ES2794778T3 - Péptidos cíclicos con selectividad mejorada de unión a los nervios, nanoparticulos unidas con dichos péptidos cíclicos y uso de los mismos para imágenes en vivo de tejidos nerviosos en tiempo real - Google Patents
Péptidos cíclicos con selectividad mejorada de unión a los nervios, nanoparticulos unidas con dichos péptidos cíclicos y uso de los mismos para imágenes en vivo de tejidos nerviosos en tiempo real Download PDFInfo
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Abstract
Un péptido cíclico que comprende la secuencia peptídica NTQTLAKAPEHT o una composición de péptido cíclico que comprende un péptido que tiene una estructura enumerada a continuación:
Description
d e s c r ip c ió n
Péptidos cíclicos con selectividad mejorada de unión a Ios nervios, nanoparticulos unidas con dichos péptidos cíclicos y uso de Ios mismos para imágenes en vivo de tejidos nerviosos en tiempo real
Campo de la invención
[0001] Esta invención se refiere generalmente a péptidos cíclicos, nanopartículas unidas con péptidos cíclicos, y métodos para el uso de dichos péptidos cíclicos y/o dichas nanopartículas unidas con péptidos cíclicos para formación de imágenes del tejido nervioso intraoperatoria.
Antecedentes
[0002] Muchos procedimientos quirúrgicos conllevan el riesgo de daño nervioso o transección accidental, lo que puede dar lugar a problemas significativos tales como dolor crónico o parálisis. Se han realizado investigaciones sobre el uso de agentes de infrarrojo cercano (NIR) para resaltar el tejido nervioso durante la cirugía, mejorando así la capacidad del cirujano para evitar cortar o dañar el nervio resaltado tejido. P. ej., se han utilizado moléculas tales como Ios derivados de distilbenceno y oxazina, pero carecen de las características de unión necesarias y/o las propiedades espectrales necesarias para ser eficaces para el uso intraoperatorio en humanos y otros mamíferos.
[0003] El documento WO 2010/121023 describe métodos para guiar la conservación de neuronas o nervios durante la cirugía mediante la administración de un péptido o aptámero marcado con fluorescencia que se une específicamente a las neuronas o nervios. Whitney y coI. identificó varios polipéptidos de unión de nervios mediante la aplicación de metodologías de visualización de fagos contra nervios periféricos murinos extirpados (Whitney, M. a .; Crisp, J. L.; Nguyen, L. T.; Friedman, B.; Gross, L. a .; Steinbach, P.; Tsien, R. y .; Nguyen, Q. T. Nat. Biotech. 2011, 29, 352). Las secuencias se marcaron posteriormente con un fluoróforo o colorante NIR, y se evaluaron in vitro e in vivo para la unión. La secuencia que proporcionó el mayor contraste sobre el fondo fue un polipéptido de 17 residuos, NP41 (FIG.
1A). Existe la necesidad de agentes de unión de nervios con una selectividad mejorada para el tejido nervioso y de propiedades espectrales mejoradas para uso intraoperatorio.
Sumario
[0004] En este documento se describen péptidos cíclicos, nanopartículas unidas con péptidos cíclicos y métodos para usar dichos péptidos cíclicos y/o dichas nanopartículas unidas con péptidos cíclicos para la obtención de imágenes intraoperatorias de tejido nervioso. En un aspecto, la invención se dirige a un péptido cíclico que comprende la secuencia de péptidos NTQTLAKAPEHT o una composición de péptidos cíclicos que comprende un péptido que tiene una estructura que se enumera a continuación:
[0005] En un aspecto, la invención se dirige a un conjugado peptídico de unión a nervios que comprende: un péptido cíclico de la invención; una nanopartícula; un agente fluorescente; y un resto enlazador. En otro aspecto, la divulgación se dirige a un conjugado peptídico de unión a nervios que comprende: un polipéptido lineal; una nanopartícula; un agente fluorescente; y un resto enlazador.
[0006] En ciertas realizaciones, la nanopartícula comprende: un núcleo a base de sílice; el agente fluorescente dentro
del núcleo; una cubierta de sílice que rodea al menos una parte del núcleo; el resto enlazador unido a la nanopartícula; y opcionalmente, de uno a veinte ligandos peptídicos unidos a la nanopartícula recubierta de polímero.
[0007] En ciertas realizaciones, la nanopartícula es una partícula ultrapequeña (p. ej., con un diámetro promedio menor que lOo nm, p. ej., menor que 50 nm, p. ej., menos de 3o nm, p. ej., menos de 20 nm, p. ej., menos de 10 nm) (p. ej., en donde la nanopartícula ultrapequeña es un punto C o punto C').
[0008] En ciertas realizaciones, el resto enlazador comprende uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), PEG2 , y para-aminobenciloxi carbamato (PABC) (p. ej., en donde el resto ligador tiene de 2 a 50 átomos). En ciertas realizaciones de la divulgación, el resto enlazador comprende uno o más de los restos enlazadores descritos en la Solicitud de Pat. de EE.UU. N014/722.307, presentada el 27 de mayo de 2015, publicada como Publicación de Solicitud de Pat. de EE.UU. No US 2O15/O343O91.
[0009] En ciertas realizaciones, el péptido cíclico se une a la nanopartícula a través de la fracción de unión. En ciertas realizaciones, el agente fluorescente comprende un colorante de cianina, p. ej., Cy5 o Cy5.5. En ciertas realizaciones, el conjugado peptídico de unión de nervios tiene de 5 a 20 residuos de aminoácidos y/o un macrociclo de 15 átomos a 60 átomos. En ciertas realizaciones, el conjugado peptídico de unión de nervios tiene 17 residuos de aminoácidos y/o un macrociclo de 51 átomos.
[0010] En ciertas realizaciones, el péptido cíclico comprende la secuencia peptídica NTQTLAKAPEHT. En ciertas realizaciones, el macrociclo se forma ciclando el péptido cabeza a cola o introduciendo un enlace covalente interno a la secuencia. En ciertas realizaciones de la divulgación, el péptido cíclico comprende una secuencia peptídica seleccionada del grupo que consiste en TYTDWLNFWAWP, KSLSRHDHIHHH y DFTKTSPLGIH.
[0011] En otro aspecto, la invención se dirige a un péptido cíclico que comprende la secuencia peptídica n t q t l a k a p e h t .
[0012] En otro aspecto, la descripción se dirige a un péptido cíclico que comprende una secuencia peptídica seleccionada del grupo que consiste en TYTDWLNFWAWP, KSLSRHDHIHHH, y DFTKTSPLGIH.
[0013] En otro aspecto, la invención se dirige a una composición de péptido cíclico que comprende: un agente fluorescente; y un péptido cíclico que comprende la secuencia peptídica Nt QTLAKAPEHT.
[0014] En otro aspecto, la descripción está dirigida a una composición de péptido cíclico que comprende: un agente fluorescente; y un péptido cíclico que comprende una secuencia peptídica seleccionada del grupo que consiste en t y t d w l n f w a w p , k s l s r h d h ih h h y d f t k t s p l g ih .
[0015] En ciertas realizaciones, el péptido cíclico comprende un macrociclo. En ciertas realizaciones, el macrociclo se forma ciclando el péptido cabeza a cola o introduciendo un enlace covalente interno a la secuencia.
[0016] En otro aspecto, la descripción está dirigida a una composición de péptido cíclico que comprende un péptido cíclico que tiene una estructura como se muestra en la FIG. IB o las FIGS. 4A - 4H. En ciertas realizaciones, el péptido cíclico está unido a una nanopartícula. En ciertas realizaciones, el péptido cíclico está unido covalentemente o no covalentemente a la nanopartícula a través de un resto conector. En ciertas realizaciones, el péptido cíclico está funcionalizado.
[0017] En ciertas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, la composición adicionalmente comprende un marcador radiactivo.
[0018] En otro aspecto, la invención está dirigida a un método de formación de imágenes que comprende: administrar a un sujeto una formulación que comprende la composición de cualquiera de los aspectos anteriores y permitir que la composición se una selectivamente al tejido nervioso del sujeto; exponer el tejido del sujeto a la luz de excitación; y detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen y mostrar la imagen.
[0019] En ciertas realizaciones, la luz emitida desde el tejido nervioso es más intensa que la luz emitida desde tejido circundante (p. ej., la relación de señal nervio a músculo es al menos 2) de tal manera que el tejido nervioso es visualmente distinguible del tejido circundante. En ciertas realizaciones, la luz emitida desde el tejido nervioso es detectable al menos 15 minutos después de la administración de la formulación al sujeto (p. ej., en donde el sujeto es un animal, p. ej., en donde el sujeto es un humano). En ciertas realizaciones, la luz emitida desde el tejido nervioso es detectable al menos durante 1 hora (p. ej., al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas o al menos 4 horas) después de la administración de la formulación a sujeto (p. ej., en donde el sujeto es un animal, p. ej., en donde el sujeto es un humano).
[0020] En ciertas realizaciones, la administración comprende la aplicación tópica de la formulación a un tronco de nervio periférico adyacente a o dentro de la vecindad de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica. En ciertas realizaciones, el método comprende aplicar tópicamente la formulación a un tronco
nervioso periférico (p. ej., adyacente a o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica), permitiendo que la composición de la formulación se difunda desde el tronco nervioso a ramas más pequeñas del tejido nervioso, y detectando la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen de las ramas más pequeñas del tejido nervioso.
[0021] En ciertas realizaciones, la formulación se administra por vía intravenosa (I.V.). En ciertas realizaciones, la formulación se administra localmente. En ciertas realizaciones de la divulgación, la exposición del tejido del sujeto a la luz de excitación ocurre durante un procedimiento quirúrgico. En ciertas realizaciones, la imagen es un video y/o imagen fija y/o video en tiempo real. En ciertas realizaciones de la divulgación, la imagen se muestra a un cirujano durante un procedimiento quirúrgico realizado sobre el sujeto.
[0022] En otro aspecto, la invención está dirigida a un método de formación de imágenes que comprende: exponer tejido de un sujeto a la luz de excitación, una formulación que comprende la composición de cualquiera de los aspectos anteriores que se ha administrado a la materia; y detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición.
[0023] En ciertas realizaciones, la etapa de detección comprende detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen y la visualización de la imagen. En ciertas realizaciones, el método comprende además la etapa de administrar la composición al sujeto.
[0024] En ciertas realizaciones, la luz emitida desde el tejido nervioso es más intenso que la luz emitida desde el tejido circundante (p. ej., la relación señal de nervio a músculo es al menos 2) de tal manera que el tejido nervioso es visualmente distinguible del tejido circundante. En ciertas realizaciones, la luz emitida desde el tejido nervioso es detectable al menos 15 minutos después de la administración de la formulación al sujeto (p. ej., en donde el sujeto es un animal, p. ej., en donde el sujeto es un humano). En ciertas realizaciones, la luz emitida desde el tejido nervioso es detectable al menos durante 1 hora (p. ej., al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas o al menos 4 horas) después de la administración de la formulación a sujeto (p. ej., en donde el sujeto es un animal, p. ej., en donde el sujeto es un humano). En ciertas realizaciones, la formulación se ha administrado por aplicación tópica a un tronco nervioso periférico adyacente a o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica. En ciertas realizaciones, la formulación se ha administrado por aplicación tópica a un tronco nervioso periférico (p. ej., adyacente a o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica) de modo que la composición de la formulación se haya difundido desde el tronco nervioso a ramas más pequeñas del tejido nervioso, en donde el método comprende detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen de las ramas más pequeñas del tejido nervioso. En ciertas realizaciones, la formulación se administra por vía intravenosa (por I.V.). En ciertas realizaciones, la formulación se administra localmente.
[0025] En ciertas realizaciones de la descripción, exponer el tejido del sujeto a la luz de excitación se produce durante un procedimiento quirúrgico. En ciertas realizaciones, la etapa de detección comprende detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen y mostrar la imagen, en la que la imagen es un video y/o imagen fija y/o video en tiempo real. En ciertas realizaciones de la divulgación, la imagen se muestra a un cirujano durante un procedimiento quirúrgico realizado sobre el sujeto.
[0026] En un aspecto, la invención se dirige a una formulación que comprende la composición de la invención para uso en un método de formación de imágenes que comprende: administrar a un sujeto la formulación y dejar que la composición selectivamente se una a tejido nervioso del sujeto; exponer el tejido del sujeto a la luz de excitación; y detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen y mostrar la imagen; en donde: (i) la exposición del tejido del sujeto a la luz de excitación ocurre durante un procedimiento quirúrgico, o (ii) la imagen se muestra a un cirujano durante un procedimiento quirúrgico realizado sobre el sujeto.
Definiciones
[0027] A fin de que la presente descripción se entienda más fácilmente, ciertos términos se definen primero a continuación. Definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la especificación.
En esta aplicación, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Como se usa en esta solicitud, el término "comprende" y las variaciones del término, tales como "que comprende" y "comprende", no pretenden excluir otros aditivos, componentes, enteros o etapas. Como se usa en esta aplicación, los términos "acerca de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Todos los números utilizados en esta aplicación con o sin alrededor de/aproximadamente están destinados a cubrir cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la técnica relevante. En ciertas realizaciones, el término "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a un rango de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto donde dicho número excedería el 100% de un valor posible).
"Administración": el término "administración" se refiere a la introducción de una sustancia o formulación en un sujeto. En general, se puede utilizar cualquier vía de administración que incluya, p. ej., parenteral (p. ej., intravenosa), oral, tópica, subcutánea, peritoneal, intraarterial, inhalación, vaginal, rectal, nasal, introducción en el líquido cefalorraquídeo o instilación en el compartimentos del cuerpo. En algunas realizaciones, la administración es oral. Adicionalmente o alternativamente, en algunas realizaciones, la administración es parenteral. En algunas realizaciones, la administración es intravenosa. En ciertas realizaciones, la sustancia o formulación se administra mediante inyección local frente a administración IV. P. ej., las sustancias o formulaciones con composiciones que contienen péptidos (p. ej., composiciones que contienen partículas y que no contienen partículas) pueden inyectarse localmente en una concentración suficientemente alta para fines de formación de imágenes. En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen péptidos sin partículas se administran por vía IV.
"Biocompatible": el término "biocompatible", como se usa en el presente documento, pretende describir materiales que no provocan una respuesta perjudicial sustancial in vivo. En ciertas realizaciones, los materiales son "biocompatibles" si no son tóxicos para las células. En ciertas realizaciones, los materiales son "biocompatibles" si su adición a las células in vitro da como resultado una muerte celular menor o igual al 20%, y/o su administración in vivo no induce inflamación u otros efectos adversos similares. En ciertas realizaciones, los materiales son biodegradables.
"Biodegradable": como se usa en el presente documento, los materiales "biodegradables" son aquellos que, cuando se introducen en las células, se descomponen mediante maquinaria celular (p. ej., degradación enzimática) o mediante hidrólisis en componentes que las células pueden reutilizar o eliminar sin efectos tóxicos significativos en las células. En ciertas realizaciones, los componentes generados por la descomposición de un material biodegradable no inducen inflamación y/u otros efectos adversos in vivo. En algunas realizaciones, los materiales biodegradables se descomponen enzimáticamente. Alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, los materiales biodegradables se descomponen por hidrólisis. En algunas realizaciones, los materiales poliméricos biodegradables se descomponen en sus polímeros componentes. En algunas realizaciones, la descomposición de materiales biodegradables (que incluyen, p. ej., materiales poliméricos biodegradables) incluye la hidrólisis de enlaces éster. En algunas realizaciones, la descomposición de los materiales (incluidos, p. ej., materiales poliméricos biodegradables) incluye la escisión de los enlaces de uretano.
"Vehículo": como se usa en el presente documento, "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Las soluciones salinas de agua o solución acuosa y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferiblemente como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin.
"Detector": como se usa en el presente documento, "detector" se refiere a cualquier detector de radiación electromagnética que incluye, entre otros, cámara CCD, tubos fotomultiplicadores, fotodiodos y fotodiodos de avalancha.
"Imagen": como se usa en el presente documento, se entiende que el término "imagen" significa una presentación visual o cualquier representación de datos que pueda interpretarse para presentación visual. P. ej., una imagen tridimensional puede incluir un conjunto de datos de valores de una cantidad dada que varía en tres dimensiones espaciales. Una imagen tridimensional (p. ej., una representación de datos tridimensional) puede mostrarse en dos dimensiones (p. ej., en una pantalla bidimensional o en una impresión bidimensional). El término "imagen" puede referirse, p. ej., a una imagen óptica, una imagen de rayos X, una imagen generada por: tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética, tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y/o ultrasonido, y cualquier combinación de estos. "Péptido" o "Polipéptido": el término "péptido" o "polipéptido" se refiere a una cadena de al menos dos (p. ej., al menos tres) aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. En algunas realizaciones, un polipéptido comprende aminoácidos que se producen naturalmente; alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, un polipéptido comprende uno o más aminoácidos no naturales (es decir, compuestos que no se encuentran en la naturaleza pero que pueden incorporarse en una cadena de polipéptidos; ver, p. ej., http://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gif, que muestra estructuras de aminoácidos no naturales que se han incorporado con éxito en canales iónicos funcionales) y/o análogos de aminoácidos como se conocen en la técnica pueden emplearse alternativamente). En algunas realizaciones, uno o más de los aminoácidos en una proteína pueden modificarse, p. ej., mediante la adición de una entidad química tal como un grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo ácido graso, un enlazador para conjugación, funcionalización u otra modificación, etc.
"Radiomarcado": como se usa en el presente documento, "radiomarcado" se refiere a un resto que comprende un isótopo radiactivo de al menos un elemento. Los radiomarcadores adecuados a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, los descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un radiomarcador es uno usado en la tomografía por emisión de positrones (PET). En algunas realizaciones, un radiomarcador es uno usado en la tomografía computarizada de emisión de fotón único (SPECT). En algunas realizaciones, los radioisótopos comprenden 99mTc, 111ln, 64C u , 67Ga, 186Re, 188Re, 153Sm, 177Lu , 67C u, 123l, 124|, i 25|, 11c , 13N, 150 , 18F, 186Re, 188Re, 153Sm, 166Ho , 177Lu , 149Pm, 90Y, 213Bi, 103Pd, 109Pd, 159Gd, 140La, 198A u , 199A u , 169Yb, 175Yb, 165Dy, 166Dy, 67C u, 105Rh, 111Ag, 89Zr, 225A c y 192lr.
"Sujeto": como se usa en el presente documento, el término "sujeto" Incluye humanos y mamíferos (p. ej., ratones, ratas, cerdos, gatos, perros y caballos). En muchas realizaciones, los sujetos son mamíferos, particularmente primates, especialmente humanos. En algunas realizaciones, los sujetos son ganado tal como ganado vacuno, ovejas, cabras, vacas, cerdos y similares; aves de corral como pollos, patos, gansos, pavos y similares; y animales domesticados, particularmente mascotas como perros y gatos. En algunas realizaciones (p. ej., particularmente en contextos de investigación) los mamíferos sujetos serán, p. ej., roedores (p. ej., ratones, ratas, hámsteres), conejos, primates o cerdos, como cerdos endogámicos y similares.
"Sustancialmente": como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de exhibir la extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto habitual en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos químicos y biológicos rara vez, si alguna vez, se completan y/o llegan a la compleción o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en el presente documento para capturar la posible falta de integridad inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
"Agente terapéutico": como se usa en el presente documento, la frase "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que tiene un efecto terapéutico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado, cuando se administra a un sujeto.
"Tratamiento": como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" (también "tratar" o "tratado") se refiere a cualquier administración de una sustancia que alivia parcial o completamente, mejora, revive, inhibe, retrasa el inicio de, reduce la gravedad de, y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, características y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o afección en particular. Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no muestra signos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante y/o de un sujeto que exhibe solo signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o condición. Alternativamente o adicionalmente, dicho tratamiento puede ser de un sujeto que exhiba uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevantes. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto que ha sido diagnosticado que padece la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de susceptibilidad que se correlacionan estadísticamente con un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección relevantes.
[0028] Los dibujos se presentan en este documento con fines ilustrativos, no con fines de limitación.
Breve descripción de Ios dibujos
[0029] Los anteriores y otros objetos, aspectos, características y ventajas de la presente descripción se harán más evidentes y se comprenderán mejor por referencia a la siguiente descripción tomada en la conducción con las que acompañan a los dibujos, en los que:
FIGS. 1A - ID muestran ejemplos de conjugados de péptido Cy5 de unión de nervios.
FIG. 1A muestra un péptido lineal de unión de nervios con Cy5 (Ac = grupo acetilo en el extremo N-terminal). FIG. IB muestra un péptido de unión a nervio cíclico con Cy5.
FIG. 1C muestra cromatografía líquida de espectrometría de masas (LCMS) de péptido lineal.
FIG. ID muestra LCMS de péptido cíclico. Para LCMS, las muestras se procesaron en una columna C18 de Waters, 4,6 x 50 mm, acetonitrilo al 5-95% en agua (0,1% TFA) en 10 min. Los datos de espectrometría de masas que confirman que el producto está en cajas negras.
FIG. 2 muestra el espécimen de nervio ciático tratado con diferente confirmación de polipéptidos (p. ej., aleatorio, cíclico, lineal). Las muestras nerviosas se incubaron con 50 |jM de polipéptido durante 30 min. a temperatura ambiente, y se lavó con PBS, tres veces. Las imágenes se obtuvieron en un sistema de imagen in vivo (IVIS). El experimento se ejecutó por duplicado.
FIG. 3 muestra un esquema de puntos de proteína de unión de nervios (NBP)-polietilenglicol (PEG)-Cy5.5-C'. Los colorantes se encapsulan dentro de una cubierta de sílice y se funcionalizan superficialmente con péptidos.
FIGs . 4A - 4H muestran conformaciones sintetizadas lineales y cicladas de péptidos de secuencia de 17 aminoácidos (AA), péptidos de secuencia truncada (p. ej., 10-AA, 14-AA) y péptidos de secuencia codificada por sintetizador de péptidos en fase sólida. El perfil de Hp LC y la caracterización usando LC-MS también se muestran.
FIG. 5 muestra estudios de unión/captación ex vivo que comparan conjugados de tinte péptido-NIR con puntos C rojos profundos/que contienen tinte NIR (Cy5, Cy5.5) funcionalizados con péptido para muestras de nervios cadavéricos humanos. Se probaron los efectos de la secuencia peptídica, la conformación y el número de ligando sobre la unión de nervios.
FIG. 6 muestra la captación del nervio ciático humano y del músculo de conjugados de péptido-tinte o puntos C funcionalizados con péptido.
FIGs .7A y 7B muestran cambios de señal variables en el tiempo en muestras de nervio ciático humano ex vivo después de la incubación con péptidos de unión de nervios o puntos C funcionalizados con péptidos usando métodos de imagen óptica.
FIG. 8 muestra intensidades de señal de fluorescencia normalizadas de muestras de nervio ciático humano después de la incubación con conjugados de colorante péptido-Cy5.
FIGS. 9A - 9E muestran microscopía de fluorescencia de muestras de nervio ciático humano pretratadas con conjugados de péptido-tinte crio-seccionados.
FIGS. 10A - 10E muestran microscopía de fluorescencia de sección transversal de muestras de nervio ciático humano después de la incubación con conjugados de péptido-tinte o sondas basadas en partículas funcionalizadas con péptido de unión a nervio fluorescente (NBP) (p. ej., Cy5-NBP-puntos C).
FIGS. 11A y 11B muestran la localización de conjugados de péptido-tinte cíclico de residuo 17 AA en muestras de nervio ciático humano.
FIG. 12 muestra microscopía de fluorescencia in vivo dependiente del tiempo del nervio ciático humano después de la inyección de 400 nmoles de conjugados de péptido-tinte cíclico.
FIGS. 13A - 13E muestran imágenes in vivo de la señal de fluorescencia del nervio ciático y muscular frente al tiempo posterior a la inyección de péptidos de unión al nervio cíclico 17 AA.
FIGS. 14A y 14B muestran imágenes in vivo de la señal de fluorescencia del nervio ciático y muscular frente al tiempo posterior a la inyección de péptidos de unión de nervios lineal 17 AA.
FIG. 15 muestra microscopía de fluorescencia in vivo, dependiente del tiempo, del nervio ciático humano después de la inyección de 150 nmoles de conjugados de péptido-tinte cíclico versus lineales en ratones transgénicos thyl-YFP.
FIGS. 16A - 16E muestran imágenes in vivo de la señal de fluorescencia del nervio ciático y muscular frente al tiempo posterior a la inyección de 150 nmoles de péptidos de unión al nervio cíclico 17 AA.
Descripción detallada
[0030] En toda la descripción, donde se describen composiciones que tienen, incluyen o que comprenden componentes específicos, o cuando se describen métodos que tienen, incluyen o comprenden etapas específicas, se contempla que, además, hay composiciones de la presente invención que consisten esencialmente en, o consisten en, los componentes mencionados, y que hay métodos de acuerdo con la presente invención que consisten esencialmente en, o consisten en, los pasos de procesamiento recitados.
[0031] Debe entenderse que el orden de las etapas u orden para realizar ciertas acciones es indiferente con tal que la invención sigue siendo operable. Además, se pueden realizar dos o más pasos o acciones simultáneamente.
[0032] La mención en este documento de cualquier publicación, p. ej., en la sección de antecedentes, no es una admisión de que la publicación sirve como la técnica anterior con respecto a cualquiera de las reivindicaciones presentadas en el presente documento. La sección de antecedentes se presenta con fines de claridad y no pretende ser una descripción de la técnica anterior con respecto a cualquier reivindicación.
[0033] En los experimentos descritos en el presente documento, los polipéptidos lineales se ciclan, dando lugar a una estructura más rígida y la mejora en las afinidades y selectividades de unión. Para los estudios presentados, se lograron condiciones optimizadas y altos rendimientos del producto utilizando dimetilformamida (DMF) como disolvente y hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi) tripirrolidinofosfonio (PyBOP) como agente de acoplamiento.
[0034] En primer lugar, el polipéptido lineal NP41 se sintetizó y se marcó con el tinte NIR Cy5 para la prueba. La estructura mostrada en la FIG. lA fue confirmada por LCMS, como se muestra en la FIG. 1C. Un análogo cíclico de la estructura NP41 de la FIG. 1A también se sintetizó. La estructura del péptido cíclico que se muestra en la FIG. IB también fue confirmada por LCMS, como se muestra en la FIG. ID. Como control, un polipéptido aleatorio (Ac-SHSSTARDLWPHGKEGC) se marcó con Cy5 y se evaluó. Como se muestra en la FIG. 2, el compuesto cíclico exhibió una intensidad de fluorescencia significativamente mejorada (2 a 3 veces) en comparación con los polipéptidos revueltos y lineales para una muestra de nervio ciático. El compuesto cíclico también exhibió selectividad del tejido nervioso mejorada (frente al tejido muscular) en comparación con polipéptidos tanto lineales como revueltos.
[0035] FIGS. 4A - 4H muestran síntesis y caracterización de diferentes confirmaciones de conjugado de péptido-tinte (p. ej., lineal, ciclado, codificado) para los experimentos de unión de nervios descritos en este documento. P. ej., conformaciones sintetizadas lineales y cicladas de péptidos de secuencia de 17 aminoácidos (AA), péptidos de secuencia truncada (10-AA, 14-AA) y péptidos de secuencia codificada por sintetizador de péptidos en fase sólida. Los péptidos se marcaron con Cy5-maleimida en el residuo de cisteína en la fase líquida. Los productos finales se purificaron usando prep-HPLC con un rendimiento superior al 95%. La pureza y la masa de los productos finales se caracterizaron y confirmaron mediante HPLC analítica y LC-MS como se muestra en cada tabla. Los productos finales peptídicos de unión de nervios se unieron posteriormente a los puntos C' para crear plataformas multivalentes para estudios in vivo y ex vivo.
[0036] Para mejorar la mejora cuántica y el brillo de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), el compuesto cíclico se puede unir (o incorporado de otro modo) sobre/en nanopartículas, p. ej., puntos de C tal como se describe por Phillips (Phillips E, Penate-Medina O, Zanzonico PB, Carvajal RD, Mohan P, Ye Y, Humm J, Gonen M, Kaliagian H, Schoder H, Strauss W, Larson SM, Wiesner U, Bradbury MS. Clinical Translation of an Ultrasmall Optical Hybrid Nanoparticle Probe. Science Translational Medicine. 2014;6(260)) y/o puntos C', un radiomarcador PET
de nueva generación (124l) punto C' funcionalizado con cRGDY aprobado por la FDA que incorpora Cy5.5. Los precursores de sílice fluorescente se desarrollan mediante el acoplamiento de una especie de colorante reactivo con una fuente de organosilicato. Los precursores híbridos se hidrolizan y condensan con sílice pura para producir núcleos orgánicos/inorgánicos híbridos. Estos núcleos actúan como núcleos heterogéneos para el crecimiento de una cubierta de sílice pura, protegiendo aún más los colorantes encapsulados. (Burns, a ., OW, H., Wiesner, U. Fluorescent coreshell silica nanoparticles: towards "Lab on a Particle" architectures for nanobiotechnology. Chem Soc Rev. 2006; 35 (11):1028-42) (FlG. 3). Las nanopartículas de cubierta de núcleo con núcleos fluorescentes también se describen en las patentes de los Estados Unidos números 8.298.677 y 8.409.876.
[0037] En ciertas realizaciones, características descritas en Bradbury et al. Integr. Biol. (2013) 5: 74-86 pueden ser utilizadas. En ciertas realizaciones, características (p. ej., especies de sonda) descritas en Herz et al. J. Mater. Chem (2009) 19, 6341-6347 pueden ser utilizados.
[0038] En ciertas realizaciones, las características (p. ej., nanopartículas) descritas en Bradbury et al., números de solicitud de patente PCT internacional PCT/US2010/040994 y PCT/US2014/030401, publicada como W02011/003109 el 6 de enero de 2011, y se puede usar el documento WO2014/145606 el 18 de septiembre de 2014.
[0039] En ciertas realizaciones, pueden ser utilizadas características (p. ej., nanopartículas) descritas en Wiesner et al., Patente de EE.UU. n08.298.677, publicada el 30 de octubre, 2012.
[0040] La FlG. 3 muestra un esquema de puntos C' NBP-PEG-Cy5.5, de acuerdo con una realización ilustrativa de la divulgación. NBP es un péptido de unión a nervio cíclico particular descrito con más detalle a continuación en el presente documento. El colorante Cy5.5 se muestra como adjunto a la estructura cíclica de NBP, y Cy5.5 también se muestra como dopado en el núcleo de sílice. En ciertas realizaciones, el colorante está unido al péptido cíclico y no está unido, contenido dentro, unido o de otra manera directamente asociado con la nanopartícula. En ciertas realizaciones, el tinte no está unido al péptido cíclico sino que está unido, contenido dentro, unido y/o directamente asociado con la nanopartícula.
[0041] Para demostrar mejora de la señal sobre el fondo, el polipéptido lineal NP41 estaba unido a puntos C' a través de la conjugación con PEG, y la mejora resultante en la mejora cuántica y se midió el brillo de FCS (Tabla 1). De manera similar, el (los) péptido(s) cícIíco(s) puede(n) unirse a nanopartículas para una mejora cuántica mejorada y brillo FCS sobre el péptido cíclico no unido.
[0042] La Tabla 1 muestra Ios datos de caracterización de Ios puntos C' NBP lineales. Las mediciones se determinaron a partir de espectroscopia de correlación de fluorescencia (f Cs ).
Tabla 1
Diámetro Mejora No de Brillo No de hidrodinámico cuántica Cy5 por f c s NBP por partículas partículas Cy5 1,4nm 1 1 9,2kHz -NBP-Cy5 cíclico 2,2nm 0,9 1 9,0kHz 1 NBP-Cy5 lineal 2,4nm 0,9 1 8,9kHz 1 Punto C' NBP-PEG-Cy5 lineal 6,2nm 1,4 1,9 23,5kHz ~5 (densidad baja de ligandos)
Punto C' NBP-PEG-Cy5 lineal 6,9nm 1,3 2,0 23,4kHz ~10 (densidad media de ligandos)
Punto C' NBP-PEG-Cy5 lineal 7,6nm 1,3 2,3 27,7kHz ~20 (densidad alta de ligandos)
[0043] Los enfoques de presentación de fagos pueden ser utilizados para identificar nuevas secuencias de péptidos de unión humanas nerviosas (p. ej., marcadores selectivos para nervios) específicas para muestras de tejido nervioso cadavérico humano. La visualización de fagos, una poderosa herramienta genética aplicada con éxito al tejido del nervio murino extirpado, se puede utilizar con muestras de nervios faciales y laríngeos humanos para identificar nuevas secuencias de NBP con selectividad para estos tejidos nerviosos. Las secuencias peptídicas que exhiben afinidades y selectividades de unión global favorables al tejido nervioso se pueden usar para aplicaciones de multiplexación después de la unión a Ios puntos C.
[0044] En ciertas realizaciones, la presentación en fagos utiliza una biblioteca combinatoria de péptidos al azar de 12 residuos, con una complejidad de 109 clones o secuencias independientes (New England Biolabs). El vector de fago m13 proporciona una presentación pentavalente de péptidos aleatorios fusionados a la proteína de recubrimiento plll. Los fagos se someten a múltiples rondas de selección positiva y negativa. Los fagos que se unen a Ios tejidos nerviosos faciales (o laríngeos) preparados se seleccionan positivamente mediante aislamiento, secuenciación y amplificación. El fago luego se somete a un paso de selección negativa; se incubará con tejido ciático y se seleccionará el fago no ligante. Este ciclo de selección puede continuar hasta que se observen repetidamente secuencias distintas.
[0045] Como se describe en el presente documento, Ios experimentos se llevaron a cabo con el polipéptido lineal NP41, que incluye la secuencia NTQTLAKAPEHT, o, más específicamente, Ac-SHSNTQTLAKAPEHt Gc , así como una forma cíclica del polipéptido (que se muestra en la FlG. IB). Cada polipéptido se funcionalizó con un tinte fluorescente. En ciertas realizaciones, se pueden usar otros marcadores detectables, y se pueden usar otras secuencias de péptidos. La secuencia central de NP41 es NTQTLAKAPEHT. Mientras que el polipéptido NP41 usado en Ios experimentos incluye un grupo acetil-SHS unido al extremo N y un grupo -GC unido al extremo C, otras realizaciones pueden usar otros grupos finales (o ningún grupo final). En el ejemplo que se muestra, el grupo -SHS-se incluye a partir de la proteína de la cubierta del fago, y se incluye -GC para el colorante. Sin desear estar sujeto a ninguna teoría en particular, parece que restringir químicamente la forma lineal del polipéptido mejora la unión. Otros polipéptidos con selectividad de tejido nervioso también podrían usarse tal cual, unidos a nanopartículas, ciclados y/o ciclados y unidos a nanopartículas, p. ej, estas últimas mediante el uso de químicas de enlace adecuadas (p. ej., PEG). P. ej., otros polipéptidos que pueden usarse, ciclarse y/o unirse a nanopartículas incluyen Ios polipéptidos lineales en Whitney et al., tales como polipéptidos que comprenden las secuencias TYTDWLNFWa W p ; NTQTLAKAPEHT; KSLSRHDHIHHH; y/o DFTKTSPLGIH.
[0046] En ciertas realizaciones, se utilizan otros polipéptidos. P. ej., cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento puede agregarse, modificarse o reducirse en longitud. Si bien Ios experimentos descritos en este documento forman péptidos cíclicos de la cabeza a la cola utilizando la química de las amidas, la restricción covalente se puede introducir internamente (p. ej., en oposición a la cabeza a la cola), y/u otras químicas también funcionarían (p. ej., clic, disulfuro, metátesis, etc.). En ciertas realizaciones, el polipéptido tiene de 5 a 20 residuos de aminoácidos y/o un átomo de 15 a 60 átomo de macrociclo (p. ej., el número de átomos que forman el anillo, p. ej., de anillo de 15 a 60 miembros).
[0047] En general, las nanopartículas usadas en la práctica de formas de realización descritas en este documento son nanopartículas a base de sílice, p. ej., puntos de C o puntos C', que se infunden con, se recubren con, o de otro modo se enlazan o asocian con un agente detectable, (p. ej., colorante orgánico, radiomarcador) y ligando(s) dirigido(s) a péptidos. En ciertas realizaciones, las nanopartículas a base de sílice, por ejemplo Ios puntos C o Ios puntos C', pueden tener un tamaño promedio (p. ej., diámetro) de menos de o igual a 10 nm, antes de la funcionalización con un péptido. En ciertas realizaciones, las nanopartículas a base de sílice, por ejemplo Ios puntos C o puntos C', pueden tener un tamaño promedio mayor de 10 nm antes de la funcionalización con un péptido. En ciertas realizaciones, el tamaño medio de partícula, las distribuciones de tamaño de partícula y/o el brillo se personalizan para la aplicación específica. En ciertas realizaciones, se usan nanopartículas basadas en polímeros. En ciertas realizaciones, el material de nanopartículas de agente detectable por polipéptido (nanopartículas con péptido cíclico y agente detectable unido al mismo o asociado de otro modo) no es tóxico y se elimina eficazmente a través de Ios riñones. En ciertas realizaciones, un tinte se une al péptido (en lugar de unirse directamente a la nanopartícula). En ciertas realizaciones, un colorante se une, se incorpora dentro o se asocia de otro modo con la nanopartícula, más bien que el péptido. En ciertas realizaciones, un tinte está asociado con la nanopartícula, y un tinte está unido al péptido.
[0048] En ciertas realizaciones, las nanopartículas a base de sílice pueden ser funcionalizadas en la superficie con múltiples diferentes polipéptidos. En ciertas realizaciones, Ios polipéptidos múltiples pueden infundirse, recubrirse o unirse o asociarse con agentes de detección múltiples que son detectables con lecturas distintas. En ciertas realizaciones, las nanopartículas a base de sílice se pueden usar simultáneamente o en diferentes momentos para realizar la detección óptica multiplexada de ligandos específicos para uso intraoperatorio. P. ej., en ciertas realizaciones, se pueden usar dos o más nanopartículas basadas en sílice espectralmente distintas, cada una de las cuales contiene un ligando de direccionamiento único funcionalizado en la superficie, para crear estructuras multivalentes para uso intraoperatorio. En ciertas realizaciones, las nanopartículas basadas en sílice espectralmente distintas, cada una de las cuales contiene un ligando de direccionamiento funcionalizado en la superficie, pueden emitir firmas medibles por distintas modalidades de detección, creando funcionalidades de lectura multimodal.
[0049] Los sistemas y métodos descritos en el presente documento se pueden usar con sistemas y métodos descritos en la Patente de EE.UU. N0 de Solicitud 13/381.209, publicada como US 2013/0039848 el 14 de febrero de 2013, que se refiere a sistemas y métodos de formación de imágenes in vivo que emplean nanopartículas fluorescentes a base de sílice. En algunas realizaciones, al menos una de las especies de sonda comprende nanopartículas. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen una arquitectura de sílice y un núcleo rico en tinte. En algunas realizaciones, el núcleo rico en colorante comprende un indicador fluorescente. En algunas realizaciones, el indicador fluorescente es un tinte de infrarrojo cercano o rojo lejano. En algunas realizaciones, el indicador fluorescente se selecciona del grupo que consiste en un fluoróforo, fluorocromo, colorante, pigmento, metal de transición fluorescente y proteína fluorescente. En algunas realizaciones, el indicador fluorescente se selecciona del grupo que consiste en Cy5, Cy5.5, Cy2, FITC, TRITC, Cy7, FAM, Cy3, Cy3.5, Texas Red, ROX, HEX, JA133, AlexaFluor 488, AlexaFluor 546, AlexaFluor 633, AlexaFluor 555, AlexaFluor 647, DAPI, TMR, R6G, GFP, GFP mejorado, CFP, ECFP, YFP, Citrine, Venus, YPet, CyPet, AMCA, Spectrum Green, Spectrum Orange, Spectrum Aqua, Lissamine y Europium.
[0050] En ciertas realizaciones, el (Ios) agente(s) fluorescente(s) tienen longitudes de onda de excitación y emisión en el rojo y cerca de espectro de infrarrojos de la gama. En ciertas realizaciones, Ios agentes fluorescentes tienen longitudes de onda de excitación y emisión que varían de 400 a 1300 nm, o de 440 a 1100 nm, o de 550 a 800 nm, o
de 600 a 900 nm. El uso de esta porción del espectro electromagnético maximiza la penetración del tejido y minimiza la absorción por absorbentes fisiológicamente abundantes como la hemoglobina (<650 nm) y el agua (>1200 nm). Las especies de sonda con longitudes de onda de excitación y emisión en otros espectros, tales como el espectro de luz visible y ultravioleta, también pueden emplearse en ciertas realizaciones. En particular, los fluoróforos tales como ciertos fluorocromos o colorantes fluorescentes de carbocianina o polimetina pueden usarse como el agente fluorescente, p. ej., la Pat. de EE.UU. N06.747,159 de Caputo et al. (2004); Pat. de EE.UU. N06.448.008 de Caputo et al. (2002); Pat. 6,136.612 de Della Ciana et al. (2000); Pat. No 4,981,977 de Southwick, et al. (1991); 5.268.486 de Waggoner et al. (1993); Pat. de EE.UU. No 5.569.587 de Waggoner (1996); 5.569.766 de Waggoner et al. (1996); Pat. de EE.UU. No 5.486.616 de Waggoner et al. (1996); Pat. de EE.UU. No 5.627.027 de Waggoner (1997); Pat. de EE.UU. No 5.808.044 de Brush, et al. (1998); Pat. de EE.UU. No 5.877.31o de Reddington, et al. (1999); Pat. de EE.UU. No 6,002,003 de Shen et al. (1999); Pat. de EE.UU. No 6,004,536 de Leung et al. (1999); Pat. de EE.UU. No 6,008,373 de Waggoner, et al. (1999); Pat. de EE.UU. No 6.043.025 de Minden, et al. (2000); Pat. de EE.UU. No 6,127,134 de Minden, et al. (2000); Pat. de EE.UU. No 6,130.094 de Waggoner et al. (2000); Pat. de EE.UU. No 6,133.445 de Waggoner et al. (2000); Pat. de EE.UU. No 7.445.767 de Licha, et al. (2008); Pat. de EE.UU. No 6.534.041 de Licha et al. (2003); Pat. de EE.UU. No 7.547.721 de Miwa et al. (2009); Pat. de EE.UU. No 7.488.468 de Miwa et al. (2009); Pat. de EE.UU. No 7,473,415 de Kawakami et al. (2003); también WO 96/17628, EP 0796 111 B1, EP 1181 940 B1, EP 0 988060 B1, WO 98/47538, WO 00/16810, EP 1113822 B1, WO 01/43781, EP 1237583 A l, WO 03/074091, EP 1 480683 B1, WO 06/072580, EP 1833513 A l, EP 1679082 A l, WO 97/40104, WO 99/51702, WO 01/21624 y EP 1 065250 A l ; y Tetrahedron Letters 41, 9185-88 (200o).
[0051] Los agentes fluorescentes ejemplares incluyen, p. ej., los siguientes: Cy5.5, Cy5, Cy7.5 y Cy7 (GE® Healthcare); AlexaFluor660, AlexaFluor680, AlexaFluor790 y AlexaFluor750 (Invitrogen); VivoTag™ 680, VivoTag™-S680, VivoTag™-S750 (VisEn Medical); Dy677, Dy682, Dy752 y Dy780 (Dyomics®); DyLight® 547 y/o DyLight® 647 (Pierce); HiLyte Fluor™ 647, HiLyte Fluor™ 680 y HiLyte Fluor™ 750 (AnaSpec®); IRDye® 800CW, IRDye® 800RS e IRDye® 700DX (LI-Coí®); ADS780WS, ADS830WS y ADS832WS (fuente de tinte estadounidense); XenoLight CF™ 68o, XenoLight CF™ 75o, XenoLight CF™ 770 y XenoLight DIR (Caliper® Life Sciences); y Kodak® X-SIGHT® 65o, Kodak® X-SIGHT 691, Kodak® X-SIGHT 751 (Carestream® Health). En ciertas realizaciones, un resto conector es un resto químico con dos o más grupos funcionales en los extremos (bifuncionales, trifuncionales, etc.) dispuestos para conectar una nanopartícula basada en sílice con un péptido y/o marcador detectable. En los ejemplos experimentales descritos en el presente documento, se usó PEG como resto enlazador para unir el polipéptido (p. ej., péptido lineal o cíclico) a la nanopartícula. Se pueden usar otros restos enlazadores. El espacio entre el punto C' (u otra nanopartícula) y el polipéptido se puede variar usando cadenas de PEG (u otro enlazador) de diferentes tamaños, por ejemplo. En ciertas realizaciones, el resto enlazador comprende uno o más de los restos enlazadores descritos en la Solicitud de Pat. de EE.UU. No 14/722.307, presentada el 27 de mayo de 2015, publicada como Publicación de Solicitud de Pat. de EE.UU. No US 2015/0343091.
[0052] En ciertas realizaciones, los puntos C funcionalizados por péptido de unión de nervios o conjugados de péptidotinte tienen diferentes conformaciones (p. ej., cíclicas) y longitudes (p. ej., truncadas y alargadas), y se administran por vía tópica en los troncos nerviosos periféricos adyacentes o próximos a los ganglios linfáticos metastásicos o tumores primarios después de la exposición quirúrgica, incluidos, entre otros, los nervios faciales, ciáticos, hipogástricos, laríngeos para mejorar el contraste y delinear pequeñas ramas nerviosas distales y/o distribuciones durante los procedimientos de mapeo de SLN que no se visualizan bien en ausencia de estos agentes para reducir el riesgo de lesiones.
[0053] En ciertas realizaciones, estas sondas de partículas funcionalizadas por péptidos o conjugados de péptido-tinte pueden ser localmente administrados sobre el sitio del tumor primario o nodos enfermos (p. ej., la glándula parótida) con el fin de facilitar su absorción por los nervios normales adyacentes, p. ej., faciales).
[0054] En ciertas realizaciones, la sustancia o formulación se administra a través de la inyección local vs. administración IV. Por ejemplo, las sustancias o formulaciones con composiciones que contienen péptidos (p. ej., composiciones que contienen partículas y que no contienen partículas) pueden inyectarse localmente en una concentración suficientemente alta para fines de formación de imágenes. En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen péptidos sin partículas se administran por vía IV. En ciertas realizaciones, se prefiere la inyección local sobre la inyección IV cuando las composiciones que contienen partículas son demasiado viscosas a concentraciones suficientemente altas para fines de formación de imágenes.
[0055] Los nuevos péptidos cíclicos o productos a base de partículas pueden ofrecer propiedades fotofísicas y de unión de nervios mejoradas en comparación con los compuestos descritos actualmente.
[0056] En ciertas realizaciones, los puntos C funcionalizados por péptidos de unión de nervios administrados a través de una o más de estas rutas permite que las estructuras neurales se visualicen máximamente con alto contraste nervio a músculo, como contra la que puede conseguirse mediante la inyección de colorantes fluorescentes simples solamente, debido a su mejora de multivalencia superior, enlace/retención de sitio objetivo mejorado y características fotofísicas. Estos productos pueden ser compatibles para su uso en aplicaciones de multiplexación junto con sondas de partículas unidas a péptidos dirigidas a objetivos de cáncer (p. ej., Ganglios portadores de cáncer). En ciertas realizaciones, un tinte visible (p. ej., un tinte en el espectro visible, p. ej., un tinte verde, p. ej., FITC) puede
administrarse localmente o por vía IV y puede usarse para ver el nervio mediante señal fluorescente. En ciertas realizaciones, el colorante visible unido al péptido se une preferentemente al tejido nervioso y la luz del colorante se puede ver con la propia vista del cirujano. P. ej., la formulación puede aplicarse tópicamente al nervio mismo o localmente cerca del nervio, p. ej., la formulación puede aplicarse tópicamente a un tronco nervioso periférico (p. ej., adyacente o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica), permitiendo que la composición de la formulación se difunda desde el tronco del nervio a ramas más pequeñas del tejido nervioso. El agente fluorescente de la composición emite luz y puede detectarse y visualizarse (p. ej., en tiempo real) o puede ser lo suficientemente brillante como para que un cirujano pueda verla directamente con su propia vista sin ayuda durante un procedimiento quirúrgico. La aplicación tópica al tejido nervioso (y su posterior difusión a través del tejido nervioso) puede proporcionar un mayor contraste, ya que se reduciría la señal de fondo de las proteínas de la sangre (p. ej., hemoglobina), en comparación con la administración intravenosa de la formulación.
Ejemplos experimentales
Síntesis de conjugados de pol¡péptido-Cv5 de unión a nervios cíclicos y lineales
[0057] La NP41 lineal (Fig. 1A) y su análogo cíclico (Fig. IB ) se sintetizaron sobre resina de clorotritilo usando protocolos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida basada en Fmoc (SPSS). El polipéptido lineal se obtuvo por escisión/desprotección de la resina peptídica con un cóctel de TFA:TIS:EDT:agua (85:5:5:5), seguido de purificación por Hp LC de fase inversa. Para preparar el análogo cíclico, se eliminó el grupo Fmoc N-terminal, y el polipéptido lineal completamente protegido se separó luego de la resina en condiciones suaves usando hexafluoroisopropanol. El análogo cíclico cabeza a cola se obtuvo mediante una reacción de acoplamiento intramolecular en la que los residuos de terminales N y C se unen en solución proporcionando el precursor cíclico deseado. El material crudo se desprotegió y purificó globalmente por HPLC de fase inversa. Usando este enfoque sintético, se obtuvo fácilmente el producto peptídico macrocíclico de 51 miembros deseado. Cabe señalar que los péptidos cíclicos de este tamaño son sintéticamente desafiantes. Sin embargo, el enfoque utilizado aquí proporcionó un producto cíclico con excelente pureza (p. ej., superior al 95%) y buen rendimiento (~ 40%). Los péptidos tanto lineales como cíclicos se marcaron con fluorescencia modificando el tiol libre de los residuos de cisteína con un maleimido-Cy5. Los productos finales se caracterizaron y confirmaron por LCMS como se muestra en las FIGS. 1A a la ID.
Síntesis de conjugados de polipéptido-nanopartícula lineales (NBP-punto C')
[0058] El polipéptido de unión a nervios lineal (NBP) NP41 se incorporó en puntos C' utilizando un resto enlazador PEG. Como se muestra en la Tabla 1, el brillo medido del colorante Cy5 es al menos 130% mayor para el NBP-punto C' que para el polipéptido libre.
Unión a tejido del nervio ciático humano ex vivo
[0059] Los péptidos lineales y cíclicos, junto con un polipéptido de control aleatorio (Ac-SHSSTARDLWPHGKEGC), fueron marcados con Cy5 y evaluados para la unión a muestras de tejido nervioso humano ex vivo. Las muestras de tejido utilizadas fueron nervios ciáticos cadavéricos recién extirpados y obtenidos por el Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (NDRI). Las muestras de tejido se prepararon en placas de 24 pocilios, se lavaron con PBS, luego se incubaron con 50 pM de polipéptido lineal, cíclico o revuelto a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, las muestras se sometieron a varias rondas de lavados con PBS. Las placas se fotografiaron usando un sistema de imagen IVIS Spectrum. Como se muestra en la FIG. 2, en general, el compuesto cíclico exhibió una intensidad de fluorescencia significativamente mejorada (2-3 veces) en comparación con los polipéptidos revueltos y lineales para la muestra de nervio ciático; y selectividad sobre el tejido muscular.
[0060] La FIG. 5 muestra que el nervio ciático cadavérico humano se seccionó en fragmentos de 1 cm de longitud y se incubó en soluciones de péptidos de 15 pM o puntos C unidos a péptidos durante 80 minutos a temperatura ambiente seguido de múltiples lavados con solución salina tamponada con fosfato. Los análisis no invasivos de la región de interés obtenidos 80 minutos después de la incubación mediante imágenes de espectro IVIS, demostraron un aumento de la señal óptica (de mayor a menor): puntos C cíclicos funcionalizados con péptidos de 17 aminoácidos (AA) (parte superior izquierda); conjugados de péptido-tinte cíclico de residuo 17 AA (superior derecha); conjugados lineales péptido-tinte de residuo 17 AA (centro derecha); puntos C codificados con péptido cíclico funcionalizado 17 AA (inferior izquierda). Las últimas dos sondas sirvieron como controles.
[0061] La FIG. 6 muestra mediciones de señal de fluorescencia ex vivo de muestras de nervio y músculo (control) incubadas en conjugados de péptido-tinte o soluciones de punto C funcionalizadas con péptido. Las muestras de tejido nervioso y muscular se incubaron en conjugado péptido-tinte 15 pM o soluciones de punto C funcionalizadas con péptido durante 80 minutos a temperatura ambiente con agitación suave seguido de lavado con PBS. Después de obtener imágenes en el espectro iVlS, se realizó un análisis de ROI. Las barras indican la desviación estándar media /-. N = 5 por grupo. Cada réplica es de un experimento biológico, cuantificado con cinco campos de visión independientes. Se observó una señal de fluorescencia más alta en los nervios, en comparación con las muestras de tejido muscular. La señal de fluorescencia máxima se midió para puntos C' funcionalizados con péptido cíclico de
residuo 17 AA, seguido de conjugados de péptido-tinte cíclico de residuo 17 AA, conjugados de péptido lineal-tinte de residuo 17 AA y puntos C codificados con péptido cíclico funcionalizado. Se observó una señal de al menos cuatro a casi cinco veces mayor en el nervio, en comparación con las muestras de tejido muscular incubadas con sondas similares. Sin desear limitarse a ninguna teoría, los datos sugieren que la absorción y retención selectiva de conjugados de péptido-tinte y puntos C funcionalizados con péptido.
[0062] Las FIGS. 7A y 7B muestran cambios de señal dependientes del tiempo en la absorción después de la incubación con péptidos de unión de nervios o puntos C funcionalizados con péptidos usando métodos de imagen óptica. Las imágenes ópticas se utilizaron para evaluar la captación variable en el tiempo en muestras de nervio ciático humano ex vivo incubadas con péptidos de unión de nervios (p. ej., cíclicos, lineales, codificados) o Ios correspondientes puntos C funcionalizados con péptidos. Las barras indican la desviación estándar media /-. N = 5 por grupo. Cada réplica es de un experimento biológico, cuantificado con cinco campos de visión independientes. Se encontró que la señal de fluorescencia normalizada relativa en las muestras de nervio incubadas era de aproximadamente el 80% a Ios 20 minutos y casi el 100% al 80% en relación con la sonda de partículas de control (p. ej., puntos C unidos a péptidos revueltos). Además, cuando se compara con el péptido lineal nativo, se encontró un 60% más de señal a Ios 20 minutos (p. ej., casi el 100% a Ios 80 minutos) para Ios puntos C funcionalizados con péptidos cíclicos 17 AA.
[0063] La FIG. 8 muestra un efecto de la longitud y la conformación de la secuencia peptídica sobre las propiedades de unión/absorción nerviosa. Las muestras de nervio ciático humano se incubaron en soluciones de 15 |jM de secuencias de péptidos de residuos 17 AA, 10-AA truncadas y 10-AA truncadas con conformaciones cíclicas para evaluar la dependencia de la unión/captación de la especificidad y conformación de la secuencia. Se usó un conjugado lineal 17 AA de péptido-tinte para determinar la influencia de la conformación. La forma cíclica de un péptido de secuencia codificada se utilizó como control. Las barras indican la desviación estándar media /-. N = 5 por grupo. Cada réplica es de un experimento biológico, cuantificado con cinco campos de visión independientes. Las regiones de interés fueron tomadas de imágenes transversales. La máxima señal de fluorescencia se observó usando tratamientos de conjugado de péptido-tinte cíclico 17 AA, seguido por el de colorante de péptido cíclico 14-AA y conjugados de péptido-tinte cíclico 10 AA. Se observó un cambio de más de 2 veces en la señal óptica con tratamientos de conjugado péptido-tinte cíclico 17 AA en comparación con tratamientos conjugados de péptido-tinte lineal 17 AA.
[0064] Las FIGS. 9A - 9E muestran un efecto de la longitud y la conformación de la secuencia peptídica sobre la unión/absorción nerviosa. La unión/absorción selectiva del nervio se evaluó después de la incubación de secciones del nervio ciático humano con soluciones conjugadas de péptido-tinte 15 |i M. El tejido nervioso preincubado se embebió en OCT y se crioseccionó en sección transversal (20 j M). Se observó una señal de fluorescencia máxima para conjugados de péptido-tinte cíclico de residuo 17 AA en relación con construcciones de péptidos lineales y codificados utilizando microscopía de fluorescencia con objetivo 5x y juego de filtros Cy5. Todas las imágenes de fluorescencia Cy5 se adquirieron en configuraciones idénticas de exposición y normalización. Barra de escala = 200 jm .
[0065] Las FIGS. 10A - 10E muestran la señal de fluorescencia de muestras de nervios incubadas con puntos C o péptidos funcionalizados con péptidos de unión a nervios de 15 j M durante 80 minutos. El tejido nervioso tratado se lavó, se crio-seccionó (15 j M) sobre portaobjetos y se observó con un microscopio de fluorescencia (objetivo 5x) (FIGS. 10A - 10D). Se colocaron regiones de interés (ROI) sobre la muestra del nervio después del tratamiento con diferentes sondas. Se observó señal de fluorescencia (orden de mayor a menor, véase la FIG. 10E) en muestras incubadas con puntos C funcionalizados con péptidos cíclicos 17 AA, seguidos de conjugados de péptido-tinte cíclico o lineal 17 AA o puntos C funcionalizados con péptido-tinte cíclico revuelto.
[0066] Las FIGS. 11A y 11B muestran que se usó microscopía invertida (x20) para observar especímenes de nervio ciático crio-seccionados (20 j M) preincubados en soluciones conjugadas de péptido-tinte cíclico 17 AA (15 j M) durante 80 min. FluoroMyelin green (marcador de mielina) se usó para teñir conjuntamente las secciones nerviosas, seguido de lavado con PBS, y escaneo mediante microscopía invertida (X20). Los resultados de la imagen muestran que no hay co-localización del péptido con este marcador de mielina; se observó que el conjugado de péptido-tinte cíclico 17 AA implica principalmente epineuro y perineuro, mientras que se observó un grado relativamente menor de señal Cy5 dentro del endoneuro.
La unión a tejido de nervio ciático humano in vivo
[0067] FIG. 12 muestra microscopía de fluorescencia in vivo dependiente del tiempo del nervio ciático humano después de la inyección de 400 nmoles de conjugados de péptido-tinte cíclico.
[0068] Las FIGS. 13A - 13E muestran la captación in vivo dependiente del tiempo de la inyección nerviosa ciática y muscular post-iv de conjugados de péptido-tinte cíclico 17 AA usando imágenes ópticas. Se inyectaron conjugados de péptido-tinte cíclico 17 AA (marcados con Cy5) por vía intravenosa (400 nmoles) en las venas de la cola del ratón desnudo antes de la exposición quirúrgica y la imagen de Ios nervios ciáticos y el músculo adyacente utilizando un microscopio estereoscópico Zeiss Lumar (objetivo 0,8X) con capacidades de imágenes de fluorescencia. Las imágenes previas y en serie después de la inyección (pi) (campo brillante, fluorescente) se adquirieron en 8 puntos de
15 min a 240 min p.i. Las barras indican la desviación estándar media /-. N = 5 por grupo. Cada réplica es de un experimento biológico, cuantificado con cinco campos de visión independientes. El análisis de la región de interés (ROI) se realizó sobre las regiones nerviosas y musculares para evaluar los cambios de señal dependientes del tiempo. Las FIGS. 13A - 13E muestran la señal de fluorescencia absoluta y relativa (p. ej., porcentaje de la señal de fluorescencia inicial adquirida a los 15 minutos pi) de los nervios (FIGS. 13A y 13B) y el músculo adyacente (FIGS.
13B y 13D), respectivamente. FIG. 13E muestra relaciones nerviosas/musculares o de contraste que varían en el tiempo, que aumentaron de aproximadamente 1,2 a casi 2,0 durante un período de 4 horas, lo que sugiere una captación y retención selectiva de muestras nerviosas con el tiempo.
[0069] Las FIGS. 13A - 13E muestran que el péptido ciclado proporciona una buena señal fluorescente del nervio en contraste con la señal del músculo (circundante). Por ejemplo, cuanto mayor es la proporción de la señal del tejido nervioso frente a la señal del tejido muscular, más se distingue visualmente el tejido nervioso del tejido circundante (de fondo) (p. ej., en tiempo real, intraoperatoriamente). El péptido lineal no se demuestra como relaciones altas. Las FIGS. 13A - 13E también muestran que la señal del péptido ciclado dura más tiempo en comparación con el péptido lineal, y la proporción de señal del tejido nervioso frente al tejido muscular en realidad aumenta con el tiempo. Una señal más duradera es un beneficio porque el cirujano tiene más flexibilidad en el procedimiento quirúrgico. Por ejemplo, la administración del agente no tiene que ocurrir inmediatamente antes del procedimiento; más bien, hay una ventana de tiempo más larga durante la cual se puede detectar una señal. La señal es detectable después de aproximadamente 15 minutos, pero la relación señal/nervio muscular en realidad mejora con el tiempo. La señal es detectable hasta al menos unas pocas horas después de la administración. Se esperan períodos de tiempo similares en humanos como en los estudios en animales.
[0070] Las FIGS. 14A y 14B muestran la captación in vivo dependiente del tiempo de la inyección nerviosa ciática y muscular post-iv de conjugados de péptido-tinte lineales 17 a A usando imágenes ópticas. Se inyectaron conjugados de péptido-tinte lineales 17 AA(marcados con Cy5) por vía intravenosa (150 nmoles) en las venas de la cola del ratón desnudo antes de la exposición quirúrgica y la imagen de los nervios ciáticos y el músculo adyacente utilizando un microscopio estereoscópico Zeiss Lumar (objetivo 0,8X) con imágenes fluorescentes capacidades. Las imágenes previas y posteriores a la inyección en serie (pi) (campo brillante, fluorescente) se adquirieron en 6 puntos (15 min -150 min). Las barras pi indican una desviación estándar media /-. N = 5 por grupo. Cada réplica es de un experimento biológico, cuantificado con fiach. La réplica es de un experimento biológico, cuantificado con ts (15 minutos a 6 veces y regiones musculares para evaluar los cambios de señal dependientes del tiempo. La FIG. 14A muestra el músculo de fluorescencia del nervio absoluto. Se observó que disminuía la señal de fluorescencia significativamente a los 30 minutos hasta aproximadamente el 15% de los niveles posteriores a la inyección; la señal era apenas perceptible a partir de entonces, lo que impide la evaluación (datos no mostrados). Además, la FIG. 14A muestra que la señal del péptido lineal se reduce al l0% de la señal inicial 30 minutos después de la administración La FIG. 14B muestra las correspondientes relaciones nervio-músculo o contraste que varían en el tiempo, que fueron aproximadamente equivalentes durante los primeros 30 minutos después de la inyección de conjugado lineal de péptido-tinte, lo que sugiere una absorción selectiva y retención por las muestras del nervio ciático con relación al músculo con el tiempo.
[0071] La FIG. 15 muestra la microscopía de fluorescencia in vivo dependiente del tiempo del nervio ciático humano después de la inyección de 150 nmoles de conjugados de péptido-tinte cíclico frente a lineal en los ratones transgénicos con 1-YFP.
[0072] Las FIGS. 16A - 16E muestran la captación in vivo dependiente del tiempo de la inyección post-iv de nervio y músculo ciático de conjugados de péptido-tinte cíclico 17 AA usando imágenes ópticas. Se inyectaron conjugados de péptido-tinte cíclico 17 AA (marcados con Cy5) por vía intravenosa (150 nmoles) en las venas de la cola del ratón desnudo antes de la exposición quirúrgica y la obtención de imágenes de los nervios ciáticos y el músculo adyacente usando un microscopio estereoscópico Zeiss Lumar (objetivo 0,8X) con capacidades de imágenes de fluorescencia. Las imágenes previas y en serie después de la inyección (pi) (campo brillante, fluorescente) se adquirieron en 6 puntos de tiempo (15 min -150 min). Las barras pi indican la desviación estándar media /-. N = 5 por grupo. Cada réplica es de un experimento biológico, cuantificado con cinco campos de visión independientes. El análisis de la región de interés (ROI) se realizó sobre las regiones nerviosas y musculares para evaluar los cambios de señal dependientes del tiempo. Las FIGS. 16A - 16D muestran la señal de fluorescencia absoluta y relativa (porcentaje de la señal de fluorescencia inicial adquirida a los 15 minutos pi) de los nervios (FIGS. 16A y 16c ) y el músculo adyacente (Figuras 16B y 16D), respectivamente. FIG. 16E muestra relaciones nerviosas-musculares o de contraste que varían en el tiempo, que aumentaron de aproximadamente 1,3 a casi 2,6 durante un período de 1,5 horas. Sin desear limitarse a ninguna teoría, estos datos sugieren una captación y retención selectiva por parte de las muestras nerviosas con el tiempo.
Claims (16)
1. Un péptido cíclico que comprende la secuencia peptídica NTQTLAKAPEHT o una composición de péptido cíclico que comprende un péptido que tiene una estructura enumerada a continuación:
Cy5 Cy5
\ \
\ \
/ Cys-Thr-Leu-Ala \ t Cys-Thr-Leu-Ala x
Thr Lys Thr Lys
' fe-Qu-Pro-Ala ' .
' His-Glu-Pro-Ala
'
Cvs-A$n-Thr-Gln-Thr-Leu Cys-Asn-Thr-GIn-Thr-Leu x
Gty Lys 9y Lys
x Tlv-hfe-Glu-Pro-Ala-Lys 7 ' Thr-His-Glu-Pro-Ala-Lys '
2. Un conjugado peptídico de unión de nervios que comprende:
el péptido cíclico de la reivindicación 1;
una nanopartícula;
un agente fluorescente; y
un resto enlazador.
3. El conjugado peptídico de unión a nervios de la reivindicación 2, en donde la nanopartícula comprende:
un núcleo basado en sílice;
el agente fluorescente dentro del núcleo;
una cubierta de sílice que rodea al menos una parte del núcleo;
el resto enlazador unido a la nanopartícula; y
opcionalmente, de uno a veinte ligandos peptídicos unidos a la nanopartícula recubierta de polímero.
4. El conjugado peptídico de unión de nervios de la reivindicación 2 o la reivindicación 3,
en donde la nanopartícula es una partícula ultrapequeña (p. ej., con un diámetro medio inferior a 100 nm, p. ej., inferior a 50 nm, p. ej., inferior a 30 nm, p. ej., inferior a 20 nm, p. ej., inferior a 10 nm) (p. ej., en donde la nanopartícula ultrapequeña es un punto C o punto C'); y/o
en donde el resto conector comprende uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), PEG2 y para-aminobenciloxicarbamato (PABC) (p. ej., en donde el resto conector tiene de 2 a 50 átomos); y/o en donde el péptido cíclico está unido a la nanopartícula a través del resto conector; y/o
en donde el agente fluorescente comprende un colorante de cianina (p. ej., Cy5 o Cy5.5); y/o
que tiene de 5 a 20 residuos de aminoácidos y/o un macrociclo de 15 átomos a 60 átomos; y/o
que tiene 17 residuos de aminoácidos y/o un macrociclo de 51 átomos; y/o
en donde se forma un macrociclo ciclando el péptido de la cabeza a la cola, o introduciendo un enlace covalente interno a la secuencia.
5. Una composición de péptido cíclico que comprende:
un agente fluorescente; y
el péptido cíclico de la reivindicación 1.
6. La composición de la reivindicación 5, en donde el péptido cíclico comprende un macrociclo; o
en donde el péptido cíclico comprende un macrociclo y el macrociclo se forma ciclando el péptido cabeza a cola, o introduciendo un enlace covalente interno a la secuencia.
7. La composición de la reivindicación 1, en la que el péptido cíclico se selecciona de:
Cys-Asn-Thr-6ln-Thr-Leu / Cys-A$n-Thr-Gln-Thr-Leu x
Gly Lys Gly Lys
' Thr-His-Glu-Pro-Ala-Lys 7 ' Thr-rts-Glu-Pro-Ala-Lys 7
y en donde el péptido cíclico está
(i) unido a una nanopartícula; o
(ii) en donde el péptido cíclico está unido a una nanopartícula covalente o no covalentemente a través de un resto conector; o
(iii) en donde el péptido cíclico está funcionalizado.
8. Un método de formación de imágenes que comprende:
administrar a un sujeto una formulación que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y que permite que la composición se una selectivamente al tejido nervioso del sujeto; exponer el tejido del sujeto a la luz de excitación; y
detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen y mostrar la imagen.
9. El método de obtención de imágenes de la reivindicación 8, en donde la luz emitida por el tejido nervioso es más intensa que la luz emitida por el tejido circundante (p. ej., la relación de señal nervio-músculo es al menos 2) de modo que el tejido nervioso se distingue visualmente del tejido circundante.
10. El método de obtención de imágenes de la reivindicación 9, en donde la luz emitida desde el tejido nervioso es detectable al menos 15 minutos después de la administración de la formulación al sujeto (p. ej., en donde el sujeto es un animal, p. ej., en donde el sujeto es un humano); y/o
en donde la luz emitida desde el tejido nervioso es detectable al menos durante 1 hora (p. ej., al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas o al menos 4 horas) después de la administración de la formulación a sujeto (p. ej., en donde el sujeto es un animal, p. ej., en donde el sujeto es un humano).
11. El método de obtención de imágenes de la reivindicación 8, en donde la administración comprende aplicar tópicamente la formulación a un tronco nervioso periférico adyacente a o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica; y/o que comprende aplicar tópicamente la formulación a un tronco nervioso periférico (p. ej., adyacente o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica), permitiendo que la composición de la formulación se difunda desde el tronco nervioso a ramas más pequeñas del tejido nervioso, y detectando la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen de las ramas más pequeñas del tejido nervioso.
12. El método de formación de imágenes de la reivindicación 8, en donde la formulación se administra por vía intravenosa (por IV); o en donde la formulación se administra localmente; o en donde la imagen es un video y/o imagen fija y/o video en tiempo real.
13. Un método de formación de imágenes que comprende:
exponer el tejido de un sujeto a la luz de excitación, una formulación que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que se ha administrado al sujeto; y
detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición.
14. El método de la reivindicación 13,
en donde la etapa de detección comprende detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen y mostrar la imagen; y/o
que comprende además la etapa de administrar la composición al sujeto; y/o
en donde la luz emitida por el tejido nervioso es más intensa que la luz emitida por el tejido circundante (p. ej., la relación de señal nervio/músculo es al menos 2) de modo que el tejido nervioso se distingue visualmente del tejido circundante; y/o
en donde la luz emitida por el tejido nervioso es detectable al menos 15 minutos después de la administración de la formulación al sujeto (p. ej., en donde el sujeto es un animal, p. ej., en donde el sujeto es un humano); y/o en donde la luz emitida desde el tejido nervioso es detectable al menos durante 1 hora (p. ej., al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas o al menos 4 horas) después de la administración de la formulación al sujeto (p. ej., en donde el sujeto es un animal, p. ej., en donde el sujeto es un humano); y/o
la formulación ha sido administrada por aplicación tópica a un tronco nervioso periférico adyacente a o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica; y/o
la formulación ha sido administrada por aplicación tópica a un tronco nervioso periférico (p. ej., adyacente o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica) de modo que la composición de la formulación se haya difundido desde el tronco nervioso a ramas más pequeñas del tejido nervioso, en donde el método comprende detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen de las ramas más pequeñas del tejido nervioso; y/o
la formulación ha sido administrada por aplicación tópica a un tronco nervioso periférico (p. ej., adyacente o cerca de un ganglio linfático metastásico o tumor primario después de la exposición quirúrgica) de modo que la composición de la formulación se haya difundido desde el tronco nervioso a ramas más pequeñas del tejido nervioso, en donde el método comprende detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen de las ramas más pequeñas del tejido nervioso y en donde (A) la formulación se administra por vía intravenosa (por I.V.) o (B) la formulación se administra localmente; y/o
en donde la etapa de detección comprende detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen y mostrar la imagen, en donde la imagen es un video y/o una imagen fija y/o un video en tiempo real.
15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, comprendiendo la composición además un radiomarcador.
16. Una formulación que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en un método de formación de imágenes que comprende:
administrar a un sujeto la formulación y permitir que la composición se una selectivamente al tejido nervioso del sujeto;
exponer el tejido del sujeto a la luz de excitación; y detectar la luz emitida por el agente fluorescente de la composición para crear una imagen y mostrar la imagen; en donde:
(i) la exposición del tejido del sujeto a la luz de excitación ocurre durante un procedimiento quirúrgico, o
(ii) la imagen se muestra a un cirujano durante un procedimiento quirúrgico realizado sobre el sujeto.
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