KR20170094268A

KR20170094268A - 향상된 신경-결합 선택성을 갖는 고리형 펩티드, 상기 고리형 펩티드와 결합된 나노입자, 및 실시간 생체내 신경 조직 영상화를 위한 이들의 용도

Info

Publication number: KR20170094268A
Application number: KR1020177017894A
Authority: KR
Inventors: 미쉘 에스. 브래드버리; 바니 유; 울리히 위즈너; 페이밍 첸; 카이 마; 스네할 쥐. 파텔; 다니엘라 카라싸와 자노니
Original assignee: 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터; 코넬 유니버시티
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2017-08-17
Also published as: CA2970719C; BR112017012621A2; US20190351077A1; RU2017122621A; JP2018506512A; ES2794778T3; CN107249647A; JP6751715B2; US10335501B2; AU2015362663B2; EP3233134B1; US10940216B2; EP3233134A1; AU2015362663A1; WO2016100340A1; US20160166714A1; CA2970719A1

Abstract

고리형 펩티드, 고리형 펩티드와 결합된 나노입자, 및 수술중 신경 조직 영상화를 위해 상기 고리형 펩티드 및/또는 상기 고리형 펩티드와 결합된 나노입자를 이용하는 방법이 본원에 기재된다.

Description

향상된 신경-결합 선택성을 갖는 고리형 펩티드, 상기 고리형 펩티드와 결합된 나노입자, 및 실시간 생체내 신경 조직 영상화를 위한 이들의 용도{CYCLIC PEPTIDES WITH ENHANCED NERVE-BINDING SELECTIVITY, NANOPARTICLES BOUND WITH SAID CYCLIC PEPTIDES, AND USE OF SAME FOR REAL-TIME IN VIVO NERVE TISSUE IMAGING}

관련 출원의 전후 참조

본 출원은 본문의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2014년 12월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 62/092,191호의 이익을 주장한다.

정부 지원

본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여되는 수여 번호 NIH NCI U54 CA199081-01 하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다.

발명의 분야

본 발명은 고리형 펩티드, 고리형 펩티드와 결합된 나노입자, 및 수술중 신경 조직 영상화를 위해 상기 고리형 펩티드 및/또는 상기 고리형 펩티드와 결합된 나노입자를 이용하는 방법에 관한 것이다.

배경

많은 외과적 시술은 만성 동통 또는 마비와 같은 유의한 문제를 발생시킬 수 있는 우발적 신경 손상 또는 가로절단의 위험을 갖는다. 수술 중에 신경 조직을 강조함으로써 강조된 신경 조직을 절단하거나 손상시키는 것을 피하는 외과의사의 능력을 향상시키는 근적외선(NIR) 작용제의 사용이 연구되었었다. 예를 들어, 디스티릴벤젠 및 옥사진 유도체와 같은 분자가 사용되었으나, 이들은 인간 및 다른 포유동물에서의 수술중 사용에 효과적이기 위해 필요한 결합 특징 및/또는 스펙트럼 특성이 결여되어 있다.

휘트니 등(Whitney et al.)은 절제된 뮤린 말초 신경에 대해 파지 디스플레이 방법을 적용시킴으로써 몇몇 신경 결합 폴리펩티드를 확인하였다(Whitney, M. A.; Crisp, J. L.; Nguyen, L. T.; Friedman, B.; Gross, L. A.; Steinbach, P.; Tsien, R. Y.; Nguyen, Q. T. Nat. Biotech. 2011, 29, 352). 이후, 서열이 형광단 또는 NIR 염료로 표지되었고, 결합에 대해 시험관내 및 생체내 평가되었다. 백그라운드에 비해 가장 높은 대조를 제공한 서열은 17-잔기의 폴리펩티드 NP41(도 1a)이었다. 신경 조직에 대한 향상된 선택성 및 수술중 사용을 위한 개선된 스펙트럼 특성을 갖는 신경-결합 작용제가 필요하다.

개요

한 양태에서, 본 발명은 고리형 펩티드; 나노입자; 형광 작용제; 및 링커 모이어티를 포함하는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 선형 폴리펩티드; 나노입자; 형광 작용제; 및 링커 모이어티를 포함하는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트에 관한 것이다.

특정 구체예(어느 한 양태의 구체예)에서, 나노입자는 실리카-기반 코어; 코어 내의 형광 작용제; 코어의 적어도 일부를 둘러싸는 실리카 쉘; 나노입자에 부착된 링커 모이어티; 및 선택적으로 중합체-코팅된 나노입자에 부착된 1 내지 20개의 펩티드 리간드를 포함한다.

특정 구체예(어느 한 양태의 구체예)에서, 나노입자는 초소형 입자(예를 들어, 100 nm 미만, 예를 들어, 50 nm 미만, 예를 들어, 30 nm 미만, 예를 들어, 20 nm 미만, 예를 들어, 10 nm 미만의 평균 직경을 가짐)(예를 들어, 초소형 나노입자는 C 도트(dot) 또는 C' 도트임)이다.

특정 구체예(어느 한 양태의 구체예)에서, 링커 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG₂, 및 파라-아미노벤질옥시 카르바메이트(PABC)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 일원을 포함한다(예를 들어, 링커 모이어티는 2 내지 50개의 원자를 갖는다). 특정 구체예에서, 링커 모이어티는 본문의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0343091호로 공개된 2015년 5월 27일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/722,307호에 기재된 링커 모이어티 중 하나 이상을 포함한다.

특정 구체예에서, 고리형 펩티드는 링커 모이어티를 통해 나노입자에 결합된다. 특정 구체예(어느 한 양태의 구체예)에서, 형광 작용제는 시아닌 염료, 예를 들어, Cy5 또는 Cy5.5를 포함한다. 특정 구체예(어느 한 양태의 구체예)에서, 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트는 5 내지 20개의 아미노산 잔기 및/또는 15개의 원자 내지 60개의 원자의 거대고리를 갖는다. 특정 구체예(어느 한 양태의 구체예)에서, 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트는 17개의 아미노산 잔기 및/또는 51개의 원자의 거대고리를 갖는다.

특정 구체예에서, 고리형 펩티드는 펩티드 서열 NTQTLAKAPEHT를 포함한다. 특정 구체예에서, 거대고리는 펩티드의 머리와 꼬리를 고리화시키거나, 서열 내부에 공유 결합을 도입시킴으로써 형성된다. 특정 구체예에서, 고리형 펩티드는 TYTDWLNFWAWP, KSLSRHDHIHHH, 및 DFTKTSPLGIH로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 펩티드 서열 NTQTLAKAPEHT를 포함하는 고리형 펩티드에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 TYTDWLNFWAWP, KSLSRHDHIHHH, 및 DFTKTSPLGIH로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함하는 고리형 펩티드에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 형광 작용제; 및 펩티드 서열 NTQTLAKAPEHT를 포함하는 고리형 펩티드를 포함하는 고리형 펩티드 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 형광 작용제; 및 TYTDWLNFWAWP, KSLSRHDHIHHH, 및 DFTKTSPLGIH로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함하는 고리형 펩티드를 포함하는 고리형 펩티드 조성물에 관한 것이다.

특정 구체예에서, 고리형 펩티드는 거대고리를 포함한다. 특정 구체예에서, 거대고리는 펩티드의 머리와 꼬리를 고리화시키거나, 서열 내부에 공유 결합을 도입시킴으로써 형성된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 도 1b 또는 도 4a-4h에 제시된 구조를 갖는 고리형 펩티드를 포함하는 고리형 펩티드 조성물에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 고리형 펩티드는 나노입자에 부착된다. 특정 구체예에서, 고리형 펩티드는 링커 모이어티를 통해 나노입자에 공유적 또는 비공유적으로 부착된다. 특정 구체예에서, 고리형 펩티드는 작용기화된다.

상기 양태 중 임의의 양태의 특정 구체예에서, 조성물은 방사성표지를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태 중 어느 한 양태의 조성물을 포함하는 제형을 대상체에 투여하여 조성물이 대상체의 신경 조직에 선택적으로 결합하도록 하는 단계; 대상체의 조직을 여기 광에 노출시키는 단계; 및 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 이미지를 생성시키고 이미지를 디스플레이하는 단계를 포함하는 영상화 방법에 관한 것이다.

특정 구체예에서, 신경 조직으로부터 방출된 광은 주위 조직으로부터 방출된 광보다 더 강하여(예를 들어, 신경 대 근육 신호비는 적어도 2임), 신경 조직이 주위 조직과 시각적으로 구별될 수 있다. 특정 구체예에서, 신경 조직으로부터 방출된 광은 적어도 대상체(예를 들어, 대상체는 동물, 예를 들어, 대상체는 인간임)로의 제형의 투여 15분 후만큼 초기에 검출 가능하다. 특정 구체예에서, 신경 조직으로부터 방출된 광은 대상체(예를 들어, 대상체는 동물, 예를 들어, 대상체는 인간임)로의 제형의 투여 후 적어도 1시간(예를 들어, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 또는 적어도 4시간)만큼 길게 검출 가능하다.

특정 구체예에서, 투여는 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기에 제형을 국소적으로 적용하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 말초 신경줄기(예를 들어, 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기)에 제형을 국소적으로 적용하는 단계, 제형의 조성물이 신경줄기로부터 신경 조직의 더 작은 가지로 확산되도록 하는 단계, 및 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 신경 조직의 더 작은 가지의 이미지를 생성시키는 단계를 포함한다.

특정 구체예에서, 제형은 정맥내(I.V.) 투여된다. 특정 구체예에서, 제형은 국소 투여된다. 특정 구체예에서, 여기 광에 대한 대상체의 조직 노출은 외과적 시술 동안 발생한다. 특정 구체예에서, 이미지는 비디오 및/또는 스틸 이미지 및/또는 실시간 비디오이다. 특정 구체예에서, 이미지는 대상체에 대해 수행되는 외과적 시술 동안 외과의사에게 디스플레이된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 조직을 여기 광, 대상체에 투여되는 상기 양태 중 어느 한 양태의 조성물을 포함하는 제형에 노출시키는 단계; 및 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하는 단계를 포함하는 영상화 방법에 관한 것이다.

특정 구체예에서, 검출 단계는 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 이미지를 생성시키고, 이미지를 디스플레이하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

특정 구체예에서, 신경 조직으로부터 방출된 광은 주위 조직으로부터 방출된 광보다 더 강하여(예를 들어, 신경 대 근육 신호비는 적어도 2임), 신경 조직이 주위 조직과 시각적으로 구별될 수 있다. 특정 구체예에서, 신경 조직으로부터 방출된 광은 적어도 대상체(예를 들어, 대상체는 동물, 예를 들어, 대상체는 인간임)로의 제형의 투여 15분 후만큼 초기에 검출 가능하다. 특정 구체예에서, 신경 조직으로부터 방출된 광은 대상체(예를 들어, 대상체는 동물, 예를 들어, 대상체는 인간임)로의 제형의 투여 후 적어도 1시간(예를 들어, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 또는 적어도 4시간)만큼 길게 검출 가능하다. 특정 구체예에서, 제형은 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기에 국소적 적용에 의해 투여되었다. 특정 구체예에서, 제형은 말초 신경줄기(예를 들어, 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기)에 국소적 적용에 의해 투여되어, 제형의 조성물이 신경줄기로부터 신경 조직의 더 작은 가지로 확산되었고, 상기 방법은 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 신경 조직의 더 작은 가지의 이미지를 생성시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 제형은 정맥내(I.V.) 투여된다. 특정 구체예에서, 제형은 국소 투여된다.

특정 구체예에서, 여기 광에 대한 대상체의 조직 노출은 외과적 시술 동안 발생한다. 특정 구체예에서, 검출 단계는 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 이미지를 생성시키고, 이미지를 디스플레이하는 단계를 포함하며, 이미지는 비디오 및/또는 스틸 이미지 및/또는 실시간 비디오이다. 특정 구체예에서, 이미지는 대상체에 대해 수행되는 외과적 시술 동안 외과의사에게 디스플레이된다.

정의

본 발명의 개시가 더욱 용이하게 이해되도록 하기 위해, 특정 용어가 먼저 하기에서 정의된다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가 정의는 명세서 전체에 걸쳐 기재되어 있다.

본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "-들을 포함하다" 및 이러한 용어의 변형, 예를 들어, "-들을 포함하는" 및 "-을 포함하다"는 다른 부가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제하고자 하는 것이 아니다. 본 출원에서 사용되는 용어 '약" 및 "대략"은 동등하게 사용된다. 약/대략을 갖거나 갖지 않는 본 출원에서 사용되는 임의의 수는 관련 분야의 당업자에 의해 인지되는 임의의 일반적인 변동을 포함하는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 해당하는 값의 범위를 나타낸다(상기 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 예외이다).

"투여" : 용어 "투여"는 물질 또는 제형을 대상체로 도입시키는 것을 나타낸다. 일반적으로, 예를 들어, 비경구(예를 들어, 정맥내), 경구, 국소, 피하, 복막, 동맥내, 흡입, 질, 직장, 비, 뇌척수액으로의 도입, 또는 신체 구획으로의 점적주입을 포함하는 임의의 경로의 투여가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 투여는 경구 투여이다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 구체예에서, 투여는 비경구 투여이다. 일부 구체예에서, 투여는 정맥내 투여이다. 특정 구체예에서, 물질 또는 제형은 IV 투여에 대해 국소 주사를 통해 투여된다. 예를 들어, 펩티드-함유 조성물(예를 들어, 입자-함유 조성물 및 비-입자 함유 조성물 둘 모두)을 갖는 물질 또는 제형은 영상화 목적을 위해 충분히 높은 농도로 국소 주사될 수 있다. 특정 구체예에서, 비-입자 펩티드 함유 조성물은 IV를 통해 투여된다.

" 생체적합성 ": 본원에서 사용되는 용어 "생체적합성"은 생체내에서 실질적인 해로운 반응을 유발하지 않는 물질을 기재하기 위한 것이다. 특정 구체예에서, 물질은 세포에 대해 독성인 아닌 경우에 "생체적합성"이다. 특정 구체예에서, 물질은 시험관 내에서 이들의 세포에 대한 첨가가 20% 이하의 세포 사멸을 발생시키고/시키거나, 생체내에서의 이들의 투여가 염증 또는 다른 유해 효과를 유도하지 않는 경우에 "생체적합성"이다. 특정 구현예에서, 물질은 생물분해성이다.

" 생물분해성 ": 본원에서 사용되는 "생물분해성" 물질은 세포로 도입되는 경우 세포 기구(예를 들어, 효소적 분해)에 의해거나, 세포에 대한 유의한 독성 효과 없이 세포가 재사용하거나 배치할 수 있는 성분으로의 가수분해에 의해 분해되는 물질이다. 특정 구체예에서, 생물분해성 물질의 분해에 의해 생성된 성분은 생체내에서 염증 및/또는 다른 유해 효과를 유도하지 않는다. 일부 구체예에서, 생물분해성 물질은 효소적으로 분해된다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구체예에서, 생물분해성 물질은 가수분해에 의해 분해된다. 일부 구체예에서, 생물분해성 중합체 물질은 이들의 성분 중합체로 분해된다. 일부 구체예에서, 생물분해성 물질(예를 들어, 생물분해성 중합체 물질을 포함함)의 분해는 에스테르 결합의 가수분해를 포함한다. 일부 구체예에서, 물질(예를 들어, 생물분해성 중합체 물질을 포함함)의 분해는 우레탄 결합의 분해를 포함한다.

" 담체 ": 본원에서 사용되는 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트, 부형제, 또는 비히클을 나타낸다. 상기 약학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어, 물 및 오일, 예를 들어, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등일 수 있다. 물 또는 수용액 염수 용액 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이 바람직하게는 담체, 특히 주사용 용액으로 사용된다. 적합한 약학적 담체는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다.

" 검출기 ": 본원에서 사용되는 "검출기"는 CCD 카메라, 광전자 증배관, 포토다이오드, 및 애벌런치 포토다이오드(avalanche photodiode)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 전자기 방사선 검출기를 나타낸다.

" 이미지 ": 본원에서 사용되는 용어 "이미지"는 시각적 디스플레이 또는 시각적 디스플레이에 대해 해석될 수 있는 임의의 데이터 표현을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 3차원 이미지는 3개의 공간 차원에서 변화하는 제공된 양의 값의 데이터세트를 포함할 수 있다. 3차원 이미지(예를 들어, 3차원 데이터 표현)는 2차원(예를 들어, 2차원 스크린 또는 2차원 인쇄출력)으로 디스플레이될 수 있다. 용어 "이미지"는, 예를 들어, 광학 이미지, x-선 이미지, 양전자 방출 단층촬영(PET), 자기 공명(MR), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 및/또는 초음파에 의해 발생된 이미지, 및 이들의 임의의 조합을 나타낼 수 있다.

" 펩티드 " 또는 " 폴리펩티드 ": 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 2개(예를 들어, 적어도 3개)의 아미노산의 스트링(string)을 나타낸다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 자연 발생 아미노산을 포함하고; 대안적으로 또는 추가로, 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 비-자연 아미노산(즉, 자연적으로 발생하지 않으나, 폴리펩티드 사슬로 통합될 수 있는 화합물; 예를 들어, 기능성 이온 채널로 성공적으로 통합된 비-자연 아미노산의 구조를 나타내는 http://www.cco.caltech.edu/^~dadgrp/Unnatstruct.gif 참조)을 포함하고/하거나, 당 분야에 공지된 바와 같은 아미노산 유사체가 대안적으로 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 내의 아미노산 중 하나 이상은, 예를 들어, 화학적 존재물, 예를 들어, 탄수화물 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 컨쥬게이션, 작용기화를 위한 링커의 첨가, 또는 다른 변형 등에 의해 변형될 수 있다.

" 방사성표지 ": 본원에서 사용되는 "방사성표지"는 적어도 하나의 원소의 방사성 동위원소를 포함하는 모이어티를 나타낸다. 예시적인 적합한 방사성표지는 본원에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 방사성표지는 양전자 방출 단층촬영(PET)에서 사용되는 것이다. 일부 구체예에서, 방사성표지는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)에서 사용되는 것이다. 일부 구체예에서, 방사성 동위원소는 ^99mTc, ¹¹¹In, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F,¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁷Lu, ¹⁴⁹Pm, ⁹⁰Y, ²¹³Bi, ¹⁰³Pd, ¹⁰⁹Pd, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁰La, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Dy, ⁶⁷Cu, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹Ag, ⁸⁹Zr, ²²⁵Ac, 및 ¹⁹²Ir을 포함한다.

" 대상체 ": 본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 및 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 돼지, 고양이, 개, 및 말)을 포함한다. 많은 구체예에서, 대상체는 포유동물, 특히 영장류, 특히 인간이다. 일부 구체예에서, 대상체는 가축, 예를 들어, 축우, 양, 염소, 소, 돼지 등; 가금, 예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조 등; 및 길들여진 동물, 특히 애완동물, 예를 들어, 개 및 고양이이다. 일부 구체예에서(예를 들어, 특히 연구 상황에서), 대상체 포유동물은, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류, 또는 돼지, 예를 들어, 순계교배 돼지 등일 것이다.

" 실질적으로 ": 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 나타낸다. 생물학 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 완료된다 하더라도 좀처럼 완료되고/되거나 완료까지 진행되지 않거나, 절대적 결과를 달성하거나 회피하는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적 결핍을 포착하기 위해 본원에서 사용된다.

" 치료제 ": 본원에서 사용되는 구 "치료제"는 대상체에 투여되는 경우 치료적 효과를 갖고/갖거나 바람직한 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유발하는 임의의 작용제를 나타낸다.

" 치료 ": 본원에서 사용되는 용어 "치료"(또는 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질병, 장애, 및/또는 질환의 하나 이상의 증상, 특징, 및/또는 원인을 부분적으로 또는 완전히 완화시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나, 경감시키고/시키거나, 억제하고/하거나, 이들의 발생을 지연시키고/시키거나, 이들의 중증도를 감소시키고/시키거나, 이들의 발생률을 감소시키는 물질의 임의의 투여를 나타낸다. 상기 치료는 관련 질병, 장애, 및/또는 질환의 징후를 나타내지 않은 대상체 및/또는 질병, 장애, 및/또는 질환의 단지 초기 징후만 나타낸 대상체의 치료일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 치료는 관련 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 확립된 징후를 나타낸 대상체의 치료일 수 있다. 일부 구체예에서, 치료는 관련 질병, 장애, 및/또는 질환으로부터 고통받는 것으로 진단된 대상체의 치료일 수 있다. 일부 구체예에서, 치료는 관련 질병, 장애, 및/또는 질환의 증가된 발생 위험과 통계적으로 관련된 하나 이상의 민감성 인자를 갖는 것으로 공지된 대상체의 치료일 수 있다.

제한이 아닌 예시 목적으로 도면이 본원에 제시된다.

도면의 간단한 설명
본 발명의 개시의 상기 및 다른 목적, 양태, 특징 및 장점은 수반되는 도면과 함께 취해지는 하기 설명을 참조함으로써 더욱 명백해지고 더 잘 이해될 것이다:
도 1a - 1d는 신경 결합 펩티드-Cy5 컨쥬게이트의 예를 제시한다.
도 1a는 Cy5(Ac = N 말단의 아세틸기)를 갖는 선형 신경 결합 펩티드를 제시한다.
도 1b는 Cy5를 갖는 고리형 신경 결합 펩티드를 제시한다.
도 1c는 선형 펩티드의 액체 크로마토그래피 질량분광법(LCMS)을 제시한다.
도 1d는 고리형 펩티드의 LCMS를 제시한다. LCMS에 대해, 샘플은 Waters, 4.6 x 50 mm C18 컬럼, 물(0.1% TFA) 중 5-95% 아세토니트릴에서 10분 동안 이동되었다. 생성물을 확인하는 질량분광법 데이터는 흑색 박스 내에 있다.
도 2는 다양한 형태의 폴리펩티드(예를 들어, 무작위, 고리형, 선형)로 처리된 좌골 신경 표본을 제시한다. 신경 샘플은 실온에서 30분 동안 50 μM의 폴리펩티드와 함께 인큐베이되고, PBS로 3회 세척되었다. 이미지는 생체내 영상화 시스템(IVIS) 시스템에서 획득되었다. 실험은 이중으로 수행되었다.
도 3은 신경 결합 단백질(NBP)-폴리에틸렌 글리콜(PEG)-Cy5.5-C' 도트의 개략도를 제시한다. 염료는 실리카 쉘 내에 캡슐화되고, 펩티드로 표면-작용기화된다.
도 4a - 4h는 고상 펩티드 합성기에 의한 17개 아미노산(AA)의 서열 펩티드, 트렁케이션된 서열 펩티드(예를 들어, 10-AA, 14-AA) 및 스크램블된 서열 펩티드의 합성된 선형 및 고리형 형태를 제시한다. LC-MS를 이용한 HPLC 프로파일 및 특성규명이 또한 제시된다.
도 5는 인간 사체 신경 표본에 대해 펩티드-NIR 염료 컨쥬게이트와 펩티드-작용기화 딥 레드(deep red)/NIR 염료-함유(Cy5, Cy5.5) C 도트를 비교하는 생체외 결합/흡수 연구를 제시한다. 신경 결합에 대한 펩티드 서열, 형태, 및 리간드 수의 효과가 시험되었다.
도 6은 펩티드-염료 컨쥬게이트 또는 펩티드-작용기화 C 도트의 인간 좌골 신경 및 근육 흡수를 제시한다.
도 7a 및 7b는 광학 영상화 방법을 이용한 신경 결합 펩티드 또는 펩티드-작용기화 C 도트와의 인큐베이션 후의 생체외 인간 좌골 신경 표본에서의 시변 신호 변화를 제시한다.
도 8은 펩티드-Cy5 염료 컨쥬게이트와의 인큐베이션 후의 인간 좌골 신경 표본의 표준화된 형광 신호 강도를 제시한다.
도 9a - 9e는 냉동-절제된 펩티드-염료 컨쥬게이트 전처리된 인간 좌골 신경 표본의 형광 현미경검사를 제시한다.
도 10a - 10e는 펩티드-염료 컨쥬게이트 또는 형광 신경 결합 펩티드(NBP)-작용기화 입자-기반 프로브(예를 들어, Cy5-NBP-C 도트)와의 인큐베이션 후 인간 좌골 신경 표본의 단면 형광 현미경검사를 제시한다.
도 11a 및 11b는 인간 좌골 신경 표본에서의 17 AA 잔기의 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 국소화를 제시한다.
도 12는 400 nmole의 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 주사 후 인간 좌골 신경의 시간 의존적 생체내 형광 현미경검사를 제시한다.
도 13a - 13e는 17 AA 고리형 신경 결합 펩티드의 주사 후 시간에 대한 좌골 신경 및 근육 형광 신호의 생체내 영상화를 제시한다.
도 14a 및 14b는 17 AA 선형 신경 결합 펩티드의 주사 후 시간에 대한 좌골 신경 및 근육 형광 신호의 생체내 영상화를 제시한다.
도 15는 thy1-YFP 트랜스제닉 마우스에서의 150 nmole의 고리형 대 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 주사 후 인간 좌골 신경의 시간 의존적 생체내 형광 현미경검사를 제시한다.
도 16a - 16e는 150 nmole의 17 AA 고리형 신경 결합 펩티드의 주사 후 시간에 대한 좌골 신경 및 근육 형광 신호의 생체내 영상화를 제시한다.

상세한 설명

설명 전체에 걸쳐, 조성물이 특정 성분을 갖거나, 함유하거나, 포함하는 것으로 기재되거나, 방법이 특정 단계를 갖거나, 함유하거나, 포함하는 것으로 기재되는 경우, 언급된 성분으로 필수적으로 구성되거나, 언급된 성분으로 구성되는 본 발명의 조성물, 및 언급된 처리 단계로 필수적으로 구성되거나, 언급된 처리 단계로 구성되는 본 발명에 따른 방법이 추가로 존재하는 것으로 간주된다.

단계의 순서 또는 특정 작용을 수행하기 위한 순서는 본 발명이 실시 가능한 한 중요하지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 2개 이상의 단계 또는 작용이 동시에 수행될 수 있다.

예를 들어, 배경 섹션에서의 임의의 간행물의 본원의 언급은 상기 간행물이 본원에 제시된 청구범위 중 임의의 청구범위에 대한 선행 기술로서 작용하는 것을 인정하는 것이 아니다. 배경 섹션은 명확성을 목적으로 제시되며, 임의의 청구범위와 관련된 선행 기술의 설명을 의미하지 않는다.

본원에 기재된 실험에서, 선형 폴리펩티드는 고리화되어 더욱 견고한 구조 및 결합 친화성 및 선택성에서의 향상을 발생시켰다. 제시된 연구에 대해, 용매로서 디메틸포름아미드(DMF) 및 커플링 작용제로서 (벤조트리아졸-1-일옥시) 트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP)를 이용하여 최적화된 조건 및 높은 생성물 수율이 달성되었다.

첫째로, 선형 폴리펩티드 NP41이 합성되고, 시험을 위해 NIR 염료 Cy5로 표지되었다. 도 1a에 제시된 구조는 도 1c에 제시된 바와 같이 LCMS에 의해 확인되었다. 도 1a의 NP41 구조의 고리형 유사체가 또한 합성되었다. 도 1b에 제시된 고리형 펩티드의 구조는 또한 도 1d에 제시된 바와 같이 LCMS에 의해 확인되었다. 대조군으로서, 무작위 폴리펩티드 (Ac-SHSSTARDLWPHGKEGC)가 Cy5로 표지되고, 평가되었다. 도 2에 제시된 바와 같이, 고리형 화합물은 좌골 신경 표본에 대해 스크램블 및 선형 폴리펩티드에 비해 유의하게 향상된 형광 강도(2 내지 3배)를 나타내었다. 고리형 화합물은 또한 선형 및 스크램블된 폴리펩티드 둘 모두에 비해 향상된 신경 조직 선택성(근육 조직에 비함)을 나타내었다.

도 4a - 4h는 본원에 기재된 신경 결합 실험에 대한 다양한 펩티드-염료 컨쥬게이트 형태(예를 들어, 선형, 고리형, 스크램블)의 합성 및 특성규명을 제시한다. 예를 들어, 고상 펩티드 합성기에 의한 17개 아미노산(AA)의 서열 펩티드, 트렁케이션된 서열 펩티드(10-AA, 14-AA) 및 스크램블된 서열 펩티드의 합성된 선형 및 고리형 형태. 펩티드는 액체상에서 시스테인 잔기에서 Cy5-말레이미드로 표지되었다. 최종 생성물은 prep-HPLC를 이용하여 95% 초과의 수율로 정제되었다. 최종 생성물의 순도 및 질량이 각각의 표에 제시된 바와 같이 분석 HPLC 및 LC-MS에 의해 특성규명되고 확인되었다. 최종 신경 결합 펩티드 생성물은 이후 C' 도트에 부착되어 생체내 및 생체외 연구를 위한 다가 플랫폼이 생성되었다.

양자 증진 및 형광 상관 분광법(FCS) 휘도를 개선시키기 위해, 고리형 화합물은 나노입자, 예를 들어, 필립스(Phillips)의 문헌[Phillips E, Penate-Medina O, Zanzonico PB, Carvajal RD, Mohan P, Ye Y, Humm J,

M, Kaliagian H,

H, Strauss W, Larson SM, Wiesner U, Bradbury MS. Clinical Translation of an Ultrasmall Optical Hybrid Nanoparticle Probe. Science Translational Medicine. 2014;6(260)]에 기재된 바와 같은 C 도트 및/또는 Cy5.5를 통합시킨 새로운 세대의 PET 방사성표지(¹²⁴I) FDA-IND 승인된 cRGDY-작용기화 C' 도트인 C' 도트 상/내에 결합(또는 그렇지 않은 경우 통합)될 수 있다. 형광 실리카 전구체는 반응성 염료 종과 오가노실리케이트 공급원을 커플링시킴으로써 발달된다. 하이브리드 전구체는 이후 가수분해되고 순수한 실리카와 축합되어 하이브리드 유기/무기 코어가 발생된다. 이들 코어는 순수한 실리카 쉘의 성장을 위한 이종성 핵으로 작용하고, 이는 캡슐화된 염료를 추가로 보호한다. (Burns, A., OW, H., Wiesner, U. Fluorescent core-shell silica nanoparticles: towards “Lab on a Particle” architectures for nanobiotechnology. Chem Soc Rev. 2006; 35(11):1028-42)(도 3). 형광 코어를 갖는 코어-쉘 나노입자는 또한 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 8,298,677호 및 8,409,876호에 기재되어 있다.

특정 구체예에서, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bradbury et al. Integr . Biol. (2013) 5:74-86]에 기재된 특징이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Herz et al. J. Mater. Chem. (2009) 19, 6341-6347]에 기재된 특징(예를 들어, 프로브 종)이 이용될 수 있다.

특정 구체예에서, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2011년 1월 6일에 WO2011/003109호 및 2014년 9월 18일에 WO2014/145606호로 공개된 브래브베리 등(Bradbury et al.)의 국제 PCT 특허 출원 번호 PCT/US2010/040994호 및 PCT/US2014/030401호에 기재된 특징(예를 들어, 나노입자)이 이용될 수 있다.

특정 구체예에서, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2012년 10월 30일에 공개된 비스너 등(Wiesner et al.)의 미국 특허 번호 8298677호에 기재된 특징(예를 들어, 나노입자)이 이용될 수 있다.

도 3은 본 발명의 예시적 구체예에 따른 NBP-PEG-Cy5.5-C' 도트의 개략도를 제시한다. NBP는 하기에서 본원에 추가로 상세히 기재되는 특정한 고리형 신경-결합 펩티드이다. Cy5.5 염료는 고리형 NBP 구조에 첨부된 것으로 제시되고, Cy5.5는 또한 실리카 코어에 도핑된 것으로 제시된다. 특정 구체예에서, 염료는 고리형 펩티드에 부착되고, 나노입자에 부착되거나, 나노입자 내에 함유되거나, 나노입자에 결합되거나, 나노입자와 달리 직접적으로 회합되지 않는다. 특정 구체예에서, 염료는 고리형 펩티드에 부착되지 않고, 나노입자에 부착되고/되거나, 나노입자 내에 함유되고/되거나, 나노입자에 결합되고/되거나, 나노입자와 달리 직접적으로 회합된다.

백그라운드에 비한 신호 증진을 입증하기 위해, 선형 폴리펩티드 NP41이 PEG 컨쥬게이션을 통해 C' 도트에 결합되었고, 양자 증진 및 FCS 휘도에서의 결과로서 발생된 개선이 측정되었다(표 1). 유사하게, 고리형 펩티드(들)은 결합되지 않은 고리형 펩티드에 비해 개선된 양자 증진 및 FCS 휘도를 위해 나노입자에 결합될 수 있다.

표 1은 선형 NBP-C' 도트의 특성규명 데이터를 제시한다. 측정은 형광 상관 분광법(FCS)으로 결정되었다.

표 1

인간 사체 신경 조직 표본에 특이적인 새로운 인간 신경 결합 펩티드 서열(예를 들어, 신경 선택성 마커)을 확인하기 위해 파지 디스플레이 접근법이 이용될 수 있다. 절제된 뮤린 신경 조직에 성공적으로 적용된 강력한 유전 도구인 파지 디스플레이는 인간 안면 및 후두 신경 표본과 함께 이용되어 이들 신경 조직에 대한 선택성을 갖는 새로운 NBP 서열을 확인할 수 있다. 신경 조직에 대한 유리한 전반적인 결합 친화성 및 선택성을 나타내는 펩티드 서열은 C 도트로의 부착 후 다중 적용에 이용될 수 있다.

특정 구체예에서, 파지 디스플레이는 109개의 독립적인 클론 또는 서열의 복잡성을 갖는 무작위 12-잔기 펩티드의 조합 라이브러리를 이용한다(New England BioLabs). m13 파지 벡터는 pIII 코트 단백질에 융합된 무작위 펩티드의 5가 디스플레이를 제공한다. 파지는 다수 횟수의 양성 및 음성 선택을 거친다. 준비된 안면(또는 후두) 신경 조직에 결합하는 파지는 분리, 시퀀싱 및 증폭을 통해 확실하게 선택된다. 파지는 이후 음성 선택 단계를 거치며, 이는 좌골 조직과 인큐베이션될 것이고, 결합하지 않은 파지가 선택된다. 이러한 선택 주기는 명백한 서열이 반복적으로 관찰될 때까지 지속될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 서열 NTQTLAKAPEHT, 또는 더욱 특히 Ac-SHSNTQTLAKAPEHTGC를 포함하는 선형 폴리펩티드 NP41 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드의 고리형 형태를 이용하여 실험이 수행되었다(도 1b에 제시됨). 각각의 폴리펩티드는 형광 염료로 작용기화되었다. 특정 구체예에서, 다른 검출 가능한 마커가 이용될 수 있고, 다른 펩티드 서열이 이용될 수 있다. NP41의 코어 서열은 NTQTLAKAPEHT이다. 실험에서 사용된 NP41 폴리펩티드는 N-말단에 부착된 아세틸-SHS-기 및 C-말단에 부착된 -GC 기를 포함하는 한편, 다른 구체예는 다른 말단기를 사용할 수 있다(또는 말단 기 없음). 제시된 예에서, -SHS- 기는 파지 코트 단백질로부터 포함되고, -GC는 염료에 대해 포함된다. 임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 폴리펩티드의 선형 형태를 화학적으로 구속하는 것이 결합을 향상시키는 것으로 보인다. 신경 조직 선택성을 갖는 다른 폴리펩티드는 또한 그대로(as-is) 사용될 수 있고/있거나, 나노입자에 결합될 수 있고/있거나, 고리화될 수 있고/있거나, 고리화되고 나노입자에 결합될 수 있고, 예를 들어, 적합한 링커 화학(예를 들어, PEG)을 이용하여 나노입자에 결합될 수 있다. 예를 들어, 사용되고/되거나, 고리화되고/되거나, 나노입자에 결합될 수 있는 다른 폴리펩티드는 휘트니 등의 선형 폴리펩티드, 예를 들어, 서열 TYTDWLNFWAWP; NTQTLAKAPEHT; KSLSRHDHIHHH; 및/또는 DFTKTSPLGIH를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

특정 구체예에서, 다른 폴리펩티드가 사용된다. 예를 들어, 본원에 개시된 서열 중 임의의 서열이 길이에 있어서 추가되거나, 변형되거나, 감소될 수 있다. 본원에 기재된 실험은 아미드 화학을 이용하여 머리-대-꼬리 고리화 펩티드를 형성하나, 공유적 구속이 내부적으로 도입될 수 있고/있거나(예를 들어, 머리-대-꼬리와 반대됨), 다른 화학(예를 들어, 클릭, 이황화물, 치환(metathesis) 등)이 또한 작용할 것이다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 5 내지 20개의 아미노산 잔기 및/또는 15개의 원자 내지 60개의 원자의 거대고리(예를 들어, 고리를 형성하는 원자의 수, 예를 들어, 15 내지 60원 고리)를 갖는다.

일반적으로, 본원에 기재된 구체예의 실시에서 사용되는 나노입자는 실리카-기반 나노입자, 예를 들어, C 도트 또는 C' 도트이며, 이들은 검출 가능한 작용제(예를 들어, 유기 염료, 방사성표지) 및 펩티드 표적화 리간드(들)과 함께 주입되거나, 이들로 코팅되거나, 이들과 달리 결합되거나 회합된다. 특정 구체예에서, 실리카-기반 나노입자, 예를 들어, C 도트 또는 C' 도트는 펩티드와의 작용기화 전에 10 nm 이하의 평균 크기(예를 들어, 직경)를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 실리카-기반 나노입자, 예를 들어, C 도트 또는 C' 도트는 펩티드와의 작용기화 전에 10 nm 초과의 평균 크기를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 평균 입자 크기, 입자 크기 분포, 및/또는 휘도는 특정 적용을 위해 맞춤화된다. 특정 구체예에서, 중합체-기반 나노입자가 사용된다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드-검출 가능한 작용제-나노입자 물질(선형 또는 고리형 펩티드 및 이에 부착되거나 이와 달리 회합되는 검출 가능한 작용제를 갖는 나노입자)은 비독성이고, 신장을 통해 효율적으로 청소된다. 특정 구체예에서, 염료는 펩티드에 결합된다(나노입자에 직접 결합되지 않음). 특정 구체예에서, 염료는 펩티드가 아니라 나노입자에 결합되거나, 나노입자 내에 통합되거나, 나노입자와 달리 회합된다. 특정 구체예에서, 염료는 나노입자와 회합되고, 염료는 펩티드에 결합된다.

특정 구체예에서, 실리카-기반 나노입자는 다수의 상이한 폴리펩티드로 표면-작용기화될 수 있다. 특정 구체예에서, 다수의 폴리펩티드가 별개의 판독으로 검출 가능한 다수의 검출 작용제와 함께 주입되거나, 다수의 검출 작용제로 코팅되거나, 다수의 검출 작용제와 달리 결합되거나 회합될 수 있다. 특정 구체예에서, 실리카-기반 나노입자는 동시에 또는 상이한 시간에 이용되어 수술중 사용을 위한 표적화된 리간드의 다중 광 검출을 수행할 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 독특한 표면-작용기화된 표적화 리간드를 각각 함유하는 2개 이상의 스펙트럼적으로 별개의 실리카-기반 나노입자가 사용되어 수술중 사용을 위한 다가 구조를 생성시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 독특한 표면-작용기화된 표적화 리간드를 각각 함유하는 스펙트럼적으로 별개의 실리카-기반 나노입자는 별개의 검출 양식에 의해 측정 가능한 징후를 방출하여 다중 양식 판독 작용성도(functionality)를 생성시킬 수 있다.

본원에 기재된 시스템 및 방법은 형광 실리카-기반 나노입자를 이용하는 생체내 영상화 시스템 및 방법과 관련되고 참조로서 본원에 포함되는 2013년 2월 14일에 US 2013/0039848호로 공개된 미국 특허 출원 번호 13/381,209호에 기재된 시스템 및 방법과 함께 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 프로브 종 중 적어도 하나는 나노입자를 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 실리카 구조 및 염료-풍부 코어를 갖는다. 일부 구체예에서, 염료 풍부 코어는 형광 리포터를 포함한다. 일부 구체예에서, 형광 리포터는 근적외선 또는 원적외선 염료이다. 일부 구체예에서, 형광 리포터는 형광단, 형광색소, 염료, 색소, 형광 전이 금속, 및 형광 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 형광 리포터는 Cy5, Cy5.5, Cy2, FITC, TRITC, Cy7, FAM, Cy3, Cy3.5, 텍사스 레드(Texas Red), ROX, HEX, JA133, AlexaFluor 488, AlexaFluor 546, AlexaFluor 633, AlexaFluor 555, AlexaFluor 647, DAPI, TMR, R6G, GFP, 증진된 GFP, CFP, ECFP, YFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, CyPet, AMCA, 스펙트럼 그린(Spectrum Green), 스펙트럼 오렌지(Spectrum Orange), 스펙트럼 아쿠아(Spectrum Aqua), 리사민(Lissamine) 및 유로퓸(Europium)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

특정 구체예에서, 형광 작용제(들)는 범위 내의 적색 및 근적외선 스펙트럼에서 여기 및 방출 파장을 갖는다. 특정 구체예에서, 형광 작용제(들)는 400 내지 1300 nm, 또는 440 내지 1100 nm, 또는 550 내지 800nm, 또는 600 내지 900 nm 범위의 여기 및 방출 파장을 갖는다. 상기 부분의 전자기 스펙트럼의 이용은 조직 투과를 최대화시키고, 생리학적으로 풍부한 흡수제, 예를 들어, 헤모글로빈(<650 nm) 및 물(>1200 nm)에 의한 흡수를 최소화시킨다. 가시광선 및 자외선 광 스펙트럼과 같은 다른 스펙트럼에서 여기 및 방출 파장을 갖는 프로브 종이 또한 특정 구체예에서 사용될 수 있다. 특히, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,747,159호(Caputo et al. (2004)); 미국 특허 번호 6,448,008호(Caputo et al. (2002)); 미국 특허 번호 6,136,612호(Della Ciana et al. (2000)); 미국 특허 번호 4,981,977호(Southwick, et al. (1991)); 5,268,486호(Waggoner et al. (1993)); 미국 특허 번호 5,569,587호(Waggoner (1996)); 5,569,766호(Waggoner et al. (1996)); 미국 특허 번호 5,486,616호(Waggoner et al. (1996)); 미국 특허 번호 5,627,027호(Waggoner (1997)); 미국 특허 번호 5,808,044호(Brush, et al. (1998)); 미국 특허 번호 5,877,310호(Reddington, et al. (1999)); 미국 특허 번호 6,002,003호(Shen, et al. (1999)); 미국 특허 번호 6,004,536호(Leung et al. (1999)); 미국 특허 번호 6,008,373호(Waggoner, et al. (1999)); 미국 특허 번호 6,043,025호(Minden, et al. (2000)); 미국 특허 번호 6,127,134호(Minden, et al. (2000)); 미국 특허 번호 6,130,094호(Waggoner, et al. (2000)); 미국 특허 번호 6,133,445호(Waggoner, et al. (2000)); 미국 특허 번호 7,445,767호(Licha, et al. (2008)); 미국 특허 번호 6,534,041호(Licha et al. (2003)); 미국 특허 번호 7,547,721호(Miwa et al. (2009)); 미국 특허 번호 7,488,468호(Miwa et al. (2009)); 미국 특허 번호 7,473,415호(Kawakami et al. (2003)); 또한 WO 96/17628호, EP 0 796 111 B1호, EP 1 181 940 B1호, EP 0 988 060 B1호, WO 98/47538호, WO 00/16810호, EP 1 113 822 B1호, WO 01/43781호, EP 1 237 583 A1호, WO 03/074091호, EP 1 480 683 B1호, WO 06/072580호, EP 1 833 513 A1호, EP 1 679 082 A1호, WO 97/40104호, WO 99/51702호, WO 01/21624호, 및 EP 1 065 250 A1호; 및 문헌[Tetrahedron Letters 41, 9185-88 (2000)]에서와 같이 형광단, 예를 들어, 특정 카르보시아닌 또는 폴리메틴 형광성 형광색소 또는 염료가 형광 작용제로 사용될 수 있다.

예시적인 형광 작용제는, 예를 들어, 다음을 포함한다: Cy5.5, Cy5, Cy7.5 및 Cy7(GE^® Healthcare); AlexaFluor660, AlexaFluor680, AlexaFluor790, 및 AlexaFluor750(Invitrogen); VivoTag™680, VivoTag™-S680, VivoTag™-S750(VisEn Medical); Dy677, Dy682, Dy752 및 Dy780(Dyomics^®); DyLight^® 547, 및/또는 DyLight^® 647(Pierce); HiLyte Fluor™ 647, HiLyte Fluor™ 680, 및 HiLyte Fluor™ 750(AnaSpec^®); IRDye^® 800CW, IRDye^® 800RS, 및 IRDye^® 700DX(Li-Cor^®); ADS780WS, ADS830WS, 및 ADS832WS(American Dye Source); XenoLight CF™ 680, XenoLight CF™ 750, XenoLight CF™ 770, 및 XenoLight DiR(Caliper^® Life Sciences); 및 Kodak^® X-SIGHT^® 650, Kodak^® X-SIGHT 691, Kodak^® X-SIGHT 751(Carestream^® Health). 특정 구체예에서, 링커 모이어티는 실리카-기반 나노입자와 펩티드 및/또는 검출 가능한 마커를 연결시키기 위해 배열된 말단에 2개 이상의 작용기(이기능성, 삼기능성 등)를 갖는 화학 모이어티이다. 본원에 기재된 실험 예에서, 나노입자에 폴리펩티드(예를 들어, 선형 또는 고리형 펩티드)를 결합시키기 위한 링커 모이어티로서 PEG가 사용되었다. 다른 링커 모이어티가 사용될 수 있다. C' 도트(또는 다른 나노입자)와 폴리펩티드 사이의 간격은, 예를 들어, 상이한 크기의 PEG(또는 다른 링커) 사슬을 이용하여 다양화될 수 있다. 특정 구체예에서, 링커 모이어티는 본문의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0343091호로 공개된 2015년 5월 27일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/722,307호에 기재된 링커 모이어티 중 하나 이상을 포함한다.

특정 구체예에서, 신경 결합 펩티드-작용기화 C 도트 또는 펩티드-염료 컨쥬게이트는 상이한 형태(예를 들어, 고리형, 선형) 및 길이(예를 들어, 트렁케이션됨, 신장됨)를 가지며, 손상의 위험을 감소시키기 위해 상기 작용제의 부재하에서 잘 시각화되지 않는 SLN 맵핑 시술 동안의 작은 원위의 신경 가지 및/또는 분포를 묘사하고 대조를 유의하게 향상시키기 위해 외과적 노출 후에 안면, 좌골, 하복, 후두 신경을 포함하나 이에 제한되지는 않는 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기에 국소적으로 투여된다.

특정 구체예에서, 이들 펩티드-작용기화 입자 프로브 또는 펩티드-염료 컨쥬게이트는 인접한 정상 신경, 예를 들어, 안면 신경에 의한 이들의 흡수를 촉진시키기 위해 원발성 종양 부위 또는 병에 걸린 결절(예를 들어, 이하선) 부근에 국소적으로 투여될 수 있다.

특정 구체예에서, 물질 또는 제형은 IV 투여에 대해 국소 주사를 통해 투여된다. 예를 들어, 펩티드-함유 조성물(예를 들어, 입자-함유 조성물 및 비-입자 함유 조성물 둘 모두)을 갖는 물질 또는 제형은 영상화 목적을 위해 충분히 높은 농도로 국소 주사될 수 있다. 특정 구체예에서, 비-입자 펩티드 함유 조성물은 IV를 통해 투여된다. 특정 구체예에서, 입자-함유 조성물이 영상화 목적에 충분히 높은 농도에서 너무 점성인 경우 IV 주사에 비해 국소 주사가 바람직하다.

새로운 고리형 펩티드 또는 입자-기반 생성물은 현재 기재된 화합물과 비교하여 개선된 광물리적 및 신경 결합 특성을 제공할 수 있다.

특정 구체예에서, 상기 경로 중 하나 이상을 통해 투여되는 신경 결합 펩티드-작용기화 C 도트는 이들의 우수한 다가성 향상, 개선된 표적 부위 결합/보존, 및 광물리학적 특징으로 인해 간단한 형광 염료 단독의 주입에 의해 달성 가능한 것과 반대로 높은 신경-대-근육 대조로 신경 구조가 최대로 시각화되도록 한다. 이들 생성물은 암 표적(예를 들어, 암-보유 결절)으로 향하는 펩티드-결합된 입자 프로브와 함께 다중 적용에서 사용하기 위해 적합화될 수 있다.

특정 구체예에서, 가시 염료(예를 들어, 가시 스펙트럼 내의 염료, 예를 들어, 그린(green) 염료, 예를 들어, FITC)가 국소적으로 또는 IV를 통해 투여될 수 있고, 형광 신호에 의해 신경을 관찰하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 펩티드-결합된 가시 염료는 신경 조직에 우선적으로 부착하며, 염료로부터의 광이 외과의사 자신의 시력으로 관찰될 수 있다. 예를 들어, 제형은 신경 자체에 국소적으로 또는 신경 근처에 국소적으로 적용될 수 있고, 예를 들어, 제형은 말초 신경줄기(예를 들어, 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근)에 국소적으로 적용될 수 있어, 제형의 조성물이 신경줄기로부터 신경 조직의 더 작은 가지로 확산하도록 할 수 있다. 광은 조성물의 형광 작용제에 의해 방출되고, 검출되고 디스플레이(예를 들어, 실시간으로 검출 및 디스플레이)될 수 있거나, 외과적 시술 동안 조력이 없는 자신의 시력으로 외과의사에 의해 직접 관찰되도록 충분히 밝을 수 있다. 신경 조직으로의 국소 적용(및 이후의 신경 조직을 통한 확산)은 더 큰 대조를 제공할 수 있는데, 이는 제형의 정맥내 투여에 비해 혈액 단백질(예를 들어, 헤모글로빈)으로부터의 백그라운드 신호가 감소될 수 있기 때문이다.

실험예

선형 및 고리형 신경 결합 폴리펩티드-Cy5 컨쥬게이트의 합성

선형 NP41(도 1a) 및 이의 고리형 유사체(도 1b)를 표준 Fmoc-기반 고상 펩티드 합성(SPSS) 프로토콜을 이용하여 클로로트리틸 수지에서 합성하였다. 선형 폴리펩티드를 TFA:TIS:EDT:물(85:5:5:5)의 칵테일로 펩티드-수지의 분해/탈보호 후, 역상 HPLC 정제에 의해 획득하였다. 고리형 유사체를 제조하기 위해, N-말단 Fmoc 기를 제거한 후, 완전히 보호된 선형 폴리펩티드를 헥사플루오로이소프로판올을 이용하여 가벼운 조건하에서 수지로부터 분해시켰다. N-말단 및 C-말단 잔기가 용액 중에서 연결되어 바람직한 고리형 전구체를 제공하는 분자내 커플링 반응에 의해 머리-대-꼬리 고리형 유사체를 획득하였다. 미정제 물질을 이후 전체적으로 탈보호시키고, 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 이러한 합성 접근법을 이용하여, 바람직한 51원의 거대고리 펩티드 생성물을 용이하게 획득하였다. 이러한 크기의 고리형 펩티드는 합성적으로 도전적인 것임이 인지되어야 한다. 그러나, 여기서 사용된 접근법은 우수한 순도(예를 들어, 95% 초과) 및 우수한 수율(약 40%)을 갖는 고리형 생성물을 제공하였다. 선형 및 고리형 펩티드 둘 모두를 시스테인 잔기의 자유 티올을 말레이미도-Cy5로 변형시킴으로써 형광 표지시켰다. 최종 생성물을 도 1a 내지 1d에 제시된 바와 같이 LCMS에 의해 특성규명하고 확인하였다.

선형 폴리펩티드-나노입자 컨쥬게이트(선형 NBP-C' 도트)의 합성

선형 신경 결합 폴리펩티드(NBP) NP41을 PEG 링커 모이어티를 이용하여 C' 도트로 통합시켰다. 표 1에 제시된 바와 같이, Cy5 염료의 측정된 휘도는 자유 폴리펩티드에 대해서보다 NBP-C' 도트에 대해 적어도 130% 더 크다.

생체외 인간 좌골 신경 조직으로의 결합

무작위 대조군 폴리펩티드(Ac-SHSSTARDLWPHGKEGC)와 함께 선형 및 고리형 펩티드를 Cy5로 표지시키고, 생체외 인간 신경 조직 샘플로의 결합에 대해 평가하였다. 사용된 조직 샘플은 미 국립 질병 연구 교류회(NDRI)에 의해 새로이 절제되고 획득된 사체 좌골 신경이었다. 조직 샘플을 24-웰 플레이트에서 제조하고, PBS로 세척한 후, 실온에서 50 uM의 선형, 고리형, 또는 스크램블된 폴리펩티드와 함께 인큐베이션하였다. 15분 후, 샘플을 PBS를 이용하여 수회 세척하였다. 플레이트를 IVIS 스펙트럼 영상화 시스템을 이용하여 이미지화시켰다. 도 2에 제시된 바와 같이, 전체적으로 고리형 화합물은 좌골 신경 표본에 대해 스크램블 및 선형 폴리펩티드에 비해 유의하게 향상된 형광 강도(2 내지 3배), 및 근육 조직보다 나은 선택성을 나타내었다.

도 5는 인간 사체 좌골 신경을 1-cm 길이의 단편으로 절단하고, 실온에서 80분 동안 펩티드 또는 펩티드-결합된 C 도트의 15 μM 용액에서 인큐베이션한 후, 포스페이트 완충 염수로 다수 세척한 것을 제시한다. IVIS 스펙트럼 영상화에 의한 인큐베이션 80분 후에 획득된 관심 비-침습성 영역 분석은 증가된 광학 신호(가장 높은 것으로부터 가장 낮은 순)를 나타내었다: 17-아미노산(AA) 잔기의 펩티드-작용기화 고리형 C 도트(상부 좌측); 17 AA 잔기의 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트(상부 우측); 17 AA 잔기의 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트(중간 우측); 17 AA 스크램블된 고리형 펩티드-작용기화 C 도트(하부 좌측). 후자의 2개의 프로브를 대조군으로 제공하였다.

도 6은 펩티드-염료 컨쥬게이트 또는 펩티드-작용기화 C 도트 용액에서 인큐베이션된 신경 및 근육(대조군) 표본의 생체외 형광 신호 측정을 제시한다. 신경 및 근육 조직 표본을 가벼운 진탕과 함께 실온에서 80분 동안 15 μM 펩티드-염료 컨쥬게이트 또는 펩티드-작용기화 C 도트 용액에서 인큐베이션한 후, PBS로 세척하였다. IVIS 스펙트럼에서의 영상화 후, ROI 분석을 수행하였다. 막대는 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 그룹 당 N=5. 각각의 복제물은 하나의 생물학적 실험으로부터 유래된 것으로 5개의 독립적 시야각으로 정량되었다. 근육 조직 표본과 반대로 신경에서 더 높은 형광 신호가 관찰되었다. 최대 형광 신호가 17 AA 잔기의 고리형 펩티드-작용기화 C' 도트에 대해 측정되었고, 그 다음은 17 AA 잔기의 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트, 17 AA 잔기의 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트, 및 스크램블된 고리형 펩티드-작용기화 C 도트였다. 유사한 프로브와 함께 인큐베이션된 근육 조직 표본과 비교하여 신경에서 적어도 4 내지 거의 5배 더 큰 신호가 관찰되었다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 데이터는 펩티드-염료 컨쥬게이트 및 펩티드-작용기화 C 도트 둘 모두의 선택적 흡수 및 보존을 암시한다.

도 7a 및 7b는 광학 영상화 방법을 이용한 신경 결합 펩티드 또는 펩티드-작용기화 C 도트와의 인큐베이션 후의 흡수에서의 시간 의존적 신호 변화를 제시한다. 신경 결합 펩티드(예를 들어, 고리형, 선형, 스크램블) 또는 상응하는 펩티드-작용기화 C 도트와 함께 인큐베이션된 생체외 인간 좌골 신경 표본에서 시변 흡수를 평가하기 위해 광학 영상화를 이용하였다. 막대는 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 그룹 당 N=5. 각각의 복제물은 하나의 생물학적 실험으로부터 유래된 것으로 5개의 독립적 시야각으로 정량되었다. 인큐베이션된 신경 표본에서의 상대 표준화 형광 신호는 대조군 입자 프로브(예를 들어, 스크램블된 펩티드-결합된 C 도트)에 비해 20분에서 약 80% 및 80%에서 거의 100%인 것으로 밝혀졌다. 추가로, 자연 선형 펩티드와 비교하는 경우, 17 AA 고리형 펩티드-작용기화 C 도트에 대해 20분에서 60% 이상의 신호(예를 들어, 80분에서 거의 100%)가 발견되었다.

도 8은 신경 결합/흡수 특성에 대한 펩티드 서열 길이 및 형태의 효과를 제시한다. 서열 특이성 및 형태에 대한 결합/흡수의 의존성을 평가하기 위해 인간 좌골 신경 표본을 17 AA, 트렁케이션된 14-AA, 및 고리형 형태를 갖는 트렁케이션된 10-AA 잔기 펩티드 서열의 15 μM 용액에서 인큐베이션하였다. 선형 17 AA 펩티드-염료 컨쥬게이트를 사용하여 형태의 영향을 결정하였다. 스크램블된 서열 펩티드의 고리형 형태를 대조군으로 이용하였다. 막대는 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 그룹 당 N=5. 각각의 복제물은 하나의 생물학적 실험으로부터 유래된 것으로 5개의 독립적 시야각으로 정량되었다. 관심 영역은 단면 이미지로부터 획득한 것이다. 최대 형광 신호가 17 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트 처리를 이용하여 관찰되었고, 그 다음은 14-AA 고리형 펩티드-염료 및 10 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 형광 신호였다. 17 AA 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트 처리와 비교하여 17 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트 처리로 광학 신호에서의 2배 초과의 변화가 관찰되었다.

도 9a - 9e는 신경 결합/흡수에 대한 펩티드 서열 길이 및 형태의 효과를 제시한다. 15 μM 펩티드-염료 컨쥬게이트 용액과 인간 좌골 신경 절편의 인큐베이션 후에 선택적 신경 결합/흡수를 평가하였다. 예비-인큐베이션된 신경 조직을 OCT에 포매시키고, 횡단면으로 냉동 절제(20μm)하였다. 5x 대물렌즈 및 Cy5 필터 세트의 형광 현미경검사를 이용하여 선형 및 스크램블된 펩티드 작제물에 비해 17 AA 잔기의 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트에 대해 최대 형광 신호가 관찰되었다. 모든 Cy5 형광 이미지를 동일한 노출 및 표준화 설정으로 획득하였다. 축척 막대 = 200 μm.

도 10a - 10e는 80분 동안 15 μM 신경 결합 펩티드-작용기화 C 도트 또는 펩티드와 함께 인큐베이션된 신경 표본의 형광 신호를 제시한다. 처리된 신경 조직을 세척하고, 슬라이드 상에 냉동-절제(15 μm)하고, 형광 현미경(5x 대물렌즈)에 의해 관찰하였다(도 10a - 10d). 관심 영역(ROI)은 다양한 프로브의 처리 후 신경 표본 상에 위치되었다. 17 AA 고리형 펩티드-작용기화 C 도트, 및 그 다음으로 17 AA 고리형 또는 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트 또는 스크램블된 고리형 펩티드-염료 작용기화 C 도트와 인큐베이션된 표본에서 형광 신호(가장 높은 것으로부터 가장 낮은 순서, 도 10e 참조)가 관찰되었다.

도 11a 및 11b는 80분 동안 17 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트 용액(15 μM)에서 예비 인큐베이션된 냉동 절제된 좌골 신경 표본(20 μm)을 관찰하기 위해 역상 현미경(x20)을 사용한 것을 제시한다. FluoroMyelin 그린(미엘린 마커)을 사용하여 신경 절편을 공동 염색한 후, PBS 세척하고, 역상 현미경(X20)으로 스캐닝하였다. 영상화 결과는 펩티드와 상기 미엘린 마커의 공동-국소화를 나타내지 않았으며; 17 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트는 주로 신경외막 및 신경다발막을 수반하는 것으로 관찰된 반면, 상대적으로 더 작은 정도의 Cy5 신호가 신경내막 내에서 관찰되었다.

생체내 인간 좌골 신경 조직으로의 결합

도 12는 400 nmole의 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 인간 좌골 신경 주사 후의 시간 의존적 생체내 형광 현미경검사를 제시한다.

도 13a - 13e는 광학 영상화를 이용한 17 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 iv 주사 후 좌골 신경 및 근육으로부터의 생체내 시간 의존적 흡수를 제시한다. 외과적 노출 및 형광 영상화 능력을 갖는 Zeiss Lumar 입체현미경(0.8X 대물렌즈)을 이용한 좌골 신경 및 인접 근육의 영상화 전에 17 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트(Cy5 표지됨)를 누드 마우스의 꼬리 정맥으로 정맥내 주사(400 nmole)하였다. 주사 전 및 일련의 주사 후(p.i.) 이미지(밝은 영역, 형광)를 15분에서 240분 p.i.까지 8개의 시점에서 획득하였다. 막대는 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 그룹 당 N=5. 각각의 복제물은 하나의 생물학적 실험으로부터 유래된 것으로 5개의 독립적 시야각으로 정량되었다. 관심 영역(ROI) 분석을 신경 및 근육 영역에 대해 수행하여 시간 의존적 신호 변화를 평가하였다. 도 13a - 13e는 각각 신경(도 13a 및 13b) 및 인접 근육(도 13b 및 13d)의 절대 및 상대 형광 신호(예를 들어, 15분 p.i.에서 획득된 최초 형광 신호의 백분율)를 제시한다. 도 13e는 4시간의 기간에 걸쳐 약 1.2에서 거의 2.0으로 증가된 시변 신경-대-근육 또는 대조비를 제시하며, 이는 시간에 따른 신경 표본에 의한 선택적 흡수 및 보존을 암시한다.

도 13a - 13e는 고리화된 펩티드가 (주위) 근육으로부터의 신호와 대조적으로 신경으로부터의 우수한 형광 신호를 제공하는 것을 제시한다. 예를 들어, 근육 조직으로부터의 신호에 비해 신경 조직으로부터의 신호의 비가 높을수록, 신경 조직이 주위(백그라운드) 조직과 시각적으로 더 잘 구별된다(예를 들어, 실시간, 수술중). 선형 펩티드는 높은 비율을 나타내지 않았다. 도 13a - 13e는 또한 선형 펩티드에 비해 고리화된 펩티드의 신호가 더 오래 지속되고, 근육 조직에 비한 신경 조직으로부터의 신호의 비가 실제로 시간이 지남에 따라 증가하는 것을 제시한다. 외과의사가 외과적 시술에서 더 많은 유연성을 가지므로 더 오래 지속되는 신호가 유리하다. 예를 들어, 작용제의 투여는 시술 직전에 이루어지지 않아야 하고; 오히려, 신호가 검출될 수 있는 더 긴 범위의 시간이 있어야 한다. 신호는 약 15분 후에 검출 가능하나, 신경/근육 신호비는 실제로 시간이 지남에 따라 향상된다. 신호는 투여 후 적어도 몇 시간까지 검출 가능하다. 유사한 기간이 동물 연구에서와 같이 인간에서도 예상된다.

도 14a 및 14b는 광학 영상화를 이용한 17 AA 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 iv 주사 후 좌골 신경 및 근육으로부터의 생체내 시간 의존적 흡수를 제시한다. 외과적 노출 및 형광 영상화 능력을 갖는 Zeiss Lumar 입체현미경(0.8X 대물렌즈)을 이용한 좌골 신경 및 인접 근육의 영상화 전에 17 AA 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트(Cy5 표지됨)를 누드 마우스의 꼬리 정맥으로 정맥내 주사(150 nmole)하였다. 주사 전 및 일련의 주사 후(p.i.) 이미지(밝은 영역, 형광)를 6개의 시점(15분에서 150분) p.i.에서 획득하였다. 막대는 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 그룹 당 N=5. 각각의 복제물은 하나의 생물학적 실험으로부터 유래된 것으로, 하나의 생물학적 실험으로부터 유래된 fiach 복제물로 정량되었고, ts(6개의 시점에서 15분 및 근육 영역)로 정량되어 시간 의존적 신호 변화를 평가하였다. 도 14a는 절대 신경 형광 근육을 제시한다. 형광 신호는 30분에서 주사후 수준의 약 15%까지 유의하게 하강하는 것으로 관찰되었고; 신호는 그 이후에 거의 감지할 수 없었고, 평가에서 배제하였다(데이터는 제시하지 않음). 또한, 도 14a는 선형 펩티드로부터의 신호가 투여 30분 후에 최초 신호의 10%까지 감소되는 것을 제시한다. 도 14b는 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 주사후 처음 30분에 걸쳐 대략적으로 동등한 상응하는 시변 신경-대-근육 또는 대조비를 제시하며, 이는 시간에 따른 근육에 비한 좌골 신경 표본에 의한 선택적 흡수 및 보존을 암시한다.

도 15는 thy1-YFP 트랜스제닉 마우스에서의 150 nmole의 고리형 대 선형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 주사 후 인간 좌골 신경의 시간 의존적 생체내 형광 현미경검사를 제시한다.

도 16a - 16e는 광학 영상화를 이용한 17 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트의 iv 주사 후 좌골 신경 및 근육으로부터의 생체내 시간 의존적 흡수를 제시한다. 외과적 노출 및 형광 영상화 능력을 갖는 Zeiss Lumar 입체현미경(0.8X 대물렌즈)을 이용한 좌골 신경 및 인접 근육의 영상화 전에 17 AA 고리형 펩티드-염료 컨쥬게이트(Cy5 표지됨)를 누드 마우스의 꼬리 정맥으로 정맥내 주사(150 nmole)하였다. 주사 전 및 일련의 주사 후(p.i.) 이미지(밝은 영역, 형광)를 6개의 시점(15분에서 150분) p.i.에서 획득하였다. 막대는 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. 그룹 당 N=5. 각각의 복제물은 하나의 생물학적 실험으로부터 유래된 것으로 5개의 독립적 시야각으로 정량되었다. 관심 영역(ROI) 분석을 신경 및 근육 영역에 대해 수행하여 시간 의존적 신호 변화를 평가하였다. 도 16a - 16d는 각각 신경(도 16a 및 16c) 및 인접 근육(도 16b 및 16d)의 절대 및 상대 형광 신호(15분 p.i.에서 획득된 최초 형광 신호의 백분율)를 제시한다. 도 16e는 1.5시간의 기간에 걸쳐 약 1.3으로부터 거의 2.6으로 증가된 시변 신경-근육 또는 대조비를 제시한다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이들 데이터는 시간에 따른 신경 표본에 의한 선택적 흡수 및 보존을 암시한다.

SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER CORNELL UNIVERSITY <120> CYCLIC PEPTIDES WITH ENHANCED NERVE-BINDING SELECTIVITY, NANOPARTICLES BOUND WITH SAID CYCLIC PEPTIDES, AND USE OF SAME FOR REAL-TIME IN VIVO NERVE TISSUE IMAGING <130> 2003080-1017 <140> PCT/US2015/065816 <141> 2015-12-15 <150> 62/092,191 <151> 2014-12-15 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 1 Asn Thr Gln Thr Leu Ala Lys Ala Pro Glu His Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 2 Thr Tyr Thr Asp Trp Leu Asn Phe Trp Ala Trp Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 3 Lys Ser Leu Ser Arg His Asp His Ile His His His 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 4 Asp Phe Thr Lys Thr Ser Pro Leu Gly Ile His 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Ser His Ser Ser Thr Ala Arg Asp Leu Trp Pro His Gly Lys Glu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Asn Thr Gln Thr Leu Ala Lys Ala Pro Glu His Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Ser His Ser Asn Thr Gln Thr Leu Ala Lys Ala Pro Glu His Thr Gly 1 5 10 15 Cys <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Thr Tyr Thr Asp Trp Leu Asn Phe Trp Ala Trp Pro 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 9 Lys Ser Leu Ser Arg His Asp His Ile His His His 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 10 Asp Phe Thr Lys Thr Ser Pro Leu Gly Ile His 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 11 Ser His Ser Asn Thr Gln Thr Leu Ala Lys Ala Pro Glu His Thr Gly 1 5 10 15 Cys <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 12 Thr Leu Ala Lys Ala Pro Glu His Thr Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 13 Thr Leu Ala Lys Ala Pro Glu His Thr Cys 1 5 10 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 14 Asn Thr Gln Thr Leu Lys Lys Ala Pro Glu His Thr Gly Cys 1 5 10 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15 Ser His Ser Ser Thr Ala Arg Asp Leu Trp Pro His Gly Ser Glu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 16 Ser His Ser Ser Thr Ala Arg Asp Leu Trp Pro His Gly Ser Glu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="Cyclic peptide" <400> 17 Arg Gly Asp Tyr 1

Claims

고리형 펩티드; 나노입자; 형광 작용제; 및 링커 모이어티를 포함하는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
선형 폴리펩티드; 나노입자; 형광 작용제; 및 링커 모이어티를 포함하는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 나노입자가 실리카-기반 코어; 코어 내의 형광 작용제; 코어의 적어도 일부를 둘러싸는 실리카 쉘; 나노입자에 부착된 링커 모이어티; 및 선택적으로 중합체-코팅된 나노입자에 부착된 1 내지 20개의 펩티드 리간드를 포함하는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 초소형 입자(예를 들어, 100 nm 미만, 예를 들어, 50 nm 미만, 예를 들어, 30 nm 미만, 예를 들어, 20 nm 미만, 예를 들어, 10 nm 미만의 평균 직경을 가짐)(예를 들어, 초소형 나노입자는 C 도트(dot) 또는 C' 도트임)인 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG₂, 및 파라-아미노벤질옥시 카르바메이트(PABC)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 일원을 포함하는(예를 들어, 링커 모이어티는 2 내지 50개의 원자를 가짐) 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 고리형 펩티드가 링커 모이어티를 통해 나노입자에 결합되는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 작용제가 시아닌 염료(예를 들어, Cy5 또는 Cy5.5)를 포함하는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 5 내지 20개의 아미노산 잔기 및/또는 15개의 원자 내지 60개의 원자의 거대고리를 갖는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 8항에 있어서, 17개의 아미노산 잔기 및/또는 51개의 원자의 거대고리를 갖는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 1항 또는 제 3항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 고리형 펩티드가 펩티드 서열 NTQTLAKAPEHT를 포함하는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 10항에 있어서, 거대고리가 펩티드의 머리와 꼬리를 고리화시키거나, 서열 내부에 공유 결합을 도입시킴으로써 형성되는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
제 1항 또는 제 3항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 고리형 펩티드가 TYTDWLNFWAWP, KSLSRHDHIHHH, 및 DFTKTSPLGIH로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함하는 신경-결합 펩티드 컨쥬게이트.
펩티드 서열 NTQTLAKAPEHT를 포함하는 고리형 펩티드.
TYTDWLNFWAWP, KSLSRHDHIHHH, 및 DFTKTSPLGIH로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함하는 고리형 펩티드.
형광 작용제; 및 펩티드 서열 NTQTLAKAPEHT를 포함하는 고리형 펩티드를 포함하는 고리형 펩티드 조성물.
형광 작용제; 및 TYTDWLNFWAWP, KSLSRHDHIHHH, 및 DFTKTSPLGIH로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함하는 고리형 펩티드를 포함하는 고리형 펩티드 조성물.
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 고리형 펩티드가 거대고리를 포함하는 조성물.
제 17항에 있어서, 거대고리가 펩티드의 머리와 꼬리를 고리화시키거나, 서열 내부에 공유 결합을 도입시킴으로써 형성되는 조성물.
도 1b 또는 도 4a - 4h에 제시된 구조를 갖는 고리형 펩티드를 포함하는 고리형 펩티드 조성물.
제 19항에 있어서, 고리형 펩티드가 나노입자에 부착되는 조성물.
제 20항에 있어서, 고리형 펩티드가 링커 모이어티를 통해 나노입자에 공유적 또는 비공유적으로 부착되는 조성물.
제 19항에 있어서, 고리형 펩티드가 작용기화되는 조성물.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제형을 대상체에 투여하여 조성물이 대상체의 신경 조직에 선택적으로 결합하도록 하는 단계; 대상체의 조직을 여기 광에 노출시키는 단계; 및 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 이미지를 생성시키고 이미지를 디스플레이하는 단계를 포함하는 영상화 방법.
제 23항에 있어서, 신경 조직으로부터 방출된 광이 주위 조직으로부터 방출된 광보다 더 강하여(예를 들어, 신경 대 근육 신호비는 적어도 2임), 신경 조직이 주위 조직과 시각적으로 구별될 수 있는 영상화 방법.
제 24항에 있어서, 신경 조직으로부터 방출된 광이 적어도 대상체(예를 들어, 대상체는 동물, 예를 들어, 대상체는 인간임)로의 제형의 투여 15분 후만큼 초기에 검출 가능한 영상화 방법.
제 24항 또는 제 25항에 있어서, 신경 조직으로부터 방출된 광이 대상체(예를 들어, 대상체는 동물, 예를 들어, 대상체는 인간임)로의 제형의 투여 후 적어도 1시간(예를 들어, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 또는 적어도 4시간)만큼 길게 검출 가능한 영상화 방법.
제 23항에 있어서, 투여가 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기에 제형을 국소적으로 적용하는 단계를 포함하는 영상화 방법.
제 23항 또는 제 27항에 있어서, 말초 신경줄기(예를 들어, 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기)에 제형을 국소적으로 적용하는 단계, 제형의 조성물이 신경줄기로부터 신경 조직의 더 작은 가지로 확산되도록 하는 단계, 및 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 신경 조직의 더 작은 가지의 이미지를 생성시키는 단계를 포함하는 영상화 방법.
제 23항에 있어서, 제형이 정맥내(I.V.) 투여되는 영상화 방법.
제 23항에 있어서, 제형이 국소 투여되는 영상화 방법.
제 23항에 있어서, 여기 광에 대한 대상체의 조직 노출이 외과적 시술 동안 발생하는 영상화 방법.
제 23항에 있어서, 이미지가 비디오 및/또는 스틸 이미지 및/또는 실시간 비디오인 영상화 방법.
제 23항에 있어서, 이미지가 대상체에 대해 수행되는 외과적 시술 동안 외과의사에게 디스플레이되는 영상화 방법.
대상체의 조직을 여기 광, 대상체에 투여되는 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제형에 노출시키는 단계; 및 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하는 단계를 포함하는 영상화 방법.
제 34항에 있어서, 검출 단계가 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 이미지를 생성시키고, 이미지를 디스플레이하는 단계를 포함하는 방법.
제 34항 또는 제 35항에 있어서, 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 34항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 조직으로부터 방출된 광이 주위 조직으로부터 방출된 광보다 더 강하여(예를 들어, 신경 대 근육 신호비는 적어도 2임), 신경 조직이 주위 조직과 시각적으로 구별될 수 있는 방법.
제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 조직으로부터 방출된 광이 적어도 대상체(예를 들어, 대상체는 동물, 예를 들어, 대상체는 인간임)로의 제형의 투여 15분 후만큼 초기에 검출 가능한 영상화 방법.
제 34항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 조직으로부터 방출된 광이 대상체(예를 들어, 대상체는 동물, 예를 들어, 대상체는 인간임)로의 제형의 투여 후 적어도 1시간(예를 들어, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 또는 적어도 4시간)만큼 길게 검출 가능한 방법.
제 34항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기에 국소적 적용에 의해 투여되는 방법.
제 34항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 말초 신경줄기(예를 들어, 외과적 노출 후 전이성 림프절 또는 원발성 종양 근처 또는 그 부근의 말초 신경줄기)에 국소적 적용에 의해 투여되어, 제형의 조성물이 신경줄기로부터 신경 조직의 더 작은 가지로 확산되는 방법으로서, 상기 방법이 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 신경 조직의 더 작은 가지의 이미지를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법.
제 34항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 정맥내(I.V.) 투여되는 방법.
제 34항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 국소 투여되는 방법.
제 34항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 여기 광에 대한 대상체의 조직 노출이 외과적 시술 동안 발생하는 방법.
제 34항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 단계가 조성물의 형광 작용제에 의해 방출된 광을 검출하여 이미지를 생성시키고, 이미지를 디스플레이하는 단계를 포함하며, 이미지가 비디오 및/또는 스틸 이미지 및/또는 실시간 비디오인, 방법.
제 45항에 있어서, 이미지가 대상체에 대해 수행되는 외과적 시술 동안 외과의사에게 디스플레이되는 방법.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 방사성표지를 추가로 포함하는 조성물.