JP6412918B2 - マルチモーダルシリカ系ナノ粒子 - Google Patents
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Description
NIH−NRRA、臨床およびトランスレーショナルサイエンス助成金;NIH−NCI R01CA161280−01A1、NSF STCプログラム同意番号ECS−9876771;ICMIC P50 CA86438;NIH SAIRP助成金番号R24 CA83084;およびNIHセンター助成金番号P30 CA08748の下、政府の支援により本発明がなされた。
本発明は、蛍光シリカ系ナノ粒子、および前記ナノ粒子を使用してがんなどの疾患を検出、診断または処置する方法に関する。
治療の成功および長期生存率を達成するためには、早期の腫瘍検出および処置選択が最重要である。多くのがんは初期段階では局在しており、外科的に処置することができる。しかしながら、外科手術の場面では、イメージング技術が十分ではないために、特に構造が複雑な領域における転移性疾患の拡散および腫瘍境界の評価が制限されている。これは、侵襲的生検の数が不均衡であることの原因になっている。コントラスト生成(すなわち、光学PET)標識が組み込まれており、改善された特異性を提供する分子ターゲティングプローブが、正常細胞と腫瘍細胞との間の分子差(例えば、受容体発現レベルのがん特異的変化)の早期イメージング検出に必要である。高感度および高解像度のイメージングツールと組み合わせると、特異的分子ターゲティングプローブは、がんの検出感度、病期分類およびモニタリングおよび/または処置を大きく改善するであろう。現在の蛍光イメージングプローブは、典型的には、従来の単一フルオロフォア(例えば、有機色素、蛍光タンパク質)、蛍光タンパク質(例えば、GFP)および半導体量子ドット(Q−ドット)からなる。通常、単一フルオロフォアは安定ではなく、イメージングの輝度が限られている。色素と同様に、蛍光タンパク質は励起状態相互作用を示す傾向があり、これが、確率論的なブリンキング、クエンチングおよびケミカルブリーチングにつながり得る。Q−ドットは、一般に、Pb2+またはCd2+などの重金属イオンから作られるので毒性である。Burnsら、“Fluorescent core−shell silica nanoparticles:towards“Lab on a Particle”architectures for nanobiotechnology”,Chem.Soc.Rev.,2006,35,1028−1042。
本出願は、腫瘍細胞を検出するための方法であって、(a)複数の蛍光シリカ系ナノ粒子を、約0.01ナノモル/kg体重〜約1ナノモル/kg体重の範囲の用量で患者に投与する工程であって、該ナノ粒子が、以下:シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含む該シリカ系コア;該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル;該ナノ粒子に結合した有機ポリマー;該ナノ粒子に結合したリガンドであって、腫瘍マーカーに結合することができるリガンド;および少なくとも1つの治療剤を含む、工程;ならびに(b)該ナノ粒子を検出する工程を含む方法を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
(請求項1)
腫瘍細胞を検出するための方法であって、
(a)複数の蛍光シリカ系ナノ粒子を、約0.01ナノモル/kg体重〜約1ナノモル/kg体重の範囲の用量で患者に投与する工程であって、該ナノ粒子が、以下:
シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含む該シリカ系コア;
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル;
該ナノ粒子に結合した有機ポリマー;
該ナノ粒子に結合したリガンドであって、腫瘍マーカーに結合することができるリガンド;および
少なくとも1つの治療剤;
を含む、工程;ならびに
(b)該ナノ粒子を検出する工程
を含む、方法。
(請求項2)
前記ナノ粒子を真皮下投与、腫瘍周囲投与、経口投与、静脈内投与、鼻腔内投与、皮下投与、筋肉内投与または経皮投与する、請求項1に記載の方法。
(請求項3)
前記ナノ粒子が約1nm〜約25nmの直径を有する、請求項1に記載の方法。
(請求項4)
前記ナノ粒子が約1nm〜約8nmの直径を有する、請求項3に記載の方法。
(請求項5)
前記有機ポリマーが、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸(PGA)、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)、ポリ酢酸ビニル(PVA)およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
(請求項6)
前記ナノ粒子に結合したリガンドの数が約1〜約25個の範囲である、請求項1に記載の方法。
(請求項7)
前記ナノ粒子に結合したリガンドの数が約1〜約10個の範囲である、請求項6に記載の方法。
(請求項8)
前記リガンドが、ペプチド、タンパク質、バイオポリマー、合成ポリマー、抗原、抗体、微生物、ウイルス、受容体、ハプテン、酵素、ホルモン、化合物、病原体、毒素、表面改変剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
(請求項9)
前記ペプチドが、トリペプチドRGD、環状ペプチドcRGD、オクトレオテート、EPPT1およびα−MSHのペプチド類似体からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
(請求項10)
造影剤またはキレートが前記ナノ粒子に結合している、請求項1に記載の方法。
(請求項11)
前記造影剤が放射性核種である、請求項10に記載の方法。
(請求項12)
前記放射性核種が、 89 Zr、 64 Cu、 68 Ga、 86 Y、 124 Iおよび 177 Luからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
(請求項13)
前記キレートが、放射性核種に結合するように適合されている、請求項10に記載の方法。
(請求項14)
前記キレートが、DFO、DOTA、TETAおよびDTPAからなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
(請求項15)
前記ナノ粒子が、PET、SPECT、CT、MRI、光学イメージング、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出可能である、請求項1に記載の方法。
(請求項16)
前記光学イメージングが蛍光イメージングである、請求項15に記載の方法。
(請求項17)
治療剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項1に記載の方法。
(請求項18)
前記治療剤が、抗生物質、抗菌剤、抗増殖剤、抗腫瘍薬、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、抗有糸分裂薬、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、PPAR−γアゴニスト、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNAならびに抗がん化学療法剤からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
(請求項19)
前記治療剤が放射標識されている、請求項17に記載の方法。
(請求項20)
前記治療剤が放射性フッ素 18 Fに結合されている、請求項19に記載の方法。
(請求項21)
前記治療剤が放射性核種である、請求項17に記載の方法。
(請求項22)
前記放射性核種が、 90 Y、 131 Iおよび 177 Luからなる群より選択される、請求項21に記載の方法。
(請求項23)
蛍光シリカ系ナノ粒子であって、以下:
シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含む該シリカ系コア;
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル;
該ナノ粒子に結合した有機ポリマー;および
該ナノ粒子に結合したリガンド
を含み、
該ナノ粒子が、約1nm〜約15nmの直径を有し、被験体への該ナノ粒子の投与後において、該ナノ粒子の腎クリアランスが、約24時間のうちに約80%ID(初期用量)〜約100%IDの範囲である、蛍光シリカ系ナノ粒子。
(請求項24)
前記ナノ粒子の腎クリアランスが、被験体への該ナノ粒子の投与後約24時間のうちに約90%ID〜約100%IDの範囲である、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項25)
前記ナノ粒子に結合したリガンドの数が約1〜約25個の範囲である、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項26)
前記ナノ粒子に結合したリガンドの数が約1〜約10個の範囲である、請求項25に記載のナノ粒子。
(請求項27)
約1nm〜約8nmの直径を有する、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項28)
前記有機ポリマーが、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸(PGA)、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)、ポリ酢酸ビニル(PVA)およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項29)
前記リガンドが少なくとも1つの細胞成分に結合することができる、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項30)
前記細胞成分が腫瘍マーカーである、請求項29に記載のナノ粒子。
(請求項31)
前記リガンドが、ペプチド、タンパク質、バイオポリマー、合成ポリマー、抗原、抗体、微生物、ウイルス、受容体、ハプテン、酵素、ホルモン、化合物、病原体、毒素、表面改変剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項32)
前記ペプチドが、トリペプチドRGD、環状ペプチドcRGD、オクトレオテート、EPPT1およびα−MSHのペプチド類似体からなる群より選択される、請求項31に記載のナノ粒子。
(請求項33)
造影剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項34)
前記造影剤が放射性核種である、請求項33に記載のナノ粒子。
(請求項35)
前記放射性核種が、 89 Zr、 64 Cu、 68 Ga、 86 Y、 124 Iおよび 177 Luからなる群より選択される、請求項34に記載のナノ粒子。
(請求項36)
キレートが前記ナノ粒子に結合している、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項37)
前記キレートが、放射性核種に結合するように適合されている、請求項36に記載のナノ粒子。
(請求項38)
前記キレートが、DFO、DOTA、TETAおよびDTPAからなる群より選択される、請求項36に記載のナノ粒子。
(請求項39)
PET、SPECT、CT、MRI、光学イメージング、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出可能である、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項40)
前記光学イメージングが蛍光イメージングである、請求項39に記載のナノ粒子。
(請求項41)
治療剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項23に記載のナノ粒子。
(請求項42)
前記治療剤が、抗生物質、抗菌剤、抗増殖剤、抗腫瘍薬、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、抗有糸分裂薬、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、PPAR−γアゴニスト、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNAならびに抗がん化学療法剤からなる群より選択される、請求項41に記載のナノ粒子。
(請求項43)
前記治療剤が放射標識されている、請求項41に記載のナノ粒子。
(請求項44)
前記治療剤が放射性フッ素 18 Fに結合されている、請求項41に記載のナノ粒子。
(請求項45)
前記治療剤が放射性核種である、請求項41に記載のナノ粒子。
(請求項46)
前記放射性核種が、 90 Y、 131 Iおよび 177 Luからなる群より選択される、請求項45に記載のナノ粒子。
本発明は、がんなどの疾患の正確な検出、特性決定、モニタリングおよび処置を可能にする蛍光シリカ系ナノ粒子を提供する。本発明はまた、腫瘍細胞を検出するための方法を提供する。前記方法は、以下:(a)複数の蛍光シリカ系ナノ粒子を、約0.01ナノモル/kg体重〜約1ナノモル/kg体重、約0.05ナノモル/kg体重〜約0.9ナノモル/kg体重、約0.1ナノモル/kg体重〜約0.9ナノモル/kg体重、約0.2ナノモル/kg体重〜約0.8ナノモル/kg体重、約0.3ナノモル/kg体重〜約0.7ナノモル/kg体重、約0.4ナノモル/kg体重〜約0.6ナノモル/kg体重または約0.2ナノモル/kg体重〜約0.5ナノモル/kg体重の範囲の用量で患者に投与する工程、および(b)前記ナノ粒子を検出する工程を含有し得る。一実施形態では、ナノ粒子は、シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を有するシリカ系コア;前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル;前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー;前記ナノ粒子に結合したリガンドであって、腫瘍マーカーに結合することができるリガンド;および少なくとも1つの治療剤を含む。
本発明の蛍光ナノ粒子は、コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コアと、前記コア上のシリカシェルとを含む。シリカシェルは、コアの少なくとも一部を取り囲み得る。あるいは、ナノ粒子はコアのみを有し得、シェルを有しなくてもよい。ナノ粒子のコアは、反応性蛍光化合物および共反応性オルガノシラン化合物の反応生成物を含有し得る。別の実施形態では、ナノ粒子のコアは、反応性蛍光化合物および共反応性オルガノシラン化合物の反応生成物と、シリカとを含有し得る。コアの直径は、約0.05nm〜約100nm、約0.1nm〜約50nm、約0.5nm〜約25nm、約0.8nm〜約15nmまたは約1nm〜約8nmであり得る。ナノ粒子のシェルは、シリカ形成化合物の反応生成物であり得る。ナノ粒子のシェルは、一定範囲の層を有し得る。例えば、シリカシェルは、約1〜約20枚の層、約1〜約15枚の層、約1〜約10枚の層または約1〜約5枚の層であり得る。シェルの厚さは、約0.01nm〜約90nm、約0.02nm〜約40nm、約0.05nm〜約20nm、約0.05nm〜約10nmまたは約0.05nm〜約5nmの範囲であり得る。
本蛍光ナノ粒子は、蛍光化合物(例えば、反応性蛍光色素)を、オルガノシラン化合物(例えば、共反応性オルガノシラン化合物)に対する反応性部分(限定されないが、マレイミド、ヨードアセトアミド、チオ硫酸塩、アミン、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、4−スルホ−2,3,5,6−テトラフルオロフェニル(STP)エステル、スルホスクシンイミジルエステル、スルホジクロロフェノールエステル、塩化スルホニル、ヒドロキシル、イソチオシアネート、カルボキシを含む)と共有結合させて、蛍光シリカ前駆体を形成する工程、および前記蛍光シリカ前駆体を反応させて蛍光コアを形成する工程;蛍光化合物(例えば、反応性蛍光色素)をオルガノシラン化合物(例えば、共反応性オルガノシラン化合物)と共有結合させて、蛍光シリカ前駆体を形成する工程、および前記蛍光シリカ前駆体をシリカ形成化合物(例えば、テトラアルコキシシラン)と反応させて、蛍光コアを形成する工程;および、得られたコアをシリカ形成化合物(例えば、テトラアルコキシシラン)と反応させて前記コア上にシリカシェルを形成し、蛍光ナノ粒子を得る工程によって合成され得る。
ナノ粒子は、任意の公知の蛍光化合物、例えば蛍光有機化合物、色素、顔料またはそれらの組み合わせが組み込まれ得る。多種多様な適切な化学反応性蛍光色素が公知であり、例えば、MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS,6th ed.,R.P.Haugland,ed.(1996)を参照のこと。典型的なフルオロフォアは、例えば、蛍光芳香族またはヘテロ芳香族化合物、例えばピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンズインドール、オキサゾールまたはベンゾオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、4−アミノ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール(NBD)、シアニン、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、クマリン(ヒドロキシクマリンおよびアミノクマリンおよびそれらのフッ素化誘導体を含む)および類似化合物である。例えば、米国特許第5,830,912号、米国特許第4,774,339号、米国特許第5,187,288号、米国特許第5,248,782号、米国特許第5,274,113号、米国特許第5,433,896号、米国特許第4,810,636号および米国特許第4,812,409号を参照のこと。一実施形態では、近赤外蛍光(NIRF)色素Cy5が、本ナノ粒子のシリカコア内に配置される。近赤外発光プローブは、組織減衰の減少および自家蛍光を示す。Burnsら、“Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine”,Nano Letters,2009,9(1),442−448。
有機ポリマーが、本ナノ粒子に付加され得る(例えば、ナノ粒子の表面に付加され得る)。有機ポリマーが、本ナノ粒子のシリカシェルに付加され得る。本発明で使用され得る有機ポリマーはとしては、PEG、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸(PGA)、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)、ポリ酢酸ビニル(PVA)およびそれらの組み合わせが挙げられる。ナノ粒子への有機ポリマーの付加は、共有結合または非共有結合によって、例えばイオン結合、水素結合、疎水結合、配位、接着剤および物理吸着などによって達成され得る。一実施形態では、ナノ粒子は、血清タンパク質の吸着を防止し、効率的な尿排泄を容易にし、ナノ粒子の凝集を減少させるPEGと共有結合される。Burnsら、“Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine”,Nano Letters,2009,9(1),442−448。
リガンドが、本ナノ粒子に付加され得る。リガンドは、少なくとも1つの細胞成分に結合することができる。細胞成分は、特定の細胞型に関連するものであり得るか、または特定の細胞型、例えばがん細胞、もしくは特定の組織および臓器に特異的な細胞でレベルが上昇しているものであり得る。したがって、ナノ粒子は特定の細胞型をターゲティングし得、ならびに/または疾患の処置および診断のためのターゲティング送達を提供する。本明細書で使用される用語「リガンド」は、物理的な状態または症状、例えば疾患状態または症状を同定、検出、ターゲティング、モニタリングまたは改変するのに使用され得る分子または実体を指す。例えば、リガンドは、特定の受容体の存在もしくは非存在、特定の受容体の発現レベル、または特定の受容体の代謝レベルを検出するのに使用され得る。リガンドは、例えば、ペプチド、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドホルモン、糖(すなわち、レクチン)、バイオポリマー、合成ポリマー、抗原、抗体、抗体断片(例えば、Fab、ナノボディ)、アプタマー、ウイルスまたはウイルス成分、受容体、ハプテン、酵素、ホルモン、化合物、病原体、微生物またはその成分、毒素、ナノ粒子のまたはナノ粒子がそれに結合する場合には分析物の表面特性または組織適合性を変化させるための表面改質剤(例えば、界面活性剤)、およびそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、リガンドは、抗体、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。別の実施形態では、リガンドは、受容体リガンドである。さらに別の実施形態では、リガンドは、ポリ−L−リジン(pリジン)である。
医学的イメージングまたは生物学的イメージングの場合、造影剤が、本ナノ粒子に付加され得る。本明細書で使用される用語「造影剤」は、医学的イメージングまたは生物学的イメージングにおいて、構造または流体の可視性を高めるのに使用される物質、分子または化合物を指す。用語「造影剤」はまた、コントラスト生成分子を指す。本発明によって包含されるイメージング技術としては、陽電子放出断層撮影(PET)、単光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)、コンピュータ断層撮影(CT)、磁気共鳴イメージング(MRI)、光学生物発光イメージング、光学蛍光イメージングおよびそれらの組み合わせが挙げられる。本発明によって包含される造影剤は、PET、SPECT、CT、MRIおよび光学イメージングについて当技術分野で公知の任意の分子、物質または化合物であり得る。造影剤は、放射性核種、放射性金属、陽電子放射体、β放射体、γ放射体、α放射体、常磁性金属イオンおよび超常磁性(supraparamagnetic)金属イオンであり得る。造影剤としては、限定されないが、ヨウ素、フッ素、銅、ジルコニウム、ルテチウム、アスタチン、イットリウム、ガリウム、インジウム、テクネチウム、ガドリニウム、ジスプロシウム、鉄、マンガン、バリウムおよび硫酸バリウムが挙げられる。本発明のナノ粒子に付加される造影剤として使用され得る放射性核種としては、限定されないが、89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124Iおよび177Luが挙げられる。
例えば、疾患のターゲティング処置の場合、治療剤が、蛍光ナノ粒子に付加され得る。治療剤は、疾患部位に高特異的または局所的に送達されて、その疾患部位で治療剤が放出され得る。あるいは、治療剤は放出されなくてもよい。リガンドとコンジュゲートされた蛍光ナノ粒子は、様々な系の所望の位置、例えば細胞もしくは細胞成分の上もしくは細胞もしくは細胞成分の内、生物(例えば、ヒト)の体内に、または血液脳関門を通じて治療剤をターゲティング送達するのに使用され得る。
被験体への本ナノ粒子の投与後において、ナノ粒子の血中滞留半減期は、約2時間〜約25時間、約3時間〜約20時間、約3時間〜約15時間、約4時間〜約10時間または約5時間〜約6時間の範囲であり得る。より長い血中滞留半減期は、より多くのナノ粒子がインビボで標的部位に蓄積することを可能にするより長い循環を意味する。血中滞留半減期は、以下のように評価され得る。最初に、ナノ粒子を被験体(例えば、マウス、ミニブタまたはヒト)に投与する。投与後の様々な時点において、血液サンプルを採取して、適切な方法によってナノ粒子の濃度を測定する。
本発明はさらに、本ナノ粒子を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な医薬単位剤形の形態で経口投与され得る。本発明の医薬組成物は、錠剤、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセル、水溶液、懸濁液およびリポソームならびに他の徐放製剤、例えば成形ポリマーゲルを含む多くの形態で調製され得る。
本発明はさらに、細胞の成分を検出するための方法であって、(a)シリカ系コア内に配置された蛍光化合物を含むシリカ系コア;前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル;前記ナノ粒子に結合した有機ポリマー;前記ナノ粒子に結合した約1〜約25個のリガンド((約1〜約20個のリガンドまたは約1〜約10個のリガンドまたは他の範囲;本明細書の議論を参照のこと);および前記ナノ粒子に結合した造影剤またはキレートを含む蛍光シリカ系ナノ粒子を前記細胞と接触させる工程;ならびに(b)少なくとも1つのイメージング技術によって、前記細胞または細胞成分に対する前記ナノ粒子の結合(および/またはその潜在的な細胞内摂取)をモニタリングする工程を含む方法を提供する。イメージング技術は、PET、SPECT、CT、MRI、生物発光イメージングまたは蛍光イメージングおよびそれらの組み合わせであり得る。
国際特許出願第PCT/US2008/074894号およびStoberら、Controlled growth of monodispersed silica spheres in the micron size range.Colloid Interface Sci.1968;26:62−69.Ohnishiら、J.Mol.Imaging 2005,4:172−181に開示されている十分に確立されたプロトコールにしたがって、近赤外発光色素(Cy−5)を含有するナノ粒子を合成し、PEG化によって官能化した。Cy5マレイミドを共反応性オルガノシラン化合物(3−メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(tromethoxysilane)と反応させて、蛍光シリカ前駆体を形成した。この蛍光シリカ前駆体をテトラエチルオルトシリケートと共縮合して、蛍光シリカ系コアを形成した。メトキシ末端ポリ(エチレングリコール)鎖(PEG、約0.5kDa)を有するPEG−シラン化合物メトキシ(ポリエチレンオキシ)プロピル]−トリメトキシシランを蛍光シリカ系コアに追加して、コア上にPEGコーティングを形成した。3500 MWCO Snakeskin Dialysis Membranesによって生理食塩水(H2O中、0.15M NaCl)に対してPEGコーティングナノ粒子を透析し、滅菌ろ過した。注射前に、すべてのサンプルをそれらのピーク吸収波長(640nm)で光学密度マッチングした。動的光散乱(DLS)および蛍光相関分光法(FCS)によって、流体力学的サイズの測定を達成した。簡潔に言えば、HeNeレーザー(λ=632.8nm)を使用して、Brookhaven Instruments Company 200SM static/DLS systemによって、水に対して透析した粒子を測定した。色素吸収が励起源とオーバーラップするために、15分間の積分時間を使用して、許容可能な信号対雑音比を達成した。FCSの場合、水に対して粒子を透析し、0.15M NaClに希釈し、Zeiss LSM 510 Confocor 2 FCS(HeNe633nm励起)によって測定した。すべての測定の前に、サイズについて機器を較正した。分子/粒子当たりの計数率として測定したFCS曲線から、遊離色素を有するPEG化ナノ粒子の相対輝度の比較を決定した。
約3nmの流体力学的半径を有する蛍光コア−シェルシリカナノ粒子を合成した。動的光散乱(DLS)の結果(図1a)に示されているように、これらのナノ粒子は、6〜10nmの直径範囲内であることが見出された。ヌードマウスにおける6nm〜3.3nmのベア(非PEGコーティング)シリカナノ粒子のインビボ全身NIR蛍光イメージングにより、注射45分後の腎クリアランスがかなりのものであり、有意な蓄積が肝臓に残っていることが示された(図1b)。その後の24時間の間に、腸肝循環への最終的な排出が起こった。これらの結果に基づいて、国際特許出願第PCT/US2008/074894号におけるプロトコールにしたがって、メトキシ末端ポリ(エチレングリコール)鎖(PEG、約0.5kDa)で粒子を共有結合的にコーティングしてオプソニン化を防止し、小さな流体力学的サイズを維持しながら、粒子のクリアランスをさらに増強した。NIR蛍光イメージングによれば、注射45分後において、この処理は肝臓保持を減少させ、膀胱への腎ろ過の増加をもたらし(図1c)、膀胱の蛍光は24時間まで可視的であった。プローブは耐容性良好であり、有害作用または動物の死亡は、研究過程で観察されなかった。124I標識PEGコーティングナノ粒子を注射した24時間後の連続コレジストレーションPET−CTイメージング(図1d、上段)により、少量の残存膀胱活性、および肝臓/消化管を覆う活性(中央)(独立して取得したマイクロCTおよびマイクロPETスキャンがその両側にある)が実証された。連続マイクロPET画像により、近赤外蛍光イメージングの結果が確認された。96時間にわたる血中放射能の時間依存性変化に基づいて、124I標識PEG化ナノ粒子の血中滞留半減期は、7.3時間であることが見出された。124I標識RGD結合ナノ粒子の場合、血中滞留半減期は5.6時間であることが見出された。
腫瘍マーカーανβ3インテグリンに対して高い親和性を有するマルチモーダル(光PET)ナノ粒子を合成するために、Cys−マレイミド結合を介して、環状RGDペンタペプチド(RGDYC)をナノ粒子にコンジュゲートした。続いて、チロシンリンカーYを使用して、放射標識を付加した。C6ラット神経膠腫細胞を雄性無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。直径約0.5cmで、ベアシリカナノ粒子(図4A)またはPEG化RGDナノ粒子(図4B、約500nm/kg)のいずれかを静脈内注射した。図4は、全身光学イメージングを使用した、非腫瘍担持マウスおよび腫瘍担持マウスにおけるインビボ生体内分布を示す。
本発明者らは、腎クリアランスに最適な粒径に正確に調整することができる構造を有する生体適合性材料シリカを利用した。本発明者らは、十分に特性決定されたインビボヒト黒色腫モデルにおける連続PETイメージング測定のために、小さなターゲティングペプチドおよび放射標識を粒子表面に付加し、カプセル化近赤外(NIR)色素およびマルチスケール光学蛍光イメージング方法を使用して、流入領域リンパ節およびリンパ管をマッピングした。Ballouら、Sentinel lymph node imaging using quantum dots in mouse tumor models.Bioconjugate Chem.18,389−396(2007).Kimら、Near−infrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping.Nat.Biotechnol.22,93−97(2003).Tanakaら、Image−guided oncologic surgery using invisible light:completed pre−clinical development for sentinel lymph node mapping.J Surg Oncol.13,1671−1681(2006)。毒性試験も実施し、ヒト正常臓器の放射線量を求めた。具体的には、本発明者らは、直径約7nmの近赤外(NIR)色素を含むコア−シェルシリカナノ粒子であって、PEG鎖でコーティングされており、少数(約6〜7個)のターゲティングペプチドおよび放射標識で表面官能化されたコア−シェルシリカナノ粒子を合成した。
cRGDY−PEGナノ粒子およびPEG−ナノ粒子の合成
以前に記載されているように、改変ストーバー型シリカ縮合によって、粒子を調製した。Wiesnerら、PEG−coated Core−shell Silica Nanoparticles and Mathods of Manufactire and Use,国際特許出願第PCT/US2008/74894号.Larsonら、Silica nanoparticle architecture determines radiative properties of encapsulated chromophores.Chem.Mater.20,2677−2684(2008).Bogushら、Preparation of Monodisperse Silica Particles:Control of Size and Mass Fraction.J.Non−Cryst.Solids,104,95−106(1988).Sadasivanら、Alcoholic Solvent Effect on Silica Synthesis−NMR and DLS Investigation.L Sol−Gel Sci.Technol.12,5−14(1998).Herzら、Large Stokes−Shift Fluorescent Silica Nanoparticles with Enhanced Emission over Free Dye for Single Excitation Multiplexing.Macromol Rapid Commun.30,1907−1910(2009)。放射性ヨウ素または安定ヨウ素部分の付加のために、チロシン残基をPEG鎖にコンジュゲートした。Hermanson,Bioconjugate Techniques,(Academic Press,London,ed.2,2008)。放射標識前に、すべてのサンプルをそれらのピーク吸収波長(640nm)で光学密度マッチングした。システイン−マレイミド結合を介してcRGDペプチドを官能化PEG鎖に付加し、粒子の絶対濃度およびcRGDペプチド用試薬の開始濃度のFCSベース測定を使用して、粒子に結合したcRGDペプチドの数を推定した。
水に対して透析した粒子を生理食塩水(H2O中、0.15M NaCl)に希釈し、HeNe633nm励起を使用してZeiss LSM 510 Confocor 2 FCSによって測定した。すべての測定の前に、サイズについて機器を較正した。拡散時間の差異を使用して、色素および粒子種の流体力学的サイズの変動を評価した。分子/粒子当たりの計数率を使用して、遊離色素およびPEGナノ粒子およびRGDY−PEGナノ粒子の相対輝度の比較を実施した。
IODOGEN法(Pierce,Rockford,IL)を使用して、cRGDY−PEGナノ粒子およびPEGナノ粒子の放射標識を実施した。Piatyszekら、Iodo−gen mediated radioiodination of nucleic acids.J.Anal.Biochem.172,356−359(1988)。ガンマ(γ)計測によって活性を測定し、バリアン蛍光光度計(励起650nm/発光680)を使用して蛍光を測定した。
RPMI1640培地/10%胎児BSA、2mM L−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン(Core Media Preparation Facility,Memorial Sloan Kettering Cancer Center,New York)中で、ヒト黒色腫M21およびM21変異体(M21−L、αν陰性)細胞株を維持した。Ml99培地/10%ウシ胎児血清、20μg/ml内皮細胞成長因子、50μg/mlヘパリン、ペニシリンおよびストレプトマイシン中で、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を培養した。
M21細胞に対する粒子の結合および特異性をアッセイするために、10μg/ml I型コラーゲン(BD Biosciences,Bedford,MA)のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で24ウェルプレートをコーティングし、インキュベート(37℃、30分間)した。M21細胞(細胞3.0〜4.0×105個/ウェル)をコンフルエントまで成長させ、RPMI1640培地/0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)で洗浄した。124I−cRGD−PEG−ナノ粒子(0〜4.0ng/ml)をウェルに追加し、細胞をインキュベート(25℃、4時間)し、RPMI1640培地/0.5%BSAで洗浄し、0.2M NaOHに溶解した。ヨウ素−124について較正した1480 Automatic Gamma Counter(Perkin Elmer)を使用して、放射能をアッセイした。1000倍過剰なcRGD(Peptides International,Louisville,KY)の存在下で、非特異的結合を決定した。結合データのスキャッチャードプロットを作成し、線形回帰分析(Microsoft Excel2007)を使用して分析して、受容体結合パラメータ(Kd、Bmax、IC50)を求めた。
競合結合研究および特異性研究で使用した最適値を用いたフローサイトメトリーを使用して、一定範囲のインキュベーション時間および粒子濃度について、M21細胞に対するcRGDY−PEG−ナノ粒子およびPEG−ナノ粒子の最大差次的結合を決定した。RPMI1640培地/0.5%BSAで細胞(細胞3.0×105個/ウェル)を洗浄し、0.25%トリプシン/EDTAを使用して剥離し、微小遠心管中でペレット化した(1400rpm、25℃で5分間)。ペレットをBD FACSFlow溶液(BD Biosciences,San Jose,CA)に再懸濁し、Cy5チャネルで分析して、粒子結合プローブの割合を決定した(FACSCalibur,Becton Dickinson,Mountain View,CA)。過剰なcRGDおよび/またはマウスモノクローナル抗ヒトインテグリンανβ3フルオレセイン結合抗体(Millipore,Temecula,CA)の存在下で、cRGDY−PEG−ナノ粒子(2.5ng/ml)をM21、M21LおよびHUVEC細胞と共にインキュベートした後に、競合結合研究をさらに実施し、フローサイトメトリーによって分析した。cRGDペプチドと比べたRGDY−PEGナノ粒子の効力を評価するために、抗接着アッセイを実施した。ビトロネクチンPBS溶液(5μg/ml)で96ウェルマイクロタイタープレートをコーティングし、続いて200μlのRPMI/0.5%BSA(1時間、37℃)でコーティングした。RPMI/0.1%BSA中で、細胞(3×104個/100μl/ウェル)を様々な濃度のcRGDY−PEG−ナノ粒子またはcRGDペプチドと共に4組でインキュベートし(30分間、25℃)、ビトロネクチンコーティングプレートに追加した(30分間、37℃)。RPMI/0.1%BSAでウェルを穏やかに洗浄して、非接着細胞を除去した;4%PFAで接着細胞を固定(20分間、25℃)し、光学密度を決定するためにメチレンブルーで染色(1時間、37℃)し、Tecan Safireプレートリーダー(λex=650nm、λem=680nm、バンド幅12nm)を使用して測定した。cRGDY−PEG−ドットのIC50値に対するcRGDペプチドの比として、多価性増大係数を計算した。Montetら、Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display.J Med Chem.49,6087−6093(2006)。
Institutional Animal Care and Use Committee of Memorial Sloan−Kettering Cancer Centerによって承認されたプロトコールにしたがって、および動物保護に関するNational Institutes of Healthガイドラインにしたがって、すべての動物実験を行った。甲状腺によって遊離放射性ヨウ素がインビボで取り込まれるのを阻止するためのヨウ化カリウム溶液を含有する水と共に、雄性無胸腺nu/nuマウス(6〜8週齢、Taconic Farms Inc,Hudson,NY)を用意し、他の場所10(elsewhere 10)で詳述されているようにHarlan Teklad Global Diet 2016を自由に摂取させた。M21またはM21L異種移植片を作製するために、等量の細胞(約5×106個/100μl)およびマトリゲルを異なるマウスの後肢に同時に皮下注射した。200mm3の平均腫瘍体積まで、キャリパーを用いて腫瘍サイズを定期的に測定した。
124I−cRGDY−PEG−ナノ粒子または124I−PEG−ナノ粒子(約20μCi/マウス)を静脈内注射した後、指定時間にマウス群を屠殺し、血液、腫瘍および臓器を採取し、計量し、124Iについて較正したシンチレーションγカウンターで計測することによって、時間依存性放射能濃度(%ID/g)(放射性崩壊について注射時に対して補正したもの)を測定した。各組織について得られた時間−放射能濃度データを減少単一指数関数に対してフィッティングして、関数のT1/2およびA、組織/臓器滞留半減期ならびにゼロ時間切片の値をそれぞれ決定した。
各組織について求めた時間−放射能関数を(放射性崩壊の効果を含めて)分析統合して、対応する累積放射能(すなわち、放射性崩壊の合計数)を求めた。次いで、このような放射線の局所吸収が完全であると仮定し、貫通放射線(すなわち、γ線)の寄与を無視して、非貫通放射線(陽電子)の124I平衡線量定数を累積放射能に乗じることによって、マウス臓器が吸収した124I線量を計算した。Eckermanら、Radionuclide Data and Decay Schemes,2nd ed.Reston,VA:Society of Nuclear Medicine;1989。マウスとヒト(70kg標準男性)との間の全体重および臓器重量の差異を調整することによって、マウス正常臓器の累積放射能をヒト正常臓器の累積放射能に変換した。Cristyら、Specific absorbed fractions of energy at various ages from internal photon sources(I−VII).Oak Ridge National Laboratory Report ORNL/TM−8381/V1−7.Springfield,VA:National Technical Information Service,Dept of Commerce;1987。計算したヒト正常臓器の累積放射能をOLINDA線量測定コンピュータプログラムに入力し、Medical Internal Dosimetry(MIRD)Committee of the Society of Nuclear Medicineの形式を使用して、標準男性臓器の吸収線量を計算した。Loevingerら、MIRD Primer for Absorbed Dose Calculations(Society of Nuclear Medicine,New York,1991).Stabinら、OLINDA/EXM:the second−generation personal computer software for internal dose assessment in nuclear medicine.J Nucl Med 46,1023−1027(2005)。
6群の雄性および雌性B6D2F1マウス(7週齢、Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)において、急性毒性試験を実施した。非標識ターゲティングプローブ(127I−RGDY−PEG−ナノ粒子)を処置群(n=雄6匹、n=雌6匹)に単回静脈内注射(200μl)し、非標識ヨウ化PEGナノ粒子(ビヒクル、127I−RGDY−PEG−ナノ粒子)を対照群(n=雄6匹、n=雌6匹)に単回静脈内注射(200μl)した。未処置対照(n=雄2匹、n=雌2匹)をさらに試験した。罹患率/死亡率および体重変化について、マウスを注射後14日間にわたって毎日観察し、血液学および血清化学評価のために、注射7〜14日後に解剖、組織病理学および血液採取を実施した(図10、表3)。
小動物専用PETスキャナー(Focus 120 microPET;Concorde Microsystems,Nashville,TN)を使用して、イメージングを実施した。スキャン期間全体において、酸素2L/分の2%イソフルラン麻酔下で、M21またはM21L後肢腫瘍担持マウスを維持した。すべてのマウスにおいて、200μCiの124I−cRGDY−PEG−ナノ粒子または124I−PEG−ナノ粒子を静脈内注射した際に、ワンアワーリストモードの取得を開始し、続いて96時間間隔で連続30分間の静止画像を得た。スキャナー応答の不均一性、デッドタイムカウント損失、ランダム数および物理的崩壊について、画像データを注射時に対して補正した。測定システムの較正係数を使用することによって、再構成画像のボクセル計数率を放射能濃度(%ID/g)に換算した。ASIProソフトウェア(Concorde Microsystems,Nashville,TN)を使用することによって、再構成画像の三次元関心領域(ROI)分析を実施して、腫瘍におけるプローブ取り込みの平均、最大およびSDを決定した。画像から求めた腫瘍%ID/g値を、γカウンターの筋肉%ID/g値で割ることによって、腫瘍対筋肉放射能濃度比を求めた。
等量50μlのcRGDY−PEG−ドットサンプルを使用して四分円的な腫瘍周囲投与によって、後肢腫瘍担持ヌードマウスに注射し、自由に歩き回らせた。30分〜1時間後、2%イソフルレン/98%酸素混合物でマウスを麻酔し、マウスの腹側面に沿って垂直に表面パラミヂン切開を行って、腫瘍と同側の後肢から腋窩までの領域を外科的に露出させた。650±20nm NIR励起および710nmロングパス発光フィルタを備える巨視的蛍光顕微鏡を使用して、局所所属リンパ節(すなわち、鼠径、腋窩)および流入領域リンパ節(腋窩領域を含む)のインサイチュー光学イメージングを実施した。全身光学画像(Cambridge Research Instruments Maestro imager)をさらに取得し、以前に報告されているようにスペクトルデコンボリューションした。Burnsら、Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine,Nano Letters 9,442−8(2009)。
ターゲティング/非ターゲティングプローブを投与した腫瘍マウス群またはM21/M21L腫瘍担持マウス群を比較する統計分析を、片側マン・ホイットニーU検定を使用して実施した(P<0.05を統計的に有意であるとみなす)。生体内分布研究の場合、124I−cRGDY−PEG−ナノ粒子(n=マウス7匹)または124I−PEG−ナノ粒子(対照、n=マウス5匹)の組織特異的な平均%ID/g値を各時点で比較したところ、血液、腫瘍および主要臓器では、注射24時間後だけではなく注射4時間後および96時間後においても、腫瘍および他の組織について、トレーサー活性の統計的有意差が観察された(表1)。腫瘍ターゲティング研究の場合、M21腫瘍マウス(n=7)とM21L腫瘍マウス(n=5)と対照プローブ投与マウス(n=5)との間の平均%ID/g値の差異は、注射4時間後に最大であり(両対照についてp=0.0015)、24時間(それぞれp=0.0015およびp=0.004)、48時間(それぞれp=0.001およびp=0.003)、72時間(それぞれp=0.015および0.005)および96時間(M21−M21Lについてp=0.005)の時点で依然として有意に上昇していることが見出された。124I−cRGDY−PEG−ナノ粒子(n=7)対124I−PEG−ナノ粒子(n=5)の腫瘍対筋肉比は、注射24時間後(p=0.001)および注射72時間後(p=0.006)では統計的に有意であるが、注射4時間後(p=.35)では統計的に有意ではないことが見出された。尿較正曲線(R2=0.973、p=0.01)について、ならびに尿(R2>0.95、p=0.047)および糞(R2>0.995、p<0.002)累積%ID排泄曲線について、非線形回帰分析(SigmaPlot,Systat,v.11.0)を使用して、適合度(R2)を関連p値と共に決定した。
ナノ粒子の設計および特性決定
以前に発表されているプロトコールにしたがって、メトキシ末端ポリエチレングリコール(PEG)鎖(PEG約0.5kDa)でコーティングしたCy5色素含有コア−シェルシリカナノ粒子(最大発光>650nm)を調製した。Burnsら、Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine,Nano Letters,9,442−8(2009).Owら、Bright and stable core−shell fluorescent silica nanoparticles.Nano Lett.5,113−117(2005)。中性PEGコーティングは、細網内皮系(オプソニン作用)によって非特異的取り込みを防止した。二官能性PEGを使用して、少数(粒子当たり約6〜7個)のανβ3インテグリンターゲティング環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(cRGDY)ペプチドリガンドを付加して、効率的な腎クリアランスを容易にする小さな流体力学的サイズを維持した。PETによって三次元的に定量イメージング可能なシグナルを得るために、チロシンリンカーを使用して、124Iでペプチドリガンドをさらに標識した(124I−cRGDY−PEG−ドット、図6A);比較的長命である124I(物理的半減期:4.2日間)の重要な実用的利点は、バックグラウンド活性の大部分を排除し、腫瘍対バックグラウンドのコントラストを最大化すると、最低でも投与後数日間にわたって放射性検出を可能にするのに十分なほど長く、十分なシグナルが持続することである。放射性薄層クロマトグラフィーによれば、放射標識ターゲティングナノ粒子の純度は>95%であった。FCS測定によれば、非放射標識ターゲティングナノ粒子の安定性は約1年間である。FCS分析によれば、粒子は尿中にそのまま排泄される。本明細書で使用される「ドット」および「ナノ粒子」は、互換的に使用される。124I標識のためのチロシン残基を含有するPEGコーティング粒子は、対照プローブ(124I−PEG−ドット)の役割を果たした。サイズ排除クロマトグラフィーによる放射標識サンプルの精製(図7)は、>95%の放射化学的収率をもたらした。非放射性cRGDY−PEGドットおよびPEG−ドットについて、蛍光相関分光法(FCS)(図6Bおよび6C)によって、直径約7nmの流体力学的直径を測定した。以前の結果と一致して、cRGDY−PEGドットの相対輝度は、遊離色素のものよりも平均200%大きいと決定した(図6C)。Burnsら、Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine,Nano Letters,9,442−8(2009).Larsonら、Silica nanoparticle architecture determines radiative properties of encapsulated chromophores.Chem.Mater.20,2677−2684(2008)。これらの物理化学的特性に基づいて、本発明者らは、ターゲティング粒子の選択的腫瘍取り込みおよび保持と腎クリアランスとの良好なバランスを達成することにより、正常組織の毒性および放射線量を最小化しながら、標的組織の局在化が最大化されると予想した。
腫瘍および血管内皮表面に対する124I−cRGDY−PEG−ドットおよび124I−PEGドットのインビトロ結合親和性および特異性を調べるために、ανβ3インテグリン過剰発現黒色腫細胞株(M21)およびανβ3インテグリン非発現黒色腫細胞株(M21L)およびヒト臍帯静脈内皮細胞株(HUVEC)を使用した。フローサイトメトリーを使用したところ、一定範囲の粒子濃度(0〜8ng/ml)およびインキュベーション時間(最大約5時間)で、cRGDY−PEG−ドットの高特異的な線形飽和結合が観察され、4時間および約2.0ng/mlの粒子濃度において、差次的結合が最大であった(データは示さず)。最初に、M21細胞を過剰な非放射標識cRGDと共にインキュベートし、次いで、様々な濃度の放射標識ターゲティングプローブを追加した後、γ計測法を使用して、124I−cRGDY−PEGドットの受容体結合特異性を試験した(図8A)。結合データのスキャッチャード分析により、0.51nMの解離平衡定数Kd(図8A、挿入図)および2.5pMの受容体濃度Bmaxが得られた。Bmax値に基づいて、ανβ3インテグリン受容体密度は、M21細胞当たり1.0×104であると推定したが、これは、この細胞株について以前に発表された推定値5.6×104と合理的に一致する。Cressmanら、Binding and uptake of RGD−containing ligands to cellular ανβ3 integrins.Int J Pept Res Ther.15,49−59(2009)。インテグリン特異的なM21細胞取り込みの増加は4〜37℃の温度範囲でも観察されたが、これは、受容体媒介性の細胞インターナリゼーションが全体的な取り込みに寄与していたことを示唆している(データは示さず)。ターゲティングプローブを使用したさらなる競合結合研究では、抗ανβ3インテグリン抗体によって受容体媒介性結合が完全に遮断されることがフローサイトメトリーにより示された(図8B)。過剰なcRGDYまたは抗体ανβ3インテグリン抗体のいずれかを使用したところ、M21L細胞と結合(M21の約10%)した受容体の程度に関して、有意な減少は見られなかった(図8C)。さらなるγ計測研究によってこれらの結果を確認し、124I−cRGDY−PEG−ドットについて、50%結合阻害濃度IC50が1.2nMであると決定した。抗接着アッセイおよびM21細胞を使用して、単量体cRGDペプチドに対するcRGDY−PEG−ドットの関連する多価性増大係数が2.0超であることが見出された(データは示さず)。Montetら、Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display.J Med Chem.49,6087−6093(2006).Liら、64Cu−labeled tetrameric and octomeric RGD peptides for small−animal PET of tumorανβ3integrin expression.J.Nucl Med.48,1162−1171(2007)。フローサイトメトリーによれば、M21細胞と同様に、過剰な抗体は、HUVEC細胞に対するcRGDY−PEG−ドット受容体結合を有効に遮断した(図8D)。
微量(約0.2ナノモル)の124I−cRGDY−PEGドットおよび124I−PEG−ドットをM21腫瘍異種移植マウスモデルに静脈内投与することによって、時間依存生体内分布ならびに腎クリアランスおよび肝胆道クリアランスを評価した(図9)。ターゲティングプローブの組織放射能濃度(1グラム当たりの注射用量の割合(%ID/g))を注射後(p.i.)196時間の時間間隔で測定したが、124I−cRGDY−PEGドット(図9A)および124I−PEG−ドットトレーサー(図9B)の比較は、後者のデータが1週間の時点で得られなかったので、96時間の時間枠に制限した。トレーサー活性の統計的有意差(p<0.05)は、血液、腫瘍および主要臓器では注射4時間後および注射96時間後に観察され、腫瘍およびいくつかの他の組織では注射24時間後に観察された(表1)。注射1週間後において、ターゲティングプローブは、死体からほぼ完全に排除された(約3%ID)。これらのトレーサーの血液、腫瘍および主要臓器の滞留半減期(T1/2)を表2に示す(カラム2および5)。代表的なデータセット(血中滞留)を図9Aの挿入図に示す。124I−PEG−ドットについて、7.3±1.2時間の比較的長い血中T1/2値を決定した。124I−cRGDY−PEG−ドットを合成するためにcRGDYペプチドを付加すると、T1/2値は5.6±0.15時間にわずかに減少したが、プローブのバイオアベイラビリティがより大きくなった(表2、カラム3)。124I−cRGDY−PEG−ドットの腫瘍T1/2値は、血液のものよりも約13倍大きいのに対して、124I−PEG−ドットではわずか5倍の違いであることが見出された(表2、カラム2および5)。
M21およびM21L皮下後肢異種移植マウスモデルにおけるインテグリン発現のPETイメージングを、124I−cRGDY−PEG−ドットまたは124I−PEG−ドット(対照)の注射後の複数の時点で実施した。注射4時間後(左:M21腫瘍;中央:M21L腫瘍)および24時間後(右:M21腫瘍)における代表的な全身冠状方向マイクロPET画像を図11Aに示す。ανβ3インテグリン過剰発現M21腫瘍の特異的ターゲティングは、これらの画像から明確に目に見える。ターゲティング124I−cRGDY−PEG−ドットを投与したM21(n=7)およびM21L(対照)腫瘍(n=5)群について、ならびに非ターゲティング124I−PEG−ドットトレーサーを投与したM21腫瘍マウス(n=5)について、平均腫瘍%ID/gおよび標準偏差を示す(図11B)。最大腫瘍取り込み(注射約4時間後)の時点において、M21腫瘍では、対照に対して3倍の放射能濃度の増加(%ID/g単位)が見られた。1時間の時点(p=0.27)を除く注射後のすべての時点(p<0.05)において、差異は統計的に有意であった。
本発明者らは、局所/所属リンパ節およびリンパ管をマッピングして上記制限を克服するために、本発明者らの小さなターゲティングナノ粒子を使用して、インビボ蛍光イメージング研究を実施した。重要なことに、本発明者らのターゲティング粒子プローブのマルチモーダル性および小サイズを利用して、四分円的腫瘍周囲投与後の本発明者らの黒色腫モデルにおける一定範囲のリンパ節サイズおよびリンパ枝を可視化し、術中ヒトセンチネルリンパ節マッピング手順をシミュレートすることができる。最初に、ターゲティング粒子プローブまたは非ターゲティング粒子プローブのいずれかを使用して、無傷のマウスにおいて、連続NIR蛍光顕微鏡検査を4時間にわたって実施した。ターゲティングプローブの腫瘍周囲投与により、この間隔にわたる、隣接する鼠径リンパ節および膝窩リンパ節への排液およびそれらの持続的な可視化が明らかになったが、リンパ節およびリンパ管がより小さくおよび/またはより多いほど、可視化がより困難であった。対照的に、非ターゲティングプローブは、局所リンパ節のより短期的(約1時間)な可視化をもたらし、観察された蛍光シグナルは徐々に弱くなった(データは示さず)。外科的な露出により、この観察結果は、ターゲティングプローブで観察された長期保持と比較してより迅速な腫瘍部位からの粒子拡散の結果であることが見出された。
本発明者らは、腫瘍選択的ターゲティングおよびリンパ節マッピングのための、効率的に排出される非毒性かつ高親和性なシリカナノ粒子であって、他の粒子技術に関連する多くの現在の課題に対処するのに成功したシリカナノ粒子について報告する。これは、その好ましい特性に基づいて、複合光学−PETプローブとして臨床的に解釈可能であると言うことができる最初のターゲティングナノ粒子である。このマルチモーダルプローブの相補的性質は、その小さなサイズ(直径約7nm)と結び付いており、異なる空間スケール、時間スケールおよび感度スケールで取得された画像データのシームレスな統合を可能にすることによって臨床的評価を容易にすることができ、腫瘍生物学を支配する基本的な分子プロセスについての新たな洞察を提供する可能性がある。
システイン末端官能性を有するcRGDペプチド(Peptides International)を、チオール−マレイミド結合を介してPEG化ナノ粒子に付加する。場合により、合成ペプチドリガンドEPPT1によって、ナノ粒子をさらに官能化し得る。粒径、サイズ分布およびフォトブリーチングに基づいて、ナノ粒子を特性決定する。
粒子当たりの光物理的特性を評価するために、分光測光法、分光蛍光分析および多光子蛍光相関分光法(FCS)を使用して、粒径、輝度およびサイズ分布を決定する。走査電子顕微鏡検査および動的光散乱(DLS)測定によって、サイズデータを確認する。Owら、Bright and stable core−shell fluorescent silica nanoparticles.Nano Letters 2005;5,113。アルカリ条件下で、ビウレット分光光度法(λ=450nm、最大吸光度)によって、ナノ粒子当たりのRGDペプチドの平均数、および官能化PEG基に対するRGDのカップリング効率を比色分析で評価する。
甲状腺癌および扁平上皮癌(SCC)細胞株におけるανβ3インテグリンおよびuMUC1発現パターンを、抗インテグリンおよび抗uMUC1抗体を使用して、公知のανβ3インテグリン陰性およびανβ3インテグリン陽性(それぞれM21−LおよびM21ヒト黒色腫細胞株)ならびにuMUC1陰性およびuMUC1陽性(それぞれU8728、H−29細胞株)対照に対して評価する。RGD−ナノ粒子およびRGD−EPPT−ナノ粒子を用いた差次的結合研究ならびにインビボイメージングのために、ανβ3インテグリンおよび/またはMUC1を高発現する細胞株を選択する。
ハイスループット診断スクリーニングツールとして光学NIRFイメージングを使用して、感度および時間分解能の増加と共に徐々に官能化したナノ粒子コンジュゲートのインビボにおける生体内分布の相対的差異を評価し得る。腫瘍特異的ターゲティングに関する半定量的データも得ることができる。PETを使用して生体内分布および腫瘍特異的ターゲティングをさらに詳細に定量するために、これらの予備的研究は、目的のマーカーを強く発現する細胞株の選択を容易にする。
これらのシステムは、一般に、手術室で使用するには非常に煩雑かつ高価であるか、または必要な視野もしくは組織コントラストを提供することができない場合があるので、現時点では、リンパ節群のリアルタイム術中スキャンを部分的に達成することができない。さらに、フルオロフォアを含有する臨床的に有望かつ生体安定な薬剤であって、拡大リンパ節マッピング/切除手順のために、組織コントラストを増強するのに利用可能な、親色素よりも改善された光物理的特徴およびより長い循環寿命を提供する薬剤は存在しない。この動物研究では、本発明者らは、マルチモーダル粒子プローブおよびリアルタイム分子イメージングデバイス技術の両方の進歩を様々な将来のヒト臨床試験に容易につなげることができることを示す。このような形成的技術は、転移性SLNの検出を容易にし、隣接生体構造からのリンパ節の正確な描写を可能にして、重要な構造に対する損傷リスクを最小化するための最先端のターゲティング可視化ツールを提供することによって、標準的な術中がん治療に大きな影響を与え得る。利点としては、頭頸部における結節性疾患拡大および腫瘍範囲に関する長期のリアルタイムインビボ術中マッピングが挙げられる。PETによって深リンパ節をマッピングすることができる一方、NIR蛍光イメージングによって、表面リンパ節の正確かつ詳細な局在性を得ることができる。小サイズの粒子プローブはまた、高感度に検出可能なリンパ節の下限を拡大することができる。提案した非毒性マルチモーダルプラットフォームの正味の効果は、複合的な診断/処置手順の適用と共に、致死率が高いこの疾患の病期分類、予後および臨床転帰に重要な意味を持つ。
全身18F−フルオロデオキシグルコース(18F−FDG)PET−CTスキャンにより、動物の右側後方の頸部の単一リンパ節だけではなく背中上部の脊椎に隣接する原発性黒色腫病変が明らかになったが、これらはFDG−avidであり、転移性疾患が疑われた。124I−RGD−PEG−ドットを腫瘍部位付近に四分円的に皮下注射した後に、この知見を確認し、2つ以上の代謝亢進リンパ節および流入領域リンパ管を同定した。最終スキャンの解釈は、3つの潜在的な転移性リンパ節を示した。ハンドヘルドPETプローブが、センチネルリンパ節の位置における計数率の上昇を同定および確認した後に、頸部の他のリンパ節群からの原発性病変、代謝亢進リンパ節および組織の外科的切除を実施した。組織学的分析によれば、切除した右後部センチネルリンパ節組織で測定された斑点状の蛍光シグナルは、黒色腫転移の部位と相関していた。すべての代謝亢進リンパ節試料を黒色に着色したところ、黒色腫細胞の明確なクラスタの存在と相関することが見出された。したがって、他の公知の黒色腫マーカーのH&E染色病理学に供した外科的に切除した組織の結果により、マルチモーダルイメージングの知見が裏付けられた。
マルチモダリティ(PET−NIRF)診断イメージング実験のために、ナノ粒子表面上のターゲティングペプチドおよび放射標識を交換して、標的特異性、親和性/アビディティおよび検出感度を決定する。続いて、MC1Rを発現する黒色腫細胞を標的殺傷するための治療放射標識(ルテチウム−177、177Lu、t1/2=6.65日間)を使用して、治療粒子も合成する。複合的な定量PETおよび光学イメージングの知見を、空間スケールで腫瘍組織オートラジオグラフィーおよび光学イメージングと相関させる。細胞顕微鏡検査の場合、複合反射率蛍光イメージングのためのインビボ共焦点蛍光スキャナーを使用する。
131I−RGDナノ粒子を用いた用量漸増試験を実施し、18F−FDG PETを使用して、処置応答を6週間にわたって週1回モニタリングする。プラナーガンマカメライメージングを使用して、ナノプラットフォームの時間依存性腫瘍取り込みおよび線量測定を実施する。インビボイメージングデータを、切除腫瘍試料のγ計測と相関させる。
ターゲティングペプチド、および高比活性放射標識と結合する大環状キレートとPEG化ナノ粒子をコンジュゲートする。
(A)64Cuを用いた標準的な同位体希釈アッセイによって、ナノ粒子当たりのDOTAキレートの平均数を決定する。簡潔に言えば、既知量のReCCMSH(Arg11)−ナノ粒子を含有する溶液に64Cuを追加する。インキュベートした溶液をシリカゲルコーティングガラスプレート上にスポットし、1:1 10%酢酸アンモニウム−メタノール(EDTAを含む)中で現像し、ラジオTLCによって分析する。64Cu標識ReCCMSH(Arg11)−ナノ粒子は発生部位に留まるが、EDTAに結合した64Cuは移動する。反応混合物に追加した64Cuの総ナノモルに対して、%標識効率をプロットする。この曲線の変曲点から、ナノ粒子当たりの結合したキレートの数を決定し得る。
リガンド(例えば、ペプチド)および造影剤(例えば、放射性核種)のその後のコンジュゲーションのための汎用官能基を含有するナノ粒子の合成
高比活性放射標識に適切なナノ粒子−ペプチド−キレート構築物を合成するために、「クリックケミストリー」アプローチを使用して、ナノ粒子表面を官能化し得る(図17)。この方法は、銅触媒による、三重結合へのアジドの付加環化に基づくものである。このようなアプローチは、マルチモダリティ用途を調べるための大きな汎用性を可能にするであろう。
本研究の目的は、本ナノ粒子の結合およびインターナリゼーションを評価して、細胞内小臓器およびエキソサイトーシスにおけるそれらの局在性を評価することである。これは、異なるターゲティング部分と、結合した治療薬とを有する官能化粒子の運命を研究するのに役立つ。例えば、診断ナノ粒子(例えば、非ターゲティングPEGコーティングナノ粒子対cRGD−PEGコーティングナノ粒子)および治療ナノ粒子(例えば、放射線治療のためのヨウ素が結合したcRGD−PEG−ナノ粒子、チロシンキナーゼ阻害剤が結合したcRGD−PEG−ナノ粒子、またはタキソールなどの化学療法薬が結合したcRGD−PEG−ナノ粒子)の両方。
インターナリゼーション/取り込み研究。特異的取り込み経路を同定するために、インターナリゼーションアッセイおよび共局在研究を実施した。
M21およびB16細胞では、cRGD−PEG−ドットおよびPEG−ドットはLysotracker Redと共局在することが見出されたが、これは、エンドソーム経路での取り込みを示唆している(図22)。データにより、これらの粒子は、トランスフェリンおよびデキストランと強く共局在することが示された。表面の機能性および全電荷に関係なく、研究したナノ粒子(流体力学的直径6〜7nm)は同じ経路を進むように思われた。両方の細胞型におけるタイムラプスイメージングにより、官能化ナノ粒子は、ほんの一部のプレートした細胞内にインターナリゼーションしたことが実証された。粒子は、核周辺領域の小胞構造に最終的に送達された。Giantin(またはGM−130)を用いた共局在化アッセイは、ゴルジ体におけるナノ粒子の蛍光シグナルを示すとは予想されない。
画像誘導術中SLNマッピングのためのデュアルモダリティシリカナノ粒子
排液腫瘍リンパ管およびリンパ節転移のリアルタイム評価、ならびに腫瘍負荷の評価を実施するために、γプローブを使用した放射性検出と共にポータブルArteMIS(商標)蛍光カメラシステムを使用する光学イメージングに、これらの研究を拡大した。代表的なミニブタ(図23a〜23i)において、上記イメージング手順を使用して、18F−FDGおよび124I−cRGDY−PEG−Cドットを使用して、最初の術前PET−CTスキャンを実施した。軸方向CT画像により、対応する18F−FDG PETスキャン(図23c、23d)における活性増加領域として見られた原発性骨盤腫瘍(図23a)および流入領域SLN(図23b)が明らかになった。粒子トレーサーを腫瘍部位付近に四分円的に皮下注射した約5分後の動的PET−CTイメージングによって、これらの知見が2日後に裏付けられた;コレジストレーション軸方向像(図23e、23g)および冠状方向像(矢印、23f、23h)は、これらの知見を実証する。術前スキャン後に、SLN部位を覆う皮膚を術中局在化のためにマーキングし、ミニブタを手術室に運んだ。ポータブルγプローブを使用した、原発性腫瘍およびSLN部位のベースライン活性測定(図23i)により、SLN内の活性がバックグラウンドシグナルと比べて20倍増加していることが示された。
リンパ節転移は、黒色腫の転帰の強力な転帰予測因子である。SLNマッピングを使用した所属リンパ節における微小転移の早期検出は、患者を適切な処置群に適時に層別化することを可能にし得、患者の転帰を潜在的に改善し得る。現在の標準治療SLNマッピングおよび生検技術は、放射能ベースのSLN同定の使用に依拠しているが、この技術には多くの制限が存在する。これらとしては、低い空間分解能、病期分類精度の低下、標的特異性の欠如、手術野を遮ぎ得る遅いトレーサークリアランス、およびSLNに近接する重要な構造の損傷を防止するための正確な術中可視化の欠如が挙げられる。
HuJ591−F(ab’)2断片を有するマルチモーダルナノ粒子は、前立腺特異的膜抗原(PSMA)に結合するための新規診断プローブである。クリアランスおよび取り込みは、抗体それ自体よりも粒子の速度論的挙動によって支配されるので、複数のF(ab’)2断片を有する粒子を合成することによって、本発明者らは、(1)多価効果による結合親和性/効力を増強し、(2)インビボ分布を変化させ得る。直径10nmの腎カットオフ以下に粒径を維持することによって、腎クリアランスを促進する。さらに、(1)および(2)の改善により、標的対バックグラウンド比が増加して、診断特異性および疾患分類が潜在的に改善される。
ナノ材料(特に、ナノ粒子プローブ)は、ユニークな物理化学的特性および生物学的特性だけではなく表面多様性も有する。その表面多様性を利用することによって、重要ながん標的を認識して位置決定する分子マーカーを用いて、生体適合性多官能性粒子を選択的に改変し得る。原発性腫瘍部位付近の局所/局部疾患の拡大のリアルタイムターゲティング検出を改善して処置を容易にし得る、よりロバストな光学的に駆動される多官能性粒子プローブの必要性は、手術場面でますます重要となっている。術中場面における重要な神経および/または血管構造の疾患のリアルタイム描写も最重要である。Duncan,R,The dawning era of polymer therapeutics,Nat Rev Drug Discov 2,347−360(2003).Wagnerら、The emerging nanomedicine landscape,Nat Biotechnol 24,1211−1217(2006).Scheinbergら、Conscripts of the infinite armada:systemic cancer therapy using nanomaterials,Nat Rev Clin Oncol 7,266−276(2010).Miyataら、Polymeric micelles for nano−scale drug delivery,React.Func.Polym.71,227−234(2011).Leeら、Multifunctional mesoporous silica nanocomposite nanoparticles for theranostic applications,Acc Chem Res 44,893−902(2011).Schroederら、Treating metastatic cancer with nanotechnology,Nat Rev Cancer 12,39−50(2012).Rosenholmら、Nanoparticles in targeted cancer therapy:mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage,Nanomedicine(Lond)7,111−120(2012).Ashleyら、The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle−supported lipid bilayers,Nat Mater 10,389−397(2011).Vivero−Escotoら、Silica−based nanoprobes for biomedical imaging and theranostic applications,Chem Soc Rev 41,2673−2685(2012).Tadaら、In vivo real−time tracking of single quantum dots conjugated with monoclonal anti−HER2 antibody in tumors of mice,Cancer Res 67,1138−1144(2007)。しかし、粒子のこれまでの幅広い発展にもかかわらず、標的化多官能性プラットフォーム技術として臨床解釈に成功した無機蛍光粒子イメージングプローブはない。Altinogluら、Near−infrared emitting fluorophore−doped calcium phosphate nanoparticles for in vivo imaging of human breast cancer,ACS Nano 2,2075−2084(2008).Hilderbrandら、Near−infrared fluorescence:application to in vivo molecular imaging,Curr Opin Chem Biol 14,71−79(2010).Choiら、Design considerations for tumour−targeted nanoparticles,Nat Nanotechnol 5,42−47(2010).Heら、Near−infrared fluorescent nanoprobes for cancer molecular imaging:status and challenges,Trends Mol Med 16,574−583(2010)。
cRGDY−PEG−C−ドットの合成および特性決定。有機色素Cy5を含むPEG化cRGDY(Peptides International,Louisville KY)表面官能化蛍光コア−シェルシリカナノ粒子(cRGDY−PEG−C−ドット)の合成および特性決定に関する詳細については、この種の過去の刊行物およびそこで引用されている参考文献を参照のこと。Benezra,Mら、Multimodal silica nanoparticles are effective cancer−targeted probes in a model of human melanoma,J Clin Invest,121,2768−2780(2011)。簡潔に言えば、改変ストーバー型シリカ縮合によって、粒子を調製した。Bogushら、Preparation of monodisperse silica particles:Control of size and mass fraction,J Non−Cryst Solids,104,95−106(1988).Herzら、Large stokes−shift fluorescent silica nanoparticles with enhanced emission over free dye for single excitation multiplexing,Macromol Rapid Commun,30,1907−1910(2009).Sadasivanら、Alcoholic solvent effect on silica synthesis−NMR and DLS investigation,J Sol−Gel Sci Technol,12,5−14(1998)。シリカ表面への付加のために、およびペプチド結合のために、シランで二官能性PEGを誘導体化した。配列シクロ−(Arg−Gly−Asp−Tyr)を含有し、システイン残基を有するcRGDYペプチド(Peptide International)を、システイン−マレイミド結合を介して官能化PEG鎖に付加した。HeNe633nm励起を使用してZeiss LSM 510 Confocor 2 FCSによって、cRGDY−PEG−Cドットの流体力学的半径、輝度および濃度を、遊離Cy5色素と比べて分析した。
ナノ粒子コンジュゲーションに使用したN−Ac−Cys−(Ahx)2−D−Lys−ReCCMSH(またはαMSH)ペプチドは、図32に示されている構造を有する。N末端システインのチオール基を介して、それをナノ粒子に付加する。2つのアミノヘキサン酸ユニットのスペーサーが、ナノ粒子の付加点をD−Lys−ReCCMSHターゲティング分子から分離する。元のReCCMSHターゲティング分子を図33に示す。それは、イメージングおよび治療のために、放射性核種を黒色腫腫瘍にターゲティングするように設計されたものである。このMSHペプチド類似体を、99mTcもしくは188Re(Reの部位で)で直接放射標識することもできるし、または金属キレート剤を介してアミノ末端に付加することもできる。
インテグリンシグナル伝達は、腫瘍細胞における多様な機能(接着/伸展、遊走、浸潤、増殖および生存を含む)を調節する。黒色腫を含むいくつかの腫瘍型では、特定のインテグリンの発現が疾患進行の増大および患者生存の減少と相関する。インテグリン媒介接着相互作用は、細胞生存機構および分岐シグナル伝達経路の活性化における新規インテグリン機能を同定した。RGD配列を含有するペプチド(またはペプチドのクラスタ)がインテグリン受容体に結合すると、インテグリンが架橋またはクラスタリングされて、それにより今度は上記のプロセスが調節されることが周知である。しかしながら、このようなインテグリンシグナル伝達イベントは、複数の粒子ベース要因(サイズ、電荷、組成、表面化学、リガンド数/種類)、腫瘍(または内皮)細胞型、細胞受容体密度および粒子投与への複雑な依存関係を反映するものであるため、複数のRGDペプチドリガンドを有するナノ粒子がこのようなインテグリンシグナル伝達イベントを誘発し得るかについては不明である。本発明者らの用量応答研究は、細胞を100nM超の粒子濃度に曝露すると分岐シグナル伝達経路が適度に活性化されて、それにより今度はM21およびHUVEC細胞の遊走、増殖活性が促進され、接着特性が変化することを実証する。
ανβ3インテグリン受容体は、血管リモデリングおよび血管新生において重要な役割を果たすが、これは、様々な腫瘍細胞株について、内皮細胞および腫瘍細胞の表面上で発現が増加していることを実証している。このことが、この受容体を診断および治療目的の標的として使用することにつながる。本発明者らの場合、濃度および時間に応じた、黒色腫細胞(M21)またはヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)に対する結合能について、cRGDY−PEG−Cドットを試験した。最初の用量応答研究では、フローサイトメトリーによって、M21およびHUVEC細胞に対するcRGDY−PEG−Cドットの結合が、濃度に応じて進行的に増加することが示された(図39、図47A)。粒子の結合は、両方の細胞株について約100nMの飽和度を示し、平均%ゲート値はM21細胞では約80%であり、HUVEC細胞では96%であった。100nM cRGDY−PEG−Cドットと共にインキュベートした後に、両方の細胞型について、粒子のインキュベーション時間に応じた用量−応答挙動をさらに調査した。インキュベーションの2時間後に最大結合が観察され、その後は比較的一定であった(図47B)。
M21細胞におけるインキュベーション後にcRGDY−PEG−C−ドットが利用する経路の性質(これが、ανβ3インテグリン受容体媒介性および/または非特異的取り込みプロセスであるか)を解明するために、本発明者らは、3つの温度(4℃、25℃および37℃)において、4時間のインキュベーション時間の間のこれらの粒子の温度依存性取り込みを調べた。図39A、Cに要約されている結果は、試験した両方の細胞株において、37℃では、細胞結合cRGDY−PEG−C−ドットが25℃または4℃と比較して増加していることを示している。また、M21およびHUVEC細胞(図39A、39C)において、ανβ3受容体に対する過剰な(250倍)抗体の存在下では、cRGDY−PEG−C−ドットのインターナリゼーションが部分的に遮断されたが、これは、受容体媒介性結合の構成要素を示唆している。加えて、それぞれ37℃および25℃(図39B)の両方において、ανβ3陰性M21L細胞における取り込みは、ανβ3発現細胞で見られるものよりも約4〜8倍低かった。
過剰(50倍〜100倍)なcRGDYペプチドを使用し、放射標識粒子トレーサー(124I−PEG−cRGDY−Cドット)をγ計測した競合結合アッセイにより、M21およびHUVEC細胞における受容体媒介性粒子結合(図48A)が、前者では80%〜85%遮断され、後者では30%〜40%遮断されたことが示された。cRGDY−PEG−Cドットとは対照的に、非ターゲティング(すなわち、PEG−Cドット)粒子プローブと共にインキュベートした後に、M21(約30%〜43%)およびHUVEC(約13%〜27%)細胞における受容体結合の規模の有意な減少がフローサイトメトリーによって見られた(図48B)。
cRGDY−PEG−Cドットが細胞の生存および増殖に悪影響を与えなかったことを実証するために、37℃の血清補充培地(2%、10%FBS)中で、G0/G1期同期化M21およびHUVEC細胞を一定範囲の粒子濃度(25〜200nM cRGDY−PEG−Cドット;15分間または24時間)およびインキュベーション時間(0〜93時間)に曝露し、光プレートリーダー(λ=440nm)を使用して吸光度の時間依存性変化を測定した。対照(すなわち、血清補充培地)と比べて、吸光度の測定値は、試験した前記粒子濃度範囲で比較的一定であることが認められたが、これは、細胞生存の有意な減少がないことを示唆している(図49A、49B)。さらに、100nM cRGDY−PEG−CドットをM21およびHUVEC細胞に複数回(n=5)追加した後に、吸光度の時間依存性減少は見られなかったが、これは、細胞の増殖特性に変化がないことを示唆している(図49C、49D)。
ανβ3インテグリン受容体に対するリガンドの結合は、シグナル伝達経路を開始することが公知である。結合するとインテグリンのクラスタリングが起こり、チロシン397(これは、Srcファミリーキナーゼの結合部位である)における非受容体キナーゼFAKの自己リン酸化につながる。Srcキナーゼが動員されると、カルボキシル末端領域において、FAKのチロシン576/577およびFAKのチロシン925がリン酸化される。チロシン397におけるFAKのリン酸化はまた、Raf/MEK/Erkおよびホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)/AKT経路(AKT、mTOR、S6K)の活性化を誘導する多数のシグナル伝達カスケードおよび下流経路の中間体(例えばRas−マイトジェン活性化タンパク質(MAPK)シグナル伝達)を活性化することが公知である(図40A)。
多くの種類の腫瘍および血管新生細胞上で高発現しているανβ3インテグリン受容体は、細胞遊走、接着、増殖、浸潤および血管新生を含む多数の下流生物学的プロセスを調節することが公知である。以下の実験において、本発明者らは、cRGDY−PEG−CドットがM21およびHUVEC細胞の遊走を変化させるかを決定しようとした。最初の実験セットでは、96時間にわたって3つの漸増粒子濃度(0nM〜400nM;37℃)でタイムラプスイメージングを使用して、平均面積閉鎖に反映されるM21細胞の遊走の時間依存性変化を調べた(図42A、i〜xx)。ベースライン値(t=0)に対する割合として、平均面積閉鎖の統計的に有意な増加が96時間にわたって観察され、使用した粒子濃度範囲(すなわち、約87%〜約92%)(図42A、B)では、対照サンプル(73%;p<0.05)と比較して比較的一定であった。それよりも早い時間間隔では、有意な変化は見られなかった(図42B)。
RGDトリペプチドは、細胞外マトリックスの構成要素であるフィブロネクチンおよびビトロネクチンの成分であることが公知である。細胞をフィブロネクチンコーティングウェルに移した後、400nM cRGDY−PEG−Cドットおよびフィブロネクチンの有無の下でプレインキュベート(25℃、30分間)したM21細胞(細胞104個/ウェル)を使用して、競合結合アッセイを実施した。cRGDY−PEG−Cドットと共にプレインキュベートしなかった細胞の約60%は、最初の30分位内にフィブロネクチンでコーティングプレート上に付着して伸展した。対照的に、400nM cRGDY−PEG−Cドットと共にプレインキュベートしたM21細胞のごく一部(15%)は、播種の120分後であっても、フィブロネクチンコーティングウェル上に付着して伸展した(図45A、45B)。2時間の期間にわたる「細長い」細胞(伸展細胞)対「円形の」細胞の平均細胞数により、粒子の非存在下(すなわち、対照条件)では、細胞の大部分において伸展細胞(「細長い」細胞)が観察されたが、粒子に曝露した細胞の場合には、主に「円形の」外観が認められたことが明らかになった(図45A)。これらの結果をそれぞれ図45Bおよび45Cにグラフで示す。メチレンブルーを追加した後の細胞の光学密度(吸光度)の定量により、フィブロネクチン上に付着して伸展した細胞(すなわち、粒子のプレインキュベーションなし)は、粒子に曝露されていない細胞よりも2倍多くのメチレンブルーを取り込んだことが明らかになった(図45D)。本発明者らは、ビトロネクチンコーティングウェルを使用した場合に同じ現象を観察した(データは示さず)。要するに、これらのデータは、cRGDY−PEG−C−ドットが、M21およびHUVEC細胞上に見られるインテグリンανβ3受容体に対する結合を介して、細胞の遊走および伸展を増強したことを実証している。
インテグリン受容体は、細胞の生存および増殖に関与するので、本発明者らは、細胞周期に対するcRGDY−PEG−C−ドットの効果を分析した。0.2%FCS補充培地中で、2つの濃度のcRGDY−PEG−C−ドット(100nM、300nM)を使用して、G0/G1期同期化M21細胞を48時間インキュベートした。この範囲にわたって、S期の細胞の割合は11%上昇し、100nM(p<0.05)および300nM(p<0.005)では、対照と比べて統計的有意性が達成された(図46A、46B)。それぞれ細胞周期のG1期およびG2期では、6%および5%の対応する減少が見られた。要するに、これらのデータは、cRGDY−PEG−Cドットの存在下におけるS期の増強を示している。
試薬、抗体および化学物質。RPMI1640、ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびHBSS(カルシウムおよびマグネシウムを含まず、0.25%トリプシンおよび0.05%EDTAを含有する)は、Core Media Preparation Facility,Memorial Sloan Kettering Cancer Center(New York,NY)から入手した。抗ポリクローナルウサギ:ホスホ−Erk1/2(p−Erk1/2Thr202/Tyr204)、ホスホ−AKT(p−AktSer473)ホスホ−Src(p−SrcTyr419)、ホスホ−p70S6(p−p70S6Thr389)、ホスホ−MEK1/2(p−MEK1/2Ser217/221)、ホスホ−FAK−Tyr397、ホスホ−FAK−Tyr576/577ホスホ−FAKTyr925、Erk、AKT、Src、p70S6、MEK1/2(47E6)およびFAKは、Cell Signaling Technology(Danvers,MA)から入手した。ヤギ抗ウサギIgG、ヤギ抗マウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートは、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)から入手した。ヨウ化プロピジウム、RNaseA、トランスフェリン−Alexa Fluor488コンジュゲート、FITC−デキストラン、フルオレセイン、LysoTracker Red DND−99、LysoTracker Green DND−26、pHrodo Redデキストランおよびヘキストは、Invitrogen−Life Technologies(Carlsbad,CA)から購入した。PF−573228は、TOCRIS bioscience(Ellisville,MO)から入手した。シクロ(Arg−Gly−Asp−D−Tyr−Cys)は、Peptides International(Louisville,KY)製であった。
薬物送達ビヒクルとして、10nm以下の粒子(例えば、Cドット)の治療可能性が検討されている。薬物結合粒子は、薬物を粒子結合二官能性PEG鎖に付加することによって開発されている。この概念実証研究に利用されるモデル薬物は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)阻害剤である。光学イメージングおよび/またはPETイメージングによって粒子取り込みの増強および腫瘍内分布を評価するための用量漸増戦略を用いることによって、標的部位における粒子治療ペイロードの送達および蓄積を最大化し得る。粒子負荷送達を増強するための別のアプローチでは、治療粒子プローブをカプセル化するリポソーム製剤を利用する。リポソームは、循環中の分解からペイロードを保護しながら、増強した血管透過性・滞留性亢進(EPR)効果によって腫瘍を受動的にターゲティングする。粒子のカプセル化前に、標的部位への送達を最大化するための能動的ターゲティング機構として、cRGDYまたはリンカー−薬物コンジュゲートのいずれかを粒子表面に付加する。
Claims (58)
- ヒト被験体をイメージングするための方法における使用のための組成物であって、
該組成物は、複数のマルチモーダルシリカ系ナノ粒子を含み、該ナノ粒子の各々が、以下:
シリカ系コア;
該コア内の蛍光化合物;および
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル;
を含み、
ここで、該ナノ粒子が有機ポリマーでコーティングされており、数が30個以下の複数のD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドが、腫瘍マーカーへの結合のために該ポリマーでコーティングされたナノ粒子に結合しており、該ナノ粒子の各々が、1nm〜15nmの範囲内の直径を有し、
該組成物は、0.01ナノモル/kg体重〜1ナノモル/kg体重の範囲の該ナノ粒子の用量で該ヒト被験体に投与され、該ナノ粒子が、投与後24時間のうちに90%〜100%の初期用量(ID)の範囲内で、該ヒト被験体による腎クリアランスにより排出されることを特徴とし、
ここで、該方法は、(a)励起光を該ヒト被験体に向けて、該蛍光化合物を励起する工程;および(b)該ナノ粒子をイメージングする工程を含む、
組成物。 - 前記ナノ粒子が1nm〜8nmの直径を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記有機ポリマーが、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸(PGA)、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)、ポリ酢酸ビニル(PVA)およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子の各々に結合したD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドの数が10個以下である、請求項1に記載の組成物。
- 造影剤またはキレートが前記ナノ粒子に結合している、請求項1に記載の組成物。
- 前記造影剤が放射性核種である、請求項5に記載の組成物。
- 前記放射性核種が、89Zr、64Cu、68Ga、86Y、124Iおよび177Luからなる群より選択される、請求項6に記載の組成物。
- 前記キレートが、放射性核種に結合するように適合されている、請求項5に記載の組成物。
- 前記キレートが、DFO、DOTA、TETAおよびDTPAからなる群より選択される、請求項5に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子が、PET、SPECT、CT、MRI、光学イメージング、生物発光イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出可能である、請求項1に記載の組成物。
- 前記光学イメージングが蛍光イメージングである、請求項10に記載の組成物。
- 治療剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項1に記載の組成物。
- 前記治療剤が、抗生物質、抗菌剤、抗増殖剤、抗腫瘍薬、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、抗有糸分裂薬、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、PPAR−γアゴニスト、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNAならびに抗がん化学療法剤からなる群より選択される、請求項12に記載の組成物。
- 前記治療剤が放射標識されている、請求項12に記載の組成物。
- 前記治療剤が放射性フッ素18Fに結合されている、請求項14に記載の組成物。
- 前記治療剤が放射性核種である、請求項12に記載の組成物。
- 前記放射性核種が、90Y、131Iおよび177Luからなる群より選択される、請求項16に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、N−Ac−Cys−(Ahx)2−D−Lys−ReCCMSHである、請求項1に記載の組成物。
- 前記ヒト被験体の少なくとも1つまたは複数の画像が細胞異常を検出またはモニターするために使用され、該細胞異常内に存在するか、またはそれに隣接する正常組織構造、神経組織、および/または血管構造が、該正常組織構造を検出またはモニターするためにマークまたは区別される、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞異常が、炎症、がん、心血管疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、眼疾患、感染症、免疫疾患、中枢神経系疾患、遺伝性疾患、代謝性疾患、環境疾患、骨関連疾患、神経変性疾患、および手術関連合併症からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む、請求項19に記載の組成物。
- 前記細胞異常が、センチネルリンパ節における転移性黒色腫である、請求項19に記載の組成物。
- 前記細胞異常が、末梢神経の異常または結節性疾患である、請求項19に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子をイメージングする工程が、ポータブル検出デバイスにより該ナノ粒子からの蛍光を検出する工程を含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子をイメージングする工程が、リンパ節群の少なくとも1つのデュアルチャネル画像を使用者に表示する工程をさらに含む、請求項23に記載の組成物。
- 前記デュアルチャネル画像は、RGBカラー画像および近赤外(NIR)画像を含む、請求項24に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子の各々が、γプローブを使用して検出される、請求項1に記載の組成物。
- 投与4時間後の前記ヒト被験体の肝臓における前記ナノ粒子が、1グラム当たりの注射用量(ID/g)の0.010%未満となるように、前記ナノ粒子が排出されることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 励起光を向ける工程および前記γプローブの使用が同時に行われる、請求項26に記載の組成物。
- 前記有機ポリマーがポリエチレングリコールを含み、該ポリエチレングリコールが、該有機ポリマーにおける活性化エステル基に結合したアミノシランを介して、前記ナノ粒子のシリカ表面に結合して、アミド結合が生じる、請求項1に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子の少なくとも1つが、数が30個以下の複数のD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドの結合のために、マレイミド末端ポリエチレングリコール鎖でコーティングされている、請求項1に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子の少なくとも1つが、前記数が30個以下の複数のD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドの結合のために、マレイミド末端ポリエチレングリコール鎖でコーティングされており、少なくとも1つのD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドが、システインリンカーのチオール基を介して、マレイミド末端ポリエチレングリコール鎖に結合している、請求項30に記載の組成物。
- 前記数が30個以下の複数のD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドが、放射性核種で標識されている、請求項31に記載の組成物。
- 前記数が30個以下の複数のD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドが、チロシン(Y)リンカーを介して前記放射性核種で標識されている、請求項32に記載の組成物。
- 前記蛍光化合物が、Cy5またはCy5.5である、請求項1に記載の組成物。
- ヒト被験体内の領域のデュアルチャネル光学イメージングのための方法における使用のための組成物であって、
該組成物は、複数のマルチモーダルシリカナノ粒子を含み、該ナノ粒子の各々は、
シリカ系コア;
該コア内の蛍光化合物;および
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル;
を含み、ここで、該ナノ粒子が有機ポリマーでコーティングされており、数が30個以下の複数のD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドが、腫瘍マーカーへの結合のために該ポリマーでコーティングされたナノ粒子に結合しており、該ナノ粒子の各々が、1nm〜15nmの範囲内の直径を有し、
ここで、該方法は、
(a)該組成物が投与された該ヒト被験体に光を向ける工程;
(b)第1のチャネルおよび第2のチャネルを介して光を向ける工程であって、デュアルチャネル光学イメージングシステムの該第1のチャネルおよび該第2のチャネルが、異なる波長である、工程;ならびに
(c)検出された光に対応するシグナルを処理して、該ヒト被験体の領域の1つまたは複数の画像を提供する工程;
を含む、組成物。 - 前記第1のチャネルは、赤、緑、および青(RGB)光を検出する、請求項35に記載の組成物。
- 前記第2のチャネルがNIR蛍光を検出する、請求項36に記載の組成物。
- 前記画像がリアルタイムで提供される、請求項35に記載の組成物。
- 投与後の前記ナノ粒子の血中滞留半減期が、2時間〜25時間、または3時間〜15時間、または4時間〜10時間である、請求項1に記載の組成物。
- 投与後の前記ナノ粒子の腫瘍滞留半減期が、5時間〜5日間、または10時間〜4日間、または15時間〜3.5日間である、請求項1に記載の組成物。
- 蛍光シリカ系ナノ粒子であって、該ナノ粒子は、
シリカ系コアであって、該シリカ系コア内に位置する蛍光化合物を含む、シリカ系コア;
該コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェル;
該ナノ粒子に結合された有機ポリマー;
該ナノ粒子に結合された1〜30個のD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンド;および
該ナノ粒子に結合した造影剤またはキレート;
を含み、
ここで、該ナノ粒子は1nm〜25nmの直径を有する、ナノ粒子。 - 1nm〜8nmの直径を有する、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記有機ポリマーが、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸(PGA)、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)、ポリ酢酸ビニル(PVA)およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記D−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドが少なくとも1つの細胞成分と結合することができる、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記細胞成分が腫瘍マーカーである、請求項44に記載のナノ粒子。
- 前記ナノ粒子に結合しているD−Lys−ReCCMSH含有ペプチドリガンドの数が1〜10の範囲である、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記造影剤が放射性核種である、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記放射性核種が、 89 Zr、 64 Cu、 68 Ga、 86 Y、 124 Iおよび 177 Luからなる群より選択される、請求項47に記載のナノ粒子。
- 前記キレートが、放射性核種に結合するように適合されている、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記キレートが、DFO、DOTA、TETAおよびDTPAからなる群より選択される、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記ナノ粒子が、PET、SPECT、CT、MRI、光学イメージングまたはそれらの組み合わせによって検出可能である、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記光学イメージングが蛍光イメージングである、請求項51に記載のナノ粒子。
- 治療剤が前記ナノ粒子に結合している、請求項41に記載のナノ粒子。
- 前記治療剤が、抗生物質、抗増殖剤、抗酸化剤、内皮細胞成長因子、トロンビン阻害剤、免疫抑制剤、抗血小板凝集剤、コラーゲン合成阻害剤、治療抗体、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、創傷治癒剤、治療遺伝子導入構築物、細胞外マトリックス成分、血管拡張剤、血栓溶解剤、代謝拮抗物質、成長因子アゴニスト、スタチン、ステロイド、ステロイド性抗炎症剤、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、フリーラジカルスカベンジャー、PPAR−γアゴニスト、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNAならびに抗がん化学療法剤からなる群より選択される、請求項53に記載のナノ粒子。
- 前記治療剤が放射標識されている、請求項53に記載のナノ粒子。
- 前記治療剤が放射性フッ素 18 Fに結合されている、請求項55に記載のナノ粒子。
- 前記治療剤が放射性核種である、請求項53に記載のナノ粒子。
- 前記放射性核種が、 90 Y、 131 Iおよび 177 Luからなる群より選択される、請求項57に記載のナノ粒子。
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