JP2018506512A - 神経結合選択性が増強された環状ペプチド、当該環状ペプチドと結合したナノ粒子、およびリアルタイムｉｎ ｖｉｖｏ神経組織撮像ための当該環状ペプチドの使用 - Google Patents
神経結合選択性が増強された環状ペプチド、当該環状ペプチドと結合したナノ粒子、およびリアルタイムｉｎ ｖｉｖｏ神経組織撮像ための当該環状ペプチドの使用 Download PDFInfo
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Abstract
本明細書では、環状ペプチド、環状ペプチドと結合したナノ粒子、ならびに手術中の神経組織の撮像のために、前記環状ペプチドおよび／または前記環状ペプチドと結合したナノ粒子を使用する方法が記載される。一態様において、本発明は、環状ペプチド；ナノ粒子；蛍光剤；およびリンカー部分を含む神経結合ペプチドコンジュゲートを対象とする。別の態様で、本発明は、線状ポリペプチド；ナノ粒子；蛍光剤；およびリンカー部分を含む神経結合ペプチドコンジュゲートを対象とする。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月１５日に出願された米国仮出願第６２／０９２，１９１号の利益を請求し、その本文は、その全体が本明細書により参照によって本明細書に組み込まれる。
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＩＨ ＮＣＩ Ｕ５４ ＣＡ１９９０８１−０１の下、政府支援によりなされた。
本出願は、２０１４年１２月１５日に出願された米国仮出願第６２／０９２，１９１号の利益を請求し、その本文は、その全体が本明細書により参照によって本明細書に組み込まれる。
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＩＨ ＮＣＩ Ｕ５４ ＣＡ１９９０８１−０１の下、政府支援によりなされた。
本発明の分野
本発明は、環状ペプチド、環状ペプチドと結合したナノ粒子、ならびに手術中に神経組織を撮像するために前記環状ペプチドおよび／または前記環状ペプチドと結合したナノ粒子を使用する方法に一般的に関する。
本発明は、環状ペプチド、環状ペプチドと結合したナノ粒子、ならびに手術中に神経組織を撮像するために前記環状ペプチドおよび／または前記環状ペプチドと結合したナノ粒子を使用する方法に一般的に関する。
多くの外科手順は、慢性疼痛または麻痺などの重大な問題を生じ得る不測の神経損傷または神経離断のリスクを伴う。手術中に近赤外（ＮＩＲ）試薬を使用して神経組織を目立たせて、それにより目立たされた神経組織を切断したり損傷したりすることを回避する外科医の能力を強化することが研究されてきた。例えば、ジスチリルベンゼンおよびオキサジン誘導体などの分子が使用されてきたが、それらは、必要な結合特性および／またはヒトおよび他の哺乳動物で手術中に使用するために効果的であることが必要とされる分光学的性質を欠いている。
Whitneyらは、切除されたマウスの末梢神経に対してファージディスプレイの方法を適用することにより、数種類の神経結合ポリペプチドを同定した（Whitney, M. A.; Crisp, J. L.; Nguyen, L. T.; Friedman, B.; Gross, L. A.; Steinbach, P.; Tsien, R. Y.; Nguyen, Q. T. Nat. Biotech.２０１１年、２９巻、３５２頁）。配列は、その後、蛍光団またはＮＩＲ染料で標識されて、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで結合について調べられた。バックグラウンドに対して最高のコントラストを提供した配列は、１７残基のポリペプチド、ＮＰ４１であった（図１Ａ）。神経組織に対しておよび手術中に使用するための改善された分光学的性質に対して選択性の増強された神経結合剤が必要である。
Whitney, M. A.; Crisp, J. L.; Nguyen, L. T.; Friedman, B.; Gross, L. A.; Steinbach, P.; Tsien, R. Y.; Nguyen, Q. T. Nat. Biotech.２０１１年、２９巻、３５２頁
本明細書に記載されるのは、環状ペプチド、環状ペプチドと結合したナノ粒子、ならびに手術中に神経組織を撮像するために前記環状ペプチドおよび／または前記環状ペプチドと結合したナノ粒子を使用する方法である。
一態様において、本発明は、環状ペプチド；ナノ粒子；蛍光剤；およびリンカー部分を含む神経結合ペプチドコンジュゲートを対象とする。別の態様で、本発明は、線状ポリペプチド；ナノ粒子；蛍光剤；およびリンカー部分を含む神経結合ペプチドコンジュゲートを対象とする。
ある特定の実施形態では（いずれかの態様の）、ナノ粒子は、シリカベースのコア；コア内の蛍光剤；コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル；ナノ粒子に付着したリンカー部分；および任意選択で、ポリマーでコートされたナノ粒子に付着した１から２０個のペプチドリガンドを含む。
ある特定の実施形態では（いずれかの態様の）、ナノ粒子は微小粒子である（例えば、平均直径が１００ｎｍ未満、例えば、５０ｎｍ未満、例えば、３０ｎｍ未満、例えば、２０ｎｍ未満、例えば、１０ｎｍ未満である）（例えば、微小ナノ粒子はＣドットまたはＣ’のドットである）。
ある特定の実施形態では（いずれかの態様の）、リンカー部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ２、およびパラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ）からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む（例えば、リンカー部分は２から５０個の原子を有する）。ある特定の実施形態では、リンカー部分は、その内容が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる２０１５年５月２７日出願の米国特許出願公開第２０１５／０３４３０９１号として公開された米国特許出願第１４／７２２，３０７号に記載されている１つまたは複数のリンカー部分を含む。
ある特定の実施形態では、環状ペプチドは、リンカー部分を介してナノ粒子に結合している。ある特定の実施形態では（いずれかの態様の）、蛍光剤は、シアニン染料、例えば、Ｃｙ５またはＣｙ５．５を含む。ある特定の実施形態では（いずれかの態様の）、神経結合ペプチドコンジュゲートは、５から２０個のアミノ酸残基および／または１５個の原子から６０個の原子の大員環を有する。ある特定の実施形態では（いずれかの態様の）、神経結合ペプチドコンジュゲートは、１７個のアミノ酸残基および／または５１個の原子の大員環を有する。
ある特定の実施形態では、環状ペプチドは、ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む。ある特定の実施形態では、大員環は、ペプチドを頭尾結合で環化させるか、または配列の内部に共有結合を導入することにより形成される。ある特定の実施形態では、環状ペプチドは、ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む。
別の態様で、本発明は、ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む環状ペプチドを対象とする。
別の態様で、本発明は、ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む環状ペプチドを対象とする。
別の態様で、本発明は、蛍光剤；およびペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む環状ペプチドを含む環状ペプチド組成物を対象とする。
別の態様で、本発明は、蛍光剤；およびＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む環状ペプチドを含む環状ペプチド組成物を対象とする。
ある特定の実施形態で、環状ペプチドは大員環を含む。ある特定の実施形態では、大員環は、ペプチドを頭尾結合で環化させることにより、または配列の内部に共有結合を導入することにより形成される。
別の態様で、本発明は、図１Ｂまたは図４Ａ〜４Ｈに示された構造を有する環状ペプチドを含む環状ペプチド組成物を対象とする。ある特定の実施形態では、環状ペプチドは、ナノ粒子に付着している。ある特定の実施形態では、環状ペプチドは、リンカー部分を介してナノ粒子に共有結合または非共有結合で付着している。ある特定の実施形態では、環状ペプチドは機能化されている。
上の態様のいずれかのある特定の実施形態では、組成物は、追加的に放射性標識を含む。
別の態様で、本発明は、上の態様のいずれか１つの組成物を含む製剤を対象に投与し、組成物を対象の神経組織に選択的に結合させること；対象の組織を励起光に曝露すること；および組成物の蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、画像を表示することを含む撮像方法を対象とする。
ある特定の実施形態では、神経組織から放射される光は、周囲の組織から放射される光より強く（例えば、神経対筋肉のシグナル比が少なくとも２である）、その結果、神経組織が周囲の組織から視覚的に識別可能である。ある特定の実施形態では、神経組織から放射される光は、製剤を対象（例えば対象は動物であり、例えば対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１５分という早さで検出可能である。ある特定の実施形態では、神経組織から放射される光は、製剤を対象（例えば対象は動物であり、例えば対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間）の間は検出可能である。
ある特定の実施形態では、投与することは、製剤を、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある末梢神経幹に局所的に適用することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、製剤を、末梢神経幹（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）に局所的に適用すること、製剤の組成物が神経幹から神経組織のさらに小さい枝に拡散することを可能にすること、および組成物の蛍光剤により放射される光を検出して神経組織のさらに小さい枝の画像を創り出すことを含む。
ある特定の実施形態では、製剤は、静脈内に（Ｉ．Ｖ．により）投与される。ある特定の実施形態では、製剤は局所的に投与される。ある特定の実施形態では、対象の組織を励起光に曝露することは、外科手順中に行われる。ある特定の実施形態では、画像は、ビデオおよび／または静止画像および／またはリアルタイムのビデオである。ある特定の実施形態では、画像は、対象に実施される外科手順中に、外科医に対して表示される。
別の態様で、本発明は、対象の組織を励起光に曝露することであって、対象に上の態様のいずれか１つの組成物を含む製剤が投与されていること；および組成物の蛍光剤により放射される光を検出することを含む撮像方法を対象とする。
ある特定の実施形態では、検出ステップは、組成物の蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、画像を表示することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、組成物を対象に投与するステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、神経組織から放射される光は、周囲の組織から放射される光より強く（例えば、神経対筋肉のシグナル比は少なくとも２である）、その結果、神経組織は周囲の組織から視覚的に識別可能である。ある特定の実施形態では、神経組織から放射される光は、製剤を対象に（例えば対象は動物であり、例えば対象はヒトである）投与した後、少なくとも１５分という早さで検出可能である。ある特定の実施形態では、神経組織から放射される光は、製剤を対象に（例えば対象は動物であり、例えば対象はヒトである）投与した後、少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間）の間は検出可能である。ある特定の実施形態では、製剤は、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍ある末梢神経幹に局所適用により投与されている。ある特定の実施形態では、製剤は、末梢神経幹（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍ある）に局所適用により投与されて、その結果、製剤の組成物は神経幹から神経組織のさらに小さい枝に拡散され、ここで、方法は、組成物の蛍光剤により放射される光を検出して神経組織のさらに小さい枝の画像を創ることを含む。ある特定の実施形態では、製剤は、静脈内に（Ｉ．Ｖ．により）投与される。ある特定の実施形態では、製剤は局所的に投与される。
ある特定の実施形態では、対象の組織を励起光に曝露することは、外科手順中に行われる。ある特定の実施形態では、検出ステップは、組成物の蛍光剤により放射される光を検出して画像を創って、画像を表示することを含み、ここで、画像は、ビデオおよび／または静止画像および／またはリアルタイムのビデオである。ある特定の実施形態では、画像は、対象に実施される外科手順中に外科医に対して表示される。
定義
定義
本開示がより容易に理解されるために、ある用語を最初に下で定義する。以下の用語および他の用語のための追加の定義は、本明細書を通して説明する。
本願では、「または」の使用は、特に断らない限り「および／または」を意味する。本願で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および該用語の変化形「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などは、他の添加物、成分、整数またはステップを排除することを意味しない。本願で使用される用語「約」および「およそ」は、等価として使用される。本願で約／およそを伴ってまたは伴わずに使用される任意の数は、関連分野における当業者により認識される任意の通常の変動を含むことが意味される。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特に断らない限りまたは前後関係からそうでないことが明らかでない限り、提示された値のどちらの方向にでも２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満以内に入る（超または未満）範囲の値を意味する（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）。
「投与」：用語「投与」は、物質または製剤を対象中に導入することを指す。例えば、非経口的（例えば、静脈内）、経口、局所、皮下、腹腔内、動脈内、吸入、膣内、直腸、鼻内、脳脊髄液中への導入、または身体区画中への点滴を含む任意の投与の経路が一般的に利用され得る。一部の実施形態では、投与は経口である。それに加えてまたはあるいは、一部の実施形態では、投与は非経口的である。一部の実施形態では、投与は静脈内である。ある特定の実施形態では、物質または製剤は、ＩＶ投与に対して局所注射により投与される。例えば、ペプチドを含有する組成物（例えば、粒子を含有するおよび粒子を含有しない組成物の両方）を含む物質または製剤を、撮像目的のために十分に高い濃度で局所的に注射することができる。ある特定の実施形態では、非粒子ペプチドを含有する組成物がＩＶによって投与される。
「生体適合性」：本明細書において使用する用語「生体適合性」は、実質的に有害な応答をｉｎ ｖｉｖｏで惹起しない材料を記述することを意図される。ある特定の実施形態では、材料は、それらが細胞に毒性でなければ「生体適合性」である。ある特定の実施形態では、材料は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞への添加が２０％未満もしくはそれと等しい細胞死を生じさせ、および／またはそれらのｉｎ ｖｉｖｏにおける投与が炎症または他のそのような有害な効果を誘発しなければ「生体適合性」である。ある特定の実施形態では、材料は生分解性である。
「生分解性」：本明細書において使用する「生分解性」材料は、細胞中に導入されたときに、細胞の仕組みにより（例えば、酵素的分解）または加水分解により細胞が再使用できるかもしくは細胞に対して顕著な毒性の効果なく処分できるいずれかの成分に分解される。ある特定の実施形態では、生分解性材料の分解により生じた成分は、ｉｎ ｖｉｖｏで炎症および／または他の有害な効果を誘発しない。一部の実施形態では、生分解性材料は、酵素的に分解される。あるいはまたはそれに加えて、一部の実施形態では、生分解性材料は、加水分解により分解される。一部の実施形態では、生分解性ポリマー材料はそれらの成分ポリマーに分解される。一部の実施形態では、生分解性材料（例えば、生分解性ポリマー材料を含む）の分解は、エステル結合の加水分解を含む。一部の実施形態では、材料（例えば、生分解性ポリマー材料を含む）の分解は、ウレタン結合の開裂を含む。
「担体」：本明細書において使用する「担体」は、化合物を投与するのに用いる希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、水、および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油（例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等）などの滅菌液体であることがきる。水または生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液が、担体として、特に注射用溶液のための担体として好ましく使用される。適当な薬学的担体は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
「検出器」：本明細書において使用する「検出器」は、ＣＣＤカメラ、光電子倍増管、フォトダイオード、およびアバランシェフォトダイオードを含むが、これらに限定されない電磁放射線の任意の検出器を指す。
「画像」：本明細書において使用する用語「画像」は、視覚的表示または視覚的表示のために翻訳処理することができる任意のデータ表現を意味すると理解される。例えば、３次元画像は、３次元空間で変化する与えられた量の値のデータセットを含むことができる。３次元画像（例えば、３次元データ表現）は、２次元で表示することもできる（例えば、２次元のスクリーンで、または２次元のプリントアウトで）。用語「画像」は、例えば、光学的画像、Ｘ線画像、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、磁性共鳴（ＭＲ）、単一光子放射形コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、および／または超音波、ならびにこれらの任意の組合せにより生じた画像を指すこともある。
「ペプチド」または「ポリペプチド」：用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されて一緒になった少なくとも２個（例えば、少なくとも３個）のアミノ酸のストリングを指す。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸を含み；あるいはまたはそれに加えて、一部の実施形態では、ポリペプチドは１個または複数の非天然アミノ酸を含み（すなわち、天然には生じないがポリペプチド鎖中に組み込まれ得る化合物；例えば、機能的イオンチャンネル中に首尾よく組み込まれた非天然アミノ酸の構造を示すhttp://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gifを参照されたい）、および／または別法では当技術分野において公知のアミノ酸類似体が使用され得る。一部の実施形態では、例えば、炭水化物基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲート化、機能化、または他の改変のためのリンカーその他などの化学的存在物の添加により、タンパク質中の１個または複数のアミノ酸が改変されていることもある。
「放射性標識」：本明細書において使用する「放射性標識」は、少なくとも１種の元素の放射性同位体を含む部分を指す。典型的な適当な放射性標識は、本明細書で記載されたものを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、放射性標識は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）で使用されるものである。一部の実施形態では、放射性標識は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）で使用されるものである。一部の実施形態では、放射性同位体は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ，１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１４９Ｐｍ、９０Ｙ、２１３Ｂｉ、１０３Ｐｄ、１０９Ｐｄ、１５９Ｇｄ、１４０Ｌａ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、６７Ｃｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、８９Ｚｒ、２２５Ａｃ、および１９２Ｉｒを含む。
「対象」：本明細書において使用する用語「対象」は、ヒトおよび哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、およびウマ）を含む。多くの実施形態で、対象は、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトである。一部の実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタなどの家畜；ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥などの家禽；および飼いならされた動物、特にイヌおよびネコなどのペットである。一部の実施形態では、（例えば、特に研究の関係で）対象哺乳動物は、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、または同系交配のブタなどのブタであろう。
「実質的に」：本明細書において使用する用語「実質的に」は、目的の特性または性質の全体のまたはほぼ全体の広がりまたは程度を示す定性的状態を指す。生物学的分野における当業者は、生物学的および化学的現象が、完了に至るおよび／もしくは完璧に進行するかまたは絶対的結果を達成するかもしくは回避することが、あるとしても稀であることを理解するであろう。用語「実質的に」は、それ故、本明細書では多くの生物学的および化学的現象に固有の完璧を欠く可能性を表現するために使用される。
「治療剤」：本明細書において使用する語句「治療剤」は、対象に投与されたときに、治療効果を有するならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を惹起する任意の作用剤を指す。
「処置」：本明細書において使用する用語「処置」は（「処置する」または「処置すること」も）、特定の疾患、障害および／または状態の１つまたは複数の症状、特徴および／または原因を部分的にまたは完全に軽減し、緩和し、和らげ、阻害し、発症を遅延させ、重症度を低下させ、および／または発病率を減少させる物質の任意の投与を指す。そのような処置は、関連する疾患、障害および／もしくは状態の徴候を示さない対象ならびに／または疾患、障害、および／または状態の初期にすぎない徴候を示す対象についてであってもよい。あるいはまたはそれに加えて、そのような処置は、関連する疾患、障害および／または状態の１つまたは複数の確立された徴候を示す対象についてであってもよい。一部の実施形態では、処置は、関連する疾患、障害、および／または状態に罹っていると診断された対象についてであってもよい。一部の実施形態では、処置は、関連する疾患、障害、および／または状態の発生の増大したリスクと統計的に相関する１つまたは複数の罹病性要因を有することが知られた対象についてであってもよい。
本明細書で提示する図面は例示目的であって、限定するためではない。
前述のおよび他の目的、態様、特徴、および本開示の利点は、添付図面を用いて伝えられる以下の記載を参照することによりさらに明確になり、より良く理解されるであろう。
図１Ａは、Ｃｙ５が付いた線状神経結合ペプチドを示す（Ａｃ＝Ｎ末端におけるアセチル基）。
図１ＢはＣｙ５が付いた神経結合環状ペプチドを示す。
図１Ｃは、線状ペプチドの液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）を示す。
図１Ｄは、環状ペプチドのＬＣＭＳを示す。ＬＣＭＳについて、試料をＷａｔｅｒｓ、４．６×５０ｍｍのＣ１８カラム、水中５〜９５％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）で１０分流した。生成物を確認する質量分析法データは黒い囲みの中である。
本明細書の記載の全体にわたって、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、または方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合には、追加的に挙げられた成分から本質的になる、もしくはからなる本発明の組成物があること、および挙げられた処理ステップから本質的になる、もしくは、からなる本発明による方法があることが企図される。
ステップの順序またはある行為を実施する順序は、本発明が実施可能である限り重要ではないことが理解されるべきである。その上、２つまたはそれ超のステップまたは行為を同時に実施することもできる。
本明細書における、例えば、背景技術の項目中の任意の刊行物への言及は、該刊行物が、本願で提供する請求項のいずれに関しても先行技術として役立つことを認めるものではない。背景技術の項目は、明確にする目的で提供されて、いかなる請求項に関しても先行技術の記載としての意味は持たない。
本明細書に記載された実験において、線状ポリペプチドは、環化されてより剛直な構造となり、結合親和性および選択性が増強された。提供された検討について、溶媒としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびカップリング剤として（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）を使用して、最適化された条件および高い生成物収率が達成された。
最初に、線状ポリペプチドＮＰ４１を合成して、試験のためにＮＩＲ染料Ｃｙ５で標識した。図１Ａに示した構造を、図１Ｃに示したように、ＬＣＭＳにより確認した。図１ＡのＮＰ４１構造の環状類似体も合成した。図１Ｂに示した環状ペプチドの構造も、図１Ｄに示したように、ＬＣＭＳにより確認した。対照として、ランダムポリペプチド（Ａｃ−ＳＨＳＳＴＡＲＤＬＷＰＨＧＫＥＧＣ）をＣｙ５で標識して評価した。図２に示したように、坐骨神経検体について、環状化合物は、スクランブルされたポリペプチドおよび線状ポリペプチドと比較して有意に増大した蛍光強度（２〜３倍）を示した。環状化合物は、線状のおよびスクランブルされた両方のポリペプチドと比較して増大した神経組織選択性（筋肉組織に対して）も示した。
図４Ａ〜４Ｈは、本明細書に記載した神経結合の実験についての異なったペプチド−染料コンジュゲートコンホメーション（例えば、線状、環化された、スクランブルされた）の合成および特徴付けを示す。例えば、固相ペプチド合成機により合成された１７アミノ酸（ＡＡ）配列のペプチド、トランケートされた配列のペプチド（１０−ＡＡ、１４−ＡＡ）およびスクランブルされた配列のペプチドの線状および環化されたコンホメーション。ペプチドは、液相中において、システイン残基でＣｙ５−マレイミドにより標識した。最終の生成物を、分取ＨＰＬＣを使用して９５％を超える収率で精製した。最終の生成物の純度および質量を、各表に示すように分析ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより特徴付けて、確認した。最終の神経結合ペプチド生成物を、その後、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏにおける検討のために、Ｃ’ドットに付着させて多価プラットホームを創った。
量子増倍（quantum enhancement）および蛍光相関分光法（ＦＣＳ）の輝度を改善するために、環状化合物をナノ粒子上／中に結合させる（または別法で組み込む）ことができる、例えば、Phillips （Phillips E、 Penate-Medina O、 Zanzonico PB、 Carvajal RD、 Mohan P、Ye Y、 Humm J、 Goenen M、 Kaliagian H、 Schoeder H、 Strauss W、 Larson SM、Wiesner U、 Bradbury MS. Clinical Translation of an Ultrasmall Optical Hybrid Nanoparticle Probe. Science Translational Medicine.２０１４年；６巻（２６０号））により記載されたＣドットおよび／またはＣ’ドット、より新しい世代のＰＥＴ放射性標識（１２４Ｉ）であるＣｙ５．５を組み込んだｃＲＧＤＹで機能化されたＣ’ドットがＦＤＡ−ＩＮＤの承認を受けた。蛍光性シリカ前駆体は、反応性染料種と有機シリケート供給源とのカップリングにより開発された。次にこのハイブリッド前駆体を加水分解し、純粋シリカと縮合させて、ハイブリッド有機／無機コアを得る。これらのコアは、純粋シリカシェルの成長のための不均一な核として作用し、さらにカプセル化された染料を保護する（Burns, A.、 OW, H.、 Wiesner, U. Fluorescent core-shell silica nanoparticles: towards 「Lab on a Particle」 architectures for nanobiotechnology. Chem Soc Rev. ２００６年、３５巻（１１号）：１０２８〜４２頁）（図３）。蛍光性コアを含むコア−シェルナノ粒子は、米国特許第８，２９８，６７７号および第８，４０９，８７６号にも記載されており、それらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるBradburyら、Integr. Biol.（２０１３年）５巻：７４〜８６頁に記載された特徴を使用することができる。ある特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるHerzら、J. Mater. Chem.（２００９年）１９巻、６３４１〜６３４７頁に記載された特徴（例えば、プローブ種）を使用することができる。
ある特定の実施形態では、両者共に全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bradburyら、ＷＯ２０１１／００３１０９として２０１１年１月６日に公開された国際ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０９９４、およびＷＯ２０１４／１４５６０６として２０１４年９月１８日に公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３０４０１に記載された特徴（例えば、ナノ粒子）を使用することができる。
ある特定の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１２年１０月３０日に公開されたWiesnerら、米国特許第８２９８６７７号に記載された特徴（例えば、ナノ粒子）を使用することができる。
図３は、本発明の例示の実施形態によるＮＢＰ−ＰＥＧ−Ｃｙ５．５−Ｃ’ドットの模式図を示す。ＮＢＰは、この下でさらに詳細に説明する特定の神経結合環状ペプチドである。Ｃｙ５．５染料は、環状ＮＢＰ構造に付随するものとして示し、Ｃｙ５．５もシリカコア中にドープされたものとして示す。ある特定の実施形態では、染料は、環状ペプチドに付着しており、ナノ粒子に付着しても含有されても結合しても、または他の方法でも直接会合していない。ある特定の実施形態では、染料は、環状ペプチドに付着しておらず、ナノ粒子に付着しているか、含有されているか、結合しているか、および／または他の方法で直接会合している。
バックグラウンドを超えるシグナルの増大を示すために、線状ポリペプチドＮＰ４１をＣ’ドットにＰＥＧコンジュゲーションを介して結合させ、量子増倍およびＦＣＳ輝度において生じた改善を測定した（表１）。同様に、環状ペプチド（複数可）を、結合していない環状ペプチドに優る改善された量子増倍およびＦＣＳ輝度のためにナノ粒子に結合させることができる。
表１は、線状ＮＢＰ−Ｃ’ドットの特徴付けのデータを示す。測定は蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により決定した。
ファージディスプレイ手法は、ヒト死体の神経組織検体に特異的な新規ヒト神経結合ペプチド配列（例えば、神経選択的マーカー）を同定するために使用することができる。切除されたマウスの神経組織に首尾よく適用される強力な遺伝学的手段であるファージディスプレイは、ヒトの顔面および喉頭部の神経検体に使用して、これらの神経組織に選択性のある新規ＮＢＰ配列を同定することができる。神経組織に対する有利な総合的結合親和性および選択性を示すペプチド配列を、Ｃドットへの付着後に多重化適用のために使用することができる。
ある特定の実施形態では、ファージディスプレイは、１０９の独立のクローンまたは配列（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）の複雑度を有するランダムな１２残基のペプチドのコンビナトリアルライブラリーを利用する。ｍ１３ファージベクターは、ｐＩＩＩコートタンパク質と融合したランダムペプチドの５価ディスプレイを提供する。ファージは、陽性および陰性選択の複数回の繰り返しを経る。準備された顔面の（または喉頭部の）神経組織に結合するファージは、単離、配列決定、および増幅を通して陽性で選択される。次に、ファージは陰性選択ステップを経て坐骨組織とインキュベートされ、結合しないファージが選択される。この選択サイクルを、明確に識別される配列が繰り返し観察されるまで続けることができる。
本明細書で記載するように、実験は、配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴ、または、より特異的にＡｃ−ＳＨＳＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴＧＣを含む線状ポリペプチドＮＰ４１、および環状形態のポリペプチド（図１Ｂに示した）を用いて実施した。各ポリペプチドは、蛍光性染料で機能化した。ある特定の実施形態では、他の検出可能なマーカーを使用することができて、他のペプチド配列を使用することもできる。ＮＰ４１のコア配列はＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴである。実験で使用したＮＰ４１ポリペプチドは、Ｎ末端に付着したアセチル−ＳＨＳ基およびＣ末端に付着した−ＧＣ基を含むが、他の実施形態では、他の末端基を使用することができる（または末端基なしで）。示した例では、−ＳＨＳ基はファージコートタンパク質から含まれ、−ＧＣは染料のために含まれる。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まず、ポリペプチドの線状形態を化学的に束縛すると、結合が強化されるように思われる。神経組織選択性を有する他のポリペプチドも、そのまま、ナノ粒子に結合して、環化されて、および／または環化されてかつナノ粒子に結合して使用することができるが、例えば、後者は適当なリンカー化学（例えば、ＰＥＧ）を使用することによる。例えば、環化されて、および／またはナノ粒子に結合して使用することができる他のポリペプチドは、Whitneyらにおける線状ポリペプチド、例えば、配列ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ；ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴ；ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ；および／またはＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨを含むポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、他のポリペプチドが使用される。例えば、本明細書で開示された任意の配列は、付加されても、改変されても、または長さが減少されてもよい。本明細書に記載された実験は、アミド化学を使用して頭尾結合で環状ペプチドを形成するが、共有結合性の束縛（例えば、頭尾結合とは対照的な）が内部に導入されることもあり、および／または他の化学も機能する（例えば、クリック（click）、ジスルフィド、メタセシス、その他）。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、５から２０個のアミノ酸残基および／または１５原子から６０原子の大員環を有する（例えば、環を形成する原子の数が、例えば、１５から６０個の員環）。
一般的に、本明細書に記載された実施形態の実施で使用されるナノ粒子は、シリカベースのナノ粒子、例えば、ＣドットまたはＣ’ドットであり、それらは、検出可能な作用剤（例えば、有機染料、放射性標識）およびペプチドを標的とするリガンド（複数可）と融合され、それらでコートされ、または他の方法で結合もしくは会合されている。ある特定の実施形態では、シリカベースのナノ粒子、例えばＣドットまたはＣ’ドットは、ペプチドによる機能化の前に１０ｎｍ未満またはそれと等しい平均サイズ（例えば、直径）を有することができる。ある特定の実施形態では、シリカベースのナノ粒子、例えばＣドットまたはＣ’ドットは、ペプチドによる機能化の前に１０ｎｍ超の平均サイズを有することができる。ある特定の実施形態では、平均粒径、粒子サイズ分布、および／または輝度は、特定の適用のために変更される。ある特定の実施形態では、ポリマーベースのナノ粒子が使用される。ある特定の実施形態では、ポリペプチド−検出可能な作用剤−ナノ粒子材料（線状または環状ペプチドおよびそれらに付着した検出可能な作用剤または他の方法でそれらに会合したナノ粒子）は、無毒性であり、腎臓を通して効率的に除かれる。ある特定の実施形態では、染料は、ペプチドに結合している（ナノ粒子に直接結合するよりむしろ）。ある特定の実施形態では、染料は、ペプチドよりむしろナノ粒子に結合しているか、その中に組み込まれるかまたは他の方法で会合している。ある特定の実施形態では、染料はナノ粒子に会合しており、染料はペプチドに結合している。
ある特定の実施形態では、シリカベースのナノ粒子は、表面が、複数の異なったポリペプチドで機能化されていてもよい。ある特定の実施形態では、複数のポリペプチドが、読み出しが明瞭で検出可能な複数の検出剤と融合し、それらで被覆され、または他の方法でそれらと結合し、または会合していることもある。ある特定の実施形態では、シリカベースのナノ粒子は、手術中に使用するために、同時にまたは異なった時に使用されて、標的とされたリガンドの多重化される光学的検出を実施することができる。例えば、ある特定の実施形態では、手術中に使用するために、標的化リガンドで機能化された特有の表面を各々含有する２種またはそれ超の分光学的に別個のシリカベースのナノ粒子を、多価の構造を創るために使用することができる。ある特定の実施形態では、標的化リガンドで機能化された特有の表面を各々含有する分光学的に別個のシリカベースのナノ粒子は、別個の検出方式により測定可能なシグネチャーを放射して、多様な読み出し機能性を創り出すことができる。
本明細書に記載したシステムおよび方法を、蛍光性のシリカベースのナノ粒子を使用するｉｎ ｖｉｖｏ撮像システムおよび方法と関係して、参照により組み込まれる２０１３年２月１４日にＵＳ２０１３／００３９８４８として公開された米国特許出願第１３／３８１，２０９号に記載されたシステムおよび方法で使用することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのプローブ種が、ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、シリカ構造および染料に富むコアを有する。一部の実施形態では、染料に富むコアは、蛍光性レポーターを含む。一部の実施形態では、蛍光性レポーターは、近赤外または遠赤外染料である。一部の実施形態では、蛍光性レポーターは、フルオロフォア、蛍光色素、染料、顔料、蛍光性遷移金属、および蛍光性タンパク質からなる群から選択される。一部の実施形態では、蛍光性レポーターは、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ２、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ７、ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、テキサスレッド、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＪＡ１３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＤＡＰＩ、ＴＭＲ、Ｒ６Ｇ、ＧＦＰ、増強されたＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＣｙＰｅｔ、ＡＭＣＡ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ａｑｕａ、リサミンおよびユウロピウムからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、蛍光剤（複数可）は、赤色および近赤外スペクトルの範囲内に励起波長および発光波長を有する。ある特定の実施形態では、蛍光剤（複数可）は、４００から１３００ｎｍ、または４４０から１１００ｎｍ、または５５０から８００ｎｍ、または６００から９００ｎｍの範囲に励起波長および発光波長を有する。電磁スペクトルのこの部分の使用は、組織浸透を最大にして、ヘモグロビン（＜６５０ｎｍ）および水（＞１２００ｎｍ）などの生理学的に豊富な吸収体による吸収を最小にする。可視および紫外線スペクトルなどの他のスペクトルに励起波長および発光波長を有するプローブ種も、ある特定の実施形態で使用することができる。特に、ある種のカルボシアニンまたはポリメチン蛍光性色素または染料などのフルオロフォアは、蛍光剤として使用することができて、例えば、Caputoら、米国特許第６，７４７，１５９号（２００４年）；Caputoら、米国特許第６，４４８，００８号（２００２年）；Della Cianaら、米国特許第６，１３６，６１２号（２０００年）；Southwickら、米国特許第４，９８１，９７７号（１９９１年）；Waggonerら、５，２６８，４８６（１９９３年）；Waggoner、米国特許第５，５６９，５８７号（１９９６年）；Waggonerら、５，５６９，７６６（１９９６年）；Waggonerら、米国特許第５，４８６，６１６号（１９９６年）；Waggoner、米国特許第５，６２７，０２７号（１９９７年）；Brushら、米国特許第５，８０８，０４４号（１９９８年）；Reddingtonら、米国特許第５，８７７，３１０号（１９９９年）；Shenら、米国特許第６，００２，００３号（１９９９年）；Leungら、米国特許第６，００４，５３６号（１９９９年）；Waggonerら、米国特許第６，００８，３７３号（１９９９年）；Mindenら、米国特許第６，０４３，０２５号（２０００年）；Mindenら、米国特許第６，１２７，１３４号（２０００年）；Waggonerら、米国特許第６，１３０，０９４号（２０００年）；Waggonerら、米国特許第６，１３３，４４５号（２０００年）；Lichaら、米国特許第７，４４５，７６７号（２００８年）；Lichaら、米国特許第６，５３４，０４１号（２００３年）；Miwaら、米国特許第７，５４７，７２１号（２００９年）；Miwaら、米国特許第７，４８８，４６８号（２００９年）；Kawakamiら、米国特許第７，４７３，４１５号（２００３年）；さらに、ＷＯ９６／１７６２８、ＥＰ０７９６１１１Ｂ１、ＥＰ１１８１９４０Ｂ１、ＥＰ０９８８０６０Ｂ１、ＷＯ９８／４７５３８、ＷＯ００／１６８１０、ＥＰ１１１３８２２Ｂ１、ＷＯ０１／４３７８１、ＥＰ１２３７５８３Ａ１、ＷＯ０３／０７４０９１、ＥＰ１４８０６８３Ｂ１、ＷＯ０６／０７２５８０、ＥＰ１８３３５１３Ａ１、ＥＰ１６７９０８２Ａ１、ＷＯ９７／４０１０４、ＷＯ９９／５１７０２、ＷＯ０１／２１６２４、およびＥＰ１０６５２５０Ａ１；およびTetrahedron Letters ４１巻、９１８５〜８８頁（２０００年）である。
典型的蛍光剤には、例えば、以下のものが含まれる：Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、Ｃｙ７．５およびＣｙ７（ＧＥ（登録商標）Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＶｉｖｏＴａｇ（商標）６８０、ＶｉｖｏＴａｇ（商標）−Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ（商標）−Ｓ７５０（ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ）；Ｄｙ６７７、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２およびＤｙ７８０（Ｄｙｏｍｉｃｓ（登録商標））；ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５４７、および／またはＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６４７（Ｐｉｅｒｃｅ）；ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ（商標）６４７、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ（商標）６８０、およびＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ（商標）７５０（ＡｎａＳｐｅｃ（登録商標））；ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、およびＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ（Ｌｉ−Ｃｏｒ（登録商標））；ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｙｅ Ｓｏｕｒｃｅ）；ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ（商標）６８０、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ（商標）７５０、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ（商標）７７０、およびＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＤｉＲ（Ｃａｌｉｐｅｒ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；およびＫｏｄａｋ（登録商標）Ｘ−ＳＩＧＨＴ（登録商標）６５０、Ｋｏｄａｋ（登録商標）Ｘ−ＳＩＧＨＴ ６９１、Ｋｏｄａｋ（登録商標）Ｘ−ＳＩＧＨＴ ７５１（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）Ｈｅａｌｔｈ）。ある特定の実施形態では、リンカー部分は、末端に２個またはそれ超の官能基（二官能性、三官能性、など）を有する、シリカベースのナノ粒子をペプチドおよび／または検出可能なマーカーに接続するように配置された化学的部分である。本明細書に記載される試験例では、ポリペプチド（例えば、線状または環状ペプチド）をナノ粒子に結合させるリンカー部分としてＰＥＧを使用した。他のリンカー部分も使用することができる。Ｃ’ドット（または他のナノ粒子）とポリペプチドとの間隔は、例えば、異なったサイズのＰＥＧ（または他のリンカー）鎖を使用して変えることができる。ある特定の実施形態では、リンカー部分は、その文言がその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３４３０９１号として公開された２０１５年５月２７日出願の米国特許出願第１４／７２２，３０７号に記載されたリンカー部分の１個または複数を含む。
ある特定の実施形態では、神経結合ペプチドで機能化されたＣドットまたはペプチド−染料コンジュゲートは、異なったコンホメーション（例えば、環状、線状）および長さ（例えば、切り詰められた、延長された）を有し、これらの作用剤の非存在下では可視化が十分ではないＳＬＮマッピング手順中に、有意にコントラストを強化して、小さい遠位神経枝および／または分布を描写し、傷害のリスクを減少させるために、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある、顔面、坐骨、下腹部、喉頭部の神経を含むが、これらに限定されない末梢神経幹に局所的に投与される。
ある特定の実施形態では、これらのペプチドで機能化された粒子プローブまたはペプチド−染料コンジュゲートは、正常な神経、例えば、顔面神経に隣接するそれらの取り込みを容易にするために、原発性腫瘍部位または病気の節（例えば、耳下腺）のあたりに局所的に投与することができる。
ある特定の実施形態では、物質または製剤は、ＩＶ投与に対して局所注射により投与される。例えば、ペプチドを含有する組成物（例えば、粒子を含有するおよび粒子を含有しない組成物の両方共）を含む物質または製剤は、撮像目的のために十分に高い濃度で局所的に注射することができる。ある特定の実施形態では、粒子ペプチドを含有しない組成物はＩＶにより投与される。ある特定の実施形態では、粒子を含有する組成物が、撮像目的のために十分高い濃度では粘稠すぎる場合には、局所注射は、静脈内注射よりも好ましい。
新しい環状ペプチドまたは粒子ベースの生成物は、現在記載されている化合物と比較して改善された光物理的および神経結合性質を提供することができる。
ある特定の実施形態では、神経結合ペプチドで機能化されたＣドットがこれらの経路の１つまたは複数により投与されると、それらの優れた多価の増強、改善された標的部位結合／保持、および光物理的特徴によって、単純な蛍光性染料単独の注射によって達成され得るものに対して、神経構造が高い神経対筋肉コントラストで最大限に可視化されることが可能になる。これらの生成物は、癌性標的（例えば、癌を担持する節）に向けられるペプチドが結合した粒子プローブと一緒に多重化適用のために使用するために適合性であり得る。
ある特定の実施形態では、可視染料（例えば、可視スペクトルにおける染料、例えば、緑色染料、例えば、ＦＩＴＣ）を、局所的にまたはＩＶにより投与することができて、神経を、蛍光性シグナルによって見るために使用することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドが結合した可視染料が、神経組織に優先的に付着して、染料からの光を、外科医は自分の視界で見ることができる。例えば、製剤は、神経自体に局所的にまたは神経の近くに局所的に適用することができて、例えば、製剤は、末梢神経幹（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）に局所的に適用することができて、製剤の組成物が神経幹から神経組織のさらに小さい枝に拡散することを可能にする。光は、組成物の蛍光剤により放射されて、検出されて表示され得るか（例えば、リアルタイムで）、または十分に明るくて、手術手順中に外科医が補助なしで自分の視力で直接観ることができる。神経組織への局所適用（およびそれに続く神経組織を通る拡散）は、血液タンパク質（例えば、ヘモグロビン）からのバックグラウンドシグナルが、製剤の静脈内投与と比較して減少されるので、より大きいコントラストを提供することができる。
ある特定の実施形態では、可視染料（例えば、可視スペクトルにおける染料、例えば、緑色染料、例えば、ＦＩＴＣ）を、局所的にまたはＩＶにより投与することができて、神経を、蛍光性シグナルによって見るために使用することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドが結合した可視染料が、神経組織に優先的に付着して、染料からの光を、外科医は自分の視界で見ることができる。例えば、製剤は、神経自体に局所的にまたは神経の近くに局所的に適用することができて、例えば、製剤は、末梢神経幹（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）に局所的に適用することができて、製剤の組成物が神経幹から神経組織のさらに小さい枝に拡散することを可能にする。光は、組成物の蛍光剤により放射されて、検出されて表示され得るか（例えば、リアルタイムで）、または十分に明るくて、手術手順中に外科医が補助なしで自分の視力で直接観ることができる。神経組織への局所適用（およびそれに続く神経組織を通る拡散）は、血液タンパク質（例えば、ヘモグロビン）からのバックグラウンドシグナルが、製剤の静脈内投与と比較して減少されるので、より大きいコントラストを提供することができる。
線状および環状神経結合ポリペプチド−Ｃｙ５コンジュゲートの合成
線状ＮＰ４１（図１Ａ）およびその環状類似体（図１Ｂ）を、標準的Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＳＳ）プロトコルを使用してクロロトリチル樹脂上で合成した。線状ポリペプチドは、ＴＦＡ：ＴＩＳ：ＥＤＴ：水（８５：５：５：５）のカクテルを用いてペプチド−樹脂を開裂／脱保護し、続いて逆相ＨＰＬＣ精製により得た。環状類似体を調製するために、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を除去して、次に、完全に保護された線状ポリペプチドを、ヘキサフルオロイソプロパノールを使用する緩和な条件下で樹脂から切断した。頭尾結合環状類似体を、Ｎ末端残基とＣ末端残基を溶液中で連結して所望の環状前駆体を提供する分子内カップリング反応により得た。次に、粗材料を全体的に脱保護して逆相ＨＰＬＣにより精製した。この合成手法を使用して、所望の５１員の大環状のペプチド生成物が容易に得られた。このサイズの環状ペプチドは、合成的に難題であることが、注目されるべきである。しかしながら、ここで使用した手法は、優れた純度（例えば、９５％超）および良好な収率（約４０％）で環状生成物を提供した。線状および環状両方のペプチドを、システイン残基の遊離チオールをマレイミド−Ｃｙ５で改変することにより蛍光で標識した。最終生成物を特徴付けして、ＬＣＭＳにより図１Ａから１Ｄに示したように確認した。
線状ポリペプチド−ナノ粒子コンジュゲート（線状ＮＢＰ−Ｃ’ドット）の合成
線状ＮＰ４１（図１Ａ）およびその環状類似体（図１Ｂ）を、標準的Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＳＳ）プロトコルを使用してクロロトリチル樹脂上で合成した。線状ポリペプチドは、ＴＦＡ：ＴＩＳ：ＥＤＴ：水（８５：５：５：５）のカクテルを用いてペプチド−樹脂を開裂／脱保護し、続いて逆相ＨＰＬＣ精製により得た。環状類似体を調製するために、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を除去して、次に、完全に保護された線状ポリペプチドを、ヘキサフルオロイソプロパノールを使用する緩和な条件下で樹脂から切断した。頭尾結合環状類似体を、Ｎ末端残基とＣ末端残基を溶液中で連結して所望の環状前駆体を提供する分子内カップリング反応により得た。次に、粗材料を全体的に脱保護して逆相ＨＰＬＣにより精製した。この合成手法を使用して、所望の５１員の大環状のペプチド生成物が容易に得られた。このサイズの環状ペプチドは、合成的に難題であることが、注目されるべきである。しかしながら、ここで使用した手法は、優れた純度（例えば、９５％超）および良好な収率（約４０％）で環状生成物を提供した。線状および環状両方のペプチドを、システイン残基の遊離チオールをマレイミド−Ｃｙ５で改変することにより蛍光で標識した。最終生成物を特徴付けして、ＬＣＭＳにより図１Ａから１Ｄに示したように確認した。
線状ポリペプチド−ナノ粒子コンジュゲート（線状ＮＢＰ−Ｃ’ドット）の合成
ＰＥＧリンカー部分を使用して、神経結合線状ポリペプチド（ＮＢＰ）ＮＰ４１を、Ｃ’ドット上に組み込んだ。表１に示したように、Ｃｙ５染料の測定された輝度は、ＮＢＰ−Ｃ’ドットが遊離のポリペプチドよりも少なくとも１３０％大きい。
ｅｘ ｖｉｖｏにおけるヒト坐骨神経組織に対する結合
ｅｘ ｖｉｖｏにおけるヒト坐骨神経組織に対する結合
線状および環状ペプチドを、ランダムな対照ポリペプチド（Ａｃ−ＳＨＳＳＴＡＲＤＬＷＰＨＧＫＥＧＣ）と一緒に、Ｃｙ５で標識して、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるヒト神経組織試料に対する結合を評価した。使用した組織試料は、新たに切除された死体の坐骨神経であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）から得た。組織試料を２４ウェルのプレート上に準備して、ＰＢＳで洗浄し、次に、５０μＭの線状、環状、またはスクランブルされたポリペプチドと室温でインキュベートした。１５分後に、試料をＰＢＳで数回洗浄した。プレートを、ＩＶＩＳスペクトル撮像システムを使用して画像化した。図２に示したように、坐骨神経検体について、全体的に環状化合物は、スクランブルされたポリペプチドおよび線状ポリペプチドと比較して有意に増大した蛍光強度（２〜３倍）；および筋肉組織を超える選択性を示した。
図５は、ヒト死体の坐骨神経が、長さ１ｃｍの断片に切断されて、ペプチドまたはペプチドが結合したＣドットの１５μＭ溶液中で、８０分間室温でインキュベートされ、続いて複数のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄されたことを示す。インキュベーション後８０分にＩＶＩＳスペクトル撮像により得られた目的の非侵襲領域の分析は、増大した光学的シグナルを示した（最高から最低へ）：１７アミノ酸（ＡＡ）残基のペプチドで機能化された環状Ｃドット（上方左）；１７ＡＡ残基環状ペプチド−染料コンジュゲート（上方右）；１７ＡＡ残基の線状ペプチド−染料コンジュゲート（中央右）；１７ＡＡのスクランブルされた環状ペプチドで機能化されたＣドット（下方左）。後方の２つのプローブは対照として機能した。
図６は、ペプチド−染料コンジュゲートまたはペプチドで機能化されたＣドット溶液中のいずれかでインキュベートされた神経および筋肉検体（対照）検体のｅｘ ｖｉｖｏの蛍光シグナル測定を示す。神経および筋肉の組織を、１５μＭのペプチド−染料コンジュゲートまたはペプチドで機能化されたＣドット溶液中で、８０分間室温で穏やかに振盪しながらインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。ＩＶＩＳスペクトルで撮像した後、ＲＯＩ分析を実施した。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群当たりＮ＝５である。１つの生物学的実験から各反復を５個の独立の視野で定量化した。筋肉と比べて神経組織検体でより高い蛍光シグナルが観察された。最大の蛍光シグナルは、１７ＡＡ残基の環状ペプチドで機能化されたＣ’ドットで測定され、１７ＡＡ残基の環状ペプチド−染料コンジュゲート、１７ＡＡ残基線状ペプチド−染料コンジュゲート、およびスクランブルされた環状ペプチド−機能化されたＣドットと続いた。同様なプローブとインキュベートされた筋肉組織検体と比較して、神経で少なくとも４から約５倍大きいシグナルが観察された。いかなる理論にも拘束されることは望まず、データは、ペプチド−染料コンジュゲートおよびペプチドで機能化されたＣドットの両方の選択的取り込みおよび保持を示唆する。
図７Ａおよび７Ｂは、神経結合ペプチドまたはペプチドで機能化されたＣドットとのインキュベーション後の取り込みにおける時間依存性のシグナル変化を、光学的撮像方法を使用して示す。光学的撮像は、神経結合ペプチド（例えば、環状、線状、スクランブルされた）または対応するペプチドで機能化されたＣドットとｅｘ ｖｉｖｏでインキュベートされたヒト坐骨神経検体における時間で変化する取り込みを評価するために使用した。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群当たりＮ＝５である。１つの生物学的実験から各反復を、５個の独立の視野で定量化した。インキュベートされた神経検体における相対的な正規化された蛍光シグナルは、対照粒子プローブ（例えば、スクランブルされたペプチドが結合したＣドット）に対して２０分で約８０％および８０分でほとんど１００％であることが見出された。さらに、１７ＡＡの環状ペプチドで機能化されたＣドットについて、元の線状ペプチドと比較した場合に、２０分で６０％大きいシグナルが見出された（例えば、８０分でほとんど１００％）。
図８は、ペプチド配列の長さおよびコンホメーションの神経結合／取り込みの性質に対する影響を示す。結合／取り込みの配列特異性およびコンホメーションに対する依存性を調べるために、ヒト坐骨神経検体を、環状のコンホメーションを有する１７ＡＡ、トランケートされた１４−ＡＡ、およびトランケートされた１０−ＡＡ残基のペプチド配列の１５μＭ溶液中でインキュベートした。線状１７ＡＡペプチド−染料コンジュゲートを、コンホメーションの影響を決定するために使用した。スクランブルされた配列のペプチドの環状形態を対照として利用した。バーは、平均＋／−標準偏差を示す。１群当たりＮ＝５である。１つの生物学的実験から各反復を、５個の独立の視野で定量化した。目的の領域を断面の画像から取った。最大蛍光シグナルは、１７ＡＡ環状ペプチド−染料コンジュゲート処理と、それに続く１４−ＡＡの環状ペプチド−染料コンジュゲート処理および１０ＡＡの環状ペプチド−染料コンジュゲート処理を使用して観察した。光学的シグナルにおいて、１７ＡＡの線状ペプチド−染料コンジュゲート処理と比較して２倍を超える変化が、１７ＡＡ環状ペプチド−染料コンジュゲート処理で観察された。
図９Ａ〜９Ｅは、ペプチド配列の長さおよびコンホメーションの神経結合／取り込みに対する影響を示す。選択的な神経結合／取り込みを、ヒト坐骨神経の切片の１５μＭのペプチド−染料コンジュゲート溶液とのインキュベーション後に評価した。前もってインキュベートされた神経組織をＯＣＴに包埋して、断面の凍結切片にした（２０μｍ）。最大蛍光シグナルを、１７ＡＡ残基の環状ペプチド−染料コンジュゲートについて、線状およびスクランブルされたペプチド構築物と比較して、５×の対物レンズおよびＣｙ５フィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を使用して観察した。全てのＣｙ５蛍光画像は、同一の露出および標準の設定で撮った。スケールバー＝２００μｍ。
図１０Ａ〜１０Ｅは、１５μＭの神経結合ペプチドで機能化されたＣドットまたはペプチドと８０分間インキュベートした神経検体の蛍光シグナルを示す。処理された神経組織を洗浄して、凍結切片にして（１５μｍ）スライド上に置き、蛍光顕微鏡（５×対物）により観察した（図１０Ａ〜１０Ｄ）。異なったプローブで処理した後、目的の領域（ＲＯＩ）を神経検体上に定めた。蛍光シグナル（最高から最低の順、図１０Ｅを参照されたい）を、１７ＡＡの環状ペプチドで機能化されたＣドットで、続いて１７ＡＡの環状または線状ペプチド−染料コンジュゲートまたはスクランブルされた環状ペプチド−染料で機能化されたＣドットとインキュベートされた検体で観察した。
図１１Ａおよび１１Ｂは、倒立顕微鏡（×２０）を使用して、１７ＡＡ環状ペプチド−染料コンジュゲート溶液（１５μＭ）で８０分間前もってインキュベートして凍結切片にした坐骨神経検体（２０μｍ）を観察したことを示す。ＦｌｕｏｒｏＭｙｅｌｉｎ ｇｒｅｅｎ（ミエリンマーカー）を使用して神経切片を共染色し、続いてＰＢＳで洗浄して、倒立顕微鏡（×２０）によって走査した。撮像の結果は、ペプチドのこのミエリンマーカーとの共局在化はないことを示し、１７ＡＡ環状ペプチド−染料コンジュゲートは、主として神経上膜および神経周膜に関与することが観察され、一方、比較的小さい程度のＣｙ５シグナルが神経内膜で観察された。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト坐骨神経組織に対する結合
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト坐骨神経組織に対する結合
図１２は、４００ナノモルの環状ペプチド−染料コンジュゲートを注射した後のヒト坐骨神経のｉｎ ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡における時間依存性を示す。
図１３Ａ〜１３Ｅは、１７ＡＡ環状ペプチド−染料コンジュゲートを静脈内注射した後の坐骨神経および筋肉からのｉｎ ｖｉｖｏにおける時間依存性の取り込みを、光学的撮像を使用して示す。１７ＡＡ環状ペプチド−染料コンジュゲート（Ｃｙ５標識された）を、手術に曝す前にヌードマウスの尾静脈中に静脈内注射して（４００ナノモル）、蛍光撮像の性能を有するＺｅｉｓｓ Ｌｕｍａｒの立体顕微鏡（０．８×対物）を使用して、坐骨神経および隣接する筋肉を撮像した。事前のおよび連続した注射（ｐ．ｉ．）後の画像（明視野、蛍光）を、注射後１５分から２４０分の８時点で撮った。バーは平均＋／−標準偏差を示す。１群当たりＮ＝５である。１つの生物学的実験から各反復を、５個の独立の視野で定量化する。目的の領域（ＲＯＩ）の分析を、神経および筋肉領域全体にわたって実施して、時間依存性のシグナル変化を評価した。図１３Ａ〜１３Ｅは、神経（図１３Ａおよび１３Ｂ）および隣接する筋肉（図１３Ｂおよび１３Ｄ）の絶対および相対蛍光シグナル（例えば、注射後１５分で撮られた初期蛍光シグナルについてのパーセンテージ）を、それぞれ示す。図１３Ｅは、時間で変化する神経対筋肉の比またはコントラスト比を示し、それは、４時間の間に約１．２からほとんど２．０に上昇し、時間による神経検体による選択的取り込みおよび保持を示唆する。
図１３Ａ〜１３Ｅは、環化されたペプチドが、（周囲の）筋肉からのシグナルと対照的に、神経から十分な蛍光性シグナルを提供することを示す。例えば、神経組織からのシグナルの筋肉組織からのシグナルに対する比が高ければ高いほど、神経組織は、より明確に周囲の（バックグラウンド）組織から視覚的に識別される（例えば、手術中にリアルタイムで）。線状ペプチドは、同様な高い比を示さない。図１３Ａ〜１３Ｅは、環化されたペプチドのシグナルが線状ペプチドと比較してより長時間続くこと、および神経組織からのシグナルの筋肉組織に対する比が、実際に時間とともに上昇することも示す。より長く持続するシグナルは有益であり、それは、外科医が、外科手順においてより柔軟性を有するからである。例えば、作用剤の投与を、手順の直前に行う必要がなく；むしろ、シグナルが検出可能な比較的長い時間枠がある。シグナルは約１５分後に検出可能であるが、神経／筋肉のシグナル比は、実際には時間とともに改善される。シグナルは、投与した後、少なくとも２〜３時間まで検出可能である。同様の期間が、動物の検討におけるものと同様にヒトでも期待される。
図１４Ａおよび１４Ｂは、１７ＡＡ線状ペプチド−染料コンジュゲートの静脈内注射後の、坐骨神経および筋肉からのｉｎ ｖｉｖｏにおける時間依存性の取り込みを、光学的撮像を使用して示す。１７ＡＡ線状ペプチド−染料コンジュゲート（Ｃｙ５標識された）を、手術に曝す前にヌードマウスの尾静脈中に静脈内注射して（１５０ナノモル）、坐骨神経および隣接する筋肉を、蛍光撮像性能を備えたＺｅｉｓｓ Ｌｕｍａｒ立体顕微鏡（０．８×対物）を使用して撮像した。事前および注射（ｐ．ｉ．）後の連続画像（明視野、蛍光）を、注射後（１５分〜１５０分）の６時点で撮った。バーは平均＋／−標準偏差を示す。１群当たりＮ＝５である。１つの生物学的実験から各反復を、筋肉領域について評価して（１５分、６回）、時間依存性のシグナル変化を評価した。図１４Ａは、神経の絶対蛍光を示す。蛍光シグナルは、３０分で注射後のレベルの約１５％に大きく低下していることがわかった。シグナルはその後ほとんど感知できなくなり、評価が不可能になった（データ掲載せず）。その上、図１４Ａは、線状ペプチドからのシグナルが、投与後３０分で初期シグナルの１０％に減少したことを示す。図１４Ｂは、対応する時間で変化する神経対筋肉またはコントラスト比を示し、それは線状ペプチド−染料コンジュゲートの注射後の最初の３０分にわたってほぼ同等であり、時間による筋肉に対する坐骨神経検体による選択的取り込みおよび保持を示唆する。
図１５は、ｔｈｙ１−ＹＦＰトランスジェニックマウスにおける、１５０ナノモルのペプチド−染料コンジュゲートの環状対線状の注射後の時間依存性のｉｎ ｖｉｖｏヒト坐骨神経の蛍光顕微鏡像を示す。
図１６Ａ〜１６Ｅは、１７ＡＡ環状ペプチド−染料コンジュゲートの静脈内注射後の坐骨神経および筋肉からのｉｎ ｖｉｖｏの時間依存性取り込みを、光学的撮像を使用して示す。１７ＡＡ環状ペプチド−染料コンジュゲート（Ｃｙ５標識された）を、手術に曝す前に、ヌードマウスの尾静脈中に静脈内注射して（１５０ナノモル）、坐骨神経および隣接する筋肉を、蛍光撮像性能を備えたＺｅｉｓｓ Ｌｕｍａｒ立体顕微鏡（０．８×対物）を使用して撮像した。事前のおよび連続した注射後（ｐ．ｉ．）の画像（明視野、蛍光）を、注射後（１５分〜１５０分）の６時点で撮った。バーは平均＋／−標準偏差を示す。１群当たりＮ＝５である。１つの生物学的実験から各反復を、５個の独立の視野で定量化した。目的の領域（ＲＯＩ）の分析を、神経および筋肉領域全体で実施して、時間依存性シグナルの変化を評価した。図１６Ａ〜１６Ｄは、神経（図１６Ａおよび１６Ｃ）および隣接する筋肉（図１６Ｂおよび１６Ｄ）それぞれの絶対および相対蛍光シグナル（注射後１５分で撮った初期蛍光シグナルについてのパーセンテージ）を示す。図１６Ｅは、時間で変化する神経−筋肉またはコントラスト比を示し、それは、１．５時間の間に約１．３からほとんど２．６に増大した。いかなる理論のも拘束されることは望まず、これらのデータは神経検体による選択的取り込みおよび経時的保持を示唆する。
「処置」：本明細書において使用する用語「処置」は（「処置する」または「処置すること」も）、特定の疾患、障害および／または状態の１つまたは複数の症状、特徴および／または原因を部分的にまたは完全に軽減し、緩和し、和らげ、阻害し、発症を遅延させ、重症度を低下させ、および／または発病率を減少させる物質の任意の投与を指す。そのような処置は、関連する疾患、障害および／もしくは状態の徴候を示さない対象ならびに／または疾患、障害、および／または状態の初期にすぎない徴候を示す対象についてであってもよい。あるいはまたはそれに加えて、そのような処置は、関連する疾患、障害および／または状態の１つまたは複数の確立された徴候を示す対象についてであってもよい。一部の実施形態では、処置は、関連する疾患、障害、および／または状態に罹っていると診断された対象についてであってもよい。一部の実施形態では、処置は、関連する疾患、障害、および／または状態の発生の増大したリスクと統計的に相関する１つまたは複数の罹病性要因を有することが知られた対象についてであってもよい。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
環状ペプチド；
ナノ粒子；
蛍光剤；および
リンカー部分
を含む神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目２）
線状ポリペプチド；
ナノ粒子；
蛍光剤；および
リンカー部分
を含む神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目３）
前記ナノ粒子が、
シリカベースのコア；
前記コア内の前記蛍光剤；
前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェル；
前記ナノ粒子に付着した前記リンカー部分；および
任意選択で、ポリマーでコートされたナノ粒子に付着した１から２０個のペプチドリガンド
を含む、項目１または２に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目４）
前記ナノ粒子が微小粒子である（例えば、平均直径が１００ｎｍ未満、例えば、５０ｎｍ未満、例えば、３０ｎｍ未満、例えば、２０ｎｍ未満、例えば、１０ｎｍ未満である）（例えば、前記微小ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目５）
前記リンカー部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ ２ 、およびパラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ）からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む（例えば、前記リンカー部分は２から５０個の原子を有する）、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目６）
前記環状ペプチドが、前記リンカー部分を介して前記ナノ粒子に結合している、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目７）
前記蛍光剤がシアニン染料（例えば、Ｃｙ５またはＣｙ５．５）を含む、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目８）
５から２０個のアミノ酸残基および／または１５個の原子から６０個の原子の大員環を有する、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目９）
１７個のアミノ酸残基および／または５１個の原子の大員環を有する、項目８に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目１０）
前記環状ペプチドが、ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む、項目１、３〜９のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目１１）
大員環が、前記ペプチドを頭尾結合で環化させることにより、または前記配列の内部に共有結合を導入することにより形成される、項目１０に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目１２）
前記環状ペプチドが、ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む、項目１、３〜９のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目１３）
ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む環状ペプチド。
（項目１４）
ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む環状ペプチド。
（項目１５）
蛍光剤；および
ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む環状ペプチド
を含む環状ペプチド組成物。
（項目１６）
蛍光剤；および
ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む環状ペプチド
を含む環状ペプチド組成物。
（項目１７）
前記環状ペプチドが大員環を含む、項目１３から１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記大員環が、前記ペプチドを頭尾結合で環化させることにより、または前記配列の内部に共有結合を導入することにより形成される、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
図１Ｂまたは図４Ａ〜４Ｈに示される構造を有する環状ペプチドを含む環状ペプチド組成物。
（項目２０）
前記環状ペプチドがナノ粒子に付着している、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記環状ペプチドが、リンカー部分を介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合で付着している、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記環状ペプチドが機能化されている、項目１９に記載の組成物。
（項目２３）
項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物を含む製剤を対象に投与し、前記組成物を前記対象の神経組織に選択的に結合させること；
前記対象の組織を励起光に曝露すること；および
前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示すること
を含む撮像方法。
（項目２４）
前記神経組織から放射される光が、周囲の組織から放射される光より強く（例えば、神経対筋肉のシグナル比は少なくとも２である）、その結果、前記神経組織が前記周囲の組織から視覚的に識別可能である、項目２３に記載の撮像方法。
（項目２５）
前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１５分という早さで検出可能である、項目２４に記載の撮像方法。
（項目２６）
前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間）の間は検出可能である、項目２４または２５に記載の撮像方法。
（項目２７）
投与することが、前記製剤を、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある末梢神経幹に局所的に適用することを含む、項目２３に記載の撮像方法。
（項目２８）
前記製剤を、（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）末梢神経幹に局所的に適用すること、前記製剤の前記組成物が前記神経幹から前記神経組織のさらに小さい枝に拡散することを可能にすること、および前記組成物の蛍光剤から放射される光を検出して前記神経組織の前記さらに小さい枝の画像を創ることを含む、項目２３または２７に記載の撮像方法。
（項目２９）
前記製剤が静脈内に（Ｉ．Ｖ．により）投与される、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３０）
前記製剤が局所的に投与される、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３１）
前記対象の組織を励起光に曝露することが、外科手順中に行われる、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３２）
前記画像が、ビデオおよび／または静止画像および／またはリアルタイムのビデオである、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３３）
前記画像が、前記対象に対して実施される外科手順中に外科医に対して表示される、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３４）
対象の組織を励起光に曝露することであって、前記対象に項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物を含む製剤が投与されていること；および
前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出すること
を含む撮像方法。
（項目３５）
前記検出ステップが、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示することを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記組成物を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目３４または３５に記載の方法。
（項目３７）
前記神経組織から放射される光が、周囲の組織から放射される光より強く（例えば、神経対筋肉のシグナル比は少なくとも２である）、その結果、前記神経組織が前記周囲の組織から視覚的に識別可能である、項目３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１５分という早さで検出可能である、項目３４から３７のいずれか一項に記載の撮像方法。
（項目３９）
前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象に（例えば、前記対象は動物であり、例えば前記対象がヒトである）投与した後、少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間）の間は検出可能である、項目３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記製剤が、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある末梢神経幹に局所適用により投与されている、項目３４から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記製剤が、末梢神経幹（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）に局所適用により投与され、その結果、前記製剤の前記組成物が前記神経幹から前記神経組織のさらに小さい枝に拡散しており、前記方法が、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して前記神経組織の前記さらに小さい枝の画像を創ることを含む、項目３４から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記製剤が静脈内に（Ｉ．Ｖ．により）投与される、項目３４から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記製剤が局所的に投与される、項目３４から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記対象の前記組織を励起光に曝露することが外科手順中に行われる、項目３４から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記検出ステップが、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示させることを含み、前記画像がビデオおよび／または静止画像および／またはリアルタイムのビデオである、項目３４から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記画像が、前記対象に実施される外科手順中に外科医に対して表示される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
放射性標識をさらに含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
環状ペプチド；
ナノ粒子；
蛍光剤；および
リンカー部分
を含む神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目２）
線状ポリペプチド；
ナノ粒子；
蛍光剤；および
リンカー部分
を含む神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目３）
前記ナノ粒子が、
シリカベースのコア；
前記コア内の前記蛍光剤；
前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェル；
前記ナノ粒子に付着した前記リンカー部分；および
任意選択で、ポリマーでコートされたナノ粒子に付着した１から２０個のペプチドリガンド
を含む、項目１または２に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目４）
前記ナノ粒子が微小粒子である（例えば、平均直径が１００ｎｍ未満、例えば、５０ｎｍ未満、例えば、３０ｎｍ未満、例えば、２０ｎｍ未満、例えば、１０ｎｍ未満である）（例えば、前記微小ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目５）
前記リンカー部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ ２ 、およびパラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ）からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む（例えば、前記リンカー部分は２から５０個の原子を有する）、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目６）
前記環状ペプチドが、前記リンカー部分を介して前記ナノ粒子に結合している、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目７）
前記蛍光剤がシアニン染料（例えば、Ｃｙ５またはＣｙ５．５）を含む、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目８）
５から２０個のアミノ酸残基および／または１５個の原子から６０個の原子の大員環を有する、先行する項目のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目９）
１７個のアミノ酸残基および／または５１個の原子の大員環を有する、項目８に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目１０）
前記環状ペプチドが、ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む、項目１、３〜９のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目１１）
大員環が、前記ペプチドを頭尾結合で環化させることにより、または前記配列の内部に共有結合を導入することにより形成される、項目１０に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目１２）
前記環状ペプチドが、ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む、項目１、３〜９のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
（項目１３）
ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む環状ペプチド。
（項目１４）
ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む環状ペプチド。
（項目１５）
蛍光剤；および
ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む環状ペプチド
を含む環状ペプチド組成物。
（項目１６）
蛍光剤；および
ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む環状ペプチド
を含む環状ペプチド組成物。
（項目１７）
前記環状ペプチドが大員環を含む、項目１３から１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記大員環が、前記ペプチドを頭尾結合で環化させることにより、または前記配列の内部に共有結合を導入することにより形成される、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
図１Ｂまたは図４Ａ〜４Ｈに示される構造を有する環状ペプチドを含む環状ペプチド組成物。
（項目２０）
前記環状ペプチドがナノ粒子に付着している、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記環状ペプチドが、リンカー部分を介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合で付着している、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記環状ペプチドが機能化されている、項目１９に記載の組成物。
（項目２３）
項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物を含む製剤を対象に投与し、前記組成物を前記対象の神経組織に選択的に結合させること；
前記対象の組織を励起光に曝露すること；および
前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示すること
を含む撮像方法。
（項目２４）
前記神経組織から放射される光が、周囲の組織から放射される光より強く（例えば、神経対筋肉のシグナル比は少なくとも２である）、その結果、前記神経組織が前記周囲の組織から視覚的に識別可能である、項目２３に記載の撮像方法。
（項目２５）
前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１５分という早さで検出可能である、項目２４に記載の撮像方法。
（項目２６）
前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間）の間は検出可能である、項目２４または２５に記載の撮像方法。
（項目２７）
投与することが、前記製剤を、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある末梢神経幹に局所的に適用することを含む、項目２３に記載の撮像方法。
（項目２８）
前記製剤を、（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）末梢神経幹に局所的に適用すること、前記製剤の前記組成物が前記神経幹から前記神経組織のさらに小さい枝に拡散することを可能にすること、および前記組成物の蛍光剤から放射される光を検出して前記神経組織の前記さらに小さい枝の画像を創ることを含む、項目２３または２７に記載の撮像方法。
（項目２９）
前記製剤が静脈内に（Ｉ．Ｖ．により）投与される、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３０）
前記製剤が局所的に投与される、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３１）
前記対象の組織を励起光に曝露することが、外科手順中に行われる、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３２）
前記画像が、ビデオおよび／または静止画像および／またはリアルタイムのビデオである、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３３）
前記画像が、前記対象に対して実施される外科手順中に外科医に対して表示される、項目２３に記載の撮像方法。
（項目３４）
対象の組織を励起光に曝露することであって、前記対象に項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物を含む製剤が投与されていること；および
前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出すること
を含む撮像方法。
（項目３５）
前記検出ステップが、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示することを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記組成物を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目３４または３５に記載の方法。
（項目３７）
前記神経組織から放射される光が、周囲の組織から放射される光より強く（例えば、神経対筋肉のシグナル比は少なくとも２である）、その結果、前記神経組織が前記周囲の組織から視覚的に識別可能である、項目３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１５分という早さで検出可能である、項目３４から３７のいずれか一項に記載の撮像方法。
（項目３９）
前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象に（例えば、前記対象は動物であり、例えば前記対象がヒトである）投与した後、少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間）の間は検出可能である、項目３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記製剤が、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある末梢神経幹に局所適用により投与されている、項目３４から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記製剤が、末梢神経幹（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）に局所適用により投与され、その結果、前記製剤の前記組成物が前記神経幹から前記神経組織のさらに小さい枝に拡散しており、前記方法が、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して前記神経組織の前記さらに小さい枝の画像を創ることを含む、項目３４から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記製剤が静脈内に（Ｉ．Ｖ．により）投与される、項目３４から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記製剤が局所的に投与される、項目３４から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記対象の前記組織を励起光に曝露することが外科手順中に行われる、項目３４から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記検出ステップが、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示させることを含み、前記画像がビデオおよび／または静止画像および／またはリアルタイムのビデオである、項目３４から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記画像が、前記対象に実施される外科手順中に外科医に対して表示される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
放射性標識をさらに含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
Claims (47)
- 環状ペプチド；
ナノ粒子；
蛍光剤；および
リンカー部分
を含む神経結合ペプチドコンジュゲート。 - 線状ポリペプチド；
ナノ粒子；
蛍光剤；および
リンカー部分
を含む神経結合ペプチドコンジュゲート。 - 前記ナノ粒子が、
シリカベースのコア；
前記コア内の前記蛍光剤；
前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェル；
前記ナノ粒子に付着した前記リンカー部分；および
任意選択で、ポリマーでコートされたナノ粒子に付着した１から２０個のペプチドリガンド
を含む、請求項１または２に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。 - 前記ナノ粒子が微小粒子である（例えば、平均直径が１００ｎｍ未満、例えば、５０ｎｍ未満、例えば、３０ｎｍ未満、例えば、２０ｎｍ未満、例えば、１０ｎｍ未満である）（例えば、前記微小ナノ粒子がＣドットまたはＣ’ドットである）、先行する請求項のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- 前記リンカー部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ２、およびパラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ）からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む（例えば、前記リンカー部分は２から５０個の原子を有する）、先行する請求項のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- 前記環状ペプチドが、前記リンカー部分を介して前記ナノ粒子に結合している、先行する請求項のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- 前記蛍光剤がシアニン染料（例えば、Ｃｙ５またはＣｙ５．５）を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- ５から２０個のアミノ酸残基および／または１５個の原子から６０個の原子の大員環を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- １７個のアミノ酸残基および／または５１個の原子の大員環を有する、請求項８に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- 前記環状ペプチドが、ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む、請求項１、３〜９のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- 大員環が、前記ペプチドを頭尾結合で環化させることにより、または前記配列の内部に共有結合を導入することにより形成される、請求項１０に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- 前記環状ペプチドが、ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項１、３〜９のいずれか一項に記載の神経結合ペプチドコンジュゲート。
- ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む環状ペプチド。
- ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む環状ペプチド。
- 蛍光剤；および
ペプチド配列ＮＴＱＴＬＡＫＡＰＥＨＴを含む環状ペプチド
を含む環状ペプチド組成物。 - 蛍光剤；および
ＴＹＴＤＷＬＮＦＷＡＷＰ、ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＤＦＴＫＴＳＰＬＧＩＨからなる群から選択されるペプチド配列を含む環状ペプチド
を含む環状ペプチド組成物。 - 前記環状ペプチドが大員環を含む、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記大員環が、前記ペプチドを頭尾結合で環化させることにより、または前記配列の内部に共有結合を導入することにより形成される、請求項１７に記載の組成物。
- 図１Ｂまたは図４Ａ〜４Ｈに示される構造を有する環状ペプチドを含む環状ペプチド組成物。
- 前記環状ペプチドがナノ粒子に付着している、請求項１９に記載の組成物。
- 前記環状ペプチドが、リンカー部分を介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合で付着している、請求項２０に記載の組成物。
- 前記環状ペプチドが機能化されている、請求項１９に記載の組成物。
- 請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物を含む製剤を対象に投与し、前記組成物を前記対象の神経組織に選択的に結合させること；
前記対象の組織を励起光に曝露すること；および
前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示すること
を含む撮像方法。 - 前記神経組織から放射される光が、周囲の組織から放射される光より強く（例えば、神経対筋肉のシグナル比は少なくとも２である）、その結果、前記神経組織が前記周囲の組織から視覚的に識別可能である、請求項２３に記載の撮像方法。
- 前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１５分という早さで検出可能である、請求項２４に記載の撮像方法。
- 前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間）の間は検出可能である、請求項２４または２５に記載の撮像方法。
- 投与することが、前記製剤を、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある末梢神経幹に局所的に適用することを含む、請求項２３に記載の撮像方法。
- 前記製剤を、（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）末梢神経幹に局所的に適用すること、前記製剤の前記組成物が前記神経幹から前記神経組織のさらに小さい枝に拡散することを可能にすること、および前記組成物の蛍光剤から放射される光を検出して前記神経組織の前記さらに小さい枝の画像を創ることを含む、請求項２３または２７に記載の撮像方法。
- 前記製剤が静脈内に（Ｉ．Ｖ．により）投与される、請求項２３に記載の撮像方法。
- 前記製剤が局所的に投与される、請求項２３に記載の撮像方法。
- 前記対象の組織を励起光に曝露することが、外科手順中に行われる、請求項２３に記載の撮像方法。
- 前記画像が、ビデオおよび／または静止画像および／またはリアルタイムのビデオである、請求項２３に記載の撮像方法。
- 前記画像が、前記対象に対して実施される外科手順中に外科医に対して表示される、請求項２３に記載の撮像方法。
- 対象の組織を励起光に曝露することであって、前記対象に請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物を含む製剤が投与されていること；および
前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出すること
を含む撮像方法。 - 前記検出ステップが、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示することを含む、請求項３４に記載の方法。
- 前記組成物を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。
- 前記神経組織から放射される光が、周囲の組織から放射される光より強く（例えば、神経対筋肉のシグナル比は少なくとも２である）、その結果、前記神経組織が前記周囲の組織から視覚的に識別可能である、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象（例えば前記対象は動物であり、例えば前記対象はヒトである）に投与した後、少なくとも１５分という早さで検出可能である、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の撮像方法。
- 前記神経組織から放射される光が、前記製剤を前記対象に（例えば、前記対象は動物であり、例えば前記対象がヒトである）投与した後、少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間）の間は検出可能である、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記製剤が、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある末梢神経幹に局所適用により投与されている、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記製剤が、末梢神経幹（例えば、外科的露出後、転移性リンパ節または原発性腫瘍に隣接するかまたはその近傍にある）に局所適用により投与され、その結果、前記製剤の前記組成物が前記神経幹から前記神経組織のさらに小さい枝に拡散しており、前記方法が、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して前記神経組織の前記さらに小さい枝の画像を創ることを含む、請求項３４から４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記製剤が静脈内に（Ｉ．Ｖ．により）投与される、請求項３４から４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記製剤が局所的に投与される、請求項３４から４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の前記組織を励起光に曝露することが外科手順中に行われる、請求項３４から４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出ステップが、前記組成物の前記蛍光剤により放射される光を検出して画像を創り出し、前記画像を表示させることを含み、前記画像がビデオおよび／または静止画像および／またはリアルタイムのビデオである、請求項３４から４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画像が、前記対象に実施される外科手順中に外科医に対して表示される、請求項４５に記載の方法。
- 放射性標識をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
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