JP2023153424A - ナノ粒子を官能化する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ナノ粒子を官能化する方法を提供すること。【解決手段】本開示は、ナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)を生成するためなど、例えば標的化リガンドおよび/またはペイロード部分をコンジュゲートするために、ナノ粒子を官能化する方法に関する。本開示は、ナノ粒子を官能化する方法を特徴とする。方法は、化合物をナノ粒子表面(例えば、がん標的化リガンドなどの標的化リガンド、例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸;および細胞毒性化合物などの治療剤、例えばエキサテカン)にコンジュゲートして、ナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)を形成するのに適したナノ粒子の調製を含むことができる。得られたNDCは、コンジュゲートされた分子とナノ粒子との非常に安定した連結を示し、また標的化された生体系における、例えばがん細胞における有効な薬物放出をもたらす。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書にそれぞれ組み込まれる、2020年10月27日に出願された米国仮出願第63/105,995号、2020年11月20日に出願された米国仮出願第63/116,393号、2020年11月23日に出願された米国仮出願第63/117,110号、2021年3月1日に出願された米国仮出願第63/155,043号、2021年7月15日に出願された米国仮出願第63/222,181号、2021年9月9日に出願された米国仮出願第63/242,201号、および2021年10月12日に出願された米国仮出願第63/254,837号の利益を主張する。
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書にそれぞれ組み込まれる、2020年10月27日に出願された米国仮出願第63/105,995号、2020年11月20日に出願された米国仮出願第63/116,393号、2020年11月23日に出願された米国仮出願第63/117,110号、2021年3月1日に出願された米国仮出願第63/155,043号、2021年7月15日に出願された米国仮出願第63/222,181号、2021年9月9日に出願された米国仮出願第63/242,201号、および2021年10月12日に出願された米国仮出願第63/254,837号の利益を主張する。
背景
ナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)は、抗体薬物コンジュゲート(ADC)などのその他の薬物担体プラットフォームの欠点の多くを解決する可能性を提供する。例えば、超小型サイズ(例えば、20nmまたはそれよりも小さい直径)のNDCは、ADCなどのその他のプラットフォームを使用すると不可能な、破壊された血液脳関門を通過しかつ治療物質を脳腫瘍に送達することができる。超小型ナノ粒子は、治療分子の腫瘍に対する深い腫瘍浸透を示すことができかつ均質な送達をもたらすことができ、一方、ADCなどのその他の薬物担体プラットフォームは、遅い腫瘍内拡散に起因して、限定された腫瘍浸透を有する。NDCは、ADCなどの従来の薬物送達プラットフォームよりも著しく多くの薬物分子を運ぶこともでき、それによってNDCは、比較的より多くの量の薬物をがん細胞に送達することが可能になる。このことは、十分な量の薬物の送達を困難にする、受容体発現が低いがん細胞を標的とする場合に、特に有用である。NDCの別の利点は、有機ポリマー層でナノ粒子をコーティングする、例えばナノ粒子表面をPEG基の層でコーティングする可能性であり、生理学的環境において(例えば、対象において)血清タンパク質のナノ粒子への吸着を防止することができ、効率的な尿排泄を容易にし、かつナノ粒子の凝集を減少させ得る(例えば、Burns et al. ”Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine”, Nano Letters (2009) 9(1):442-448参照)。
ナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)は、抗体薬物コンジュゲート(ADC)などのその他の薬物担体プラットフォームの欠点の多くを解決する可能性を提供する。例えば、超小型サイズ(例えば、20nmまたはそれよりも小さい直径)のNDCは、ADCなどのその他のプラットフォームを使用すると不可能な、破壊された血液脳関門を通過しかつ治療物質を脳腫瘍に送達することができる。超小型ナノ粒子は、治療分子の腫瘍に対する深い腫瘍浸透を示すことができかつ均質な送達をもたらすことができ、一方、ADCなどのその他の薬物担体プラットフォームは、遅い腫瘍内拡散に起因して、限定された腫瘍浸透を有する。NDCは、ADCなどの従来の薬物送達プラットフォームよりも著しく多くの薬物分子を運ぶこともでき、それによってNDCは、比較的より多くの量の薬物をがん細胞に送達することが可能になる。このことは、十分な量の薬物の送達を困難にする、受容体発現が低いがん細胞を標的とする場合に、特に有用である。NDCの別の利点は、有機ポリマー層でナノ粒子をコーティングする、例えばナノ粒子表面をPEG基の層でコーティングする可能性であり、生理学的環境において(例えば、対象において)血清タンパク質のナノ粒子への吸着を防止することができ、効率的な尿排泄を容易にし、かつナノ粒子の凝集を減少させ得る(例えば、Burns et al. ”Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine”, Nano Letters (2009) 9(1):442-448参照)。
しかしながら、NDCの開発および製造には著しい障害がある。例えば、臨床移行に必要とされる、製造制御、安定性、薬物放出、安全性、および有効性の厳しい基準を満たすNDCを創出することは、非常に困難である。特に、これらの基準を満たすコンジュゲートされた分子(例えば、薬物分子および/または標的化リガンド)とナノ粒子担体との間に連結を創出することは、特に難しい。
[0004]
したがって、ナノ粒子を官能化しかつ分子とナノ粒子、例えば薬物分子または標的化リガンドとのコンジュゲーションを可能にするための方法に、未だ満たされないニーズがある。
[0004]
したがって、ナノ粒子を官能化しかつ分子とナノ粒子、例えば薬物分子または標的化リガンドとのコンジュゲーションを可能にするための方法に、未だ満たされないニーズがある。
Burns et al. "Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine", Nano Letters (2009) 9(1):442-448
概要
本開示は、ナノ粒子を官能化する方法を特徴とする。方法は、化合物をナノ粒子表面(例えば、がん標的化リガンドなどの標的化リガンド、例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸;および細胞毒性化合物などの治療剤、例えばエキサテカン)にコンジュゲートして、ナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)を形成するのに適したナノ粒子の調製を含むことができる。得られたNDCは、コンジュゲートされた分子とナノ粒子との非常に安定した連結を示し、また標的化された生体系における、例えばがん細胞における有効な薬物放出をもたらす。
本開示は、ナノ粒子を官能化する方法を特徴とする。方法は、化合物をナノ粒子表面(例えば、がん標的化リガンドなどの標的化リガンド、例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸;および細胞毒性化合物などの治療剤、例えばエキサテカン)にコンジュゲートして、ナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)を形成するのに適したナノ粒子の調製を含むことができる。得られたNDCは、コンジュゲートされた分子とナノ粒子との非常に安定した連結を示し、また標的化された生体系における、例えばがん細胞における有効な薬物放出をもたらす。
本明細書に開示される合成方法は、一連の種々の反応性基(本明細書では、官能基と呼ばれることもある)または化合物(例えば、ペイロード部分または標的化リガンド)をナノ粒子表面に導入することができる、反応シーケンスを含むことができる。これらの反応は、とりわけシラン縮合、Diels-Alder反応、および「クリックケミストリー」、2+3または2+4付加環化反応、例えば本明細書に記述されるその他の反応を含むことができる。方法は、有機ポリマーでコーティングされたナノ粒子、および/またはシリカナノ粒子(例えば、超小型PEG化シリカナノ粒子、例えばC’ドット)を含む、超小型ナノ粒子を官能化するのに使用されてもよい。
ナノ粒子を官能化する方法は、ナノ粒子と、第1の二官能性前駆体、例えばシラン部分および別の反応性基(例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、またはアルキン)を含む二官能性前駆体とを接触させるステップを含むことができ、このナノ粒子は、シラン(例えば、シリカ表面)と反応性のある表面を含み、接触させるステップは、シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件(例えば、シラン縮合に適した本明細書に記述される条件)下にあり、それによって、シラン部分とナノ粒子の表面との間に共有結合が形成され、反応性基(例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、またはアルキン)で官能化されたナノ粒子が提供される。この方法は、複数の反応性基を含むナノ粒子を提供するのに使用できることが理解されよう。
ナノ粒子と第1の二官能性前駆体との接触は、PEGでコーティングされた表面を含むナノ粒子を使用したときなど、ナノ粒子に付着された有機ポリマー分子(例えば、PEG鎖)間の間隙空間への二官能性前駆体の挿入を含んでいてもよい。したがってこの方法は、官能化のために有機ポリマー層(例えば、PEG分子の層)を含むナノ粒子の表面に前駆体分子を効果的に送達できないナノ粒子官能化の、従来の方法における困難を克服する。
本明細書に開示される方法は、反応性基で官能化されたナノ粒子(例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、またはアルキンで官能化されたナノ粒子)を、第2の二官能性前駆体と接触させることをさらに含んでいてもよく、この第2の二官能性前駆体は、ナノ粒子上の反応性基に反応性のある基を含み、この第2の二官能性前駆体は、別の官能基(例えば、アルキン部分(例えば、ジベンゾアザシクロオクチン(DBCO))、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アルケン、またはアジド)を含む。例えば、第2の二官能性前駆体は、ナノ粒子上の反応性基(例えば、ジエン)と反応性のあるジエノフィル(例えば、マレイミド)を含んでいてもよく、第2の二官能性前駆体は、アルキン部分(例えば、DBCO)を含んでいてもよい。接触は、官能化ナノ粒子と第2の二官能性前駆体との間の反応に適した条件(例えば、本明細書に開示される
反応条件)下にあってもよく、それによって、第2の二官能性前駆体をナノ粒子に共有結合し、別の官能基(例えば、DBCOなどのアルキン部分)で官能化されたナノ粒子が提供される。方法は、複数の別の官能基(例えば、複数のDBCO部分)で官能化させたナノ粒子を提供するのに使用できることが理解されよう。
反応条件)下にあってもよく、それによって、第2の二官能性前駆体をナノ粒子に共有結合し、別の官能基(例えば、DBCOなどのアルキン部分)で官能化されたナノ粒子が提供される。方法は、複数の別の官能基(例えば、複数のDBCO部分)で官能化させたナノ粒子を提供するのに使用できることが理解されよう。
方法はさらに、別の官能基で官能化させたナノ粒子(例えば、DBCO官能化ナノ粒子)と、ナノ粒子上の別の官能基に反応性のある基を含む化合物とを接触させることを、含んでいてもよい。例えば、化合物は、アルキン官能化ナノ粒子のアルキン基と反応させるのに適切な、アルキン反応性基(例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)を含んでいてもよい。接触は、アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件、例えば本明細書に記述される反応条件、例えばクリックケミストリー条件、またはその他の付加環化条件(例えば、3+2付加環化または4+2付加環化)下であってもよく、それによって、化合物で官能化されたナノ粒子が形成される。ナノ粒子上の官能基に反応性のある基を含む化合物は、ペイロード部分(例えば、本明細書に開示される細胞毒性薬物、例えばエキサテカン)または標的化リガンド(例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸)を含んでいてもよい。方法は、複数の化合物をナノ粒子表面に共有結合で付着するのに使用されてもよい。例えば、方法は、官能化ナノ粒子に反応性のある基を含む複数の化合物を導入してもよく、または官能化ナノ粒子に反応性のある基をそれぞれが含む複数の種々の化合物(例えば、複数の標的化リガンド、複数のペイロード部分、またはこれらの組合せ)を導入してもよく、前記化合物はナノ粒子に共有結合により付着されるものであってもよい。
方法の各ステップは、複数の官能基をナノ粒子に導入するのに使用され得ることが理解されよう。例えば、ナノ粒子は、シラン基および反応性基を含む、複数の第1の二官能性前駆体に接触することができ、複数の反応性基(例えば、複数のジエン部分)で官能化されたナノ粒子を提供する。複数の反応性基(例えば、複数のジエン部分)で官能化されたナノ粒子は、複数の第2の二官能性前駆体に接触することができ、第2の二官能性前駆体は、ナノ粒子上の反応性基に反応性のある基を含み、第2の二官能性前駆体は、別の官能基(例えば、アルキン、例えばDBCO)を含み、それによって、第2の二官能性前駆体からの複数の官能基(例えば、複数のDBCO部分)で官能化されたナノ粒子が提供される。次いで第2の二官能性前駆体からの複数の官能基で官能化されたナノ粒子は、ナノ粒子上の官能基に反応性のある基を含む複数の化合物と接触してもよく、複数の化合物を含むナノ粒子が提供される。第2の二官能性前駆体からの複数の官能基で官能化されたナノ粒子は、ナノ粒子上の官能基に反応性のある基を含む第1の複数の化合物(例えば、アジドを含む標的化リガンド)に接触してもよく、その後、ナノ粒子上の官能基に反応性のある基を含む第2の複数の化合物(例えば、アジドを含むペイロード-リンカーコンジュゲート)に接触してもよく、第1および第2の複数の化合物は、構造的に異なる化合物を含み、それによって、2つの異なる複数の化合物(例えば、複数の標的化リガンド、および複数のペイロード部分)を含むナノ粒子が提供される。
例えば、方法は、シラン部分とナノ粒子の表面との間の反応に十分な条件下、例えばナノ粒子と、シラン部分およびジエン部分を含む複数の第1の二官能性前駆体とを接触させることにより、複数のジエン部分(例えば、シクロペンタジエン部分)で官能化されたナノ粒子を形成することを含むことができる。方法は、例えば複数のジエン部分(例えば、シクロペンタジエン部分)を含むナノ粒子を、ジエン部分とジエノフィルとの間の反応に十分な条件下、ジエノフィル(例えば、マレイミド)およびアルキン部分(例えば、DBCO)を含む複数の第2の二官能性前駆体に接触させることにより、複数のアルキン部分(例えば、DBCO部分)で官能化されたナノ粒子を形成することを含むことができる。方法は:(a)ナノ粒子上の複数のアルキン部分の第1の部分を、アルキン反応性基を含む第1の化合物と反応させること(アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に十分
な条件下);および(b)ナノ粒子上の複数のアルキン部分の第2の部分を、アルキン反応性基を含む第2の化合物と反応させること(アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に十分な条件下)をさらに含み、それによって、複数の第1の化合物および複数の第2の化合物で官能化されたナノ粒子を形成してもよく、第1の化合物および第2の化合物は化学的に異なるものである。例えば、(a)第1の化合物は、本明細書に開示された式(D)の化合物(例えば、式(D-1)の化合物)であってもよく;第2の化合物は、本明細書に開示された式(E)の化合物(例えば、式(E-1)の化合物)であってもよい。あるいは、第1の化合物は、本明細書に開示される式(E)の化合物(例えば、式(E-1)の化合物)であってもよく、第2の化合物は、本明細書に開示される式(D)の化合物(例えば、式(D-1)の化合物)である。
な条件下);および(b)ナノ粒子上の複数のアルキン部分の第2の部分を、アルキン反応性基を含む第2の化合物と反応させること(アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に十分な条件下)をさらに含み、それによって、複数の第1の化合物および複数の第2の化合物で官能化されたナノ粒子を形成してもよく、第1の化合物および第2の化合物は化学的に異なるものである。例えば、(a)第1の化合物は、本明細書に開示された式(D)の化合物(例えば、式(D-1)の化合物)であってもよく;第2の化合物は、本明細書に開示された式(E)の化合物(例えば、式(E-1)の化合物)であってもよい。あるいは、第1の化合物は、本明細書に開示される式(E)の化合物(例えば、式(E-1)の化合物)であってもよく、第2の化合物は、本明細書に開示される式(D)の化合物(例えば、式(D-1)の化合物)である。
本開示は、シリカナノ粒子を官能化する方法も対象とし、この方法は:(i)シリカナノ粒子と第1の二官能性前駆体とを接触させることであって、第1の二官能性前駆体がシラン部分およびシクロペンタジエン部分を含み、シリカナノ粒子が、シラン部分に反応性のある表面(例えば、シリカ表面)を含み、接触は、シラン部分とシリカナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にあり、それによって、シラン部分とナノ粒子の表面との間に共有結合が形成され、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子が提供されるものであること;(ii)シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を第2の二官能性前駆体と接触させることであって、第2の二官能性前駆体がアルキン部分(例えば、DBCO)およびジエノフィル(例えば、マレイミド)を含み、接触が、ジエノフィルとシクロペンタジエン部分との間の反応に適した条件下にあり、それによって、ナノ粒子のジエン部分と第2の二官能性前駆体とを反応させ、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供するものであること;および(iii)アルキン部分と、アジド部分を含む化合物とを、アルキン部分とアジド部分との間の反応に適した条件(例えば、クリックケミストリー条件)下で接触させ、それによって、ナノ粒子のアルキン部分とアジド部分とを反応させ、化合物(例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物)で官能化されたナノ粒子を提供することを含む。
本開示は、シリカナノ粒子を官能化する方法であって:(i)シリカナノ粒子と、式(A)の構造を含む第1の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供すること;(ii)シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を、式(B)の構造を含む第2の二官能性前駆体と接触させ、それによって、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供すること;および(iii)アルキン部分を、式(D)の化合物もしくは式(E)の化合物またはその両方の化合物と接触させ、それによって、標的化リガンド、ペイロード部分、またはその両方で官能化されたナノ粒子を提供することを含む方法も対象とする。
第1の二官能性前駆体は、本明細書で提供される式(A-1)の構造を含んでいてもよい。第2の二官能性前駆体は、本明細書で提供される式(B-1)の構造を含んでいてもよい。式(D)の化合物は、本明細書で提供される式(D-1)の構造を含んでいてもよい。式(E)の化合物は、本明細書で提供される式(E-1)の構造を含んでいてもよい。
本明細書に開示される方法は、本明細書で提供される式(NP-2)の化合物を含むナノ粒子を提供することができる。ナノ粒子の(NP-2)に対する平均比は、約1:1から約1:50であってもよく(各ナノ粒子は、平均して1~50単位のNP-2を含む)、例えば約1:40、約1:30、約1:25、約1:20、約1:15、約1:14、約1:13、約1:12、約1:11、または約1:10であってもよい。
方法は、本明細書で提供される式(NP-3)の化合物を含むナノ粒子を提供すること
ができる。ナノ粒子の(NP-3)に対する平均比は、約1:1から約1:80(各ナノ粒子は、平均して1~80単位のNP-3を含む)、例えば約1:60、約1:40、約1:30、約1:28、約1:26、約1:25、約1:24、約1:23、約1:22、約1:21、約1:20、約1:19、または約1:18であってもよい。
ができる。ナノ粒子の(NP-3)に対する平均比は、約1:1から約1:80(各ナノ粒子は、平均して1~80単位のNP-3を含む)、例えば約1:60、約1:40、約1:30、約1:28、約1:26、約1:25、約1:24、約1:23、約1:22、約1:21、約1:20、約1:19、または約1:18であってもよい。
方法は、式(NP-2)の化合物および式(NP-3)の化合物を含むナノ粒子を提供することができ、その構造は本明細書で提供され、ナノ粒子:(NP-3):(NP-2)の比は、約1:20:10、1:20:11、1:20:12、1:20:13、1:20:14、1:20:15、1:21:10、1:21:11、1:21:12、1:21:13、1:21:14、1:21:15、1:22:10、1:22:11、1:22:12、1:22:13、1:22:14、1:22:15、1:23:10、1:23:11、1:23:12、1:23:13、1:23:14、1:23:15、1:24:10、1:24:11、1:24:12、1:24:13、1:24:14、1:24:15、1:25:10、1:25:11、1:25:12、1:25:13、1:25:14、または1:25:15である。
本明細書に開示される方法の利点は、比較的安定した前駆体(例えば、ジエン-シラン前駆体)の使用であり、安定な官能化ナノ粒子をもたらす。例えば、本明細書に開示される方法を使用して生成され得る官能化ナノ粒子(例えば、NDC)は、その他の方法を使用してまたはその他の前駆体で生成された官能化ナノ粒子(例えば、NDC)で生じる可能性のある早期のまたは望ましくない切断を回避することができる。例えば、ナノ粒子を官能化するその他の方法は、ナノ粒子の表面に反応性部分を持つナノ粒子をもたらす前駆体を用い、これは例えばペイロードの早期の放出または標的化リガンドの望ましくない放出をもたらし得る望ましくない反応性を促進させる可能性があるものである。さらに、ナノ粒子官能化のその他の方法は、不安定な前駆体を使用し、反応中に自己縮合する可能性があり、望ましくない凝集を引き起こす可能性がある。凝集体は、官能化ナノ粒子から分離することが非常に難しくなる可能性がある。
対照的に、本明細書に開示される方法は、比較的安定な前駆体を用いることができ、得られた官能化ナノ粒子(例えば、NDC)は、安定でありかつ高度に純粋である。例えば、本開示の官能化ナノ粒子は、ジエン-シラン前駆体(シクロペンタジエン-シラン前駆体など)で調製して、1個または複数のジエン基で官能化されたナノ粒子を得ることができる。次いでジエン基は、ジエノフィル含有前駆体(例えば、PEG-マレイミド誘導体、例えばDBCO-PEG-マレイミド)などの第2の前駆体と反応させてもよく、安定な付加環化物が形成される。付加環化物を含む、得られた官能化ナノ粒子は、必要に応じて1つまたは複数の後続の前駆体(本明細書に記述される標的化リガンド前駆体および/またはペイロード-リンカーコンジュゲート前駆体など)と反応させて、さらにナノ粒子を官能化してもよい。ジエン-シラン前駆体と、生成された付加環化物は、その他の官能化ナノ粒子またはそれらの前駆体で見い出すことができる望ましくない特徴を示さない。例えば、本明細書に開示される方法を使用して調製された官能化ナノ粒子(例えば、NDC)は、比較的高い血清安定性を有し、高い収率および純度(例えば、凝集した前駆体を含まない)で生成することができる。さらに、この手法は高度にモジュール的であるので、ペイロード、標的化リガンド、またはその他のものの任意の所望の比を、ナノ粒子に導入することができる。これらの方法、およびそれらの利益を使用してナノ粒子を調製する例を、実施例で提示する。
詳細な説明
選択された化学的定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、1から18個の炭素原子、例えば1から約12個の炭素原子、または1から約6個の炭素原子を含んでいてもよい1価の脂肪族炭化水素基(「C1~18アルキル」)を指す。アルキル基は、直鎖、分岐鎖、単環式部分、または多環式部分、またはこれらの組合せとすることができる。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、iso-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニル、および同様のものが含まれる。アルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても(「非置換アルキル」)または1個または複数の置換基で、例えば1から5個の置換基、1から3個の置換基、または1個の置換基で置換されても(「置換アルキル」)よい。
選択された化学的定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、1から18個の炭素原子、例えば1から約12個の炭素原子、または1から約6個の炭素原子を含んでいてもよい1価の脂肪族炭化水素基(「C1~18アルキル」)を指す。アルキル基は、直鎖、分岐鎖、単環式部分、または多環式部分、またはこれらの組合せとすることができる。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、iso-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニル、および同様のものが含まれる。アルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても(「非置換アルキル」)または1個または複数の置換基で、例えば1から5個の置換基、1から3個の置換基、または1個の置換基で置換されても(「置換アルキル」)よい。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、2から18個の炭素原子、1つまたは複数の炭素-炭素二重結合を有し、三重結合を持たない、1価の直鎖または分岐状炭化水素基(「C2~18アルケニル」)を指す。アルケニル基は、2から8個の炭素原子、2から6個の炭素原子、2から5個の炭素原子、2から4個の炭素原子、または2から3個の炭素原子を有していてもよい。1つまたは複数の炭素-炭素二重結合は、内部(2-ブチルなど)または末端(1-ブテニルなど)とすることができる。アルケニル基の例には、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、ブタジエニル、ペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、オクタトリエニル、および同様のものが含まれる。アルケニル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても(「非置換アルケニル」)または1個または複数の置換基で、例えば1から5個の置換基、1から3個の置換基、または1個の置換基で置換されても(「置換アルケニル」)よい。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、2から18個の炭素原子、および1つまたは複数の炭素-炭素三重結合を有する、1価の直鎖または分岐状炭化水素基(「C2~18アルキニル」)を指す。アルキニル基は、2から8個の炭素原子、2から6個の炭素原子、2から5個の炭素原子、2から4個の炭素原子、または2から3個の炭素原子を有していてもよい。1つまたは複数の炭素-炭素三重結合は、内部(2-ブチニルなど)または末端(1-ブチニルなど)とすることができる。アルキニル基の例には、エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、および同様のものが含まれる。アルキニル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても(「非置換アルキニル」)または1個または複数の置換基で、例えば1から5個の置換基、1から3個の置換基、または1個の置換基で置換されても(「置換アルキニル」)よい。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、非環式の安定な直鎖ま
たは分岐鎖、またはこれらの組合せであって、少なくとも1個の炭素原子と、O、N、P、Si、およびSからなる群より選択される少なくとも1個のヘテロ原子とを含み、窒素および硫黄原子が必要に応じて酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が必要に応じて第四級化されていてもよいものを指す。ヘテロ原子(複数可)O、N、P、S、およびSiは、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置されてもよい。
たは分岐鎖、またはこれらの組合せであって、少なくとも1個の炭素原子と、O、N、P、Si、およびSからなる群より選択される少なくとも1個のヘテロ原子とを含み、窒素および硫黄原子が必要に応じて酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が必要に応じて第四級化されていてもよいものを指す。ヘテロ原子(複数可)O、N、P、S、およびSiは、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置されてもよい。
「アルキレン」、「アルケニレン」、「アルキニレン」、または「ヘテロアルキレン」という用語は、単独でまたは別の置換基の部分として、他に指示しない限り、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはヘテロアルキルからそれぞれ誘導された2価のラジカルを意味する。「アルケニレン」という用語は、それ自体または別の置換基の部分として、他に指示しない限り、アルケンから誘導された2価のラジカルを意味する。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、またはヘテロアルキレン基は、例えば、C1~6員アルキレン、C1~6員アルケニレン、C1~6員アルキニレン、またはC1~6員ヘテロアルキレンと記述されてもよく、「員」という用語は、その部分における非水素原子を指す。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は、鎖末端のいずれかまたはその両方を占有することもできる(例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、および同様のもの)。さらになお、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の式が書かれる方向によって連結基の配向は示唆されない。例えば、式-C(O)2R’-は、-C(O)2R’-および-R’C(O)2-の両方を表してもよい。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、またはヘテロアルキレン基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても(「非置換アルキレン」)または1個または複数の置換基で置換されても(「置換ヘテロアルキレン」)よい。
本明細書で使用される場合、「置換アルキル」、「置換アルケニル」、「置換アルキニル」、「置換ヘテロアルキル」、「置換ヘテロアルケニル」、「置換ヘテロアルキニル」、「置換シクロアルキル」、「置換ヘテロシクリル」、「置換アリール」、および「置換ヘテロアリール」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール部分をそれぞれ指し、その部分の1個または複数の炭素またはヘテロ原子上の1個または複数の水素原子を置き換える置換基を有するものである。そのような置換基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含むことができる。シクロアルキルは、例えば上述の置換基でさらに置換することができる。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、式-O-アルキルの基を指す。「アルコキシ」または「アルコキシル」という用語は、酸素原子に共有結合で連結された置換または非置換アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基またはアルコキシルラジカルの例には、限定するものではないがメトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が含まれる。置換アルコ
キシ基の例には、ハロゲン化アルコキシ基が含まれる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの基で置換することができる。ハロゲン置換アルコキシ基の例には、限定するものではないがフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、およびトリクロロメトキシが含まれる。
キシ基の例には、ハロゲン化アルコキシ基が含まれる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの基で置換することができる。ハロゲン置換アルコキシ基の例には、限定するものではないがフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、およびトリクロロメトキシが含まれる。
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、その全ての環原子が炭素でありかつ置換されても置換されなくてもよい、単環式または多環式であってもよい安定な芳香族環系を指す。芳香族環系は、例えば3~7個の環原子を有していてもよい。例には、フェニル、ベンジル、ナフチル、アントラシル、および同様のものが含まれる。アリール基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち置換されなくても(「非置換アリール」)または1個または複数の置換基で置換されても(「置換アリール」)よい。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、1個または複数の環ヘテロ原子を含むアリール基を指す。例えば、ヘテロアリールは、炭素原子と、窒素、酸素、および硫黄からなる群より独立して選択される1個または複数のヘテロ原子とからなる安定な5-、6-、または7員単環式、または7-、8-、または9員二環式芳香族複素環式環を含むことができる。窒素原子は、置換されても置換されなくてもよい(例えば、NまたはNR4であり、式中、R4は、定義されるようにHまたはその他の置換基である)。ヘテロアリール基の例には、ピロール、フラン、インドール、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、および同様のものが含まれる。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキレン」、「ヘテロシクリレン」、「アリーレン」、および「ヘテロアリーレン」という用語は、単独でまたは別の置換基の部分として、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからそれぞれ誘導された2価のラジカルを意味する。シクロアルキレン、ヘテロシクリレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンのそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても(「非置換アリーレン」)または1個または複数の置換基で置換されても(「置換ヘテロアリーレン」)よい。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、非芳香族環式炭化水素環、例えばその環構造内に3から8個の炭素原子を有する炭化水素環を含むものとする。シクロアルキルは、シクロブチル、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、および同様のものを含むことができる。シクロアルキル基は、単環式(「単環式シクロアルキル」)であってもよく、または二環式系(「二環式シクロアルキル」)などの縮合、架橋、もしくはスピロ環系を含有していてもよく、飽和され得るかまたは部分的に不飽和にされ得る。「シクロアルキル」は、上記定義されたシクロアルキル環が1個または複数
のアリール基と縮合された環系であって、付着点がシクロアルキル環上にあり、そのような場合には炭素の数が、シクロアルキル環系内の炭素の数を示し続けるものも含む。シクロアルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても(「非置換シクロアルキル」)または1個または複数の置換基で置換されても(「置換シクロアルキル」)よい。
のアリール基と縮合された環系であって、付着点がシクロアルキル環上にあり、そのような場合には炭素の数が、シクロアルキル環系内の炭素の数を示し続けるものも含む。シクロアルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されなくても(「非置換シクロアルキル」)または1個または複数の置換基で置換されても(「置換シクロアルキル」)よい。
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」という用語は、1個または複数の環内に(即ち、複素環式環のラジカル)、少なくとも2個の異なる元素の原子を含む、1価の環式分子構造を指す。複素環式環が有機化学の分野で十分に確立された用語である証拠として、Oxford Dictionary of Biochemistry and
Molecular Biology, Oxford University Press, Oxford, 1997をさらに参照されたい。
Molecular Biology, Oxford University Press, Oxford, 1997をさらに参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ジペプチド」という用語は、-A1-A2-と本明細書で示され得る2個のアミノ酸残基から構成されるペプチドを指す。例えば、本開示のプロテアーゼ切断可能リンカー-ペイロードコンジュゲートの合成で用いられるジペプチドは、Val-Cit、Phe-Lys、Trp-Lys、Asp-Lys、Val-Lys、およびVal-Alaからなる群より選択されてもよい。
本明細書で使用される場合、「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、F、Cl、Br、またはIを指す。
アリールまたはヘテロアリール芳香族環は、1つまたは複数の環位置で、上述のような置換基、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分で置換することができる。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」という用語は、式-OHの基を指す。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル」という用語は、ヒドロキシルラジカル(.OH)を指す。
本明細書で使用される場合、「オキソ」という用語は、炭素または別の元素に二重結合された酸素(即ち、=O)を指す。
本明細書で使用される場合、句「必要に応じて置換された」は、非置換または置換を意味する。一般に、「置換された」という用語は、基(例えば、炭素または窒素原子)上に存在する少なくとも1個の水素が、許容される置換基、例えば置換後に安定な化合物をもたらす置換基で、置き換えられることを意味する。「置換された」という用語は、安定な化合物の形成をもたらす本明細書に記述される置換基のいずれかなど、有機化合物の全て
の許容される置換基で置換を含むことができる。本開示の目的のため、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の価数を満たしかつ安定な部分の形成をもたらす水素置換基および/または本明細書に記述される任意の適切な置換基を有していてもよい。
の許容される置換基で置換を含むことができる。本開示の目的のため、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の価数を満たしかつ安定な部分の形成をもたらす水素置換基および/または本明細書に記述される任意の適切な置換基を有していてもよい。
本明細書で使用される場合、「標的化リガンド」は、ナノ粒子に結合し、かつ典型的には腫瘍またはがん細胞に結合することによって(例えば、腫瘍またはがん細胞の表面に発現したタンパク質に結合することによって)ナノ粒子を腫瘍またはがん細胞に標的化することができる分子である。標的化リガンドは、小さい有機分子(例えば、葉酸塩または葉酸類似体)、抗体の抗原結合部分(例えば、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、scFv断片、Fv断片、dsFvダイアボディ(diabody)、dAb断片、Fd’断片、Fd断片、または単離された相補的決定領域(CDR)領域)、抗体模倣体(antibody mimetic)(例えば、アプタマー、アフィボディ(affibody)、アフィリン(affilin)、アフィマー(affimer)、アンチカリン(anticalin)、アビマー(avimer)、ダルピン(Darpin)、および同様のもの)、受容体の結合ドメイン、核酸、脂質、および同様のものなどの任意の適切な分子とすることができる。
さらに、本明細書に記述される合成方法は様々な保護基を利用することが、当業者に理解されよう。本明細書で使用される場合、「保護基」という用語は、特定の官能性部分、例えば、反応を多官能性化合物の別の反応性部位で選択的に実施することができるように一時的に遮断されるO、S、またはNを指す。保護基は、当業者に公知の方法を使用して、化合物の合成の適切な段階で導入され除去されてもよい。保護基は、文献に記述される有機合成の標準的な方法に従い適用される(保護基に関して参照により組み込まれる、Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts (2007) Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th edition, John Wiley and Sons)。
例示的な保護基には、限定するものではないが酸素、硫黄、窒素、および炭素保護基が含まれる。例えば、酸素保護基には、限定するものではないがメチルエーテル、置換メチルエーテル(例えば、MOM(メトキシメチルエーテル)、MTM(メチルチオメチルエーテル)、BOM(ベンジルオキシメチルエーテル)、PMBM(ピメトキシベンジルオキシメチルエーテル)、必要に応じて置換されたエチルエーテル、必要に応じて置換されたベンジルエーテル、シリルエーテル(例えば、TMS(トリメチルシリルエーテル)、TES(トリエチルシリルエーテル)、TIPS(トリイソプロピルシリルエーテル)、TBDMS(t-ブチルジメチルシリルエーテル)、トリベンジルシリルエーテル、TBDPS(t-ブチルジフェニルシリルエーテル)、エステル(例えば、ホルメート、アセテート、ベンゾエート(Bz)、トリフルオロアセテート、ジクロロアセテート)カーボネート、環式アセタール、およびケタールが含まれる。さらに、窒素保護基には、限定するものではないがカルバメート(メチル、エチル、および置換エチルカルバメート(例えば、Troc)を含む)、アミド、環式イミド誘導体、N-アルキルおよびN-アリールアミン、イミン誘導体、およびエナミン誘導体などが含まれる。アミノ保護基には、限定するものではないがフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)、カルボキシベンジル(Cbz)、アセトアミド、トリフルオロアセトアミドなどが含まれる。ある特定のその他の例示的な保護基について本明細書で詳述するが、本開示は、これらの保護基に限定するものではなく;むしろ当業者に公知の方法により様々な追加の均等な保護基が利用され得ることが理解されよう。
本開示の全体を通して、ナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)は時々、CDC(C’ドット-薬物-コンジュゲート)、例えばFA-CDC、または単に官能化ナノ粒子と呼んでもよい。
ナノ粒子
本明細書に開示される方法は、任意の適切なナノ粒子を官能化するのに使用されてもよい。例えば、シリカナノ粒子は、本明細書に開示される方法を使用して、官能化することができる(シリカから部分的に構成される、またはシリカから完全に構成されるナノ粒子を含む)。ナノ粒子は、約0.5nmから約100nm、例えば約0.1nmから約50nm、約0.5nmから約25nm、約1nmから約20nm、約0.8nmから約15nm、約1nmから約10nm、または約1nmから約8nm、例えば約1nm、約2nm、約3nm、約4nm、約5nm、約6nm、約7nm、約8nm、約9nm、約10nm、約11nm、または約12nmの直径を有することができる。
本明細書に開示される方法は、任意の適切なナノ粒子を官能化するのに使用されてもよい。例えば、シリカナノ粒子は、本明細書に開示される方法を使用して、官能化することができる(シリカから部分的に構成される、またはシリカから完全に構成されるナノ粒子を含む)。ナノ粒子は、約0.5nmから約100nm、例えば約0.1nmから約50nm、約0.5nmから約25nm、約1nmから約20nm、約0.8nmから約15nm、約1nmから約10nm、または約1nmから約8nm、例えば約1nm、約2nm、約3nm、約4nm、約5nm、約6nm、約7nm、約8nm、約9nm、約10nm、約11nm、または約12nmの直径を有することができる。
ナノ粒子は、シェルによって取り囲まれたコアを含んでいてもよい(即ち、コア-シェルナノ粒子)。あるいはナノ粒子は、コアのみを有してシェルがなくてもよい。ナノ粒子は、シラン部分、例えばシリカ表面に対して反応性のある材料を含んでいてもよい(例えば、その表面に)。ナノ材料のシェルは、シラン部分、例えばシリカシェルに対して反応性のある材料であってもよい。本明細書に開示される方法は、シリカ系コアおよびコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカ系シェルを含むシリカナノ粒子(コア-シェルシリカナノ粒子)を修飾するのに使用することができる。ナノ粒子は、非メソポーラスナノ粒子(例えば、非メソポーラスコア-シェルナノ粒子)、例えば非メソポーラスシリカナノ粒子(例えば、非メソポーラスコア-シェルシリカナノ粒子)であってもよい。
ナノ粒子は、その表面に有機ポリマーコーティングを含んでいてもよい。ナノ粒子に付着され得る有機ポリマーには、限定するものではないがポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸(PGA)、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、ポリ酢酸ビニル(PVA)、およびこれらの組合せが含まれる。例えば、ナノ粒子は、表面に付着されたポリエチレングリコール(PEG)分子の層を有していてもよい。ある特定の有機ポリマーコーティングは、生体系に適した性質など、有利な性質を持つナノ粒子を提供することができる。例えば、動物(例えば、ヒト)へのPEGコーティングを含むナノ粒子の投与の後、PEG基は、ナノ粒子への血清タンパク質の吸着を防止してもよく、効率的な尿排泄を容易にしてもよく、ナノ粒子の凝集を減少させてもよい(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Burns et al. ”Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine”, Nano Letters
(2009) 9(1):442-448参照)。
(2009) 9(1):442-448参照)。
ナノ粒子のシェルは、ある範囲の層を有していてもよい。例えば、シェルは、約1から約20層、約1から約15層、約1から約10層、または約1から約5層を含んでいてもよい。例えば、シェルは、約1から約3層を含んでいてもよい。シェルの厚さは、約0.5nmから約90nm、例えば約1nmから約40nm、約1nmから約20nm、約1nmから約10nm、または約1nmから約5nmに及んでもよい。例えば、シェルの厚さは、約1nmから約2nmであってもよい。ナノ粒子のシェルは、ナノ粒子の一部分のみまたは粒子全体を覆ってもよい。例えば、シェルは、ナノ粒子の約1から約100パーセント、約10から約80パーセント、約20から約60パーセント、または約30から約50パーセントを覆ってもよい。ナノ粒子のシェルはシリカを含むことができ、および/またはテトラアルキルオルトシリケート(例えばテトラエチルオルトシリケート(TEOS))などのシリカの形成化合物の反応生成物であってもよい。
ナノ粒子(例えば、ナノ粒子コアおよび/またはシェル)は、実質的に非多孔質、メソポーラス、半多孔質、または多孔質とすることができる。ナノ粒子は、非細孔表面(no
n-pore surface)および細孔表面(pore surface)を含んでいてもよい。細孔表面は、内面と呼んでもよい。ナノ粒子は、非細孔表面(または非多孔質表面)を有していてもよい。非細孔表面は、本明細書では、外側ナノ粒子表面と呼んでもよい。ナノ粒子の細孔表面(例えば、細孔表面の少なくとも一部分)および/または非細孔表面(例えば、非細孔表面の少なくとも一部分)は、官能化することができる。上述のように、ナノ粒子および/またはナノ粒子のシェルは、非メソポーラスであってもよい。
n-pore surface)および細孔表面(pore surface)を含んでいてもよい。細孔表面は、内面と呼んでもよい。ナノ粒子は、非細孔表面(または非多孔質表面)を有していてもよい。非細孔表面は、本明細書では、外側ナノ粒子表面と呼んでもよい。ナノ粒子の細孔表面(例えば、細孔表面の少なくとも一部分)および/または非細孔表面(例えば、非細孔表面の少なくとも一部分)は、官能化することができる。上述のように、ナノ粒子および/またはナノ粒子のシェルは、非メソポーラスであってもよい。
ナノ粒子は、蛍光化合物などの色素を含有していてもよい。色素は、ナノ粒子コア内に含有され得る。例えば、ナノ粒子は、ナノ粒子内に共有結合で被包された色素を含有してもよい。シリカナノ粒子の色素は、反応性色素(例えば、蛍光化合物)と共反応性(co-reactive)有機シラン化合物との反応生成物であってもよい。シリカナノ粒子は、反応性色素化合物と共反応性有機シラン化合物との反応生成物、およびシランを含有していてもよい。
ナノ粒子は、任意の公知の蛍光化合物、例えば蛍光有機化合物、色素、顔料、またはこれらの組合せを組み込んでもよい。そのような蛍光化合物は、シリカナノ粒子のコアのシリカマトリクス中に組み込むことができる。広く様々な適切な化学反応性蛍光色素/フルオロフォアが公知であり、例えば、Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th ed., R. P. Haugland, ed. (1996)を参照されたい。蛍光化合物は、ナノ粒子のコア内に、共有結合により被包されてもよい。
蛍光化合物は、限定するものではないが、遊離蛍光色素よりもさらに大きい輝度および蛍光量子収量を提供することができる、ナノ粒子のコア内に位置決めされた近赤外蛍光(NIRF)色素とすることができる。近赤外放出プローブは、低下した組織減衰および自己蛍光を示すことが周知である(上記Burns et al.)。本開示で使用され得る(例えば、NDCにより被包される)蛍光化合物には、限定するものではないがCy5、Cy5.5(Cy5++としても公知である)、Cy2、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、フィコエリスリン、Cy7、フルオレセイン(FAM)、Cy3、Cy3.5(Cy3++としても公知である)、Texas Red(スルホローダミン101酸塩化物)、LIGHTCYCLER(登録商標)-Red 640、LIGHTCYCLER(登録商標)-Red 705、テトラメチルローダミン(TMR)、ローダミン、ローダミン誘導体(ROX)、ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、ローダミン6G(R6G)、ローダミン誘導体JA133、Alexa蛍光色素(例えば、ALEXA FLUOR(登録商標)488、ALEXA FLUOR(登録商標)546、ALEXA FLUOR(登録商標)633、ALEXA FLUOR(登録商標)555、およびALEXA FLUOR(登録商標)647)、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ヨウ化プロピジウム、アミノメチルクマリン(AMCA)、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムアクア、LISSAMINE(商標)、および蛍光遷移金属錯体、例えばユーロピウムが含まれる。使用することができる蛍光化合物には、蛍光タンパク質、例えばGFP(緑色蛍光タンパク質)、増強型GFP(EGFP)、青色蛍光タンパク質および誘導体(BFP、EBFP、EBFP2、アズライト、mKalama1)、シアン蛍光タンパク質および誘導体(CFP、ECFP、Cerulean、CyPet)、ならびに黄色蛍光タンパク質および誘導体(YFP、Citrine、Venus、YPet)も含まれる(WO 2008/142571、WO 2009/056282、WO 1999/22026)。好ましい態様では、蛍光化合物がCy5である。
ナノ粒子は:(1)マレイミド、ヨードアセトアミド、チオスルフェート、アミン、N-ヒドロキシスクシミドエステル、4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル(STP)エステル、スルホスクシニミジルエステル、スルホジクロロフェノールエステル、塩化スルホニル、ヒドロキシル、イソチオシアネート、カルボキシルを含むがこれらに限定されない反応性部分を持つ反応性蛍光色素(例えば、Cy5)などの蛍光化合物と、共反応性有機シラン化合物などの有機シラン化合物とを、共有結合によりコンジュゲートして蛍光シリカ前駆体を形成し、蛍光シリカ前駆体を反応させて、蛍光コアを形成するステップ;または(2)蛍光シリカ前駆体と、テトラアルコキシシランなどのシリカ形成化合物とを反応させて蛍光コアを形成し、得られたコアと、テトラアルコキシシランなどのシリカ形成化合物とを反応させて、コア上にシリカシェルを形成することにより、蛍光ナノ粒子を提供するステップによって、合成されてもよい。
蛍光シリカ系ナノ粒子は、当技術分野で公知であり、参照によりその内容全体が本明細書にそれぞれ組み込まれる米国特許第8,298,677号;第9,625,456号;第10,548,997号;第9,999,694号;第10,039,847号;および第10,548,998号に記載されている。
本明細書に開示される方法によって官能化されたナノ粒子は、シリカ系コアとコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含むナノ粒子、ならびにナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール(PEG)を含んでいてもよい。ナノ粒子は、ナノ粒子のコア内に共有結合により被包された蛍光化合物を有していてもよい。例えば、C’ドットとも呼ばれる超小型PEG化シリカナノ粒子は、本明細書に開示される方法を使用して官能化することができる。C’ドットは、既に記述されたように調製することができる(例えば、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、Ma, K. et al. Chemistry of Materials (2015) 27(11):4119-4133参照)。本明細書に記述される方法で使用されるナノ粒子は、Ma, K. et al. Chem. Mater. (2013), 25:677-691; Ma, K. et al. Chem. Mater. (2016) 28:1537-1545; Ma, K. et al. Chem. Mater. (2017) 29:6840-6855; WO 2016/179260;およびWO 2018/213851に記載されるように調製されてもよい。各C’ドットは、近赤外蛍光Cy5色素が共有結合により被包されるPEG化シリカ粒子(直径約6nm)を含む。
ナノ粒子を官能化する方法
本明細書に開示される方法を使用して、ナノ粒子の表面に1個または複数の官能基を組み込むようにナノ粒子を修飾することができ、これをさらに修飾してもよい(例えば、分子に官能基をコンジュゲートすることによって)。例えば、シラン(例えば、シラノール基)に反応性のあるナノ粒子の表面の材料を、シラン基および別の官能基を含む二官能性前駆体などの本明細書に開示される二官能性前駆体と反応させて、別の官能基をナノ粒子表面に付着することができる。シラン基に反応性のある材料は、ナノ粒子の有機ポリマー層コーティングの下(例えば、PEG層の下)にあってもよく、二官能性前駆体は、有機ポリマー分子の間隙空間に挿入され、ナノ粒子表面の材料と反応してもよい。
本明細書に開示される方法を使用して、ナノ粒子の表面に1個または複数の官能基を組み込むようにナノ粒子を修飾することができ、これをさらに修飾してもよい(例えば、分子に官能基をコンジュゲートすることによって)。例えば、シラン(例えば、シラノール基)に反応性のあるナノ粒子の表面の材料を、シラン基および別の官能基を含む二官能性前駆体などの本明細書に開示される二官能性前駆体と反応させて、別の官能基をナノ粒子表面に付着することができる。シラン基に反応性のある材料は、ナノ粒子の有機ポリマー層コーティングの下(例えば、PEG層の下)にあってもよく、二官能性前駆体は、有機ポリマー分子の間隙空間に挿入され、ナノ粒子表面の材料と反応してもよい。
本明細書に開示される方法を使用して、ナノ粒子を1つまたは複数のアルキン部分で官能化することができ、これをさらに、アルキン反応性基(例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)を含む化合物でコンジュゲートすることができる。したがって本明細書に開示される方法は、特定の使用のために、例えば標的化がん治療で使用するために、ナノ粒子の官能化を可能にすることができる。例えば、アルキン反応性基を含む
化合物は、特定の生物学的標的(例えばがん細胞、例えばがん細胞によって発現された受容体)を標的とする(例えば、親和性を有する)ことができる部分を含んでもよい。例えば、分子は、ある特定の受容体に結合する化合物、例えば葉酸またはその誘導体など、葉酸受容体に結合する化合物などの標的化リガンドであってもよい。したがって本明細書に開示される方法は、がん細胞を標的とするのに適したナノ粒子を官能化するのに使用することができる。アルキン反応性基を含む化合物は、細胞毒性化合物であってもよく、切断可能リンカーを含むことができ、したがって細胞毒性化合物は、リンカーの切断後に生体系内(例えば、がん細胞内)で放出され得る。ペイロードは、小分子化学治療薬などの細胞毒性薬、例えばエキサテカンまたはその誘導体とすることができ、リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカーとすることができる。例えば、本明細書に開示される方法を使用して作製されたエキサテカンペイロードおよび葉酸標的化リガンドを含む例示的なナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)を、図1に示す。
化合物は、特定の生物学的標的(例えばがん細胞、例えばがん細胞によって発現された受容体)を標的とする(例えば、親和性を有する)ことができる部分を含んでもよい。例えば、分子は、ある特定の受容体に結合する化合物、例えば葉酸またはその誘導体など、葉酸受容体に結合する化合物などの標的化リガンドであってもよい。したがって本明細書に開示される方法は、がん細胞を標的とするのに適したナノ粒子を官能化するのに使用することができる。アルキン反応性基を含む化合物は、細胞毒性化合物であってもよく、切断可能リンカーを含むことができ、したがって細胞毒性化合物は、リンカーの切断後に生体系内(例えば、がん細胞内)で放出され得る。ペイロードは、小分子化学治療薬などの細胞毒性薬、例えばエキサテカンまたはその誘導体とすることができ、リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカーとすることができる。例えば、本明細書に開示される方法を使用して作製されたエキサテカンペイロードおよび葉酸標的化リガンドを含む例示的なナノ粒子薬物コンジュゲート(NDC)を、図1に示す。
本明細書に開示される方法は、有機ポリマーでコーティングされたナノ粒子を官能化するのに使用することができる。例えば、本明細書に記述される方法は、ナノ粒子がポリエチレングリコールでコーティングされた後(PEG化後)に実施されてもよい。このことは、反応最適化の必要性を低減させ、合成プロトコールおよびナノ粒子そのものの両方に必要とされる変更を最小限に抑え(例えば、本明細書に開示される方法を実施する前にナノ粒子の表面化学を最適化するのに変更を必要としない)、このことは、ナノ粒子官能化に関する従来の方法よりも効率的である。従来のナノ粒子官能化手法を使用して、通常は、官能基を、有機ポリマーコーティング(例えば、PEG)を有するナノ粒子に導入するのは可能ではないか、または非常に非効率的である。それは部分的には、前駆体分子をナノ粒子表面にコンジュゲートするのを防止する有機ポリマーの立体障害に起因するからであり、これらの従来の方法は、典型的には、低い収率を提供しまたは任意の官能化ナノ粒子を提供することができない。ナノ粒子を官能化するためのこれらの課題を回避する典型的な方法は、有機ポリマーコーティング分子の添加と同時に、前駆体分子(所望の官能基を含有する)をナノ粒子の表面に導入することである。しかしながらこの手法には、予測不能な反応動態(例えば、前駆体分子の官能基とナノ粒子表面との間の引力または反発力に起因する)、合成中にナノ粒子の有機ポリマー層に「埋め込まれる」ようになる官能基、および合成中に部分的にコーティングされたナノ粒子の凝集などの著しい欠点があり、そのそれぞれは、ナノ粒子の低い収率および最適以下の官能化をもたらす。このことは、荷電表面を保有するシリカナノ粒子を使用したときの特定の課題であり、望ましくない分子間相互作用を悪化させかつ予測不能な方法で反応動態に影響を及ぼす可能性がある。本明細書に開示される方法は、これらの問題を克服することができる。
さらに、本明細書に開示される方法は、DBCOなどの嵩高い分子を、有機ポリマーコーティング(例えば、PEG層)により立体的に障害されたナノ粒子の表面にどのように付着するのかの問題に対する解決策を提供する。ある特定の分子、特に、より大きいサイズおよび立体障害を有する分子は、ナノ粒子の表面へのアクセスを制限しており、より低い反応性をもたらしかつナノ粒子表面への分子の付着を妨げる。例えば、DBCO-PEG-シラン前駆体が反応混合物中で比較的高い比にある場合であっても、DBCO-PEG-シランを二官能性前駆体として使用するときに2個のDBCO基しかナノ粒子に付着できない(例えば、実施例1および図2参照)。
開示された方法は、2ステップ反応シーケンスを含むことができ、比較的高い拡散係数を有する小さい第1の二官能性前駆体(例えば、シラン基を含む前駆体)は、最初にナノ粒子表面に結合され、次いで引き続き、別の化合物、例えば追加の二官能性前駆体(複数可)により修飾される。例えば、シラン部分および別の反応性基(例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、ニトロン、酸化ニトリル、またはアルキン)を含む、小さい二官能性前駆体は、ナノ粒子表面とシラン基との間の反応に適した
条件下、シラン基に対して反応性のある表面を含むナノ粒子の溶液に添加することができ、それによって、別の反応性基で官能化されたナノ粒子が提供される。
条件下、シラン基に対して反応性のある表面を含むナノ粒子の溶液に添加することができ、それによって、別の反応性基で官能化されたナノ粒子が提供される。
シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件は、ナノ粒子と第1の二官能性前駆体とを水性反応媒体(例えば、実質的に水である反応媒体)中で組み合わせることを含んでいてもよい。反応媒体は、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはアセトニトリルなどの非プロトン有機溶媒を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、20v/v%以下の非プロトン溶媒、例えば18v/v%未満、16v/v%未満、14v/v%未満、12v/v%未満、10v/v%未満、8v/v%未満、6v/v%未満、4v/v%未満、2v/v%未満、または1v/v%未満の非プロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、アルコール(例えば、tert-ブタノール)などのプロトン有機溶媒を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、20v/v%以下のプロトン溶媒、例えば18v/v%未満、16v/v%未満、14v/v%未満、12v/v%未満、10v/v%未満、8v/v%未満、6v/v%未満、4v/v%未満、2v/v%未満、または1v/v%未満のプロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、リン酸緩衝食塩水(PBS)などの緩衝液(例えば、水性緩衝液)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、緩衝液(例えば、PBSなどの水性緩衝液)を、約1×から約5×の間、例えば約1×、約2×、約3×、約4×、または約5×の最終濃度で含んでいてもよい。反応媒体は、有機溶媒を実質的に含まなくてもよい(例えば、有機プロトン溶媒を実質的に含まない、非プロトン溶媒を実質的に含まない、またはいかなる有機溶媒も実質的に含まない)。反応媒体は、緩衝液を実質的に含まなくてもよい。反応媒体は、実質的に水であってもよい。
シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件は、ナノ粒子と第1の二官能性前駆体とを反応媒体中で、ある特定の期間にわたり、例えば約1分から約60分の間、約0.5時間から約24時間の間、約0.5時間から約18時間の間、約0.5時間から約12時間の間、約0.5時間から約6時間の間、約0.5時間から約4時間の間、約0.5時間から約3時間の間、約0.5時間から約2時間の間、約0.5時間から約1時間の間、または約1時間から約48時間の間で組み合わせることを含んでいてもよい。例えば、条件は、反応媒体を一晩、保持することを含んでいてもよい。
シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件は、ナノ粒子と第1の二官能性前駆体とを反応媒体中で組み合わせ、反応媒体を、例えば約20℃またはそれよりも高い温度、例えば約35℃またはそれよりも高い、約40℃またはそれよりも高い、約45℃またはそれよりも高い、約50℃またはそれよりも高い、約60℃またはそれよりも高い、約70℃またはそれよりも高い、約80℃またはそれよりも高い、約90℃またはそれよりも高い、約100℃またはそれよりも高い、約110℃またはそれよりも高い、または120℃またはそれよりも高い、例えば約20℃から約60℃の間、約40℃から約80℃の間、約60℃から約100℃の間、約20℃から約40℃の間、約30℃から約50℃の間、約40℃から約60℃の間、約50℃から約70℃の間、約60℃から約80℃の間、約70℃から約90℃の間、約80℃から約100℃の間、または約90℃から約110℃の間の温度に加熱することを含んでいてもよい。条件は、ナノ粒子および第1の二官能性前駆体を室温で維持することを含んでいてもよい。シラン部分とナノ粒子表面との間の反応に適した条件は、撹拌、振盪、またはその他の混合方法の反応媒体への適用を含んでいてもよい。
第1の二官能性前駆体は、ナノ粒子表面に反応性のある任意の適切なシラン含有化合物とすることができ、さらなる修飾に、例えば第1の二官能性前駆体をナノ粒子に付着した後に利用可能である官能基を含んでいてもよい。官能基は、ナノ粒子に対して反応性ではない、および/またはシランに対して反応性ではない基であってもよい。第1の二官能性前駆体は、シラン基が一端にありかつ別の官能基(例えば、ジエン、アミン、チオール、
ヒドロキシル、アジド、アルケン、ニトロン、酸化ニトリル、またはアルキン)が他端にあるアルキレン基(例えば、C1~C6アルキレン基)を含んでいてもよい。第1の二官能性前駆体は、シラン基が一端にありかつ別の官能基(例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、ニトロン、酸化ニトリル、またはアルキン)が他端にあるヘテロアルキレン基(例えば、C1~C6ヘテロアルキレン基)を含んでいてもよい。第1の二官能性前駆体は、シラン基が一端にありかつジエン基、例えば環式ジエニル基(例えば、シクロペンタジエニル基)が他端にあるアルキレン基(例えば、C1~C6アルキレン基)を含むことができる。任意の適切なジエン基が使用されてもよい。例えば、Diels-Alder(またはHetero-Diels Alder)付加環化を受けるのに適した任意のジエンが使用されてもよい。第1の二官能性前駆体中に存在し得るジエンの例には、限定するものではないがシクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、ブタジエン、およびこれらの誘導体が含まれる。また、例えば別の実体との反応によって修飾が可能なその他の部分は、第1の二官能性前駆体上に存在してもよく、方法は、Diels-Alder付加環化の使用に限定されない(例えば、その他の付加環化、またはその他の結合形成反応、例えば本明細書に記述される別の結合形成反応を、使用することができる)。
ヒドロキシル、アジド、アルケン、ニトロン、酸化ニトリル、またはアルキン)が他端にあるアルキレン基(例えば、C1~C6アルキレン基)を含んでいてもよい。第1の二官能性前駆体は、シラン基が一端にありかつ別の官能基(例えば、ジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルケン、ニトロン、酸化ニトリル、またはアルキン)が他端にあるヘテロアルキレン基(例えば、C1~C6ヘテロアルキレン基)を含んでいてもよい。第1の二官能性前駆体は、シラン基が一端にありかつジエン基、例えば環式ジエニル基(例えば、シクロペンタジエニル基)が他端にあるアルキレン基(例えば、C1~C6アルキレン基)を含むことができる。任意の適切なジエン基が使用されてもよい。例えば、Diels-Alder(またはHetero-Diels Alder)付加環化を受けるのに適した任意のジエンが使用されてもよい。第1の二官能性前駆体中に存在し得るジエンの例には、限定するものではないがシクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、ブタジエン、およびこれらの誘導体が含まれる。また、例えば別の実体との反応によって修飾が可能なその他の部分は、第1の二官能性前駆体上に存在してもよく、方法は、Diels-Alder付加環化の使用に限定されない(例えば、その他の付加環化、またはその他の結合形成反応、例えば本明細書に記述される別の結合形成反応を、使用することができる)。
第1の二官能性前駆体は、式(A):
の構造を含むことができ、式中、R1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、-ORA、-NRBRC、-NO2、または-CNであり、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく;各R2は、独立して、水素、アルキル、ハロ、または-ORAであり;RA、RB、およびRCはそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;nは、0から12の整数であり;およびmは、0から5の整数である。例えば、R1は、アルキル、C3-アルケニル、C3-アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、-ORAとすることができ、各アルキル、C3-アルケニル、C3-アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく;各R2は、独立して、水素、アルキル、ハロ、または-ORAであり;RAは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;nは0から12の整数であり;およびmは0から5の整数である。例えば、R2は、-ORAであってもよく、式中、RAは、アルキル(例えば、メチルまたはエチル)であり;nは、1から5の整数(例えば、3)であってもよく;およびmは、0であってもよい。一部の態様では、R2が-OEtであり;nは3であり;およびmは0である。例えば、第1の二官能性前駆体は、式(A-1):
の構造を含むことができる。
第1の二官能性前駆体は、(3-シクロペンタジエニルプロピル)トリエトキシシラン(例えば、実施例3で実証されるように)であってもよく、方法は、1個または複数のシクロペンタジエニル基で官能化されたナノ粒子を提供する。あるいは、第1の二官能性前駆体は、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(例えば、実施例2で実証されるように)であってもよく、方法は、1個または複数のアミン基で官能化されたナノ粒子を提供する。
ナノ粒子と第1の二官能性前駆体とを反応させるステップは、さらに修飾されてもよい、第1の反応性基で官能化されたナノ粒子を提供することができる。例えば、第1の反応性基で官能化されたナノ粒子は、第1の反応性基に対して反応性のある部分を含む第2の二官能性前駆体と接触してもよい。
第1の反応性基で官能化されたナノ粒子と第2の二官能性前駆体とを接触させることは、第1の反応性基と、第1の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した任意の条件下とすることができる。例えば、第1の反応性基と、第1の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、水性反応媒体(例えば、実質的に水である反応媒体)を含むことができる。反応媒体は、リン酸緩衝食塩水(PBS)などの緩衝液(例えば、水性緩衝液)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、約1×から約5×の間、例えば約1×、約2×、約3×、約4×、または約5×の最終濃度の緩衝液(例えば、PBSなどの水性緩衝液)を含んでいてもよい。反応媒体は、非プロトン有機溶媒、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)またはアセトニトリルを含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、20v/v%以下の非プロトン溶媒、例えば18v/v%未満、16v/v%未満、14v/v%未満、12v/v%未満、10v/v%未満、8v/v%未満、6v/v%未満、4v/v%未満、2v/v%未満、または1v/v%未満の非プロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、プロトン有機溶媒、例えばアルコール(例えば、tert-ブタノール)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、20v/v%以下のプロトン溶媒、例えば18v/v%未満、16v/v%未満、14v/v%未満、12v/v%未満、10v/v%未満、8v/v%未満、6v/v%未満、4v/v%未満、2v/v%未満、または1v/v%未満のプロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、有機溶媒を実質的に含まなくてもよい(例えば、有機プロトン溶媒を実質的に含まない、非プロトン溶媒を実質的に含まない、またはいかなる有機溶媒も実質的に含まない)。反応媒体は、実質的に水であってもよい。
第1の反応性基と、第1の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、反応混合物を、ある特定の期間にわたり、例えば約1分から約60分の間、約0.5時間から約24時間の間、約0.5時間から約18時間の間、約0.5時間から約12時間の間、約0.5時間から約6時間の間、約0.5時間から約4時間の間、約0.5時間から約3時間の間、約0.5時間から約2時間の間、約0.5時間から約1時間の間、または約1時間から約48時間の間の期間にわたり、保持することを含むことができる。例えば、反応媒体は一晩保持されてもよい。
第1の反応性基と、第1の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、反応媒体を、例えば約20℃またはそれよりも高い温度に、例えば約35℃またはそれよりも高い、約40℃またはそれよりも高い、約45℃またはそれよりも高い、約50℃またはそれよりも高い、約60℃またはそれよりも高い、約70℃またはそれよりも高い、約80℃またはそれよりも高い、約90℃またはそれよりも高い、約100℃またはそれよりも高い、約110℃またはそれよりも高い、または約120℃またはそれよりも高い、例えば約20℃から約60℃の間、約40℃から約80℃の間、約60℃から約100℃の間、約20℃から約40℃の間、約30℃から約50℃の間、約40℃から約60℃の間、約50℃から約70℃の間、約60℃から約80℃の間、約70℃から約90℃の間、約80℃から約100℃の間、または約90℃から約110℃の間の温度に加熱することを含むことができる。条件は、反応混合物を室温で維持することを含んでいてもよい。第1の反応性基と、第1の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、撹拌、振盪、またはその他の混合方法を反応媒体に適用することを含むこともできる。
第1の反応性基は、ジエン(例えば、シクロペンタジエン)とすることができ、第2の二官能性前駆体は、第1の反応性基に対して反応性のあるジエノフィル(例えば、本明細書に記述されるジエノフィル、例えばマレイミド)を含むことができ、接触は、ジエンとジエノフィルとの間のDiels-Alder付加環化を促進させるのに十分な条件下にあってもよい。
ジエノフィルは、任意の適切なジエノフィル、例えば電子欠乏アルケンを含む部分とすることができる。ジエノフィルは、環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、無水マレイン酸、ジアルキルアセチレンジカルボン酸、またはこれらの任意の誘導体を含んでいてもよい。
ジエンおよびジエノフィルの位置は、それぞれ第1の二官能性前駆体上または第2の二官能性前駆体上のいずれかにすることができることが、理解されよう。言い換えれば、本明細書で例示されたある特定の方法は、ジエンを含む第1の二官能性前駆体およびジエノフィルを含む第2の二官能性前駆体を特徴とするが、これらの方法または前駆体は、第1の二官能性前駆体がジエノフィルを含みかつ第2の二官能性前駆体がジエンを含むように、容易に修飾することができる。さらに、ジエンとジエノフィルとの間の反応は本開示において例示されてきたが、第1の反応性基と第2の二官能性前駆体との間のコンジュゲーションは、任意のその他の適切な共有結合形成反応を含むことができ、これは第1の二官能性前駆体および第2の二官能性前駆体上の基を選択することによって決定することができる。例えば、ナノ粒子を官能化する(例えば、プロセスの任意のステップで)、本明細書に開示される方法は、エーテル化、アミド結合形成、クリックケミストリー、Diels-Alder付加環化、Hetero-Diels-Alder付加環化、1,2-付加、例えばMichael付加、Huisgen付加環化、ニトロン-オレフィン付加環化、3+2付加環化、4+2付加環化、オレフィンメタセシス、またはKolb et al. Angew. Chem. Int. Ed. (2001) 40:2004-2021(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載される任意の反応を、含むことができる。例えば、第2の二官能性前駆体を第1の反応性基を介してナノ粒子にコンジュゲートするのにDiels-Alder反応を使用する代わりに、方法は、第1の反応性基(第1の二官能性前駆体によって導入された)をアミンとすることができるように、および第2の二官能性前駆体がN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基を含むことができるように修飾することができ、第2の二官能性前駆体およびアミン基を含む官能化ナノ粒子は、アミン-エステル反応を促進させかつ第1の反応性基と第2の二官能性前駆体との間に結合を形成するのに十分な条件下で接触させることができる。あるいは、第1の反応性基を介して第2の二官能性前駆体をナノ粒子にコンジュゲートす
るのにDiels-Alder反応を使用する代わりに、クリックケミストリー反応を使用することができ、例えば第1の反応性基(第1の二官能性前駆体により導入された)がアジドまたはアルキンであり、第2の二官能性前駆体がアルキンまたはアジドであり、第2の二官能性前駆体および官能化ナノ粒子は、第1の反応性基と第2の二官能性前駆体との間でクリックケミストリー反応を促進させるのに十分な条件下で、接触することができる。
るのにDiels-Alder反応を使用する代わりに、クリックケミストリー反応を使用することができ、例えば第1の反応性基(第1の二官能性前駆体により導入された)がアジドまたはアルキンであり、第2の二官能性前駆体がアルキンまたはアジドであり、第2の二官能性前駆体および官能化ナノ粒子は、第1の反応性基と第2の二官能性前駆体との間でクリックケミストリー反応を促進させるのに十分な条件下で、接触することができる。
特定の態様では、第1の二官能性前駆体はジエン(例えば、シクロペンタジエン)を含み、第2の二官能性前駆体は、Diels-Alder反応でジエンと反応することができるジエノフィル(例えば、マレイミド)を含み、実施例3で実証されるようにおよびスキーム1にも示されるように、第2の二官能性前駆体をナノ粒子に付着させる(第1の二官能性前駆体を介して)。
第2の二官能性前駆体は、さらに別の反応性基を、例えば第1の反応性基に対して反応性のある部分の反対側にある第2の二官能性前駆体の末端に含んでいてもよい。例えば、第2の二官能性前駆体は、ジエン部分(例えば、ジエノフィル、例えばマレイミド)に対して反応性のある一端に基を含むことができ、かつさらなる修飾に適した他端に別の基を含むことができる。第2の二官能性前駆体上の別の反応性基(官能基と呼ばれることもある)は、アルキン、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリルに対して反応性のある部分であってもよい。反応性基は、クリックケミストリー反応を受けるのに適した部分であってもよい。例えば、反応性基は、アルキン、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリルを含んでいてもよい。アルキンは、歪んだアルキン(strained alkyne)とすることができる。例えば、反応性基は、ジベンゾアザシクロオクチン(DBCO)基またはその誘導体(DIBACと呼ばれることもある)を含んでいてもよい。アルキンは、ジベンゾシクロオクチン基(DIBO)またはその誘導体を含んでいてもよい。アルキンは、末端アルキンであってもよい。あるいは、第2の二官能性前駆体上の反応性基は、コンジュゲーションに適した任意のその他の基、例えばジエン、アミン、チオール、ヒドロキシル、アジド、ニトロン、酸化ニトリル、アルケン、またはアルケンであってもよい。
第2の二官能性前駆体は、2価のリンカー、例えば、アルキレンまたはヘテロアルキレン基を含むこともでき、アルキレンまたはヘテロアルキレン基は、置換されていないかまたは置換されている(例えば、1個または複数のオキソ基で置換されたアルキレンまたはヘテロアルキレン)。2価のリンカーは、PEG基、例えばPEG4を含むことができる。2価のリンカーは、アミド結合、例えば1、2、3、またはそれよりも多くのアミド結合を含むことができる。各アミド結合は、任意の配向にあってもよい。例えば、アミド結合は、PEG基とアルキレン基との間の2価のリンカーに据えられてもよく、アミドのカルボニル基の炭素原子はPEG基の原子に共有結合により付着され、アミドの窒素原子はアルキレン基の原子に共有結合により付着され;またはアミドのカルボニル基の炭素原子はアルキレン基の原子に付着されてもよく、アミド基の窒素原子はPEG基の原子に付着されてもよい。2価のリンカー(例えば、ヘテロアルキレン基)は、一端にジエノフィル部分を、および他端にアルキンを、例えばDBCO基を含んでいてもよい。あるいは、第2の二官能性前駆体は、NHSエステルを一端に持ちかつDBCO基などのアルキンを他端に持つ2価のリンカー(例えば、ヘテロアルキレン基)を含むことができる。2価のリンカーは、PEG基(例えば、PEG4部分)、アミド基、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。
第2の二官能性前駆体は、式(B)
の構造を含むことができ、
式中:Xは、反応性基、例えばジエノフィル(例えば、電子欠乏アルケン基を含む部分;または環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、または無水マレイン酸)であり;Yは、2価のリンカー(例えば、置換または非置換アルキレンまたはヘテロアルキレン基)であり;R3およびR4は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、-ORA、-NRBRC、-NO2、または-CNであり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく;RA、RB、およびRCはそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;qおよびpはそれぞれ独立して、0から4の整数であり;vは、0から2の整数である。例えば、Xはマレイミドであってもよく;qおよびpはそれぞれ独立して0の整数であってもよく;およびvは、1の整数であってもよい。
式中:Xは、反応性基、例えばジエノフィル(例えば、電子欠乏アルケン基を含む部分;または環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、または無水マレイン酸)であり;Yは、2価のリンカー(例えば、置換または非置換アルキレンまたはヘテロアルキレン基)であり;R3およびR4は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、-ORA、-NRBRC、-NO2、または-CNであり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく;RA、RB、およびRCはそれぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;qおよびpはそれぞれ独立して、0から4の整数であり;vは、0から2の整数である。例えば、Xはマレイミドであってもよく;qおよびpはそれぞれ独立して0の整数であってもよく;およびvは、1の整数であってもよい。
2価のリンカーは、式(G):
の構造を含むことができ、
式中、A1、A2、およびA3はそれぞれ独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、-C(O)-、-C(O)N(RB)-、-N(RB)C(O)-、-N(RB)-、-OC(O)-、および-C(O)O-からなる群より選択され;RBは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;k、v、w、およびxはそれぞれ独立して、0から10の整数であり;および各
は独立して、第2の二官能性前駆体の別の部分との付着点を示す。例えば、A1およびA2はそれぞれ独立して、-C(O)N(RB)-であってもよく;A3は-C(O)O-であってもよく;RBのそれぞれの場合は独立して、水素であってもよく;k、v、およびwはそれぞれ独立して、2の整数であってもよく;およびxは、4の整数であってもよい。
式中、A1、A2、およびA3はそれぞれ独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、-C(O)-、-C(O)N(RB)-、-N(RB)C(O)-、-N(RB)-、-OC(O)-、および-C(O)O-からなる群より選択され;RBは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;k、v、w、およびxはそれぞれ独立して、0から10の整数であり;および各
2価のリンカーは、式(C):
の構造を含むことができ、
式中、各RBは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;xは、0から10の整数であり;および各
は独立して、第2の二官能性前駆体の別の部分との付着点を示す(例えば、ジエノフィルとのまたはDBCOの複素環式環の窒素原子との付着)。
式中、各RBは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;xは、0から10の整数であり;および各
2価のリンカーは、式(C’):
の構造を含むことができ、
式中、各RBは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;xは、0から10の整数であり;および各
は独立して、第2の二官能性前駆体の別の部分との付着点を示す(例えば、ジエノフィルとのまたはDBCOの複素環式環の窒素原子との付着)。
式中、各RBは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;xは、0から10の整数であり;および各
2価のリンカーは、式(C”):
の構造を含むことができ、
式中、各RBは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;xは、0から10の整数であり;および各
は独立して、第2の二官能性前駆体の別の部分との付着点を示す(例えば、NHS部分の窒素原子とのまたはDBCOの複素環式環の窒素原子との付着)。
式中、各RBは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり;xは、0から10の整数であり;および各
第2の二官能性前駆体は、式(B-1)
の構造を含んでいてもよく、
式中、xは0から10の整数である(例えば、4)。例えば、xは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であってもよい。好ましい実施形態では、xが4である。
式中、xは0から10の整数である(例えば、4)。例えば、xは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であってもよい。好ましい実施形態では、xが4である。
ジエン部分(例えば、ナノ粒子表面に共有結合により付着されたジエン部分)と第2の二官能性前駆体との反応は、式(NP-1)
の化合物を提供してもよく、
式中、xは0から10の整数であり(例えば、4)、ケイ素原子はナノ粒子の一部である。例えば、xは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であってもよい。好ましい実施形態では、xが4である。
式中、xは0から10の整数であり(例えば、4)、ケイ素原子はナノ粒子の一部である。例えば、xは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であってもよい。好ましい実施形態では、xが4である。
第2の二官能性前駆体(例えば、DBCO含有前駆体、例えばDBCO-マレイミド)と官能化ナノ粒子(例えば、ジエン部分を含むナノ粒子)との間の反応の効率は、第2の二官能性前駆体の拡散係数とは無関係であってもよい。例えば、様々な長さのPEG基を含む本明細書に開示される第2の二官能性前駆体は、PEG長とは無関係に、官能化ナノ粒子と類似の反応性を有していてもよい(例えば、実施例4および図2を参照、様々な長さのPEGを持つDBCO-PEG-マレイミド前駆体を用いることは、反応性に著しい影響を及ぼさなかった)。このことは、他の前駆体(例えば、スキーム3または4に示される前駆体)を含む典型的な方法から逸脱しており、反応効率は、前駆体のサイズまたは分子量によって大きな影響を受ける可能性があるものである。本明細書に開示された二官能性前駆体(例えば、第2の二官能性前駆体)は、シラノール基、例えば別の前駆体上またはナノ粒子上のシラノール基との望ましくない静電的相互作用(例えば、反発力)を回避することができる特定の溶解度または極性を有していてもよい。さらに、本明細書に開示される二官能性前駆体(例えば、第2の二官能性前駆体)は、例えばクリックケミストリー反応を使用した、別の前駆体による後続の修飾に関して改善されたアクセス可能性などの所望の性質を持つ、結果として得られる官能化ナノ粒子を得るために(第2の二官能性前駆体とのコンジュゲーション後)、特定の長さ(例えば、PEGスペーサーに起因して)を有していてもよい。
本明細書に開示された方法は、治療適用などの特定の適用に適したナノ粒子を提供するのに使用されてもよい。例えば、方法は、例えば治療(例えば、がん治療)、外科的ナビゲーション、撮像、診断、またはこれらの組合せで使用するために、生物学的標的を標的
とするのに適したナノ粒子を提供するのに使用することができる。ナノ粒子は、in vivo使用に適切であってもよく、またはex vivoで、例えば分析または診断の適用で使用することができる。本明細書に開示される方法は、生体系の特定の受容体(または受容体の群)を標的とするのに適したナノ粒子を作製するのに使用されてもよい。方法は、ペイロードを1つ(または複数)の生物学的標的に送達するのに適した官能化ナノ粒子(例えば、NDC)を調製するのに使用されてもよい。例えば、本明細書に開示される方法を使用して、ナノ粒子を標的化リガンドにおよびペイロード部分にコンジュゲートすることができる。例えば、本明細書に開示される方法は、例えば図1に示される例示的なNDCなど、標的化がん治療のための葉酸受容体標的化NDCを調製するのに使用することができる。
とするのに適したナノ粒子を提供するのに使用することができる。ナノ粒子は、in vivo使用に適切であってもよく、またはex vivoで、例えば分析または診断の適用で使用することができる。本明細書に開示される方法は、生体系の特定の受容体(または受容体の群)を標的とするのに適したナノ粒子を作製するのに使用されてもよい。方法は、ペイロードを1つ(または複数)の生物学的標的に送達するのに適した官能化ナノ粒子(例えば、NDC)を調製するのに使用されてもよい。例えば、本明細書に開示される方法を使用して、ナノ粒子を標的化リガンドにおよびペイロード部分にコンジュゲートすることができる。例えば、本明細書に開示される方法は、例えば図1に示される例示的なNDCなど、標的化がん治療のための葉酸受容体標的化NDCを調製するのに使用することができる。
ナノ粒子と第2の二官能性前駆体との反応は、分子(例えば、標的化リガンドおよび/またはペイロード)とコンジュゲートするのに適した1個または複数の基を含むナノ粒子を提供することができる。例えば、ナノ粒子と、アルキン基を含む第2の二官能性前駆体との反応は、1個または複数のアルキン基で官能化されたナノ粒子を提供することができ、アルキン基はさらに、アルキン反応性基を含む化合物とコンジュゲートされてもよい。
反応性基を含む任意の所望の化合物は、適切な対応する反応性基で官能化された本明細書に開示されるナノ粒子に付着されてもよい。例えば、アルキン反応性基を含む任意の所望の化合物は、アルキンで官能化されたナノ粒子に付着されてもよい。例えば、ペイロード部分(例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカンを含む)またはリンカー-ペイロードコンジュゲート(アルキン反応性基を含む)を、ナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。あるいは、アルキン反応性基を含む標的化リガンド(例えば、葉酸受容体(FR)標的化リガンド、例えば葉酸)を、ナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。化合物の任意の組合せを、この方法を使用してナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。例えば、標的化リガンドおよびペイロード部分は共に、ナノ粒子にコンジュゲートすることができる。標識(例えば、放射性標識または色素)、ポリマー、および/または高分子などのその他の分子も、この方法を使用してナノ粒子にコンジュゲートすることができる。
例えば、アルキン部分を含むナノ粒子(例えば、本明細書に開示される方法を使用して調製された)は、アルキン反応性基(例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)を含む化合物に、アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件下で接触させることができ、それによって、化合物(例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物)で官能化されたナノ粒子が形成される。
アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件は、任意の適切なクリックケミストリー条件を含んでいてもよい(例えば、Kolb et al. Angew.
Chem. Int. Ed. (2001) 40:2004-2021参照)。例えば、アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応を容易にすることは、アルキン部分を含むナノ粒子と、アルキン反応性基を含む化合物とを、銅触媒(例えば、CuSO4、CuI、CuCl、Cu(OAc)2、CuSO2、CuBr)などの触媒とともに組み合わせることを含んでいてもよい。クリックケミストリー反応をもたらすことが公知のその他の金属触媒、例えばルテニウム触媒を使用してもよい。あるいは、反応は、触媒なしで(即ち、無触媒条件、例えば銅を含まない条件)実施されてもよい。例えば、官能化ナノ粒子上のアルキンは、無触媒クリックケミストリー反応(例えば、歪み促進型付加環化(strain-promoted cycloaddition))に適し得る。例えば、DBCOは、触媒なしでクリックケミストリー反応で使用することができる。
Chem. Int. Ed. (2001) 40:2004-2021参照)。例えば、アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応を容易にすることは、アルキン部分を含むナノ粒子と、アルキン反応性基を含む化合物とを、銅触媒(例えば、CuSO4、CuI、CuCl、Cu(OAc)2、CuSO2、CuBr)などの触媒とともに組み合わせることを含んでいてもよい。クリックケミストリー反応をもたらすことが公知のその他の金属触媒、例えばルテニウム触媒を使用してもよい。あるいは、反応は、触媒なしで(即ち、無触媒条件、例えば銅を含まない条件)実施されてもよい。例えば、官能化ナノ粒子上のアルキンは、無触媒クリックケミストリー反応(例えば、歪み促進型付加環化(strain-promoted cycloaddition))に適し得る。例えば、DBCOは、触媒なしでクリックケミストリー反応で使用することができる。
アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件は、アルキン部分を含むナノ粒子とアルキン反応性基を含む化合物とを水性反応媒体(例えば、実質的に水である反
応媒体)中で組み合わせることを含んでいてもよい。反応媒体は、緩衝液(例えば、水性緩衝液)、例えばリン酸緩衝食塩水(PBS)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、緩衝液(例えば、PBSなどの水性緩衝液)を、約1×から約5×の間の最終濃度、例えば約1×、約2×、約3×、約4×、または約5×で含んでいてもよい。反応媒体は、非プロトン有機溶媒、例えばDMSOまたはアセトニトリル)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、20v/v%以下の非プロトン溶媒、例えば18v/v%未満、16v/v%未満、14v/v%未満、12v/v%未満、10v/v%未満、8v/v%未満、6v/v%未満、4v/v%未満、2v/v%未満、または1v/v%未満の非プロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体はまた、アルコールなどのプロトン有機溶媒、例えばtert-ブタノール)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、20v/v%以下のプロトン溶媒、例えば18v/v%未満、16v/v%未満、14v/v%未満、12v/v%未満、10v/v%未満、8v/v%未満、6v/v%未満、4v/v%未満、2v/v%未満、または1v/v%未満のプロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、有機溶媒を実質的に含まなくてもよい(例えば、有機プロトン溶媒を実質的に含まない、非プロトン溶媒を実質的に含まない、またはいかなる有機溶媒も実質的に含まない)。反応媒体は、実質的に水であってもよい。
応媒体)中で組み合わせることを含んでいてもよい。反応媒体は、緩衝液(例えば、水性緩衝液)、例えばリン酸緩衝食塩水(PBS)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、緩衝液(例えば、PBSなどの水性緩衝液)を、約1×から約5×の間の最終濃度、例えば約1×、約2×、約3×、約4×、または約5×で含んでいてもよい。反応媒体は、非プロトン有機溶媒、例えばDMSOまたはアセトニトリル)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、20v/v%以下の非プロトン溶媒、例えば18v/v%未満、16v/v%未満、14v/v%未満、12v/v%未満、10v/v%未満、8v/v%未満、6v/v%未満、4v/v%未満、2v/v%未満、または1v/v%未満の非プロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体はまた、アルコールなどのプロトン有機溶媒、例えばtert-ブタノール)を含んでいてもよい。例えば、反応媒体は、20v/v%以下のプロトン溶媒、例えば18v/v%未満、16v/v%未満、14v/v%未満、12v/v%未満、10v/v%未満、8v/v%未満、6v/v%未満、4v/v%未満、2v/v%未満、または1v/v%未満のプロトン溶媒を含んでいてもよい。反応媒体は、有機溶媒を実質的に含まなくてもよい(例えば、有機プロトン溶媒を実質的に含まない、非プロトン溶媒を実質的に含まない、またはいかなる有機溶媒も実質的に含まない)。反応媒体は、実質的に水であってもよい。
アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件は、アルキン部分を含むナノ粒子とアルキン反応性基を含む化合物とを、反応媒体中で、ある特定の期間にわたり、例えば約1分から約60分の間、約0.5時間から約24時間の間、約0.5時間から約18時間の間、約0.5時間から約12時間の間、約0.5時間から約6時間の間、約0.5時間から約4時間の間、約0.5時間から約3時間の間、約0.5時間から約2時間の間、約0.5時間から約1時間の間、または約1時間から約48時間の間、組み合わせることを含んでいてもよい。例えば、反応媒体は一晩保持されてもよい。
アルキン部分とアルキン反応性基との間の反応に適した条件は、アルキン部分を含むナノ粒子と、アルキン反応性基を含む化合物とを、反応媒体中で組み合わせること、および反応媒体を、例えば約20℃またはそれよりも高い温度、例えば約35℃またはそれよりも高い、約40℃またはそれよりも高い、約45℃またはそれよりも高い、約50℃またはそれよりも高い、約60℃またはそれよりも高い、約70℃またはそれよりも高い、約80℃またはそれよりも高い、約90℃またはそれよりも高い、約100℃またはそれよりも高い、約110℃またはそれよりも高い、あるいは約120℃またはそれよりも高い、例えば約20℃から約60℃の間、約40℃から約80℃の間、約60℃から約100℃の間、約20℃から約40℃の間、約30℃から約50℃の間、約40℃から約60℃の間、約50℃から約70℃の間、約60℃から約80℃の間、約70℃から約90℃の間、約80℃から約100℃の間、または約90℃から約110℃の間の温度に加熱することを含んでいてもよい。あるいは、反応条件は、反応混合物を室温で維持することを含んでいてもよい。第1の反応性基と、第1の反応性基に対して反応性のある部分との間の反応に適した条件は、撹拌、振盪、またはその他の混合方法の反応媒体への適用を含むこともできる。
反応性基(例えば、アルキン反応性基)を含む化合物は、標的化リガンドを含んでいてもよく、さらにリンカー(例えば、切断不能リンカー)を含んでいてもよい。標的化リガンドは、葉酸受容体標的化リガンドとすることができる。例えば、標的化リガンドは、葉酸受容体、例えばがん細胞または腫瘍上に発現する葉酸受容体に結合することができる分子であってもよい。葉酸受容体(FR)標的化リガンドは、葉酸、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、またはその葉酸受容体結合誘導体であってもよい。葉酸受容体標的化リガンドは、葉酸受容体を標的にすることができる高分子、例えばタンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、または抗体断片であり得る。例えば、葉酸受容体標的化リガンドは、インタクトな抗体の一部分、例えば、抗体の抗原結合または可変領域などを含んでいてもよい
。葉酸受容体標的抗体断片の例には、限定するものではないがFab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、scFv断片、Fv断片、dsFVダイアボディ、dAb断片、Fd’断片、Fd断片、または単離された相補的決定領域(CDR)領域が含まれる。抗体の抗原結合断片は、任意の手段によって生成されてもよい。例えば、抗体の抗原結合断片は、インタクトな抗体の断片化により、酵素によってまたは化学的に生成されてもよく、および/または部分抗体配列をコード化する遺伝子から組換えにより生成されてもよい。あるいは、または追加として、抗体の抗原結合断片は、全体的にまたは部分的に合成により生成されてもよい。リンカーは、任意の適切な2価のリンカー、例えばアルキレンまたはヘテロアルキレン基とすることができる。2価のリンカーは、PEG基(例えば、PEG1、PEG2、PEG3、またはPEG4、基)であってもよい。
。葉酸受容体標的抗体断片の例には、限定するものではないがFab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、scFv断片、Fv断片、dsFVダイアボディ、dAb断片、Fd’断片、Fd断片、または単離された相補的決定領域(CDR)領域が含まれる。抗体の抗原結合断片は、任意の手段によって生成されてもよい。例えば、抗体の抗原結合断片は、インタクトな抗体の断片化により、酵素によってまたは化学的に生成されてもよく、および/または部分抗体配列をコード化する遺伝子から組換えにより生成されてもよい。あるいは、または追加として、抗体の抗原結合断片は、全体的にまたは部分的に合成により生成されてもよい。リンカーは、任意の適切な2価のリンカー、例えばアルキレンまたはヘテロアルキレン基とすることができる。2価のリンカーは、PEG基(例えば、PEG1、PEG2、PEG3、またはPEG4、基)であってもよい。
反応性基(例えば、アルキン反応性基)を含む化合物は、式(D’):
の構造を含んでいてもよく、式中、Jは反応性基、例えばアルキン反応性基であり;例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリルであり);Tは、標的化リガンド(例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸またはその誘導体)であり;yは、0から20の整数(例えば、3)である。例えば、yは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば2、3、または4であってもよい。
アルキン反応性基を含む化合物は、式(D):
の構造を含んでいてもよく、式中、Tは、標的化リガンド(例えば、葉酸受容体標的化リガンド、例えば葉酸またはその誘導体)であり;およびyは、0から20の整数(例えば、3)である。例えば、yは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば2、3、または4であってもよい。
反応性基(例えば、アルキン反応性基)を含む化合物は、式(D-1’):
の構造を含んでいてもよく、
式中、Jは、反応性基(例えば、アルキン反応性基;例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)であり;yは、0から20の整数(例えば、3)である。例えば、yは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば2、3、または4であってもよい。
式中、Jは、反応性基(例えば、アルキン反応性基;例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)であり;yは、0から20の整数(例えば、3)である。例えば、yは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば2、3、または4であってもよい。
アルキン反応性基を含む化合物は、式(D-1):
の構造を含んでいてもよく、
式中、yは、0から20の整数(例えば、3)である。例えば、yは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば2、3、または4であってもよい。
式中、yは、0から20の整数(例えば、3)である。例えば、yは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば2、3、または4であってもよい。
反応性基(例えば、アルキン反応性基)を含む化合物は、ペイロード部分を含んでいてもよく、リンカー(例えば、切断可能リンカー)をさらに含んでいてもよい。ペイロード部分は、がん治療での使用など、治療上の使用を有する分子とすることができる。例えば、ペイロード部分は、細胞毒性化合物、例えば細胞毒性の性質を持つ小分子とすることができる。
例示的なペイロードには、酵素阻害剤(例えば、”A Review of Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery,” Robert A. Copeland, John Wiley and Sons, Hoboken, New Jersey参照)、例えばトポイソメラーゼ阻害剤(例えば、エキサテカン、SN-38、トポテカン、イリノテカン、カムプトテシン、ベロテカン、インデノイソキノリン、フェナントリジン、インドロカルバゾール、およびこれらの類似体)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤、DNAインターカレーター、DNA副溝バインダー、チューブリン擾乱剤(tubulin disruptor)、DNA切断剤(DNA cleaver)、アントラサイクリン、ビンカ薬物、マイトマイシン(例えば、マイトマイシン-C、マイトマイシン-A)、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン、ジイネン、エネジイン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、アウリスタチン(例えば、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF))、マイタンシノイド、分化誘導剤、デュオカルマイシン、およびタキサン(例えば、タキソール)が含まれる。例えば、ペイロードは、エキサテカン、SN-38、トポテカン、イリノテカン、ベロテカン、9-アミノカムプトテシン、エトポシド、カムプトテシン、タキソール、エスペラマイシン、1,8-ジヒドロキシ-ビシクロ[7.3.1]トリデカ-4-9-ジエン-2,6-ジイン-13-オン、ポドフィロトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、モルホリン-ドキソルビシン、N-(5,5-ジアセトキシ-ペンチル)ドキソルビシン、米国特許第5,198,560号に記載される化合物、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、N8-アセチルスペルミジン、ピロロベンゾジアゼピン、1-(2 クロロエチル)-1,2-ジメタンスルホニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、ドラスタチン、アウリスタチン、カリケアマイシンヒドラジド、エスペラマイシン、および6-メルカプトプリン、メトトレキセート、酪酸、レチノイン酸、またはこれらの誘導体であってもよい。
本開示のコンジュゲートを調製する目的で、ペイロードとリンカーとの反応をより都合良く行うために、化学修飾は所望のペイロードになされてもよいことが理解されよう。例えば、官能基、例えばアミン、ヒドロキシル、またはスルフヒドリルは、薬物の活性またはその他の性質に対して最小限のまたは許容される効果を発揮する位置で、薬物に付加さ
れてもよい。
れてもよい。
リンカーは、任意の適切な2価のリンカーであってもよく、ある特定の条件下で切断可能な一部分を含むことができる。例えば、リンカーは、ある特定の条件下、in vitroまたはin vivoでペイロードを放出することが可能な自己犠牲リンカー(self-immolative linker)とすることができる。リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカー(例えば、カテプシンまたはトリプシンなどのプロテアーゼによって切断可能)、pH感受性リンカー、またはレドックス感受性リンカーであってもよい。プロテアーゼ切断可能リンカーは、カテプシンB(Cat-B)切断可能リンカーとすることができる。リンカーは、例えばがん細胞などの細胞内での有効な切断のために、ペプチド部分(例えば、ジペプチド)、PEGスペーサー、および/または自己犠牲部分(例えば、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PABC))を含んでいてもよい。切断可能なリンカーは、所望の場所でまたは選択された時間の後(例えば、標的化されたがん細胞に進入した後)に選択的に切断されてもよい。
反応性基(例えば、アルキン反応性基)を含む化合物は、式(E’):
の構造を含んでいてもよく、式中、Jは、反応性基(例えば、アルキン反応性基;例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)であり;Lは、切断可能なリンカー部分(例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー部分)であり;Pは、ペイロード部分(例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン)であり;およびyは0から20の整数(例えば、9)である。例えば、Lは、プロテアーゼ切断可能リンカー部分であってもよく、Pは、エキサテカンであってもよく、およびyは、0から20の整数(例えば、7、8、9、10、または11)であってもよい。
アルキン反応性基を含む化合物は、式(E):
の構造を含んでいてもよく、式中、Lは切断可能リンカー部分(例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー部分)であり;Pは、ペイロード部分(例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン)であり;およびyは、0から20の整数(例えば、9)である。例えば、Lは、プロテアーゼ切断可能リンカー部分であってもよく、Pはエキサテカンであってもよく、およびyは、0から20の整数(例えば、7、8、9、10、または11)であってもよい。
切断可能リンカー部分は、式(F):
の構造を含むことができ、
式中、[AA]のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり;zは1から
5の整数であり;wは1から4の整数(例えば、2または3であり);および各
は、反応性基を含む化合物の別の部分との付着点(例えば、アルキン反応性基、例えばPEG基との付着、アルキン反応性基との付着、またはペイロード部分との付着)を示す。例えば、-[AA]w-は、Val-Lys、Val-Cit、Phe-Lys、Trp-Lys、Asp-Lys、Val-Arg、またはVal-Alaを含んでいてもよく、zは2であってもよく、1つの
は、PEG基の酸素原子との付着点を示し、他の
は、エキサテカンの窒素原子との付着点を示す。
式中、[AA]のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり;zは1から
5の整数であり;wは1から4の整数(例えば、2または3であり);および各
切断可能リンカー部分は、式(F-1):
の構造を含むことができ、
式中、1つの
は、反応性基を含む化合物の別の部分との付着点を示す(例えば、アルキン反応性基;例えばPEG基との付着、アルキン反応性基との付着、またはペイロード部分との付着)。例えば、1つの
は、PEG基の酸素原子との付着を示してもよく、他の
は、エキサテカンの窒素原子との付着を示してもよい。
式中、1つの
反応性基(例えば、アルキン反応性基)を含む化合物は、式(E-1’):
の構造を含んでいてもよく、
式中、Jは反応性基(例えば、アルキン反応性基;例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)であり;yが0から20の整数(例えば、9)である。
式中、Jは反応性基(例えば、アルキン反応性基;例えばアジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)であり;yが0から20の整数(例えば、9)である。
アルキン部分(例えば、ナノ粒子に共有結合により付着されたアルキン)と、アルキン反応性基を含む化合物(例えば、式Dの化合物、例えばD-1)との反応は、式(NP-2):
の化合物を提供することができ、
式中、xは、0から10の整数(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、例えば4)であり、yは、0から20の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば3)であり、ケイ素原子はナノ粒子の一部である(例えば、コア-シェルシリカナノ粒子のシリカシェルに結合される)。
式中、xは、0から10の整数(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、例えば4)であり、yは、0から20の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば3)であり、ケイ素原子はナノ粒子の一部である(例えば、コア-シェルシリカナノ粒子のシリカシェルに結合される)。
アルキン部分(例えば、ナノ粒子に共有結合により付着されたアルキン部分)と、アルキン反応性基を含む化合物(例えば、式Eの化合物、例えばE-1)との反応は、式(NP-3):
の化合物を提供することができ、
式中、xは、0から10の整数(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10、例えば4)であり、yは、0から20の整数(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば9)であり、ケイ素原子はナノ粒子の一部(例えば、コア-シェルシリカナノ粒子のシリカシェルで結合された)である。
式中、xは、0から10の整数(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10、例えば4)であり、yは、0から20の整数(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20、例えば9)であり、ケイ素原子はナノ粒子の一部(例えば、コア-シェルシリカナノ粒子のシリカシェルで結合された)である。
プロテアーゼ切断可能リンカーを介して連結されたペイロード(エキサテカン)を含む例示的なNDCと、リンカーの切断およびペイロードの放出のメカニズムを、スキーム2に示す。
スキーム2. 本明細書に開示された方法により生成された例示的なNDCおよびカテプシンB(Cat-B)によるその切断。
スキーム2. 本明細書に開示された方法により生成された例示的なNDCおよびカテプシンB(Cat-B)によるその切断。
本明細書に開示される方法は、所望の数の標的化リガンドまたはペイロード部分を持つナノ粒子薬物コンジュゲートを得るのに使用することができる。例えば、本明細書に開示される方法を使用して生成されたNDCは、ナノ粒子のペイロード(例えば、エキサテカンまたはその塩もしくは類似体)に対する平均比が約1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、
1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:32、1:34、1:36、1:38、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、または1:80であってもよい。例えば、各ナノ粒子上のエキサテカン分子の平均数は、ナノ粒子当たり約5から約10個の間、約10から約15個の間、約15から約20個の間、約20から約25個の間、または約25から約30個の間、例えば約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、または約30個のエキサテカン分子であってもよい。本明細書に開示される方法を使用して生成されたNDCは、約1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、または1:30の、ナノ粒子の標的化リガンド(例えば、葉酸)に対する平均比を有していてもよい。例えば、ナノ粒子の標的化リガンドに対する平均比は、約1から約20に及ぶことができ、例えば各ナノ粒子上の葉酸分子の平均数は、ナノ粒子当たり約5から約10個の間、約10から約15個の間、または約15から約20個の間、たとえば約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、または約15個の葉酸分子であってもよい。
1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:32、1:34、1:36、1:38、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、または1:80であってもよい。例えば、各ナノ粒子上のエキサテカン分子の平均数は、ナノ粒子当たり約5から約10個の間、約10から約15個の間、約15から約20個の間、約20から約25個の間、または約25から約30個の間、例えば約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、または約30個のエキサテカン分子であってもよい。本明細書に開示される方法を使用して生成されたNDCは、約1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、または1:30の、ナノ粒子の標的化リガンド(例えば、葉酸)に対する平均比を有していてもよい。例えば、ナノ粒子の標的化リガンドに対する平均比は、約1から約20に及ぶことができ、例えば各ナノ粒子上の葉酸分子の平均数は、ナノ粒子当たり約5から約10個の間、約10から約15個の間、または約15から約20個の間、たとえば約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、または約15個の葉酸分子であってもよい。
本明細書で例示される方法は、アルキンでナノ粒子を官能化し、アルキン反応性部分を含む化合物をナノ粒子にコンジュゲートすることを特徴とするが、これらの官能基は逆転させてもよいことが理解されよう。例えば、本明細書に開示される方法は、アルキン反応性部分(例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)でナノ粒子を官能化し、さらに官能化ナノ粒子を、アルキンを含む化合物とコンジュゲートするように修正することができる。例えば、ナノ粒子は、第1の二官能性前駆体で官能化することができ、その後、アルキン反応性基を含む第2の二官能性前駆体とコンジュゲートすることができ、それによって、アルキン反応性基(例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)で官能化されたナノ粒子が提供される。次いでアルキンを含む化合物(例えば、標的化リガンドまたはペイロード)をナノ粒子と反応させて、化合物をナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。
本明細書に開示される方法は、ナノ粒子を官能化するためのその他の方法の欠点を克服することができる。例えば、本明細書に開示される方法は、その他の方法を使用して作製されたナノ粒子コンジュゲートの限られた安定性に対処することができる。特に、本明細書に開示される方法は、反応性の高い基(例えば、ある特定のアミン基)を含む二官能性前駆体を使用したときに生じる可能性のある、リンカー部分における結合の加水分解を促進させない、比較的安定した二官能性前駆体を特徴とする。さらに、本明細書に開示される方法は、例えば静電気引力またはその他の望ましくない分子間もしくは分子内相互作用に起因する、その他の二官能性前駆体(例えば、アミン含有二官能性前駆体)を使用したときに生じる可能性のある自己縮合を反応中に実質的に行わない二官能性前駆体を用いる。これらの課題の克服は、収率を大幅に増大させることができ、臨床使用が意図されるNDCの生成に特に関連のある、通常なら必要と考えられる困難または不可能な精製プロセスを回避することができる。したがって本明細書に開示される方法は、高度に純粋な官能化ナノ粒子を生成する際のその容易さおよび信頼性に起因して、臨床使用に意図されるNDCを生成するのに特に有用である。
本明細書に開示された方法を使用して生成された官能化ナノ粒子は、例えば透過型電子顕微鏡法(TEM)により測定されたとき、均一な形態および狭いサイズ分布を示すことができる。ナノ粒子は、例えばナノ粒子の内部または表面の色素またはリガンドの吸収ピ
ーク特性を同定するために、TEMまたはUV分光法によって特徴付けられてもよい。ナノ粒子の純度は、クロマトグラフィー、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して評価することができる。本明細書に開示される方法は、様々な反応規模の全体を通しておよびバッチごとに、高度に一貫したナノ粒子特性を提供することもできる。
ーク特性を同定するために、TEMまたはUV分光法によって特徴付けられてもよい。ナノ粒子の純度は、クロマトグラフィー、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して評価することができる。本明細書に開示される方法は、様々な反応規模の全体を通しておよびバッチごとに、高度に一貫したナノ粒子特性を提供することもできる。
本明細書に記述される本発明を、より十分に理解し得るようにするために、下記の実施例について述べる。これらの実施例は、本明細書に提供される方法および官能化ナノ粒子を示すために提供され、いかなる方法によってもそれらの範囲を限定すると解釈するものではない。
本明細書で提供される化合物は、当業者に周知と考えられる、以下に述べる特定の合成プロトコールに対する改変を使用して、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的なまたは好ましいプロセス条件(即ち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など)が与えられる場合、他に述べない限りその他のプロセス条件を使用できることも理解されよう。最適な反応条件は、使用される特定の反応物または溶媒と共に変えてもよく、しかしそのような条件は、通常の最適化手順によって当業者が決定することができる。
さらに、当業者に明らかにされるように、従来の保護基は、ある特定の官能基が所望の反応を受けないようにするのに必要と考えられる。特定の官能基に適した保護基、ならびに保護および脱保護に適した条件の選択は、当技術分野で周知である。例えば、数多くの保護基とそれらの導入および除去は、Greene et al. Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991、およびそこに引用される参考文献に、記載されている。
[0145]
材料および方法
全ての材料は、受け取ったままの状態で使用した。全ての非水性反応は、火炎乾燥したガラス器具で、アルゴンの陽圧下で実行した。無水溶媒は、商業上の供給元(RANKEM)から購入した。フラッシュクロマトグラフィーを、指示される溶媒系により230~400メッシュのシリカゲル上で行った。プロトン核磁気共鳴スペクトルを、重水素化クロロホルムまたはDMSOを溶媒として使用して、Bruker分光計で、400MHZで記録した。ピーク位置は、内部標準としてのテトラメチルシランから百万分率単位で低磁場に与えられた。J値は、ヘルツを単位として表される。質量分析は、エレクトロスプレー(ES)技法を使用する(Agilent/Shimadzu)分光計で行った。HPLC分析は、(Agilent/Waters)、Gemini C-18(1000×4.6mm;5u)を備えたPDA-UV検出器で行い、試験した全ての化合物は、この方法を使用して>95%純粋であることを決定した。本明細書に記述される手順に従い調製された化合物は、分取HPLC法によって単離されてもよい。シアニン5マレイミドは、Lumiprobeから購入した。DBCO-PEG4-マレイミド、葉酸-PEG-アジド、およびエキサテカン-リンカーコンジュゲートは、WuXi AppTec、Tianjin、Chinaによるカスタム合成から得た。(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、2-[メトキシ(ポリエチレンオキシ)6-9プロピル]トリメトキシシラン、および(3-シクロペンタジエニルプロピル)トリエトキシシラン前駆体を、Gelestから購入した。10×PBSを、Thermo Fisher Scientificから購入した。ヒトカテプシン-Bは、Millipore Sigmaから購入した。ヒトおよびマウス血清は、BIOIVT(New York)から購入した。全てのその他の化学物質は、Millipore Sigmaから購入した。Cy5-
C’ドットは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMa, K. et al. Chemistry of Materials (2015) 27(11):4119-4133に記載されたプロトコールに従い調製した。
[0145]
材料および方法
全ての材料は、受け取ったままの状態で使用した。全ての非水性反応は、火炎乾燥したガラス器具で、アルゴンの陽圧下で実行した。無水溶媒は、商業上の供給元(RANKEM)から購入した。フラッシュクロマトグラフィーを、指示される溶媒系により230~400メッシュのシリカゲル上で行った。プロトン核磁気共鳴スペクトルを、重水素化クロロホルムまたはDMSOを溶媒として使用して、Bruker分光計で、400MHZで記録した。ピーク位置は、内部標準としてのテトラメチルシランから百万分率単位で低磁場に与えられた。J値は、ヘルツを単位として表される。質量分析は、エレクトロスプレー(ES)技法を使用する(Agilent/Shimadzu)分光計で行った。HPLC分析は、(Agilent/Waters)、Gemini C-18(1000×4.6mm;5u)を備えたPDA-UV検出器で行い、試験した全ての化合物は、この方法を使用して>95%純粋であることを決定した。本明細書に記述される手順に従い調製された化合物は、分取HPLC法によって単離されてもよい。シアニン5マレイミドは、Lumiprobeから購入した。DBCO-PEG4-マレイミド、葉酸-PEG-アジド、およびエキサテカン-リンカーコンジュゲートは、WuXi AppTec、Tianjin、Chinaによるカスタム合成から得た。(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、2-[メトキシ(ポリエチレンオキシ)6-9プロピル]トリメトキシシラン、および(3-シクロペンタジエニルプロピル)トリエトキシシラン前駆体を、Gelestから購入した。10×PBSを、Thermo Fisher Scientificから購入した。ヒトカテプシン-Bは、Millipore Sigmaから購入した。ヒトおよびマウス血清は、BIOIVT(New York)から購入した。全てのその他の化学物質は、Millipore Sigmaから購入した。Cy5-
C’ドットは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMa, K. et al. Chemistry of Materials (2015) 27(11):4119-4133に記載されたプロトコールに従い調製した。
ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)の特徴付けおよび精製は、Chen, F. et al. Chemistry of Materials (2017) 29(20):8766-8779に概説された手順に従い行った。透過型電子顕微鏡法(TEM)の特徴付けは、ナノ粒子の分布を実証するために、Titan Cubed Themis 300 TEMおよび高角度環状暗視野(HAADF)撮像を使用して行った。試料のUV-可視分光法分析を、Cary 5000 UV-Vis-NIR分光光度計を使用して行った。蛍光相関分光法(FCS)測定は、Ma, K. et al. Chemistry of Materials (2016) 28(5):1537-1545に記載されている自作のFCS装置を使用して行った。633nmの固体レーザーを使用して、C’ドットのシリカコアに被包されたCy5色素を励起した。フォトダイオードアレイ(PDA)検出器に連結されたRP-HPLCは、市販のWaters Xbridge Peptide BEH C18カラム(50×4.6mm)を使用してナノ粒子コンジュゲート(FA-CDCを含む)の純度を評価するのに使用した。分離のための移動相は、85%A(脱イオン水中0.1体積%のトリフルオロ酢酸)/15%B(アセトニトリル)の組成で開始する勾配溶出であり、組成は、15分間にわたって5%A/95%Bに直線的に変化する。RP-HPLCは、異なる極性を持つ分子を分離し、その超小型の10nmに満たない粒度により、FA-CDCの分析法として適している。RP-HPLCを使用して、ナノ粒子は、ナノ粒子と非共有結合により関連付けられ、分解されたリガンドまたは強制的に放出された成分などのその他の化学的部分から十分に分離される。種々の化学的部分は、PDA検出器を使用して収集された溶出時間および固有のUV/可視スペクトルに基づいて特定される。試料中の不純物含量は、主要な不純物に関する参照標準材料により作成した較正曲線を使用して定量することができる。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の特徴付けを、PDA検出器に連結されたTosoh Bioscience PWXL 4000 7.8mm×300mmカラムを使用して、80%の脱イオン水中0.9重量%塩化ナトリウムと、20%のアセトニトリルとで構成された移動相により行った。分離は、均一溶媒モードで30分間にわたり行い、分離の典型的な流量は0.6mL/分であった。
(実施例1)
DBCO-PEG-シランを使用した例示的な官能化ナノ粒子の合成。
スキーム3. DBCO-PEG-シランを使用してDBCOでナノ粒子を官能化する例示的な1ステップ法。
(実施例1)
DBCO-PEG-シランを使用した例示的な官能化ナノ粒子の合成。
Cy5-C’ドットを、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で、脱イオン水で希釈して所望の濃度にし、典型的には15から30μMの間の濃度にした。DBCO-PEGn-シラン(n=4または12)をDMSOに溶解し、撹拌しながら反応に添加して、粒子のDBCOに対する所望のモル比を達成した。室温で一晩の反応後、反応溶液を濃縮し、ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)を使用して精製した。ナノ粒子に付着されたDBCO基の数を、図2に提示する。
(実施例2)
アミン系前駆体を使用した例示的な官能化ナノ粒子の合成。
有機ポリマーコーティング(例えば、PEG層)の下のナノ粒子の表面のシラノール基は、DBCO-PEG-シランなどの嵩高い分子に対して容易にアクセス可能ではない。結果は、DBCO-PEG-シランを二官能性前駆体として使用した場合(例えば、実施例1におけるように)、DBCO-PEG-シランのナノ粒子に対する反応比が高い場合であっても(図2参照)、1個または2個のDBCO基しか各ナノ粒子(例えば、C’ドット)に付着できない。したがって、代替の2ステップ反応が設計され、スキーム4に示されるように高い拡散係数をもつ比較的小さいシラン分子を用いた。
スキーム4. アミン-シラン二官能性前駆体を使用してDBCOでナノ粒子を官能化する例示的な2ステップ法。
アミン系前駆体を使用した例示的な官能化ナノ粒子の合成。
有機ポリマーコーティング(例えば、PEG層)の下のナノ粒子の表面のシラノール基は、DBCO-PEG-シランなどの嵩高い分子に対して容易にアクセス可能ではない。結果は、DBCO-PEG-シランを二官能性前駆体として使用した場合(例えば、実施例1におけるように)、DBCO-PEG-シランのナノ粒子に対する反応比が高い場合であっても(図2参照)、1個または2個のDBCO基しか各ナノ粒子(例えば、C’ドット)に付着できない。したがって、代替の2ステップ反応が設計され、スキーム4に示されるように高い拡散係数をもつ比較的小さいシラン分子を用いた。
Cy5-C’ドットを、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で脱イオン水で希釈して所望の濃度にし、典型的には15から30μMの間にした。(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTMS)をC’ドット溶液中に撹拌しながら添加して、粒子のAPTMSに対する所望のモル比を達成した。一晩反応後、DMSO中のDBCO-PEG4-NHSエステルを添加して、粒子のDBCOに対する所望のモル比に到達させ、かつアミン-エステル反応を介してC’ドット上のアミン基にさらにコンジュゲートした。反応を室温で一晩そのままにし、次いで濃縮し、GPCを使用して精製した。GPC精製後、0.9%の食塩水中の精製された粒子を、水浴中で一晩、80℃に加熱した。熱処理後、溶液を濃縮し、GPCを使用して再び精製して、アミン系DBCO-C’ドットを得た。単一ステップ反応と比較して、この2ステップ反応は、小さいシラン分子の高速拡散を利用して、PEG層下のそれらのシラノール基に対する反応性を高め、20個よりも多いDBCO基を各C’ドット上に容易に付着させることが可能になる(図2参照)。
しかしながら、この手法を使用して生成されるアミン系DBCO-C’ドットは、限られた安定性を示した。例えば、かなりの量のDBCOが、37℃のPBS中で一晩インキュベートされた後にC’ドットから脱離し(図3A参照)、これはDBCO基とC’ドットとの間のアミド結合の加水分解に起因する可能性があり、C’ドット表面に残留する第一級アミン基によって加速される。さらに、アミン-シラン分子は、それらの正に帯電したアミン部分と負に帯電したシラノール部分との間の静電的引力に起因して反応中に自己縮合する可能性がある。アミン-シラン凝集体は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によってC’ドット溶液から除去するのが難しく(図3C参照)、望ましくない下流の影響をもたらす可能性がある。例えば、投与される場合、これらの凝集体は、アミンの正電荷に起因して腎臓貯留をもたらし得る。
(実施例3)
コンジュゲーション化学合成のスクリーニング
実施例2に記述されるアミン-シラン前駆体を使用することの欠点を克服するために、コンジュゲーション化学のライブラリーをスクリーニングし、これを表1にまとめる。
表1. コンジュゲーション化学のスクリーニング。
a 粒子当たりのアジド基の数は、UV-Visスペクトルから直接定量できない。したがってDBCO-Cy3分子を、アジド官能化C’ドットにさらにコンジュゲートし、DBCOとアジドとの間のクリックケミストリー反応を介してCy3を粒子に付着させた;
b C’ドット上のアルキン基の存在は、290nmでのアルキンの特異的な吸光度ピークによって検証された; c合成プロトコールの最適化後に得られた; d DBCO-Cy3分子をさらに、アジド官能化C’ドットにコンジュゲートし、Cy3を、DBCOとアジドとの間のクリックケミストリー反応を介して粒子に付着させた。
コンジュゲーション化学合成のスクリーニング
実施例2に記述されるアミン-シラン前駆体を使用することの欠点を克服するために、コンジュゲーション化学のライブラリーをスクリーニングし、これを表1にまとめる。
表1. コンジュゲーション化学のスクリーニング。
b C’ドット上のアルキン基の存在は、290nmでのアルキンの特異的な吸光度ピークによって検証された; c合成プロトコールの最適化後に得られた; d DBCO-Cy3分子をさらに、アジド官能化C’ドットにコンジュゲートし、Cy3を、DBCOとアジドとの間のクリックケミストリー反応を介して粒子に付着させた。
(実施例4)
ジエン系DBCO-C’ドットの合成
Diels-Alder反応の使用は、アミン-エステル反応の適切な置換えとして実施例3で特定された。例えば、実施例2に記述される方法で使用したアミン-シランは、シクロペンタジエン基でC’ドットを最初に官能化するために(3-シクロペンタジエニルプロピル)トリエトキシシラン(「ジエン-シラン」)と置き換えることができ、実施例2の方法で使用したDBCO-PEG-NHSエステルは、DBCO-PEG-マレイミドと置き換えることができる。この方法をスキーム5に示し、DBCO-PEG-マレイミド上のマレイミド基とC’ドット上のジエン基との間のDiels-Alder反応を使用して、DBCO(リンカーを介して)をナノ粒子に付着することができる。
スキーム5. ジエン-シラン二官能性前駆体を使用してDBCOでナノ粒子を官能化する例示的な2ステップ法。
ジエン系DBCO-C’ドットの合成
Diels-Alder反応の使用は、アミン-エステル反応の適切な置換えとして実施例3で特定された。例えば、実施例2に記述される方法で使用したアミン-シランは、シクロペンタジエン基でC’ドットを最初に官能化するために(3-シクロペンタジエニルプロピル)トリエトキシシラン(「ジエン-シラン」)と置き換えることができ、実施例2の方法で使用したDBCO-PEG-NHSエステルは、DBCO-PEG-マレイミドと置き換えることができる。この方法をスキーム5に示し、DBCO-PEG-マレイミド上のマレイミド基とC’ドット上のジエン基との間のDiels-Alder反応を使用して、DBCO(リンカーを介して)をナノ粒子に付着することができる。
Cy5-C’ドットを、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で、脱イオン水で希釈して所望の濃度にし、典型的には15から30μMの間にした。(3-シクロペンタジエニルプロピル)トリエトキシシラン(シクロペンタジエン)を最初にDMSO中で100×に希釈し、次いで撹拌しながら反応に添加して、粒子のシクロペンタジエンに対する所望のモル比に到達させた。一晩の反応後、10×PBSを反応に添加して、1×PBSの最終濃度に到達させた。次に、DBCO-マレイミド前駆体(DBCO-mal、DBCO-PEG4-mal、DBCO-PEG12-mal、またはDBCO-スルホ-mal)をDMSOに溶解し、反応に添加して、粒子のDBCOに対する所望のモル比に到達させた。約30分から1時間混合後、反応混合物を、一晩撹拌しながら80℃に加熱した。次いで反応溶液を濃縮し、ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)を使用して精製し、ジエン系DBCO-C’ドットを得た。
理論に拘束されることを望まないが、シクロペンタジエン基の中性電荷は、前駆体としてアミン-シランを使用したときにC’ドット上の第一級アミンによって加速する可能性がある、連結におけるアミド結合の加水分解を、回避すると考えられる。したがって、この方法を使用して生成されるC’ドットは、非常に安定している(図3B参照)。さらに、シクロペンタジエン基の使用は、反応中のシランの自己縮合を大幅に減じ(図3D参照)、官能化ナノ粒子(例えば、DBCO-C’ドット)の安定性、サイズの均質性、反応収率、および純度を改善する。
DBCO含有前駆体(例えば、DBCO-マレイミド)の反応効率は、その拡散係数とは無関係である。例えば、様々なPEGスペーサー長および分子量を持つDBCO-マレイミド前駆体を、C’ドットの官能化に用いる場合であっても、得られたC’ドットのそれぞれに付着されたDBCO基の数は一定のままであった(図2参照)。このことは、反応効率がシランのモル質量に大きく影響を受ける可能性がある、その他の二官能性前駆体を含む典型的な方法から逸脱している。このことは、C’ドットと嵩高いシランとの反応からの低収率が、シランの自己縮合により主に引き起こされ、そのナノ粒子の有機ポリマーコーティング(例えば、C’ドットPEG層)内への拡散および後続の反応と競合することも示唆している。DBCO-マレイミド前駆体とナノ粒子(例えば、C’ドット)との間の反応は、使用されるDBCO-マレイミド前駆体の疎水性および電荷状態に対して感受性がある可能性がある。例えば、負電荷を持つ比較的親水性の分子、例えば親水性スルホン化スペーサーを持つDBCO-スルホ-マレイミドは、比較的乏しい反応性を示す。理論に拘束されることを望まないが、この乏しい反応性は、増大した水溶解度と、負に
帯電したシラノール基からの静電反発力に起因する可能性がある。これらの結果に基づいて、4つのエチレングリコール単位を持つ短いPEGスペーサーをDBCO-マレイミド前駆体で使用して、C’ドット表面のDBCO基に、例えばクリックケミストリー反応を使用して後続の修飾用に所望のアクセス可能性を与えた。
帯電したシラノール基からの静電反発力に起因する可能性がある。これらの結果に基づいて、4つのエチレングリコール単位を持つ短いPEGスペーサーをDBCO-マレイミド前駆体で使用して、C’ドット表面のDBCO基に、例えばクリックケミストリー反応を使用して後続の修飾用に所望のアクセス可能性を与えた。
(実施例5)
FA-CDCの合成
本明細書に開示される方法によって生成されたアルキン部分(例えば、DBCO)を含むNDCを、反応性基、例えばアルキン反応性基(例えば、アジド)を含む化合物とさらにコンジュゲートすることができる。これらの化合物は、例えば合成実施例1に記述されるようにペイロード-リンカーコンジュゲート前駆体、および/または例えば合成実施例2に記述されるように葉酸塩標的化リガンド前駆体を含むことができる。
FA-CDCの合成
本明細書に開示される方法によって生成されたアルキン部分(例えば、DBCO)を含むNDCを、反応性基、例えばアルキン反応性基(例えば、アジド)を含む化合物とさらにコンジュゲートすることができる。これらの化合物は、例えば合成実施例1に記述されるようにペイロード-リンカーコンジュゲート前駆体、および/または例えば合成実施例2に記述されるように葉酸塩標的化リガンド前駆体を含むことができる。
例えば、クリックケミストリーを使用して、本明細書に開示される方法によって生成されたDBCO-C’ドットをアジド官能化葉酸-リンカーコンジュゲート(葉酸受容体(FR)を発現するがんを標的にするための標的化リガンドとして適切である)、およびアジド官能化エキサテカン-リンカーコンジュゲート(エキサテカンは、がんの処置に適したトポイソメラーゼI阻害剤薬物である)とコンジュゲートした。葉酸部分を、切断不能リンカーを通して付着し、一方、エキサテカン部分は、カテプシン-B(Cat-B)切断可能リンカー(Cat-Bは、細胞リソソームに存在する酵素であり、様々な悪性疾患で過剰発現される)を通して付着した。これらの方法を、スキーム6に示す。
スキーム6. 葉酸部分およびエキサテカン部分でナノ粒子を官能化する例示的な方法。
DBCO-C’ドットを、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で、脱イオン水で希釈して所望の濃度にし、典型的には15から30μMの間にした。DBCO-C’ドットを葉酸リガンドで官能化するため、葉酸塩-PEG-アジドをDMSOに溶解し、撹拌しながら反応に添加して、粒子当たり所望の数のリガンドを達成した。反応を室温で一晩そのままにし、変換率を、プロセス内HPLC純度試験によりチェックした(典型的には95%よりも高い)。純度が95%よりも下である場合、反応溶液を濃縮し、GPCを使用して精製することができると考えられる。葉酸官能化C’ドットを中間体として単離して、UV-Visを使用して粒子当たりの葉酸リガンドの数を決定した。葉酸官能化C’ドットと切断可能エキサテカンとをさらにコンジュゲートするため、粒子濃度を必要に応じて調節した。切断可能リンカー-エキサテカンコンジュゲートをDMSOに溶解し、撹拌しながら粒子溶液に添加して、粒子当たり所望の数のペイロードを達成した。反応を室温で一晩そのままにし、次いで反応溶液を濃縮し、GPCを使用して精製して、FA-CDCを得た。
得られた標的化されたNDCは、平均コアサイズ3.9nmで、透過型電子顕微鏡法(TEM)の下、均一な形態および狭いサイズ分布を示した。NDCの平均流体力学直径は、蛍光相関分光法(FCS)により6.4nmであることが決定され(図4)、TEMと
一致したが、これは2.5nmの差が、TEMで観察することができない有機PEG層に起因するからである。最終精製NDCは、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)およびSEC(図6A~6B)の両方によって特徴付けられたように、99.0%よりも高い純度を有した。NDCのこれらの品質属性は、様々な反応規模にわたりバッチごとに高度に一貫していることが実証された(表2)。
表2. 例示的な規模でのバッチ間でのNDCの特性。
一致したが、これは2.5nmの差が、TEMで観察することができない有機PEG層に起因するからである。最終精製NDCは、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)およびSEC(図6A~6B)の両方によって特徴付けられたように、99.0%よりも高い純度を有した。NDCのこれらの品質属性は、様々な反応規模にわたりバッチごとに高度に一貫していることが実証された(表2)。
表2. 例示的な規模でのバッチ間でのNDCの特性。
UV-Visスペクトルを、標的化されたNDCを生成するために、C’ドットがシクロペンタジエン、DBCO、葉酸、およびエキサテカンで順次官能化されたときに各ステップで収集した。特性吸収ピークを使用して、各リガンドの存在を検証しかつ粒子当たりのリガンドの数を決定した(図5)。DBCO-C’ドットは、共有結合により被包されたCy5に相当する647nmで1つの吸収ピークを示し、DBCO基に相当する308nmおよび290nmでダブレットピークを示した。Cy5およびDBCOのモル濃度は、それらの吸光係数を使用してそれぞれ647nmおよび308nmでBeer-Lambertの法則を適用することにより、決定することができる。粒子濃度は、FCSにより決定されるように、Cy5のモル濃度を、粒子当たりのCy5色素の数で割ることによって得られた。粒子当たりのDBCO基の数は、DBCO基のモル濃度を粒子濃度で割ることによって得た。
エキサテカンペイロードを付着する前の葉酸官能化C’ドットのUV-Visスペクトルを使用して、粒子の濃度およびFR標的化リガンドの濃度を、それぞれ647nm(共有結合により被包されたCy5に相当)および360nm(葉酸標的化リガンドに相当)で、Beer-Lambertの法則を適用することによって決定した。粒子当たりのFR標的化リガンドの数は、FR標的化リガンドのモル濃度を、粒子濃度で割ることによって決定した。FR標的化リガンドの数は、FA-CDCを生成する後続の処理において変化しないままであることが確認されてきた。
同様に、FA-CDCのUV-Visスペクトルを使用して、FA-CDC粒子の濃度ならびに切断可能エキサテカンの濃度を、Beer-Lambertの法則を647nmおよび360nm(葉酸標的化リガンドおよびエキサテカンの両方に相当する)で適用することによって、360nmでFR標的化リガンドの吸光度を差し引いた後に、決定することができる。次いでエキサテカンの濃度を、FA-CDC粒子の濃度で割ることにより、粒子当たりのエキサテカンの数を決定した。
(実施例6)
食塩水、PBS、ヒトおよびマウス血清におけるNDCの安定性
本明細書で生成されたNDCの安定性を、0.9%の食塩水、PBS、ヒト血漿(10%)、およびマウス血漿(10%)中、37℃で、振盪乾燥浴内で種々の期間にわたりインキュベーションした後、評価した。分析前に、試料中の血漿タンパク質を、等体積の冷アセトニトリルの添加を経た沈殿によって除去し、その後、Eppendorf 5425微量遠心分離機で10000rpmで遠心分離した。遠心分離後、透明な上澄みを、遠心管から透明な完全回収HPLCバイアルに移した。目に見えるいかなる凝集もない上澄みを、等体積の脱イオン水で希釈して、HPLC分離の出発条件に一致するようにかつ感度の損失が回避されるように、試料マトリクスを調節した。次いで各試料の純度および不純物を、上述のようにRP-HPLCにより定量した。実施例2および実施例4の方法により生成されたNDCのヒトおよびマウス血清における安定性を、図8A~8Bに提示する。
食塩水、PBS、ヒトおよびマウス血清におけるNDCの安定性
本明細書で生成されたNDCの安定性を、0.9%の食塩水、PBS、ヒト血漿(10%)、およびマウス血漿(10%)中、37℃で、振盪乾燥浴内で種々の期間にわたりインキュベーションした後、評価した。分析前に、試料中の血漿タンパク質を、等体積の冷アセトニトリルの添加を経た沈殿によって除去し、その後、Eppendorf 5425微量遠心分離機で10000rpmで遠心分離した。遠心分離後、透明な上澄みを、遠心管から透明な完全回収HPLCバイアルに移した。目に見えるいかなる凝集もない上澄みを、等体積の脱イオン水で希釈して、HPLC分離の出発条件に一致するようにかつ感度の損失が回避されるように、試料マトリクスを調節した。次いで各試料の純度および不純物を、上述のようにRP-HPLCにより定量した。実施例2および実施例4の方法により生成されたNDCのヒトおよびマウス血清における安定性を、図8A~8Bに提示する。
ナノ粒子コンジュゲート試料(例えば、FA-CDC)は、最初にFA-CDC試料のアリコートを2μM濃度に希釈し、次いで37℃の振盪乾燥浴で活性化組換えヒトカテプシン-Bと共にインキュベートすることにより、強制放出のために調製した。組換えヒトカテプシン-Bを、下記の通り調製した:4μLの0.33μg/μLのカテプシン-Bを、ジチオトレイトールおよび(MES)からなる活性化緩衝液に添加し、pH5.0に調節した。適切なpHを、調製後にpH試験片で確認した。24時間のインキュベーション後、強制放出された遊離エキサテカンを、RP-HPLCの遊離エキサテカン溶出時間で存在する積分面積のパーセンテージによって決定した。この研究の結果を図7に提示する。
標的化されたNDCを組換えヒトCat-B(SI)と共にインキュベートしたとき、エキサテカン薬物の95%超が、当て嵌めから約3.0時間の半減期で48時間以内にNDCから放出され(図7)、がん環境における有効な薬物放出を実証している。ジエン-シラン前駆体を使用して生成された標的化されたNDC(スキーム5に示される)も、マウスおよびヒト血漿中で高い安定性を示し、アミン-シラン前駆体を使用して生成されたそれらの対応物と比べて(スキーム4に示す)著しい安定性の改善を示した(図8Aおよび8B)。エキサテカン薬物の95%超が、マウスおよびヒト血清中で最長7日間にわたりNDC上に残り、これはRP-HPLCクロマトグラムにおけるNDCピークのUV-Visスペクトルにより得られたものであった。一方、遊離エキサテカンをモニタリングする独立したRP-HPLCアッセイは、放出されたエキサテカンがRP-HPLCの検出限界、即ち0.02%よりも下にあることを示し、望ましくない遊離薬物が存在しないことは、それらの高い血漿安定性をさらに実証する。標的化されたNDCは、0.9%の食塩水中、4℃で、高い保存安定性も示した。それらの純度、サイズ分布、および流体力学直径を、RP-HPLC、SEC、およびFCSによりそれぞれ特徴付け、これらは保存条件下で6カ月間にわたり変化しないままであった。そのような高い保存安定性は、臨床移行および商業的製造の両方に関して重要な、別の主要なパラメーターである。
(合成実施例1)
リンカー-ペイロードコンジュゲート前駆体の合成
本明細書に開示される方法での使用に適したリンカー-ペイロードコンジュゲート前駆体は、下記の例示的なプロトコールに従い合成することができる。
(S)-2-アミノ-N-(4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)-6-((ジフェニル(pトリル)メチル)アミノ)ヘキサンアミド(161)の合成
スキーム7: 化合物(161)の合成。
リンカー-ペイロードコンジュゲート前駆体の合成
本明細書に開示される方法での使用に適したリンカー-ペイロードコンジュゲート前駆体は、下記の例示的なプロトコールに従い合成することができる。
(S)-2-アミノ-N-(4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)-6-((ジフェニル(pトリル)メチル)アミノ)ヘキサンアミド(161)の合成
4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)アニリン(159)の合成: イミダゾール(5.54g、81.22mmol)を、(4-アミノフェニル)メタノール(75)(5.0g、40.61mmol)のDMF(25mL)中の溶液に0℃で添加し、その後、tert-ブチル(クロロ)ジフェニルシラン(13.39g、48.73mmol)を添加し、反応混合物を室温で16時間撹拌した。反応の進行をTLCによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水(20mL)でクエンチし、EtOAc(2×200mL)で抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で濃縮し、石油エーテル中10%EtOAcで溶出するシリカゲル(230~400メッシュ)を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)アニリン(159;6.6g)をガムとして得た。LCMS: m/z 362.31[(M+H)+];Rt:2.58分;純度93.68%。
(9H-フルオレン-9-イル)メチル(S)-(1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)カルバメート(160)の合成: ジイソプロピルエチルアミン(4.18mL、24mmol)、HATU(6.08g、16mmol)、および4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)アニリン(159)(2.89g、8mmol)を、N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(ジフェニル(p-トリル)メチル
)-L-リシン(149)(5.0g、8mmol)のDMF(50mL)中の溶液に0℃で添加し、反応混合物を室温で16時間撹拌した。反応の進行をTLCによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を氷水でクエンチした。沈殿した固体を濾過し、真空乾燥して、(9H-フルオレン-9-イル)メチル(S)-(1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)カルバメート(160;5.5g)を固体として得た。LCMS:m/z 990.37[(M+H)+];Rt:2.84分;純度96.79%。
)-L-リシン(149)(5.0g、8mmol)のDMF(50mL)中の溶液に0℃で添加し、反応混合物を室温で16時間撹拌した。反応の進行をTLCによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を氷水でクエンチした。沈殿した固体を濾過し、真空乾燥して、(9H-フルオレン-9-イル)メチル(S)-(1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)カルバメート(160;5.5g)を固体として得た。LCMS:m/z 990.37[(M+H)+];Rt:2.84分;純度96.79%。
(S)-2-アミノ-N-(4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)-6-((ジフェニル(pトリル)メチル)アミノ)ヘキサンアミド(161)の合成: ピペリジン(16.5mL)を、(9H-フルオレン-9-イル)メチル(S)-(1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)カルバメート(160)(5.5g、5.68mmol)のDMF(38.5mL)中の溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。反応の進行をTLCによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、100%EtOAcで溶出するシリカゲル(230~400メッシュ)を使用したカラムクロマトグラフィーにより精製して、(S)-2-アミノ-N-(4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ヘキサンアミド(160;3.5g)をガムとして得た。LCMS:m/z 744.24[(M-H)-];Rt:2.20分;純度90.16%。
4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル(4-ニトロフェニル)カーボネート(191)の合成。
スキーム8: 化合物(191)の合成。
4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル(4-ニトロフェニル)カーボネート(191)の合成。
(9H-フルオレン-9-イル)メチル((S)-1-(((S)-1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバメート(187)の合成: ジイソプロピルエチルアミン(1.54mL、8.83mmol)、HATU(2.24g、5.89mmol)、および(S)-2-アミノ-N-(4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ヘキサンアミド(161)(2.19g、2.94mmol)を、(((N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-L-バリン(1g、2.94mmol)のDMF(20mL)中の溶液に0℃で添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。反応の進行をTLCによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を氷水でクエンチした。沈殿した固体を濾過し、真空乾燥して、(((9H-フルオレン-9-イル)メチル((S)-1-(((S)-1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミ
ノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバメート(187;2.5g)を固体として得た。LCMS:MH+ 1067、保持時間2.42分。
ノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバメート(187;2.5g)を固体として得た。LCMS:MH+ 1067、保持時間2.42分。
(S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)-N-(4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ヘキサンアミド(188)の合成: ピペリジンのDMF(4.5mL)中の30%溶液を、(((9H-フルオレン-9-イル)メチル((S)-1-(((S)-1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバメート(187)(1.5g、1.40mmol)のDMF(6mL)中の溶液に、室温で添加し、反応混合物を室温で2時間撹拌した。反応の進行をTLCによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、100%EtOAcで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、(S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)-N-(4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ヘキサンアミド(188;1.1g)を固体として得た。
1-アジド-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサトリアコンタン-30-アミド(189)の合成: ジイソプロピルエチルアミン(0.49mL、2.83mmol)、HATU(719.47mg、1.89mmol)、および(S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)-N-(4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ヘキサンアミド(188)(800mg、0.94mmol)を、1-アジド-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサトリアコンタン-30-オイック酸(86)(484mg、0.94mmol)のDMF(8mL)中の溶液に0℃で添加し、反応混合物を室温で6時間撹拌した。反応の進行をTLCによってモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水(15mL)でクエンチし、EtOAc(2×30mL)で抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で濃縮し、DCM中3%MeOHで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、1-アジド-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサトリアコンタン-30-アミド(189;0.60g)をガムとして得た。
1-アジド-N-((S)-1-(((S)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサトリアコンタン-30-アミド(190)の合成: NH4F(166mg、4.48mmol)を、1-アジド-N-((S)-1-(((S)-1-((4-(((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサトリアコンタン-30-アミド(189)(600mg、0.44mmol)のメタノール(10mL)中の溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で6時間撹拌した。反応の進行をTLCによってモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残留物を水(15mL)で希釈し、EtOAc(2×20mL)で抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で濃縮し、DCM中5%MeOHで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、1-アジド-N-((S)-1-(((S)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサトリアコンタン-30-アミド(190;0.40g)をガムとして得た。
4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル(4-ニトロフェニル)カーボネート(191)の合成: ピリジン(0.14mL、1.80mmol)および4-ニトロフェニルクロロホルメート(14)(145mg、0.72mmol)を、1-アジド-N-((S)-1-(((S)-6-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)-3,6,9,12,15,18,21,24,2
7-ノナオキサトリアコンタン-30-アミド(190)(400mg、0.36mmol)のDCM(10mL)中の溶液に0℃で添加し、反応混合物を室温で6時間撹拌した。反応の進行をTLCによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、DCM中3%MeOHで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル(4-ニトロフェニル)カーボネート(191;0.34g)をガムとして得た。LCMS:MH+ 1265、保持時間1.33分。
7-ノナオキサトリアコンタン-30-アミド(190)(400mg、0.36mmol)のDCM(10mL)中の溶液に0℃で添加し、反応混合物を室温で6時間撹拌した。反応の進行をTLCによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、DCM中3%MeOHで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル(4-ニトロフェニル)カーボネート(191;0.34g)をガムとして得た。LCMS:MH+ 1265、保持時間1.33分。
4-((32S,35S)-35-(4-アミノブチル)-1-アジド-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)カルバメート(202)の合成。
スキーム9: プロテアーゼ切断可能リンカー-ペイロードコンジュゲート前駆体(202)の合成。
4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)カルバメート(201)の合成: トリエチルアミン(0.09mL、0.62mmol)および(1R,9R)-1-アミノ-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-1,2,3,9,12,15-ヘキサヒドロ
-10H,13H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-10,13-ジオンメタンスルホネート(エキサテカンメシレート;16;131mg、0.25mmol)を、4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル(4-ニトロフェニル)カーボネート(191;311mg、0.25mmol)のNMP(2.5mL)中の溶液に0℃で添加し、混合物を室温で8時間撹拌した。反応の進行をLCMSによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水(15mL)でクエンチし、クロロホルム中10%のメタノール(2×20mL)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム(Na2SO4)上で乾燥し、減圧下で濃縮した。ジエチルエーテルを粗製材料に添加し、得られた沈殿物を濾過し、DCM中5%MeOHで溶出するカラムクロマトグラフィー(Combi-Flash(登録商標))を使用して精製して、4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)カルバメート(201)を固体(0.3g)として得た。LCMS:MH+ 1561、保持時間2.18分。
-10H,13H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-10,13-ジオンメタンスルホネート(エキサテカンメシレート;16;131mg、0.25mmol)を、4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル(4-ニトロフェニル)カーボネート(191;311mg、0.25mmol)のNMP(2.5mL)中の溶液に0℃で添加し、混合物を室温で8時間撹拌した。反応の進行をLCMSによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水(15mL)でクエンチし、クロロホルム中10%のメタノール(2×20mL)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム(Na2SO4)上で乾燥し、減圧下で濃縮した。ジエチルエーテルを粗製材料に添加し、得られた沈殿物を濾過し、DCM中5%MeOHで溶出するカラムクロマトグラフィー(Combi-Flash(登録商標))を使用して精製して、4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)カルバメート(201)を固体(0.3g)として得た。LCMS:MH+ 1561、保持時間2.18分。
4-((32S,35S)-35-(4-アミノブチル)-1-アジド-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)カルバメート(202)の合成: トリフルオロ酢酸(TFA)のDCM中の1%溶液を、4-((32S,35S)-1-アジド-35-(4-((ジフェニル(p-トリル)メチル)アミノ)ブチル)-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)カルバメート(201;300mg、0.19mmol)のDCM(5mL)中の溶液に0℃で添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応の進行をLCMSによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をジエチルエーテルで粉砕し、RP分取HPLCにより精製して、4-((32S,35S)-35-(4-アミノブチル)-1-アジド-32-イソプロピル-30,33-ジオキソ-3,6,9,12,15,18,21,24,27-ノナオキサ-31,34-ジアザヘキサトリアコンタン-36-アミド)ベンジル((1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル)カルバメート(202)(70mg)を固体として得た。
(合成実施例2)
標的化リガンド前駆体の合成
本明細書に開示される方法で使用するのに適した標的化リガンド前駆体は、下記の例示的な合成プロトコールに従い調製することができる。
[0146]
(S)-16-(4-(((2-アミノ-4-オキソ-3,4-ジヒドロプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-1-アジド-13-オキソ-3,6,9-トリオキサ-12-アザヘプタデカン-17-オイック酸(606)の合成
スキーム10: 葉酸受容体標的化リガンド(606)の合成。
標的化リガンド前駆体の合成
本明細書に開示される方法で使用するのに適した標的化リガンド前駆体は、下記の例示的な合成プロトコールに従い調製することができる。
[0146]
(S)-16-(4-(((2-アミノ-4-オキソ-3,4-ジヒドロプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-1-アジド-13-オキソ-3,6,9-トリオキサ-12-アザヘプタデカン-17-オイック酸(606)の合成
化合物600の調製: 化合物599(160g、512mmol)をTFAA(800mL)に25℃で溶解し、暗所で5時間、窒素雰囲気下で撹拌した。次いで溶媒を50℃で真空除去して、粗製生成物を得た。粗製生成物をMTBE(750mL)で60分間粉砕し、次いで濾過して、化合物600(203g、粗製)を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
化合物602の調製: TBTU(238g、740mmol)およびDIPEA(95.7g、740mmol)を、化合物601(225g、529mmol)のDMF(2.25L)中の溶液に添加した。20℃で30分間撹拌した後、2-(2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタン-1-アミン(試薬A;121g、555mmol)を添加し、混合物を50℃で12時間撹拌した。2種の反応混合物を合わせ、後処理し、残留物をH2O(3L)で希釈し、酢酸エチル(1500mL×3)で抽出した。合わせた有機層をブライン(800mL×3)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=100/1から1/1)により精製して、化合物602(590g)を油として得た。
化合物603の調製: N-エチルエタンアミン(1.27kg、17.4mol)を、化合物602(435g、695mmol)のDCM(4.35L)中の溶液に添加し、混合物を25℃で3時間撹拌した。次いで溶媒を室温で真空除去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(DCM/MeOH=100/1から1/1)により精製して、化合物603(245g)を油として得た。
化合物604の調製: TBTU(119g、372mmol)およびDIEA(160g、1.24mol)を、化合物600(101g、248mmol)のDMF(900mL)中の溶液に添加し、混合物を30分間撹拌した。次いでDMF(100mL)中の化合物603(100g、248mmol)を添加した。混合物を25℃で12時間撹拌した。2種の反応混合物を合わせ、濃縮し、残留物をH2O(2.5L)で希釈し、酢酸エチル(1L×5)で抽出した。合わせた有機層をブライン(600mL×3)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物4(420g、粗製)を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
化合物605の調製: K2CO3(585g、4.23mol)を、化合物604(420g、529mmol)のTHF(4.2mL)およびH2O(500mL)中の溶液に添加し、混合物を60℃で0.5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、THFを除去し、残留物をH2O(500mL)で希釈し、HCl(M=1)でpHを3に調節し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物605(260g、粗製)を固体として得、これを精製することなく直接使用した。
化合物606の調製: トリフルオロ酢酸(2.12kg、18.6mol)を、CH2Cl2(2.6L)中の化合物605(260g、373mmol)の混合物に20℃で、窒素下で一度に添加し、混合物を20℃で5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、HPLC(カラム:Agela DuraShell C18 250×80mm×10um;移動相:[水(10mM NH4HCO3)-MeOH];B%:5%~40%、20分)により精製して、与えられた化合物606(52.5g)を固体として得た。(M+H)642.80;IR:2107(N3結合)。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
ナノ粒子を官能化する方法であって、
ナノ粒子と第1の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第1の二官能性前駆体がシラン部分およびジエン部分を含み、前記ナノ粒子が、シランに反応性のある表面(例えば、シリカ表面)を含み、および前記接触させるステップが、前記シラン部分と前記ナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にある、ステップ、ならびに
前記シラン部分と前記ナノ粒子の表面との間に共有結合を形成し、それによってジエン部分で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
を含む、方法。
(項目2)
ジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、第2の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第2の二官能性前駆体が、アルキン部分と、ジエン部分に反応性のある基(例えばジエノフィル、例えばマレイミド)とを含み、前記接触させるステップが、ジエン部分に反応性のある前記基と前記ジエン部分との間の反応に適した条件下にある、ステップ、および
前記ナノ粒子の前記ジエン部分と前記第2の二官能性前駆体とを反応させ、それによってアルキン部分で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記アルキン部分と、アルキン反応性基(例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)を含む化合物とを、前記アルキン部分と前記アルキン反応性基との間の反応に適した条件(例えば、クリックケミストリー条件)下で接触させ、それによって、前記化合物(例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物)で官能化されたナノ粒子を形成するステップをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記ジエン部分が、シクロペンタジエン部分である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記第1の二官能性前駆体が、式(A):
の構造を含み、
式中、
R1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、または-ORA-であり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく、
各R2は、独立して、水素、アルキル、ハロ、または-ORAであり、
RAは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、
ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
nは、0から12の整数であり、および
mは、0から5の整数である、
前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
R2が、-ORAであり、
RAが、アルキル(例えば、エチル)であり、
nが、1から5の整数(例えば、3)であり、および
mが0である、
項目5に記載の方法。
(項目7)
前記第1の二官能性前駆体が、式(A-1):
の構造を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記第2の二官能性前駆体が、式(B):
の構造を含み、
式中、
Xは、ジエノフィル(例えば、電子欠乏アルケン基を含む部分;または環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、または無水マレイン酸)であり、
Yは、2価のリンカー(例えば、置換または非置換ヘテロアルキレン基)であり、
R3およびR4はそれぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、-ORA、-NRBRC、-NO2、-CNであり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく、
RA、RB、およびRCは、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
qおよびpはそれぞれ独立して、0から4の整数であり、および
vは、0から2の整数である、
項目2から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
Xがマレイミドであり、
qおよびpがそれぞれ独立して、0の整数であり、および
vが1の整数である、
項目8に記載の方法。
(項目10)
前記2価のリンカーが、アルキレンまたはヘテロアルキレン基であり、前記アルキレンまたはヘテロアルキレン基は、置換されていないかまたは置換されている(例えば、1個または複数のオキソ基で置換されたアルキレンまたはヘテロアルキレン)、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
前記2価のリンカーが、式(C):
の構造を含み、
式中、各RBは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
xは、0から10の整数であり、および
各
は独立して、前記第2の二官能性前駆体の一部分との付着点(例えば、前記ジエノフィルとのまたは複素環式環の窒素原子との付着)を示す、
項目8から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記第2の二官能性前駆体が、式(B-1):
の構造を含み、
式中、xは0から10の整数(例えば、4)である、
項目8から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記ジエン部分と前記第2の二官能性前駆体とを反応させるステップが、式(NP-1):
の化合物を提供し、
式中、xは0から10の整数(例えば、4)であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
項目12に記載の方法。
(項目14)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、ペイロード部分(例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン)または標的化リガンド(例えば、葉酸受容体(FR)標的化リガンド、例えば葉酸)を含む、項目3から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、式(D)または式(E):
の構造を含み、
式中、
Tは、標的化リガンド(例えば、FR標的化リガンド、例えば葉酸)であり、
Lは、切断可能リンカー部分(例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー部分)であり、
Pは、ペイロード部分(例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン)であり、および
yは、0から20の整数(例えば、3または9)である、
項目3から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記切断可能リンカー部分が、式(F):
の構造を含み、
式中、
[AA]のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり、
zは、1から5の整数であり、
wは、2または3の整数であり、および
各
は、独立して、アルキン反応性基を含む前記化合物の一部分との付着点(例えば、アジド基との付着またはペイロード部分との付着)を示す、
項目15に記載の方法。
(項目17)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、
からなる群より選択される構造を含み、
式中、yは0から20の整数である、
項目3から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記アルキン部分と、アルキン反応性基を含む前記化合物とを反応させるステップが、式(NP-2)または(NP-3):
の化合物を提供し、
式中、
xのそれぞれの場合は、独立して、0から10の整数(例えば、4)であり、
yのそれぞれの場合は、独立して、0から20の整数(例えば3または9)であり、ならびに
(NP-2)および(NP-3)のそれぞれのケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部である、
項目3から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記ナノ粒子が、シリカナノ粒子(例えば、コア-シェルシリカナノ粒子)である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記ナノ粒子(例えば、前記ナノ粒子の表面)が、有機ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)でコーティングされる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記第1の二官能性前駆体の前記シラン部分と、前記ナノ粒子の表面との間に前記共有結合を形成するステップが、前記第1の二官能性前駆体を、前記有機ポリマーの有機ポリマー分子間(例えば、PEG分子間)の間隙空間内に挿入することを含む、項目20に記載の方法。
(項目22)
複数のジエン部分で官能化されたナノ粒子が形成される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
複数のアルキン部分で官能化されたナノ粒子が形成される、項目2に記載の方法。
(項目24)
(a)前記複数のアルキン部分の第1の部分と、アルキン反応性基を含む第1の化合物とを反応させるステップ、および
(b)前記複数のアルキン部分の第2の部分と、アルキン反応性基を含む第2の化合物とを反応させ、それによって、前記第1の化合物および前記第2の化合物で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
をさらに含み、
前記第1の化合物および前記第2の化合物が化学的に異なる、
項目23に記載の方法。
(項目25)
(a)前記第1の化合物が式(D)の化合物(例えば、式(D-1)の化合物)であり、前記第2の化合物が式(E)の化合物(例えば、式(E-1)の化合物)である、または
(b)前記第1の化合物が式(E)の化合物であり、前記第2の化合物が式(D)の化合物である、
項目24に記載の方法。
(項目26)
シリカナノ粒子を官能化する方法であって、
(i)シリカナノ粒子を第1の二官能性前駆体と接触させるステップであって、前記第1の二官能性前駆体が、シラン部分およびシクロペンタジエン部分を含み、前記シリカナノ粒子が、前記シラン部分に反応性のある表面(例えば、シリカ表面)を含み、および前記接触させるステップが、前記シラン部分と前記シリカナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にあり、それによって、前記シラン部分と前記ナノ粒子の表面との間に共有結合を形成し、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供する、ステップ、
(ii)シクロペンタジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、第2の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第2の二官能性前駆体が、アルキン部分(例えば、DBCO)およびジエノフィル(例えば、マレイミド)を含み、前記接触させるステ
ップが、前記ジエノフィルと前記シクロペンタジエン部分との間の反応に適した条件下にあり、それによって、前記ナノ粒子のジエン部分と前記第2の二官能性前駆体とを反応させ、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供する、ステップ、ならびに
(iii)前記アルキン部分と、アジド部分を含む化合物とを、前記アルキン部分とアジド部分との間の反応に適した条件(例えば、クリックケミストリー条件)下で接触させ、それによって、前記ナノ粒子の前記アルキン部分と前記アジド部分とを反応させ、前記化合物(例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物)で官能化されたナノ粒子を提供するステップ
を含む、方法。
(項目27)
シリカナノ粒子を官能化する方法であって、
(i)シリカナノ粒子と、式(A)の構造を含む第1の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供するステップ、
(ii)シクロペンタジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、式(B)の構造を含む第2の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供するステップ、および
(iii)前記アルキン部分と、式(D)の化合物もしくは式(E)の化合物またはその両方の化合物とを接触させ、それによって、標的化リガンド、ペイロード部分、またはその両方で官能化されたナノ粒子を提供するステップ
を含む、方法。
(項目28)
前記第1の二官能性前駆体が、式(A-1):
の構造を含む、項目26または27に記載の方法。
(項目29)
前記第2の二官能性前駆体が、式(B-1):
の構造を含み、
式中、xは0から10の整数(例えば、4)である、
項目26から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
式(D)の化合物が、式D-1:
の構造を含み、
式中、yは0から10の整数(例えば、3)である、
項目27に記載の方法。
(項目31)
式(E)の化合物が、式E-1:
の構造を含み、
式中、yは0から20の整数(例えば、9)である、
項目27に記載の方法。
(項目32)
前記方法は、式(NP-2):
の化合物を含むナノ粒子を提供し、式中、xは4であり、yは3であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
項目29に記載の方法。
(項目33)
前記方法は、式(NP-3):
の化合物を提供し、式中、xは4であり、yは9であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
項目31に記載の方法。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
ナノ粒子を官能化する方法であって、
ナノ粒子と第1の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第1の二官能性前駆体がシラン部分およびジエン部分を含み、前記ナノ粒子が、シランに反応性のある表面(例えば、シリカ表面)を含み、および前記接触させるステップが、前記シラン部分と前記ナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にある、ステップ、ならびに
前記シラン部分と前記ナノ粒子の表面との間に共有結合を形成し、それによってジエン部分で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
を含む、方法。
(項目2)
ジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、第2の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第2の二官能性前駆体が、アルキン部分と、ジエン部分に反応性のある基(例えばジエノフィル、例えばマレイミド)とを含み、前記接触させるステップが、ジエン部分に反応性のある前記基と前記ジエン部分との間の反応に適した条件下にある、ステップ、および
前記ナノ粒子の前記ジエン部分と前記第2の二官能性前駆体とを反応させ、それによってアルキン部分で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記アルキン部分と、アルキン反応性基(例えば、アジド、ジエン、ニトロン、または酸化ニトリル)を含む化合物とを、前記アルキン部分と前記アルキン反応性基との間の反応に適した条件(例えば、クリックケミストリー条件)下で接触させ、それによって、前記化合物(例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物)で官能化されたナノ粒子を形成するステップをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記ジエン部分が、シクロペンタジエン部分である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記第1の二官能性前駆体が、式(A):
式中、
R1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、または-ORA-であり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく、
各R2は、独立して、水素、アルキル、ハロ、または-ORAであり、
RAは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、
ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
nは、0から12の整数であり、および
mは、0から5の整数である、
前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
R2が、-ORAであり、
RAが、アルキル(例えば、エチル)であり、
nが、1から5の整数(例えば、3)であり、および
mが0である、
項目5に記載の方法。
(項目7)
前記第1の二官能性前駆体が、式(A-1):
(項目8)
前記第2の二官能性前駆体が、式(B):
式中、
Xは、ジエノフィル(例えば、電子欠乏アルケン基を含む部分;または環式ジエノフィル、例えばマレイミド、キノン、または無水マレイン酸)であり、
Yは、2価のリンカー(例えば、置換または非置換ヘテロアルキレン基)であり、
R3およびR4はそれぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、-ORA、-NRBRC、-NO2、-CNであり、ここで各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、置換されても置換されなくてもよく、
RA、RB、およびRCは、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
qおよびpはそれぞれ独立して、0から4の整数であり、および
vは、0から2の整数である、
項目2から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
Xがマレイミドであり、
qおよびpがそれぞれ独立して、0の整数であり、および
vが1の整数である、
項目8に記載の方法。
(項目10)
前記2価のリンカーが、アルキレンまたはヘテロアルキレン基であり、前記アルキレンまたはヘテロアルキレン基は、置換されていないかまたは置換されている(例えば、1個または複数のオキソ基で置換されたアルキレンまたはヘテロアルキレン)、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
前記2価のリンカーが、式(C):
式中、各RBは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
xは、0から10の整数であり、および
各
項目8から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記第2の二官能性前駆体が、式(B-1):
式中、xは0から10の整数(例えば、4)である、
項目8から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記ジエン部分と前記第2の二官能性前駆体とを反応させるステップが、式(NP-1):
式中、xは0から10の整数(例えば、4)であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、
項目12に記載の方法。
(項目14)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、ペイロード部分(例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン)または標的化リガンド(例えば、葉酸受容体(FR)標的化リガンド、例えば葉酸)を含む、項目3から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、式(D)または式(E):
式中、
Tは、標的化リガンド(例えば、FR標的化リガンド、例えば葉酸)であり、
Lは、切断可能リンカー部分(例えば、プロテアーゼ切断可能リンカー部分)であり、
Pは、ペイロード部分(例えば、細胞毒性薬物、例えばエキサテカン)であり、および
yは、0から20の整数(例えば、3または9)である、
項目3から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記切断可能リンカー部分が、式(F):
式中、
[AA]のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり、
zは、1から5の整数であり、
wは、2または3の整数であり、および
各
項目15に記載の方法。
(項目17)
アルキン反応性基を含む前記化合物が、
式中、yは0から20の整数である、
項目3から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記アルキン部分と、アルキン反応性基を含む前記化合物とを反応させるステップが、式(NP-2)または(NP-3):
式中、
xのそれぞれの場合は、独立して、0から10の整数(例えば、4)であり、
yのそれぞれの場合は、独立して、0から20の整数(例えば3または9)であり、ならびに
(NP-2)および(NP-3)のそれぞれのケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部である、
項目3から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記ナノ粒子が、シリカナノ粒子(例えば、コア-シェルシリカナノ粒子)である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記ナノ粒子(例えば、前記ナノ粒子の表面)が、有機ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)でコーティングされる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記第1の二官能性前駆体の前記シラン部分と、前記ナノ粒子の表面との間に前記共有結合を形成するステップが、前記第1の二官能性前駆体を、前記有機ポリマーの有機ポリマー分子間(例えば、PEG分子間)の間隙空間内に挿入することを含む、項目20に記載の方法。
(項目22)
複数のジエン部分で官能化されたナノ粒子が形成される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
複数のアルキン部分で官能化されたナノ粒子が形成される、項目2に記載の方法。
(項目24)
(a)前記複数のアルキン部分の第1の部分と、アルキン反応性基を含む第1の化合物とを反応させるステップ、および
(b)前記複数のアルキン部分の第2の部分と、アルキン反応性基を含む第2の化合物とを反応させ、それによって、前記第1の化合物および前記第2の化合物で官能化されたナノ粒子を形成するステップ
をさらに含み、
前記第1の化合物および前記第2の化合物が化学的に異なる、
項目23に記載の方法。
(項目25)
(a)前記第1の化合物が式(D)の化合物(例えば、式(D-1)の化合物)であり、前記第2の化合物が式(E)の化合物(例えば、式(E-1)の化合物)である、または
(b)前記第1の化合物が式(E)の化合物であり、前記第2の化合物が式(D)の化合物である、
項目24に記載の方法。
(項目26)
シリカナノ粒子を官能化する方法であって、
(i)シリカナノ粒子を第1の二官能性前駆体と接触させるステップであって、前記第1の二官能性前駆体が、シラン部分およびシクロペンタジエン部分を含み、前記シリカナノ粒子が、前記シラン部分に反応性のある表面(例えば、シリカ表面)を含み、および前記接触させるステップが、前記シラン部分と前記シリカナノ粒子表面との間の反応に適した条件下にあり、それによって、前記シラン部分と前記ナノ粒子の表面との間に共有結合を形成し、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供する、ステップ、
(ii)シクロペンタジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、第2の二官能性前駆体とを接触させるステップであって、前記第2の二官能性前駆体が、アルキン部分(例えば、DBCO)およびジエノフィル(例えば、マレイミド)を含み、前記接触させるステ
ップが、前記ジエノフィルと前記シクロペンタジエン部分との間の反応に適した条件下にあり、それによって、前記ナノ粒子のジエン部分と前記第2の二官能性前駆体とを反応させ、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供する、ステップ、ならびに
(iii)前記アルキン部分と、アジド部分を含む化合物とを、前記アルキン部分とアジド部分との間の反応に適した条件(例えば、クリックケミストリー条件)下で接触させ、それによって、前記ナノ粒子の前記アルキン部分と前記アジド部分とを反応させ、前記化合物(例えば、ペイロードまたは標的化リガンドを含む化合物)で官能化されたナノ粒子を提供するステップ
を含む、方法。
(項目27)
シリカナノ粒子を官能化する方法であって、
(i)シリカナノ粒子と、式(A)の構造を含む第1の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、シクロペンタジエン部分で官能化されたナノ粒子を提供するステップ、
(ii)シクロペンタジエン部分で官能化された前記ナノ粒子と、式(B)の構造を含む第2の二官能性前駆体とを接触させ、それによって、アルキン部分で官能化されたナノ粒子を提供するステップ、および
(iii)前記アルキン部分と、式(D)の化合物もしくは式(E)の化合物またはその両方の化合物とを接触させ、それによって、標的化リガンド、ペイロード部分、またはその両方で官能化されたナノ粒子を提供するステップ
を含む、方法。
(項目28)
前記第1の二官能性前駆体が、式(A-1):
(項目29)
前記第2の二官能性前駆体が、式(B-1):
式中、xは0から10の整数(例えば、4)である、
項目26から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
式(D)の化合物が、式D-1:
式中、yは0から10の整数(例えば、3)である、
項目27に記載の方法。
(項目31)
式(E)の化合物が、式E-1:
式中、yは0から20の整数(例えば、9)である、
項目27に記載の方法。
(項目32)
前記方法は、式(NP-2):
項目29に記載の方法。
(項目33)
前記方法は、式(NP-3):
項目31に記載の方法。
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