CN115282294B - 显影剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了显影剂及其制备方法与应用，涉及核磁共振显影剂制备领域。该显影剂由纳米颗粒与聚乙二醇、顺磁离子、神经结合肽和近红外荧光染料复合而成，具有穿透深度高、灵敏性高、信噪比高、神经靶向性强、生物安全性好等优势，提高了近红外荧光染料的水溶性和生物相容性，且具有优异的成像质量，可作为多模态显像剂实现自主神经的靶向性荧光/MRI成像，能够实现术前高选择性MRI成像和术中实时近红外荧光成像。
Description
技术领域
本发明涉及核磁共振显影剂制备领域，尤其是涉及显影剂及其制备方法与应用。
背景技术
宫颈癌、前列腺癌和直肠癌等腹盆腔手术中损伤盆腔自主神经常造成严重的神经损伤相关并发症，患者术后易出现膀胱、直肠和性功能的障碍，发生率高，且难以治愈。为实现术中盆腔自主神经高效、准确地辨识，学术界采用了触摸法、解剖标志法、超声吸脂术、术中神经电刺激等方法，但效果欠佳。
因此，亟需一种指导术中盆腔自主神经辨识的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种显影剂，该显影剂具有穿透深度高、灵敏性高、信噪比高、神经靶向性强、生物安全性好等优势，提高了近红外荧光染料的水溶性和生物相容性，且具有优异的成像质量。
本发明还提出上述显影剂的制备方法。
本发明还提供上述显影剂的应用。
根据本发明的第一方面实施例的显影剂，由纳米颗粒与聚乙二醇、顺磁离子、神经结合肽和近红外荧光染料复合而成。
根据本发明实施例的显影剂，至少具有如下有益效果：
本发明实施例的显影剂具有穿透深度高、灵敏性高、信噪比高、神经靶向性强、生物安全性好等优势，提高了近红外荧光染料的水溶性和生物相容性，且具有优异的成像质量，可作为多模态显像剂实现自主神经的靶向性荧光/MRI成像，能够实现术前高选择性MRI成像和术中实时近红外荧光成像。较现有的近红外荧光成像显影剂，本发明实施例提供的显影剂具有更高的成像信噪比以及长的体内循环时间，极大地提高了自主神经的术中实时荧光成像质量。
根据本发明的一些实施例，所述显影剂为盆腔显影剂。该显影剂能够在术中实时显影周围神经，兼具盆腔自主神经MRI成像和近红外荧光成像效果，在腹盆腔手术中盆腔自主神经术中实时导航应用中显示出巨大的前景。
根据本发明的一些实施例，所述纳米颗粒包括PDA纳米颗粒、纳米二氧化钛纳米颗粒中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述纳米颗粒为聚多巴胺(PDA)纳米颗粒。聚多巴胺纳米颗粒在盆腔自主神经组织中积聚到一定浓度时，会使得组织呈现黑色，能够达到白光肉眼下识别神经的效果，为识别提供双重保障
根据本发明的一些实施例，所述顺磁离子包括Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述神经结合肽为神经结合肽NP41。
根据本发明的一些实施例，所述近红外荧光染料为羧基端近红外荧光染料。
根据本发明的一些实施例，近红外荧光染料包括菁类、氟硼吡咯(BODIPY)类、罗丹明类、方酸类、卟啉类中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述近红外荧光染料为IR820。
根据本发明的一些实施例，所述聚乙二醇包括双氨基化聚乙二醇和氨基-羧基化聚乙二醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述聚乙二醇的分子量为0.5kD～7kD。
根据本发明的一些实施例，所述聚乙二醇的分子量为1kD～6kD。
根据本发明的一些实施例，所述聚乙二醇的分子量为2kD～5kD。
根据本发明的一些实施例，所述显影剂的粒径为20nm～49nm。
根据本发明的一些实施例，所述显影剂的粒径为40nm～49nm。由此，能够延长显影剂在体内的循环时间和周围神经部位的滞留。
根据本发明的第二方面实施例的上述显影剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：将所述纳米颗粒与所述聚乙二醇混合反应后，得到纳米复合物A；
S2：将所述纳米复合物A的羧基活化后，与所述神经结合肽混合反应，得到纳米复合物B；
S3：将所述纳米复合物B与所述近红外荧光染料混合反应，得到纳米复合物C；
S4：将所述纳米复合物C与顺磁离子混合反应，得到显影剂。
根据本发明实施例的试剂盒，至少具有如下有益效果：
本发明制备方法简单，对操作人员的专业要求不高。
根据本发明的一些实施例，所述纳米颗粒为聚多巴胺纳米颗粒。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
将盐酸多巴胺与碱溶液混合，40℃～60℃反应8h～12h，得到所述聚多巴胺纳米颗粒。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法中，所述碱溶液为NaOH溶液和KOH溶液中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法中，所述碱溶液为NaOH溶液。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法中，所述盐酸多巴胺与所述碱溶液中的碱的摩尔比为1：0.5～2。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法中，所述盐酸多巴胺与所述碱溶液中的碱的摩尔比为1：1。通过调节碱与盐酸多巴胺的比例能够控制聚多巴胺纳米颗粒的粒径。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法中，所述反应温度为45℃～55℃。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法中，所述反应温度为50℃。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法中，所述反应时间为9h～11h。
根据本发明的一些实施例，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法中，所述反应时间为10h。
根据本发明的一些实施例，步骤S1的反应条件为碱性环境。
根据本发明的一些实施例，pH为8～11。
根据本发明的一些实施例，pH为8.5～10。
根据本发明的一些实施例，pH为9～10。
根据本发明的一些实施例，pH为9。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述纳米颗粒与所述聚乙二醇的质量比为1：0.8～1.6。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述纳米颗粒与所述聚乙二醇的质量比为1：1～1.4。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述纳米颗粒与所述聚乙二醇的质量比为1：1.1～1.3。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述纳米颗粒与所述聚乙二醇的质量比为1：1.2。当纳米颗粒为聚多巴胺纳米颗粒时，通过聚乙二醇的修饰，能够使其完全溶于水。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，反应时间为10h～14h。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，反应时间为11h～13h。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，反应时间为12h。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述纳米复合物B的羧基活化方法包括以下步骤：将所述纳米复合物B与MES、EDC和NHS混合反应。
根据本发明的一些实施例，所述纳米复合物B与MES、EDC和NHS的质量比为1：0.2～0.6：0.05～0.3：0.05～0.3。
根据本发明的一些实施例，所述纳米复合物B与MES、EDC和NHS的质量比为1：0.3～0.5：0.1～0.2：0.1～0.2。
根据本发明的一些实施例，所述纳米复合物B与MES、EDC和NHS的质量比为1：0.4～0.5：0.13～0.17：0.13～0.17。
根据本发明的一些实施例，所述纳米复合物B与MES、EDC和NHS的质量比为1：0.43：0.15：0.12。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述神经结合肽的添加量为：每克纳米复合物A添加1mmol～3mmol神经结合肽。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述神经结合肽的添加量为：每克纳米复合物A添加1.5mmol～2.5mmol神经结合肽。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述神经结合肽的添加量为：每克纳米复合物A添加2mmol神经结合肽。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，反应时间为1h～3h。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，反应时间为1.5h～2.5h。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，反应时间为2h。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，所述纳米复合物B与所述近红外荧光染料的质量比为1：0.01～0.1。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，所述纳米复合物B与所述近红外荧光染料的质量比为1：0.02～0.07。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，所述纳米复合物B与所述近红外荧光染料的质量比为1：0.04。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，反应时间为3h～5h。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，反应时间为4h。
根据本发明的一些实施例，步骤S3中，反应需在避光条件下进行。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，所述纳米复合物C与顺磁离子的质量比为1：0.01～0.1。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，所述纳米复合物C与顺磁离子的质量比为1：0.02～0.07。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，所述纳米复合物C与顺磁离子的质量比为1：0.04。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，反应时间为3h～5h。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，反应时间为4h。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，反应需在避光条件下进行。
根据本发明的第三方面实施例的上述显影剂在制备核磁共振用试剂中的应用。
根据本发明实施例的显影剂的应用，至少具有如下有益效果：
由于应用显影剂制备得到的核磁共振用试剂采用了上述实施例的显影剂的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例提供的NP41-PDA-IR820-Mn的透射电镜图。
图2为本发明实施例提供的NP41-PDA-IR820-Mn的紫外-可见吸收光谱。
图3为本发明实施例提供的NP41-PDA-IR820-Mn浓度与弛豫速率的关系图。
图4为SD大鼠注射本发明实施例提供的NP41-PDA-IR820-Mn后的腹主动脉冰冻切片。
图5为本发明实施例提供的纳米粒子的神经细胞摄取试验(a：PDA-IR820-Mn；b：NP41-PDA-IR820-Mn；c：Anti-Laminin抗体+NP41-PDA-IR820-Mn)。
具体实施方式
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如无特别说明，下述实施例中的常温指25±5℃。
实施例1
本实施例提供一种用于制备盆腔自主神经荧光/MRI(磁共振成像)多模态显像剂的方法，具体包括以下步骤：
(1)PDA纳米颗粒的制备：
将432mg(2.28mmol)盐酸多巴胺及2.28mol/L NaOH溶液加入含有216mL去离子水的三颈烧瓶中，50℃下搅拌10h，经超滤管(100kD)6000rpm离心10min，去上清，得到聚多巴胺(PDA)纳米颗粒，用去离子水重复洗涤3次后，用去离子水重悬。取500μL PDA溶液烘干，测量烘干后的质量，以计算PDA纳米颗粒的浓度。
(2)PDA纳米颗粒的PEG化：
将PDA溶液调节pH至9.0左右。将氨基-羧基化聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)按照质量比1:1.2(PDA：NH2-PEG-COOH)加至PDA溶液中，常温下搅拌12h，得到PEG化PDA纳米颗粒(PDA-PEG)溶液。取500μLPDA-PEG溶液烘干，测量烘干后的质量，计算PDA-PEG的浓度。
(3)PDA-NP41探针的合成：
将20μmol MES、10μmol EDC、10μmol NHS加入到含有10mg PEG-PDA的溶液中，室温下搅拌30min以活化羧基，随后经超滤管(100kD)在6000rpm条件下离心10min，以过滤除去多余的MES、EDC和NHS。向过滤后的溶液中加入20μmol神经结合肽NP41，搅拌反应2h，随后经超滤管(100kD)在6000rpm条件下离心10min，以过滤除去多余的神经结合肽NP41。并进一步用去离子水重复洗涤3次，以去除未参与反应的神经结合肽NP41，得到负载有神经结合肽NP41的PDA-PEG(PDA-NP41)，用去离子水重悬后，得PDA-NP41溶液，于4℃储存。
(4)NP41-PDA-IR820的制备：
将近红外荧光造影剂IR820按照质量比1:0.04(PDA-NP41：IR820)加入到步骤(3)制备得到的PDA-NP41溶液中，常温避光搅拌4h。随后经超滤管(100kD)在6000rpm条件下离心10min，以过滤除去多余的IR820，得到负载有IR820的PDA-NP41(NP41-PDA-IR820)。NP41-PDA-IR820溶液于4℃避光保存。
(5)NP41-PDA-IR820-Mn的制备：
将MnCl2按照质量比1:0.04(NP41-PDA-IR820：MnCl2)加入到步骤(4)制备得到NP41-PDA-IR820溶液中，常温避光搅拌4h，获得NP41-PDA-IR820-Mn。
对比例1
对比例1与实施例1相比，区别仅在于：缺省了步骤(4)，制备得到PDA-IR820-Mn。
检测例
1、NP41-PDA-IR820-Mn的透射电镜表征：
采用高分辨率透射电子显微镜(JEM-2100，日本电子株式会社，日本)表征NP41-PDA-IR820-Mn的粒径。
如图1所示。实施例1制备得到的NP41-PDA-IR820-Mn的粒径为42nm～45nm，且无大块聚集现象。
2、NP41-PDA-IR820-Mn的紫外特征吸收峰检测：
采用荧光分光光度计(ND-10001,NanoDrop,美国)在200nm～1000nm波长范围内对NP41-PDA-IR820-Mn水溶液(指：材料)和滤出液(指实施例1步骤(3)超滤后得到的滤出液)进行光谱扫描，分析NP41-PDA-IR820-Mn的紫外特征吸收峰。
神经结合肽NP41成功负载到PEG化PDA纳米颗粒上，制备得到了NP41-PDA-IR820-Mn。如图2所示。
3、NP41-PDA-IR820-Mn的MRI弛豫率分析：
采用3.0T MRI扫描仪(Achieva，Philips，荷兰，配有8通道头部线圈)测量浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0mg/mL的NP41-PDA-IR820-Mn水溶液的T1弛豫时间。
随着NP41-PDA-IR820-Mn浓度的升高，T1信号呈线性增强，这表明NP41-PDA-IR820-Mn具有较好的弛豫速率，具有MRI成像潜能。如图3所示。
4、盆腔自主神经的多模态成像：
将实施例1制备得到的盆腔自主神经多模态显像剂NP41-PDA-IR820-Mn用于盆腔自主神经的多模态成像，具体步骤如下：
经尾静脉向SD大鼠注射1.5mL浓度为2mg/mL的NP41-PDA-IR820-Mn水溶液，3小时后利用近红外术中成像系统，对大鼠腹主动脉丛进行成像。
对其腹主动脉丛进行取材后冰冻切片，利用DAPI标记细胞核，在激光共聚焦扫描显微镜下发现神经组织内可检测出IR820荧光信号，IR820信号主要分布在神经外膜和神经束膜。如图4所示。这表明NP41-PDA-IR820-Mn可用于盆腔自主神经的高信噪比成像，可用于腹盆腔手术中盆腔自主神经辨识。
5、细胞实验：
从出生2天的SD乳鼠中分离得到神经原代细胞，通过施万细胞特异性抗体GFAP、S100及CNPase证实了所获取细胞为高纯度施万细胞。用层粘连蛋白(Laminin)预处理施万细胞，使Laminin结合在施万细胞表面，形成Laminin整合素聚合体，以模拟体内施万细胞状态。设置三个处理组，第一组用0.016mg/mL PDA-IR820-Mn与施万细胞共孵育1h；第二组用0.016mg/mL NP41-PDA-IR820-Mn与施万细胞共孵育1h；第三组用Anti-Laminin抗体预处理后，继续用0.016mg/mL NP41-PDA-IR820-Mn与施万细胞共孵育1h。检测各组的摄取情况。
相比于PDA-IR820-Mn，NP41-PDA-IR820-Mn更容易被施万细胞摄取；而NP41的摄取增强效果可被Anti-Laminin抗体阻断。如图5所示。
上面对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (7)
1.一种显影剂，其特征在于，由纳米颗粒与聚乙二醇、顺磁离子、神经结合肽和近红外荧光染料复合而成；
所述聚乙二醇为氨基-羧基化聚乙二醇；
所述顺磁离子为Mn；
所述显影剂的制备方法包括以下步骤：
S1：将所述纳米颗粒与所述聚乙二醇混合反应后，得到纳米复合物A；
所述纳米颗粒包括PDA纳米颗粒；
所述纳米颗粒与所述聚乙二醇的质量比为1：0.8~1.6；
S2：将所述纳米复合物A的羧基活化后，与所述神经结合肽混合反应，得到纳米复合物B；
所述神经结合肽为神经结合肽NP41；
步骤S2中，所述神经结合肽的添加量为：每克纳米复合物A添加1mmol~3mmol神经结合肽；
S3：将所述纳米复合物B与所述近红外荧光染料混合反应，得到纳米复合物C；
所述近红外荧光染料为IR820；
步骤S3中，所述纳米复合物B与所述近红外荧光染料的质量比为1：0.01~0.1；
S4：将所述纳米复合物C与顺磁离子混合反应，得到显影剂；
步骤S4中，所述纳米复合物C与顺磁离子的质量比为1：0.01~0.1。
2.根据权利要求1所述的显影剂，其特征在于，步骤S1的反应条件为碱性环境。
3.权利要求1所述的显影剂，其特征在于，步骤S1的反应条件为pH为8~10。
4.根据权利要求1所述的显影剂，其特征在于，步骤S2中，所述纳米复合物A的羧基活化方法包括以下步骤：将所述纳米复合物A与MES、EDC和NHS混合反应。
5.权利要求4所述的显影剂，其特征在于，所述纳米复合物A与MES、EDC和NHS的质量比为1：0.2~0.6：0.05~0.3：0.05~0.3。
6.权利要求1所述的显影剂，其特征在于，步骤S2中，所述反应时间为1h~3h。
7.权利要求1至6任一项所述的显影剂在制备核磁共振用试剂中的应用。
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