1:23:14, 1:23:15 , 1:24:10, 1:24:11, 1:24:12, 1:24:13, 1:24:14, 1:24:15, 1:25:10, 1:25:11, 1 :25:12, 1:25:13, 1:25:14 o 1:25:15.
[0020] Una ventaja de los procedimientos descritos en el presente documento es el uso de precursores relativamente estables (por ejemplo, precursores de dieno-silano), lo que da como resultado nanopartículas funcionalizadas estables. Por ejemplo, las nanopartículas funcionalizadas (por ejemplo, NDC) que pueden producirse utilizando los procedimientos descritos en el presente documento pueden evitar la escisión prematura o no deseada, que puede tener lugar en nanopartículas funcionalizadas (por ejemplo, NDC) producidas utilizando otros procedimientos o con otros precursores. Por ejemplo, otros procedimientos de funcionalización de nanopartículas emplean precursores que dan como resultado nanopartículas con restos reactivos en la superficie de la nanopartícula, que pueden promover una reactividad no deseada que puede conducir a, por ejemplo, la liberación prematura de una carga útil o la liberación no deseada del ligando dirigido. Además, otros procedimientos de funcionalización de nanopartículas utilizan precursores que son inestables y pueden autocondensarse durante la reacción, provocando una agregación no deseada. Los agregados pueden resultar muy difíciles de separar de las nanopartículas funcionalizadas.
[0021] Por el contrario, los procedimientos descritos en el presente documento pueden emplear precursores relativamente estables y las nanopartículas funcionalizadas resultantes (por ejemplo, NDC) son estables y muy puras. Por ejemplo, las nanopartículas funcionalizadas de la presente divulgación se pueden preparar con un precursor de dieno-silano (tal como un precursor de ciclopentadieno-silano), para proporcionar una nanopartícula funcionalizada con uno o más grupos dieno. Los grupos dieno pueden entonces hacerse reaccionar con un segundo precursor, tal como un precursor que contiene dienófilo (por ejemplo, un derivado de PEG-maleimida, por ejemplo, una DBCO-PEG-maleimida), provocando la formación de un cicloaducto estable. La nanopartícula funcionalizada resultante, que comprende el cicloaducto, puede de manera opcional hacerse reaccionar con uno o más precursores posteriores (tales como un precursor de ligando dirigido y/o un precursor de conjugado de carga útil-enlazador descrito en el presente documento) para funcionalizar adicionalmente la nanopartícula. El precursor de dieno-silano y los cicloaductos que se producen no muestran características no deseadas que puedan encontrarse en otras nanopartículas funcionalizadas o sus precursores. Por ejemplo, las nanopartículas funcionalizadas (por ejemplo, NDC) preparadas utilizando los procedimientos descritos en el presente documento tienen una estabilidad sérica relativamente alta y pueden producirse con alto rendimiento y pureza (por ejemplo, libres de precursores agregados). Además, como este enfoque es altamente modular, se puede introducir en la nanopartícula cualquier proporción deseada de carga útil, ligando dirigido o de otro tipo. En los Ejemplos se proporcionan ejemplos de preparación de nanopartículas usando estos procedimientos y sus ventajas.
[0022] En el Esquema 1 se representa una secuencia de ejemplo de funcionalización de una nanopartícula.
Esquema 1.Secuencia de ejemplo de modificación de una nanopartícula (C'Dot)
-
C'Dot dirigido NDC dirigido
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0023]
La figura 1ilustra la estructura de un conjugado de fármaco y nanopartículas (NDC) de ejemplo que se puede preparar utilizando los procedimientos descritos en el presente documento.
La figura 2es un gráfico que compara la eficiencia entre diferentes enfoques para funcionalizar nanopartículas con restos de DBCO.
Las figuras 3A-3Dson cromatogramas de RP-HPLC y SEC.La figura 3Aproporciona el cromatograma RP-HPLC de nanopartículas funcionalizadas con DBCO preparadas usando un precursor bifuncional a base de amina, antes y después de la incubación en PBS durante 24 horas.La figura 3Bproporciona el cromatograma RP-HPLC de nanopartículas funcionalizadas con DBCO preparadas usando un precursor bifuncional a base de dieno, antes y después de la incubación en PBS durante 24 horas.La figura 3Cproporciona el cromatograma SEC de nanopartículas funcionalizadas con DBCO preparadas usando un precursor bifuncional a base de amina.La figura 3Dproporciona el cromatograma SEC de nanopartículas funcionalizadas con DBCO preparadas utilizando un precursor bifuncional a base de dieno.
La figura 4es un espectrógrafo de espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) de un NDC de ejemplo preparado usando los procedimientos descritos en el presente documento, que indica el diámetro hidrodinámico promedio.
La Figura 5muestra espectros UV-Vis superpuestos de una nanopartícula funcionalizada de ejemplo en diferentes etapas de funcionalización, que indican picos de absorción característicos que pueden usarse para verificar la presencia y el número promedio de cada conjugado (por ejemplo, ligando de reconocimiento, por ejemplo, ácido fólico (FA), o carga útil, por ejemplo, exatecán) por partícula.
Las figuras 6A-6Bproporcionan el cromatograma RP-HPLC (FIG. 6A) y el cromatograma SEC (FIG. 6B) en dos longitudes de onda de un NDC de ejemplo preparado usando los procedimientos descritos en el presente documento.
La Figura 7es un gráfico que proporciona la cantidad de fármaco (exatecán) liberado a lo largo del tiempo a partir de un NDC de ejemplo mientras se incuba con catepsina-B a 37 °C. El recuadro proporciona los espectros UV-Vis superpuestos registrados en cada punto de tiempo.
Las figuras 8A-8Bson gráficos que ilustran la estabilidad en suero de NDC de ejemplo preparados usando procedimientos descritos en el presente documento.La figura 8Acompara la estabilidad de un NDC producido usando un precursor bifuncional basado en dieno y un NDC producido usando un precursor bifuncional basado en amina en suero humano al 10 % a 37 °C, durante 7 días.La figura 8Bcompara la estabilidad de un NDC producido usando un precursor bifuncional basado en dieno y un NDC producido usando un precursor bifuncional basado en amina en suero de ratón al 10 % a 37 °C, durante 7 días.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones químicas seleccionadas
[0024] Tal como se usa en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático monovalente que puede comprender de 1 a 18 átomos de carbono, tal como de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, o de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono ("alquilo C-ms"). Un grupo alquilo puede ser de cadena lineal, de cadena ramificada, de un resto monocíclico o de un resto policíclico o combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos de grupos alquilo se incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, norbornilo y similares. Cada caso de un grupo alquilo puede estar de manera independiente de manera opcional sustituido, es decir, no sustituido (un "alquilo no sustituido") o sustituido (un "alquilo sustituido") con uno o más sustituyentes, por ejemplo, de 1 a 5 sustituyentes, de 1 a 3 sustituyentes o 1 sustituyente.
[0025] Tal como se usa en el presente documento, el término "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada que tiene de 2 a 18 átomos de carbono, uno o más dobles enlaces carbonocarbono y ningún triple enlace ("alquenilo C 2-is"). Un grupo alquenilo puede tener de 2 a 8 átomos de carbono, de 2 a 6 átomos de carbono, de 2 a 5 átomos de carbono, de 2 a 4 átomos de carbono o de 2 a 3 átomos de carbono. Los uno o más dobles enlaces carbono-carbono pueden ser internos (tal como en 2-butenilo) o terminales (tal como en 1-butenilo). Entre los ejemplos de grupos alquenilo se incluyen etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, butadienilo, pentenilo, pentadienilo, hexenilo, heptenilo, octenilo, octatrienilo y similares. Cada caso de un grupo alquenilo puede estar de manera independiente de manera opcional sustituido, es decir, no sustituido (un "alquenilo no sustituido") o sustituido (un "alquenilo sustituido") con uno o más sustituyentes, por ejemplo, de 1 a 5 sustituyentes, de 1 a 3 sustituyentes o 1 sustituyente.
[0026] Tal como se usa en el presente documento, el término "alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada que tiene de 2 a 18 átomos de carbono, y uno o más triples enlaces carbono-carbono ("alquinilo C2-18"). El grupo alquinilo puede tener de 2 a 8 átomos de carbono, de 2 a 6 átomos de carbono, de 2 a 5 átomos de carbono, de 2 a 4 átomos de carbono o de 2 a 3 átomos de carbono. Los uno o más triples enlaces carbono-carbono pueden ser internos (tal como en 2-butinilo) o terminales (tal como en 1 -butinilo). Entre los ejemplos de grupos alquinilo se incluyen etinilo, 1 -propinilo, 2-propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo y similares. Cada caso de un grupo alquinilo puede estar de manera independiente de manera opcional sustituido, es decir, no sustituido (un "alquinilo no sustituido") o sustituido (un "alquinilo sustituido") con uno o más sustituyentes, por ejemplo, de 1 a 5 sustituyentes, de 1 a 3 sustituyentes, o 1 sustituyente.
[0027] Tal como se usa en el presente documento, el término "heteroalquilo" se refiere a una cadena lineal o ramificada estable no cíclica, o combinaciones de las mismas, que incluyen al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, P, Si y S, y en el que los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar de manera opcional oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar de manera opcional cuaternizado. El heteroátomo o heteroátomos O, N, P, S y Si pueden estar colocados en cualquier posición del grupo heteroalquilo.
[0028] Los términos "alquileno", "alquenileno", "alquinileno" o "heteroalquileno", solos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un radical divalente derivado de un alquilo, alquenilo, alquinilo o heteroalquilo, respectivamente. El término "alquenileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical divalente derivado de un alqueno. Un grupo alquileno, alquenileno, alquinileno o heteroalquileno puede describirse como, por ejemplo, un alquileno de C1-6 miembros, un alquenileno de C1-6 miembros, un alquinileno de C 1-6 miembros o un heteroalquileno de C1-6 miembros, en el que el término "miembros" se refiere a los átomos distintos de hidrógeno dentro del resto. En el caso de grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino y similares). Aún más, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, la dirección en la que está escrita la fórmula del grupo de enlace no implica ninguna orientación del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(O)2R'- puede representar tanto -C(O)2R'- como -R'C(O)2-. Cada caso de un grupo alquileno, alquenileno, alquinileno o heteroalquileno puede estar de manera independiente de manera opcional sustituido, es decir, no sustituido (un "alquileno no sustituido") o sustituido (un "heteroalquileno sustituido") con uno o más sustituyentes.
[0029] Tal como se usan en el presente documento, los términos "alquilo sustituido", "alquenilo sustituido", "alquinilo sustituido", "heteroalquilo sustituido", "heteroalquenilo sustituido", "heteroalquinilo sustituido", "cicloalquilo sustituido", "heterociclilo sustituido", "arilo sustituido" y "heteroarilo sustituido" se refieren a restos alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo, respectivamente, que tienen sustituyentes que reemplazan uno o más átomos de hidrógeno en uno o más carbonos o heteroátomos del resto. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático. Los cicloalquilos pueden estar sustituidos adicionalmente, por ejemplo, con los sustituyentes descritos anteriormente.
[0030] Tal como se usa en el presente documento, el término "alcoxi" se refiere a un grupo de fórmula -O-alquilo. El término "alcoxi" o "alcoxilo" incluye grupos alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos y no sustituidos unidos de manera covalente a un átomo de oxígeno. Entre los ejemplos de grupos alcoxi o radicales alcoxilo se incluyen, pero sin limitarse a estos, grupos metoxi, etoxi, isopropiloxi, propoxi, butoxi y pentoxi. Entre los ejemplos de grupos alcoxi sustituidos se incluyen grupos alcoxi halogenados. Los grupos alcoxi pueden estar sustituidos con grupos, tales como alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o restos aromáticos o heteroaromáticos. Entre los ejemplos de grupos alcoxi sustituidos con halógeno se incluyen, pero sin limitarse a estos, fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, clorometoxi, diclorometoxi y triclorometoxi.
[0031] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "arilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos estable, que puede ser monocíclico o policíclico, del cual todos los átomos del anillo son carbono, y que puede estar sustituido o no sustituido. El sistema de anillos aromáticos puede tener, por ejemplo, de 3 a 7 átomos en el anillo. Los ejemplos incluyen fenilo, bencilo, naftilo, antracilo y similares. Cada caso de un grupo arilo puede estar de manera independiente de manera opcional sustituido, es decir, no sustituido (un "arilo no sustituido") o sustituido (un "arilo sustituido") con uno o más sustituyentes.
[0032] Tal como se usa en el presente documento, el término "heteroarilo" se refiere a un grupo arilo que incluye uno o más heteroátomos del anillo. Por ejemplo, un heteroarilo puede incluir un anillo heterocíclico aromático monocíclico de 5, 6 o 7 miembros o bicíclico de 7, 8 o 9 miembros estables que consiste en átomos de carbono y uno o más heteroátomos, seleccionados de manera independiente de entre el grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. El átomo de nitrógeno puede estar sustituido o no sustituido (por ejemplo, N o NR4, en el que R4 es H u otros sustituyentes, tal como se define). Entre los ejemplos de grupos heteroarilo se incluyen pirrol, furano, indol, tiofeno, tiazol, isotiazol, imidazol, triazol, tetrazol, pirazol, oxazol, isoxazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina y similares.
[0033] Tal como se usan en el presente documento, los términos "cicloalquileno", "heterociclileno", "arileno" y "heteroarileno", solos o como parte de otro sustituyente, significan un radical divalente derivado de un cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo. respectivamente. Cada caso de cicloalquileno, heterociclileno, arileno o heteroarileno puede estar de manera independiente de manera opcional sustituido, es decir, no sustituido (un "arileno no sustituido") o sustituido (un "heteroarileno sustituido") con uno o más sustituyentes.
[0034] Tal como se utiliza en el presente documento, se pretende que el término "cicloalquilo" incluya anillos de hidrocarburos cíclicos no aromáticos, tales como anillos de hidrocarburos que tienen de tres a ocho átomos de carbono en su estructura de anillo. Cicloalquilo puede incluir ciclobutilo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares. El grupo cicloalquilo puede ser monocíclico ("cicloalquilo monocíclico") o contener un sistema de anillos fusionados, con puente o espiro, tal como un sistema bicíclico ("cicloalquilo bicíclico") y puede estar saturado o parcialmente insaturado. "Cicloalquilo" también incluye sistemas de anillos en los que el anillo cicloalquilo, tal como se define anteriormente, está fusionado con uno o más grupos arilo, en los que el punto de unión está en el anillo cicloalquilo, y en tales casos, el número de carbonos continúa designando el número de carbonos en el sistema de anillos cicloalquilo. Cada caso de un grupo cicloalquilo puede estar de manera independiente de manera opcional sustituido, es decir, no sustituido (un “cicloalquilo no sustituido”) o sustituido (un “cicloalquilo sustituido”) con uno o más sustituyentes.
[0035] Tal como se usa en el presente documento, el término "heterociclilo" se refiere a una estructura molecular cíclica monovalente que comprende átomos de al menos dos elementos diferentes en el anillo o anillos (es decir, un radical de un anillo heterocíclico). Se hace referencia adicional a: Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, Oxford, 1997 como prueba de que anillo heterocíclico es un término bien establecido en el campo de la química orgánica.
[0036] Tal como se usa en el presente documento, el término "dipéptido" se refiere a un péptido que está compuesto por dos residuos de aminoácidos, que pueden indicarse en el presente documento como -A1-A2-. Por ejemplo, los dipéptidos empleados en la síntesis de un conjugado de proteasa-enlazador escindible-carga úti de la presente divulgación se pueden seleccionar del grupo que consiste en Val-Cit, Phe-Lys, Trp-Lys, Asp-Lys, Val-Lys y Val-Ala.
[0037] Tal como se usa en el presente documento, el término "halo" o "halógeno" se refiere a F, Cl, Br o I.
[0038] El anillo aromático de arilo o heteroarilo puede estar sustituido en una o más posiciones del anillo con sustituyentes tales como los descritos anteriormente, por ejemplo, alquilo, alquenilo, aquinilo, halógeno, hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, alquilaminocarbonilo, aralquilaminocarbonilo, alquenilaminocarbonilo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, alquenilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (que incluye alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (que incluye alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo, o un resto aromático o heteroaromático.
[0039] Tal como se usa en el presente documento, el término "hidroxi" se refiere a un grupo de fórmula -OH.
[0040] Tal como se usa en el presente documento, el término "hidroxilo" se refiere a un radical hidroxilo (.OH).
[0041] Tal como se usa en el presente documento, el término "oxo" se refiere a un oxígeno que tiene un doble enlace con carbono u otro elemento (es decir, =O).
[0042] Tal como se usa en el presente documento, la frase "de manera opcional sustituido" significa no sustituido o sustituido. En general, el término "sustituido" significa que al menos un hidrógeno presente en un grupo (por ejemplo, un átomo de carbono o nitrógeno) se reemplaza con un sustituyente permisible, por ejemplo, un sustituyente que tras la sustitución da como resultado un compuesto estable. El término "sustituido" puede incluir sustitución con todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos, tales como cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento que dan como resultado la formación de un compuesto estable. Para los fines de la presente divulgación, los heteroátomos, tales como el nitrógeno, pueden tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualquier sustituyente adecuado, tal como se describe en el presente documento, que satisfaga las valencias de los heteroátomos y dé como resultado la formación de un resto estable.
[0043] Tal como se usa en el presente documento, un "ligando de reconocimiento" es una molécula que puede unirse a una nanopartícula y dirigir la nanopartícula a un tumor o célula cancerosa, típicamente uniéndose al tumor o célula cancerosa (tal como uniéndose a una proteína expresada en la superficie del tumor o de la célula cancerosa). El ligando de reconocimiento puede ser cualquier molécula adecuada, tal como una molécula orgánica pequeña (por ejemplo, folato o un análogo de folato), una parte de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento scFv, un fragmento Fv, un diacuerpo dsFv, un fragmento dAb, un fragmento Fd', un fragmento Fd o una región determinante de complementariedad (CDR) aislada), un mimético de anticuerpo (por ejemplo, un aptámero, affibody, affilin, affimer, anticali, avimer, Darpin y similares), el dominio de unión de un receptor, un ácido nucleico, un lípido y similares.
[0044] Además, un experto en la técnica entenderá que los procedimientos sintéticos, tal como se describen en el presente documento, utilizan una variedad de grupos protectores. Tal como se usa en el presente documento, el término "grupo protector" se refiere a un resto funcional particular, por ejemplo, O, S o N, que está bloqueado temporalmente de modo que se pueda llevar a cabo una reacción selectivamente en otro sitio reactivo en un compuesto multifuncional. Los grupos protectores se pueden introducir y eliminar en etapas apropiadas durante la síntesis de un compuesto usando procedimientos que son conocidos por un experto en la técnica. Los grupos protectores se aplican según procedimientos estándar de síntesis orgánica, tal como se describe en la literatura (Theodora W. Greene y Peter GM Wuts (2007) Protecting Groups in Organic Synthesis, 4a edición, John Wiley and Sons).
[0045] Entre los grupos protectores de ejemplo se incluyen, pero no se limitan a, grupos protectores de oxígeno, azufre, nitrógeno y carbono. Por ejemplo, entre los grupos protectores de oxígeno se incluyen, pero no se limitan a, éteres metílicos, éteres metílicos sustituidos (por ejemplo, MOM (metoximetil éter), MTM (metiltiometil éter), BOM (benciloximetil éter), PMBM (pimetoxibenciloximetil éter), éteres etílicos opcionalmente sustituidos, éteres bencílicos opcionalmente sustituidos, éteres silílicos (por ejemplo, TMS (éter trimetilsilílico), TES (éter trietilsilílico), TIPS (éter triisopropilsilílico), TBDMS (éter t-butildimetilsilílico), éter tribencilsilílico, TBDPS (éter t-butildifenilsilílico), ésteres (por ejemplo, formiato, acetato, benzoato (Bz), trifluoroacetato, dicloroacetato), carbonatos, acetales cíclicos y cetales. Además, entre los grupos protectores de nitrógeno se incluyen, pero no se limitan a, carbamatos (que incluyen carbamatos de metilo, etilo y etilo sustituidos (por ejemplo, Troc), amidas, derivados de imida cíclica, N-alquil y N-aril aminas, derivados de imina y derivados de enamina, etc. Entre los grupos protectores de amino se incluyen, pero no se limitan a, fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), terc-butiloxicarbonilo (Boc), carboxibencilo (Cbz), acetamida, trifluoroacetamida, etc. En el presente documento se detallan otros grupos protectores de ejemplo, sin embargo, se apreciará que la presente divulgación no pretende limitarse a estos grupos protectores; más bien, se puede utilizar una variedad de grupos protectores equivalentes adicionales según procedimientos conocidos por un experto en la técnica. pero no se limitan a fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), terc-butiloxicarbonilo (Boc), carboxibencilo (Cbz), acetamida, trifluoroacetamida, etc. En el presente documento se detallan otros grupos protectores de ejemplo, sin embargo, se entenderá que la presente divulgación no pretende limitarse a estos grupos protectores; más bien, se puede utilizar una variedad de grupos protectores equivalentes adicionales según procedimientos conocidos por un experto en la técnica.
[0046] A lo largo de la presente divulgación, un conjugado de fármaco y nanopartícula (NDC) a veces puede denominarse CDC (conjugado de fármaco y C'Dot), por ejemplo, FA-CDC, o simplemente como una nanopartícula funcionalizada .
Nanopartículas
[0047] Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para funcionalizar cualquier nanopartícula adecuada. Por ejemplo, las nanopartículas de sílice se pueden funcionalizar usando un procedimiento descrito en el presente documento (que incluyen nanopartículas que están compuestas parcialmente de sílice o completamente compuestas de sílice). La nanopartícula puede tener un diámetro de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 100 nm, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 25 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 0,8 nm a aproximadamente 15 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm, o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 8 nm, por ejemplo, aproximadamente 1 nm, aproximadamente 2 nm, aproximadamente 3 nm, aproximadamente 4 nm, aproximadamente 5 nm, aproximadamente 6 nm, aproximadamente 7 nm, aproximadamente 8 nm, aproximadamente 9 nm, aproximadamente 10 nm, aproximadamente 11 nm o aproximadamente 12 nm.
[0048] La nanopartícula puede comprender un núcleo rodeado por una cubierta (es decir, una nanopartícula de núcleocubierta). De manera alternativa, la nanopartícula puede tener sólo un núcleo y ninguna cubierta. La nanopartícula también puede comprender un material (por ejemplo, en su superficie) que sea reactivo con un resto de silano, por ejemplo, una superficie de sílice. La cubierta del nanomaterial puede ser un material que sea reactivo con un resto de silano, por ejemplo, una cubierta de sílice. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para modificar una nanopartícula de sílice que comprende un núcleo a base de sílice y una cubierta a base de sílice que rodea al menos una parte del núcleo (una nanopartícula de sílice núcleo-cubierta). La nanopartícula puede ser una nanopartícula no mesoporosa (por ejemplo, una nanopartícula de núcleo-envoltura no mesoporosa), tal como una nanopartícula de sílice no mesoporosa (por ejemplo, una nanopartícula de sílice de núcleo-cubierta no mesoporosa).
[0049] La nanopartícula puede comprender un recubrimiento de polímero orgánico en su superficie. Un polímero orgánico que puede unirse a la nanopartícula incluye, pero sin limitarse a los mismos, polietilenglicol (PEG), polilactato, ácidos polilácticos, azúcares, lípidos, ácido poliglutámico (PGA), ácido poliglicólico, poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), acetato de polivinilo (PVA) y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la nanopartícula puede tener una capa de moléculas de polietilenglicol (PEG) unidas a la superficie. Ciertos recubrimientos de polímeros orgánicos pueden proporcionar una nanopartícula con propiedades ventajosas, tales como propiedades adecuadas para un sistema biológico. Por ejemplo, después de la administración de una nanopartícula que comprende un recubrimiento de PEG a un animal (por ejemplo, un ser humano), los grupos PEG pueden evitar la adsorción de proteínas séricas a la nanopartícula y pueden facilitar la excreción urinaria eficaz, y pueden disminuir la agregación de la nanopartícula (véase, por ejemplo, Burns et al. “Fluroescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine”, Nano Letters (2009) 9(1): 442-448).
[0050] La cubierta de la nanopartícula puede tener una variedad de capas. Por ejemplo, la cubierta puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 capas, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 capas, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 capas, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 capas. Por ejemplo, la cubierta puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 capas. El grosor de la cubierta puede variar desde aproximadamente 0,5 nm hasta aproximadamente 90 nm, por ejemplo, desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 40 nm, desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 20 nm, desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 10 nm, o desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 5 nm. Por ejemplo, el grosor de la cubierta puede ser de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 2 nm. La cubierta de la nanopartícula puede cubrir sólo una parte de la nanopartícula o la partícula completa. Por ejemplo, la cubierta puede cubrir de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 100 por cien, de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 80 por ciento, de aproximadamente el 20 a aproximadamente el 60 por ciento, o de aproximadamente el 30 a aproximadamente el 50 por ciento de la nanopartícula. La cubierta de la nanopartícula puede comprender sílice y/o puede ser el producto de reacción de un compuesto formador de sílice, tal como un ortosilicato de tetraalquilo, por ejemplo ortosilicato de tetraetilo (TEOS). La nanopartícula (por ejemplo, el núcleo y/o la cubierta de la nanopartícula) puede ser sustancialmente no porosa, mesoporosa, semiporosa o porosa. La nanopartícula puede comprender una superficie sin poros y una superficie con poros. La superficie con poros puede denominarse superficie interior. La nanopartícula también puede tener una superficie sin poros (o superficie no porosa). La superficie sin poros puede denominarse en el presente documento superficie exterior de nanopartículas. La superficie con poros (por ejemplo, al menos una parte de la superficie con poros) y/o la superficie sin poros (por ejemplo, al menos una parte de la superficie sin poros) de la nanopartícula pueden funcionalizarse. Tal como se indicó anteriormente, la nanopartícula y/o la cubierta de nanopartícula pueden ser no mesoporosas.
[0051] La nanopartícula puede contener un colorante, tal como un compuesto fluorescente. El colorante puede estar contenido dentro del núcleo de la nanopartícula. Por ejemplo, la nanopartícula puede contener un colorante encapsulado de manera covalente en la nanopartícula. El colorante en una nanopartícula de sílice puede ser el producto de reacción de un colorante reactivo (por ejemplo, un compuesto fluorescente) y un compuesto organosilano correactivo. Una nanopartícula de sílice puede contener el producto de reacción de un compuesto colorante reactivo y un compuesto organosilano correactivo, y sílice.
[0052] Las nanopartículas pueden incorporar cualquier compuesto fluorescente conocido, tal como un compuesto orgánico fluorescente, colorantes, pigmentos o combinaciones de los mismos. Estos compuestos fluorescentes se pueden incorporar a la matriz de sílice del núcleo de una nanopartícula de sílice. Se conoce una amplia variedad de colorantes/fluoróforos fluorescentes químicamente reactivos adecuados; véase, por ejemplo, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6a ed., RP Haugland, ed. (1996). El compuesto fluorescente puede estar encapsulado de manera covalente dentro del núcleo de la nanopartícula.
[0053] El compuesto fluorescente puede ser, pero sin limitarse a estos, un colorante fluorescente del infrarrojo cercano (NIRF) que se coloca dentro del núcleo de la nanopartícula, que puede proporcionar mayor brillo y rendimiento cuántico fluorescente en relación con el colorante fluorescente libre. Es bien sabido que las sondas emisoras de infrarrojo cercano presentan una atenuación tisular y una autofluorescencia disminuidas (Burns et al. supra). Los compuestos fluorescentes que se pueden usar (por ejemplo, encapsulados por un NDC) en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a los mismos, Cy5, Cy5.5 (también conocido como Cy5++), Cy2, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), ficoeritrina, Cy7, fluoresceína (<f>A<m>), Cy3, Cy3.5 (también conocido como Cy3++), Texas Red (cloruro de ácido sulforodamina 101), LIGHTCYCLER®-Red 640, LIGHTCYCLER®-Red 705, tetrametilrodamina (TMR), rodamina, derivado de rodamina (ROX), hexaclorofluoresceína (HEX), rodamina 6G (R6G), el derivado de rodamina JA133, colorantes fluorescentes Alexa (tal como ALEXA FLUOR ® 488, ALEXA FLUOR ® 546 , ALEXA FLUOR ® 633, ALEXA FLUOR ® 555 y ALEXA FLUOR® 647), 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), yoduro de propidio, aminometilcumarina (AMCA), Spectrum Green, Spectrum Orange, Spectrum Aqua, LISSAMINE™y complejos de metales de transición fluorescentes, tales como el europio. Los compuestos fluorescentes que se pueden usar también incluyen proteínas fluorescentes, tales como GFP (proteína fluorescente verde), GFP mejorada (EGFP), proteína fluorescente azul y derivados (BFP, EBFP, EBFP2, azurita, mKalamal), proteína fluorescente cian y derivados (CFP , ECFP, Cerulean, CyPet) y proteína fluorescente amarilla y derivados (YFP, Citrine, Venus, YPet) (documentos WO 2008/142571, WO 2009/056282, WO 1999/22026). En aspectos preferidos, el compuesto fluorescente es Cy5.
[0054] La nanopartícula se puede sintetizar mediante las etapas de: (1) conjugar de manera covalente un compuesto fluorescente, tal como un colorante fluorescente reactivo (por ejemplo, Cy5), con un resto reactivo que incluye, pero sin limitación a los mismos, maleimida, yodoacetamida, tiosulfato, amina, éster de N-hidroxisuccimida, éster de 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo (STP), éster de sulfosuccinimidilo, ésteres de sulfodiclorofenol, cloruro de sulfonilo, hidroxilo, isotiocianato, carboxilo, a un compuesto de organosilano coreactivo, para formar un precursor de sílice fluorescente, y hacer reaccionar el precursor de sílice fluorescente para formar un núcleo fluorescente; o (2) hacer reaccionar el precursor de sílice fluorescente con un compuesto formador de sílice, tal como tetraalcoxisilano, para formar un núcleo fluorescente y hacer reaccionar el núcleo resultante con un compuesto formador de sílice, tal como un tetraalcoxisilano, para formar una cubierta de sílice sobre el núcleo, para proporcionar la nanopartícula fluorescente.
[0055] Las nanopartículas fluorescentes a base de sílice son conocidas en la técnica y se describen en las patentes de Estados Unidos Nos. 8,298,677; 9,625,456; 10,548,997; 9,999,694; 10,039,847; y 10,548,998.
[0056] Las nanopartículas funcionalizadas mediante procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender una nanopartícula que comprende un núcleo a base de sílice y una cubierta de sílice que rodea al menos una parte del núcleo, y polietilenglicol (PEG) unido de manera covalente a la superficie de la nanopartícula. Las nanopartículas pueden tener un compuesto fluorescente encapsulado de manera covalente dentro del núcleo de la nanopartícula. Por ejemplo, las nanopartículas de sílice PEGiladas ultrapequeñas, denominadas C'Dots, se pueden funcionalizar utilizando los procedimientos descritos en el presente documento. Los C'dots se pueden preparar, tal como se han descrito anteriormente (ver, por ejemplo, Ma, K. et al. Chemistry of Materials (2015) 27(11):4119-4133). Las nanopartículas para usar en un procedimiento descrito en el presente documento también se pueden preparar, tal como se describe en Ma, K. et al. Chem. Mater. (2013), 25:677-691; Ma, K. et al. Chem. Mater. (2016) 28:1537-1545; Ma, K. et al. Chem. Mater. (2017) 29:6840-6855; WO 2016/179260; y WO 2018/213851. Cada C'Dot comprende una partícula de sílice PEGilada (de aproximadamente 6 nm de diámetro) en la que se encapsulan de manera covalente colorantes Cy5 fluorescentes del infrarrojo cercano.
Procedimientos de funcionalización de nanopartículas
[0057] Usando los procedimientos descritos en el presente documento, se puede modificar una nanopartícula para incorporar uno o más grupos funcionales en la superficie de la nanopartícula, que se puede modificar aún más (por ejemplo, conjugando el grupo funcional con una molécula). Por ejemplo, un material en la superficie de la nanopartícula que es reactivo con un silano (por ejemplo, un grupo silanol) se puede hacer reaccionar con un precursor bifuncional descrito en el presente documento, tal como un precursor bifuncional que comprende un grupo silano y otro grupo funcional, para unir el otro grupo funcional a la superficie de la nanopartícula. El material reactivo con el grupo silano puede estar debajo de un recubrimiento de capa de polímero orgánico de la nanopartícula (por ejemplo, debajo de una capa de PEG), y el precursor bifuncional puede insertarse en el espacio intersticial de las moléculas de polímero orgánico, y reaccionar con el material en la superficie de la nanopartícula.
[0058] Usando los procedimientos descritos en este documento, una nanopartícula se puede funcionalizar con uno o más restos de alquino, que se pueden conjugar adicionalmente con un compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino (por ejemplo, azida, dieno, nitrona u óxido de nitrilo). Por tanto, los procedimientos descritos en el presente documento pueden permitir la funcionalización de una nanopartícula para un uso particular, por ejemplo, para su uso en una terapia dirigida contra el cáncer. Por ejemplo, el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino también puede comprender un resto que puede dirigirse (por ejemplo, tiene afinidad por) una diana biológica particular (por ejemplo, una célula cancerosa, por ejemplo, un receptor expresado por una célula cancerosa). Por ejemplo, la molécula puede ser un ligando dirigido, tal como un compuesto que se une a un determinado receptor, por ejemplo, un compuesto que se une a un receptor de folato, tal como ácido fólico o un derivado del mismo. Por tanto, el procedimiento descrito en el presente documento se puede utilizar para funcionalizar nanopartículas que sean adecuadas para reconocer células cancerosas. El compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino puede ser un compuesto citotóxico y puede incluir un enlazador escindible, de modo que el compuesto citotóxico pueda liberarse en un sistema biológico (por ejemplo, dentro de una célula cancerosa) tras la escisión del enlazador. La carga útil puede ser un fármaco citotóxico, tal como un fármaco quimioterapéutico de molécula pequeña, por ejemplo, exatecán o un derivado del mismo, y el enlazador puede ser un enlazador escindible por proteasa. Por ejemplo, en la figura 1 se representa un conjugado de nanopartícula y fármaco (NDC) de ejemplo que comprende una carga útil de exatecán y un ligando dirigido de ácido fólico, fabricado utilizando un procedimiento descrito en el presente documento.
[0059] Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para funcionalizar una nanopartícula que está recubierta con un polímero orgánico. Por ejemplo, el procedimiento descrito en el presente documento se puede llevar a cabo después de que la nanopartícula se haya recubierto con polietilenglicol (post-PEGilación). Esto reduce la necesidad de optimización de la reacción y minimiza las alteraciones necesarias tanto en el protocolo sintético como en la propia nanopartícula (por ejemplo, no se necesitan alteraciones para optimizar la química de la superficie de la nanopartícula antes de llevar a cabo un procedimiento divulgado en el presente documento), que es más eficiente que los procedimientos convencionales para la funcionalización de nanopartículas. Utilizando enfoques convencionales de funcionalización de nanopartículas, normalmente no es posible o es muy ineficiente introducir un grupo funcional en una nanopartícula que tiene un recubrimiento de polímero orgánico (por ejemplo, PEG) debido, en parte, al impedimento estérico del polímero orgánico que impide la conjugación de moléculas precursoras con la superficie de la nanopartícula, y estos procedimientos convencionales generalmente proporcionan bajos rendimientos o no logran proporcionar ninguna nanopartícula funcionalizada. La forma típica de evitar estos problemas para funcionalizar nanopartículas es introducir moléculas precursoras (que contienen los grupos funcionales deseados) en la superficie de la nanopartícula de manera simultánea con la adición de una molécula de recubrimiento de polímero orgánico. Sin embargo, este enfoque tiene desventajas importantes, tales como una cinética de reacción impredecible (por ejemplo, debido a la atracción o repulsión entre los grupos funcionales de las moléculas precursoras y la superficie de la nanopartícula), grupos funcionales que quedan "enterrados" en la capa de polímero orgánico de la nanopartícula durante la síntesis, y la agregación de nanopartículas parcialmente recubiertas durante la síntesis, cada una de las cuales da como resultado bajos rendimientos y una funcionalización subóptima de la nanopartícula. Este es un problema particular cuando se utilizan nanopartículas de sílice que poseen una superficie cargada, que puede exacerbar las interacciones intermoleculares no deseadas y afectar a la cinética de la reacción de manera impredecible. Los procedimientos descritos en el presente documento pueden superar estos problemas.
[0060] Además, los procedimientos descritos en el presente documento proporcionan una solución al problema de cómo unir moléculas voluminosas, tales como DBCO, a la superficie de una nanopartícula que está estéricamente impedida por un recubrimiento de polímero orgánico (por ejemplo, capa de PEG). Ciertas moléculas, particularmente aquellas que tienen mayor tamaño e impedimento estérico, tienen un acceso limitado a la superficie de la nanopartícula, lo que da lugar a una menor reactividad y dificulta la unión de las moléculas a la superficie de la nanopartícula. Por ejemplo, sólo se pueden unir dos grupos DBCO a una nanopartícula cuando se usa DBCO-PEG-silano como precursor bifuncional, incluso cuando el precursor DBCO-PEG-silano está en una proporción relativamente alta en la mezcla de reacción (ver, por ejemplo, Ejemplo 1 y Figura 2).
[0061] Los procedimientos divulgados pueden implicar una secuencia de reacción de dos etapas, en la que un primer precursor bifuncional pequeño (por ejemplo, un precursor que comprende un grupo silano) que tiene un coeficiente de difusión relativamente alto se une en primer lugar a la superficie de la nanopartícula, y a continuación se modifica posteriormente mediante otro compuesto, por ejemplo, uno o más precursores bifuncionales adicionales. Por ejemplo, se puede añadir un precursor bifuncional pequeño que comprende un resto silano y otro grupo reactivo (por ejemplo, un dieno, una amina, un tiol, un hidroxilo, una azida, un alqueno, una nitrona, un óxido de nitrilo o un alquino) a una solución de una nanopartícula que comprende una superficie que es reactiva con el grupo silano, en condiciones adecuadas para la reacción entre la superficie de la nanopartícula y el grupo silano, proporcionando así una nanopartícula que está funcionalizada con el otro grupo reactivo.
[0062] Las condiciones adecuadas para la reacción entre el resto de silano y la superficie de la nanopartícula pueden comprender combinar la nanopartícula y el primer precursor bifuncional en un medio de reacción acuoso (por ejemplo, un medio de reacción que es sustancialmente agua). El medio de reacción también puede comprender un disolvente orgánico aprótico, tal como dimetilsulfóxido (DMSO) o acetonitrilo). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender no más del 20 % v/v del disolvente aprótico, por ejemplo, menos del 18 % v/v, menos del 16 % v/v, menos del 14%v/v, menos del 12%v/v, menos del 10%v/v, menos del 8%v/v, menos del 6%v/v, menos del 4%v/v, menos del 2 % v/v o menos de 1 % v/v del disolvente aprótico. El medio de reacción también puede comprender un disolvente orgánico prótico, tal como un alcohol (por ejemplo, terc-butanol). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender no más del 20 % v/v del disolvente prótico, por ejemplo, menos del 18 % v/v, menos del 16 % v/v, menos del 14 % v/v, menos del 12 % v/v, menos del 10 % v/v, menos del 8 % v/v, menos del 6 % v/v, menos del 4 % v/v, menos del 2 % v/v o menos de 1 % v/v del disolvente prótico. El medio de reacción puede comprender un tampón (por ejemplo, un tampón acuoso), tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender un tampón (por ejemplo, un tampón acuoso, tal como PBS) en una concentración final entre aproximadamente 1x y aproximadamente 5x, por ejemplo, aproximadamente 1x, aproximadamente 2x, aproximadamente 3x, aproximadamente 4x o aproximadamente 5x. El medio de reacción puede estar sustancialmente libre de un disolvente orgánico (por ejemplo, sustancialmente libre de disolvente prótico orgánico, sustancialmente libre de disolvente aprótico o sustancialmente libre de cualquier disolvente orgánico). El medio de reacción puede estar sustancialmente libre de tampón. El medio de reacción puede ser sustancialmente agua.
[0063] Las condiciones adecuadas para la reacción entre el resto silano y la superficie de la nanopartícula pueden comprender combinar la nanopartícula y el primer precursor bifuncional en un medio de reacción durante un cierto período de tiempo, por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 60 minutos, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 24 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 6 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 2 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 1 hora, o entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 48 horas. Por ejemplo, las condiciones pueden comprender mantener el medio de reacción durante la noche.
[0064] Las condiciones adecuadas para la reacción entre el resto silano y la superficie de la nanopartícula pueden comprender combinar la nanopartícula y el primer precursor bifuncional en un medio de reacción, y calentar el medio de reacción, por ejemplo, hasta una temperatura de aproximadamente 20 °C o superior, por ejemplo, aproximadamente 35 °C o superior, aproximadamente 40 °C o superior, aproximadamente 45 °C o superior, aproximadamente 50 °C o superior, aproximadamente 60 °C o superior, aproximadamente 70 °C o superior, aproximadamente 80 °C o superior, aproximadamente 90 °C o superior, aproximadamente 100 °C o superior, aproximadamente 110 °C o superior, o aproximadamente 120 °C o superior, por ejemplo, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 60 °C, entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 80 °C, entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 100 °C, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C, entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 50 °C, entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C, entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 70 °C, entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 80 °C, entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 100 °C, o entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110 °C. Las condiciones pueden comprender mantener la nanopartícula y el primer precursor bifuncional a temperatura ambiente. Las condiciones adecuadas para una reacción entre el resto silano y la superficie de la nanopartícula pueden comprender agitar, remover o aplicar otros procedimientos de mezcla al medio de reacción.
[0065] El primer precursor bifuncional puede ser cualquier compuesto que contenga silano adecuado que sea reactivo con la superficie de la nanopartícula, y puede comprender un grupo funcional que estará disponible para modificación adicional, por ejemplo, después de la unión del primer precursor bifuncional a la nanopartícula. El grupo funcional puede ser un grupo que no sea reactivo con la nanopartícula y/o no sea reactivo con un silano. El primer precursor bifuncional puede comprender un grupo alquileno (por ejemplo, un grupo alquileno C1-C6), con un grupo silano en un extremo y otro grupo funcional en el otro extremo (por ejemplo, un dieno, una amina, un tiol, un hidroxilo, una azida, un alqueno, una nitrona, un óxido de nitrilo o un alquino). El primer precursor bifuncional puede comprender un grupo heteroalquileno (por ejemplo, un grupo heteroalquileno C1-C6), con un grupo silano en un extremo, y otro grupo funcional en el otro extremo (por ejemplo, un dieno, una amina, un tiol, un hidroxilo, una azida, un alqueno, una nitrona, un óxido de nitrilo o un alquino). El primer precursor bifuncional puede comprender un grupo alquileno (por ejemplo, un grupo alquileno C1-C6), con un grupo silano en un extremo y un grupo dieno en el otro extremo, tal como un grupo dienilo cíclico (por ejemplo, un grupo ciclopentadienilo). Puede usarse cualquier grupo dieno adecuado. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier dieno adecuado para realizar una cicloadición Diels-Alder (o Hetero-Diels Alder). Entre los ejemplos de dienos que pueden estar presentes en el primer precursor bifuncional se incluyen, pero sin limitación a los mismos, ciclopentadieno, ciclohexadieno, furano, butadieno y derivados de los mismos. Además, pueden estar presentes en el primer precursor bifuncional otros restos capaces de modificación, por ejemplo, mediante una reacción con otra entidad, y el procedimiento no se limita a usar cicloadiciones de Diels-Alder (por ejemplo, se pueden utilizar otras cicloadiciones u otras reacciones de formación de enlaces), tal como otra reacción de formación de enlaces descrita en el presente documento).
[0066] El primer precursor bifuncional puede comprender una estructura de Fórmula (A):
en la que R1 es alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, halo, -ORA, -NRBRC, -NO2 o -CN, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo puede estar sustituido o no sustituido ; cada R2 es de manera independiente hidrógeno, alquilo, halo o -ORA; RA, RBy RC son cada uno de manera independiente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; n es un número entero de 0 a 12; y m es un número entero de 0 a 5. Por ejemplo, R1 puede ser alquilo, alquenilo C3, alquinilo C3, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, halo, -ORA, en el que cada alquilo, alquenilo C3 , alquinilo C3, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo, pueden estar sustituidos o no sustituidos; cada R2 es de manera independiente hidrógeno, alquilo, halo o -ORA; RA es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; n es un número entero de 0 a 12; y m es un número entero de 0 a 5. Por ejemplo, R2 puede ser -ORA, en el que RA es alquilo (por ejemplo, metilo o etilo); n puede ser un número entero de 1 a 5 (por ejemplo, 3); y m puede ser 0. En algunos aspectos, R2 es -OEt; n es 3; y m es 0. Por ejemplo, el primer precursor bifuncional puede comprender la estructura de Fórmula (A-1):
[0067] El primer precursor bifuncional puede ser (3-ciclopentadienilpropil)trietoxisilano (por ejemplo, tal como se demuestra en el Ejemplo 3), en el que el procedimiento proporciona una nanopartícula funcionalizada con uno o más grupos ciclopentadienilo. De manera alternativa, el primer precursor bifuncional puede ser (3-aminopropil)trietoxisilano (por ejemplo, tal como se demuestra en el Ejemplo 2), en el que el procedimiento proporciona una nanopartícula funcionalizada con uno o más grupos amina.
[0068] La etapa de hacer reaccionar la nanopartícula con el primer precursor bifuncional puede proporcionar una nanopartícula funcionalizada con un primer grupo reactivo, que puede modificarse adicionalmente. Por ejemplo, la nanopartícula funcionalizada con un primer grupo reactivo puede ponerse en contacto con un segundo precursor bifuncional que comprende un resto reactivo con el primer grupo reactivo.
[0069] El contacto de la nanopartícula funcionalizada con un primer grupo reactivo con el segundo precursor bifuncional puede realizarse bajo cualquier condición adecuada para una reacción entre el primer grupo reactivo y el resto reactivo con el primer grupo reactivo. Por ejemplo, las condiciones adecuadas para una reacción entre el primer grupo reactivo y el resto reactivo con el primer grupo reactivo pueden comprender un medio de reacción acuoso (por ejemplo, un medio de reacción que es sustancialmente agua). El medio de reacción puede comprender un tampón (por ejemplo, un tampón acuoso), tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender un tampón (por ejemplo, un tampón acuoso, tal como PBS) en una concentración final entre aproximadamente 1x y aproximadamente 5x, por ejemplo, aproximadamente 1x, aproximadamente 2x, aproximadamente 3x, aproximadamente 4x o aproximadamente 5x. El medio de reacción también puede comprender un disolvente orgánico aprótico, tal como dimetilsulfóxido (DMSO) o acetonitrilo. Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender no más del 20 % v/v del disolvente aprótico, por ejemplo, menos del 18 % v/v, menos del 16 % v/v, menos del 14 % v/v, menos del 12 % v/v, menos del 10 % v/v, menos del 8 % v/v, menos del 6 % v/v, menos del 4 % v/v, menos del 2 % v/v o menos de 1 % v/v del disolvente aprótico. El medio de reacción también puede comprender un disolvente orgánico prótico, tal como un alcohol (por ejemplo, terc-butanol). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender no más del 20 % v/v del disolvente prótico, por ejemplo, menos del 18 % v/v, menos del 16 % v/v, menos del 14 % v/v, menos del 12 % v/v, menos del 10 % v/v, menos del 8 % v/v, menos del 6 % v/v, menos del 4 % v/v, menos del 2 % v/v o menos de 1 % v/v del disolvente prótico. El medio de reacción puede estar sustancialmente libre de un disolvente orgánico (por ejemplo, sustancialmente libre de disolvente prótico orgánico, sustancialmente libre de disolvente aprótico o sustancialmente libre de cualquier disolvente orgánico). El medio de reacción puede estar sustancialmente libre de agua.
[0070] Las condiciones adecuadas para una reacción entre el primer grupo reactivo y el resto reactivo con el primer grupo reactivo pueden comprender mantener la mezcla de reacción durante un cierto período de tiempo, por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 60 minutos, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 24 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 6 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 2 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 1 hora, o entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 48 horas. Por ejemplo, el medio de reacción puede mantenerse durante la noche.
[0071] Las condiciones adecuadas para una reacción entre el primer grupo reactivo y el resto reactivo con el primer grupo reactivo pueden comprender calentar el medio de reacción, por ejemplo, hasta una temperatura de aproximadamente 20 °C o superior, por ejemplo, aproximadamente 35 °C o superior, aproximadamente 40 °C o superior, aproximadamente 45 °C o superior, aproximadamente 50 °C o superior, aproximadamente 60 °C o superior, aproximadamente 70 °C o superior, aproximadamente 80 °C o superior, aproximadamente 90 °C o superior, aproximadamente 100 °C o superior, aproximadamente 110 °C o superior, o aproximadamente 120 °C o superior, por ejemplo, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 60 °C, entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 80 °C, entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 100 °C, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C, entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 50 °C, entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C, entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 70 °C, entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 80 °C, entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 100 °C, o entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110 °C. Las condiciones también pueden comprender mantener la mezcla de reacción a temperatura ambiente. Las condiciones adecuadas para una reacción entre el primer grupo reactivo y el resto reactivo con el primer grupo reactivo también pueden comprender agitar, remover o aplicar otros procedimientos de mezcla al medio de reacción.
[0072] El primer grupo reactivo puede ser un dieno (por ejemplo, ciclopentadieno), y el segundo precursor bifuncional puede comprender un dienófilo (por ejemplo, un dienófilo descrito en el presente documento, por ejemplo, maleimida) que es reactivo con el primer grupo reactivo, en el que el contacto puede estar en condiciones suficientes para promover una cicloadición de Diels-Alder entre un dieno y un dienófilo.
[0073] El dienófilo puede ser cualquier dienófilo adecuado, tal como un resto que comprende un alqueno deficiente en electrones. El dienófilo puede comprender un dienófilo cíclico, por ejemplo, una maleimida, una quinona, un anhídrido maleico, ácido dialquilacetilenodicarboxílico o cualquier derivado de los mismos.
[0074] Se entenderá que la posición del dieno y del dienófilo puede estar en el primer precursor bifuncional o en el segundo precursor bifuncional, respectivamente. En otras palabras, si bien ciertos procedimientos ejemplificados en el presente documento presentan un primer precursor bifuncional que comprende un dieno y un segundo precursor bifuncional que comprende un dienófilo, estos procedimientos o precursores pueden modificarse fácilmente de modo que el primer precursor bifuncional comprenda el dienófilo y el segundo precursor bifuncional comprenda el dieno. Además, si bien la reacción entre dienos y dienófilos se ha ejemplificado en esta divulgación, la conjugación entre el primer grupo reactivo y el segundo precursor bifuncional puede implicar cualquier otra reacción de formación de enlace covalente adecuada, que puede determinarse mediante selección de grupos en el primer precursor bifuncional y el segundo precursor bifuncional. Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento para funcionalizar una nanopartícula (por ejemplo, en cualquier etapa del proceso) pueden implicar eterificación, formación de enlace amida, química Click, cicloadición de Diels-Alder, cicloadición de hetero-Diels-Alder, adición 1,2, tal como una adición de Michael, cicloadición de Huisgen, cicloadición de nitrona-olefina, cicloadición 3+2, cicloadición 4+2, metátesis de olefinas o cualquier reacción descrita en Kolb et al. Angew. Chem. Int. Ed. (2001) 40: 2004-2021. Por ejemplo, en lugar de utilizar una reacción de Diels-Alder para conjugar el segundo precursor bifuncional con la nanopartícula a través del primer grupo reactivo, el procedimiento se puede modificar de manera que el primer grupo reactivo (introducido por el primer precursor bifuncional) pueda ser una amina, y el segundo precursor bifuncional pueda comprender un grupo éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), y el segundo precursor bifuncional y la nanopartícula funcionalizada que comprende un grupo amina puede ponerse en contacto en condiciones suficientes para promover una reacción de amina-éster y formar un enlace entre el primer grupo reactivo y el segundo precursor bifuncional. De manera alternativa, en lugar de usar una reacción de Diels-Alder para conjugar el segundo precursor bifuncional con la nanopartícula a través del primer grupo reactivo, se podría usar una reacción química de clic, por ejemplo, donde el primer grupo reactivo (introducido por el primer precursor bifuncional) es una azida o un alquino, y el segundo precursor bifuncional es un alquino o una azida, y el segundo precursor bifuncional y la nanopartícula funcionalizada se pueden poner en contacto en condiciones suficientes para promocionar una reacción de química click ente el primer grupo reactivo y el segundo precursor bifuncional.
[0075] En aspectos particulares, el primer precursor bifuncional comprende un dieno (por ejemplo, ciclopentadieno), y el segundo precursor bifuncional comprende un dienófilo (por ejemplo, maleimida) que puede hacerse reaccionar con el dieno en una reacción de Diels-Alder, para unir el segundo precursor bifuncional de la nanopartícula (a través del primer precursor bifuncional), tal como se demuestra en el Ejemplo 3, y también tal como se representa en el Esquema 1.
[0076] El segundo precursor bifuncional puede comprender aún otro grupo reactivo, por ejemplo, en el extremo del segundo precursor bifuncional opuesto al resto que es reactivo con el primer grupo reactivo. Por ejemplo, el segundo precursor bifuncional puede comprender un grupo en un extremo que es reactivo con un resto dieno (por ejemplo, un dienófilo, por ejemplo, maleimida), y comprender otro grupo en el otro extremo adecuado para modificación adicional. El otro grupo reactivo (a veces denominado grupo funcional) en el segundo precursor bifuncional puede ser un resto que reacciona con un alquino, azida, dieno, nitrona u óxido de nitrilo. El grupo reactivo puede ser un resto que sea adecuado para experimentar una reacción química de clic. Por ejemplo, el grupo reactivo puede comprender un alquino, una azida, un dieno, una nitrona o un óxido de nitrilo. El alquino puede ser un alquino tensionado. Por ejemplo, el grupo reactivo puede comprender un grupo dibenzoazaciclooctino (DBCO) o un derivado del mismo (a veces denominado DIBAC). El alquino puede comprender un grupo dibenzociclooctino (DIBO) o un derivado del mismo. El alquino también puede ser un alquino terminal. De manera alternativa, el grupo reactivo en el segundo precursor bifuncional puede ser cualquier otro grupo adecuado para la conjugación, por ejemplo, un dieno, una amina, un tiol, un hidroxilo, una azida, una nitrona, un óxido de nitrilo, un alqueno o un alqueno.
[0077] El segundo precursor bifuncional también puede comprender un enlazador divalente, por ejemplo, un grupo alquileno o heteroalquileno, en el que el grupo alquileno o heteroalquileno está sin sustituir o sustituido (por ejemplo, alquileno o heteroalquileno sustituido con uno o más grupos oxo). El enlazador divalente puede comprender un grupo PEG, por ejemplo, PEG4. El enlazador divalente puede comprender un enlace amida, por ejemplo, uno, dos, tres o más enlaces amida. Cada enlace amida puede estar en cualquier orientación. Por ejemplo, un enlace amida puede estar situado en el enlazador divalente entre un grupo PEG y un grupo alquileno, en el que el átomo de carbono del grupo carbonilo de la amida está unido de manera covalente a un átomo del grupo PEG y el átomo de nitrógeno de la amida está unido de manera covalente a un átomo del grupo alquileno; o el átomo de carbono del grupo carbonilo de la amida puede estar unido a un átomo del grupo alquileno, y el átomo de nitrógeno del grupo amida puede estar unido a un átomo del grupo PEG. El enlazador divalente (por ejemplo, un grupo heteroalquileno) puede comprender un resto dienófilo en un extremo y un alquino en el otro extremo, tal como un grupo DBCO. De manera alternativa, el segundo precursor bifuncional puede comprender un enlazador divalente (por ejemplo, un grupo heteroalquileno) con un éster de NHS en un extremo y un alquino en el otro extremo, tal como un grupo DBCO. El enlazador divalente puede comprender un grupo PEG (por ejemplo, un resto PEG4), un grupo amida o una combinación de los mismos.
[0078] El segundo precursor bifuncional puede comprender una estructura de Fórmula (B)
en la que: X es un grupo reactivo, tal como un dienófilo (por ejemplo, un resto que comprende un grupo alqueno deficiente en electrones; o un dienófilo cíclico, por ejemplo, una maleimida , una quinona o un anhídrido maleico); Y es un enlazador divalente (por ejemplo, un grupo alquileno o heteroalquileno sustituido o no sustituido); R3 y R4 son cada uno de manera independiente alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, halo, -ORA, -NRBRC, -NO2 o -C<n>, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo pueden estar sustituidos o no sustituidos; RA, RB y RC son cada uno de manera independiente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; q y p son cada uno de manera independiente un número entero de 0 a 4; y v es un número entero de 0 a 2. Por ejemplo, X puede ser maleimida; q y p pueden ser cada uno de manera independiente un número entero de 0; y v puede ser un número entero de 1.
[0079] El enlazador divalente puede comprender una estructura de Fórmula (G):
en la que A1, A2 y A3 se seleccionan cada uno de manera independiente del grupo que consiste en alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, arileno, heteroarileno, -C(O)-, -C(O)N(RB)-, -N(RB)C(O)-, -N(RB)-, -OC(O)- y -C(O)O-; RB es de manera independiente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; k, v, w y x son cada uno de manera independiente un
número entero de 0 a 10; y cada uno de "^ ind ica de manera independiente un punto de unión a otra parte del segundo precursor bifuncional. Por ejemplo, A1 y A2 puede ser cada uno de manera independiente -C(O)N(RB)-; A3 puede ser -C(O)O-; cada caso de RB puede ser de manera independiente hidrógeno; k, v y w pueden ser cada uno de manera independiente números enteros de 2; y x puede ser un número entero de 4.
[0080] El enlazador divalente puede comprender una estructura de Fórmula (C):
en la que cada RB es de manera independiente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; x es un número entero de 0 a 10; y cada uno de ^ indica de manera independiente un punto de unión a otra parte del segundo precursor bifuncional (por ejemplo, una unión al dienófilo o al átomo de nitrógeno del anillo heterocíclico de DBCO).
en la que cada RB es de manera independiente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; x es un número entero de 0 a 10; y cada uno de ^ indica de manera independiente un punto de unión a otra parte del segundo precursor bifuncional (por ejemplo, una unión al dienófilo o al átomo de nitrógeno del anillo heterocíclico de DBCO).
en la que cada RB es de manera independiente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; x es un número entero de 0 a 10 y cada uno de indica de manera independiente un punto de unión a otra parte del segundo precursor bifuncional (por ejemplo, una unión al átomo de nitrógeno de un resto NHS, o al átomo de nitrógeno del anillo heterocíclico de DBCO).
[0083] El segundo precursor bifuncional puede comprender una estructura de Fórmula (B-1)
en la que x es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, 4). Por ejemplo, x puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En realizaciones preferidas, x es 4.
[0084] La reacción de un resto dieno (por ejemplo, un resto dieno unido de manera covalente a una superficie de nanopartícula) con el segundo precursor bifuncional puede proporcionar un compuesto de Fórmula (NP-1)
en la que x es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, 4), y en la que el átomo de silicio es una parte de una nanopartícula. Por ejemplo, x puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En realizaciones preferidas, x es 4.
[0085] La eficiencia de la reacción entre el segundo precursor bifuncional (por ejemplo, un precursor que contiene DBCO, por ejemplo, DBCO-maleimida) y la nanopartícula funcionalizada (por ejemplo, nanopartícula que comprende un resto dieno) puede ser independiente del coeficiente de difusión del segundo precursor bifuncional. Por ejemplo, los segundos precursores bifuncionales descritos en el presente documento que comprenden un grupo PEG de longitud variable pueden tener reactividades similares con una nanopartícula funcionalizada, de manera independiente de la longitud del PEG (véanse, por ejemplo, el Ejemplo 4 y la Figura 2, donde el empleo de precursores de DBCO-PEG-maleimida con diferentes longitudes de PEG no afectaron significativamente a la reactividad). Esto supone una desviación de los procedimientos típicos que implican otros precursores (por ejemplo, los precursores mostrados en el Esquema 3 o 4), donde la eficacia de la reacción puede verse muy influenciada por el tamaño o la masa molecular del precursor. Los precursores bifuncionales descritos en el presente documento (por ejemplo, segundos precursores bifuncionales) también pueden tener una solubilidad o polaridad particular que puede evitar interacciones electrostáticas no deseadas (por ejemplo, repulsión) con grupos silanol, por ejemplo, grupos silanol en otro precursor o en una nanopartícula. Además, los precursores bifuncionales (por ejemplo, el segundo precursor bifuncional) descritos en el presente documento pueden tener una longitud particular (por ejemplo, debido a un espaciador de PEG) para dotar a la nanopartícula funcionalizada resultante (después de la conjugación con el segundo precursor bifuncional) con una propiedad deseada, tal como accesibilidad mejorada para modificaciones posteriores mediante otro precursor, por ejemplo, usando reacciones químicas de clic.
[0086] El procedimiento descrito en el presente documento puede usarse para proporcionar nanopartículas adecuadas para una aplicación particular, tal como una aplicación terapéutica. Por ejemplo, el procedimiento se puede usar para proporcionar nanopartículas adecuadas para dirigirse a una diana biológica, por ejemplo, para uso en terapia (por ejemplo, terapia contra el cáncer), navegación quirúrgica, formación de imágenes, diagnóstico o una combinación de los mismos. Las nanopartículas pueden ser adecuadas para su uso in vivo o pueden usarse ex vivo, por ejemplo, para aplicaciones analíticas o de diagnóstico. El procedimiento descrito en el presente documento se puede utilizar para fabricar una nanopartícula adecuada para dirigirse a un receptor particular (o grupo de receptores) en un sistema biológico. El procedimiento también se puede usar para preparar una nanopartícula funcionalizada (por ejemplo, NDC) adecuada para suministrar una carga útil a una diana (o dianas) biológicas. Por ejemplo, usando un procedimiento divulgado en el presente documento, una nanopartícula se puede conjugar con un ligando dirigido y con un resto de carga útil. Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para preparar un NDC dirigido a un receptor de folato, por ejemplo, para una terapia dirigida contra el cáncer, tal como el NDC de ejemplo representado en la figura 1.
[0087] La reacción de una nanopartícula con el segundo precursor bifuncional puede proporcionar una nanopartícula que comprende uno o más grupos adecuados para la conjugación con una molécula (por ejemplo, un ligando dirigido y/o carga útil). Por ejemplo, la reacción de la nanopartícula con un segundo precursor bifuncional que comprende un grupo alquino puede proporcionar una nanopartícula funcionalizada con uno o más grupos alquino, en donde los grupos alquino pueden conjugarse adicionalmente con un compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino.
[0088] Cualquier compuesto deseado que comprenda un grupo reactivo puede unirse a una nanopartícula descrita en el presente documento que esté funcionalizada con el grupo reactivo homólogo apropiado. Por ejemplo, cualquier compuesto deseado que comprenda un grupo reactivo con alquino puede unirse a la nanopartícula funcionalizada con un alquino. Por ejemplo, se puede conjugar a la nanopartícula un resto de carga útil (por ejemplo, que comprende un fármaco citotóxico, por ejemplo, exatecán) o un conjugado de enlazador-carga útil que comprende un grupo reactivo con alquino. De manera alternativa, se puede conjugar a la nanopartícula un ligando dirigido (por ejemplo, un ligando dirigido al receptor de folato (FR), por ejemplo, ácido fólico) que comprende un grupo reactivo con alquino. Se puede conjugar cualquier combinación de compuestos con la nanopartícula utilizando este procedimiento. Por ejemplo, a la nanopartícula se pueden conjugar tanto un ligando dirigido como un resto de carga útil. Otras moléculas, tales como marcadores (por ejemplo, radiomarcadores o colorantes), polímeros y/o macromoléculas también se pueden conjugar con una nanopartícula utilizando este procedimiento.
[0089] Por ejemplo, una nanopartícula que comprende un resto de alquino (por ejemplo, preparada usando un procedimiento descrito en el presente documento) se puede poner en contacto con un compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino (por ejemplo, una azida, un dieno, una nitrona o un óxido de nitrilo) en condiciones adecuadas para una reacción entre el resto de alquino y el grupo reactivo con alquino, formando así una nanopartícula funcionalizada con el compuesto (por ejemplo, un compuesto que comprende una carga útil o un ligando dirigido).
[0090] Las condiciones adecuadas para una reacción entre el resto de alquino y el grupo reactivo con alquino pueden comprender cualquier condición química de clic adecuada (véase, por ejemplo, Kolb et al. Angew. Chem. Int. Ed. (2001) 40: 2004-2021). Por ejemplo, facilitar una reacción entre el resto de alquino y el grupo reactivo con alquino puede comprender combinar la nanopartícula que comprende un resto de alquino y el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino con un catalizador, tal como un catalizador de cobre (por ejemplo, CuSO4, CuI, CuCl, Cu(OAc)2, CuSO2, CuBr). También se pueden usar otros catalizadores metálicos que se sabe que llevan a cabo reacciones químicas de clic, tales como un catalizador de rutenio. De manera alternativa, la reacción se puede llevar a cabo sin un catalizador (es decir, condiciones sin catalizador, por ejemplo, condiciones sin cobre). Por ejemplo, el alquino de la nanopartícula funcionalizada puede ser adecuado para reacciones químicas de clic sin catalizador (por ejemplo, cicloadición promovida por deformación). Por ejemplo, DBCO se puede utilizar en una reacción química de clic sin un catalizador.
[0091] Las condiciones adecuadas para una reacción entre el resto de alquino y el grupo reactivo con alquino pueden comprender combinar la nanopartícula que comprende un resto de alquino y el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino en un medio de reacción acuoso (por ejemplo, un medio de reacción que es sustancialmente agua). El medio de reacción puede comprender un tampón (por ejemplo, un tampón acuoso), tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender un tampón (por ejemplo, un tampón acuoso, tal como PBS) a una concentración final entre aproximadamente 1x y aproximadamente 5x, por ejemplo, aproximadamente 1x, aproximadamente 2x, aproximadamente 3x, aproximadamente 4x o aproximadamente 5x. El medio de reacción también puede comprender un disolvente orgánico aprótico, tal como DMSO o acetonitrilo). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender no más del 20 % v/v del disolvente aprótico, por ejemplo, menos del 18 % v/v, menos del 16 % v/v, menos del 14 % v/v, menos del 12 % v/v, menos del 10 % v/v, menos del 8 % v/v, menos del 6 % v/v, menos del 4 % v/v, menos de 2 % v/v, o menos de 1 % v/v del disolvente aprótico. El medio de reacción también puede comprender un disolvente orgánico prótico, tal como un alcohol, por ejemplo, terc-butanol). Por ejemplo, el medio de reacción puede comprender no más del 20 % v/v del disolvente prótico, por ejemplo, menos del 18 % v/v, menos del 16 % v/v, menos del 14 % v/v, menos del 12 % v/v, menos del 10 % v/v, menos del 8 % v/v, menos del 6 % v/v, menos del 4 % v/v, menos del 2 % v/v o menos del 1 % v/v del disolvente prótico. El medio de reacción puede estar sustancialmente libre de un disolvente orgánico (por ejemplo, sustancialmente libre de disolvente prótico orgánico, sustancialmente libre de disolvente aprótico o sustancialmente libre de cualquier disolvente orgánico). El medio de reacción puede ser sustancialmente agua.
[0092] Las condiciones adecuadas para una reacción entre el resto de alquino y el grupo reactivo con alquino pueden comprender combinar la nanopartícula que comprende un resto de alquino y el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino en un medio de reacción durante un cierto período de tiempo, por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 60 minutos, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 24 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 6 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 2 horas, entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 1 hora, o entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 48 horas. Por ejemplo, el medio de reacción puede mantenerse durante la noche.
[0093] Las condiciones adecuadas para una reacción entre el resto de alquino y el grupo reactivo con alquino pueden comprender combinar la nanopartícula que comprende un resto de alquino y el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino en un medio de reacción, y calentar el medio de reacción, por ejemplo, hasta una temperatura de aproximadamente 20 °C o superior, por ejemplo, aproximadamente 35 °C o superior, aproximadamente 40 °C o superior, aproximadamente 45 °C o superior, aproximadamente 50 °C o superior, aproximadamente 60 °C o superior, aproximadamente 70 °C o superior, aproximadamente 80 °C o superior, aproximadamente 90 °C o superior, aproximadamente 100 °C o superior, aproximadamente 110 °C o superior, o aproximadamente 120 °C o superior, por ejemplo, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 60 °C, entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 80 °C, entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 100 °C, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C, entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 50 °C, entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C, entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 70 °C, entre aproximadamente 60 °C y aproximadamente 80 °C, entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 100 °C, o entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 110 °C. De manera alternativa, las condiciones de reacción pueden comprender mantener la mezcla de reacción a temperatura ambiente. Las condiciones adecuadas para una reacción entre el primer grupo reactivo y el resto reactivo con el primer grupo reactivo también pueden comprender agitar, remover o aplicar otros procedimientos de mezcla al medio de reacción.
[0094] El compuesto que comprende un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino) puede comprender un ligando dirigido y puede comprender además un enlazador (por ejemplo, un enlazador no escindible). El ligando dirigido puede ser un ligando dirigido a un receptor de folato. Por ejemplo, el ligando dirigido puede ser una molécula que puede unirse a un receptor de folato, por ejemplo, un receptor de folato expresado en una célula cancerosa o tumor. El ligando dirigido al receptor de folato (FR) puede ser ácido fólico, ácido dihidrofólico, ácido tetrahidrofólico o un derivado de unión al receptor de folato de los mismos. El ligando dirigido al receptor de folato puede ser una macromolécula, tal como una proteína, un péptido, un aptámero, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que puede reconocer un receptor de folato. Por ejemplo, el ligando dirigido al receptor de folato puede incluir una parte de un anticuerpo intacto, tal como, por ejemplo, la región variable o de unión al antígeno de un anticuerpo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo dirigidos al receptor de folato se incluyen, pero sin limitación a los mismos, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento scFv, un fragmento Fv, un diacuerpo dsFv, un fragmento dAb, un fragmento Fd', un fragmento Fd o una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede producirse mediante cualquier medio. Por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede producirse enzimática o químicamente mediante fragmentación de un anticuerpo intacto y/o puede producirse de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia parcial del anticuerpo. De manera alternativa o adicionalmente, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede producirse total o parcialmente de forma sintética. El enlazador puede ser cualquier enlazador divalente adecuado, tal como un grupo alquileno o heteroalquileno. El enlazador divalente puede ser un grupo PEG (por ejemplo, un grupo PEG1, PEG2, PEG3 o PEG4).
[0095] El compuesto que comprende un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino) puede comprender una estructura de Fórmula (D'):
en la que J es un grupo reactivo, por ejemplo, un grupo reactivo con alquino; por ejemplo, una azida, un dieno, una nitrona o un óxido de nitrilo); T es un ligando de reconocimiento (por ejemplo, un ligando de reconocimiento de un receptor de folato, por ejemplo, ácido fólico o un derivado del mismo); e y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 3). Por ejemplo, y puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, por ejemplo, 2, 3 o 4.
[0096] El compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino puede comprender una estructura de Fórmula (D):
en la que T es un ligando de reconocimiento (por ejemplo, un ligando de reconocimiento de un receptor de folato, por ejemplo, ácido fólico o un derivado del mismo); e y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 3). Por ejemplo, y puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, por ejemplo, 2, 3 o 4.
[0097] El compuesto que comprende un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino) puede comprender
en la que J es un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino; por ejemplo, una azida, un dieno, una nitrona o un óxido de nitrilo); y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 3). Por ejemplo, y puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, por ejemplo, 2, 3 o 4.
[0098] El compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino puede comprender una estructura de Fórmula (D-1):
en la que y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 3). Por ejemplo, y puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, por ejemplo, 2, 3 o 4.
[0099] El compuesto que comprende un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino) puede comprender un resto de carga útil y puede comprender además un enlazador (por ejemplo, un enlazador escindible). El resto de carga útil puede ser una molécula con uso terapéutico, tal como para uso en terapia contra el cáncer. Por ejemplo, el resto de carga útil puede ser un compuesto citotóxico, por ejemplo, una molécula pequeña con propiedades citotóxicas.
[0100] Entre las cargas útiles de ejemplo se incluyen inhibidores de enzimas (véase, por ejemplo, “A review of Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery”, Robert A. Copeland, John Wiley and Sons, Hoboken, New Jersey), tales como inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, exatecán, SN-38, topotecán, irinotecán, camptotecina, belotecán, indenoisoquinolina, fenantridinas, indolocarbazoles y análogos de los mismos), inhibidores de dihidrofolato reductasa, inhibidores de timidilato sintasa, intercaladores de ADN, enlazadores de surcos menores de ADN, disruptores de tubulina, cortadores (“cleavers”) de ADN, antraciclinas, fármacos de tipo vinca, mitomicinas (por ejemplo, mitomicina C, mitomicina A), bleomicinas, nucleósidos citotóxicos, pteridinas, diinenos, enediinos, podofilotoxinas, dolastatinas, auristatinas (por ejemplo, monometil auristatina E (MmAE), monometil auristatina F (MMAF)), maitansinoides, inductores de la diferenciación, duocarmicina y taxanos (por ejemplo, taxol). Por ejemplo, la carga útil puede ser exatecán, SN-38, topotecán, irinotecán, belotecán, 9-amino camptotecina, etopósido, camptotecina, taxol, esperamicina, 1,8-dihidroxi-biciclo[7.3.1]trideca-4-9-dieno-2,6-diino-13-ona, podofilotoxina, anguidina, vincristina, vinblastina, duocarmicina, una pirrolobenzodiazepina, morfolinodoxorrubicina, N-(5,5-diacetoxipentil)doxorrubicina, un compuesto descrito en la patente de Estados Unidos No. 5,198,560, daunorrubicina, doxorrubicina, aminopterina, actinomicina, bleomicina, N8-acetil espermidina, una pirrolobenzodiazepina, 1-(2 cloroetil)-1,2-dimetanosulfonil hidrazida, talisomicina, citarabina, una dolastatina, una auristatina, una hidrazida de caliqueamicina, esperamicina y 6-mercaptopurina, metotrexato, ácido butírico, ácido retinoico o un derivado de los mismos.
[0101] Se entenderá que se pueden realizar modificaciones químicas en la carga útil deseada a efectos de hacer que las reacciones de la carga útil con el enlazador sean más convenientes para los fines de preparar los conjugados de la presente divulgación. Por ejemplo, se puede añadir un grupo funcional, por ejemplo, amina, hidroxilo o sulfhidrilo, al fármaco en una posición que tenga un efecto mínimo o aceptable sobre la actividad u otras propiedades del fármaco.
[0102] El enlazador puede ser cualquier enlazador divalente adecuado y puede comprender una parte que se puede escindir en determinadas condiciones. Por ejemplo, el enlazador puede ser un enlazador autoinmolable capaz de liberar la carga útil in vitro o in vivo bajo ciertas condiciones. El enlazador puede ser un enlazador escindible por proteasa (por ejemplo, escindible por una proteasa, tal como catepsina o tripsina), un enlazador sensible al pH o un enlazador sensible a redox. El enlazador escindible por proteasa puede ser un enlazador escindible por catepsina B (Cat-B). El enlazador puede comprender un resto peptídico (por ejemplo, un dipéptido), un espaciador de PEG y/o un resto autoinmolable (por ejemplo, p-aminobenciloxicarbonilo (PABC)), por ejemplo, para una escisión eficaz en una célula, tal como una célula cancerosa. El enlazador escindible puede escindirse de manera selectiva en una ubicación deseada o después de un tiempo seleccionado (por ejemplo, al entrar en una célula cancerosa diana).
[0103] El compuesto que comprende un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino) puede comprender una estructura de Fórmula (E'):
en la que J es un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino; por ejemplo, una azida, un dieno, una nitrona o un óxido de nitrilo); L es un resto enlazador escindible (por ejemplo, un resto enlazador escindible por proteasa); P es un resto de carga útil (por ejemplo, un fármaco citotóxico, por ejemplo, exatecán); e y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 9). Por ejemplo, L puede ser un resto enlazador escindible por proteasa, P puede ser exatecán e y puede ser un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 7, 8, 9, 10 u 11).
[0104] El compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino puede comprender una estructura de Fórmula (E):
N3^ o f L" P
y (E),
en la que L es un resto enlazador escindible (por ejemplo, un resto enlazador escindible por proteasa); P es un resto de carga útil (por ejemplo, un fármaco citotóxico, por ejemplo, exatecán); e y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 9). Por ejemplo, L puede ser un resto enlazador escindible por proteasa, P puede ser exatecán e y puede ser un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 7, 8, 9, 10 u 11).
[0105] El resto enlazador escindible puede comprender una estructura de Fórmula (F):
en la que cada caso de [AA] es un residuo de aminoácido natural o no natural; z es un número entero de 1 a 5; w esun número entero de 1 a 4 (por ejemplo, 2 o 3); y cada uno de s indica un punto de unión a otra parte del compuestoque comprende un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo rea Vctivo con alquino; por ejemplo, una unión a un grupo PEG, una unión a un grupo reactivo con alquino o una unión a un resto de carga útil). Por ejemplo, -[AA]W- puede comprender Val-Lys, Val-Cit, Phe-Lys, Trp-Lys, Asp-Lys, Val-Arg o Val-Ala, y z puede ser 2, donde un indica un punto de unión al átomo de oxígeno de un grupo PEG, y el otro\indica un punto de unión al átomo de nitrógeno deexatecán.
indica un punto de unión a otra parte del compuesto que comprende un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino; por ejemplo, una unión a un grupo PEG, una unión a un grupo con reactivo alquino o una unión a un resto de carga útil). Por ejemplo, un’***'
puede indicar una unión al átomo de oxígeno de un grupo PEG y el otro
puede indicar una unión al átomo de nitrógeno de exatecán.
[0107] El compuesto que comprende un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino) puede comprender una estructura de Fórmula (E-1'):
en la que J es un grupo reactivo (por ejemplo, un grupo reactivo con alquino; por ejemplo, una azida, un dieno, una nitrona o un óxido de nitrilo); e y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 9).
[0108] El compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino puede comprender una estructura de Fórmula (E-1):
en la que y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 9).
[0109] La reacción de un resto de alquino (por ejemplo, un alquino unido de manera covalente a una nanopartícula) con un compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino (por ejemplo, un compuesto de Fórmula D, por
en la que x es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, por ejemplo, 4), e y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, por ejemplo, 3) , y el átomo de silicio es una parte de la nanopartícula (por ejemplo, unida a la cubierta de sílice de una nanopartícula de sílice núcleo-cubierta).
[0110] La reacción de un resto de alquino (por ejemplo, un resto de alquino unido de manera covalente a una nanopartícula) con un compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino (por ejemplo, un compuesto de
en la que x es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 4), e y es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, por ejemplo, 9), y el átomo de silicio es una parte de la nanopartícula (por ejemplo, unida a la cubierta de sílice de una nanopartícula de sílice núcleo-cubierta).
[0111] En el Esquema 2 se representa un NDC de ejemplo que comprende una carga útil (exatecán) unida a través de un enlazador escindible por proteasa, y el mecanismo de escisión del enlazador y liberación de la carga útil.
Esquema2. NDC de ejemplo producido mediante un procedimiento descrito en el presente documento y su escisión por catepsina B (Cat-B)
[0112] Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para obtener un conjugado de nanoparticula y fármaco con un número deseado de ligandos dirigidos o restos de carga útil. Por ejemplo, un NDC producido usando un procedimiento descrito en el presente documento puede tener una proporción promedio de nanopartícula con respecto a carga útil (por ejemplo, exatecán o una sal o análogo del mismo) de aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1: 5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1: 30, 1:32, 1:34, 1:36, 1:38, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, o 1:80. Por ejemplo, el número promedio de moléculas de exatecán en cada nanopartícula puede estar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 25, o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 30, por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23 , aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29 o aproximadamente 30 moléculas de exatecán por nanopartícula. Un NDC producido usando un procedimiento descrito en el presente documento puede tener una proporción promedio de nanopartícula con respecto a ligando dirigido (por ejemplo, ácido fólico) de aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1. :7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 , 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29 o 1:30. Por ejemplo, la proporción promedio de nanopartículas con respecto a ligando dirigido puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, por ejemplo, el número promedio de moléculas de ácido fólico en cada nanopartícula puede estar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20, por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14 o aproximadamente 15 moléculas de ácido fólico por nanopartícula.
[0113] Se entenderá que si bien los procedimientos ejemplificados en el presente documento presentan la funcionalización de una nanopartícula con un alquino y la conjugación de un compuesto que comprende un resto reactivo con alquino con la nanopartícula, estas funcionalidades pueden revertirse. Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden modificar para funcionalizar la nanopartícula con un resto reactivo con alquino (por ejemplo, una azida, un dieno, una nitrona o un óxido de nitrilo) y conjugar además la nanopartícula funcionalizada con un compuesto que comprende un alquino. Por ejemplo, la nanopartícula puede funcionalizarse con un primer precursor bifuncional, seguido de conjugación con un segundo precursor bifuncional que comprende un grupo reactivo con alquino, proporcionando así una nanopartícula funcionalizada con un grupo reactivo con alquino (por ejemplo, azida, un dieno, una nitrona, o un óxido de nitrilo). Entonces, los compuestos (por ejemplo, los ligandos dirigidos o cargas útiles) que comprenden un alquino se pueden hacer reaccionar con la nanopartícula para conjugar los compuestos a la nanopartícula.
[0114] Los procedimientos descritos en este documento pueden superar las deficiencias de otros procedimientos para funcionalizar nanopartículas. Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento pueden abordar la estabilidad limitada de los conjugados de nanopartículas elaborados mediante otros procedimientos. En particular, los procedimientos descritos en el presente documento presentan precursores bifuncionales relativamente estables, que no promueven la hidrólisis de enlaces en los restos enlazadores, lo que puede tener lugar cuando se usan precursores bifuncionales que comprenden grupos altamente reactivos (por ejemplo, ciertos grupos amina). Además, los procedimientos descritos en el presente documento emplean precursores bifuncionales que no se autocondensan sustancialmente durante la reacción, lo que puede tener lugar cuando se usan otros precursores bifuncionales (por ejemplo, precursores bifuncionales que contienen amina) debido a, por ejemplo, atracción electrostática u otras interacciones intermoleculares o intramoleculares no deseadas. Superar estos problemas puede aumentar considerablemente el rendimiento y evitar procesos de purificación difíciles o imposibles que de otro modo serían necesarios, lo cual es particularmente relevante para producir NDC destinados a uso clínico. Por tanto, los procedimientos descritos en este documento son particularmente útiles para producir NDC destinados a uso clínico, debido a su facilidad y fiabilidad en la producción de nanopartículas funcionalizadas de alta pureza.
[0115] Las nanopartículas funcionalizadas producidas usando procedimientos descritos en el presente documento pueden mostrar una morfología uniforme y una distribución de tamaño estrecha, por ejemplo, medida por microscopía electrónica de transmisión (TEM,transmisión electrón microscopy).Las nanopartículas pueden caracterizarse mediante TEM o espectroscopía UV, por ejemplo, para identificar picos de absorción característicos de un colorante o ligando en o sobre la nanopartícula. La pureza de las nanopartículas se puede evaluar mediante cromatografía, por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) y cromatografía de exclusión por tamaño. Los procedimientos descritos en este documento también son capaces de proporcionar características de nanopartículas altamente consistentes en varias escalas de reacción y de lote a lote.
EJEMPLOS
[0116] Para que la divulgación y la invención descritas en el presente documento puedan entenderse de manera más completa, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se ofrecen para ilustrar los procedimientos y las nanopartículas funcionalizadas proporcionadas en este documento y no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes de su alcance.
[0117] Los compuestos proporcionados en el presente documento se pueden preparar a partir de materiales de partida fácilmente disponibles usando modificaciones a los protocolos de síntesis específicos establecidos a continuación que serían bien conocidos por los expertos en la técnica. Se entenderá que cuando se proporcionan condiciones de proceso típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos, disolventes, presiones, etc.), también se pueden usar otras condiciones de proceso, a menos que se indique lo contrario. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos o disolventes particulares utilizados, pero los expertos en la técnica pueden determinar dichas condiciones mediante procedimientos de optimización de rutina.
[0118] Además, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica, pueden ser necesarios grupos protectores convencionales para evitar que ciertos grupos funcionales experimenten reacciones no deseadas. La elección de un grupo protector adecuado para un grupo funcional particular, así como las condiciones adecuadas para la protección y desprotección, son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se describen numerosos grupos protectores y su introducción y eliminación en Greene et al. Protecting Groups in Organic Synthesis, segunda edición, Wiley, Nueva York, 1991, y las referencias citadas en dicho documento.
Materiales y procedimientos
[0119] Todos los materiales se utilizaron tal como se recibieron. Todas las reacciones no acuosas se realizaron en material de vidrio secado a la llama bajo una presión positiva de argón. Los disolventes anhidros se adquirieron de proveedores comerciales (RANKEM). La cromatografía ultrarrápida se realizó en gel de sílice de malla 230-400 con los sistemas de disolventes indicados. Los espectros de resonancia magnética nuclear de protones se registraron en un espectrómetro Bruker a 400 MHz utilizando cloroformo deuterado o DMSO como disolvente. Las posiciones de los picos se indican en partes por millón de campo bajo a partir del tetrametilsilano como patrón interno. Los valores deJse expresan en hercios. Los análisis de masas se realizaron en un espectrómetro (Agilent/Shimadzu) utilizando la técnica de electropulverización (ES). Los análisis de HPLC se realizaron en un detector PDA-UV (Agilent/Waters) equipado con un Gemini C-18 (1000 x 4,6 milímetros; 5u) y se determinó que todos los compuestos probados tenían >95 % de pureza usando este procedimiento. Los compuestos preparados según los procedimientos descritos en el presente documento se pueden aislar mediante procedimientos de HPLC preparativa. La cianina5 maleimida se adquirió de Lumiprobe. Los conjugados DBCO-PEG4-maleimida, folato-PEG-azida y exatecán-enlazador se obtuvieron a partir de la síntesis del cliente por parte de WuXi AppTec, Tianjin, China. Los precursores de (3-mercaptopropil)trimetoxisilano, 2-[metoxi(polietilenoxi)6-9propil]trimetoxisilano y (3-ciclopentadienilpropil)trietoxisilano se adquirieron de Gelest. Se adquirió PBS 10x de Thermo Fisher Scientific. La catepsina B humana se adquirió de Millipore Sigma. El suero humano y de ratón se adquirió en BIOIVT (Nueva York). Todos los demás productos químicos se adquirieron de Millipore Sigma. Cy5-C'Dot se preparó siguiendo el protocolo descrito en Ma, K. et al. Química de Materiales (2015) 27(11):4119-4133.
[0120] La caracterización y purificación por cromatografía de permeación en gel (GPC) se realizó según los procedimientos descritos en Chen, F. et al. Chemistry of Materials (2017) 29(20):8766-8779. La caracterización por microscopía electrónica de transmisión (TEM) se realizó utilizando un TEM Titan Cubed Themis 300 y las imágenes de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF) para demostrar la distribución de nanopartículas. El análisis de muestras por espectroscopía UV visible se realizó utilizando un espectrofotómetro Cary 5000 UV-Vis-NIR. Las mediciones de espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) se realizaron utilizando una configuración FCS casera, tal como se describe en Ma, K. et al. Chemistry of Materials (2016) 28(5): 1537-1545. Se utilizó un láser de estado sólido de 633 nm para excitar el colorante Cy5 encapsulado en el núcleo de sílice de C'Dots. Se utilizó RP-HPLC acoplado a un detector de matriz de fotodiodos (PDA,photodiode array)para evaluar la pureza de los conjugados de nanopartículas (incluido FA-CDC), utilizando una columna Waters Xbridge Peptide BEH C18 disponible comercialmente (50 x 4,6 mm). La fase móvil para la separación es una elución en gradiente que comienza en una composición del 85 % A (0,1 % en volumen de ácido trifluoroacético en agua desionizada)/15 % B (acetonitrilo) y la composición se cambia linealmente a 5 % A/95 % B durante el transcurso de 15 minutos. RP-HPLC separa moléculas con diferentes polaridades y es adecuado como procedimiento analítico para FA-CDC debido a su tamaño de partícula ultrapequeño inferior a 10 nm. Usando RP-HPLC, las nanopartículas se separan bien de otros restos químicos, tales como ligandos que están asociados de manera no covalente con las nanopartículas y componentes degradados o liberados a la fuerza. Se identifican diferentes restos químicos según el tiempo de elución y los espectros UV/visible únicos recopilados mediante el detector PDA. El contenido de impurezas en una muestra se puede cuantificar utilizando curvas de calibración desarrolladas con materiales estándar de referencia para impurezas clave. La caracterización por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC,size exclusión chromatography)se realizó utilizando una columna Tosoh Bioscience PWXL 4000 de 7,8 mm x 300 mm acoplada a un detector PDA, con una fase móvil compuesta de 80 % de cloruro de sodio al 0,9 % en peso en agua desionizada y 20 % acetonitrilo. La separación se produce en el transcurso de 30 minutos en el modo isocráctico y el caudal típico para la separación es de 0,6 ml/min.
Ejemplo 1. Síntesis de una nanopartícula funcionalizada de ejemplo usando DBCO-PEG-silano (ejemplo de referencia).
[0122] Se diluyó Cy5-C'Dot con agua desionizada hasta una concentración deseada, normalmente entre 15 y 30 pM, en un matraz de fondo redondo con una barra agitadora. Se disolvió DBCO-PEGn-silano (n = 4 o 12) en DMSO y se añadió a la reacción con agitación, para lograr la relación molar deseada de partícula con respecto a DBCO. Después de reaccionar a temperatura ambiente durante la noche, la solución de reacción se concentró y se purificó usando cromatografía de permeación en gel (GPC). El número de grupos DBCO unidos a las nanopartículas se proporciona en la figura 2.
Ejemplo 2. Síntesis de una nanopartícula funcionalizada de ejemplo utilizando un precursor a base de amina (ejemplo de referencia).
[0123] Los grupos silanol en la superficie de la nanopartícula bajo el recubrimiento de polímero orgánico (por ejemplo, capa de PEG) no son fácilmente accesibles para moléculas voluminosas, tales como DBCO-PEG-silano. El resultado es que cuando se usa DBCO-PEG-silano como precursor bifuncional (por ejemplo, como en el Ejemplo 1), sólo se pueden unir uno o dos grupos DBCO a cada nanopartícula (por ejemplo, C'Dot), incluso a una relación de reacción alta de DBCO-PEG-silano con respecto a nanopartícula (véase la figura 2). Por lo tanto, se diseñó una reacción alternativa de dos etapas, empleando moléculas de silano relativamente pequeñas con un alto coeficiente de difusión, tal como se muestra en el Esquema 4.
Esquema 4.Procedimiento de dos etapas de ejemplo de funcionalización de una nanopartícula con DBCO utilizando un precursor bifuncional amina-silano
[0124] Cy5-C'Dot se diluyó con agua desionizada hasta una concentración deseada, típicamente entre 15 y 30 j M, en un matraz de fondo redondo con una barra agitadora. Se añadió (3-aminopropil)trietoxisilano (APTMS) a la solución de C'Dot con agitación, para lograr la relación molar deseada de partículas con respecto a APTMS. Después de la reacción durante la noche, se añadió DBCO-PEG4-éster de NHS en DMSO para alcanzar la relación molar deseada de partículas con respecto a DBCO y para conjugar adicionalmente con los grupos amina en C'Dots mediante una reacción amina-éster. La reacción se dejó a temperatura ambiente durante la noche y, a continuación, se concentró y se purificó usando GPC. Después de la purificación por GPC, las partículas purificadas en solución salina al 0,9 % se calentaron hasta 80 °C en un baño de agua durante la noche. Después del tratamiento térmico, la solución se concentró y se purificó nuevamente usando GPC para obtener DBCO-C'Dots a base de amina. En comparación con la reacción de una sola etapa, la reacción en dos etapas utiliza la difusión rápida de moléculas de silano pequeñas para aumentar su reactividad a los grupos de silanol bajo la capa de PEG, permitiendo que más de 20 grupos DBCO se unan fácilmente sobre cada C'Dot (véase la figura 2).
[0125] Sin embargo, los DBCO-C'Dots a base de amina producidos utilizando este enfoque mostraron una estabilidad limitada. Por ejemplo, una cantidad considerable de DBCO se desprendió de C'Dots después de la incubación en PBS a 37 °C durante la noche (ver FIG. 3A), lo que puede deberse a la hidrólisis de los enlaces amida entre los grupos DBCO y C'Dot, acelerada por grupos de amina primaria residuales en la superficie de C'Dot. Además, las moléculas de amina-silano pueden autocondensarse durante la reacción debido a la atracción electrostática entre su parte de amina cargada positivamente y su parte de silanol cargada negativamente. Los agregados de amina-silano son difíciles de eliminar de la solución de C'Dot mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (ver Figura 3C) y pueden provocar efectos posteriores no deseados. Por ejemplo, si se administra, estos agregados pueden conducir a retención en el riñón debido a la carga positiva de amina.
Ejemplo 3. Cribado de la síntesis química de conjugación
[0126] Para superar las deficiencias del uso de precursores de amina-silano descritos en el Ejemplo 2, se seleccionó una biblioteca de química de conjugación, que se resume en la Tabla 1.
Tabla 1.Cribado de la uímica de la conu ación.
Ejemplo 4. Síntesis de un DBCO-C'Dot a base de dieno
[0127] El uso de una reacción de Diels-Alder se identificó en el Ejemplo 3 como un reemplazo adecuado para la reacción de amina-éster. Por ejemplo, la amina-silano usada en el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 se puede reemplazar por (3-ciclopentadienilpropil)trietoxisilano ("dieno-silano") para funcionalizar primero los C'Dots con grupos ciclopentadieno, y se el DBCO-PEG-éster de NHS usado en el procedimiento del Ejemplo 2 se puede reemplazar por una DBCO-PEG-maleimida. Este procedimiento se representa en el Esquema 5, donde se puede usar una reacción de Diels-Alder entre los grupos maleimida en la DBCO-PEG-maleimida y los grupos dieno en C'Dots para unir el DBCO (a través de un enlazador) a la nanopartícula.
Esquema 5.Un procedimiento de dos etapas de ejemplo de funcionalización de una nanopartícula con DBCO utilizando un precursor bifuncional de dieno-silano
[0128] Cy5-C'Dot se diluyó con agua desionizada hasta una concentración deseada, típicamente entre 15 y 30 pM, en un matraz de fondo redondo con una barra agitadora. En primer lugar, se diluyó (3-ciclopentadienilpropil)trietoxisilano (ciclopentadieno) 100x en DMSO y a continuación se añadió a la reacción con agitación, para alcanzar la relación molar deseada de partícula con respecto a ciclopentadieno. Después de la reacción durante la noche, se añadió 10x PBS a la reacción para lograr una concentración final de 1x PBS. A continuación, se disolvió un precursor de DBCO-maleimida (DBCO-mal, DBCO-PEG4-mal, DBCO-PEG12-mal o DBCO-sulfo-mal) en DMSO y se añadió a la reacción para alcanzar la relación molar deseada de partícula con respecto a DBCO. Después de mezclar durante aproximadamente 30 min a 1 hora, la mezcla de reacción se calentó hasta 80 °C mientras se agitaba durante la noche. A continuación, la solución de reacción se concentró y purificó utilizando cromatografía de permeación en gel (GPC) para obtener DBCO-C'Dot a base de dieno.
[0129] Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que la carga neutra de los grupos ciclopentadieno evita la hidrólisis de los enlaces amida en el enlace, que puede ser acelerada por la amina primaria en C'Dots cuando se usa una amina-silano como precursor. Por lo tanto, los C'Dots producidos usando este procedimiento son altamente estables (ver Figura 3B). Además, el uso de grupos ciclopentadieno disminuye en gran medida la autocondensación del silano durante la reacción (ver Figura 3D) y mejora la estabilidad, la homogeneidad del tamaño, el rendimiento de la reacción y la pureza de las nanopartículas funcionalizadas (por ejemplo, DBCO-C'Dots).
[0130] La eficacia de la reacción del precursor que contiene DBCO (por ejemplo, DBCO-maleimida) es independiente de su coeficiente de difusión. Por ejemplo, incluso cuando se emplearon precursores de DBCO-maleimida con diferentes longitudes y pesos moleculares de espaciador de PEG para funcionalizar C'Dots, el número de grupos DBCO unidos a cada uno de los C'Dots resultantes permaneció constante (ver Figura 2). Esto supone una desviación de los procedimientos típicos que implican otros precursores bifuncionales, donde la eficiencia de la reacción puede verse muy influenciada por la masa molar de los silanos. Esto también sugiere que los bajos rendimientos de la reacción de C'Dots con silanos voluminosos se deben principalmente a la autocondensación de los silanos, que compiten con su difusión en el recubrimiento de polímero orgánico de la nanopartícula (por ejemplo, la capa de C'Dot PEG) y con reacciones posteriores. La reacción entre el precursor de DBCO-maleimida y la nanopartícula (por ejemplo, C'Dot) puede ser sensible a la hidrofobicidad y al estado de carga del precursor de DBCO-maleimida utilizado. Por ejemplo, las moléculas relativamente hidrófilas con cargas negativas, por ejemplo. DBCO-sulfomaleimida con un espaciador sulfonado hidrófilo, exhiben una reactividad relativamente mala. Sin querer limitarse a ninguna teoría, esta mala reactividad puede deberse a la mayor solubilidad en agua y a la repulsión electrostática de los grupos silanol cargados negativamente. En base a estos resultados, se usó un espaciador de PEG corto con 4 unidades de etilenglicol en un precursor de DBCO-maleimida para dotar a los grupos DBCO en la superficie de C'Dot de la accesibilidad deseada para modificaciones posteriores, por ejemplo, usando reacciones químicas de clic.
Ejemplo 5. Síntesis de FA-CDC
[0131] Los NDC que comprenden un resto de alquino (por ejemplo, DBCO) producidos mediante los procedimientos descritos en el presente documento se pueden conjugar adicionalmente con un compuesto que comprende un grupo reactivo, por ejemplo, un grupo reactivo con alquino (por ejemplo, una azida). Estos compuestos pueden incluir precursores de conjugados de carga útil-enlazador, por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo sintético 1, y/o precursores de ligando que reconocen folato, por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo sintético 2.
[0132] Por ejemplo, usando química de clic, los DBCO-C'Dots producidos mediante los procedimientos descritos en el presente documento se conjugaron con conjugados de enlazador-ácido fólico funcionalizados con azida (adecuados como ligando de reconocimiento para dirigirse a cánceres que expresan el receptor de folato (FR)), y conjugados de exatecán-enlazador funcionalizados con azida (el exatecán es un fármaco inhibidor de la topoisomerasa I, adecuado para tratar el cáncer). El resto de ácido fólico se unió a través de un enlazador no escindible, mientras que el resto de exatecán se unió a través de un enlazador escindible por catepsina-B (Cat-B) (Cat-B es una enzima presente en los lisosomas celulares y se sobreexpresa en una variedad de tumores malignos). Estos procedimientos se representan
[0133] Se diluyó DBCO-C'Dot con agua desionizada hasta una concentración deseada, habitualmente entre 15 y 30 |jM, en un matraz de fondo redondo con una barra agitadora. Para funcionalizar el DBCO-C'Dot con ligandos de ácido fólico, se disolvió folato-PEG-azida en DMSO y se añadió a la reacción con agitación, para lograr el número deseado de ligandos por partícula. La reacción se dejó a temperatura ambiente durante la noche y la tasa de conversión se comprobó mediante una prueba de pureza por HPLC durante el proceso (normalmente por encima del 95 %). Si la pureza fuera inferior al 95 %, la solución de reacción se concentraría y purificaría usando GPC. El C'Dot funcionalizado con ácido fólico se aisló como intermedio para determinar el número de ligandos de ácido fólico por partícula usando UV-Vis. Para conjugar posteriormente el C'Dot funcionalizado con ácido fólico con exatecán escindible, la concentración de partículas se ajustó según fuera necesario. El conjugado de enlazador-exatecán escindible se disolvió en DMSO y se añadió a la solución de partículas con agitación, para lograr el número deseado de cargas útiles por partícula. La reacción se dejó a temperatura ambiente durante la noche y a continuación la solución de reacción se concentró y se purificó usando GPC para obtener FA-CDC.
[0134] Los NDC dirigidos resultantes exhibieron una morfología uniforme y una distribución de tamaño estrecha bajo microscopía electrónica de transmisión (TEM) con un tamaño de núcleo promedio de 3,9 nm. El diámetro hidrodinámico promedio de los NDC se determinó mediante espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) y fue de 6,4 nm (FIG. 4), lo que coincide con TEM, ya que la diferencia de 2,5 nm se atribuye a la capa de PEG orgánico que no se puede observar en TEM. Los NDC purificados finales tenían una pureza superior al 99,0 % según se caracteriza tanto por cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) como por SEC (FIGS. 6A-6B). Se demostró que estos atributos de calidad de los NDC son muy consistentes de un lote a otro en varias escalas de reacción (Tabla 2).
Tabla 2. Características de las NDC de un lote a otro a escalas de eem lo.
[0135] Los espectros UV-Vis se recogieron en cada etapa cuando los C'Dots se funcionalizaron secuencialmente con ciclopentadieno, DBCO, ácido fólico y exatecán para producir un NDC dirigido. Los picos de absorción característicos se utilizaron para verificar la presencia de cada ligando y para determinar el número de ligandos por partícula (FIG.
5). DBCO-C'Dot exhibe un pico de absorción a 647 nm correspondiente a Cy5 encapsulada de manera covalente, y un pico doblete a 308 nm y 290 nm correspondiente a grupos DBCO. La concentración molar de Cy5 y DBCO se puede determinar aplicando la ley de Beer-Lambert a 647 nm y 308 nm respectivamente utilizando sus coeficientes de extinción. La concentración de partículas se obtuvo dividiendo la concentración molar de Cy5 por el número de colorantes Cy5 por partícula según lo determinado mediante FCS. El número de grupos DBCO por partícula se obtuvo dividiendo la concentración molar de grupos DBCO por concentración de partícula.
[0136] El espectro UV-Vis de C'Dot funcionalizado con ácido fólico antes de unir cargas útiles de exatecán se usó para determinar la concentración de las partículas y la concentración de ligandos dirigidos a FR mediante la aplicación de la Ley de Beer-Lambert a 647 nm (correspondiente a Cy5 encapsulada de manera covalente) y 360 nm (correspondientes a ligandos dirigidos al ácido fólico), respectivamente. El número de ligandos dirigidos a FR por partícula se determinó dividiendo la concentración molar de ligandos dirigidos a FR por la concentración de partículas. Se ha confirmado que el número de ligandos dirigidos a FR permanece sin cambios en el procesamiento posterior para producir FA-CDC.
[0137] De manera similar, el espectro UV-Vis de FA-CDC se puede utilizar para determinar la concentración de partículas de FA-CDC, así como la concentración de exatecán escindible mediante la aplicación de la Ley de Beer-Lambert a 647 nm y 360 nm (correspondientes a ligandos dirigidos a fólico y exatecán) después de restar la absorbancia de los ligandos dirigidos a FR a 360 nm. A continuación, la concentración de exatecán se dividió por la concentración de partículas de FA-CDC para determinar la cantidad de exatecán por partícula.
Ejemplo 6. Estabilidad de los NDC en solución salina, PBS, suero humano y de ratón
[0138] La estabilidad de los NDC producidos en este documento se evaluó después de la incubación en solución salina al 0,9 %, PBS, plasma humano (10 %) y plasma de ratón (10 %) a 37 °C en un baño seco con agitación durante diferentes períodos de tiempo. Antes del análisis, las proteínas plasmáticas de las muestras se extrajeron mediante precipitación, a través de la adición de un volumen equivalente de acetonitrilo frío, seguido de centrifugación a 10.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5425. Después de la centrifugación, el sobrenadante transparente se transfirió del tubo de centrífuga a un vial de HPLC transparente de recuperación total. El sobrenadante libre de cualquier agregación visible se diluyó con un volumen equivalente de agua desionizada para ajustar la matriz de la muestra para que coincidiera con las condiciones iniciales de la separación por HPLC y evitar la pérdida de sensibilidad. A continuación, se cuantifica la pureza y la impureza de cada muestra mediante RP-HPLC, tal como se ha descrito anteriormente. La estabilidad en suero humano y de ratón de los NDC producidos mediante un procedimiento del Ejemplo 2 y el Ejemplo 4 se proporciona en las figuras 8A-8B.
[0139] Se prepararon muestras de conjugado de nanopartículas (por ejemplo, FA-CDC) para la liberación forzada diluyendo en primer lugar una alícuota de la muestra de FA-CDC a una concentración de 2 pM y, a continuación, incubando con catepsina-B humana recombinante activada en un baño seco con agitación a 37 °C . Se preparó catepsina-B humana recombinante de la siguiente manera: se añadieron 4 pl de 0,33 pg/pl de catepsina-B a un tampón de activación que consistía en ditiotreitol y (MES) y se ajustó a pH 5,0. El pH apropiado se confirmó con una tira reactiva de pH después de la preparación. Después de 24 horas de incubación, el exatecán libre liberado a la fuerza se determina mediante el porcentaje del área integrada que está presente en el tiempo de elución del exatecán libre en RP-HPLC. Los resultados de este estudio se proporcionan en la FIG. 7.
[0140] Cuando los NDC dirigidos se incubaron con Cat-B (SI) humana recombinante, más del 95 % de los fármacos de exatecán se liberaron de los NDC en un plazo de 48 horas con una semivida de aproximadamente 3,0 horas desde el ajuste (FIG. 7), lo que demuestra la liberación eficaz de fármacos en entornos oncológicos. Los NDC dirigidas, producidos usando el precursor de dieno-silano (representado en el Esquema 5) también mostraron una alta estabilidad en plasma de ratón y humano y mostraron una mejora significativa de la estabilidad (FIGS. 8A y 8B), en relación con sus homólogos producidos usando un precursor de amina-silano (representado en el Esquema 4). Más del 95 % de los fármacos de exatecán permanecen en los NDC durante hasta 7 días en plasma de ratón y humano, obtenido mediante los espectros UV-Vis de los picos de NDC en cromatogramas de RP-HPLC. Mientras tanto, un ensayo independiente de RP-HPLC que monitorizaba el exatecán libre sugirió que el exatecán liberado estaba por debajo del límite de detección de RP-HPLC, es decir, 0,02 %, y la ausencia de fármaco libre no deseado demuestra aún más su alta estabilidad plasmática. Los NDC dirigidos también mostraron una alta estabilidad de almacenamiento a 4 °C en solución salina al 0,9 %. Su pureza, distribución de tamaño y diámetro hidrodinámico se caracterizaron mediante RP-HPLC, SEC y FCS respectivamente, y permanecieron sin cambios durante 6 meses en condiciones de almacenamiento. Esta alta estabilidad en almacenamiento es otro parámetro clave importante tanto para la traducción clínica como para la fabricación comercial.
Ejemplo sintético 1: Síntesis de precursores del conjugado enlazador-carga útil
[0141] Los precursores del conjugado enlazador-carga útil adecuados para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento se pueden sintetizar de acuerdo con los siguientes protocolos de ejemplo.
Síntesis de (S)-2-am¡no-N-(4-(((terc-but¡ld¡fen¡ls¡l¡l)ox¡)met¡l)fen¡l)-6-((difen¡l(p-tol¡l)met¡l)am¡no)hexanam¡da (161)
[0142]
a)TBDPSCI, ¡midazol , DMF, 0 °C a ta , 16 h; b)(149),HATU, DIPEA, DMF ta 16 h; c) Piperidina al 30%, DMF, ta 3 h
Esquema7: Síntesis del compuesto (161)
[0143]Síntesis de 4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)anilina (159):Se añadió imidazol (5,54 g, 81,22 mmol) a una solución de (4-aminofenil)metanol (75) (5,0 g, 40,61 mmol) en DMF (25 ml) a 0 °C, seguido de tercbutil(cloro)difenMsilano (13,39 g, 48,73 mmol), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Después de completar la reacción del material de partida, la mezcla de reacción se inactivó con agua (20 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se concentró a presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna usando gel de sílice (malla 230-400) eluyendo con EtOAc al 10 % en éter de petróleo para proporcionar 4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)anilina (159; 6,6 g) como una goma. LCMS: m/z 362,31 [(M+H)+]; Rt: 2,58 min; 93,68 % de pureza.
[0144]Síntesis de (S)-(1-((4-(((terc-buWdifenilsiW)oxi)metil)fenil)amino)-6-((difenil(p-toW)metil)amino)-1-oxohexan-2-il)carbamato de (9H fluoren-9-il)metilo(160): Se añadieron diisopropiletilamina (4,18 ml, 24 mmol), HATU (6,08 g, 16 mmol) y 4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)anilina (159) (2,89 g, 8 mmol) a una solución de N2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-N6-(difenil(p-tolil)metil)-L-lisina (149) (5,0 g, 8 mmol) en Dm F (50 ml) a 0 °C y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Después de agotar el material de partida, la mezcla de reacción se inactivó con agua helada. El sólido precipitado se filtró y se secó al vacío para proporcionar (S)-(1-((4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)amino)-6-((difenil(p-tolil)metil)amino)-1-oxohexan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (160; 5,5 g) como un sólido. LCMS: m/z 990,37 [(M+H)+];Rt:2,84 min; 96,79 % de pureza.
[0145]Síntesis de (S)-2-amino-N-(4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)-6-((difenil(ptolil)metil)amino)hexanamida(161): Se añadió piperidina (16,5 ml) a una solución de (S)-(1-((4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)amino)-6-((difenil(p-tolil)metil)amino)-1-oxohexan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (160) (5,5 g, 5,68 mmol) en DMF (38,5 ml) a temperatura ambiente, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Después de agotar el material de partida, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna usando gel de sílice (malla 230-400) eluyendo con EtOAc al 100 % para proporcionar (S)-2-amino-N-(4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)-6-((difenil(ptolil)metil)amino)hexanamida (160; 3,5 g) como una goma. LCm S: m/z 744,24 [(M-H)’];Rt:2,20 min; 90,16% de pureza.
Síntesis de (4-nitrofenil)carbonato de 4-((32S,35S)-1-azido-35-(4-((difenil(p-tolil)metil)amino)butil)-32-isopropil-30,33-d¡oxo-3.6.9.12.15.18.21.24.27-nonaoxa-31,34-d¡azahexatr¡acontan-36-am¡do)benc¡lo (191).
[0146]
[0147]Síntesis de ((S)-1-(((S)-1-((4-(((terc-buWdifenilsiW)oxi)metil)fenil)amino)-6-((difenil(p-tolil)meW)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-Fluoren-9-il)metilo (187):Se añadieron dMsopropiletilamina (1,54 ml, 8,83 mmol), HATU (2,24 g, 5,89 mmol) y (S)-2-amino-N-(4-(((tercbutildifenilsilil)oxi)metil)fenM)-6-((difenil(p-tolM)metil)amino)hexanamida (161) (2,19 g, 2,94 mmol) a una solución de (((N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-L-valina (1 g, 2,94 mmol), en DMF (20 ml) a 0 °C, y La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Después de completarse el material de partida, la mezcla de reacción se inactivó con agua helada. El sólido precipitado se filtró y se secó al vacío para proporcionar ((S)-1-(((S)-1 -((4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)amino)-6-((difenil(ptolil)metil)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (((9H-fluoren-9-il)metilo (187; 2,5 g) como un sólido LCMS: MH+ 1067, tiempo de retención 2,42 min.
[0148]Síntesis de (S)-2-((S)-2-Amino-3-metilbutanamido)-N-(4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)-6-((difenil(ptolil)metil)amino)hexanamida (188):Se añadió una solución al 30 % de piperidina en DMF (4,5 ml) a una solución de ((S)-1-(((S)-1-((4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)amino)-6-((difenil(p-tolil)metil)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (((9H-fluoren-9-il)metilo(187)(1,5 g, 1,40 mmol) en DMF (6 ml) a temperatura ambiente, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Después de completar la reacciónd el material de partida, la mezcla de reacción se concentró en condiciones reducidas y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc al 100 % para proporcionar (S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-(4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)-6-((difenil(ptolil)metil)amino)hexanamida (188; 1,1 g) como un sólido. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da): 8 10,07 (s, 1H), 7,64-7,63 (d, 4H), 7,56-7,54 (d, 2H), 7,46-7,35 (m, 9H), 7,27- 7,24 (m, 8H), 7,185-7,11 (m, 2H), 7,05-7,03 (d, 2H), 4,71 (s, 2H), 4,44 (d, 1H), 3,25-3,16 (d, 1H), 3,01- 3,00 (m, 1H), 2,21 (s, 3H), 1,98-1,93 (m, 2H), 1,68-1,38 (m, 4H), 1,15 (s, 10H), LCm S: MH+845, tiempo de retención 3,63 min.
[0149]Síntesis de 1-azido-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)amino)-6-((difenil(ptolil)metil)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxatriacontan-30-amida (189):Se añadieron diisopropiletilamina (0,49 ml, 2,83 mmol), HATU (719,47 mg, 1,89 mmol) y (S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-(4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil)fenil)-6-((difenil(p-tolil)metil)amino)hexanamida (188) (800 mg, 0,94 mmol) a una solución de ácido 1-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxatriacontan-30-oico (86) (484 mg, 0,94 mmol) en DMF (8 ml) a 0 °C, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Después de completar la reacción del material de partida, la mezcla de reacción se inactivó con agua (15 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 30 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se concentraron en condiciones reducidas y se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida eluyendo con MeOH al 3 % en DCM para proporcionar 1-azido-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(((tercbutildifenilsilil)oxi)metil)fenil)amino)-6-((difenil(p-tolil)metil)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxatriacontan-30-amida (189; 0,60 g) como una goma. RMN 1H (400 MHz, DMSO- d6): 8 9,91 (s, 1H), 8,02-8,00 (d, 2H), 7,95 (s, 2H), 7,87-7,85 (d, 1H), 7,64-7,63 (d, 4H), 7,57-7,55 (d, 2H), 7,46-7,32 (m, 11H), 7,26-7,24 (m, 8H), 7,15-7,11 (t, 2H), 7,05-7,03 (d, 2H), 4,71 (s, 2H), 4,35-4,33 (m, 1H), 4,19 (s, 1H), 3,59-3,36 (m, 38H), 2,68-2,38 (m, 6H), 2,22 (s, 3H), 1,98-1,92 (m, 2H), 1,47-1,17 (m, 4H), 1,02 (s,9H), 0,85-0,80 (m, 6H). LCMS: MH+1338, tiempo de retención 2,92 min.
[0150]Síntesis de 1-azido-N-((S)-1-(((S)-6-((difenil(p-tolil)metil)amino)-1-((4-(hidroximetil)fenil) amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxatriacontan-30-amida (190):Se añadió NH4F (166 mg, 4,48 mmol) a una solución de 1-azido-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(((terc-butildifenilsilil)oxi)metil) fenil)amino)-6-((difenil(ptolil)metil)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxatriacontan-30-amida (189) (600 mg, 0,44 mmol) en metanol (10 ml) a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Después de completar la reacción del material de partida, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo obtenido se diluyó con agua (15 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se concentró a presión reducida y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida eluyendo con MeOH al 5 % en DCM para proporcionar 1-azido-N-((S)-1-(((S)-6-((difenil(p-tolil)metil)amino)-1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxatriacontan-30-amida (190; 0,40 g) en forma de goma. RMN 1H (400 MHz, DMSO- d6): 69,81 (s, 1H), 7,96-7,94 (d, 1H), 7,84-7,81 (d, 1H), 7,53-7,51 (d, 2H), 7,37- 7,35 (d, 4H), 7,26-7,12 (m, 9H), 7,096-7,04 (d, 2H), 5,06-5,04 (t, 1H), 4,43-4,41 (d, 2H), 4,35 (m, 1H), 4,18-4,16 (t, 1H), 3,60-3,46 (m, 33H), 3,39-3,36 (t, 2H), 2,50-2,23 (m, 2H), 2,23 (s, 3H), 2,23-1,93 (m,2H) ), 1,48-1,23 (m, 6H), 0,85-0,80 (m, 6H). LCMS: MH+1100, tiempo de retención 3,72 min.
[0151]Síntesis de (4-nitrofenil)carbonato de 4-((32S,35S)-1-azido-35-(4-((difenil(p-tolil)metil)amino)butil)-32-isopropil-30,33-dioxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31,34-diazahexatriacontan-36-amido)bencilo (191):Se añadieron piridina (0,14 ml, 1,80 mmol) y cloroformiato de 4-nitrofenilo (14) (145 mg, 0,72 mmol) a una solución de 1-azido-N-((S)-1-(((S)-6-((difenil(p-tolil)metil)amino)-1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-3,6,9,12,15,18,21 ,24,27-nonaoxatriacontan-30-amida (190) (400 mg, 0,36 mmol) en DCM (10 ml) a 0 °C, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante CCF. Después de completar el material de partida, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida eluyendo con MeOH al 3 % en DCM para proporcionar 4-((32S,35S)-1-azido-35-(4-((difenil(p-tolil)metil)amino)butil)-32-isopropil-30,33-dioxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31,34-diazahexatriacontan-36-amido)bencil (4-nitrofenil) carbonato (191; 0,34 g) como una goma. LCMS: MH+ 1265, tiempo de retención 1,33 min.
Síntesis_____ de_____ ((1S.9S)-9-et¡l-5-fluoro-9-h¡drox¡-4-met¡l-10,13-d¡oxo-2.3._____ 9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de1p¡rano[3'.4':6.71¡ndol¡z¡no[1,2-b1qu¡nol¡n-1-¡l)carbamato de 4-((32S,35S)-35-(4-aminobutil)-1-azido-32-¡soprop¡l-30.33-d¡oxo-3,6.9.12.15.18.21. 24.27-nonaoxa-31,34-d¡azahexatr¡acontan-36-am¡do)benc¡lo (202).
Esquema9: Síntesis del precursor del conjugado de enlazador escindible por proteasa-carga útil<(>202<)>
[0153]Síntesis de ((1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, I S-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4 ’:6,7jindolizino[1,2-bjquinolin-1-il)carbamato de 4-((32S,35S)-1-azido-35-(4-((difenil(ptolil)metil)amino)butil)-32-isopropil-30, 33-dioxo-3, 6,9, 12, 15, 18,21, 24, 27-nonaoxa-31, 34-diazahexatriacontan-36-amido) bencilo (201):Se añadieron trietilamina (0,09 ml, 0,62 mmol) y (1R,9R)-1-amino-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-1,2,3,9,12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona metano sulfonato (mesilato de exatecán; 16; 131 mg, 0,25 mmol) a una solución de (4-nitrofenil) carbonato de 4-((32S,35S)-1-azido-35-(4-((difenil(p-tolil)metil)amino)butil)-32-isopropil-30,33-dioxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-3l,34-diazahexatriacontan-36-amido) bencilo (191; 311 mg, 0,25 mmol) en NMP (2,5 ml) a 0 °C y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante LCMS. Después de completar la reacción del material de partida, la mezcla de reacción se inactivó con agua (15 ml) y se extrajo con metanol al 10 % en cloroformo (2 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) y se concentró a presión reducida. Se añadió éter dietílico al material en bruto y el precipitado resultante se filtró y purificó usando cromatografía en columna (Combi-Flash) eluyendo con MeOH al 5 % en DCM para proporcionar ((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7] indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamato de 4-((32S,35S)-1-azido-35-(4-((difenil(p-tolil)metil)amino)butil)-32-isopropil-30,33-dioxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31,34-diazahexatriacontan-36-amido)bencilo (201) como un sólido (0,3 g).
[0154] LCMS: MH 1561, tiempo de retención 2,18 min.
[0155]Síntesis de ((1S,9S)-9-etil-5-uoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamato de 4-((32S,35S)-35-(4-aminobutil)-1-azido-32-isopropil-30,33-dioxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31,34-diazahexatriacontan-36-amido)bencilo (202):Se añadió una solución al 1% de ácido trifluoroacético (TFA) en DCM a una solución de ((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamato de 4-((32S,35S)-1-azido-35-(4-((difenil(p-tolil)metil)amino)butil)-32-isopropil-30,33-dioxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31,34-diazahexatriacontan-36-amido)bencilo (201; 300 mg, 0,19 mmol) en DCM (5 ml) a 0 °C, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante LCMS. Después de completar la reacción del material de partida, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se trituró con éter dietílico y se purificó mediante RP-prep-HPLC para proporcionar ((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamato de 4-((32S,35S)-35-(4-aminobutil)-1-azido-32-isopropil-30,33-dioxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxa-31,34-diazahexatriacontan-36-amido)bencilo (202) (70 mg) como un sólido. RMN 1H(400 MHz, DMSO-d6): 89,96 (s, 1H), 8,12-8,10 (q, 2H), 7,89-7,87 (d, 1H), 7,76-7,61 (d, 1H), 7,59-7,31 (m, 7H), 6,51 (s, 1H), 5,44 (s, 2H), 5,29 (s, 3H), 5,09 (s, 2H), 4,37-4,20 (m, 1H), 4,18-4,16 (t, 1H), 3,49-3,44 (m, 4H), 3,12-2,55 (m, 39H), 2,40-1,34 (m, 15H), 0,89-0,82 (m, 9h ), LCMS: MH 1305, tiempo de retención 5,33 y 5,47 mín.
Ejemplo sintético 2: Síntesis de precursores de ligandos dirigidos
[0156] Los precursores de ligandos dirigidos adecuados para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento se pueden preparar de acuerdo con los siguientes protocolos sintéticos de ejemplo.
[0157] Síntesis de ácido (S)-16-(4(((2-amino-4-oxo-3,4-dihidropteridin-6-il)metil)amino)benzamido)-1-azido-13-oxo-3,6.9-tr¡oxa-12-azaheptadecan-17-oico (606)
TBTU 1.4 e
606
Esquema 10:Síntesis de ligado dirigido a receptor de folato (606)
[0158] Preparación del compuesto 600: Se disolvió el compuesto 599 (160 g, 512 mmol) en TFAA (800 ml) a 25 °C y se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno en la oscuridad durante 5 horas. A continuación, se eliminó el disolvente a 50 °C al vacío para dar el producto en bruto. El producto en bruto se trituró con MTBE (750 ml) durante 60 min y, a continuación, se filtró para proporcionar el compuesto 600 (203 gramos en bruto) como un sólido, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LC-MS: RMN 1H: (400 MHz, CDCl3) 812,74 (s ancho, 1H), 8,88 (s, 1H), 7,97 8,05 (m, 2H), 7,66-7,74 (m, 2H), 5,26 (s, 1H).
[0159] Preparación del compuesto 602: Se añadieron TBTU (238 g, 740 mmol) y DIPEA (95,7 g, 740 mmol) a una solución del compuesto 601 (225 g, 529 mmol) en DMF (2,25 litros). Después de 30 minutos de agitación a 20 °C, se añadió 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etan-1-amina (Reactivo A; 121 g, 555 mmol) y la mezcla se agitó a 50 °C durante 12 horas. Se combinaron y procesaron dos mezclas de reacción, y el residuo se diluyó con H2O (3 litros) y se extrajo con acetato de etilo (1500 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de cloruro sódico (800 ml x 3), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida y se purificaron mediante cromatografía en columna (SO2, Éter de petróleo/acetato de etilo = 100/1 a 1/1) para proporcionar el compuesto 602 (590 g) en forma de un aceite. RMN 1H: (400 MHz, CDCh) 87,76-7,78 (m, 2H), 7,63 7,60 (m, 2H), 7,41-7,27 (m, 4H), 6,43 (s, 1H), 5,70 (s, 1H), 4,42-4,38 (m, 2H), 4,24-4,23 (m, 2H), 3,63-3,36 (m, 16H), 2,28-2,18 (m, 3H), 1,98-1,96 (m, 1H), 1,48 ( s, 9H).
[0160] Preparación del compuesto 603: Se añadió N-etiletanamina (1,27 kg, 17,4 mol) a una solución del compuesto 602 (435 g, 695 mmol) en DCM (4,35 litros) y la mezcla se agitó a 25 °C durante 3 horas. . A continuación, se eliminó el disolvente a temperatura ambiente al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna (DCM/MeOH = 100/1 a 1/1) para proporcionar el compuesto 603 (245 g) en forma de un aceite. RMN 1H: (400 MHz, CDCla) 86,55 (s, 1H), 3,67-3,30 (m, 17H), 2,34-2,30 (m, 2H), 2,10-2,06 (m, 1H), 1,87 (s, 2H), 1,77-1,73 (m, 1H), 1,44 (s, 9H).
[0161] Preparación del compuesto 604: Se añadieron TBTU (119 g, 372 mmol) y DIEA (160 g, 1,24 mol) a una solución del compuesto 600 (101 g, 248 mmol) en DMF (900 ml) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. A continuación, se añadió el compuesto 603 (100 g, 248 mmol) en DMF (100 ml). La mezcla se agitó a 25 °C durante 12 horas. Se combinaron dos mezclas de reacción y se concentraron y el residuo se diluyó con H2O (2,5 litros) y se extrajo con acetato de etilo (1 litro x 5). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de cloruro sódico (600 ml x 3), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar el compuesto 4 (420 gramos en bruto) como un sólido, que se usó en la siguiente etapa sin más purificación adicional.
[0162] Preparación del compuesto 605: Se añadió K2CO3 (585 g, 4,23 mol) a una solución del compuesto 604 (420 g, 529 mmol) en THF (4,2 ml) y H2O (500 ml) y la mezcla se agitó a 60 °C durante 0,5 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para eliminar el THF y el residuo se diluyó con H2O (500 ml) y se ajustó el pH a 3 con HCl (1), se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto 605 (260 gramos en bruto) como un sólido, que se usó directamente sin purificación.
[0163] Preparación del compuesto 606: Se añadió ácido trifluoroacético (2,12 kg, 18,6 mol) de una vez a una mezcla del compuesto 605 (260 g, 373 mmol) en CH2Ch (2,6 litros) a 20 °C en atmósfera de nitrógeno y la mezcla se agitó a 20 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se purificó mediante HPLC (columna: Agela DuraShell C18250 * 80 mm * 10 um; fase móvil: [agua (NH4HCO3 10 mM)-MeOH]; B %: 5 %-40 %, 20 minutos) para producir el compuesto 606 (52,5 g) en forma de un sólido. (M+H) 642,80; IR: 2107 (enlace N3).

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para funcionalizar una nanopartícula, que comprende: poner en contacto una nanopartícula con un primer precursor bifuncional, en el que el primer precursor bifuncional comprende un resto de silano y un resto de dieno, y en el que el contacto se realiza en condiciones adecuadas para la reacción entre el resto de silano y la superficie de la nanopartícula; formar un enlace covalente entre el resto de silano y una superficie de la nanopartícula, formando de este modo una nanopartícula funcionalizada con un resto de dieno; poner en contacto la nanopartícula funcionalizada con un resto de dieno con un segundo precursor bifuncional, en el que el segundo precursor bifuncional comprende un resto de alquino y un dienófilo, en el que el contacto se realiza en condiciones adecuadas para una reacción entre el dienófilo y el resto de dieno; y hacer reaccionar el resto de dieno de la nanopartícula con el segundo precursor bifuncional, formando de este modo una nanopartícula funcionalizada con un resto de alquino; en el que la nanopartícula es una nanopartícula de sílice.
  2. 2. Procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto el resto de alquino con un compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino en condiciones adecuadas para una reacción entre el resto de alquino y el grupo reactivo con alquino, formando de este modo una nanopartícula funcionalizada con el compuesto.
  3. 3. Procedimiento de la reivindicación 2, en el que el grupo reactivo con alquino es una azida, y/o en el que el resto de dieno es un resto de ciclopentadieno.
  4. 4. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer precursor bifuncional comprende la estructura de Fórmula (A):
    en la que R1 es alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, halo, -ORA, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo, pueden estar sustituidos o no sustituidos; cada R2 es de manera independiente hidrógeno, alquilo, halo o -ORA; RA es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; n es un número entero de 0 a 12; y m es un número entero de 0 a 5.
  5. 5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en la que R2 es -ORA; RA es alquilo; n es un número entero de 1 a 5; y m es 0.
  6. 6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer precursor bifuncional
  7. 7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo precursor bifuncional comprende una estructura de Fórmula (B):
    en la que: X es un dienófilo; Y es un enlazador divalente; R3 y R4 son cada uno de manera independiente alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, halo, -ORA, -NRBRC, -NO2 o -CN, en donde cada alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo pueden estar sustituidos o no sustituidos; RA, RB y RCson cada uno de manera independiente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; q y p son cada uno de manera independiente un número entero de 0 a 4; y v es un número entero de 0 a 2.
  8. 8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que Y es un grupo heteroalquileno sustituido o no sustituido; y/o en el que X es maleimida, q y p son cada uno de manera independiente un número entero de 0, y v es un número entero de 1.
  9. 9. Procedimiento, según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el enlazador divalente comprende una estructura de Fórmula (C):
    en la que cada RB es de manera independiente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo; x es un número entero de 0 a 10; y cada uno de indica de manera independiente un punto de unión a una parte del segundo precursor bifuncional.
  10. 10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el segundo precursor bifuncional comprende una estructura de Fórmula (B-1):
    en la que x es un número entero de 0 a 10, o 4; y/o en la que la reacción del resto de dieno con el segundo precursor bifuncional proporciona un compuesto de Fórmula (NP-1):
    en la que x es un número entero de 0 a 10, o 4, y en la que el átomo de silicio es una parte de la nanopartícula.
  11. 11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en el que el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino comprende (i) un resto de carga útil, o (ii) un ligando dirigido.
  12. 12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en el que el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino comprende una estructura de Fórmula (D) o Fórmula (E):
    en la que: T es un ligando dirigido; L es un resto enlazador escindible o un resto enlazador escindible por proteasa; P es un resto de carga útil; e y es un número entero de 0 a 20, o 3 o 9.
  13. 13. Procedimiento, según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que: (i) el resto de carga útil es un fármaco citotóxico; y/o (ii) el ligando dirigido es un ligando dirigido al receptor de folato (FR).
  14. 14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que: (i) el resto de carga útil es exatecán; y/o (ii) el ligando dirigido es ácido fólico.
  15. 15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el resto enlazador escindible o el resto enlazador escindible por proteasa comprende una estructura de Fórmula (F):
    en la que cada caso de [AA] es un residuo de aminoácido natural o no natural; z es un número entero de 1 a 5; w es un número entero de 2 o 3; y cada uno de "^ ind ica de manera independiente un punto de unión a una parte del compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino.
  16. 16. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-15, en el que el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino comprende una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
    en el que la reacción del resto de alquino con el compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino proporciona un compuesto de Fórmula (NP-2):
    en las que: cada caso de x es de manera independiente un número entero de 0 a 10, o 4; cada caso de y es de manera independiente un número entero de 0 a 20, o 3 o 9; y en las que el átomo de silicio en cada uno de (NP-2) y (NP-3) es una parte de la nanopartícula.
  17. 17. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la nanopartícula está recubierta con un polímero orgánico, o en el que la nanopartícula está recubierta con polietilenglicol.
  18. 18. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se forma una nanopartícula funcionalizada con una pluralidad de restos de alquino.
  19. 19. Procedimiento, según la reivindicación 18, que comprende además: (a) hacer reaccionar una primera parte de la pluralidad de restos de alquino con un primer compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino; y (b) hacer reaccionar una segunda parte de la pluralidad de restos de alquino con un segundo compuesto que comprende un grupo reactivo con alquino, formando así una nanopartícula funcionalizada con el primer compuesto y el segundo compuesto, en el que el primer compuesto y el segundo compuesto son químicamente distintos.
  20. 20. Procedimiento, según la reivindicación 19, en el que:
    en la que y es 9, o (b) el primer compuesto es el compuesto de Fórmula (E-1) y el segundo compuesto es el compuesto de Fórmula (D-1).
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